CN106069786A - 一种在桉树组织培养中抗褐化和促进不定芽分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在桉树组织培养中抗褐化和促进不定芽分化的方法；具体是切取尾叶桉无菌苗下胚轴做外植体，接种在愈伤组织诱导培养基，暗培养一段时间，取出浸泡在10～50μmol/L的二甲基硫脲溶液中一段时间，后取出转移至新的愈伤组织诱导培养基上诱导不定芽生长。二甲基硫脲处理后尾叶桉胚性愈伤组织的比例可达34.7%，白色愈伤组织比例可达40.8%，褐化比例为24.5%；相同的培养基中如果不添加二甲基硫脲，褐化比例高达45.1%，胚性愈伤组织的比例仅13.7%，白色愈伤组织比例为25.5%；其中20μmol/L二甲基硫脲处理得到的胚性愈伤组织不定芽分化率为92.3%；本发明将显著提高桉树转基因操作的转化率，为建立桉树高效遗传转化体系奠定了基础。

Description

一种在桉树组织培养中抗褐化和促进不定芽分化的方法

技术领域

本发明涉及组织培养技术领域，更具体地，涉及一种在桉树组织培养中抗褐化和促进不定芽分化的方法。

背景技术

桉树原产澳大利亚，是桃金娘科（Myrtaceae）桉属（Eucalyptus）植物的统称，有900多个种、亚种和变种。由于桉树具有耐干旱、耐瘦瘠、适应性广、生长速度快、轮伐期短、用途广泛、经济效益高等诸多优点，被公认为三大人工林树种之一。目前，中国桉树人工林面积已达368万hm²，且每年新营造桉树林达10万hm²。尾叶桉（Eucalyptus Urophylla）具备树干通直、林相整齐、木材蓄积量高等特点，是华南地区的主要人工林树种之一。同时，也是繁育优良杂交树种尾巨桉或巨尾桉的亲本。

随着新品种的引入和人工林面积的扩大，桉树生产必需解决好提高木材蓄积量、改良材质、增强病虫害抗性等诸多问题，以促进桉树产业的可持续发展。高效再生体系的建立是桉树分子育种和优良种质快繁推广的前提和基础。但桉树为木本植物，细胞中酚类物质含量高、组织培养时外植体极易褐变致死。

褐化分为两种情况：一是不利条件造成外植体细胞的死亡，二是酚类物质在多酚氧化酶催化下氧化为醌类物质。外植体的基因型、大小、消毒剂的类型和消毒时间、培养基成分、培养条件都会影响到外植体是否发生褐化和褐化程度。使用抗氧化剂如抗坏血酸、柠檬酸等或吸收剂如聚乙烯吡咯烷酮、活性炭能有效的减轻外植体的褐化；调整基本培养基的各种组分可减轻褐化；过高浓度的细胞分裂素和生长素有可能刺激外植体的褐化；现有技术缺乏针对桉树组织培养时抑制褐化的物质和有效的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种在桉树组织培养中抗褐化和促进不定芽分化的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

二甲基硫脲在桉树组织培养中抗褐化和促进不定芽分化中的应用。

优选地，所述二甲基硫脲的浓度为10～50μmol/L。

更优选地，所述二甲基硫脲的浓度为10～30μmol/L。

最优选地，二甲基硫脲的浓度为20μmol/L。

本发明还提供一种在桉树组织培养中抗褐化和促进不定芽分化的方法，是选取桉树的下胚轴作为外植体，将外植体接种于愈伤组织诱导培养基上暗培养一段时间，取出浸泡在10～50μmol/L的二甲基硫脲溶液中一段时间，后取出转移至新的愈伤组织诱导培养基上诱导不定芽生长。

这里暗培养的目的是为了产生愈伤组织，暗培养7～9 d 后外植体伤口处刚好开始膨大，此时刚好处于脱分化的时期，选择在这个时间段处理效果会更好，因此，优选地，所述外植体在愈伤组织诱导培养基上暗培养的时间为7～9 d；更优选地，所述外植体在愈伤组织诱导培养基上暗培养的时间为7d。

研究中发现，愈伤组织诱导培养基的组成对褐化效果由影响，优选地，所述愈伤组织诱导培养基是在1/2MS培养基中，添加10～20 g·L^-1蔗糖、7～8 g·L^-1琼脂、80～120mg·L^-1 Vc、3.42～4.56 μmol·L^-1 PBU、0～0.57 μmol·L^-1 6-BA、0.29～0.68 μmol·L^-1 IAA、3.06～6.12 mmol·L^-1 Ca²⁺；pH为5.8～6.0。

最优选地，添加10 g·L^-1蔗糖、7 g·L^-1琼脂、100 mg·L^-1 Vc、3.99 μmol·L^-1 PBU、0.57 μmol·L^-1 6-BA、0.57μmol·L^-1 IAA、6.12 mmol·L^-1 Ca²⁺；pH为5.8～6.0。

培养基中采用1/2MS的盐浓度、降低蔗糖浓度对减轻褐化有一定的帮助；调整PBU、6-BA和IAA的比例为7：1：1对愈伤组织分化和减轻褐化有一定的帮助；6.12 mmol·L^-1 Ca²⁺浓度有利于胚性愈伤组织的形成。

