ES2638888T3 - Modulación de la metilación epigenética del AND para provocar que las células adopten patrones de metilación del ADN asociados con células jóvenes - Google Patents

Abstract

Una composición tópica para controlar la metilación del ADN en células de la piel humana, que comprende: (a) un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal, que es un extracto de la suspensión de células de meristemo vegetal derivado de las plantas del género Oryza, (b) un conservante presente en una cantidad suficiente para proporcionar una eficacia esterilizante o bioestática con respecto al componente (a); y (c) un vehículo dermatológicamente aceptable.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Modulacion de la metilacion epigenetica del AND para provocar que las celulas adopten patrones de metilacion del ADN asociados con celulas jovenes

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a composiciones eficaces para controlar la metilacion del ADN en celulas de la piel humana. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a composiciones topicas que contienen un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal derivado de las plantas de la familia Poaceae, y a la fabricacion y al metodo de utilizar este tipo de composiciones.

Antecedentes de la invencion

Las plantas son unicas entre los organismos vivos en la tierra para poder cultivar una nueva planta a partir de una sola celula tomada de una planta mas vieja. Al proceso de cultivo de estas celulas vegetales se le alude como cultivo de tejidos vegetales y se conoce desde principios de 1900.

Se han utilizado cultivos de celulas vegetales en aplicaciones topicas. Por ejemplo, el documento US 2008/0299092 A1 describe el uso de celulas vegetales desdiferenciadas derivadas de manzanas en preparaciones cosmeticas con el fin de influir en la salud de las celulas madre de la piel. Igualmente, el documento Ep 1 736 167 A2 describe la aplicacion topica de medios de cultivo de celulas vegetales de Syringa vulgaris enriquecido en verbascosidos destinados a proporcionar influencias antioxidantes a la piel. El documento 2007/0015252 A1 describe la aplicacion topica de cultivos vegetales de Ajuga reptans que contienen fenilpropanoides para dar al extracto un alto nivel de antioxidantes. La patente de EE.Uu. n° 6.551.625 describe que celulas vegetales no diferenciadas cultivadas como un cultivo en suspension de Salvia miltiorrhiza pueden utilizarse en aplicaciones cosmeticas y topicas para ayudar a prevenir la formacion de olores corporales. El documento EP 2 133 323 A1 describe el cultivo de Centella asiatica como un cultivo tisular para la produccion de acido 3,5-dicafeoil-4-malonilqumico que puede tener actividad inhibidora de metaloproteinasas cuando se utiliza en productos cosmeticos para la piel. El documento EP 0 797 984 A2 describe cosmeticos anti-envejecimiento con una disolucion enzimolizada de extracto alcalino de extracto de arroz (grano). Es adecuado en el tratamiento anti-envejecimiento de la piel y el tratamiento anti-arrugas, y fomenta la produccion de colageno.

Sin embargo, hasta la fecha, segun el conocimiento de la solicitante, no existe tecnica anterior que divulgue tratamientos topicos hechos a partir de cultivos celulares de plantas destinados a influir sobre el ADN epigenetico o la metilacion de cromatina en celulas de la piel.

La epigenetica es el estudio de los cambios heredables en la expresion genica que son provocados por un mecanismo distinto de los cambios en la secuencia del ADN. Cualquier modificacion que altere la actividad genica sin cambiar la secuencia del ADN y que tambien pueda transmitirse a las celulas hijas se considerana una modificacion epigenetica. Los cambios epigeneticos se transmiten a las celulas hijas y pueden durar multiples generaciones, aunque no haya cambios en la secuencia del ADN. Los factores y los cambios epigeneticos han demostrado que juegan un papel importante en la diferenciacion celular, el desarrollo, el envejecimiento y las enfermedades (Cropley et al., 2006; Weaver et al., 2006; Rakyan et al., 2003).

Se ha demostrado que la metilacion del ADN tanto a nivel global como genetico desempena un papel importante en lo que respecta a la memoria epigenetica; se ha demostrado que los cambios en la metilacion del ADN estan relacionados con la edad (Gopisetty et al., 2006, Ottaviano et al., 1994, Feng et al., 2006, Boks et al., 2009). La metilacion del ADN con respecto a los cambios epigeneticos se produce en la citosina-5 en los dinucleotidos CpG. El grupo metilo se une a una base citosina seguida por una base de dinucleotido guanina. El p representa el fosfato que une entre sf la C y la G. Esto ayuda a diferenciar CpG de un par de bases CG. La metilacion del ADN tambien puede producirse en los sitios CpA, CpT y CpC, aunque actualmente la mayona de los datos que enlazan la metilacion de citosina y la transcripcion genica provienen de datos CpG debido a razones tanto biologicas como tecnicas.

La metilacion de las zonas promotoras ricas en CpG, denominadas islas CpG, se ha identificado como un mecanismo esencial en la regulacion de la transcripcion de genes (Metivier et al., 2008, Bird, 2002). Las islas CpG han sido definidas por Takai y Jones (2002) como una region de 200 pares de bases con un contenido de GC de > 55%. Las islas CpG se encuentran en aproximadamente el 70% de promotores humanos (Saxonov et al., 2006). Los promotores genicos son regiones del aDn aguas arriba de un gen en el que la ARN polimerasa se une inicialmente para iniciar la transcripcion del gen. Ademas de asociarse con promotores, las islas CpG tambien estan enlazadas a genes de control interno. Las islas CpG estan tfpicamente no metiladas en celulas normales, permitiendo asf a la maquinaria de transcripcion el acceso al ADN. En determinadas enfermedades y con el envejecimiento, las islas CpG se vuelven aberrantemente metiladas, desregulando la actividad transcripcional usual del gen. La metilacion se produce simetricamente sobre los restos citosina en ambas cadenas de los dinucleotidos de CpG. La metilacion del ADN se establece en una fase temprana en un organismo durante la embriogenesis. Aproximadamente el 70-80% de los sitios CpG estan metilados en celulas de mamfferos, pero los sitios CpG y sus grados de metilacion estan distribuidos de manera irregular en el genoma (Bird et al., 1985). Los sitios CpG se encuentran principalmente dentro

2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

de los promotores de ~ 70 de los genes humanos (Saxonov et al. 2006) y estos sitios tienden a ser no metilados. Cuando las islas CpG en un promotor estan metiladas, esto da lugar a la represion transcripcional del gen adyacente. Generalmente, los genes expresados parecen tener una baja metilacion en su region promotora y una alta metilacion en su cuerpo del gen (Ball et al., 2009). Se supone que la metilacion del ADN cambia la densidad de cromatina y la accesibilidad del ADN a la maquinaria celular, influyendo asf en el potencial transcripcional de la secuencia de ADN subyacente.

Los niveles de metilacion del ADN dentro de una celula espedfica en genes espedficos estan sujetos a cambios a lo largo del tiempo. Al igual que los niveles de metilacion del ADN cuando se comparan diferentes tipos de celulas tales como las celulas madre pluripotentes humanas y las celulas somaticas (Deng et al., 2009). Los gemelos monocigoticos (identicos) tienen el mismo genotipo, ya que se derivan del mismo cigoto. Estudios han demostrado que los patrones de modificacion epigenetica divergen en gemelos monocigoticos a medida que envejecen, lo que sugiere que pueden producirse pequenos defectos en la transmision de informacion epigenetica a traves de sucesivas divisiones celulares (Fraga et al., 2005). Este proceso, denominado "deriva epigenetica", esta asociado con el envejecimiento. Estudios de gemelos han estimado que los factores geneticos solo determinan el 20-30% de la variacion en la esperanza de vida humana. El 70-80% restante de la variacion se debe al entorno y otros factores no geneticos (Fraga et al., 2005; Mitchell et al., 2001; Herskind et al., 1996; Poulsen et al., 2007).

Se conocen metodos para influir sobre la metilacion del ADN. Por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 7.790.746 describe metodos para inhibir la metilacion del ADN utilizando diversos derivados de quinolina. Sin embargo, esta patente no revela el uso de agentes activos derivados de vegetales como un medio para influir sobre la metilacion del ADN, particularmente en el promotor del gen.

Lo que actualmente se necesita en la comunidad cosmetica son ingredientes que mejoran las caractensticas del envejecimiento de la piel al influir sobre la metilacion de las regiones de promotor de los diversos genes cnticos asociados con el envejecimiento en celulas de la piel de mairnferos, especialmente humanas. La presente invencion proporciona una respuesta a esa necesidad.

