ES2921427T3 - Métodos de eliminación de nematodos que comprenden la aplicación de un componente terpénico encapsulado - Google Patents

Abstract

Hay un método revelado para matar nematodos que comprenden el paso de aplicar una cantidad efectiva de una composición nematicida que comprende un componente terpeno y composiciones adecuadas para su uso en el método. El componente terpeno está preferiblemente en asociación con el agua, ya sea como solución o suspensión. También se puede incluir un excipiente, que es adecuadamente partículas de glucano huecas que encapsulan el componente terpeno. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de eliminación de nematodos que comprenden la aplicación de un componente terpénico encapsulado La presente invención se refiere a composiciones nematicidas que comprenden un componente terpénico, y a métodos para eliminar nematodos mediante la administración de una composición nematicida que comprende un componente terpénico.

Los nematodos (Reino: Animalia, Filo: Nematoda) son gusanos redondos microscópicos. En general, pueden describirse como gusanos redondos acuáticos, triploblásticos, no segmentados, con simetría bilateral, incoloros, transparentes, generalmente bisexuales y con forma de gusano (vermiforme), aunque algunos pueden hincharse (piroformo). Se cree que los nematodos son la forma de vida animal más abundante y sólo se ha estudiado en detalle un 3% de las especies de nematodos.

Muchos nematodos son parásitos obligados y varias especies constituyen un problema importante en la agricultura. Se ha sugerido que las pérdidas anuales de cultivos causadas por los nematodos parásitos de las plantas ascienden a unos 80.000 millones de dólares en todo el mundo, de los cuales 8.000 millones corresponden a Estados Unidos. Los nematodos son una plaga grave y los métodos para controlar sus actividades parasitarias son un elemento importante para maximizar la producción de los cultivos en la agricultura intensiva moderna.

Existen aproximadamente 197 géneros y 4300 especies de nematodos fitoparásitos. Los nematodos parásitos de las plantas se alimentan de las raíces o los brotes de las plantas. Los nematodos pueden ser ectoparásitos (es decir, se alimentan del exterior de una planta) o endoparásitos (es decir, viven/se alimentan dentro del huésped) y pueden ser migratorios o sedentarios.

Algunos de los nematodos parásitos de las plantas más significativos son:

Género; Nombre común

Meloidogyne; nematodo de la raíz

Pratylenchus; nematodo de la lesión

Heterodera; nematodo del quiste

Globodera; nematodo del quiste

Ditylenchus; nematodo del tallo y del bulbo

Tylenchulus; Nematodo de los cítricos

Xiphinema; Nematododaga

Radopholus; Nematodo excavador

Rotylenchulus; Nematodo reniforme

Helicotylenchus; Nematodo espiral

Belonolaimus; Nematodo picador

Los nematodos no sólo son parásitos de las plantas, sino que varias especies son parásitas de los animales, tanto vertebrados como invertebrados. Alrededor de 50 especies atacan a los seres humanos y entre ellas se encuentran la anquilostomiasis (Anclyostoma), los estrongílidos (Strongylus), los oxiuros (Enterolobius), la triquinosis (Trichina), la elefantitis (Wuchereria), la dirofilaria y los ascáridos (Ascaris).

Sin embargo, cabe señalar que no todos los nematodos que habitan en el suelo son fito-parásitos. Existen varios nematodos saprófagos que no dañan a las plantas y que, de hecho, pueden existir en una relación simbiótica con ellas. El procedimiento actual para la eliminación de nematodos en la agricultura consiste en tratar el suelo con bromuro de metilo (MB). El MB esencialmente esteriliza el suelo y proporciona un control eficaz de una amplia gama de patógenos y plagas transmitidas por el suelo, incluyendo hongos, bacterias, nematodos, insectos, ácaros, malas hierbas y plantas parásitas. Sin embargo, el MB tiene un importante impacto negativo en el medio ambiente.

Los problemas asociados con el MB incluyen:

• Erradicación de la microflora y microfauna beneficiosas del suelo, lo que provoca la eliminación del control biológico natural y el resurgimiento de plagas y enfermedades secundarias. El "vacío biológico" creado por el uso de potentes biocidas, como el MB, provoca una rápida reinfestación de los suelos tratados.

• Efectos secundarios tóxicos sobre los seres humanos, las plantas (fitotoxicidad) y otros organismos no objetivo. Esto tiene implicaciones de seguridad con respecto a la manipulación del MB, ya que cualquier contacto con el usuario sería perjudicial. Por lo tanto, también hay gastos importantes relacionados con el equipo especializado, la formación y otras precauciones relacionadas con el uso, la manipulación y el transporte seguros del MB.

• El MB se asocia con el agotamiento de la capa de ozono.

• Contaminación del medio ambiente, incluyendo el suelo, el agua y la atmósfera. El MB es, en particular, un importante contaminante de las aguas subterráneas.

• La presencia de residuos de plaguicidas en los productos agrícolas supone un riesgo para la salud de los consumidores y un importante obstáculo para el comercio agrícola internacional. Se sabe que la fumigación del suelo con MB deja residuos de bromo en el suelo que pueden ser absorbidos por las plantas y acumularse en ellas. Los problemas con los residuos de bromo en las verduras de hoja, como la lechuga, son bastante comunes. De hecho, en las regiones productoras de uva no se permite el uso de MB debido a sus implicaciones sanitarias.

Por las razones mencionadas anteriormente, entre otras cosas, la producción y el uso del metilbromuro se está eliminando a escala mundial. De acuerdo con el Protocolo de Montreal de 1991, el uso de MB debe eliminarse antes de 2005 en la UE y otros países desarrollados, y antes de 2015 en los países en desarrollo. Por lo tanto, es necesario identificar soluciones alternativas adecuadas para la gestión de los patógenos transmitidos por el suelo, en particular los nematodos.

El inventor ha descubierto sorprendentemente que los terpenos son eficaces para eliminar los nematodos.

Los terpenos están muy extendidos en la naturaleza, principalmente en las plantas como componentes de los aceites esenciales. Su componente básico es el hidrocarburo isopreno (C5Hs)n. Los terpenos están clasificados como generalmente considerados como seguros (GRAS) por la Agencia de Protección Ambiental (EPA) en los Estados Unidos y se han utilizado en las industrias de sabores y fragancias.

Se ha descubierto que los terpenos son eficaces como agentes antitumorales dietéticos no tóxicos que actúan a través de diversos mecanismos de acción (Crowell y Gould, 1994- Crit Rev Oncog 5{1): 1-22; y Crowell et al., 1996- Adv Exp Med Biol 401: 131-136). Los terpenos, es decir, el geraniol, el tocotrienol, el alcohol perilico, la b-ionona y el d-limoneno, suprimen la actividad de la ^h MG-COA reductasa hepática, un paso que limita la síntesis del colesterol, y reducen modestamente los niveles de colesterol en los animales (Elson y Yu, 1994 - J Nutr. 124: 607-614). El D-limoneno y el geraniol reducen los tumores mamarios (Elegbede et al., 1984-Carcinogénesis 5(5): 661-664; y Elegbede et al., 1986- J Natl Cancer Inst 76(2): 323-325; y Karlson et al., 1996- Anticancer Drugs 7(4): 422-429) y suprimen el crecimiento de los tumores trasplantados (Yu et al., 1995- J Agri Food Chem 43:2144-2147).

También se ha descubierto que los terpenos inhiben el crecimiento in vitro de bacterias y hongos (Chaumont y Leger, 1992- Ann Pharm Fr 50(3): 156-166; Moleyar y Narasimham, 1992- Int J Food Microbial 16 (4): 337-342; y Pattnaik, et al. 1997 - Microbios 89(358): 39-46) y algunos parásitos internos y externos (Hooser, et al., 1986- J Am Vet Med Assoc 189(8): 905-908). Se descubrió que el geraniol inhibe el crecimiento de las cepas de Candida albicans y Saccharomyces cerevisiae al aumentar la tasa de fuga de potasio y perturbar la fluidez de la membrana (Bard et al., 1988- Lipids 23(6): 534-538). La B-ionona tiene una actividad antifúngica que se determinó mediante la inhibición de la germinación de esporas y la inhibición del crecimiento en agar (Mikhlin et al., 1983 - Prikl Biokhim Mikrobiol. 19: 795-803; y Salt et al., 1986 -Adam Physiol Malec Plant Path 28: 287-297). La teprenona (geranilgeranilacetona) tiene un efecto antibacteriano sobre H. pylori (Ishii, 1993 - Int J Med Microbiol Viral Parasitol Infect Dis 280(1-2): 239-243). Las soluciones de 11 terpenos diferentes fueron eficaces para inhibir el crecimiento de las bacterias patógenas en pruebas in vitro; los niveles que oscilaron entre 100 ppm y 1000 ppm fueron eficaces. Los terpenos se diluyeron en agua con un 1% de polisorbato 20 (Kim et al., 1995 - J Agric Food Chem 43: 2839-2845). Los diterpenos, es decir, el trichorabdal A (de R. Trichocarpa) ha mostrado un efecto antibacteriano muy fuerte contra H. pylori (Kadota et al., 1997 - Zentralblatt fur Bakteriologie. 286 (1 ):63-7).

El rosanol, un producto comercial con un 1% de aceite de rosa, ha demostrado inhibir el crecimiento de varias bacterias (Pseudomona, Staphylococus, E. coli y H pylori). El geraniol es el componente activo (75%) del aceite de rosa.

En las patentes estadounidenses No. 5,977,186 y 6,130,253 se divulgan métodos de uso de terpenos para eliminar piojos.

En la solicitud de patente internacional publicada con el número WO 03/020024, por el presente inventor, se divulgan métodos de uso de terpenos para prevenir y tratar infecciones de plantas por bacterias, fitoplasmas, micoplasmas u hongos.

Puede haber diferentes modos de acción de los terpenos contra los microorganismos; podrían (1) interferir con la bicapa de fosfolípidos de la membrana celular, (2) perjudicar una variedad de sistemas enzimáticos (HMG-reductasa), y (3) destruir o inactivar el material genético. Se cree que debido a que los modos de acción de los terpenos son tan básicos, por ejemplo, el bloqueo del colesterol, los agentes infecciosos no podrán crear una resistencia a los terpenos.

Sin embargo, el uso de terpenos presenta una serie de inconvenientes. Estos incluyen:

- Los terpenos son líquidos, lo que puede dificultar su manipulación y hacerlos inadecuados para ciertos fines. - Los terpenos no son muy miscibles con el agua, y generalmente se requiere el uso de detergentes, tensioactivos u otros emulsionantes para preparar emulsiones acuosas. Sin embargo, se puede obtener una solución estable mezclando los terpenos bajo un alto cizallamiento.

