PT2338332E - Partícula oca de glucano ou partícula de parede celular que encapsula um componente de terpeno - Google Patents

Partícula oca de glucano ou partícula de parede celular que encapsula um componente de terpeno Download PDF

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Description

ΕΡ 2 338 332/ΡΤ DESCRIÇÃO "Partícula oca de glucano ou partícula de parede celular que encapsula um componente de terpeno" A presente invenção refere-se a composições contendo terpenos e partículas ocas de glucano ou partículas de parede celular e métodos para a preparação de tais composições. As composições aumentam a estabilidade e a actividade dos terpenos e proporcionam um veículo adequado para os mesmos. A invenção também se refere a métodos de utilização das referidas composições nos campos médico, veterinário e agrícola.
Os terpenos são compostos químicos comuns na natureza, presentes principalmente em plantas como constituintes de óleos essenciais. 0 seu componente principal é o hidrocarboneto isopreno (C5Hg)n. Exemplos de terpenos incluem citral, pineno, nerol, b-ionona, geraniol, carvacrol, eugenol, carvona, terpineol, anetol, cânfora, mentol, limoneno, nerolidol, farnesol, fitol, caroteno (vitamina Ai) , esqualeno, timol, tocotrienol, álcool perílico, borneol, mirceno, simeno, careno, terpineno e linalol.
Os terpenos são classificados como GRAS ("Generally Recognized as Safe" - Geralmente Reconhecidos como Seguros) e são usados há muitos anos na indústria de aromas e sabores. A LD50 de citral em ratos é de aproximadamente 5 g/kg, o que é uma indicação adicional da segurança relativa destes compostos. Além disso, os terpenos têm um tempo de vida relativamente curto, de aproximadamente 28 dias após exposição ao oxigénio (por exemplo, ar). Os terpenos decompõem-se em CO2 e água. Esta decomposição dos terpenos demonstra a segurança ambiental das composições e métodos da invenção.
Demonstrou-se que os terpenos inibiram o crescimento de células cancerosas, diminuíram o tamanho de tumores, diminuíram os níveis de colesterol e tiveram um efeito biocida em microorganismos in vitro. Owawunmi (Letters in Applied Microbiology, 1993, 9(3):105-108) demonstrou que meios de cultura com mais de 0, 01% de citral reduziam a 2 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ concentração de Ε. coli e que com 0,08% havia um efeito bactericida. A patente US N° 5673468 descreve uma formulação de terpeno, com base em óleo de pinho, usada como desinfectante ou agente de limpeza anti-séptico. A patente US N° 5849956 ensina que um terpeno que se encontra no arroz tem actividade antifúngica. A patente US N° 5939050 descreve um produto antimicrobiano de higiene oral com uma combinação de 2 ou 3 terpenos que demonstrou um efeito sinérgico. Várias patentes americanas (patentes US Nos 5547677, 5549901, 5618840, 5629021, 5662957, 5700679 e 5730989) revelam que determinados tipos de emulsões óleo-água têm propriedades antimicrobianas, adjuvantes e de distribuição. Demonstrou-se que os terpenos são agentes antineoplásicos alimentares eficazes e não tóxicos, que actuam através de uma variedade de mecanismos de acção (Crowell et al., Crit. Rev. Oncog., 1994,5 (1): 1-22; Crowell et al., Adv. Exp. Med. Biol. , 1996, 401: 131-136). Os terpenos geraniol, tocotrienol, álcool perilico, b-ionona e d-limoneno suprimem a actividade da HMG-CoA redutase hepática, um passo limitante na velocidade de sintese de colesterol, e diminuem moderadamente os níveis de colesterol em animais (Elson et al., J. Nutr., 1994, 124: 607-614). O d-limoneno e o geraniol reduziram tumores mamários (Elegbede et al., Carcinogenesls, 1984, 5(5): 661-664; Elegbede et al., J. Natl. Câncer Inst., 1986, 76(2): 323-325; Karlson et al., Anticancer Drugs, 1996, 7(4): 422-429) e suprimiram o crescimento de tumores transplantados (Yu et al., J. Agri. Food Chem., 1995, 43: 2144-2147).
Também se verificou que os terpenos inibiram o crescimento in vitro de bactérias e fungos (Chaumont et al.), Ann. Pharm. Fr., 1992, 50(3): 156-166; Moleyar et al., Int. J. Food Microbiol, 1992, 16(4): 337-342; e Pattnaik et al., Microbios, 1997, 89(358): 39-46) e alguns parasitas internos e externos (Hooser et al., J. Am. Vet. Med. Assoe., 1986, 189(8): 905-908). Verificou-se que o geraniol inibiu o crescimento de estirpes de Candida alblcans e Saccharomyces cerevisiae melhorando a taxa de fuga de potássio e perturbando a fluidez da membrana (Bard et al., Lipids, 1998, 23(6): 534-538). A b-ionona tem actividade antifúngica, determinada pela inibição da germinação de esporos e pela inibição do crescimento em ágar (Mikhlin et al., A. Prikl. Biokhim. Mikrobiol, 1983, 19: 795-803; Salt et al., Adam. 3 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Physiol. Molec. Plant Path, 1986, 28: 287-297). A teprenona (geranilgeranilacetona) tem um efeito antibacteriano sobre a H. pylori (Ishii, Int. J. Med. Microbiol. Virol. Parasitol. Infect. Dis., 1993, 280(1-2): 239-243). Demonstrou-se que o rosanol, um produto comercializado com 1% de óleo de rosas, inibiu o crescimento de várias bactérias (Pseudomonas, Staphylococus, E. coli e H. pylori). O geraniol é o componente activo (75%) do óleo de rosas. O óleo de rosas e o geraniol numa concentração de 2 mg/L inibiram o crescimento da H. pylori in vitro. Demonstrou-se que alguns extractos de plantas medicinais têm um efeito inibidor sobre a H. pylori, sendo o decursinol angelato, a decursina, o magnolol, a berberina, o ácido cinâmico, o decursinol e o ácido gálico os mais eficazes (Bae et al., Biol. Pharm. Buli., 1998, 21 (9): 990-992). Extractos de maçã de caju, ácido anacárdico e (E)-2-hexenal demonstraram um efeito bactericida contra H. pylori.
Os diterpenos, ou seja, o tricorabdal A (de .R. Trichocarpa), demonstraram um efeito antibacteriano muito forte contra H. pylori (Kadota et al., Zentralbl. Bakteriol, 1997, 287 (1) : 63-67) .
Soluções de 11 terpenos diferentes foram eficazes na inibição do crescimento de bactérias patogénicas em testes in vitro; os niveis entre 100 ppm e 1000 ppm foram eficazes. Os terpenos foram diluídos em água com 1% de polissorbato 20 (Kim et al., J. Agric. Food Chem., 1995, 43: 2839-2845).
Os terpenos podem ter diferentes modos de acção contra microorganismos; podem (1) interferir com a camada fosfolipidica dupla da membrana plasmática, (2) enfraquecer uma série de sistemas enzimáticos (HMG-redutase) e (3) destruir ou inactivar material genético. Acredita-se que, sendo os modos de acção dos terpenos tão básicos (por exemplo, bloqueio de colesterol), os agentes infecciosos não serão capazes de criar resistência contra terpenos. Há, no entanto, uma série de inconvenientes na utilização dos terpenos, que incluem as seguintes: 4 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ - Os terpenos sao líquidos, o que pode dificultar o seu manuseio e torná-los inadequados para determinados fins. - Os terpenos não são muito miscíveis com água e, geralmente, é necessária a utilização de detergentes, tensioactivos ou outros emulsificantes para a preparação de emulsões aquosas. No entanto, pode obter-se uma solução estável fazendo a mistura dos terpenos em condições de elevado cisalhamento. - Geralmente, as formulações de terpeno em pó seco contêm apenas uma baixa percentagem p/p de terpenos. - Os terpenos têm tendência a oxidar em sistemas de emulsão aquosa, o que torna problemático o armazenamento prolongado. Há limitações às actuais técnicas de revestimento por pulverização, extrusão, coacervação, encapsulamento molecular e secagem/arrefecimento por pulverização para proporcionar sistemas de administração de ingredientes.