Sumario de la invencion

En un aspecto, la presente invencion se refiere a una composicion topica para controlar la metilacion del ADN en celulas de la piel humana, que comprende: (a) un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal, que es un extracto de la suspension de celulas de meristemo vegetal derivado de las plantas del genero Oryza, (b) un conservante presente en una cantidad suficiente para proporcionar una eficacia esterilizante o bioestatica con respecto al componente (a); y (c) un vedculo dermatologicamente aceptable.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un concentrado de composicion que contiene (a) un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal (extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal) derivado de las plantas del genero Oryza, y (b) un conservante presente en una cantidad suficiente para proporcionar una eficacia esterilizante o bioestatica con respecto al componente (a), en donde el componente (a) esta presente en una cantidad de 0,0000001% a 99% en peso del concentrado de la composicion, prefiriendose 90% a 99% y siendo mas preferido 97% a 99%, y el componente (b) esta presente en una cantidad de 0,01% a 10% en peso del concentrado de la composicion, prefiriendose 0,1% a 5% y siendo lo mas preferido 0,4% a 2%.

En aun otro aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento para preparar la composicion topica descrita anteriormente. El procedimiento incluye las etapas de: (i) proporcionar celulas vegetales totipotentes e indiferenciadas derivadas de plantas del genero Oryza; (ii) cultivar las celulas vegetales en un medio nutriente lfquido en presencia o ausencia de tensiones qmmicas, gaseosas o energeticas destinadas a provocar la expresion de metabolitos de celulas vegetales secundarios para producir una mezcla que contiene componentes hidrosolubles e insolubles en agua, (iii) separar los componentes insolubles en agua para producir el medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal (extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal) y (iv) combinar el medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal (extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal) con un conservante y un veldculo dermatologicamente aceptable, haciendo de este modo la composicion topica.

En aun otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para controlar la metilacion del ADN en celulas de la piel humana. El metodo incluye poner en contacto la piel con la composicion topica de la invencion.

Breve descripcion de las figuras

La Fig. 1 es un cromatograma HPLC de un medio nutriente acondicionado de meristemo estresado por ozono (extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal).

La Fig. 2 es un cromatograma HPLC de un medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz no estresado por ozono (extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal).

La Fig. 3. es un grafico que ilustra el efecto de un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal (extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal) de la invencion en el nivel de metilacion en los promotores de genes de fibroblastos cultivados in vitro.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

La Fig. 4 es un grafico que ilustra el efecto de un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal (extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal) de la invencion en el nivel de metilacion en promotores de genes 1A1 de colageno de fibroblastos cultivados in vitro.

La Fig. 5 es un grafico que ilustra el efecto de un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal (extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal) de la invencion en el nivel de metilacion en el promotor del gen 1A2 de colageno de fibroblastos cultivados in vitro.

La Fig. 6 es un grafico que ilustra el efecto de un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal (extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal) de la invencion sobre los niveles de protema de colageno 1A de fibroblastos cultivados in vitro.

La Fig. 7 es un grafico que ilustra el efecto de un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal (extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal) de la invencion sobre la expresion de la protema dermatopontina de fibroblastos cultivados in vitro.

Descripcion detallada de la invencion

Se ha encontrado ahora, sorprendentemente, que medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal, que son extractos de suspension de celulas de meristemo derivados de plantas del genero Oryza, mas preferiblemente de la especie sativa, cuando se aplican topicamente a celulas de la piel humanas tales como, por ejemplo, fibroblastos, queratinocitos, melanocitos y similares, pueden modular la metilacion del ADN en celulas de piel de mairnferos jovenes y mas particularmente intrmseca y extrmsecamente envejecidas, especialmente en la region del promotor de los genes. Las celulas tratadas muestran patrones de metilacion del ADN mas caractensticos de los encontrados en celulas jovenes no envejecidas. Las composiciones topicas que contienen estos medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal son particularmente ventajosas para uso en terapia humana y veterinaria y para fines nutricionales y cosmeticos.

Por consiguiente, en una realizacion, la presente invencion proporciona una composicion topica para controlar la metilacion del ADN en celulas de la piel humana, que comprende: (a) un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal (extracto de la suspension de celulas de meristemo vegetal) derivado de las plantas del genero Oryza, (b) un conservante presente en una cantidad suficiente para proporcionar una eficacia esterilizante o bioestatica con respecto al componente (a); y (c) un vehmulo dermatologicamente aceptable.

En relacion con la composicion topica de la invencion arriba descrita, el componente (a) esta presente en una cantidad de 0,0000001% a 99% en peso de la composicion, prefiriendose 0,0001% a 50% y siendo mas preferido 0,001% a 25%y siendo lo mas preferido 0,01% a 10%, el componente (b) esta presente en una cantidad de 0,01% a 10% en peso de la composicion, siendo mas preferida de 0,1% a 5% y siendo mas preferida de 0,4% a 2%, y el componente (c) esta presente en una cantidad de 1% a 98% en peso de la composicion, siendo el mas preferido 80% a 90%.

El componente (a), un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal (extracto de suspension de celulas del meristemo vegetal) adecuado para uso en la composicion topica de la invencion se deriva de las plantas del genero Oryza, preferiblemente de plantas Oryza sativa.

Los medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal (extractos de suspension de celulas de meristemo vegetal) pueden prepararse mediante un procedimiento que incluye las etapas de (i) cultivar cultivos de meristemo vegetal derivados de las plantas del genero Oryza en un medio nutriente lfquido para producir una mezcla que contiene componentes solubles en agua e insolubles en agua, y (ii) separar los componentes insolubles en agua para producir los medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal (extractos de suspension de celulas de meristemo vegetal).

El metodo para crear cultivos de meristemos vegetales se conoce en la tecnica. Tfpicamente, las plantas se esterilizan en primer lugar, a continuacion se extirpa el meristemo de la planta y se coloca en un medio nutriente solido con el fin de que los tejidos de callo indiferenciados se formen a partir del meristemo.

Medios nutrientes solidos son generalmente conocidos por una persona experta en la tecnica. En una realizacion, contienen factores tales como medio Murashige & Skoog, sacarosa, vitaminas Gamborg, hormonas de crecimiento tales como IAA, cinetina, y agar.

Para los fines de la presente invencion, es preferible mantener los tejidos del callo formados a partir del meristemo como celulas indiferenciadas. En los medios nutrientes, un nivel relativamente alto de auxina a cinetina favorece el enraizamiento, mientras que a la inversa puede conducir a la formacion de brotes y niveles intermedios a la proliferacion del callo. Por consiguiente, los niveles de auxina y cinetina en los medios nutrientes deben mantenerse de manera que solo se produzcan celulas indiferenciadas.

Despues de que el meristemo crezca en los medios solidos durante un penodo de tiempo adecuado, los tejidos del callo se sub-cultivan dividiendo y transfiriendolos a nuevos medios solidos. Preferiblemente, este proceso se repite al

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

menos varias veces con el fin de obtener lmeas celulares estables. Tal como se utiliza en esta memoria, lmeas celulares estables significan las celulas que tienen rasgos constantes, producen una cantidad reproducible de agentes activos, crecen a una velocidad constante y se ven igual despues de multiples generaciones. Tfpicamente, los cultivos estabilizados tienen poca variacion dentro del cultivo y a lo largo del tiempo y la replicacion tendra poca variacion.

Tal como saben los expertos en la tecnica, los cultivos de tejidos pueden producir variantes clonales. Dentro de un callo o tejido vegetal existe variacion natural dentro de las celulas. Esta variacion somaclonal depende de la variacion en una poblacion de celulas, ya sea pre-existente o inducida por el cultivo. La variacion puede ser genetica o epigenetica. Estos cambios en el callo o cultivos en suspension tienen un beneficio significativo en la produccion de agentes activos metabolicos secundarios de los cultivos en suspension. Por lo tanto, para los fines de la presente invencion, se eligen lmeas celulares de sub-cultivo que son de crecimiento rapido, tienen rasgos estables tales como color y tamano, crecen a una velocidad constante y otras cualidades de interes.

Despues de que se determina que una lmea celular es estable, las celulas del medio solido, es decir, celulas vegetales totipotentes e indiferenciadas, se inoculan en un medio lfquido. Un medio lfquido es conocido por una persona experta en la tecnica. Contiene factores tales como el medio Murashige & Skoog, sacarosa, vitaminas Gamborg, hormonas de crecimiento tales como IAA y cinetina.

En una realizacion, se deja que las celulas crezcan en un medio nutriente lfquido en presencia de tensiones qmmicas, gaseosas o energeticas destinadas a provocar la expresion de metabolitos de celulas vegetales secundarios.

Aunque puede utilizarse una diversidad de tensiones qmmicas o energeticas para inducir la produccion de metabolitos secundarios, el ozono es un factor de estres preferido, ya que se introduce facilmente en los cultivos celulares a traves de la alimentacion de oxfgeno utilizada para mantener las celulas en un ambiente oxigenado en el reactor.

La exposicion al ozono ayuda a las celulas a sintetizar mas metabolitos secundarios. Los metabolitos secundarios de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a reguladores de crecimiento de plantas, citoquinas vegetales, flavonoides, carotenoides, fitoesteroles, saponinas, glucosinolatos, inhibidores de proteasa, fitoestrogenos, sulfuros, acidos ffticos, alcaloides, terpenoides, glicosidos, fenoles, fenazinas, policetidos, peptidos, polifenoles y similares.

