CN117187310A - 无花果沙雷氏菌mgs11在生产有机酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了无花果沙雷氏菌MGS11在生产有机酸中的应用，属于微生物技术领域。无花果沙雷氏菌MGS11，其分类命名为Serratia ficaria MGS11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2023年5月26日，保藏编号CCTCCNo:M 2023826，保藏地址：中国武汉武汉大学。MGS11发酵液中检测出了葡萄糖酸、柠檬酸、延胡索酸、苹果酸、琥珀酸、2‑酮基‑D‑葡萄糖酸和2‑Keto‑D‑glularic acid 7种有机酸。MGS11菌剂实验组栓皮栎幼苗的株高、叶干重和根系干重分别提高了7.13％、3.97％、6.1％。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体地说，涉及无花果沙雷氏菌MGS11在生产有机酸中的应用。
背景技术
有机酸是一类对植物生长具有重要影响的化合物。它们可以通过植物的代谢过程产生，也可以从土壤中吸收。有机酸可以促进植物的吸收和利用营养元素。有机酸可以与土壤中的矿物质结贪，形成可溶性的盐类，从而增加了植物对这些矿物质的吸收能力。此外，有机酸还可以促进植物根系的生长和发育.增加根系表面积，从而提高了植物对营养元素的吸收效率。有机酸可以调节植物的生长和发育，可以影响植物的生长素合成和分解，从而调节植物的生长和发育。此外，有机酸还可以影响植物的光合作用和呼吸作用，从而影响植物的生长和发育。有机酸可以提高植物的抗逆性，提高植物的抗氧化能力，从而减轻植物受到的氧化损伤。此外，有机酸还可以促进植物的抗病能力，从而减轻植物受到的病害损害。有机酸对植物生长具有重要影响。
中国专利CN 115725473 A公开的的Serratia sp.JS-043菌株具有优秀的耐受高浓度柠檬酸的能力，可以通过生物转化植物类酸性物质如柑汁、柑渣中的有机酸类化合物，提高其pH值，减少或解除低pH条件对发酵微生物的活性抑制作用，并有效提高了柑汁等酸性有机物的利用效率。杜秉海等获得了一株可以在pH12和10％NaCl中生长的深红沙雷氏菌，通过喷洒该菌的发酵液降解土壤中的蛋白质，增加氨基酸含量，可以改善小麦在盐碱环境下的生长状况。研究有机酸的生物学功能和作用机制，对于提高植物的生产力和抗逆性具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供无花果沙雷氏菌MGS11在生产有机酸中的应用，用于筛选抗逆菌株。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
无花果沙雷氏菌MGS11在生产有机酸中的应用，所述的无花果沙雷氏菌MGS11序列如SEQ ID NO.1所示；其分类命名为Serratia ficaria MGS11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2023年5月26日，保藏编号CCTCCNo:M 2023826，保藏地址：中国武汉武汉大学。
无花果沙雷氏菌MGS11的发酵液在生产有机酸中的应用。
所述有机酸为葡萄糖酸、柠檬酸、延胡索酸、苹果酸、琥珀酸、2-酮基-D-葡萄糖酸、2-Keto-D-glularic acid。
所述无花果沙雷氏菌MGS11的发酵液的制备方法为：取纯化好的菌株接种于LB培养基，28℃，180rpm/min摇培过夜，用无菌LB培养基调节细菌悬液的浓度至其OD值为0.6-0.7；然后将细菌悬液按1％的接种量接种到NBRIP液体培养基中，28℃，180rpm/min摇培2d后，将细菌悬液10000rpm离心10min，用0.22μm滤膜对离心后的上清液进行过滤，制得无花果沙雷氏菌MGS11的发酵液。
无花果沙雷氏菌MGS11在促进栓皮栎株高增加中的应用。
无花果沙雷氏菌MGS11在促进栓皮栎叶干重增加中的应用。
无花果沙雷氏菌MGS11在促进栓皮栎根干重增加中的应用。
无花果沙雷氏菌MGS11的菌剂在促进栓皮栎株高增加中的应用。
无花果沙雷氏菌MGS11的菌剂在促进栓皮栎叶干重增加中的应用。
无花果沙雷氏菌MGS11的菌剂在促进栓皮栎根干重增加中的应用。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