- Las formulaciones de terpenos en polvo seco generalmente sólo contienen un bajo porcentaje p/p de terpenos. - Los terpenos son propensos a la oxidación en los sistemas de emulsión acuosa, lo que hace que el almacenamiento a largo plazo sea un problema.

Las técnicas actuales de recubrimiento por pulverización, extrusión, coacervación, encapsulación molecular y secado/enfriamiento por pulverización tienen limitaciones para proporcionar sistemas de suministro de ingredientes. Las paredes celulares de la levadura se derivan de las células de la levadura y están compuestas por los biopolímeros insolubles p-1,3-glucano, p-1,6-glucano, manano y quitina. Suelen ser microesferas de entre 2 y 4 micras de diámetro con una pared de cáscara de sólo 0,2-0,3 micras de grosor que rodea una cavidad abierta. Este material tiene una considerable capacidad de retención de líquidos, que suele absorber entre 5 y 25 veces su peso en líquido. La cubierta es lo suficientemente porosa como para que cargas útiles de hasta 150,000 daltons puedan atravesar la cubierta exterior de glucano y ser absorbidas en la cavidad hueca de la partícula esférica. Las paredes celulares de la levadura tienen varias propiedades únicas, como la estabilidad al calor (por ejemplo, a 121°C), la estabilidad al cizallamiento, la estabilidad al pH (por ejemplo, pH 2-12) y, a altas concentraciones, no generan una viscosidad significativa. Además de sus propiedades físicas, esta composición contiene las fibras dietéticas naturales y saludables que aportan beneficios para la salud cardiovascular e inmunopotenciadora.

Las paredes celulares de levadura se preparan a partir de células de levadura mediante la extracción y purificación de la fracción particulada insoluble de los componentes solubles de la célula de levadura. Las paredes celulares fúngicas pueden producirse a partir del subproducto insoluble de la fabricación del extracto de levadura. Además, las células de levadura pueden tratarse con una solución acuosa de hidróxido, sin alterar las paredes celulares de la levadura, que digiere la proteína y la porción intracelular de la célula, dejando el componente de la pared celular de la levadura desprovisto de contaminación proteica significativa, y teniendo sustancialmente la estructura inalterada de la pared celular de los glucanos enlazados p(1-6) y p(1-3). Una descripción más detallada de las partículas de glucano enteras y del proceso de preparación de las mismas es descrita por Jamas et al. en la Pat. U.S. No. 4,810,646 y en las solicitudes de patente co-pendientes U.S. Ser. No. 166,929, U.S. Ser. No. 297,752 y U.S. Ser. No. 297,982. La patente estadounidense No. 6,242,594, asignada a Novogen Research Pty Ltd., describe un método de preparación de partículas de glucano de levadura mediante extracción con álcali, extracción con ácido y, a continuación, extracción con un disolvente orgánico y, finalmente, secado. El documento US 5,401,727, asignado a AS Biotech-Mackzymal, divulga los métodos de obtención de partículas de glucano de levadura y los métodos de uso para promover la resistencia en animales acuáticos y como adyuvante para vacunas. El documento US 5,607,677, asignado a Alpha-Beta Technology. Inc., divulga el uso de partículas huecas de glucano entero como paquete de entrega y adyuvante para la entrega de una variedad de agentes farmacéuticos.

El documento US 4,049,828 describe el uso de citral para reducir la población de nematodos.

El documento EP 0460945 describe un proceso para la producción de microcápsulas.

El documento JP H08 243378 describe un método de preparación de microcápsulas que pueden utilizarse para encapsular líquidos hidrófobos.

De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para eliminar nematodos, dicho método comprende el paso de aplicar a al menos una porción de, preferiblemente todo, un volumen de suelo que está infestado con nematodos una cantidad efectiva de una composición nematicida que comprende un componente terpénico, donde la composición nematicida comprende partículas huecas de glucano que encapsulan el componente terpénico, donde las partículas huecas de glucano tienen un contenido en lípidos superior al 5% en peso, y donde las partículas huecas de glucano son paredes celulares de levadura que se preparan mediante la extracción y purificación de la fracción particulada insoluble de los componentes solubles de una célula de levadura antes de la encapsulación del componente terpénico.

Las características preferidas de la composición nematicida se describen a continuación.

El componente terpénico puede comprender un solo terpeno o una mezcla de terpenos.

La lista de terpenos que están exentos de las regulaciones de EE. UU. se encuentra en la regulación de la EPA 40 C.F.R. Parte 152.

Preferiblemente el componente terpénico comprende uno o más terpenos seleccionados del grupo que comprende citral, pineno, nerol, b-ionona, geraniol, carvacrol, eugenol, carvona, terpeniol, anetol, alcanfor, mentol, limoneno, nerolidol, farnesol, fitol, caroteno (vitamina A), escualeno, timol, tocotrienol, alcohol perílico, borneol, mirceno, simeno, careno, terpeneno y linalol.

También cabe señalar que los terpenos también se conocen por sus nombres de extracto o aceite esencial, por ejemplo, el aceite de hierba de limón (contiene citral).

Un componente terpénico adecuado puede comprender, por ejemplo:

100% citral;

50% de citral y 50% de b-ionona;

50% de citral y 50% de a-terpineol;

50% de d-limoneno y 50% de b-ionona; o

50% de a-terpineol y 50% de b-ionona.

Se ha descubierto que las composiciones que comprenden citral son particularmente eficaces para eliminar nematodos. Por lo tanto, se prefiere que la composición nematicida de la presente invención comprenda citral.

Es muy preferible que todos los compuestos presentes en la composición nematicida estén clasificados como generalmente considerados como seguros (GRAS).

El término "terpeno", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere no sólo a los terpenos de fórmula (C5H8)n, sino que también abarca los derivados de terpeno, como los aldehídos de terpeno. Además, la referencia a un solo nombre de un compuesto abarcará los diversos isómeros de ese compuesto. Por ejemplo, el término citral incluye el isómero cis del citral-a (o geranial) y el isómero trans del citral-b (o neral).

En una realización preferida, la composición nematicida comprende un componente terpénico y agua. El componente terpénico puede estar en solución en el agua. Alternativamente, la composición nematicida puede comprender un tensioactivo que mantiene el terpeno en suspensión en el agua. Entre los tensioactivos adecuados se encuentran el lauril sulfato de sodio, el polisorbato 20, el polisorbato 80, el polisorbato 40, el polisorbato 60, el éster de poliglicerilo, el monooleato de poliglicerilo, el monocaprilato de decaglicerilo, el dicaprilato de propilenglicol, el monoestearato de triglicerol, el Tw Ee N, el Tween 80, el SPAN 20, el SPAN 40, el SPAN 60, el SPAN 80, el Brig 30 o sus mezclas. El lauril sulfato de sodio es un tensioactivo preferido debido a su reconocida seguridad.

En una realización de la invención, la composición nematicida tiene un pH inferior a 7, convenientemente un pH de alrededor de 3 a menos de 7, y preferiblemente un pH de alrededor de 3 a alrededor de 5. Cuando la composición nematicida tiene un pH inferior a 7, la actividad nematicida de la composición no disminuye con el tiempo en comparación con una composición que tiene un pH superior a 7.

Convenientemente, la composición nematicida comprende el componente terpénico en una concentración de aproximadamente 125 a aproximadamente 2000 ppm en agua, preferentemente de aproximadamente 250 a aproximadamente 1000 ppm. Puede preferirse una concentración del componente terpénico de aproximadamente 500 a aproximadamente 2000 ppm si se desea una mayor tasa de mortalidad.

En una realización de la invención, el componente terpénico se proporciona a una concentración en la que los nematodos parásitos son eliminados selectivamente sobre los nematodos no parásitos. Los nematodos parásitos son nematodos de la raíz y los nematodos no parásitos son nematodos saprófagos.

Las concentraciones adecuadas incluyen de 250 a 1000 ppm, y preferentemente de 250 a 750 ppm.

La composición nematicida comprende partículas huecas de glucano. El término "partícula hueca de glucano", tal como se utiliza aquí, incluye cualquier partícula hueca que comprenda glucano como componente estructural. Así, en particular, el término incluye las paredes celulares de la levadura (en formas purificadas o crudas) u otras partículas huecas de glucano, que pueden ser partículas huecas de glucano entero.

Se ha descubierto que los terpenos pueden ser captados y encapsulados de forma estable dentro de partículas de glucano huecas.

Las composiciones nematicidas que comprenden una partícula hueca de glucano que encapsula un componente terpénico pueden proporcionar las siguientes ventajas:

- maximizar la carga de terpenos;

- minimizar la carga útil no encapsulada;

- controlar la estabilidad de la carga útil;

- controlar la cinética de liberación de la carga útil;

- creación de una forma sólida de un terpeno líquido para aumentar la masa y la uniformidad;

- simplificar la manipulación y la aplicación de los terpenos; y

- enmascarar el olor y el sabor del terpeno.

Preferiblemente, las partículas huecas de glucano son paredes celulares de levadura. Las paredes celulares de levadura son preparaciones de células de levadura que conservan la estructura tridimensional de la célula de levadura de la que derivan. Por tanto, tienen una estructura hueca que permite encapsular el componente terpénico dentro de las paredes celulares de la levadura. Las paredes de levadura pueden derivarse adecuadamente de las células de levadura de Baker (disponibles en Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO).

Las partículas alternativas son las conocidas por los nombres comerciales SAF-Mannan (SAF Agri, Minneapolis, MN) y Nutrex (Sensient Technologies, Milwaukee, WI). Se trata de partículas huecas de glucano que son el flujo de residuos insolubles del proceso de fabricación de extractos de levadura. Durante la producción de extractos de levadura se eliminan los componentes solubles de las células de levadura parcialmente autolizadas y el residuo insoluble es un material adecuado para la carga de terpenos. Estas partículas huecas de glucano tienen un contenido de ~25-35% en peso de glucano. Un atributo clave de estos materiales es que tienen >10% de lípidos en peso y son muy eficaces para absorber terpenos. Además, al ser un producto de desecho, son una fuente relativamente barata de partículas huecas de glucano.

Las partículas huecas de glucano alternativas que tienen mayor pureza son las producidas por Nutricepts (Nutricepts Inc., Burnsville, MN) y ASA Biotech. Estas partículas han sido extraídas con álcali, lo que elimina los componentes intracelulares adicionales, así como la capa externa de manoproteína de la pared celular, dando lugar a una partícula con un 50-65% en peso de glucano. Dado que la extracción con álcalis saponifica algunos de los lípidos, estas partículas son menos eficaces para absorber los terpenos. También son significativamente más caras, por lo que estos materiales son las partículas preferidas.