As paredes celulares da levedura de panificação São ("fermento de padeiro") são derivadas das células da levedura de panificação e são compostas pelos biopolímeros insolúveis -1,3-glucano, -1,6-glucano, manano e quitina. tipicamente microesferas com diâmetro de 2-4 mícron, com um invólucro de apenas 0,2-0,3 mícron de espessura ao redor de uma cavidade aberta. Este material tem uma considerável capacidade de retenção de líquidos, absorvendo tipicamente 5-25 vezes o seu peso em líquidos. O invólucro é suficientemente poroso para permitir a passagem e absorção de cargas de até 150.000 Dalton de tamanho, através do invólucro exterior e para dentro da cavidade oca da partícula esférica. As paredes celulares da levedura de panificação têm várias propriedades distintivas, incluindo estabilidade térmica (por exemplo, para 121°C), estabilidade de cisalhamento, estabilidade de pH (por exemplo, pH 2-12) e, em concentrações elevadas, não acumulam viscosidade significativa. Para além das suas propriedades físicas, esta composição contém fibras alimentares naturais e saudáveis, que proporcionam benefícios para a saúde cardiovascular e imunológica. 5 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
As paredes celulares de levedura são preparadas a partir de células de levedura, pela extracção e purificação da fracção de partículas insolúveis dos componentes solúveis da célula de levedura. As paredes celulares fúngicas podem ser produzidas a partir do subproduto insolúvel da produção de extracto de levedura. Além disso, as células de levedura podem ser tratadas, sem romper as suas paredes celulares, com uma solução aquosa de hidróxido, a qual digere as proteínas e a porção intracelular da célula, deixando o componente da parede celular da levedura isento de contaminação proteica significativa e mantendo substancialmente a estrutura da parede celular inalterada dos glucanos ligados (1-6) e (1-3). Uma descrição mais detalhada das partículas de glucano integral e do seu processo de preparação é apresentada por Jamas et al. na patente US N° 4810646 e nos pedidos co-pendentes de patente US com números de série US Ser. N° 166929, US Ser. N° 297752 e US Ser. N° 297982 . A patente US N° 6242594, transmitida a Novogen Research Pty Ltd., descreve um método de preparação de partículas de glucano de levedura por extracção alcalina, extracção ácida e extracção com um solvente orgânico, seguidas de secagem. A patente US N° 5401727, transmitida a AS Biotech-Mackzymal, revela os métodos de obtenção de partículas de glucano de leveduras e métodos de as utilizar para promover a resistência em animais aquáticos e como adjuvante para vacinação. A patente US N° 5607677, transmitida a Alpha-Beta Technology Inc., revela a utilização de partículas ocas de glucano integral como veículo de administração e adjuvante de uma série de produtos farmacêuticos.
Outros tipos de células de levedura e fungos têm paredes celulares que não contêm glucano. As paredes celulares dessas leveduras e fungos podem ser isoladas por técnicas similares às supra mencionadas para obtenção de partículas de parede celular.
Adicionalmente, as células de muitas plantas, algas, bactérias e outros microorganismos também incluem uma parede celular. A estrutura e composição da parede celular varia de microorganismo para microorganismo, mas, de modo geral, é uma estrutura robusta e relativamente inerte. É possível obter partículas de parede celular derivadas dessas células através 6 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ de técnicas convencionais, como as mencionadas acima a respeito da levedura.
Verificou-se agora que os terpenos podem ser absorvidos e encapsulados de forma estável dentro de partículas ocas de glucano ou de partículas ocas de parede celular. 0 encapsulamento de terpenos nas referidas partículas pode ser obtido por incubação das partículas com o terpeno.
De acordo com a presente invenção, é disponibilizada uma composição incluindo uma partícula oca de glucano ou uma partícula oca de parede celular, encapsulando um componente de terpeno, em que o componente de terpeno compreende uma mistura de geraniol, timol ou eugenol. 0 termo "partícula oca de glucano", no sentido aqui utilizado, refere-se a qualquer partícula oca contendo glucano como componente estrutural. Assim, em particular, o termo inclui paredes celulares de leveduras (em formas purificadas ou não purificada) ou partículas ocas de glucano integral. 0 termo "partícula de parede celular" refere-se a uma partícula contendo a parede de uma célula (numa forma purificada ou não purificada) , da qual o glucano não é componente estrutural. Partículas adequadas incluem as paredes celulares de células de plantas, algas, fungos ou bactérias. As partículas de parede celular geralmente mantêm a forma da célula da qual derivam e, assim sendo, tal como uma partícula oca de glucano, proporcionam uma cavidade central oca adequada para o encapsulamento do componente de terpeno.
Para a presente invenção, é necessário que a partícula oca de glucano ou de parede celular seja capaz de encapsular de forma estável o componente de terpeno. De um modo geral, isto significa que a partícula oca de glucano ou a partícula de parede celular tem de ser capaz de manter a sua estrutura durante a incubação com o componente de terpeno (geralmente, o componente de terpeno está numa concentração relativamente elevada) e que o componente de terpeno tem de ser capaz de migrar para dentro da partícula. As partículas ocas de glucano e as partículas de parede celular são, em geral, formadas a partir de materiais relativamente inertes e são 7 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ porosas, podendo portanto presumir-se que, de modo geral, as partículas ocas de glucano e as partículas de parede celular serão capazes de encapsular um componente de terpeno.
As composições de acordo com a presente invenção são eficazes contra vários agentes infecciosos, incluindo bactérias, vírus, micoplasmas, fungos e/ou nemátodos.
As composições de acordo com a presente invenção podem oferecer as seguintes vantagens: - maximizar a carga de terpeno; - minimizar a carga não-encapsulada; - controlar a estabilidade da carga; - controlar a cinética de libertação da carga; - criar uma forma sólida de um terpeno líquido para aumentar a massa e uniformidade; - simplificar o manuseamento e a aplicação de terpenos; e - mascarar o cheiro e o sabor do terpeno.
Partículas ocas de glucano ou partículas de parede celular especialmente adequadas são as de paredes celulares fúngicas, de preferência as paredes celulares de leveduras. Paredes celulares de leveduras são preparados de células de levedura que mantêm a estrutura tridimensional da célula de levedura da qual são derivadas. Portanto, têm uma estrutura oca que permite o encapsulamento do componente de terpeno dentro das paredes celulares da levedura. As paredes celulares de leveduras podem ser adequadamente derivadas de células de levedura de panificação (comercializadas por Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO). Também podem ser adquiridas partículas de parede celular de leveduras com as propriedades desejáveis em Biorigin (São Paulo, Brasil), com a designação comercial Nutricell MOS 55. Estas partículas são um extracto seco por nebulização de S. cerevisiae.
As designações comerciais SAF-Mannan (SAF Agri,
Minneapolis, MN) e Nutrex (Sensient Technologies, Milwaukee, WI) oferecem partículas alternativas. Trata-se de partículas ocas de glucano que são o resíduo insolúvel do processo de produção de extracto de levedura. Durante a produção de 8 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ extractos de levedura, os componentes solúveis de células de levedura parcialmente autolisadas são retirados e o resíduo insolúvel é um material adequado para receber terpeno. Estas partículas ocas de glucano contêm aproximadamente 25-35% de beta 1,3-glucano p/p. Um atributo principal destes materiais é o facto de conterem mais de 10% de lípidos p/p e serem muito eficazes a absorver terpenos. Além disso, sendo um produto do fluxo de resíduos, são uma fonte relativamente barata de partículas ocas de glucano.
Partículas ocas de glucano alternativas, com pureza superior, são as produzidas por Nutricepts (Nutricepts Inc., Burnsville, MN) e ASA Biotech. Estas partículas são obtidas por extracção alcalina, que elimina componentes intracelulares adicionais bem como a camada exterior de manoproteína da parede celular, produzindo uma partícula de 50-65% de glucano p/p.
As partículas ocas de glucano de pureza superior são as partículas WGP, de Biopolymer Engineering. Estas partículas são obtidas por extracção ácida, eliminando componentes de levedura adicionais e produzindo um produto de 75-85% de glucano p/p.
Partículas ocas de glucano de pureza muito elevada são as Adjuvax™, de Alpha-beta Technology, Inc. (Worcester, MA), e as micropartícuias de glucano de Novogen (Stamford, CT) . Estas partículas são obtidas por extracção com solvente orgânico, que elimina os lípidos residuais e, portanto, as partículas contêm mais de 90% de glucano p/p.
Em algumas concretizações podem ser necessárias partículas de glucano ou partículas de parede celular de elevada pureza, por exemplo, nos casos em que é necessário um controlo rigoroso dos possíveis contaminantes. Nestes casos, as partículas de pureza superior são preferíveis em detrimento de produtos menos puros. Para outras concretizações, as partículas menos puras são preferíveis por motivos económicos; também se verificou que essas partículas são mais eficazes a absorver terpenos. 9 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Preferivelmente, ο teor lipídico da partícula oca de glucano ou da partícula de parede celular é de 5% p/p ou superior, de preferência 10% p/p ou superior.
Opcionalmente, o componente de terpeno da presente invenção pode ser associado a um tensioactivo. O tensioactivo pode ser não-iónico, catiónico ou aniónico. Exemplos de tensioactivos adequados incluem laurilsulfato de sódio, polissorbato 20, polissorbato 80, polissorbato 40, polissorbato 60, éster de poliglicerilo, monooleato de poliglicerilo, monocaprilato de decaglicerilo, dicaprilato de propilenoglicol, monoestearato de triglicerol, monooleato de polioxietileno-sorbitano, Tween®, Span® 20, Span® 40, Span® 60, Span® 80, Brig 30 ou misturas dos mesmos. O tensioactivo segura o componente de terpeno numa emulsão e também ajuda ao encapsulamento do componente de terpeno dentro da partícula oca de glucano ou na partícula de parede celular. O componente de terpeno da presente invenção compreende uma mistura de geraniol, timol e eugenol. As misturas de terpenos podem ter efeitos sinérgicos. O termo "terpeno", no sentido aqui utilizado, refere-se não apenas a terpenos de fórmula (C5H8)n, mas também engloba derivados de terpeno, como aldeídos de terpeno ou polímeros de terpeno. Inclui-se terpenos naturais e sintéticos, por exemplo, monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos e tetraterpenos. Além disso, a referência a um nome de um composto englobará os vários isómeros desse composto. Por exemplo, o termo citral inclui o isómero cis citral-a (ou geranial) e o isómero trans citral-b (ou neral).