优选地，本发明所述方法中，在二甲基硫脲中的浸泡时间为30～60min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明应用二甲基硫脲在桉树组织培养中有效地起到了抗褐化和促进不定芽分化的作用；具体是切取尾叶桉无菌苗下胚轴做外植体，接种在愈伤组织诱导培养基，暗培养一段时间，取出浸泡在10～50μmol/L的二甲基硫脲溶液中一段时间，后取出转移至新的愈伤组织诱导培养基上诱导不定芽生长。二甲基硫脲处理后尾叶桉胚性愈伤组织的比例可达34.7%，白色愈伤组织比例可达40.8%，褐化比例达24.5%；相同的培养基中如果不添加二甲基硫脲，褐化比例高达45.1%，胚性愈伤组织的比例仅13.7%，白色愈伤组织比例为25.5%；其中 20μmol/L二甲基硫脲处理得到的胚性愈伤组织不定芽分化率为92.3%。

附图说明

图1为尾叶桉愈伤组织，其中，图1A为尾叶桉无菌苗；图1B为愈伤组织；图1C为已分化出不定芽的胚性愈伤组织。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。

实施例1

1、外植体的获取：将尾叶桉种子消毒后播种到MS培养基，25℃暗处进行萌发，7天后切取尾叶桉无菌苗0.8cm长的下胚轴作外植体。

2、将外植体接种在愈伤组织诱导培养基，愈伤组织诱导培养基配方：1/2MS + 10g·L^-1蔗糖 + 7 g·L^-1琼脂+ 100 mg·L^-1 Vc + 3.99 μmol·L^-1 PBU + 0.57 μmol·L^-1 6-BA + 0.57μmol·L^-1 IAA + 6.12 mmol·L^-1 Ca²⁺ ，pH为5.8～6.0，暗培养7d后取出。

3、二甲基硫脲处理：将在愈伤组织诱导培养基中暗培养后取出的外植体浸泡在20μmol·L^-1 二甲基硫脲溶液中30min，取出再次转移到新的愈伤组织诱导培养基。

4、外植体分化情况统计：外植体在新的愈伤组织诱导培养基上培养，培养条件：25±2℃，12小时光照/12小时黑暗的光周期，光照强度为 50μmol m^-2 s^-1；培养42 天后，统计愈伤组织生长情况，培养63天后统计不定芽诱导情况。

实施例2

实验方法同实施例1，唯一不同的是：本实施例的方法不含步骤3。

实施例3

实验方法同实施例1，唯一不同的是：步骤3中二甲基硫脲的浓度为10μmol·L^-1。

实施例4

实验方法同实施例1，唯一不同的是：步骤3中二甲基硫脲的浓度为30μmol·L^-1。

实施例5

实验方法同实施例1，唯一不同的是：步骤3中二甲基硫脲的浓度为50μmol·L^-1。

实施例6

实验方法同实施例1，唯一不同的是：步骤3中二甲基硫脲的浓度为100μmol·L^-1。

将实施例1～6的方法培养的外植体进行统计，结果如表1，由表1可知，能够抗褐化的二甲基硫脲的浓度范围为10～30μmol·L^-1，能够促进不定芽分化的二甲基硫脲的浓度范围为10～30μmol·L^-1。

实施例7

实验方法同实施例1，唯一不同的是，步骤2中外植体在愈伤组织诱导培养基上暗培养的时间为0d。

实施例8

实验方法同实施例1，唯一不同的是，步骤2中外植体在愈伤组织诱导培养基上暗培养的时间为14d。

实施例9

实验方法同实施例1，唯一不同的是，步骤2中外植体在愈伤组织诱导培养基上暗培养的时间为21d。

将实施例1和实施例7～9的方法获得的外植体进行统计，结果如表2，从表2中可以看出，在外植体刚启动分化第7天，愈伤组织的褐化率最低，提前或延后处理其褐化效果会有一定程度的降低。

Claims (5)

1.二甲基硫脲在桉树组织培养中抗褐化和促进不定芽分化中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述二甲基硫脲的浓度为10～50μmol/L。

3.一种在桉树组织培养中抗褐化和促进不定芽分化的方法，其特征在于，选取桉树的下胚轴作为外植体，将外植体接种于愈伤组织诱导培养基上暗培养一段时间，取出浸泡在10～50μmol/L的二甲基硫脲溶液中一段时间，后取出转移至新的愈伤组织诱导培养基上诱导不定芽生长。

4. 根据权利要求3所述的在桉树组织培养中抗褐化和促进不定芽分化的方法，其特征在于，所述外植体在愈伤组织诱导培养基上暗培养的时间为7～9 d。

5. 根据权利要求3所述的在桉树组织培养中抗褐化和促进不定芽分化的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基是在1/2MS培养基中，添加10～20 g·L^-1蔗糖、7～8 g·L^-1琼脂、80～120 mg·L^-1 Vc、3.42～4.56 μmol·L^-1 PBU、0～0.57 μmol·L^-1 6-BA、0.29～0.68 μmol·L^-1 IAA、3.06～6.12 mmol·L^-1 Ca²⁺；pH为5.8～6.0。