Las partículas huecas de glucano de mayor pureza son las partículas WGP de Biopolymer Engineering. Estas partículas se extraen con ácido, eliminando los componentes adicionales de la levadura, lo que da lugar a un producto con un 75-85% en peso de glucano. Son aún más caras que las partículas de Nutricepts y As a Biotech y su menor contenido en lípidos hace que la carga de terpenos sea escasa.

Las partículas huecas de glucano de muy alta pureza son WGP de Alpha-beta Technology, Inc. (Worcester, MA) y glucano microparticulado de Novogen (Stamford, CT). Estas partículas se extraen con disolventes orgánicos eliminando los lípidos residuales y son >90% en peso de glucano.

De todos los materiales probados hasta ahora, estas partículas fueron las que menos terpenos absorbieron.

Sin embargo, pueden preverse situaciones en las que se requiera una partícula de glucano de alta pureza, por ejemplo, cuando se requiera un control estricto de los posibles contaminantes. En estos casos, se preferirán las partículas de mayor pureza a los productos más crudos, a pesar de sus peores características de carga de terpenos.

Preferiblemente, las partículas huecas de glucano tienen un ligero contenido de lípidos. Un ligero contenido de lípidos puede aumentar la capacidad de la partícula hueca de glucano para encapsular el componente terpénico. Preferiblemente, el contenido en lípidos de las partículas huecas de glucano es superior al 5% en peso, más preferiblemente superior al 10% en peso.

Para la encapsulación en una partícula hueca de glucano, el componente terpénico de la presente invención puede asociarse opcionalmente con un tensioactivo. El tensioactivo puede ser no iónico, catiónico o aniónico. Entre los ejemplos de tensioactivos adecuados se encuentran el lauril sulfato de sodio, el polisorbato 20, el polisorbato 80, el polisorbato 40, el polisorbato 60, el éster de poliglicerilo, el monooleato de poliglicerilo, el monocaprilato de decaglicerilo, el dicaprilato de propilenglicol, el monoestearato de triglicerol, el Tween®, el Tween 80, el Span® 20, el Span® 40, el Span® 60, el Span® 80, el Brig 30 o sus mezclas. El tensioactivo actúa para mantener el componente terpénico en una emulsión y también ayuda a la encapsulación del componente terpénico en la partícula hueca de glucano.

La composición nematicida de la invención puede comprender partículas huecas de glucano que encapsulan un componente terpénico que comprenden del 1 al 99% en volumen del componente terpénico, del 0 al 99% en volumen del tensioactivo y del 1 al 99% de las partículas de glucano huecas. Más concretamente, las partículas huecas de glucano que encapsulan un componente terpénico pueden comprender de un 10% a un 67% en volumen del componente terpénico, un 0,1-10% de tensioactivo y un 40-90% de partículas de glucano hueco. Se puede realizar una suspensión estable de partículas huecas de glucano que incorporan citral de 25 ppt de citral.

La composición nematicida comprende de 500 a 10.000 ppm de partículas de glucano huecas, donde las partículas contienen de 1 a 67% de componente terpénico. Preferentemente, la composición nematicida comprende de aproximadamente 1000 a aproximadamente 2000 ppm de partículas de glucano hueco, donde las partículas contienen de aproximadamente 10 a aproximadamente 50% de componente terpénico.

El método es particularmente adecuado para eliminar nematodos en el suelo, especialmente en el suelo utilizado para fines agrícolas u hortícolas. Dicho método implica la administración de una composición nematicida que comprende un componente terpénico a al menos una parte del suelo a tratar, preferiblemente a la totalidad del mismo.

Opcionalmente, la aplicación de la composición nematicida puede repetirse. Esto puede ser necesario en algunos casos para garantizar la eliminación efectiva de los nematodos presentes en la porción de suelo. La aplicación de la composición nematicida al suelo puede llevarse a cabo de varias maneras, incluida la pulverización, el riego o similares.

En un aspecto, la presente invención proporciona además un método de preparación de una composición nematicida que comprende partículas huecas de glucano que encapsulan un componente terpénico, dicho método comprende los pasos de;

a) proporcionar un componente terpénico;

b) proporcionar partículas huecas de glucano;

c) incubar el componente terpénico con las partículas de glucano en condiciones adecuadas para la encapsulación de terpenos; y

d) recuperar las partículas de glucano que encapsulan el componente terpénico.

Opcionalmente, el método anterior puede comprender además el paso de secado de las partículas de glucano que encapsulan el componente terpénico. El secado puede llevarse a cabo de varias maneras y pueden mencionarse la liofilización, el secado en lecho fluidizado, el secado en tambor o el secado por pulverización, todos ellos procesos bien conocidos.

En el paso a) del método anterior, el componente terpénico se proporciona convenientemente como una suspensión en un disolvente acuoso, y opcionalmente en presencia de un tensioactivo. Es conveniente que el disolvente sea agua. Un tensioactivo adecuado es el Tween-80 (monooleato de polietilenosorbitán) o el laurilsulfato de sodio, y preferiblemente el tensioactivo está presente en una concentración de aproximadamente 0,1 a 10 % en volumen de la mezcla de reacción total, más preferiblemente de aproximadamente 1%. Alternativamente, el componente terpénico puede proporcionarse como una verdadera solución en un disolvente, por ejemplo, agua. Se puede obtener una verdadera solución de terpeno en agua mezclando el terpeno en agua a alto cizallamiento hasta que se obtenga una verdadera solución. La Publicación N.° WO 03/020024 proporciona más detalles sobre la formación de verdaderas soluciones de terpenos en agua.

En el paso b) del método anterior, las partículas huecas de glucano se suministran convenientemente como una suspensión en agua u otro líquido adecuado. La suspensión comprende aproximadamente de 1 a 1000 mg de partículas de glucano por ml, preferiblemente de 200 a 400 mg/ml. Alternativamente, las partículas huecas de glucano pueden suministrarse como polvo seco y añadirse a la suspensión de terpeno-surfactante.

Alternativamente, las partículas de glucano se suministran con suficiente líquido para hidratar mínimamente las partículas, pero no en exceso significativo. El término "volumen hidrodinámico" (HV) se utiliza para describir el volumen de líquido necesario para hidratar mínimamente las partículas. Por lo tanto, las partículas se encuentran entre el HV y el HV 50% de agua. Esto hace que el paso de secado posterior sea más eficiente. Además, si se utiliza un volumen bajo de agua (es decir, entre el HV y el HV 50%), también es posible extrudir el producto acabado en forma de pellets o fideos, lo cual es conveniente para el secado en lecho fluidizado.

Se ha comprobado que el componente terpénico puede ser encapsulado por las partículas huecas de glucano a temperatura ambiente. Sin embargo, la tasa de encapsulación aumenta a 37°C, pero la temperatura debe mantenerse por debajo del punto de ebullición o de la temperatura de desnaturalización de cualquier componente de la composición. Por lo tanto, las condiciones adecuadas para el paso c) del método anterior son presión atmosférica a una temperatura de 20 a 37°C. La optimización de las condiciones para una reacción de encapsulación particular será una cuestión de experimentación rutinaria.

La presente invención también proporciona el uso de una composición nematicida que comprende un componente terpénico como el descrito anteriormente para la exterminación de nematodos, especialmente nematodos en suelos y/o que infectan plantas.

Será obvio para un experto en la materia que el uso nematicida de una composición hecha enteramente de compuestos que son GRAS es altamente preferible sobre el uso de composiciones tóxicas del arte previo. Las preocupaciones medioambientales asociadas al uso de la composición se reducirán en gran medida y no habrá problemas significativos de acumulación del producto en los cultivos alimentarios. Además, la aprobación reglamentaria de la composición en varias jurisdicciones no sería tan difícil de obtener como en el caso de una composición tóxica y, de hecho, podría no ser necesaria en algunos casos.

Las realizaciones de la presente invención se describirán ahora sólo a modo de ejemplo, con referencia a las figuras en las que:

La Fig. 1 representa una micrografía de luz de paredes celulares de levadura vacías;

La Fig. 2 representa una micrografía óptica de las paredes celulares de la levadura que encapsulan L-carvona; La Fig. 3 representa una micrografía óptica de las paredes celulares de la levadura que encapsulan citral; La Fig. 4 representa una micrografía de luz de la emulsión de terpeno;

La Fig. 5 representa una micrografía de luz de las paredes celulares de la levadura en agua de volumen hidrodinámico (HV);

La Fig. 6 representa una micrografía de luz de las paredes celulares de la levadura encapsulando el terpeno en 5 veces el volumen hidrodinámico (HV) del agua;

La Fig. 7 representa una micrografía de luz de las paredes celulares de la levadura encapsulando el terpeno en HV de agua;

La Fig. 8 representa una micrografía de luz de las paredes celulares de la levadura encapsulando terpeno en HV más 5% de agua;

La Fig. 9 representa una micrografía de luz de las paredes celulares de la levadura encapsulando el terpeno en HV más 10% de agua;

La Fig. 10 representa una micrografía de luz de las paredes celulares de la levadura encapsulando terpeno en HV más 20% de agua;

La Fig. 11 representa una micrografía de luz de las paredes celulares de la levadura encapsulando el terpeno en HV más 30% de agua;

La Fig. 12 representa una micrografía de luz de las paredes celulares de la levadura encapsulando el terpeno en HV más 40% de agua.

La Fig. 13 representa una micrografía de luz que muestra la dispersión de las partículas huecas de glucano secas que encapsulan un componente terpénico y sin goma xantana.

La Fig. 14 representa una micrografía de luz como la de la Fig. 13 en la que se incluyen 0,07 g de goma xantana al 1%. La Fig. 15 representa una micrografía de luz como la de la Fig. 13 en la que se incluyen 0,14 g de goma xantana al 1%. La Fig. 16 representa una micrografía de luz como la de la Fig. 13 en la que se incluyen 0,28 g de goma xantana al 1%. La Fig. 17 representa una micrografía de luz como la de la Fig. 13 en la que se incluyen 0,55 g de goma xantana al 1%. La Fig. 18 representa una micrografía de luz como la de la Fig. 13 en la que se incluye 1,1 g de goma xantana al 1 %. La Fig. 19 representa una micrografía de luz como la de la Fig. 13 en la que se incluyen 2,2 g de goma xantana al 1%. La Fig. 20 representa una micrografía de luz como la de la Fig 13 en la que se incluyen 4,4 g de goma xantana al 1%.

Los Ejemplos 1 a 21 se incluyen como Ejemplos de Referencia.