De notar que os terpenos também são conhecidos pelos nomes do extracto ou do óleo essencial que os contém, por exemplo, óleo de erva-do-príncipe (contém citral).
Os terpenos que são excluídos dos regulamentos americanos e que são listados na norma EPA 40 C.F.R. Parte 152 são adequados para uso nesta invenção.
Terpenos particularmente adequados para utilizar com a presente invenção incluem os seleccionados do grupo composto 10 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ por citral, pineno, nerol, b-ionona, geraniol, carvacrol, eugenol, carvona (por exemplo, L-carvona), terpeniol, anetol, cânfora, mentol, timol, limoneno, nerolidol, farnesol, fitol, caroteno (vitamina Al), esqualeno, timol, tocotrienol, álcool perilico, borneol, mirceno, simeno, careno, terpineno, linalol e suas misturas.
De preferência, os terpenos usados na presente invenção têm a estrutura geral Ci0Hi6, uma vez que este subgrupo é geralmente mais eficaz contra agentes infecciosos. 0 timol demonstrou ser particularmente eficaz no tratamento ou prevenção de infecções fúngicas de plantas. 0 citral demonstrou especial eficácia contra uma série de microorganismos.
Uma combinação de geraniol, timol e eugenol demonstrou especial eficácia no combate a infecções de plantas e é, portanto, um componente de terpeno particularmente adequado.
Outras formulações de terpeno que demonstraram elevada eficácia no tratamento de infecções de plantas incluem (as percentagens estão em p/p): - 100% timol; - 50% geraniol e 50% timol; - 50% eugenol e 50% timol; - 33% geraniol, 33% eugenol e 33% timol; - 33% eugenol, 33% timol e 33% citral; - 25% geraniol, 25% eugenol, 25% timol e 25% citral; - 20% geraniol, 20% eugenol, 20% citral, 20% timol e 20% L-carvona. O citral, por exemplo o citral 95, é um terpeno C10H16 oxigenado, Ci0Hi6O CAS N.° 5392-40-5 (3, 7-dimetilo-2,6- octadieno-l-al). Pode ser formada uma suspensão estável de citral até cerca de 2500 ppm. 0 citral pode ser transformado em solução em até cerca de 500 ppm. Pode ser feita uma suspensão estável de partículas ocas de glucano com citral incorporado de 25 ppt de citral. 11 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ A composição da invenção pode conter 10% a 67% p/p de terpenos, 0,1-10% de tensioactivos e 40-90% de partículas ocas de glucano ou partículas ocas de parede celular.
Adequadamente, uma composição da presente invenção contém entre cerca de 500 e cerca de 10000 ppm de partículas ocas de glucano ou partículas de parede celular, em que as partículas contêm entre cerca de 1 e cerca de 67% de componente de terpeno. De preferência, a composição contém entre cerca de 1000 e cerca de 2000 ppm de partículas ocas de glucano ou partículas de parede celular, em que as partículas contêm entre cerca de 10 e cerca de 50% de componente de terpeno.
Concentrações de partículas ocas de glucano ou partículas de parede celular com terpenos encapsulados de 1, 5, 10 , 20, 30, 40, 50, 60, 70 O OD 90, 100, 110, 125, 130, 140, 150, 160, 175, 190 , 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 , 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775 , 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100 , 1250, 1375, 1425, 1500, 1600 , 1750 ou 2000 ppm podem ser usadas como concentrações eficazes nas composições e métodos da presente invenção. Podem produzir-se concentrações até superiores (até 25 ppt, ou seja partes por milhar) e podem ser úteis na presente invenção. A composição da presente invenção pode conter entre cerca de 1 ppm e cerca de 25 ppt (25000 ppm) do componente de terpeno, de preferência entre 100 e 2000 ppm do componente de terpeno, por exemplo, 250, 500, 1000, 2000 ppm do mesmo.
Os terpenos, tensioactivos e outros componentes da invenção podem ser adquiridos prontos ou sintetizados usando técnicas do conhecimento geral dos especialistas em síntese química. É muitíssimo preferível que os terpenos usados na presente invenção, por questões regulamentares e de saúde, sejam, no mínimo, terpenos de qualidade alimentar (tal como definido pela FDA americana ou pela entidade reguladora equivalente fora dos EUA). 12 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Opcionalmente, a composição pode conter outros componentes activos de qualidade alimentar, para além do componente de terpeno; por exemplo, outros agentes antimicrobianos, enzimas ou análogos.
Opcionalmente, a composição pode conter outros agentes activos para além do componente de terpeno; por exemplo, um agente antimicrobiano, um agente antifúngico, um agente insecticida, um agente anti-inflamatório, um anestésico ou análogos. Agentes adequados incluem: - Antifúngicos: hidrolases da parede celular (desde que não degradem a partícula oca de glucano ou a partícula de parede celular), inibidores da síntese da parede celular, antifúngicos padrão. - Antibacterianos: anti-sépticos, hidrolases da parede celular, inibidores da síntese, antibióticos. - Insecticidas: insecticidas naturais, quitinase. A composição pode compreender um antioxidante, para diminuir a oxidação do terpeno. Exemplos de antioxidantes podem ser o óleo de alecrim, a vitamina C ou a vitamina E. A composição da presente invenção pode estar sob a forma de um pó seco. A composição pode ser fornecida em combinação com um portador adequado para os domínios agrícola, alimentar ou farmacêutico ou com um excipiente liquido, sólido ou em gel.
Para as composições sólidas, são portadores adequados o manitol, a lactose, o amido, o estearato de magnésio, a sacarina de sódio, o talco, a celulose, a glucose, a sacarose e o carbonato de magnésio, todos de qualidade farmacêutica, e análogos. Adequadamente, a formulação é sob a forma de comprimidos ou peletes. Um material alimentar humano ou animal também pode ser um portador adequado. Adicionalmente, também podem ser utilizados portadores agrícolas convencionais.
Um pelete, comprimido ou outra forma sólida da composição pode também, de preferência, conter um agente de 13 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ dispersão, que promova a dispersão da composição quando imersa num liquido como, por exemplo, a áqua. Os aqentes de dispersão adequados incluem a qoma xantana, a maltodextrina, alqinatos, ou análogos.
Podem, por exemplo, ser preparadas composições liquidas pela dispersão da composição em água, solução salina, dextrose aquosa, glicerol, etanol, ou análogos, para formar uma solução ou suspensão. Se desejado, estas composições podem conter quantidades minimas de substâncias auxiliares não tóxicas, como agentes humidificantes ou emulsificantes, agentes tampão do pH (por exemplo, acetato de sódio, monolaurato de sorbitano, acetato de sódio de trietanolamina ou oleato de trietanolamina). Os métodos de preparação das referidas composições liquidas são conhecidos, ou serão evidentes, para os especialistas desta arte; por exemplo, consultar "Remington: The Science and Practice of Pharmacy"; Lippincott, Williams & Wilkins (15 de Dezembro de 2000) incorporado no presente por meio de referência. Novamente, uma composição liquida pode ser preparada por dispersão da composição numa bebida ou alimento liquido para humanos ou animais. Adicionalmente, pode ser utilizado um excipiente agrícola líquido adequado.
Para administração oral, geralmente são preferíveis comprimidos e grânulos. Os comprimidos podem conter aglutinantes e lubrificantes. Os pós finos ou os grânulos podem conter agentes activos anticoagulantes, de dispersão e/ou de superfície e podem apresentar-se em água ou num xarope. As cápsulas ou saquetas podem conter convenientemente a composição num estado seco. As soluções ou suspensões não aquosas da composição também são adequadas e podem conter agentes de suspensão. Quando desejável ou necessário, podem ser incluídos agentes aromatizantes, conservantes, suspensores, espessantes ou emulsificantes. Naturalmente, é adequado usar um alimento ou bebida como método de administração oral. A administração parentérica é geralmente caracterizada por injecção. No que se refere a injectáveis, note-se que, de modo geral, todos os materiais usados na composição e qualquer excipiente usado têm de ser de qualidade 14 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ farmacêutica. Os injectáveis podem ser preparados nas formas convencionais, seja sob a forma de soluções, emulsões ou suspensões liquidas, sob a forma sólida adequada para dissolução, sob a forma de suspensão em liquido antes da injecção ou sob a forma de emulsões. Uma abordagem alternativa para a administração parentérica implica a utilização de um sistema de libertação lenta ou prolongada, de modo a manter um nível constante de dosagem. Ver, por exemplo, a patente US N° 3710795, incorporada no presente por meio de referência. As preparações para administração parentérica também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados. Exemplos de solventes não aquosos são o propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais (como o azeite) e esteres orgânicos injectáveis (como o oleato de etilo). Os portadores aquosos incluem a água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e meios tamponados. Outros veículos parentéricos incluem a solução de cloreto de sódio, a dextrose de Ringer, o cloreto de dextrose e sódio, o lactato de Ringer ou os óleos fixos. Os veículos para uso intravenoso incluem os restauradores de líquidos e nutrientes, restauradores de electrólitos (como os baseados na dextrose de Ringer) e análogos. Também podem estar presentes conservantes e outros aditivos, como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e análogos.