Bajo un cierto umbral, un estres leve del ozono puede ser compensado por la planta, provocando que produzca mas agentes activos. Mientras que, a niveles mas altos, los efectos perjudiciales del estres severo pueden provocar danos irreversibles. Ademas, el umbral de tolerancia al estres depende no solo del tipo de factor de estres, en el caso del ozono, ni del tiempo de exposicion, sino tambien de la capacidad espedfica de resistencia al estres de la especie. Es posible optimizar la cantidad de ozono aplicada al cultivo de suspension de arroz para conseguir resultados espedficos relacionados con el estres. Niveles tfpicos de ozono utiles para la presente invencion pueden estar en el intervalo de 0,0001 a 50 mM. Mas preferidos son niveles de ozono de 0,01 mM a 5 mM. Los mas preferidos son niveles de ozono de 0,1 mM a 0,5 mM. Las celulas vegetales pueden ser expuestas al ozono durante varios minutos a varios dfas, dependiendo de la especie vegetal, la concentracion de ozono, las tasas de ventilacion, la temperatura y similares.

Otra forma de vigilar el estres oxidativo en las fermentaciones de medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal es aplicar el ozono hasta que haya muerto un cierto numero de celulas vegetales. Metodos para medir la viabilidad de las celulas vegetales son bien conocidos por los expertos en la tecnica y pueden incluir, por ejemplo, el ensayo MTT que es un ensayo colorimetrico que demuestra funciones mitocondriales viables, demostrando asf las celulas que viven de aquellas que estan muertas. Un recuento de viabilidad celular preferido sena 50%, un nivel mas preferido sena 75% y un nivel mas preferido sena 80% de viabilidad de las celulas vegetales despues de la aplicacion del estres de ozono.

Generadores de ozono comercialmente disponibles utilizados para el tratamiento con ozono de las celulas vegetales pueden encontrarse, por ejemplo, en Erwin Sander Elektroapparatebau GmbH, Uetze-Eltze, Alemania. En la mayona de las circunstancias, se utiliza un detector de ozono ademas del generador de ozono. Detectores de ozono adecuados estan disponibles de Dasibi, Glandlae, California.

Aunque el ozono se describe aqm como un factor de estres preferido, pueden utilizarse tambien otros factores de estres conocidos por los expertos en la tecnica para inducir metabolitos secundarios. Estos factores de estres incluyen, pero no se limitan a reguladores del crecimiento de plantas, protemas de patogenos de plantas y polfmeros tales como quitina y diversas formas de energfa externa, que incluyen, pero no se limitan a calor y radiacion UV.

Se deja que las celulas crezcan durante un cierto tiempo hasta que se obtenga una cantidad suficiente de biomasa. Si es necesario, se puede anadir medio lfquido nutriente fresco. En una realizacion, se deja que las celulas crezcan hasta una densidad optica de 100-400, despues de lo cual, se recoge la biomasa y se realiza una extraccion para proporcionar el medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal. El proceso de extraccion es conocido por un experto en la materia, por ejemplo, se pueden separar por filtracion los componentes insolubles y los componentes solubles obtenidos como el medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal (extracto de suspension de celulas

5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

de meristemo vegetal).

Sin estar ligado por teona alguna, se cree que a traves del crecimiento de las celulas vegetales, las celulas son capaces de acondicionar los medios nutrientes metabolizando compuestos en los medios y excretando en los medios algunos de estos metabolitos junto con otros diversos compuestos producidos en celulas vegetales. Dado que la fuente inicial de tejido vegetal procede del meristemo vegetal, para los fines de la presente solicitud de patente, los medios acondicionados se denominan “medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal”.

Si es necesario, los medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal asf obtenidos (extractos de suspension de celulas de meristemo vegetal) pueden procesarse adicionalmente por metodos conocidos por los expertos en la tecnica para mejorar el color o el olor o para concentrar o incluso secar completamente el producto.

La eficacia de los medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal (extractos de suspension de celulas de meristemo vegetal) puede mejorarse adicionalmente incluyendo los medios en sistemas de suministro tales como, por ejemplo, liposomas, niasomas, polimerosomas, dendrimerosomas y similares, o a traves de mecanismos de mejora de penetracion tales como, por ejemplo, iontoforesis.

Los medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal (extractos de suspension de celulas de meristemo vegetal) tambien pueden incluirse en sistemas anhidros por separacion del disolvente de extraccion mediante cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica tales como, por ejemplo, liofilizacion, secado por pulverizacion, secado en cinta y similares. En la forma anhidra, los medios se pueden incluir en geles anhidros tales como, por ejemplo, geles de silicona o en polvos anhidros tales como, por ejemplo, bases y polvos prensados.

Los medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal (extractos de suspension de celulas de meristemo vegetal) son adecuados para su uso en la composicion topica de la invencion. Ademas, estos medios acondicionados pueden ser tambien la base para otras modificaciones a traves de una fermentacion adicional de plantas o microorganismos, en que el medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal se anade a un proceso de fermentacion en curso como fuente secundaria de nutrientes de la fermentacion.

El componente (b) de la composicion topica de la presente invencion es un conservante presente en una cantidad suficiente para proporcionar una eficacia esterilizante o bioestatica con respecto al componente (a), el medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal.

Conservantes son bien conocidos por los expertos en la tecnica y pueden incluir, por ejemplo, ingredientes tales como acidos organicos tales como, por ejemplo, acido salidlico o acido sorbico, alcoholes organicos tales como, por ejemplo, fenoxietanol, alcohol bendlico, glicoles y etanol, ingredientes cuaternarios tales como, por ejemplo, Quaternium-15, enzimas tales como, por ejemplo, glucosa oxidasa y lactoperoxidasa en combinacion con un sustrato tal como glucosa vendido comercialmente como Biovert por Arch Personal Care (South Plainfield, NJ) y similares, o combinaciones de estos conservantes.

Conservantes preferidos se seleccionan del grupo que consiste en acido salidlico, acido sorbico, fenoxietanol, alcohol bendlico, etanol, Quaternium-15, glucosa oxidasa y lactoperoxidasa en combinacion con un sustrato, y combinaciones de los mismos.

El conservante debe ser anadido a los medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal (extractos de suspension de celulas de meristemo vegetal) a una concentracion suficiente para actuar como un antibiotico, que es esencialmente esterilizar los medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal, o como un agente bioestatico, manteniendo los medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal en un estado tal que no se reproducen los microorganismos vivos presentes en los medios. Metodos para determinar la eficacia de un sistema conservante son bien conocidos por los expertos en la tecnica. El metodo mas popular para probar la eficacia del conservante se denomina prueba de desaffo. En este metodo de ensayo, los microorganismos se introducen en los medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal lfquidos de una manera controlada y se les permite tratar de crecer en los medios. Si los niveles de microorganismos disminuyen o permanecen inalterados a lo largo de un tiempo prescrito, se dice que el medio esta adecuadamente protegido frente a una contaminacion microbiana.

Un conservante particularmente preferido es fenoxietanol.

El conservante y, en particular, fenoxietanol, se utiliza preferiblemente a un nivel de al menos 0,5% en peso, mas preferiblemente 1,0% en peso, lo mas preferido 1,2% en peso de la composicion.

Si el producto se afsla en forma de un solido, es probable que todavfa se requiera un conservante para mantener el producto el tiempo suficiente para permitir el secado y permanecera en el producto en polvo despues del evento de secado. Metodos de secado son bien conocidos por los expertos en la tecnica y pueden incluir, por ejemplo, secado por pulverizacion, liofilizacion, secado en tambor, secado de pelfcula, y similares. Un metodo de secado especialmente preferido de los metodos de secado por pulverizacion se describe, por ejemplo, en el documento US 2003/0198682 A1.

Los componentes (a) y (b) se han descrito anteriormente. El componente (c) de la composicion de la invencion es un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

veldculo dermatologicamente aceptable. La frase "veldculo dermatologicamente aceptable", tal como se utiliza en esta memoria, significa que el veldculo es adecuado para aplicacion topica a la piel, tiene buenas propiedades esteticas, es compatible con los agentes activos de la presente invencion y cualesquiera otros componentes y no provocara ninguna preocupacion adversa de seguridad o toxicidad.