Ejemplo de referencia 1 - Preparación de una emulsión o suspensión de terpenos con un tensioactivo

Un terpeno, una mezcla de terpenos o una combinación de liposomas y terpenos pueden combinarse con un tensioactivo para formar una suspensión. La proporción volumétrica de los terpenos es generalmente del 1 al 99%, y la proporción volumétrica del tensioactivo es del 1 al 50% de la solución/mezcla. Los terpenos, compuestos por terpenos naturales o sintéticos, se añaden al agua. El tensioactivo, preferiblemente polisorbato 80 u otro tensioactivo GRAS adecuado, se añade a la mezcla de agua/terpenos y se mezcla para formar una suspensión. El citral es un terpeno adecuado.

Ejemplo de referencia 2 - Preparación de una solución de terpenos (sin tensioactivos)

La solución puede prepararse sin un tensioactivo colocando el terpeno, por ejemplo, el citral, en agua y mezclando en condiciones de cizallamiento de la solución hasta que el terpeno esté en solución.

Se añadieron 0,5 ml de citral a 1 litro de agua. El citral y el agua se mezclaron en una batidora doméstica durante 30 segundos.

Alternativamente, la agitación moderada también preparó una solución de citral agitando a mano durante aproximadamente 2-3 minutos.

Se añaden al agua entre cero ppm y 1000 ppm de terpenos naturales o sintéticos, como citral, b-ionona, geraniol, carvona, terpeniol, carvacrol, anetol u otros terpenos con propiedades similares, y se someten a una acción de mezcla por cizallamiento que fuerza al terpeno a formar una verdadera solución. El nivel máximo de terpeno(s) que puede ser solubilizado varía con cada terpeno. En la Tabla 1 se muestran ejemplos de estos niveles.

T l 1 - Niv l l i n r v ri r n .

Ejemplo de referencia 3 - Potencia de la solución

Los terpenos se descomponen en presencia de oxígeno. La velocidad a la que se descomponen varía para cada terpeno en particular.

El citral es un terpeno aldehido y se descompone en un período de días. A continuación, se describen dos protocolos que cuantifican la velocidad de descomposición del citral.

Se utilizó el siguiente protocolo para determinar la tasa de descomposición del citral en un recipiente sellado:

Material de prueba

Se preparó una solución como la descrita en el Ejemplo 2 que contenía citral a 1000 ppm en agua destilada. Esta solución se almacenó en un frasco de vidrio con tapa durante la duración de la prueba.

Procedimiento

Se preparó una curva estándar con citral y B-ionona como estándar interno.

Al principio del estudio y semanalmente durante cuatro semanas, se analizó la suspensión de 1000 ppm mediante un procedimiento de cromatografía de gases. La concentración de citral se determinó trazando la curva estándar.

Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 - Estabilidad del citral

Se utilizó el siguiente protocolo para determinar la velocidad de descomposición del citral en un recipiente con tapa porosa.

Para determinar la concentración de citral en agua se utilizó el siguiente protocolo:

Material de prueba

Se preparó una solución que contenía citral a 1000 ppm en agua destilada. Esta solución se almacenó en un vaso de precipitados cubierto con papel poroso durante la duración de la prueba.

Procedimiento

Se preparó una curva estándar con citral y B-ionona como estándar interno.

Al principio del estudio y después de una semana, se analizó la suspensión de 1000 ppm mediante un procedimiento de cromatografía de gases. La concentración de citral se determinó trazando la curva estándar.

Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3 - Estabilidad del citral

Ejemplo de referencia 4 - Extracción de huevos de nematodos del suelo y recuento del número de nematodos Extracción de huevos y cuantificación de las poblaciones del suelo

A continuación, se presenta un esquema de una técnica adecuada para determinar las densidades de población de los nemátodos del quiste de la soja (SCN) en muestras de suelo, aunque sería aplicable a otros nematodos del suelo. El procedimiento consta de tres pasos:

• extraer los quistes del suelo;

• aplastar los quistes para extraer los huevos; y,

• observación microscópica de la suspensión de huevos para su recuento.

Extracción de quistes del suelo

Los quistes del nematodo del quiste de la soja se recuperan del suelo mediante una combinación de tamizado en húmedo y decantación. La técnica es una modificación del método Cobb (Cobb, N.A. 1918. Estimación de la población de nema del suelo. U.S. Dept. Agr. Bur. Plant Ind. Agr. Tech. Cir., 1:1-48) técnica de tamizado y gravedad.

El procedimiento es el siguiente:

1. Combinar una muestra de suelo de 100 cm3 bien mezclada (aproximadamente 1/2 taza) en un cubo con dos (2) cuartos de galón (2,27 litros) de agua.

2. Romper los grumos con los dedos y mezclar bien la suspensión de la tierra durante 15 segundos.

3. Verter la suspensión de tierra a través de un tamiz de 8 pulgadas de diámetro #20 (850 mm de poro) en otro cubo. Enjuague brevemente los restos atrapados en el tamiz de malla 20.

4. Verter la suspensión de tierra en el segundo cubo a través de un tamiz del n° 60 (250 mm de poro).

5. Lavar los restos atrapados en el tamiz de malla 60 en una bandeja.

6. Volver a verter la suspensión a través del tamiz de malla 60 - mantener el tamiz en ángulo para concentrar los quistes y los restos.

7. Lavar a contracorriente en una cacerola con una cantidad mínima de agua (<250 ml).

8. Verter los quistes y los restos en un vaso de precipitados de 250 ml.

NOTA: Desechar el material más pesado que se deposita rápidamente en el fondo de los cubos/bandejas durante el proceso de tamizado anterior.

Extracción de los huevos de los quistes

La técnica anterior dará como resultado una suspensión de quistes de SCN, junto con restos orgánicos y sedimentos de tamaño similar a los quistes. Los quistes en esta suspensión podrían contarse utilizando un simple microscopio de disección. Algunos laboratorios que analizan el suelo para detectar el nematodo del quiste de la soja informan de los resultados en forma de quistes por cada 100 cm3 de suelo. El contenido de huevos de los quistes es muy variable y no permite obtener un recuento fiable de la población de NMS en la muestra. Por lo tanto, es preferible que los huevos se extraigan de los quistes y que los resultados se comuniquen como huevos y juveniles de segunda fase (J-2) por 100 cm3 de suelo.

El procedimiento utilizado para extraer los huevos de los quistes es el siguiente:

1. Dejar que los quistes/restos se asienten durante unos 30 minutos en los vasos de precipitados de 250 ml. Verter el exceso de agua, resuspender los sedimentos y transferirlos a vasos de precipitados de 50 ml.

2. Deje que los quistes se asienten en los vasos de precipitados de 50 ml.

3. Vierta el exceso de agua (~30 ml) y transfiera la suspensión de quistes/restos a una trituradora de tejidos Wheaton Potter-Elvehjen de 55 ml.

4. Moler a 7500 RPM durante 10 segundos. Enjaguar el mortero en el tubo de molienda.

5. Después de la molienda, vierta la suspensión en el tubo a través de un tamiz de 8 pulgadas de diámetro #200 (75 mm de poro) sobre un tamiz de acero inoxidable #500 (25 mm de poro).

6. Enjuagar el tubo varias veces con agua del grifo, vertiendo cada vez el contenido a través de los tamices. Desechar los sedimentos atrapados en el tamiz #200.

7. Lavar cuidadosamente los sedimentos y los huevos atrapados en el tamiz #500 en un vaso de precipitados limpio con la menor cantidad de agua posible.

Recuento de huevos con el portaobjetos de recuento de nematodos:

El volumen de la suspensión de huevos debe llevarse exactamente a 50 ml con agua del grifo. Llenar la cámara del portaobjetos de recuento de nematodos con una suspensión bien mezclada utilizando una pipeta. Los portaobjetos de recuento de nematodos especialmente fabricados están construidos de forma que el volumen de suspensión de huevos observado sobre la rejilla sea exactamente de 1 ml. Por consiguiente, basta con contar el número de huevos que aparecen dentro de la rejilla del portaobjetos para determinar el número de huevos por ml de suspensión. El número total de huevos en la muestra puede entonces calcularse multiplicando el número de huevos por ml por 50.

Fuentes de materiales y equipos

Tamices:

• Fisher Scientific, 1600 W. Glenlake Avenue, Itasca, IL 60141 -(800) 223-9114

• VWR Scientific, P.O. Box 66929, O'Hare AMF, Chicago, IL 60666 -(800) 932-5000

Pulverizador de tejido:

Fisher Scientific, 1600 W. Glenlake Avenue, Itasca, IL 60143 -(800) 223-9114

Agitador motorizado:

El agitador motorizado de laboratorio es un agitador Talboys Modelo 101. Este agitador puede adquirirse a través de VWR Scientific o directamente a través de Talboys Engineering Corporation, South Montrose, PA 18843.

Portaobjetos de recuento de nematodos:

Los portaobjetos para el recuento de nematodos especialmente fabricados pueden adquirirse en Advanced Equine Products, 5004228th Avenue S.E., Issaquah, Washington 98029, (425) 391-1169, FAX (425) 391-6669.

Ejemplo de referencia 5 - Efecto de los terpenos sobre la eclosión de huevos de nematodos y la supervivencia juvenil

Se evaluó el efecto de varias composiciones que contienen terpenos en relación con los huevos de nematodos y los nematodos juveniles.

El protocolo utilizado fue el siguiente:

Los huevos vivos se trataron en las distintas muestras durante una hora, se enjuagaron, se volvieron a poner en agua destilada y se contaron 24 horas después:

Tabla 4a

Los resultados del protocolo se muestran en la Tabla 4b.

Tabla 4b - Resultados

Observaciones: Las combinaciones que contienen citral (NM3 y NM5) fueron más eficaces. El tensioactivo Brig no fue tan eficaz como el Tween 80. El aldehído funcionó mejor que los alcoholes.

Ejemplo de referencia 6 - Efecto de los terpenos sobre los nematodos maduros de la raíz, del anillo y de los cítricos

Se evaluó el efecto de varias composiciones que contienen terpenos en relación con los nematodos de la raíz (Meloidogyne), los nematodos del anillo (Criconemella xenoplax) y los nematodos de los cítricos (Tylenchulus semipenetrans).

El protocolo utilizado fue el siguiente:

Nematodos: Como inóculo inicial se utilizó un volumen único de 5 ml con números de nematodos previamente contados. Los nematodos se recogieron, identificaron y mantuvieron en suelos de cultivos agrícolas comerciales. Se contaron los nematodos y se evaluó su buena salud durante el estudio.