Para a administração tópica, podem ser usados líquidos, suspensões, loções, cremes, geles, pomadas, gotas, supositórios, sprays e pós. Os portadores farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou óleos, espessantes e análogos podem ser usados sempre que necessário ou desejado. A presente invenção proporciona ainda um método de preparar uma partícula oca de glucano ou partícula oca de parede celular encapsulando um componente de terpeno, compreendendo o referido método os passos de: a) proporcionar um componente de terpeno que compreende geraniol; eugenol e timol; b) proporcionar uma partícula oca de glucano ou partícula oca de parede celular; 15 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ c) incubar ο componente de terpeno com a partícula de glucano ou partícula oca de parede celular à pressão atmosférica a uma temperatura de 20 a 37°C; e d) recuperar a partícula oca de glucano ou partícula oca de parede celular com o componente de terpeno encapsulado.
Opcionalmente, o método acima definido pode incluir ainda o passo de secagem das partículas com o componente de terpeno encapsulado. A secagem pode ser obtida de vários modos e pode fazer-se menção de liofilização, secagem em leito fluidizado, secagem em tambor ou secagem por nebulização; sendo todos estes processos bem conhecidos.
No passo a) do método acima, o componente de terpeno é fornecido de forma adequada como suspensão num solvente aquoso e, opcionalmente, na presença de um tensioactivo. Adequadamente, o solvente é água. Um tensioactivo adequado é o Tween 80 (monooleato de polioxietileno-sorbitano) e, de preferência, o tensioactivo está presente numa concentração entre cerca de 0,1 e 10% em volume da mistura reaccional total, preferentemente cerca de 1%. Em alternativa, o componente de terpeno pode ser fornecido como uma verdadeira solução num solvente, por exemplo, água. Uma verdadeira solução de terpeno em água pode ser obtida misturando o terpeno na água sob elevado cisalhamento até se alcançar uma verdadeira solução. A publicação N.° WO 03/020024 proporciona mais detalhes sobre a formação de verdadeiras soluções de terpenos em água.
No passo b) do método acima definido, a partícula oca de glucano ou partícula de parede celular é fornecida de forma adequada como uma suspensão em água ou outro líquido adequado. Adequadamente, a suspensão contém aproximadamente entre 1 e 1000 mg de partículas por ml, de preferência entre 200 e 400 mg/ml. Em alternativa, as partículas podem ser fornecidas sob a forma de pó seco e adicionadas à suspensão de terpeno-tensioactivo.
Em alternativa, as partículas são fornecidas em líquido suficiente para serem minimamente hidratadas, mas não de forma significativamente excessiva. O termo "volume hidrodinâmico" (VH) é usado para descrever o volume de 16 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ líquido necessário para hidratar minimamente as partículas. Assim, adequadamente, as partículas são fornecidas com um volume que varia entre o VH e um volume de 1,5 vezes o VH (1,5 VH). Isto torna o passo seguinte, da secagem, mais eficaz. Além disso, quando é usado um reduzido volume de líquido (por exemplo, entre cerca do VH e 1,5 VH) , também é possível extrair o produto acabado sob a forma de pelete ou massa, o que é conveniente para secagem em leito fluidizado.
Foi constatado que o componente de terpeno pode ficar encapsulado pela partícula oca de glucano ou partícula de parede celular à temperatura ambiente. No entanto, a taxa de encapsulamento aumenta aos 37°C, mas a temperatura deve ser mantida abaixo do ponto de ebulição ou da temperatura de desnaturação de qualquer componente da composição. Portanto, a condição adequada para o passo c) do método acima mencionado é uma pressão atmosférica a uma temperatura de 20 a 37°C. A optimização das condições para uma reacção de encapsulamento particular será matéria de experimentação de rotina. A presente invenção proporciona ainda um método para matar um microorganismo, compreendendo o referido método o passo de: a) colocar o referido microorganismo em contacto com uma composição contendo uma partícula oca de glucano ou partícula de parede celular encapsulando um componente de terpeno.
As composições adequadas são as que foram definidas mais detalhadamente acima. A presente invenção proporciona ainda um método para prevenir ou tratar uma infecção num paciente, compreendendo o referido método o passo de: a) administrar ao referido paciente, numa dose de eficácia terapêutica, uma composição contendo uma partícula oca de glucano ou partícula de parede celular encapsulando um componente de terpeno. 17 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
As composições adequadas sao as que foram definidas mais detalhadamente acima. A infecção do paciente pode ser causada por qualquer agente infeccioso. Exemplos destes agentes infecciosos incluem, mas não se limitam a Staphylococcus aureus, Aspergillius fumigatus, Mycoplasma iowae, Penicillium sp. e Mycoplasma pneumoniae.
Para administração interna, a composição pode ser administrada por via oral, vaginal, rectal, inalatória ou por vias parentéricas, por exemplo, por via intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intra-rectal, intra-arterial, intralinfática, intravenosa, intratecal e intratraqueal. As formulações adequadas da composição para estas vias são discutidas acima.
Para tratamento externo, a composição pode ser aplicada topicamente, por exemplo, sob a forma de creme ou pomada ou sob a forma de pó seco para tratamento de uma lesão. A quantidade de terpeno administrado pelo método acima referido deve ser claramente suficiente para obter o resultado desejado, ou seja, prevenção e/ou tratamento da infecção, mas não deve atingir um nível que induza efeitos tóxicos graves no paciente. A quantidade de composição administrada dependerá, naturalmente, do modo de administração, do paciente a ser tratado, ou seja, do seu peso, idade, condição física, sexo e extensão da doença no indivíduo, bem como da decisão do médico prescritor. A dose, a posologia e a via de administração podem ser variadas. Um perito na especialidade seria capaz de determinar prontamente a quantidade anti-infecciosa para uma dada aplicação com base no conhecimento geral da arte e nos procedimentos dos Exemplos dados abaixo. De notar que o termo "paciente", no sentido aqui utilizado, se refere a qualquer indivíduo, seja humano ou animal, ao qual o tratamento é aplicado. Assim, o paciente pode ser um animal doméstico (por exemplo, gato, cão, etc.), animal de criação (por exemplo, bovino, cavalo, porco, ovelha, cabra, etc.), animal de laboratório (por exemplo, rato, coelho, 18 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ ratazana, cobaia, etc.), aves e peixes. Adequadamente, o indivíduo é um mamífero e em especial um primata, por exemplo, um ser humano.
Numa outra concretização, a presente invenção proporciona um método para tratar ou prevenir a infecção de uma planta, compreendendo o referido método o passo de: a) administrar, numa dose de eficácia terapêutica, uma composição contendo uma partícula oca de glucano ou partícula de parede celular encapsulando um componente de terpeno na planta ou no solo na proximidade da planta.
As composições adequadas são as que foram definidas mais detalhadamente acima.
Foi demonstrado que os terpenos eliminam uma série de agentes patogénicos para as plantas (ver WO 03/020024) e, conforme descrito no pedido co-pendente US 2008/0220038, também matam eficazmente os nemátodos, que são parasitas significativos para as plantas. No entanto, os terpenos isolados, em suspensão ou solução, são algo instáveis e degradam-se rapidamente no solo, perdendo assim eficácia. A incorporação de um componente de terpeno numa partícula oca de glucano ou partícula de parede celular pode reduzir a velocidade da libertação e degradação do terpeno, aumentando assim a duração da acção do terpeno no solo.
Adequadamente, a infecção de uma planta a ser tratada ou prevenida pelo método acima descrito é uma infecção por nemátodos.
Outras infecções de plantas que podem ser tratadas ou prevenidas incluem infecções de plantas por fungos, especialmente as que afectam a superfície de uma planta. Essas infecções incluem o míldio, o oídio ou a podridão cinzenta (botrytis); estas infecções afectam particularmente a vinha. 19 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Numa concretização, a infecção da planta pode ser provocada por um ou mais dos seguintes agentes:
Aspergillius fumigatus, Sclerotinta homeocarpa,
Rhizoctonia solani, Colletotrichum graminicola ou
Penicillium sp.
Uma vantagem de um tratamento baseado em terpenos para as plantas é o facto de poder ser aplicado pouco antes da colheita.