1)本发明的无花果沙雷氏菌MGS11的发酵液中检测出了葡萄糖酸、柠檬酸、延胡索酸、苹果酸、琥珀酸、2-酮基-D-葡萄糖酸和2-Keto-D-glularic acid 7种有机酸，根据峰面积求得菌株MGS11的发酵液中葡萄酸的含量为103.06±5.92μg/mL，柠檬酸含量为25.32±1.02μg/mL，延胡索酸的含量为2.72±0.49μg/mL，苹果酸的含量为18.77±2.35μg/mL，琥珀酸的含量为2.44±0.47μg/mL，2-酮基-D-葡萄糖酸的含量为12848.30±792.77μg/mL，2-Keto-D-glularic acid的含量为348.19±9.81μg/mL。
2)本发明的无花果沙雷氏菌MGS11菌剂实验组栓皮栎幼苗的株高、叶干重和根系干重分别提高了7.13％、3.97％、6.1％。
附图说明
图1为无花果沙雷氏菌MGS11的生长情况图；
图2为无花果沙雷氏菌MGS11的系统发育树图；
图3为无花果沙雷氏菌MGS11的革兰氏染色图；
图4为无花果沙雷氏菌MGS11发酵液中有机酸的定性和定量检测图(A为对照组上清液的色谱图，B为菌株MGS11发酵液上清液的色谱图)；
图5为无花果沙雷氏菌MGS11菌剂对栓皮栎幼苗茎粗、株高、叶干重、根干重的影响图(*为与对照组相比差异达到显著水平P＜0.05)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中如无特殊说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
栓皮栎新鲜根际土取自山东省临沂市平邑县的明光寺林场内(北纬35°34′46″，东经117°50′39″)，所有样品一分为二，一份放到-80℃冰箱中保存，一份用于分离细菌。
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，pH值7.1-7.3。
NBRIP固体培养基：葡萄糖10g，氯化镁5g，结晶硫酸镁0.25g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g，磷酸三钙5g。
NBRIP液体培养基：萄糖10g，氯化镁5g，结晶硫酸镁0.25g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g，磷酸三钙5g，pH值7.2。
实施例1
1、细菌的分离与纯化
称量5g栓皮栎新鲜根际土加到含有20-30颗无菌玻璃珠的45mL TSB培养基中，放到震荡培养箱中，28℃，180rpm/min培养12h，进行菌种富集与活化；取1mL上清液梯度稀释至10-4、10-5、10-6和10-7，分别吸取浓度为10-4、10-5、10-6和10-7的稀释液100μL用涂布棒均匀涂布到TSB固体培养基中；挑取平板上生长状态良好的菌落采用三区划线法在TSB培养基上连续划线，将其纯化5次及以上直到得到纯化后的单菌落。
2、细菌的筛选和鉴定
将纯化的得到的细菌接种到NBRIP固体培养基中，用封口膜将平板封口，28℃倒置培养7d，用直尺测量透明圈的直径D及菌落直径d，计算溶磷指数PSI(PSI＝D/d)。
结果如图1所示，经过筛选得到菌株MGS11，该菌株可以在NBRIP固体平板上产生明显的透明圈，PSI＝2.674±0.196。
用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，采用通用引物27-F(5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492-R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')请提供进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳观察，回收DNA片段送至上海生工生物工程公司完成序列测定，得到无花果沙雷氏菌MGS11的16SrDNA序列，其序列如SEQ ID NO.1所示。将上述序列在EzBioCloud数据库上进行BLAST分析，并且利用MEGA7.0构建系统系统发育树(图2)，测序结果经BLAST比对，鉴定该菌株为无花果沙雷氏菌Serratia ficaria MGS11。
用无菌牙签挑取少量新鲜菌体均匀涂布到滴有一滴生理盐水的载玻片上对无花果沙雷氏菌MGS11进行革兰氏染色，使用油镜观察染色结果(图3)，其生理生化特征如表1所示。
表1 无花果沙雷氏菌MGS11的生理生化特征
| 项目 | 结果 | 项目 | 结果 |
| V-P试验 | + | M.R试验 | - |
| 蔗糖产酸试验 | - | 葡萄糖产酸试验 | - |
| 吲哚试验 | + | 柠檬酸盐利用试验 | + |
| 硝酸盐还原试验 | + | 硫化氢试验 | + |
| 革兰氏染色 | G- |
实施例2