Composiciones nematicidas: En este protocolo el terpeno utilizado en la composición nematicida fue el citral. Los detalles relevantes del citral utilizado son los siguientes:

Se utilizaron 3 concentraciones diferentes de citral para evaluar la eficacia de los terpenos para eliminar a los nematodos. Éstas fueron el control sin tratar (UTC), 500ppm y la concentración máxima de terpenos solubles (900ppm). Los terpenos se combinaron con agua en forma de solución, mezclándolos con un cizallamiento formador de solución. El valor de la concentración de 900 ppm no se midió, sino que se estimó en la máxima concentración soluble que puede obtenerse con agua destilada a 65°F (28,3°C). Se utilizaron 3 réplicas de la concentración de 900 ppm (R1, R2 y R3) y una réplica de la concentración de 500 ppm y UTC.

Las mezclas de prueba de nematodos y las composiciones nematicidas se prepararon según la Tabla 5.

T l - M z l r

El terpeno y el agua que contenía los nematodos se combinaron para formar un volumen de dilución final y se mantuvieron en viales entre las evaluaciones. Los nematodos se expusieron a los terpenos entre 48 y 72 horas, dependiendo de su supervivencia.

Evaluaciones: Se contaron los nematodos y se evaluó su aspecto al microscopio. El microscopio utilizado para el ensayo sólo permitía ver 5 ml de una vez. Por lo tanto, los 20 ml de agua de muestra de nematodos terpénicos totales se dividieron en 4 partes para cada ensayo y se recombinaron después. La calificación del grado de eficacia de las muestras de ensayo se determinó mediante la observación de la movilidad de los nematodos, la mortalidad y la alteración interna o vacuolización a lo largo del tiempo.

Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6 - Resultados

Hubo una pequeña pérdida de nematodos de una lectura a otra debido a que los nematodos se colgaron de los lados de los platos y frascos. Estas poblaciones suelen ser inferiores a 5 nematodos por lectura.

Observaciones:

Día 1 - las lecturas del pretratamiento mostraron que no había nematodos muertos y que todos los nematodos se movían, y no tenían ninguna alteración interna ni vacuolación.

Día 1 - 6pm (20ml - R1+R2+R3) todos los tratamientos parecían haber ralentizado el movimiento, pero no tenían ninguna disrupción interna o vacuolación.

Los tratamientos del día 1 a las 6 de la tarde (1,0 y UTC) no mostraron ninguna ralentización del movimiento, ni alteración o vacuolación interna.

Día 2 - 6 de la mañana (UTC y 1,0) todos los tratamientos parecían normales, sin pérdida de movimiento y sin desorganización o vacuolización interna.

Día 2 - 6 de la mañana (20ml - R1+R2+R3) los tratamientos tenían algunos muertos (los muertos no tenían movimiento y sus estructuras corporales internas estaban muy vacuoladas). Los nematodos vivos seguían moviéndose, aunque lentamente, pero no presentaban alteraciones internas ni vacuolización.

Día 2 - 6pm (UTC) el tratamiento todo parecía normal, sin pérdida de movimiento y sin interrupción interna o vacuolación.

Día 2 - 6pm (1.0) el tratamiento tenía algunos muertos. Los muertos no tenían movimiento con desorganización interna y vacuolación. Algunos de los vivos tenían movimiento lento y otros no, pero ninguno tenía disrupción interna ni vacuolación.

Día 2 - 6pm (20ml - R1+R2+R3) los tratamientos estaban todos muertos sin movimiento y con disrupción interna con vacuolación.

Día 3 - 6 de la mañana (UTC) los tratamientos mostraron unos pocos nematodos muertos o moribundos. No tenían movimiento, pero no mostraban ninguna alteración interna ni vacuolación. El resto de los nematodos, catalogados como vivos, aún tenían buen movimiento.

Los tratamientos del día 3 - 6 de la mañana (1,0) mostraron alrededor de un 50% de muertos y tanto disrupción interna como vacuolización. Los nematodos vivos mostraron una cierta ralentización del movimiento, pero sin desorganización interna ni vacuolización.

Como puede verse claramente en los resultados, el segundo día, a las 18 horas, las composiciones R1, R2 y R3 habían eliminado todos los nematodos. Esto demuestra las propiedades altamente nematicidas de las composiciones R1, R2 y R3 y, en consecuencia, las propiedades nematicidas del citral.

Ejemplo de referencia 7 - Efecto del citral solo y del citral y el timol sobre los juveniles del nematodo de la raíz Las muestras de tratamiento se prepararon como sigue:

Citral - Se añadió 1 ml de citral a 400 ml de agua destilada estéril y se mezcló con una batidora doméstica durante 40 segundos. Se etiquetó como 2500 ppm y se diluyó para obtener soluciones de ensayo a 500, 250, 125 y 62,5 ppm. Citral y timol - Se disolvió 1,0 g de timol en 1 ml de citral y se mezcló en 400 ml de agua como para el citral solo. Se marcó 2500 ppm y se diluyó para obtener soluciones de ensayo a 500, 250, 125 y 62,5 ppm.

Control - Se utilizó agua como control.

Los juveniles de nematodos se recogieron en agua y se añadieron de 0,1 a 0,15 ml a cada pocillo de una placa de ensayo de plástico. Se añadió 1,0 ml de las soluciones de ensayo a cada pocillo. Se realizaron observaciones al microscopio después de 24 y 48 horas como se describe en el Ejemplo 4. Los nematodos muertos adoptan una posición recta y no se mueven cuando se les sondea con una aguja fina. Los nematodos vivos se mueven con un movimiento ondulante, como una ola.

Los resultados de dos experimentos se presentan a continuación en las tablas 7 y 8. Las cifras indicadas se refieren al porcentaje de nematodos muertos tras el examen microscópico y son la media de 2 réplicas.

Tabla 7 - Ef l l i n r l v nil l r íz 24 48 horas

Tabla 8 - Ef l l i n r l v nil l r íz 24 horas.

Los resultados demuestran la capacidad del citral solo y de una mezcla de citral y timol para eliminar nematodos a bajas concentraciones. Las tasas de eliminación en la tabla 7 después de 48 horas fueron superiores al 90% para ambas mezclas en concentraciones de 250 ppm y 500 ppm. La concentración de 125 ppm mostró una tasa de mortalidad inferior. Las tasas de mortalidad de la tabla 8 muestran altas tasas de mortalidad después de 24 horas para concentraciones tan bajas como 62,5 ppm.

La mezcla de timol y citral no mostró un aumento significativo de la tasa de mortalidad en comparación con el citral solo. Los resultados muestran que el citral es un nematicida eficaz incluso a bajas concentraciones.

Ejemplo de referencia 8 - Efectos del citral sobre el nudo de la raíz

Nematodos frente a nematodos saprófagos

El propósito de este experimento era demostrar que el citral elimina selectivamente a los nematodos dañinos de la raíz por encima de los nematodos saprófagos, que no son dañinos, y de hecho pueden ser beneficiosos para la planta y el suelo. Esta eliminación selectiva es un efecto sorprendente que significa que el tratamiento con terpenos puede eliminar a los nematodos parásitos, pero no eliminar la microfauna beneficiosa del suelo.

Se produjeron mezclas acuosas de prueba que comprendían 250 ppm de citral solo y 250 ppm de citral y 10% de tween según las técnicas descritas en el Ejemplo de referencia 7 anterior. Estas composiciones se incubaron con nematodos saprófagos y nódulos de la raíz y se evaluó la tasa de mortalidad al microscopio. Los nematodos saprófagos vivos se mueven rápidamente en el agua. El control utilizado fue el de los nematodos en agua sola.

Los resultados se presentan en las Tablas 9 y 10 siguientes. Las cifras indicadas se refieren al porcentaje de nematodos muertos tras el examen microscópico y son la media de 2 réplicas.

Tabla 9- Actividad nematicida del citral sobre los nematodos de la raíz % muertos

Tabla 10- Actividad nematicida del citral sobre los nematodos sa rófa os % muertos

Los resultados muestran claramente que el citral elimina a los nematodos patógenos de la raíz con una tasa de mortalidad mucho mayor que la de los nematodos beneficiosos saprófagos. Después de 48 horas, la tasa de mortalidad de los nematodos de la raíz fue del 100% en todas las mezclas de prueba, mientras que en el caso de los nematodos saprófagos fue sólo del 50-53%. Los resultados no se vieron afectados significativamente por la inclusión de Tween 80. Los resultados demuestran que los terpenos tienen la capacidad de eliminar selectivamente a los nematodos patógenos mientras permiten que los nematodos beneficiosos sobrevivan en el suelo. Esto daría lugar a un entorno de suelo más saludable tras el tratamiento que un tratamiento que mate a toda la población de nematodos del suelo. En primer lugar, esto se debe a que los nematodos beneficiosos estarían presentes en el suelo después del tratamiento y, en segundo lugar, no habría un "vacío" de nematodos en el suelo que podría llenarse con nematodos patógenos u otros patógenos. Cabe esperar que una concentración muy alta de terpeno pueda dar lugar a una mayor tasa de mortalidad de nematodos saprófagos, reduciendo así la selectividad del tratamiento. Por lo tanto, en el uso en el campo, puede seleccionarse la concentración mínima que logre la tasa de mortalidad deseada en los nematodos de la raíz u otros nematodos parásitos, maximizando así la selectividad.

Ejemplo de referencia 9 - Efecto del pH en la actividad nematicida de las composiciones que contienen Citral. Se realizó el siguiente protocolo para evaluar el efecto del pH en las soluciones de prueba que contienen citral.

Se prepararon soluciones de citral a concentraciones de 250, 125 y 62,5 ppm. Se prepararon soluciones de prueba de estas tres concentraciones a diferentes pH ajustando el pH con HCl o NaOH a pH 4, 7 y 10.

Un lote de soluciones de prueba se utilizó inmediatamente y otro se dejó durante 24 horas antes de su uso. El método de administración a los nematodos y el recuento de la tasa de mortalidad es el mismo que el de los protocolos anteriores.

Los resultados se muestran en las tablas 11 y 12. Las cifras indicadas se refieren al porcentaje de nematodos muertos tras el examen microscópico y son la media de 2 réplicas.

T l 11 - Ef l ir l fr r niv l H r l n m l r íz n m m r

Tabla 12 - Efecto del citral de un día de duración a tres niveles de pH sobre los nematodos de la raíz (% de nematodos muertos

Los resultados demuestran que, en general, las soluciones de prueba pierden eficacia si se dejan durante un día antes de su uso. Sin embargo, se observó que las soluciones de citral con pH bajo (es decir, 4) no perdieron eficacia en tal medida y, de hecho, la muestra de 250 ppm aumentó su eficacia después de dejarla durante un día. En todas las concentraciones probadas, las muestras de pH bajo no mostraron una caída tan significativa de la eficacia después de ser dejadas en comparación con las contrapartes de pH neutro y alto.