Muitos tratamentos convencionais exigem um período alargado antes de se poder reentrar na área tratada (geralmente, 3 semanas) . Isto significa que um surto de uma doença das plantas pouco antes da colheita não pode ser tratado com tratamentos convencionais, uma vez que depois não seria possível fazer a colheita no momento desejado. As composições da presente invenção podem ser adequadamente aplicadas em qualquer momento até à colheita, por exemplo, 21 dias antes da colheita, 14 dias antes da colheita, 7 dias antes da colheita, ou até 3 dias ou menos antes da colheita.
Os terpenos encapsulados demonstraram especial eficácia no tratamento do míldio, do oídio e da podridão cinzenta nas uvas e, portanto, a presente invenção proporciona um método para tratar ou prevenir estas doenças. A prevenção de infecções nas plantas pode ser alcançada tratando regularmente as plantas com os terpenos encapsulados, como medida profiláctica.
Adequadamente, a composição da presente invenção é aplicada por pulverização. Isto é especialmente adequado para tratar uma doença das plantas que afecte a superfície da planta. Para pulverização, pode ser usada uma preparação contendo 2 g/1 da composição em água. As concentrações entre 2 e 4 g/1 são especialmente eficazes e podem ser usadas concentrações superiores a 4 g/1, conforme necessário.
Obviamente, é importante que a concentração da composição usada seja suficiente para matar ou inibir o agente causador da doença, mas não tão elevada que danifique a planta a ser tratada. 20 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Na pulverização de plantas, uma taxa de 500 1/ha ou superior é adequada para cobrir as plantas. De preferência, deve usar-se uma taxa de 900 1/ha ou superior, se possível de 1200 1/ha ou superior, para garantir uma boa cobertura. No tratamento de vinhas, uma taxa de 1200 1/ha mostrou-se adequadamente eficaz. A composição da presente invenção pode, em alternativa, ser aplicada por irrigação. Isto é especialmente adequado para o tratamento de nemátodos ou outros agentes patogénicos ou parasitas transmitidos pelo solo.
Numa outra concretização, a presente invenção também proporciona uma composição contendo uma partícula oca de glucano ou partícula de parede celular encapsulando um componente de terpeno para uso na prevenção ou tratamento de uma infecção num paciente ou numa planta. As composições adequadas são as que foram definidas mais detalhadamente acima.
Numa outra concretização, a presente invenção proporciona o uso de uma composição contendo uma partícula oca de glucano ou partícula de parede celular encapsulando um componente de terpeno na produção de um medicamento para o tratamento de infecções causadas por um microorganismo. As composições adequadas são as que foram definidas mais detalhadamente acima. A presente invenção será agora descrita em mais pormenor, com referência aos seguintes exemplos e figuras, não limitantes, nos quais: A Fig. 1 representa uma micrografia de luz de paredes celulares de levedura vazias; A Fig. 2 representa uma micrografia de luz de paredes celulares de levedura encapsulando L-carvona; A Fig. 3 representa uma micrografia de luz de paredes celulares de levedura encapsulando citral; 21 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ A Fig. 4 representa uma micrografia de luz de emulsão de terpeno; A Fig. 5 representa uma micrografia de luz de paredes celulares de levedura em volume hidrodinâmico (VH) de água; A Fig. 6 representa uma micrografia de luz de paredes celulares de levedura encapsulando terpeno em 5 vezes o volume hidrodinâmico (VH) de água; A Fig. 7 representa uma micrografia de luz de paredes celulares de levedura encapsulando terpeno em VH de água; A Fig. 8 representa uma micrografia de luz de paredes celulares de levedura encapsulando terpeno em VH mais 5% de água; A Fig. 9 representa uma micrografia de luz de paredes celulares de levedura encapsulando terpeno em VH mais 10% de água; A Fig. 10 representa uma micrografia de luz de paredes celulares de levedura encapsulando terpeno em VH mais 20% de água; A Fig. 11 representa uma micrografia de luz de paredes celulares de levedura encapsulando terpeno em VH mais 30% de água; A Fig. 12 representa uma micrografia de luz de paredes celulares de levedura encapsulando terpeno em VH mais 40% de água; A Fig. 13 representa uma micrografia de luz da dispersão de partículas ocas de glucano secas encapsulando um componente de terpeno, na ausência de goma xantana. A Fig. 14 representa uma micrografia de luz como na Fig. 13, com a inclusão de 0,07 g de goma xantana a 1%. 22 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ A Fig. 15 representa uma micrografia de luz como na Fig. 13, com a inclusão de 0,14 g de goma xantana a 1%. A Fig. 16 representa uma micrografia de luz como na Fig. 13, com a inclusão de 0,28 g de goma xantana a 1%. A Fig. 17 representa uma micrografia de luz como na Fig. 13, com a inclusão de 0,55 g de goma xantana a 1%. A Fig. 18 representa uma micrografia de luz como na Fig. 13, com a inclusão de 1,1 g de goma xantana a 1%. A Fig. 19 representa uma micrografia de luz como na Fig. 13, com a inclusão de 2,2 g de goma xantana a 1%. A Fig. 20 representa uma micrografia de luz como na Fig. 13, com a inclusão de 4,4 g de goma xantana a 1%. A Fig. 21 mostra uma representação esquemática das áreas de tratamento nos locais 18 e 20. A Fig. 22 mostra uma representação esquemática das áreas de tratamento nos locais 18 e 20. A Fig. 23 mostra uma representação esquemática das áreas de tratamento no local 7. A Fig. 24 mostra um gráfico da comparação das formulações de terpeno encapsulado versus não-encapsulado.
Os seguintes exemplos são fornecidos de modo a permitir às pessoas competentes nesta área fazer ou usar a presente invenção. São meramente exemplificativos e não limitam o âmbito da invenção. Salvo indicação em contrário, as partes são partes por volume ou partes por peso, conforme indicado, a temperatura é em graus Celsius (°C) ou à temperatura ambiente e a pressão é a pressão atmosférica ou próxima da pressão atmosférica. Há numerosas variações e combinações das composições e condições para as fabricar ou utilizar; por exemplo, concentrações do componente, solventes desejáveis, misturas de solventes, temperaturas, pressões e outras gamas 23 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ e condições que podem ser usadas para optimizar os resultados obtidos das composições e métodos descritos. Será apenas necessária experimentação razoável e de rotina para efeitos de optimização.
Exemplo 1 (não de acordo com a invenção) - Demonstração do carregamento de terpeno em partículas de levedura de panificação e partículas purificadas de glucano de levedura
Foi seguido o seguinte protocolo para demonstrar que os terpenos ficam carregados nas paredes celulares de levedura e outras partículas ocas de glucano.
Foram preparadas emulsões de citral e L-carvona misturando 150 μΐ do terpeno com 100 μΐ do Tween a 10% em água e 250 μΐ de água.
Foram misturadas partículas de levedura de panificação (PL) ou partículas de glucano de levedura Levacan™ (PGL), comercializadas por Savory Systems International, Inc., Branchburg, NJ, com água para formar uma suspensão de 250 mg/ml. 500 μΐ da suspensão de PL ou PGL e 250 μΐ da emulsão de terpeno foram misturados e incubados durante a noite, sob agitação constante. Usou-se uma suspensão de 500 μΐ de PL ou PGL e 500 μΐ de água como controlo. As partículas foram então lavadas com água até eliminar a emulsão exterior. As preparações de partículas foram então congeladas e liofilizadas até secarem.
As partículas foram então re-hidratadas e examinadas no microscópio com luz. Os resultados estão ilustrados nas Figs. 1 a 4. A Fig. 1 mostra estruturas esféricas com uma área escura no centro; são partículas ocas de glucano vazias. As Figs. 2 e 3 mostram estruturas esféricas com uma aparência inchada com um interior de cor clara; são partículas com terpeno encapsulado na cavidade central - citral na Fig. 2 e L-carvona na Fig. 3. Nas Figs. 2 a 3 podem ver-se também pequenas bolhas de terpeno livre, por exemplo, no cimo da 24 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Fig. 2, logo à esquerda do centro. A Fig. 4 mostra a emulsão de terpeno como pequenas bolhas de terpeno suspensas na água.