El veldculo puede estar en una amplia diversidad de formas. Por ejemplo, en esta memoria son utiles soportes de emulsion, incluyendo, pero no se limitan a emulsiones de aceite en agua, agua en aceite, agua en aceite en agua y aceite en agua en silicona. Estas emulsiones pueden cubrir una amplia gama de viscosidades, p. ej., de aproximadamente 100 cps a aproximadamente 200.000 cps. Estas emulsiones tambien pueden suministrarse en forma de pulverizaciones utilizando recipientes de bomba mecanica o recipientes de aerosol presurizados utilizando propelentes convencionales. Estos soportes tambien pueden ser suministrados en forma de una espuma. Otros soportes topicos adecuados incluyen disolventes lfquidos anhidros tales como aceites, alcoholes y siliconas (p. ej., aceite mineral, etanol, isopropanol, dimeticona, ciclometicona y similares); disolventes lfquidos monofasicos de base acuosa (p. ej., sistemas de disolventes acuoso-alcoholicos); y versiones espesadas de estos disolventes monofasicos anhidros y de base acuosa (p. ej., en los casos en los que la viscosidad del disolvente se ha incrementado para formar un solido o semisolido mediante la adicion de gomas, resinas, ceras, polfmeros, sales y similares apropiados). Ejemplos de sistemas de soportes topicos utiles en la presente invencion se describen en las siguientes cuatro referencias: “Sun Products Formulary" Cosmetics & Toiletries, vol. 105, pags. 122-139 (diciembre de 1990); "Sun Products Formulary", Cosmetics & Toiletries, vol. 102, pags. 117-136 (marzo de 1987); Patente de EE.UU. N° 4.960.764 expedida a Figueroa et al.; y patente de EE.UU. N° 4.254.105 expedida a Fukuda et al.

Una discusion mas detallada de vedculos adecuados se encuentra en la Patente de EE.UU. N° 5.605.894 concedida a Blank et al., y la Patente de EE.UU. N° 5.681.852 expedida a Bissett. El vedculo tambien puede ser una composicion topica de tipo en polvo tal como, por ejemplo, una base en polvo.

Adicionalmente, la composicion topica de la presente invencion puede contener opcionalmente otros ingredientes funcionales tales como agua, tensioactivos, emulsionantes, acondicionadores, emolientes, ceras, aceites, polfmeros, espesantes, fijadores, colorantes, humectantes, hidratantes, estabilizadores, diluyentes, disolventes, fragancias y similares, asf como ingredientes activos tales como, por ejemplo, agentes botanicos, nutraceuticos, cosmeceuticos, terapeuticos, farmaceuticos, antifungicos, antimicrobianos, hormonas esteroides, agentes anticaspa, componentes anti-acne, protectores solares, conservantes y similares.

La composicion topica de la invencion puede estar en cualquier forma conocida por una persona experta en la tecnica, por ejemplo, una crema, locion, gel, suero, jabon, baston, polvo o similar. La composicion se puede aplicar como un producto de reposicion o como un producto destinado a ser enjuagado de la piel inmediatamente despues de aplicaciones, incluyendo estos productos cosas tales como lavados corporales, champus y similares.

Se ha encontrado, sorprendentemente, que la aplicacion de las composiciones topicas de la presente invencion puede influir en las alteraciones epigeneticas relacionadas con la edad y retrasar y aliviar ciertos aspectos del envejecimiento de la piel. A traves de la aplicacion topica de composiciones que contienen medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal (extractos de suspension de celulas de meristemo vegetal), se ha encontrado, sorprendentemente, que la modulacion de la metilacion del ADN puede ocurrir de tal manera que las celulas envejecidas experimentan una transformacion y recuperan los patrones de metilacion de CpG del ADN que tedan sus celulas mas jovenes, no envejecidas. Patrones de metilacion del ADN, tanto al nivel genomico como al de genes espedficos pueden ser modulados a traves de la aplicacion de medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal. La identificacion de que tanto el genoma como los genes individuales tienen estados de metilacion reversibles y que los medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal pueden influir en el estado de metilacion de las celulas de la piel resulta en nuevas oportunidades terapeuticas topicas.

Aunque el genoma puede ser exactamente el mismo en dos individuos, la regulacion de la expresion genica a traves de modificaciones epigeneticas puede jugar un papel en grandes diferencias entre la longevidad y la aptitud del organismo o tejido. Mediante la modulacion de los patrones de metilacion del ADN celular se pueden lograr oportunidades para tratar la perdida del cabello, estados inflamatorios de la piel, pigmentacion y manchas de la edad, arrugas, sequedad de la piel relacionada con el envejecimiento y perdida de elasticidad y textura de la piel, entre otras dolencias.

El patron epigenetico y el mantenimiento son de gran importancia para el funcionamiento celular normal. Mediante el perfil de metilacion CpG de tejidos de la piel jovenes y envejecidos, se puede observar la caracterizacion del papel del envejecimiento y la exposicion a los UVB en cuanto a la variacion de la metilacion. Debido a que la correlacion positiva mas fuerte entre el envejecimiento y la metilacion se produce en loci en las islas CpG en las regiones de promotor del gen, los estudios sobre la eficacia de los medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal se centraron en estos sitios importantes de metilacion.

En otra realizacion, la presente invencion se refiere tambien a un concentrado de composicion que comprende: (a) un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal que es un extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal derivado de plantas del genero Oryza, (b) un conservante presente en una cantidad suficiente para proporcionar una eficacia esterilizante y bioestatica con respecto al componente (a), en donde el componente (a)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

esta presente en una cantidad de 0,0000001% a 99% en peso de la composicion, prefiriendose 90% a 99% y siendo mas preferido 97% a 99%, y el componente (b) esta presente en una cantidad de 0,01% a 10% en peso de la composicion, prefiriendose 0,1% a 5% y siendo lo mas preferido 0,4% a 2%.

En una realizacion preferida, el componente (a) del concentrado de la composicion es un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal que es un extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal derivado de plantas de Oryza sativa.

El concentrado de composicion de la presente invencion se puede incorporar adecuadamente en una composicion topica tal como se ha descrito anteriormente por cualesquiera metodos conocidos por una persona experta en la tecnica.

Aun otra realizacion de la invencion es un procedimiento para preparar la composicion de la invencion, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

(i) proporcionar celulas vegetales totipotentes, indiferenciadas, derivadas de plantas del genero Oryza;

(ii) cultivar las celulas vegetales en un medio nutriente Kquido en presencia o ausencia de tensiones qmmicas, gaseosas o energeticas destinadas a provocar la expresion de metabolitos de celulas vegetales secundarios para producir una mezcla que contiene componentes solubles en agua e insolubles en agua

(iii) separar los componentes insolubles en agua para producir el medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal, que es un extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal, y

(iv) combinar el medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal con un conservante y un vehfculo dermatologicamente aceptable, haciendo de este modo la composicion de la invencion.

En una realizacion preferida del procedimiento, las celulas vegetales de la etapa (i) se derivan de plantas de Oryza sativa.

En otra realizacion preferida del procedimiento, las celulas vegetales se cultivan en presencia de ozono en la etapa

(ii).

En una realizacion particularmente preferida del procedimiento, las celulas vegetales de la etapa (i) se preparan mediante un metodo, que comprende las etapas de

(1) hacer crecer meristemos vegetales derivados de las plantas del genero Oryza en un medio nutriente solido; y

(2) seleccionar cultivos estabilizados, produciendo de este modo dichas celulas vegetales.

Todavfa otra realizacion de la invencion es un metodo para controlar la metilacion del ADN en celulas de la piel humana, que comprende poner en contacto la piel con una composicion topica que comprende:

(a) medios nutrientes acondicionados de meristemo vegetal derivados de plantas del genero Oryza,

(b) un conservante presente en una cantidad suficiente para proporcionar una eficacia esterilizante o bioestatica con respecto al componente (a); y

(c) un vehfculo dermatologicamente aceptable.

El metodo anterior para controlar la metilacion de ADN en celulas de la piel humana es preferiblemente no terapeutico, p. ej., es cosmetico.

La invencion se describe adicionalmente en los Ejemplos dados a continuacion. Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar el alcance de la presente invencion. Todos los porcentajes dados aqu son porcentajes en peso basados en el peso total de la composicion, a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 1:

Produccion de un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal de Oryza sativa (arroz)

Cultivos de meristemos de arroz se cultivaron en un medio solido (Murashigie & Skoog con vitaminas Gamborg 1X, 30 g/L de sacarosa, 1 mg/L de cinetina, 0,2 mg/L de IAA y agar al 1% a pH 5,6) y se sub-cultivaron durante al menos tres meses. El callo de la misma lmea de cultivo se inoculo en multiples matraces de 250 mL que conteman aproximadamente 60 mL del medio anterior sin agar. Despues de dos semanas, el cultivo se introdujo en un matraz de 500 mL que contema aproximadamente 130 mL de medio lfquido, que contema medio Murashige & Skoog, vitaminas Gamborg 1X, 30 g/L de sacarosa, 1 mg/L de cinetina, 0,2 mg/L de IAA a pH 5,6. Despues de dos semanas, el cultivo se cambio a un matraz de 1 L que contema aproximadamente 300 mL de medio lfquido. Despues de la fermentacion durante 14 dfas, se introdujeron 600 mL de cultivo en un biorreactor de 3 L con un

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

volumen de trabajo de 2,3 L. Despues de tres semanas de fermentacion, se trasladaron 5 L de cultivo a un biorreactor de 30 L con un volumen de trabajo de 22 L. Despues de la fermentacion durante tres semanas, se trasladaron 40 L de cultivo a un biorreactor de 250 L con un volumen de trabajo de 200 L. Despues de cuatro semanas de fermentacion, 200 L se trasladaron a un biorreactor de 1000 L con un total de 400 L de medio Kquido. Despues de 2 semanas de fermentacion, se anadieron 350 L de medio reciente para llevar el volumen total a 750 L. Se dejo crecer el cultivo durante 2 semanas, despues de lo cual se anadieron 0,5 ppm de ozono al conducto de aire. El cultivo crecio durante una semana adicional para producir metabolitos secundarios, despues de lo cual el cultivo se homogeneizo utilizando un homogeneizador Niro y se filtro para separar el material solido. Al material resultante se le aludio como medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz (extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal) o como cultivo de arroz para abreviar.