Esto demuestra que un pH bajo del citral es beneficioso para conservar la eficacia del citral como nematicida a lo largo del tiempo. Las razones de esto no están claras, pero puede ser el resultado de la estabilización del citral y la prevención de la degradación.

Por lo tanto, está claro que ajustar el pH de una composición nematicida que contenga citral para que sea ácido (es decir, un pH inferior a 7) sería beneficioso para prolongar su acción.

Ejemplo de referencia 10 - Comparación de la actividad nematicida del Citral de alta pureza (98% de pureza) con el Citral de baja pureza (80% de pureza).

El citral está disponible comercialmente en 2 formas - regular (98% puro) y técnico (80% puro). El siguiente protocolo se llevó a cabo para determinar si el citral técnico es una alternativa viable al citral puro.

Se produjeron composiciones de citral regular y técnico a 250 y 125 ppm en Tween 80 al 1% y se incubaron con nematodos de la raíz de la misma manera que se describió anteriormente. Se realizaron observaciones de la tasa de muerte (porcentaje de muertos) a las 21 y 42 horas.

Los resultados se muestran en la Tabla 13 y son la media de cuatro réplicas.

T l 1 - r n m i m r

Los resultados indican que tanto el citral normal como el técnico eliminan eficazmente a los nematodos a concentraciones de 250 ppm. Por lo tanto, el citral técnico puede utilizarse como una alternativa más barata al citral normal.

Ejemplo de referencia 11 - Efectos nematicidas del citral en el suelo

Se llevó a cabo el siguiente protocolo para evaluar las propiedades nematicidas de los nematodos en el suelo.

Metodología: Los nematodos utilizados para el análisis procedían de suelos de cultivos agrícolas comerciales. Las especies de nematodos incluían nematodos de la raíz y cítricos. Antes de comenzar cada estudio, se contaron los nematodos y se evaluó su viabilidad. En cada experimento, las muestras de suelo se infectaron con una sola especie de nematodo. Se colocaron tres cantidades medidas de tierra (250 g) en grandes contenedores de plástico de PVC.

La humedad del suelo se evaluó pesando una muestra de suelo y secándola después en un horno de secado. El contenido de humedad del suelo se confirmó utilizando un instrumento "Hydroscout". En todos los casos, el contenido de humedad medido por ambos métodos estaba dentro de la resolución de los instrumentos. La determinación del contenido de agua del suelo permitió calcular el volumen de la solución de terpeno que se diluiría al mezclarse con el suelo.

Se preparó una serie de diluciones de citral en agua (de 500 ppm a 62,5 ppm) de manera que, al añadirlas a las muestras de suelo, se obtuvieran las proporciones requeridas. Estas diluciones fueron por volumen y no por las proporciones de masa más comúnmente utilizadas. La razón de utilizar diluciones por volumen era simplemente por comodidad, ya que permitía utilizar una micropipeta o un cilindro para medir el terpeno. La relación de masas de la solución "en suelo" y "en agua" podía calcularse simplemente multiplicando las ppm de terpeno por su densidad (0,92 g/ml).

La solución de terpenos se añadió a cada tubo de ensayo que contenía una muestra pesada de suelo infectado por nematodos. La solución de terpenos y la tierra se mezclaron invirtiendo el tubo de ensayo varias veces. Los tubos de ensayo que contenían la tierra y la solución de terpenos se dejaron reposar en bastidores en el laboratorio durante 48 horas-72 horas, dependiendo de la supervivencia de los nematodos no tratados. En cada experimento se trató un grupo de control con agua destilada. El porcentaje de mortalidad (eliminado) en los grupos de tratamiento se comparó con la población de control.

Los nematodos se extrajeron mediante "tamizado y extracción por niebla" (Ayoub, S.M. 1977) antes de ser contados. Criterios de evaluación: Se realizaron recuentos de nematodos para determinar la proporción de nematodos que sobrevivieron y murieron en cada grupo de tratamiento.

Tabla 14 - Recuento de nematodos antes del tratamiento

Los resultados se muestran en las tablas 15 y 16.

Tabla 15 - Tratamiento de los nematodos de la raíz con solución de ter eno.

Tabla 1 peno

Se repitió el protocolo, esta vez utilizando sólo citral a una concentración de 500 ppm. Los resultados se muestran a continuación en las tablas 17 a 19.

Tabla 17 - Recuentos de nematodos antes del tratamiento

Tabla 18 - Tratamiento de los nematodos de la raíz con solución de ter eno

Tabla 19 - Tratamiento de los nematodos de los cítricos con solución de ter eno

Se volvió a realizar el experimento, esta vez con los siguientes cambios:

- Se utilizó un rango de dosis de 125ppm-750ppm.

- Se utilizaron tubos de vidrio que contenían 150 g de tierra, a diferencia de los tubos de PVC de los experimentos anteriores.

Los resultados se muestran en la Tabla 20.

Tabla 20 - Tratamiento de nematodos de la raíz con solución de ter eno

Todos los resultados muestran que los terpenos son nematicidas eficaces en el suelo. Esto apoya los datos ya proporcionados que muestran que los terpenos son nematicidas eficaces in vitro. Las concentraciones de terpeno tan bajas como 125 ppm demuestran una fuerte actividad nematicida en el suelo, aunque las concentraciones de 250 ppm y superiores mostraron tasas de mortalidad más consistentes.

Ejemplo de referencia 12 - Demostración de la carga de terpenos en partículas de levadura de Bakers y partículas de glucano de levadura purificado

Se realizó el siguiente protocolo para demostrar que los terpenos se cargarían en las paredes celulares de la levadura y en otras partículas de glucano de levadura.

Se prepararon emulsiones de citral y L-carvona mezclando 150 pl del terpeno con 100 pl de Tween 80 al 10% en agua y 250 ml de agua.

Las partículas de levadura de Baker (YP) o las partículas de glucano de levadura Levacan™ (YGP), disponibles en Savory Systems International, Inc., Branchburg, NJ, se mezclaron con agua para formar una suspensión de 250 mg/ml. Se mezclaron 500 pl de la suspensión de YP o YGP y 250 pl de la emulsión de terpenos y se incubaron durante la noche bajo agitación constante. Se utilizaron 500 pl de suspensión de YP o YGP y 500 pl de agua como control. A continuación, las partículas se lavaron con agua hasta que quedaron libres de la emulsión externa. A continuación, las preparaciones de partículas se congelaron y liofilizaron hasta que se secaron.

A continuación, las partículas se rehidrataron y se examinaron al microscopio de luz. Los resultados se muestran en las Figs. 1 a 4.

La Fig. 1 muestra estructuras esféricas con una zona oscura en su centro, se trata de partículas huecas de glucano vacías. Las Figs. 2 y 3 muestran estructuras esféricas con una apariencia hinchada con un interior de color claro, estas son partículas con terpeno encapsulado en la cavidad central - citral en la Fig. 2 y L-carvona en la Fig. 3. En las Figs. 2 y 3 también se pueden ver pequeñas manchas de terpeno libre, por ejemplo, en la parte superior de la Fig. 2, justo a la izquierda del centro. La figura 4 muestra la emulsión de terpeno como pequeñas manchas de terpeno suspendidas en agua.

Ejemplo de referencia 13 - Determinación de los niveles máximos de carga de citral y L-carvona en las partículas de levadura de Baker (YP)

Se realizó el siguiente protocolo para determinar las cantidades máximas de terpenos que se cargarían en el YP.

- Las emulsiones de L-carvona y citral se prepararon sonicando 4,5 g del terpeno con 0,3 ml de agua.

- Se preparó una solución de Tween-80 al 10% sonicando 4,5 g de Tween-80 en 40,5 ml de agua.

- La suspensión de YP se preparó mezclando YP con agua para formar una suspensión de 20 mg/ml.

- Las reacciones de encapsulación se establecieron como se describe en la Tabla 21.

La emulsión de citral o L-carvona-agua se mezcló con YP y el surfactante Tween 80 durante la noche a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos y se puntuó la aparición de terpeno libre flotando en la capa acuosa. Los resultados se muestran en la columna de la derecha etiquetada como terpeno libre de la Tabla 21.

La expresión "terpeno libre" se refiere a la presencia visible de terpeno en la mezcla de reacción centrifugada. La ausencia de terpeno libre indica la completa absorción del terpeno por las partículas. El mayor volumen de terpeno absorbido por las partículas, evidenciado por la ausencia de terpeno libre, se registró como el volumen máximo de emulsión de terpeno absorbido.

Tabla 21

Como se desprende de los resultados, el YP es capaz de absorber y encapsular al menos 16,5 pl de emulsión de ^{terpeno de L-carvona o al menos 5 pl de emulsión de citral por cada 10 mg de} Y^p.

Ejemplo de referencia 14 - Demostración de la mejora de la carga de terpenos con tensioactivos y determinación de la relación óptima Tween- 80:Terpeno

El siguiente protocolo se realizó para demostrar que la presencia de tensioactivos mejora la carga de terpenos y para determinar el nivel mínimo de tensioactivo Tween-80 necesario para la reacción de carga de terpenos YP.

Las emulsiones de L-carvona y citral se prepararon sonicando 4,5 g del terpeno con 0,3 ml de agua.

Se preparó una solución de Tween-80 al 10% sonicando 4,5 g de Tween-80 en 40,5 ml de agua.

La suspensión de YP de Baker se preparó mezclando YP con agua para formar una suspensión de 250 mg/ml.

Las reacciones de carga se establecieron como se muestra en la Tabla 22 a continuación.

La emulsión de citral o L-carvona-agua se mezcló con YP con 0 - 10% v/v de surfactante Tween 80 durante la noche a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos y se puntuó la aparición de terpeno libre flotando en la capa acuosa. Los resultados se muestran en la columna de la derecha etiquetada como terpeno libre de la Tabla 22.

La expresión "terpeno libre" se refiere a la presencia visible de terpeno en la mezcla de reacción centrifugada. La ausencia de terpeno libre indica la completa absorción y encapsulación del terpeno por el YP. El mayor volumen de terpeno absorbido por el YP, evidenciado por la ausencia de terpeno libre, se registró como el volumen máximo de emulsión de terpeno absorbido.

Tabla 22

Como puede observarse en los resultados, una concentración de Tween-80 del 1% (es decir, 100 ml de Tween-80 al 10% en 1000 ml de mezcla de reacción) es suficiente para permitir la absorción completa del terpeno en la reacción anterior. Una concentración de Tween-80 del 2% no causa ninguna mejora en los resultados, mientras que con una concentración del 0,33% se observó terpeno libre. Esto indica que:

a) Los terpenos se absorben en las partículas de YP en ausencia de un tensioactivo, pero la presencia de éste aumenta significativamente la absorción de terpenos.

b) Una concentración de Tween-80 de alrededor del 1% es óptima para la carga de YP, ya que garantiza una carga adecuada y maximiza la carga de terpenos de las partículas de YP.