Exemplo 2 (não de acordo com a invenção) - Determinação dos níveis máximos de carregamento de citral e L-carvona em partículas de parede celular de levedura de panificação (PL)
Foi seguido o seguinte protocolo para determinar as quantidades máximas de terpenos que ficam carregadas em PL. - Foram preparadas emulsões de L-carvona e citral submetendo a ultrassons 4,5 g do terpeno com 0,3 ml de água. - Foi preparada uma solução de Tween 80 a 10% submetendo a ultrassons 4,5 g de Tween 80 em 40,5 ml de água. - Foi preparada uma suspensão de PL misturando PL com água para formar uma suspensão de 20 mg/ml. - As reacções de encapsulamento foram preparadas conforme descrito na Tabela 1. A emulsão de citral ou L-carvona-água foi misturada com PL e tensioactivo Tween 80 durante a noite, à temperatura ambiente. Foram centrifugadas amostras a 14000 χ g durante 10 minutos e o aparecimento do terpeno livre a flutuar na camada aquosa foi classificado. Os resultados encontram-se na coluna do lado direito da Tabela 1, com o título "Terpeno Livre". A expressão "terpeno livre" refere-se à presença visível de terpeno na mistura de reacção centrifugada. A ausência de terpeno livre indica absorção completa do terpeno pelas partículas. O volume mais elevado de terpeno absorvido pelas partículas, evidenciado pela ausência de terpeno livre, foi registado como volume máximo de emulsão de terpeno absorvida. 25 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Tabela 1
Tubo 20 mg/ml PL Emulsão de Terpeno Vol. Tween 80 a 10% Terpeno Livre μΐ μΐ μΐ 1 500 - - 500 - 2 500 L-carvona 0,5 500 - 3 500 L-carvona 1,65 500 - 4 500 L-carvona 5 495 - 5 500 L-carvona 16,5 483,5 - 6 500 L-carvona 50 450 + 7 500 L-carvona 165 335 + 8 500 L-carvona 500 - + 9 500 Citral 0,5 500 - 10 500 Citral 1,65 500 - 11 500 Citral 5 495 - 12 500 Citral 16,5 483,5 + /- 13 500 Citral 50 450 + 14 500 Citral 165 335 + 15 500 Citral 500 - +
Como se pode ver pelos resultados, a PL é capaz de absorver e encapsular, pelo menos, 16,5 μΐ de emulsão de terpeno L-carvona ou, pelo menos, 5 μΐ de emulsão de citral por 10 mg de PL.
Exemplo 3 (não de acordo com a invenção) - Demonstração de melhorias no carregamento de terpeno com tensioactivo e determinação do rácio óptimo Tween 80:terpeno
Foi seguido o seguinte protocolo para demonstrar que a presença de tensioactivo melhora o carregamento de terpeno e para determinar o nivel minimo de tensioactivo Tween 80 necessário para a reacção de carregamento do terpeno na PL. - Foram preparadas emulsões de L-carvona e citral submetendo a ultrassons 4,5 g do terpeno com 0,3 ml de água. - Foi preparada uma solução de Tween 80 a 10%, submetendo a ultrassons 4,5 g de Tween 80 em 40,5 ml de água. - Foi preparada uma suspensão de PL de panificação misturando PL com água para formar uma suspensão de 250 mg/ml. 26 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
As reacçoes de carregamento foram preparadas conforme ilustrado na Tabela 2 abaixo. A emulsão de citral ou L-carvona-água foi misturada com PL com 0 - 10% v/v de tensioactivo Tween 80 durante a noite, à temperatura ambiente. Foram centrifugadas amostras a 14000 x g durante 10 minutos e o aparecimento do terpeno livre a flutuar na camada aquosa foi classificado. Os resultados encontram-se na coluna do lado direito da Tabela 2, com o titulo "Terpeno Livre". A expressão "terpeno livre" refere-se à presença visível de terpeno na mistura de reacção centrifugada. A ausência de terpeno livre indica absorção completa do terpeno e encapsulamento do terpeno pela PL. O volume mais elevado de terpeno absorvido pela PL, evidenciado pela ausência de terpeno livre, foi registado como volume máximo de emulsão de terpeno absorvida.
Tabela 2
Tubo 20 mg/ml PL Emulsão de Terpeno Vol. Tween 80 a 10% Água Terpeno Livre μΐ μΐ μΐ μΐ 1 500 - - - 500 - 2 500 L-carvona 150 0 350 L 3 500 L-carvona 150 5 345 L 4 500 L-carvona 150 10 340 L 5 500 L-carvona 150 33 317 L 6 500 L-carvona 150 100 250 - 7 500 L-carvona 150 200 150 - 8 500 L-carvona 150 350 - - 9 500 L-carvona 400 0 100 + + 10 500 L-carvona 400 5 95 + + 11 500 L-carvona 400 10 90 + + 12 500 L-carvona 400 33 77 + + 13 500 L-carvona 400 100 - 14 500 L-carvona 400 20 μΐ 100% 30 + 15 500 Citral 113 0 387 16 500 Citral 113 5 382 17 500 Citral 113 10 377 + 18 500 Citral 113 33 354 L 19 500 Citral 113 100 287 L 20 500 Citral 113 200 187 - 21 500 Citral 113 350 37 - 27 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ 22 500 Citral 250 0 250 + + 23 500 Citral 250 5 245 + + 24 500 Citral 250 10 240 + + 25 500 Citral 250 33 217 26 500 Citral 250 100 150 27 500 Citral 250 20 μΐ 100% 230 L = ligeiro
Como se pode verificar pelos resultados, uma concentração de Tween 80 a 1% (ou seja, 100 μΐ de Tween 80 a 10% em 1000 μΐ de mistura de reacção) é suficiente para permitir a completa absorção do terpeno na reacção acima. Um Tween 80 a 2% não provoca melhoria nos resultados, mas com uma concentração de 0,33% foi observado terpeno livre. Isto indica que: a) Os terpenos são absorvidos para dentro das PL na ausência de um tensioactivo, mas a presença de tensioactivo aumenta significativamente a absorção do terpeno. b) Uma concentração de Tween 80 de cerca de 1% é óptima para o carregamento das PL, uma vez que assegura o carregamento adequado enquanto maximiza a carga de terpeno das PL.
Exemplo 4 (não de acordo com a invenção) - Determinação do carregamento e encapsulamento máximo do terpeno a níveis elevados de partículas de parede celular de levedura de panificação (PL)
Foi seguido o seguinte protocolo para determinar as quantidades máximas de terpenos que ficam carregadas em PL a níveis elevados de PL. - Foram preparadas emulsões de L-carvona e citral, submetendo a ultrassons 4,5 g do terpeno com 3 ml de Tween a 1%. - Foi preparada uma solução de Tween 80 a 5%, submetendo a ultrassons 0,5 g de Tween 80 em 9,5 ml de água. - Foi preparada uma suspensão de PL misturando PL com água para formar uma suspensão de 250 mg/ml. 28 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ - As reacções de encapsulamento foram preparadas conforme descrito na Tabela 3. A emulsão de citral ou L-carvona-água foi misturada com PL e tensioactivo Tween 80 durante a noite, à temperatura ambiente. Foram centrifugadas amostras a 14000 χ g durante 10 minutos e o aparecimento do terpeno livre a flutuar na camada aquosa foi classificado. Os resultados encontram-se na coluna do lado direito da Tabela 3, com o título "Terpeno Livre". A expressão "terpeno livre" refere-se à presença visível de terpeno na mistura de reacção centrifugada. A ausência de terpeno livre indica absorção completa do terpeno pela PL. O volume mais elevado de terpeno absorvido pela PL, evidenciado pela ausência de terpeno livre, foi registado como volume máximo de emulsão de terpeno absorvida.
Tabela 3
Tubo 250 mg/ml PL Emulsão de Terpeno Vol. Tween 80 a 1% Terpeno Livre μΐ μΐ μΐ 1 500 - - 500 - 2 500 L-carvona 15 485 - 3 500 L-carvona 37, 5 462,5 - 4 500 L-carvona 75 425 - 5 500 L-carvona 112,5 387,5 - 6 500 L-carvona 150 350 L + 7 500 L-carvona 225 275 + 8 500 L-carvona 450 50 + 9 500 Citral 15 485 - 10 500 Citral 37, 5 462,5 - 11 500 Citral 75 425 - 12 500 Citral 112,5 387, 5 L + 13 500 Citral 150 350 + 14 500 Citral 225 275 + 15 500 Citral 450 50 +
Como se pode verificar pelos resultados na Tabela 3, a PL é capaz de absorver e encapsular terpenos numa concentração elevada de PL. A PL absorveu e encapsulou, pelo menos, 112,5 μΐ da emulsão de terpeno L-carvona ou, pelo menos, 75 μΐ da emulsão de citral por 125 mg de PL. Isto demonstra que a reacção de encapsulamento de terpeno é independente da concentração de PL nos intervalos testados. 29 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Exemplo 5 (nao de acordo com a invenção) - Avaliar partículas disponíveis no mercado quanto à absorção de terpeno
Foi seguido o seguinte protocolo para analisar as propriedades de carregamento de tipos diferentes de partículas. As partículas estudadas foram as partículas de parede celular de levedura de panificação (Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO), paredes Nutrex™ (Sensient Technologies, Milwaukee, WI), SAF-Mannan™ (SAF Agri, Minneapolis, MN), NutriceptWalls™ (Nutricepts Inc., Burnsville, MN), Levacan™ (Savory Systems International, Inc., Branchburg, NJ) e WGP™ (Alpha-beta Technology, Inc., Worcester, MA).
Foram preparadas emulsões de L-carvona e citral, submetendo a ultrassons 7 g de terpeno + 3 ml de Tween 8 0 a 3,3%.
Na Tabela 4 abaixo compara-se a pureza com o número de partículas de levedura por mg e o rácio peso/volume de matéria sólida embalada.