Ejemplo 2:

Cromatograma de HPLC de medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz estresado con ozono del Ejemplo 1

El analisis de HPLC se realizo en el extracto de medio nutriente acondicionado de meristemo del Ejemplo 1. Se observaron picos multiples, pero solo uno era de biotina, lo que denota que el ozono provoca la produccion de metabolitos secundarios por los cultivos de arroz. El analisis se realizo utilizando una columna Phenomenex Kinetex de 2,6 pm, 100 x 4,6 mm. El disolvente A era metanol. El disolvente B era fosfato sodico 50 mM (pH 4,5). Se utilizo disolvente A al 10% y el disolvente B se utilizo al 90% isocraticamente. El caudal era de 1,0 mL por minuto y la temperatura de la columna era de 30°C. La deteccion se realizo a una longitud de onda de 200 nm. El resultado del analisis HPLC se muestra en la Figura 1.

Ejemplo 3

Cromatograma de HPLC de medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz no estresado con ozono

Se preparo un extracto de meristemo de arroz de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 1, excepto que no se anadio ozono. El analisis por HPLC se realizo en las condiciones descritas en el Ejemplo 1. El resultado se muestra en la Fig. 2. Tal como se muestra en la Fig. 2, se observaron muy pocos picos de metabolitos secundarios en el cromatograma de HPLC.

Ejemplo 4

La metilacion media de CpG en todos los promotores de genes de todo el genoma en fibroblastos cultivados in vitro disminuye con la aplicacion de medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz ozonizado del Ejemplo 1

Tal como se describio arriba, un rasgo importante de las celulas jovenes es que tienen bajos niveles de metilacion en comparacion con las celulas mas viejas. Este ejemplo demuestra que la aplicacion de 2% de medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal del Ejemplo 1 aplicado a fibroblastos cultivados in vitro provoco que las celulas tuvieran un nivel disminuido de metilacion en los promotores de genes de todo el genoma en comparacion con el control no tratado.

Sumario del Metodo de Ensayo

Para este estudio, se tomaron fibroblastos dermicos humanos a lo largo de un penodo de envejecimiento intrmseco y extrmseco combinado (pasajes secuenciales de celulas y exposicion repetida a UVB) o no envejecidos. Para el procedimiento de envejecimiento intrmseco los fibroblastos se tomaron a traves de 8 pasajes de cultivo celular (3 semanas en cultivo). Las celulas se cultivaron en placas de 12 pocillos y se cultivaron hasta confluir (cada 48 a 72 horas) y se cosecharon y se sembraron nuevamente a un 50% de la densidad celular original, de manera que cada uno de los pasajes representaba aproximadamente una duplicacion de la poblacion. Para el aspecto de envejecimiento extrmseco, las celulas se irradiaron con UVB tres veces por semana. Si bien la intencion original del estudio era llevar a este grupo a traves de 8 pasajes, esto no fue posible. En el tercer pasaje la velocidad de replicacion celular se habfa ralentizado hasta el punto en el que ya no era posible pasar las celulas. Este grupo se mantuvo en cultivo durante 3 semanas y se sometio a 9 exposiciones a UVB.

Ademas de los tratamientos de envejecimiento, los fibroblastos tambien se trataron con materiales de ensayo que estaban presentes durante todo el proceso de envejecimiento. La lista de grupos de tratamiento es la siguiente:

1. Celulas No Envejecidas (cosechadas despues de unos pocos dfas en cultivo)

2. Envejecimiento Intrmseco + Envejecimiento Extrmseco

3. Envejecimiento Intrmseco + Envejecimiento Extrmseco + 2% de cultivo de arroz del Ejemplo 1 Al final del penodo de cultivo, el medio de cultivo celular se recogio y se analizo para detectar cambios.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Metodos

Preparacion y Tratamiento de Fibroblastos

Los fibroblastos se sembraron en los pociMos individuals de una placa de 12 pocillos en 1 mL de Medio de Crecimiento de Fibroblastos (MGF) y se incubaron a 37±2°C y 5±1% de CO2, cambiandose los medios cada 48 a 72 horas. Al alcanzar la confluencia, las celulas se cosecharon y luego se sembraron nuevamente a un 50% de su densidad original. Para las exposiciones a UVB en los grupos de envejecimiento intrmseco mas extrmseco, el medio de cultivo celular se reemplazo con solucion salina tamponada con fosfato y las celulas se expusieron a 5-7 mJ/cm2 de UVB. Esta exposicion se aplico tres veces a la semana con al menos 24 horas entre las exposiciones.

Las celulas se cultivaron durante 3 semanas como se ha descrito anteriormente. Durante este tiempo, el grupo de envejecimiento intrmseco mas extrmseco paso por 3 duplicaciones de poblacion y 9 exposiciones a UVB. Al final del penodo de tres semanas, el medio de cultivo celular y las celulas se recogieron 48 horas despues del ultimo cambio de medio. Las celulas se enjuagaron con solucion salina tamponada con fosfato para separar cualquier material residual de ensayo y luego se anadieron a cada uno de los pocillos 200 |jL de tampon de lisis (EDTA 1 mM, Triton X- 100 al 0,5%, NaF 10 mM, NaCl 150 mM, p-glicerofosfato 20 mM, DTT 1 mM, 10 jg/mL de leupeptina, 10 jg/mL de pepstatina, 3 jg/mL de aprotinina preparada en solucion salina tamponada con fosfato). Las celulas se incubaron durante aproximadamente 15 minutos en hielo para permitir una lisis completa. Los lisados se recogieron a continuacion y se almacenaron a -75°C hasta su analisis.

Protocolo de matriz de metilacion

El chip de matriz de metilacion de CpG del ADN es de Agilent y cubre 27.627 islas CpG. Para la matriz, ADN genomico total (5 jg) fue aislado de fibroblastos in vitro, y luego se cortaron en fragmentos (aproximadamente 400 a 800 bases de longitud). A partir de esta muestra de 5 jg de ADN genomico cortado, se separo 1 jg de ADN genomico total, mientras que los 4 jg restantes se utilizaron para aislar ADN metilado. El ADN metilado se separo utilizando inmunoprecipitacion con un anticuerpo espedfico para ADN metilado. El 1 jg de ADN genomico total y el ADN metilado fueron entonces marcados por fluorescencia y se aplico a la matriz de metilacion del ADN. Despues de hibridar, se escaneo la matriz y se determino entonces la intensidad de fluorescencia de las caractensticas de la matriz. Los valores para todos los sitios CpG en todos los promotores de genes se promediaron para determinar la media. Los resultados se resenan en la Fig. 3.

Los datos en la Fig. 3 demuestran que la aplicacion topica de 2% del medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz muestra una reduccion en la metilacion global de CpG en la region de promotor en fibroblastos intrmseca y extrmsecamente envejecidos en comparacion con celulas similares sin tratamiento.

Ejemplo 5

La metilacion media de CpG en el promotor de colageno 1A1 en fibroblastos cultivados in vitro disminuye con la aplicacion de medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz ozonizado del Ejemplo 1

Uno de los genes que ha incrementado la metilacion del promotor durante el envejecimiento es colageno 1A1 (Takatsu et al., 1999). Este ejemplo ilustra que la aplicacion de 2% de medios nutrientes acondicionados de meristemo de arroz del Ejemplo 1 a fibroblastos cultivados in vitro provoco que las celulas tuvieran un nivel disminuido de metilacion en el promotor del gen de colageno 1A1 en comparacion con celulas similares sin tratamiento. El ensayo se realizo tal como se ha descrito anteriormente. Los niveles de metilacion en todos los sitios CpG en el promotor de colageno 1A1 se promediaron y se encontro la media. Los resultados se resenan en la Fig. 4.

Los datos en la Fig. 4 demuestran que la aplicacion topica de 2% de medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz del Ejemplo 1 demuestra una reduccion en la metilacion de CpG del ADN en el promotor del gen de colageno 1A1 en celulas que han sido envejecidas intrmseca y extrmsecamente comparadas con celulas similares sin tratamiento.