取少量新鲜纯化好的菌株接种于LB培养基，于摇床(28℃，180rpm/min)中摇培过夜，用无菌LB培养基调节细菌悬液的浓度至其OD值为0.6-0.7；然后将细菌悬液按1％的接种量接种到NBRIP液体培养基中，对照组接种等量无菌LB溶液，每种处理设置三组重复；28℃，180rpm/min摇培2d后，将细菌悬液10000rpm离心10min，用0.22μm滤膜对离心后的上清液进行过滤，制得无花果沙雷氏菌MGS11的发酵液。
用超高效液相色谱Waters ACQUITY UHPLC和高分辨质谱Bruker Q-TOF-MS对MGS11发酵液中的有机酸进行定性和定量检测，检测条件如表2所示。以无菌LB培养基溶液作为对照。根据定性检测图谱，选择有机酸的标准品类，配置不同浓度梯度的酸液，绘制标准曲线。根据保留时间及峰面积计算出各种有机酸的含量。
表2有机酸定性定量检测条件
结果如图4所示，菌株MGS11的发酵液中检测出了葡萄糖酸、柠檬酸、延胡索酸、苹果酸、琥珀酸、2-酮基-D-葡萄糖酸和2-Keto-D-glularic acid 7种有机酸，根据峰面积求得菌株MGS11的发酵液中葡萄酸的含量为103.06±5.92μg/mL，柠檬酸含量为25.32±1.02μg/mL，延胡索酸的含量为2.72±0.49μg/mL，苹果酸的含量为18.77±2.35μg/mL，琥珀酸的含量为2.44±0.47μg/mL，2-酮基-D-葡萄糖酸的含量为12848.30±792.77μg/mL，2-Keto-D-glularic acid的含量为348.19±9.81μg/mL。
实施例3
将长相健康、大小相近的栓皮栎种子用1％高锰酸钾进行消毒处理，超纯水冲洗掉种子上残余的高锰酸钾，然后将种子包裹到煮沸消毒后湿纱布里，移置培养箱中(27℃，湿度75，光照12h)催芽，每隔一天洒适量水使纱布保持湿润，等种子冒出约2cm的胚根后，栽种到32孔育苗盘里，半个月后，从育苗盘里挑选长势大体一致的栓皮栎幼苗，移栽到121℃高压蒸汽灭菌90min后的无菌山土中。
将无花果沙雷氏菌MGS11接种至LB液体培养基摇培过夜，取菌悬液离心，弃上清，用无菌水将菌体洗涤三次；再次用无菌水将菌体重悬，并用紫外分光光度计调节其吸光值OD600到0.6，制得接种用的无花果沙雷氏菌MGS11菌剂。设置实验组和对照组各三组，每组三棵幼苗，移栽到第四天时，实验组每株苗采用灌根法添加10mL菌剂，对照组浇等量无菌水。三个月后，用直尺测量实验组和对照组所有栓皮栎的株高，用游标卡尺测植株茎粗。取六组植株的所有叶片和根系于烘箱中105℃烘干2h，等温度降到60℃以下后，用电子分析天平测量每组叶片及根系的干重。
结果如图5所示，施用无花果沙雷氏菌MGS11菌剂后栓皮栎幼苗的的株高、叶干重和根系干重分别提高了7.13％、3.97％、6.1％；同时，实验组植株的茎粗比于对照也有所增加，但两种处理的差异并不显著。
Claims (10)
1.无花果沙雷氏菌MGS11在生产有机酸中的应用，其分类命名为Serratia ficariaMGS11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2023年5月26日，保藏编号CCTCC No:M2023826，保藏地址：中国武汉武汉大学。
2.权利要求1所述的无花果沙雷氏菌MGS11的发酵液在生产有机酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的无花果沙雷氏菌MGS11的发酵液在生产有机酸中的应用，其特征在于，所述有机酸为葡萄糖酸、柠檬酸、延胡索酸、苹果酸、琥珀酸、2-酮基-D-葡萄糖酸、2-Keto-D-glularic acid。
4.根据权利要求2所述的无花果沙雷氏菌MGS11的发酵液在生产有机酸中的应用，其特征在于，所述无花果沙雷氏菌MGS11的发酵液的制备方法为：取纯化好的菌株接种于LB培养基，28℃，180rpm/min摇培过夜，用无菌LB培养基调节细菌悬液的浓度至其OD值为0.6-0.7；然后将细菌悬液按1％的接种量接种到NBRIP液体培养基中，28℃，180rpm/min摇培2d后，将细菌悬液10000rpm离心10min，用0.22μm滤膜对离心后的上清液进行过滤，制得无花果沙雷氏菌MGS11的发酵液。
5.权利要求1所述的无花果沙雷氏菌MGS11在促进栓皮栎株高增加中的应用。
6.权利要求1所述的无花果沙雷氏菌MGS11在促进栓皮栎叶干重增加中的应用。
7.权利要求1所述的无花果沙雷氏菌MGS11在促进栓皮栎根干重增加中的应用。
8.权利要求1所述的无花果沙雷氏菌MGS11的菌剂在促进栓皮栎株高增加中的应用。
9.权利要求1所述的无花果沙雷氏菌MGS11的菌剂在促进栓皮栎叶干重增加中的应用。
10.权利要求1所述的无花果沙雷氏菌MGS11的菌剂在促进栓皮栎根干重增加中的应用。
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