Ejemplo de referencia 15 - Determinación de la carga máxima de terpenos y de la encapsulación en niveles elevados de partículas de levadura de Baker (YP)

Se realizó el siguiente protocolo para determinar las cantidades máximas de terpenos que se cargarían en el YP a niveles altos de YP.

- Las emulsiones de L-carvona y citral se prepararon sonicando 4,5 g del terpeno con 3 ml de Tween al 1%.

- Se preparó una solución de Tween-80 al 5% sonicando 0,5 g de Tween-80 en 9,5 ml de agua.

- La suspensión de YP se preparó mezclando YP con agua para formar una suspensión de 250 mg/ml.

- Las reacciones de encapsulación se establecieron como se indica en la Tabla 23.

La emulsión de citral o L-carvona-agua se mezcló con YP y el surfactante Tween 80 durante la noche a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos y se puntuó la aparición de terpeno libre flotando en la capa acuosa. Los resultados se muestran en la columna de la derecha etiquetada como terpeno libre de la Tabla 23.

La expresión "terpeno libre" se refiere a la presencia visible de terpeno en la mezcla de reacción centrifugada. La ausencia de terpeno libre indica la completa absorción del terpeno por el YP. El mayor volumen de terpeno absorbido por el YP, como se evidencia por la ausencia de terpeno libre, se registró como el volumen máximo de emulsión de terpeno absorbido.

Como puede verse en los resultados de la Tabla 9, la YP es capaz de absorber y encapsular terpenos a una alta concentración de YP. La YP absorbió y encapsuló al menos 112,5 ml de emulsión de terpenos de L-carvona o al menos 75 ml de emulsión de citral por 125 mg de YP. Esto demuestra que la reacción de encapsulación de terpenos es independiente de la concentración de YP dentro de los rangos probados.

Ejemplo de referencia 16 - Examinar las partículas disponibles en el mercado para la absorción de terpenos Se realizó el siguiente protocolo para analizar las propiedades de carga de diferentes tipos de partículas. Las partículas estudiadas fueron Baker's Yeast Particles (Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO), Nutrex™ Walls (Sensient Technologies, Milwaukee, WI), SAF-Mannan™ (SAF Agri, Minneapolis, MN), Nutricept Walls™ (Nutricepts Inc, Burnsville, MN), Levacan™ (Savory Systems International, Inc., Branchburg, NJ) y WGP™ (Alpha-beta Technology, Inc. Worcester, MA).

Las emulsiones de L-carvona y citral se prepararon sonicando 7 g de terpeno 3 ml de Tween-80 al 3,3%. En la Tabla 24 se compara la pureza con el número de partículas de levadura por mg y la relación peso/volumen de sólidos empaquetados.

Tabla 24

De la Tabla 24 se puede concluir que el número de partículas por mg es inversamente proporcional a la pureza. Así, el número de partículas por mg de w Gp es casi 10 veces mayor que el YP de Baker.

Las suspensiones de YP se prepararon como sigue:

- La suspensión de partículas de levadura de Baker (YP) se preparó mezclando 250 mg de YP / ml de Tween 80 al 1%.

- La suspensión de Nutrex se preparó mezclando 163 mg de Nutrex YGP / ml de Tween 80 al 1%.

- La suspensión de SAF Mannan se preparó mezclando 234 mg de Biospringer YGP / ml de Tween 80 al 1%.

- La suspensión de Nutricepts se preparó mezclando 99 mg de Nutricepts YGP / ml de Tween 80 al 1%.

- La suspensión de Levacan se preparó mezclando 217 mg de Lev YGP / ml de Tween 80 al 1 %.

- La suspensión de WGP se preparó mezclando 121 mg de WGP YGP / ml de Tween 80 al 1%.

El volumen empaquetado de las partículas mencionadas es idéntico, lo que significa que se ensay o un número igual de partículas.

Las reacciones de carga se prepararon como se muestra en la Tabla 25 y se dejaron incubar durante la noche. Las muestras se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos y se puntuó la aparición de terpenos libres flotando en la capa acuosa y el color de los terpenos encapsulados en el pellet. Los resultados se muestran en las dos columnas de la derecha de la Tabla 25. El mayor volumen de terpeno absorbido por las partículas, según la ausencia de terpeno libre, se registró como el volumen de emulsión de terpeno absorbido.

Tabla 25

A partir de los resultados se llegó a las siguientes conclusiones:

- Las partículas purificadas con un bajo contenido en lípidos fueron menos eficaces en la absorción de terpenos. - Las partículas menos puras fueron más eficaces en la absorción de terpenos.

- El producto de degradación amarillo del citral no se formó cuando se encapsuló en SAF-Mannan™.

- Basándose en la carga cualitativa en el nivel de terpeno único probado, SAF Mannan™ parece ser el mejor, Nutrex™ el segundo y el tercero de Baker.

Ejemplo de referencia 17 - Cinética de carga de terpenos en varios tipos de partículas y diferentes temperaturas de incubación.

Se adoptó el siguiente protocolo para comparar la cinética de carga de varios tipos de partículas de levadura.

Las emulsiones de L-carvona y citral se prepararon sonicando 7 g de terpeno con 3 ml de Tween-80 al 3,3%.

Se preparó una solución de Tween-80 al 1% sonicando 1 ml de Tween-80 al 10% en 10 ml de agua.

- El YP de Baker's se preparó mezclando 5 g de YP de Baker's en 20 ml de Tween-80 al 1%.

- La suspensión de Nutrex™YGP se preparó mezclando 2 g de Nutrex™ YGP en 20 ml de Tween-80 al 1%.

- La suspensión de SAF Mannan™ se preparó mezclando 2 g de SAF Mannan™ en 20 ml de Tween-80 al 1%. Las reacciones de carga se establecieron como se muestra en la Tabla 26.

Las reacciones se incubaron durante 1, 3, 6, 9 y 24 horas a temperatura ambiente o 37 °C. Tras la incubación, las muestras se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos y se puntuó la aparición de terpeno libre flotando en la capa acuosa. Los resultados se muestran en las dos columnas de la derecha de la Tabla 26. El mayor volumen de terpeno absorbido por las partículas, evidenciado por la ausencia de terpeno libre, se registró como el volumen de emulsión de terpeno absorbido. El color del gránulo encapsulado se calificó a las 24 horas.

Tabla 26

A partir de los resultados mostrados en la Tabla 26 y de otras observaciones se pueden sacar las siguientes conclusiones:

- La reacción de carga del terpeno dura entre 1 y 3 horas.

- La carga de terpenos se produce más rápidamente a 37 °C que a temperatura ambiente.

- SAF Mannan™ parecen ser partículas preferibles por dos razones:

- Absorción más rápida y completa de ambos terpenos.

- El citral permanece estable cuando se carga, como lo demuestra la ausencia de color amarillo, característico de la degradación del citral, después de 24 horas a 37 °C.

Ejemplo de referencia 18 - Examen de una gama de terpenos individuales y combinaciones de terpenos para la carga de partículas

Se adoptó el siguiente protocolo para comparar la eficiencia de carga del YP de Baker frente al SAF Mannan™.

Las emulsiones de terpeno se prepararon como sigue:

- L-carvona - 4,5 g de L-carvona en 1,5 ml de Tween-80 al 3,3%.

- Citral - 4,5 g de citral en 1,5 ml de Tween-80 al 3,3%.

- Mezcla de timol/L-carvona (T/L)- 2,25 g de timol y 2,25 g de L-carvona en 1,5 ml de Tween-80 al 3,3%.

- Eugenol - 4,5 g de eugenol en 1,5 ml de Tween-80 al 3,3%.

- Geraniol - 4,5 g de geraniol en 1,5 ml de Tween-80 al 3,3%.

- Mezcla de Citral/L-carvona/Eugenol (C/L/E) - 1,5 g de citral, 1,5 g de L-carvona, 1,5 g de eugenol en 1,5 ml de Tween-80 al 3,3%.

Para estos experimentos se utilizaron emulsiones compuestas por una relación terpeno:agua:tensioactivo de 0,75:0,3:0,05.

Se mezclaron volúmenes crecientes de emulsión de terpeno con 250 mg/ml de YP de Baker o 250 mg/ml de SAF Mannan™ durante la noche a temperatura ambiente como se muestra en las Tablas 27 y 28. Las muestras se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos y se puntuó la aparición de terpeno libre flotando en la capa acuosa. Se registró como volumen de emulsión de terpenos absorbida el mayor volumen de Baker's YP o SAF Mannan™ evidenciado por la ausencia de terpeno libre. Se registró el color de los terpenos encapsulados en el pellet. Los resultados de las Tablas 27 y 28 muestran que todas las combinaciones de terpenos y las de un solo terpeno se cargaron eficazmente en las partículas de Baker's YP o SAF Mannan.

Tabla 27 - Evaluación de la car a de Baker's YP de diferentes ter enos mezclas de ter enos.

Tabla 28 - Evaluación de la car a de manano SAF de diferentes ter enos ^ mezclas de ter enos.

A partir de los resultados se hicieron las siguientes observaciones:

- Todos los terpenos parecían cargarse en el YP de Baker y el SAF Mannan.

- El SAF Mannan tiene una mayor capacidad de carga de terpenos que el YP de Baker. - Las mezclas de dos y tres vías de terpenos también parecen cargar eficazmente.

- El terpeno Eugenol parece tener una mayor densidad que las partículas y el agua, ya que se encontró asociado al pellet.

- Para el SAF Mannan, los niveles de carga más altos y las partículas más ligeras dieron lugar a partículas cargadas que flotaban en la superficie de la capa acuosa para el citral y el geraniol.

- El citral fue protegido de la oxidación por el SAF Mannan pero no por el YP de Baker.

Se determinó la carga máxima aproximada para cada tipo de partícula y se muestra en las tablas 29 y 30 siguientes. El porcentaje de carga representa una relación entre la cantidad de terpeno cargado y la cantidad de partícula presente (peso por peso).

Tabla 29 - Car a máxima de ter enos en el YP de Baker.

Tabla 30 - Car a máxima de ter enos en SAF Mannan.

Ejemplo de referencia 19 - Evaluación de la estabilidad de los terpenos en emulsiones acuosas y formulaciones de terpenos encapsulados

La estabilidad del terpeno se evaluó mediante la observación de las formulaciones de citral para la formación de un producto de oxidación de color amarillo. Como se observa en la columna de la derecha en las Tablas 25 - 28, las emulsiones de citral y el Bakers YP encapsulado con citral adquirieron un color amarillo progresivamente creciente con el tiempo. Sin embargo, la encapsulación de citral en SAF Mannan™ aumentó la estabilidad del citral, como lo demuestra la reducción o ausencia de color amarillo con el tiempo.