Ejemplo 6

La metilacion media de CpG en el promotor de colageno 1A2 en fibroblastos cultivados in vitro disminuye con la aplicacion de medios nutrientes acondicionados de meristemo de arroz ozonizado del Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra que la aplicacion de 2% de medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz a celulas de fibroblastos cultivadas in vitro provoco que las celulas tuvieran un nivel disminuido de metilacion en el promotor del gen de colageno 1A2. El ensayo se realizo como se ha descrito anteriormente. Los niveles de metilacion en todos los sitios CpG en el promotor de colageno 1A2 se promediaron y se encontro la media. Los resultados se resenan en la Fig. 5.

Los datos en la Fig. 5 demuestran que la aplicacion topica de 2% de medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz del Ejemplo 1 demuestra una reduccion en la metilacion de CpG del ADN en el promotor del gen de colageno 1A2 en celulas que han sido envejecidas intrmseca y extrmsecamente comparadas con celulas similares cultivadas

Ejemplo 7

Los niveles de proteina de colageno en fibroblastos cultivados in vitro aumentan con la aplicacion de medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz ozonizado del Ejemplo 1

5 Este ejemplo ilustra que la aplicacion de 2% de medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz a celulas de fibroblastos in vitro provocaron que las celulas aumentaran su produccion de colageno. Las celulas se cultivaron y se trataron como arriba. El ensayo de colageno se realizo tanto en muestras de medios recogidas a las 24 horas como en medios recogidos en el instante de 48 horas. Para el ensayo, se preparo una serie de patrones de peptidos C de tipo I que oscilaban entre 0 ng/mL y 640 ng/mL. A continuacion, se preparo una microplaca ELISA separando 10 cualesquiera tiras innecesarias del marco de la placa seguido de la adicion de 100 pl de anticuerpo peptfdico de tipo I-C anti-procolageno marcado con peroxidasa a cada uno de los pocillos utilizados en el ensayo. Despues se anadieron veinte (20) pL de cualquiera de las muestras (medio de cultivo de tejido recogido) o patron a los pocillos apropiados y la microplaca se cubrio y se dejo incubar durante 3 ± 0,25 horas a 37°C. Despues de la incubacion, los pocillos fueron aspirados y lavados tres veces con 400 pL de tampon de lavado. Despues de retirar el ultimo lavado, 15 se anadieron 100 pL de disolucion de sustrato de peroxidasa (peroxido de hidrogeno + tetrametilbencidina como cromogeno) a cada uno de los pocillos y la placa se incubo durante 15±5 minutos a temperatura ambiente. Despues de la incubacion, se anadieron 100 pL de disolucion de parada (acido sulfurico 1 N) a cada uno de los pocillos y se leyo la placa utilizando un lector de microplacas a 450 nm. Los resultados se resenan en la Fig. 6.

Los datos en la Fig. 6 demuestran que la aplicacion topica de 2% de medio nutriente acondicionado de meristemo de 20 arroz del Ejemplo 1 demuestra un aumento en el colageno de Tipo 1A en celulas que han sido envejecidas intrmseca y extrmsecamente comparadas con celulas semejantes cultivadas sin tratamiento.

Ejemplo 8

Los niveles de proteina dermatopontina en fibroblastos cultivados in vitro aumentan con la aplicacion de medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz ozonizado del Ejemplo 1

25 Este ejemplo ilustra que la aplicacion de 2% de medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz del Ejemplo 1 a celulas de fibroblastos cultivadas in vitro provoco que las celulas aumentaran su produccion de dermatopontina. Las celulas se cultivaron y se trataron como anteriormente. Los niveles de proteina dermatopontina se ensayaron utilizando inmunotransferencia.

Transferencia de Microfiltracion de Lisado de Celulas e Inmunodeteccion

30 Se equilibro una membrana en solucion salina tamponada con Tris (TBS: Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) y se ensamblo en un aparato de microfiltracion Bio-Dot. Despues del ensamblaje, se anadieron 200 pL de TBS a cada uno de los pocillos utilizados en el Bio-Dot y se aplico vado para asegurar que hubiera un flujo adecuado a traves de todos los pocillos. A continuacion, se asigno a cada una de las muestras de lisado de celulas (aproximadamente 5 pg) un pocillo en el aparato y se aplico al pocillo apropiado. Las muestras se filtraron en bajo vado. Se anadio TBS a 35 los pocillos a los que no se asigno una muestra para asegurar que la membrana no se secara durante el proceso. Al final del proceso de transferencia, se aplicaron 200 pL adicionales de TBS y se filtro a traves de cada uno de los pocillos. La membrana se retiro entonces del aparato Bio-Dot, se lavo en tBs durante 5-10 minutos y despues se coloco en disolucion de bloqueo (solucion salina tamponada con Tris [Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, leche en polvo sin grasa al 0,1%]) y se dejo incubar durante al menos 1 hora a temperatura ambiente en una plataforma 40 oscilante.

Incubacion y Deteccion de Anticuerpos

Despues de bloquear, la membrana se transfirio a 20 mL de TBST (TBS con Tween-20 al 0,1%) y leche en polvo sin grasa al 0,1% con una dilucion apropiada del anticuerpo de deteccion y se dejo incubar durante la noche a 4°C en una plataforma oscilante. Despues de esta incubacion, la membrana se lavo 3 veces (1 vez durante 15 minutos y 2 45 veces durante 5 minutos) en TBST. El anticuerpo secundario (conjugado con un fluoroforo) se incubo entonces con la membrana en 15 mL de TBST con leche en polvo sin grasa al 0,1% durante 1 hora a temperatura ambiente y despues se lavo 3 veces con TBS (1 vez durante 15 minutos, 2 veces durante 5 minutos).

Despues del lavado final, la membrana se coloco en un aparato BioRad Molecular Imager FX y se escaneo utilizando una combinacion de laser de excitacion y filtro de emision apropiada para el fluoroforo. Las imagenes 50 producidas por el escaner se analizaron a continuacion utilizando el software de analisis de imagenes ImageJ. Los resultados se resenan en la Fig. 7.

Los datos en la Fig. 7 demuestran que la aplicacion topica de 2% de medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz del Ejemplo 1 provoco un aumento significativo en la expresion de dermatopontina en celulas envejecidas frente a celulas no tratadas cultivadas bajo condiciones similares.

Ejemplo 9

Emulsiones de aceite en agua

El medio nutriente acondicionado de meristemo de arroz del Ejemplo 1 ("cultivo de arroz") se formulo en una emulsion de aceite en agua utilizando la siguiente formulacion y procedimiento:

5 Emulsion de Aceite en Agua que contiene Extracto del Ejemplo 1

Ingrediente

Nomenclatura INCI %

Agua

Agua

c.s.

Versene 100

EDTA Tetrasodico 0,10

Glicerina

Glicerina

2,00

Carbopol Ultrez 10

Carbomero 0,20

Brookswax D

Alcohol Ceteanlico y Ceteareth-20 2,00

Liquiwax DIADD **

Dodecanodioato de Dioctildodecilo 5,00

Loronate TMP-TC

Tricaprilato / Tricaprato de Trimetilolpropano 2,00

Arlacel 60

Estearato de Sorbitan 1,50

Alcohol Esteanlico

Alcohol Esteanlico

0,20

Alcohol Cetilico

Alcohol Cetilico

0,50

Acido Estearico

Acido Estearico

0,50

Myritol 318

Triglicerido Capnlico / Caprico 2,00

DC 200/100 cst

Dimeticona 0,75

Agua

Agua

5,00

TEA 99

Trietanolamina 0,25

Cultivo de Arroz del Ejemplo 1

- 1,00

Mikrokill COS

Fenoxietanol y Caprilil-Glicol y Clorofenesina 0,75

Procedimiento:

Combinar la fase A y calentar a 75 °C. Mezclar hasta que sea uniforme.

Combinar la fase B y calentar a 75 °C. Mezclar hasta que sea uniforme.

10 Con mezcladura lenta, anadir la Fase B a la Fase A. Mezclar durante 20 minutos.

Agregar la Fase C de Premezcla y mezclar hasta que sea uniforme. Desconectar el calor.

En la caldera pre-mezclar la Fase D y agregar a la tanda por debajo de 40 °C. Mezclar hasta que sea uniforme. Anadir Mikrokill COS y fragancia de la Fase E, y mezclar hasta que sea uniforme.

Ejemplo 10

15 Emulsiones de agua en aceite

El cultivo de arroz del Ejemplo 1 se formulo en emulsiones de agua-en-aceite utilizando la siguiente formulacion y proceso:

Agua en Emulsion de Aceite que contiene medios nutrientes acondicionados de meristemo de arroz

Ingrediente

Nomenclatura INCI %

Agua

Agua

c.s. hasta 100

Glicerina

Glicerina

3,00

Cloruro Sodico

Cloruro Sodico

1,00

Cultivo de Arroz del Ejemplo 1

1,00

Mikrokill COS

Fenoxietanol y Caprilil-Glicol y Clorofenesina 0,75

SF1328

Ciclometicona y Dimeticona Copoliol 10,00

SF 1202

Ciclometicona 8,50

Gel Base Sil

Ciclometicona y Dimeticona 1,50

Gel Base BSM-PE

Ciclometicona y Dimeticona y Fenil-Trimeticona y Polietileno 1,50

100,00

Procedimiento:

Mezclar todos los ingredientes de la Fase A juntos.