Tabela 4
Partícula de Levedura % Pureza Beta 1,3-glucano N. ° partículas/mg Mg partículas/ml de panificação 11,2 4 x 107 250 Nutrex 24,5 1,7 x 108 58,8 SAF Mannan 33,4 2,4 x 108 41, 7 Nutricepts 55, 7 5,2 x 108 37 Levacan 74,6 1 x 108 19,2 WGP 82,1 3,5 x 108 10 A partir da Tabela 4, pode concluir-se que o número de partículas por mg é inversamente proporcional à pureza. Assim, o número de partículas por mg de WGP é quase 10 vezes mais elevado do que o de PL de panificação.
As suspensões de PL foram preparadas do seguinte modo: — A suspensão de partículas de parede celular de levedura de panificação (PL) foi preparada misturando 250 mg de PL/ml e Tween 80 a 1%. — A suspensão de Nutrex foi preparada misturando 163 mg de PGL Nutrex/ml e Tween 80 a 1%. 30 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ - A suspensão de SAF Mannan foi preparada misturando 234 mg de PGL Bio Springer/ml e Tween 80 a 1%. - A suspensão de Nutricepts foi preparada misturando 99 mg de PGL Nutricepts/ml e Tween 80 a 1%. - A suspensão de Levacan foi preparada misturando 217 mg de PGL Lev/ml e Tween 80 a 1%. - A suspensão de WGP foi preparada misturando 121 mg de PGL WGP/ml e Tween 80 a 1%. 0 volume embalado das partículas acima mencionadas é idêntico, o que significa que foram avaliados números iguais de partículas.
As reacções de carregamento foram preparadas conforme ilustrado na Tabela 5 e deixadas a incubar durante a noite. Foram centrifugadas amostras a 14000 x g durante 10 minutos e o aparecimento do terpeno livre a flutuar na camada aquosa e a cor dos terpenos encapsulados no pelete foram classificados. As duas colunas do lado direito na Tabela 5 apresentam os resultados. O volume mais elevado de terpeno absorvido pelas partículas, evidenciado pela ausência de terpeno livre, foi registado como volume máximo de emulsão de terpeno absorvida.
Tabela 5
Tubo Particula Cone. mg/ml μΐ Emulsão de Terpeno Vol. μΐ Tween 80 a 1% μΐ Terpeno Livre Cor 1 Panificação 250 500 L-carvona 125 375 - B 2 Nutrex 163 500 L-carvona 125 375 - B 3 SAF Mannan 234 500 L-carvona 125 375 - B 4 Nutricepts 99 500 L-carvona 125 375 + B 5 Levacan 217 500 L-carvona 125 375 + B 6 WGP 121 500 L-carvona 125 375 + B 7 Panificação 250 500 Citral 100 375 - A 8 Nutrex 163 500 Citral 100 375 - A 9 SAF Mannan 234 500 Citral 100 375 - B 10 Nutricepts 99 500 Citral 100 375 + A 11 Levacan 217 500 Citral 100 375 + Int. 12 WGP 121 500 Citral 100 375 + Int. 13 - - - L-carvona 125 875 + - 14 - - - Citral 100 900 + A B = branco; A = amarelo; L = ligeiro; Int. = intermédio 31 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ A partir dos resultados, foram tiradas as seguintes conclusões: — As partículas purificadas com um baixo teor lipídico foram menos eficazes na absorção de terpenos. — As partículas menos puras foram mais eficazes na absorção de terpenos. — 0 produto amarelo de degradação do citral não se formou quando este estava encapsulado em SAF-Mannan™. — Com base no carregamento qualitativo ao nível do terpeno único testado, a SAF Mannan™ parece ser a melhor, seguida pela Nutrex™ em segundo lugar e pela de panificação em terceiro.
Exemplo 6 (não de acordo com a invenção) - Cinética do carregamento de terpeno em vários tipos de partículas e diferentes temperaturas de incubação
Foi adoptado o seguinte protocolo para comparar a cinética de carregamento de vários tipos de partículas de levedura.
Foram preparadas emulsões de L-carvona e citral, submetendo a ultrassons 7 g de terpeno com 3 ml de Tween 80 a 3,3%.
Foi preparada uma solução de Tween 80 a 1%, submetendo a ultrassons 1 ml de Tween 80 a 10% em 10 ml de água. - Foi preparada PL de panificação misturando 5 g de PL de panificação em 20 ml de Tween 80 a 1%. - Foi preparada uma suspensão de PGL Nutrex™ misturando 2 g de PGL Nutrex™ em 20 ml de Tween 80 a 1%. - Foi preparada uma suspensão de SAF Mannan™ misturando 2 g de SAF Mannan™ em 20 ml de Tween 80 a 1%.
As reacções de carregamento foram preparadas conforme ilustrado na Tabela 6.
As reacções foram incubadas durante 1, 3, 6, 9 e 24 horas à temperatura ambiente ou 37 °C. Após incubação, foram 32 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ centrifugadas amostras a 14000 x g durante 10 minutos e o aparecimento do terpeno livre a flutuar na camada aquosa foi classificado. A duas colunas do lado direito na Tabela 6 apresentam os resultados. O volume mais elevado de terpeno absorvido pelas partículas, evidenciado pela ausência de terpeno livre, foi registado como volume máximo de emulsão de terpeno absorvida. A cor do pelete encapsulado foi classificada às 24 horas.
Tabela 6
Tubo Temp. °C Partícula Cone. mg/ml μΐ Emulsão de Terpeno Vol. μΐ Tween 80 a 1% Terpeno (h) Livre Cor 1 3 6 9 24 1 Ta panificação 250 3500 L-carvona 788 2712 + - - - - B 2 37 panificação 250 3500 L-carvona 788 2712 + - - - - B 3 Ta Nutrex 100 3500 L-carvona 1050 2450 + - - - - B 4 37 Nutrex 100 3500 L-carvona 1050 2450 + - - - - B 5 Ta SAF 100 3500 L-carvona 1050 2450 < + - - - - B 6 37 SAF 100 3500 L-carvona 1050 2450 < + - - - - B 7 Ta panificação 250 3500 Citral 525 2975 + - - - - A 8 37 panificação 250 3500 Citral 525 2975 + - - - - MA 9 Ta Nutrex 100 3500 Citral 788 2712 + - - - - A 10 37 Nutrex 100 3500 Citral 788 2712 + - - - - MA 11 Ta SAF 100 3500 Citral 788 2712 + - - - - B 12 37 SAF 100 3500 Citral 788 2712 + - - - - B B = Branco; A = Amarelo; MA = Muito Amarelo; Ta = Temperatura ambiente.
Dos resultados mostrados na Tabela 6 e de outras observações, podem ser tiradas as seguintes conclusões: • A reacção de carregamento do terpeno demora entre 1 e 3 horas • carregamento do terpeno ocorre mais rapidamente a 37 °C do que à temperatura ambiente. • As partículas SAF Mannan™ parecem ser preferíveis por dois motivos: - Absorção mais rápida e mais completa de ambos os terpenos. - O citral mantém-se estável quando carregado, como evidenciado pela ausência da cor amarela, característica da degradação do citral, após 24 horas a 37°C. 33 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Exemplo 7 (não de acordo com a invenção) - Avaliar uma gama de terpenos únicos e combinações de terpenos quanto ao carregamento nas partículas
Foi adoptado o seguinte protocolo para comparar a eficiência de carregamento da PL de panificação versus SAF Mannan™.
As emulsões de terpeno foram preparadas do seguinte modo: - L-carvona - 4,5 g de L-carvona em 1,5 ml de Tween 80 a 3,3%. - Citral - 4,5 g de citral em 1,5 ml de Tween 80 a 3,3%. - Mistura de timol/L-carvona (T/L) - 2,25 g de timol e 2,25 g de L-carvona em 1,5 ml de Tween 80 a 3,3%. - Eugenol - 4,5 g de eugenol em 1,5 ml de Tween 80 a 3,3%. - Geraniol - 4,5 g de geraniol em 1,5 ml de Tween 80 a 3,3%. - Mistura de citral/L-carvona/eugenol (C/L/E) - 1,5 g de citral, 1,5 g de L-carvona, 1,5 g de eugenol em 1,5 ml de Tween 80 a 3,3%.
Foram usadas emulsões compostas por terpeno:água:tensioactivo num rácio de 0,75:0,3:0,05 para estas experiências.