Ejemplo de referencia 20 - Carga de terpenos en agua mínima

El siguiente protocolo se llevó a cabo para evaluar la posibilidad de que la carga de terpenos y la encapsulación en YP pudieran llevarse a cabo a un nivel de sólidos de partículas de levadura (YP) muy alto para permitir la extrusión directa de la formulación cargada en un secador de lecho fluidizado. Se determinó que la cantidad mínima de agua para hidratar completamente las partículas de SAF Mannan™ era de 3,53 g de agua por g de sólidos. Esto define el volumen hidrodinámico (VH) o la capacidad de absorción de agua de las partículas. Con este nivel de agua, las partículas hidratadas tienen la consistencia de una masa rígida que es tixotrópica, es decir, se adelgaza al cizallamiento como la mayonesa. La adición de agua hasta un 40% por encima del HV da lugar a una pasta espesa y fluida. La reacción estándar que se ha utilizado en los ejemplos anteriores se ha llevado a cabo a 3 X HV de agua.

Se llevaron a cabo una serie de reacciones de carga de terpeno (L-carvona) manteniendo constante la relación partícula:terpeno:Tween (1: 0,44:0,04) y variando la cantidad de agua en el sistema desde el HV (3,53 g) hasta el HV 40% de agua (4,92 g). Los controles fueron el sistema de carga estándar que utiliza 3 X de agua HV, las reacciones de sólo partículas y de sólo terpenos. Tras la incubación de una noche, se evaluaron muestras de las mezclas al microscopio para detectar terpenos libres y pruebas de absorción de terpenos en las partículas, así como las características de flujo del material mediante la evaluación del flujo en tubos invertidos durante 15 minutos. Además, se evaluó la presencia de aceite libre hidratando la mezcla de reacción con 5 X HV, agitando en vórtex para obtener una dispersión completa de las partículas y centrifugando para sedimentar el terpeno encapsulado en las partículas. Los resultados se muestran en la Tabla 31 y en las Figs. 7 a 12. Las Figs. 7 a 12 muestran los resultados de carga de los siguientes tubos:

- Fig. 7 - Tubo 3

- Fig. 8 - Tubo 5

- Fig. 9 - Tubo 6

- Fig. 10 - Tubo 8

- Fig. 11 - Tubo 10

- Fig. 12 - Tubo 11

Tabla 31

Los resultados mostrados en la Tabla 31 y las Figs. 7 a 12 demuestran que la carga de terpeno y la encapsulación en las partículas se produjo en todas las proporciones de agua evaluadas. Sorprendentemente, se produjo una carga equivalente incluso cuando la reacción de carga tenía lugar en una reacción con la consistencia de una masa rígida utilizando la cantidad mínima de agua para hidratar las partículas. La ausencia de terpeno libre se observó microscópicamente (Figs. 7 a 12) y en el bajo nivel de terpeno en los sobrenadantes, como lo demuestra una marcada reducción de la turbidez del sobrenadante en comparación con el control de sólo terpeno.

Estos resultados amplían nuestra comprensión de las condiciones para cargar terpenos en partículas de glucano huecas. La flexibilidad de utilizar un volumen mínimo de agua para hidratar las partículas durante el proceso de carga permitirá cargar los terpenos en condiciones en las que la mezcla de reacción tenga una consistencia maleable similar a la de la masa, utilizando amasadoras de superficie barrida estándar para alimentos. La consistencia de la mezcla final cargada de terpenos con alto contenido en sólidos es adecuada para la extrusión directa para formar fideos y gránulos para el secado en lecho fluidizado.

Las instalaciones adecuadas para aumentar la producción de esta manera requerirían:

- Homogeneizador Gaulin, o equivalente para producir una emulsión de terpenos estable.

- Tanque de mezcla de masa de superficie barrida.

- Extrusora.

- Secador de lecho fluidizado.

Ejemplo de referencia 21 - Evaluación de un agente hidrocoloide intersticial para ayudar a la dispersión en partículas huecas de glucano secas que encapsulan una dispersión de componentes terpénicos cuando se rehidratan.

Se adoptó el siguiente protocolo para evaluar el efecto de un hidrocoloide intersticial para aumentar las formulaciones de terpenos encapsulados en partículas huecas de glucano secas para que se dispersen cuando se hidraten.

- Partículas SAF Mannan™

- 0,1% Tween 80

- L-carvona

- Goma xantana - 1% p/v en 0,1% de Tween 80

Se evaluó el efecto del aumento de los niveles de goma xantana en la dispersión de L-carvona encapsulada en partículas huecas de glucano secas en agua, cargando L-carvona en SAF Mannan incubando 1,1 g de una emulsión de L-carvona (relación L-carvona:agua:tensioactivo de 0,75:0,3:0,05) con 1 g de SAF Mannan y 4,4 g de Tween 80 al 0,1% que contenía 0 - 1% de goma xantana, como se muestra en la Tabla 32.

Tabla 32

Los resultados de la Tabla 32 y las Figs. 13 a 20 demuestran que la inclusión de un hidrocoloide de alto peso molecular durante el secado del terpeno encapsulado en partículas ayuda a la hidratación y dispersión de las micropartículas en una suspensión uniforme. Otros ejemplos de tales agentes hidrocoloides son la maltodextrina, los alginatos o similares. También puede valer la pena incluir un recubrimiento de pellets para aumentar la estabilidad de los terpenos cargados, y para proporcionar una liberación sostenida de terpeno.

Ejemplo 22 - Actividad nematicida de los terpenos encapsulados

Se prepararon preparaciones de paredes celulares de levadura que encapsulan citral según los procedimientos descritos anteriormente. Las partículas huecas de glucano contenían 17,5% de citral, y las partículas estaban presentes en las preparaciones de prueba a una concentración de 1000 ppm. Esto significa que los terpenos estaban efectivamente presentes a una concentración de 175 ppm.

Se añadió 1,0 ml de los preparados de prueba a 0,1 a 0,15 ml de agua que contenía nematodos de la raíz. Se añadió 1,0 de agua a los nematodos como control.

Se hicieron observaciones como [revopis;u descrobado y se evaluó la tasa de muerte (es decir, el porcentaje de muertos) después de 24 y 48 horas. Los resultados que se muestran a continuación en la Tabla 13 son un promedio de 2 conjuntos de resultados.

Tabla 33 - Actividad nematicida de la solución ter énica enca sulada 17,5% de citral @ 1000ppm)

Los resultados demuestran que las partículas huecas de glucano que encapsulan terpenos son eficaces para eliminar a los nematodos de la raíz a una concentración de partículas de 1000 ppm, que corresponde a una concentración de citral de sólo 175 ppm.

Así, las partículas huecas de glucano que encapsulan terpenos parecen ser tan eficaces como los terpenos en solución o con tensioactivos como nematicidas. La actividad nematicida se mantiene a pesar de que el terpeno esté encapsulado dentro de la partícula. Cabe esperar que una mayor concentración de terpenos dentro de las partículas de glucano huecas, o una mayor concentración de las partículas, dé lugar a una tasa de mortalidad aún mayor, como ocurre con los terpenos en solución o con tensioactivos.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un método para eliminar nematodos, dicho método comprende el paso de aplicar a por lo menos una porción, preferiblemente toda, de un volumen de suelo que está infestado de nematodos una cantidad efectiva de una composición nematicida que comprende un componente terpénico,

donde la composición nematicida comprende partículas huecas de glucano que encapsulan el componente terpénico, donde las partículas huecas de glucano tienen un contenido en lípidos superior al 5% en peso, y

donde las partículas huecas de glucano son paredes celulares de levadura que se preparan mediante la extracción y purificación de la fracción particulada insoluble de los componentes solubles de una célula de levadura antes de la encapsulación del componente terpénico.

2. El método según la reivindicación 1, donde el componente terpénico comprende uno o más terpenos seleccionados del grupo que consiste en citral, pineno, nerol, b-ionona, geraniol, carvacrol, eugenol, carvona, terpeniol, anetol, alcanfor, mentol, limoneno, nerolidol, farnesol, fitol, caroteno, escualeno, timol, tocotrienol, alcohol perílico, borneol, mirceno, simeno, careno, terpeneno y linalol.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, donde las paredes de la levadura proceden de células de levadura de Baker.

4. El método según la reivindicación 1 o 2, donde las partículas huecas de glucano se obtienen mediante al menos uno de los siguientes pasos antes de la encapsulación del componente terpénico:

(i) de la corriente de residuos insolubles de un proceso de fabricación de extracto de levadura;

(ii) extracción con álcali;

(iii) extracción con ácido; y

(iv) extracción con un disolvente orgánico.

5. El método según cualquier reivindicación anterior, donde las partículas huecas de glucano tienen un contenido en lípidos superior al 10% en peso.

6. El método según cualquier reivindicación anterior, donde el componente terpénico se asocia con un tensioactivo.

7. El método según la reivindicación 6, donde el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en lauril sulfato de sodio, polisorbato 20, polisorbato 80, polisorbato 40, polisorbato 60, éster de poliglicerilo, monoleato de poliglicerilo, monocaprilato de decaglicerilo, dicaprilato de propilenglicol, monoestearato de triglicerol, monooleato de polioxietilenosorbitan, y mezclas de ellos.

8. El método según cualquier reivindicación anterior, donde la composición nematicida se aplica al suelo mediante pulverización o riego.

9. Un método para preparar una composición nematicida que comprende partículas huecas de glucano que encapsulan un componente terpénico, dicho método comprende los pasos de;

a) proporcionar un componente terpénico;

b) proporcionar partículas huecas de glucano;

c) después el paso b), incubar el componente terpénico con las partículas huecas de glucano en condiciones adecuadas para la encapsulación de terpenos; y

d) recuperar las partículas de glucano que encapsulan el componente terpénico.

10. El método según la reivindicación 9, que comprende además el paso de secar las partículas de glucano que encapsulan el componente terpénico, tal como por liofilización, secado en lecho fluidizado, secado en tambor o secado por aspersión.

11. Una composición nematicida que comprende un componente terpénico para la exterminación de nematodos en suelos y/o plantas infectadas, donde la composición nematicida comprende partículas huecas de glucano que encapsulan el componente terpénico, donde las partículas huecas de glucano tienen un contenido en lípidos superior al 5% en peso, y donde las partículas huecas de glucano son paredes celulares de levadura que se preparan mediante la extracción y purificación de la fracción particulada insoluble de los componentes solubles de una célula de levadura antes de la encapsulación del componente terpénico.