5 Combinar los ingredientes de la Fase B en el orden indicado, mezclando a fondo cada uno de los componentes hasta homogeneizar antes de agregar los siguientes ingredientes.

Anada lentamente la Fase A a la Fase B con una buena mezcladura. Gradualmente, aumentar la agitacion hasta una alta cizalladura a medida que la mezcla se espesa. Continuar la agitacion durante 10 minutos.

Ejemplo 11

10 Composiciones de gel de ojos

El cultivo de arroz del Ejemplo 1 se encapsulo en una composicion liposomica, a continuacion el extracto encapsulado se incorporo en una composicion de gel para los ojos utilizando el siguiente proceso:

GEL DE OJOS que contiene liposoma de medios nutrientes acondicionados con meristemo de arroz

Ingrediente

Nomenclatura INCI %

Agua

Agua

c.s.

Carbopol Ultrez 21

Polfmero Cruzado de Acrilatos/Acrilato de Alquilo C10- 30 0,50

Keltrol CG-SFT

Goma xantano 0,10

Butilenglicol

Butilenglicol

5,00

Mikrokill COS

Fenoxietanol y Caprilil-Glicol y Clorofenesina 1,00

Tensioactivo Dow Corning 193

Dimeticona Copoliol 0,30

EDTA Disodico

EDTA Disodico

0,10

AMP 95

Aminometilpropanol 0,45

Cultivo de arroz que contiene liposomas del Ejemplo 1

1,00

1. Dispersar el Carbopol Ultrez 21 en agua a 50 °C y anadir el Keltrol CG-SFT. Mezclar hasta que sea uniforme.

2. Anadir el Butilenglicol, Mikrokill COS, AMP, EDTA y Silicona 193. Mezclar hasta que sea uniforme.

3. Anadir el liposoma de medios nutrientes acondicionados con meristemo de arroz con agitacion de barrido a 40 °C. 5 Mezclar hasta que sea uniforme.

5. Ajustar el pH a 5,5, si es necesario.

Ejemplo 12

Extracto Encapsulado del Ejemplo 1

El cultivo de arroz del Ejemplo 1 se encapsulo en una matriz polimerica utilizando las tecnicas descritas en la 10 Publicacion de la Solicitud de Patente de EE.UU. N° 2003/0198682 A1.

Ejemplo 13

Composiciones de Lapiz Labial

El cultivo de arroz del Ejemplo 1 se encapsulo en la matriz polimerica del Ejemplo 12, que luego se formulo en un lapiz labial utilizando la siguiente formulacion y procedimiento:

15 LAPIZ LABIAL que contiene medio nutriente acondicionado con meristemo de arroz

Ingrediente

Nomenclatura INCI %

Fase (A)

Aceite de Ricino

Aceite de Semillas de Ricinus Communis (Ricino) 31,45

Schercemol TISC

Citrato de triisoestearilo 15,00

Liquiwax PolyIPL

Dilinoleato Dfmero de Estearil-PPG-3-Miristil-Eter 5,00

Liquiwax PolyEFA

Dilinoleato Dfmero de Octildecil-PPG-3-Miristil-Eter 15,00

Cera de Candelilla

Cera de Euphorbia Cerifer (Candelilla) 6,00

Ozokerite 170D

Ozoquerita 2,50

Microwax SP 19

Cera Microcristalina 3,50

Cera de Carnauba

Cera de Copernicia cerifera (carnauba) 1,50

Metilparabeno

Metilparabeno

0,20

Propilparabeno

Propilparabeno

0,10

Fase (B)

Mezcla de Colores

Rojo 7 Lago c19-7711

Rojo 7 Lago 0,04

Rojo 6 Lago c 19-7712

Rojo 6 Lago 0,17

Oxido de Hierro Rojo A-1205

Oxidos de Hierro 2,00

Dioxido de Titanio Ultra-Fino 70110

Dioxido de Titanio 2,00

Oxido de Hierro Negro c33-134

Oxidos de Hierro 0,05

Liquiwax PolyEFA *

Dilinoleato Dfmero de Octildodecil-PPG-3-Miristil-Eter 4,44

Fase (C)

Palmitato de Ascorbilo

Palmitato de Ascorbilo

0,05

Rojo Flamenco

Mica y Dioxido de Titanio 10,00

Cultivo de arroz en polvo del Ejemplo 12

-- 1,00

Combinar Ceras, Aceites y Conservantes (Fase A) y calentar a 83-87 °C.

Mantener la temperatura y agitar hasta que sea homogeneo.

Bajar la temperatura a 75-80 °C y agregar la Fase B; mezclar hasta que sea homogeneo 5 Agregar Perla, medios nutrientes acondicionados de meristemo de arroz y Palmitato de Ascorbilo (Fase C).

Verter en moldes.

Ejemplo 14

Composiciones tonificantes

El cultivo de arroz del Ejemplo 1 se formulo en un tonico alcoholico acuoso utilizando la siguiente formulacion y 10 procedimiento:

Tonificador que contiene medios nutrientes acondicionados de meristemo de arroz

Ingrediente

Nomenclatura INCI %

Agua

Agua

c.s. hasta 100

Betafin BP - 20 *

Betama 3,00

Cultivo de Arroz del Ejemplo 1

-- 1,00

Hamamelis con 14% de alcohol

Agua y Etanol y Hamamelis 25,00

Mikrokill COS

Fenoxietanol y Caprilil-Glicol y Clorofenesina 0,75

Procedimiento:

1. Cargar Agua y anadir Betafin BP-20 y medios nutrientes acondicionados de meristemo de Arroz. Mezclar hasta que sea uniforme.

15 2. Agregue Hamamelis y Mikrokill COS, mezclar hasta que sea uniforme.

Ejemplo 15

Composiciones de lavado corporal

El cultivo de arroz del Ejemplo 1 se formulo en un lavado corporal utilizando la siguiente formulacion y procedimiento.

20 Lavado Corporal que contiene medios nutrientes acondicionados de meristemo de Arroz

Ingrediente

Nomenclatura INCI %

Agua

Agua

c.s.

Hamp-ene Na2

EDTA Disodico 0,10

Glicerina

Glicerina

2,00

Standapol WAQ-Special

Lauril-Sulfato de Sodio 30,00

Standapol ES-2

Laureth-Sulfato de sodio 25,00

Cerasynt IP

Estearato de Glicol y Acido Estearico y Aminometil-Propanol 0,50

Velvetex BA-35

Cocoamidopropil-Betama 7,00

Cocamide MEA

Cocamida MEA 2,00

Mikrokill COS

Fenoxietanol y Caprilil-Glicol y Clorofenesina 0,75

Cultivo de Arroz del Ejemplo 1

1,00

1. Calentar Agua a 70 °C y agregar EDTA Disodico, Glicerina, y mezclar hasta que sea uniforme.

2. Mantener la temperature por encima de 70 °C y agregar Standapol WAQ Special, Standapol ES-2, Cerasynt IP, 5 Cocamida MEA, Velvetex BA-35, y mezclar hasta que sea uniforme.

3. Enfriar a 45 °C y anadir Mikrokill COS y extracto de naranja Osage.

4. Mezclar hasta que sea homogeneo.

Ejemplo 16

Levadura/Ejemplo 1 Extracto de productos de fermentacion

10 El cultivo de arroz del Ejemplo 1 se incluyo como parte de medios de fermentacion que conternan la levadura Saccharomyces cerevisiae. Una muestra del extracto del Ejemplo 1 se dispuso en una mezcla acuosa de medios de cultivo de levaduras de Baker, obtenido de Red Star Yeast (Milwaukee, WI). Los medios se inocularon con un cultivo de levadura de Saccharomyces cerevisiae activo, tambien obtenidos de Red Star y la mezcla se dejo fermentar bajo condiciones aerobias controladas para proporcionar un Derivado de Celula de Levadura Vivo (LYCD) obtenido al 15 utilizar condiciones de estres tal como se describe en patente de EE.UU. 2.239.345.

Ejemplo 17

Concentrados en emulsion sub-micronicos

Este ejemplo ilustra un concentrado en emulsion sub-micronico que contiene cultivo de arroz preparado como se

describe en el Ejemplo 1.

Ingrediente % en peso

Tricaprilato/tricaprato de trimetilolpropano 18,0 Glicerina 8,0

Alcohol ceteanlico 2,0

Ceteareth 20 2,0

Estearato de glicerilo 2,0

BHT 0,01

Cultivo de arroz del Ejemplo 1 1,0

Agua hasta 100,0

20 Referencias

Ball MP, Li JB, Gao Y, Lee JH, LeProust EM, Park IH, Xie B, Daley GQ, Church GM (2009) Targeted and genome- scale strategies reveal gene-body methylation signatures in human cells. Nat Biotechnol 27(4): 361-368.

Bird A, Taggart M, Frommer M, Miller OJ, Macleod D (1985) A fraction of the mouse genome that is derived from islands of nonmethylated, CpG-rich DNA. Cell 40: 91-99.

25 Bird A (2002) DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev 16: 6-21.

Boks MP, Derks EM, Weisenberger DJ, Strengman E, Janson E, Sommer IE, Kahn RS, Ophoff RA. (2009) The relationship of DNA methylation with age, gender and genotype in twins and healthy controls. PLoS One. 4(8): e6767.

Cropley JE, Suter CM, Beckman KB, Martin DI (2006) Germ-line epigenetic modification of the murine A vy allele by 30 nutritional supplementation. Proc Natl Acad Sci 103: 17308-17312. Deng J, Shoemaker R, Xie B, Gore A, LeProust

EM, Antosiewicz-Bourget J, Egli D, Maherali N, Park IH, Yu J, et al. (2009) Targeted bisulfate sequencing reveals changes in DNA methylation associated with nuclear reprogramming. Nat Biotechnol 27: 353-360.

5

10

15

20

25

Feng YQ, Desprat R, Fu H, Olivier E, Lin CM, et al. (2006) DNA methylation supports intrinsic epigenetic memory in mammalian cells. PLoS Genet 2: e65.

Fraga MF, Ballestar E, Paz MF, Ropero S, Setien F, et al. (2005) Epigenetic differences arise during the lifetime of monozygotic twins. Proc Natl Acad Sci 102: 10604-10609.

Gopisetty G, Ramachandran K, Singal R (2006) DNA methylation and apoptosis. Mol Immunol 43: 1729-1740.

Herskind AM, McGue M, Holm NV, Sorensen TI, Harvald B, Vaupel JW (1996) The heritability of human longevity: a population-based study of 2872 Danish twin pairs born 1870-1900. Hum Genet 97: 319-323.

Metivier R, Gallais R, Tiffoche C, Le PC, Jurkowska RZ, et al. (2008) Cyclical DNA methylation of a transcriptionally active promoter. Nature 452: 45-50.

Mitchell BD, Hsueh WC, King TM, Pollin TI, Sorkin J, Agarwala R, Schaffer AA, Shuldiner AR (2001) Heritability of life span in the old order Amish. Am J Med Genet 102: 346-352.

Ottaviano YL, Issa JP, Parl FF, Smith HS, Baylin SB, et al. (1994) Methylation of the estrogen receptor gene CpG island marks loss of estrogen receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Res 54: 2552-2555.

Poulsen P, Esteller M, Vaag A, Fraga MF (2007) The epigenetic basis of twin discordance in age-related diseases. Pediatr Res 61: 38R-42R.

Rakyan VK, Chong S, Champ ME, Cuthbert PC, Morgan HD, et al. (2003) Transgenerational inheritance of epigenetic states at the murine Axin(Fu) allele occurs after maternal and paternal transmission. Proc Natl Acad Sci USA 100: 2538-2543.

Saxonov S, Berg P, Brutlag DL (2006) A genome-wide analysis of CpG dinucleotides in the human genome distinguishes two distinct classes of promoters. Proc Natl Acad Sci USA 103: 1412-1417.

Takatsu M, Uyeno S, Komura J, Watanabe M, Ono T (1999) Age-dependent alterations in mRNA level and promoter methylation of collagen alpha1(I) gene in human periodontal ligament. Mech Ageing Dev 110: 37-48.

Takai D, Jones PA (2002) Comprehensive analysis of CpG islands in human chromosomes 21 and 22. Proc Natl Acad Sci USA 99(6): 3740-3745.

Weaver IC, Meaney MJ, Szyf M (2006) Maternal care effects on the hippocampal transcriptome and anxiety- mediated behaviors in the offspring that are reversible in adulthood. Proc Natl Acad Sci USA 103: 3480-3485.

Claims (16)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion topica para controlar la metilacion del ADN en celulas de la piel humana, que comprende:

   (a) un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal, que es un extracto de la suspension de celulas de meristemo vegetal derivado de las plantas del genero Oryza,

   (b) un conservante presente en una cantidad suficiente para proporcionar una eficacia esterilizante o bioestatica con respecto al componente (a); y

   (c) un veldculo dermatologicamente aceptable.
2. 2. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el componente (a) esta presente en una cantidad de 0,0000001% a 99% en peso de la composicion, prefiriendose 0,0001% a 50% y siendo mas preferido 0,001% a 25% y siendo lo mas preferido 0,01% a 10%, el componente (b) esta presente en una cantidad de 0,01% a 10% en peso de la composicion, siendo mas preferida de 0,1% a 5% y siendo mas preferida de 0,4% a 2%, y el componente (c) esta presente en una cantidad de 1% a 98% en peso de la composicion, siendo el mas preferido 80% a 90%.
3. 3. La composicion de la reivindicacion 1 o 2, en donde el componente (a) se deriva de plantas de Oryza sativa.
4. 4. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el componente (a) ha sido preparado (i) cultivando meristemos vegetales derivados de las plantas del genero Oryza en un medio nutriente lfquido para producir una mezcla que contiene componentes solubles en agua e insolubles en agua, y (ii) separar los componentes insolubles en agua, produciendo con ello el medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal.
5. 5. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las celulas de meristemo vegetal han sido cultivadas en un medio nutriente lfquido en presencia de tensiones qmmicas, gaseosas o energeticas destinadas a provocar la expresion de metabolitos de celulas vegetales secundarios.
6. 6. La composicion de la reivindicacion 5, en donde las celulas de meristemo vegetal han sido cultivadas en un medio nutriente lfquido en presencia de ozono.
7. 7. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el conservante se selecciona del grupo que consiste en acido salicilico, acido sorbico, fenoxietanol, alcohol bendlico, etanol, Quaternium-15, glucosa oxidasa y lactoperoxidasa en combinacion con un sustrato, y combinaciones de los mismos.
8. 8. La composicion de la reivindicacion 7, en donde el conservante es fenoxietanol.
9. 9. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el conservante esta presente en una cantidad de al menos 0,5% en peso, basado en el peso total de la composicion.
10. 10. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende, ademas, al menos un ingrediente seleccionado del grupo que comprende agua, tensioactivos, emulsionantes, acondicionadores, emolientes, ceras, aceites, polfmeros, espesantes, fijadores, colorantes, humectantes, hidratantes, estabilizadores, diluyentes, disolventes, fragancias, agentes botanicos, nutraceuticos, cosmeceuticos, terapeuticos, farmaceuticos, antifungicos, antimicrobianos, hormonas esteroides, agentes anticaspa, componentes anti-acne, protectores solares, conservantes y combinaciones de los mismos.
11. 11. Un concentrado de composicion que comprende:

    (a) un medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal que es un extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal y se deriva de las plantas del genero Oryza, y

    (b) un conservante presente en una cantidad suficiente para proporcionar una eficacia esterilizante y bioestatica con respecto al componente (a),

    en donde el componente (a) esta presente en una cantidad de 0,0000001% a 99% en peso del concentrado de la composicion, prefiriendose 90% a 99% y siendo mas preferido 97% a 99%, y el componente (b) esta presente en una cantidad de 0,01% a 10% en peso del concentrado de la composicion, prefiriendose 0,1% a 5% y siendo lo mas preferido 0,4% a 2%.
12. 12. El concentrado de composicion de la reivindicacion 11, en donde el componente (a) se deriva de plantas de Oryza sativa.
13. 13. Un procedimiento para preparar la composicion de la reivindicacion 1, que comprende las etapas de:

    (i) proporcionar celulas vegetales totipotentes e indiferenciadas derivadas de plantas del genero Oryza;

    (ii) cultivar las celulas vegetales en un medio nutriente lfquido en presencia o ausencia de tensiones qmmicas, gaseosas o energeticas destinadas a provocar la expresion de metabolitos de celulas vegetales

    18

    10

    secundarios para producir una mezcla que contiene componentes solubles en agua e insolubles en agua,

    (iii) separar los componentes insolubles en agua para producir el medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal que es un extracto de suspension de celulas de meristemo vegetal y

    (iv) combinar el medio nutriente acondicionado de meristemo vegetal con un conservante y un vehnculo dermatologicamente aceptable, haciendo de este modo la composicion de la reivindicacion 1.
14. 14. El procedimiento de la reivindicacion 13, en el que las celulas vegetales de la etapa (i) se derivan de plantas de

    Oryza sativa.
15. 15. El procedimiento de la reivindicacion 13 o 14, en el que las celulas vegetales se cultivan en presencia de ozono

    en la etapa (ii).
16. 16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que las celulas vegetales de la etapa (i) se

    preparan mediante un metodo, que comprende:

    (1) hacer crecer meristemos vegetales derivados de las plantas del genero Oryza en un medio nutriente solido; y

    (2) seleccionar cultivos estabilizados, produciendo de este modo dichas celulas vegetales.