Foram misturados volumes crescentes de emulsão de terpeno com 250 mg/ml de PL de panificação ou 250 mg/ml de SAF Mannan™, durante a noite, à temperatura ambiente, conforme ilustrado nas Tabelas 7 e 8. Foram centrifugadas amostras a 14000 x g durante 10 minutos e o aparecimento do terpeno livre a flutuar na camada aquosa foi classificado. O volume mais elevado de emulsão de terpeno absorvida pela PL de panificação ou SAF Mannan™, evidenciado pela ausência de terpeno livre, foi registado como volume máximo de emulsão de terpeno absorvida. A cor dos terpenos encapsulados no pelete foi registada. Os resultados nas Tabelas 7 e 8 mostram que tanto o terpeno único como as combinações de terpeno foram todos eficazmente carregados tanto na PL de panificação como nas partículas SAF Mannan. 34 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Tabela 7 - Avaliaçao do carregamento da PL de panificaçao de diferentes terpenos e misturas de terpenos
Tubo Panificação (μΐ) Emulsão de Terpeno Vol . (μΐ) Tween 80 a 1% (μΐ) Terpeno Livre Cor 1 500 - - 500 - B 2 500 L-carvona 15 485 - B 3 500 L-carvona 37,5 462,5 - B 4 500 L-carvona 7 425 + /- B 5 500 L-carvona 112,5 387,5 + /- B 6 500 L-carvona 150 350 + B 7 500 L-carvona 225 275 + B 8 500 L-carvona 450 50 + + B 9 500 Citral 15 485 - A 10 500 Citral 37,5 462,5 - A 11 500 Citral 75 425 - A 12 500 Citral 112,5 387,5 + /- A 13 500 Citral 150 350 + A 14 500 Citral 225 275 + A 15 500 Citral 450 50 + A 16 500 T/L 15 485 - B 17 500 T/L 37,5 462,5 - B 18 500 T/L 75 425 - B 19 500 T/L 112,5 387,5 + /- B 20 500 T/L 150 350 + B 21 500 T/L 225 275 + B 22 500 T/L 450 50 + B 23 500 Eugenol 15 485 - B 24 500 Eugenol 37,5 462,5 - B 25 500 Eugenol 75 425 - B 26 500 Eugenol 112,5 387,5 + /- B 27 500 Eugenol 150 350 + B 28 500 Eugenol 225 275 + B 29 500 Eugenol 450 50 + B 30 500 Geraniol 15 485 - B 31 500 Geraniol 37,5 462,5 - B 32 500 Geraniol 75 425 - B 33 500 Geraniol 112,5 387,5 + B 34 500 Geraniol 150 350 + B 35 500 Geraniol 225 275 + B 36 500 Geraniol 450 50 + B 37 500 C/L/E 15 485 - A 38 500 C/L/E 37,5 462,5 - A 39 500 C/L/E 75 425 - A 40 500 C/L/E 112,5 387,5 + /- A 41 500 C/L/E 150 350 + A 42 500 C/L/E 225 275 + A 43 500 C/L/E 450 50 + A 35 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Tabela 8 - Avaliaçao do carregamento da SAF Mannan de diferentes terpenos e misturas de terpenos
Tubo SAF (μΐ) Emulsão de Terpeno Vol. Tween 80 a 1% (μΐ) Terpeno Livre Cor 1 500 - - 500 - B 2 500 L-carvona 15 485 - B 3 500 L-carvona 37,5 462,5 - B 4 500 L-carvona 75 425 - B 5 500 L-carvona 112,5 387,5 - B 6 500 L-carvona 150 350 + /- B 7 500 L-carvona 225 275 + /- B 8 500 L-carvona 450 50 + B 9 500 Citral 15 485 - B 10 500 Citral 37,5 462,5 - B 11 500 Citral 75 ul 425 - B 12 500 Citral 112,5 387,5 - B 13 500 Citral 150 350 + / - Invertido B 14 500 Citral 225 275 + Invertido B 15 500 Citral 450 50 + Invertido B 16 500 T/L 15 485 - B 17 500 T/L 37,5 462,5 - B 18 500 T/L 75 425 - B 19 500 T/L 112,5 387, 5 - B 20 500 T/L 150 350 + /- B 21 500 T/L 225 275 + B 22 500 T/L 450 50 + B 23 500 Eugenol 15 485 - B 24 500 Eugenol 37, 5 462,5 - B 25 500 Eugenol 75 425 - B 26 500 Eugenol 112,5 387, 5 + /- B 27 500 Eugenol 150 350 + B 28 500 Eugenol 225 275 + B 29 500 Eugenol 450 50 + B 30 500 Geraniol 15 485 - B 31 500 Geraniol 37,5 462,5 - B 32 500 Geraniol 75 425 - B 33 500 Geraniol 112,5 387, 5 - B 34 500 Geraniol 150 350 - B 35 500 Geraniol 225 275 - Invertido B 36 500 Geraniol 450 50 + Invertido B 37 500 C/L/E 15 485 - B 38 500 C/L/E 37,5 462,5 - B 39 500 C/L/E 75 425 - B 40 500 C/L/E 112,5 387, 5 - B 41 500 C/L/E 150 350 - B 42 500 C/L/E 225 275 + /- B 43 500 C/L/E 450 50 + B
Invertido = Inversão de fase - sólidos a flutuar em cima - sem óleos livres; B = branco; A = amarelo. 36 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ A partir dos resultados, foram feitas as seguintes observações: - Todos os terpenos pareceram ficar carregados na PL de panificação e na SAF Mannan. - A SAF Mannan tem uma capacidade de carregamento de terpeno superior à da PL de panificação. - As misturas de dois e três terpenos também pareceram carregar eficazmente. - 0 terpeno eugenol parece ter uma densidade superior à das partículas e da água, uma vez que foi encontrado associado ao pelete. - No caso da SAF Mannan, os níveis de carregamento mais elevados e as partículas mais leves tiveram como resultado partículas carregadas a flutuar à superfície da camada aquosa no caso do citral e do geraniol. - 0 citral foi protegido da oxidação pela SAF Mannan, mas não pela PL de panificação.
Foi determinado o carregamento máximo aproximado para cada tipo de partícula, encontrando-se ilustrado nas Tabelas 9 e 10 abaixo. A percentagem carregada representa o rácio da quantidade de terpeno carregado em relação à quantidade de partículas presente (peso por peso).
Tabela 9 - Carregamento máximo de terpeno na PL de panificação
Terpeno Vol. Carregado μΐ % Carregada p/p L-carvona 37, 5 33,3 Citral 75 67% Timol/L-carvona 1:1 75 67% Eugenol 75 67% Geraniol 75 67% Citral/L-carvona/ Eugenol (1:1:1) 75 67% 37 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Tabela 10 - Carregamento máximo de terpeno na SAF Mannan
Terpeno Vol. Carregado μΐ % Carregada p/p L-carvona 112,5 100% Citral 150 133% Timol/L-carvona 1:1 112,5 100% Eugenol 112,5 100% Geraniol 150 133% Citral/L-carvona/ Eugenol (1:1:1) 150 133%
Exemplo 8 (não de acordo com a invenção) - Avaliação da estabilidade do terpeno em emulsões aquosas e formulações de terpeno encapsulado A estabilidade do terpeno foi avaliada pela observação de formulações de citral, procurando a formação de um produto de oxidação de cor amarela. Conforme ilustrado na coluna do lado direito das Tabelas 5-8, as emulsões de citral e a PL de panificação com citral encapsulado adquiriram progressivamente uma cor cada vez mais amarela com o tempo. No entanto, o encapsulamento de citral em SAF Mannan™ aumentou a estabilidade do citral, evidenciado pela redução ou ausência da cor amarela com o tempo.
Exemplo 9 (não de acordo com a invenção) - Carregamento de terpenos em água minima
Foi seguido o seguinte protocolo para avaliar a possibilidade de o carregamento e encapsulamento do terpeno nas PL poder ser realizado a um nível muito elevado de partículas de levedura (PL) sólidas, para permitir a extrusão directa da formulação carregada para um secador de leito fluidizado. Determinou-se que a quantidade mínima de água para hidratar completamente as partículas SAF Mannan™ é de 3,53 g de água por g de sólidos. Isto define o volume hidrodinâmico (VH) ou a capacidade de absorção de água das partículas. Com este nível de água, as partículas hidratadas têm uma consistência de uma massa firme que é tixotrópica, ou seja, tem pseudoplasticidade como a maionese. A adição de água até 40% acima do VH resulta numa pasta espessa que flui. A reacção padrão que foi usada nos exemplos acima mencionados foi realizada a 3 χ VH de água. 38 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Foram executadas uma série de reacções de carregamento de terpeno (L-carvona), mantendo constante o rácio de partícula:terpeno:Tween (1: 0,44:0,04) e variando a quantidade de água no sistema, desde o VH (3,53 g) até ao VH + 40% de água (4,92 g) . Os controlos foram o sistema de carregamento padrão, que usa 3 x VH de água, reacções de partículas apenas e terpeno apenas. Após incubação durante a noite, foram avaliadas amostras das misturas ao microscópio, para verificar a existência de terpeno livre e evidências de absorção do terpeno pelas partículas, bem como para verificar as características de fluidez do material, avaliando a fluidez em tubos invertidos durante 15 minutos. Além disso, a presença de óleo livre foi avaliada hidratando a mistura de reacção com 5 χ VH, misturando em vórtice para obter uma dispersão completa das partículas e centrifugando para sedimentar o terpeno encapsulado nas partículas. Os resultados estão ilustrados na Tabela 11 e nas Figs. 7 a 12. As Figs. 7 a 12 mostram os resultados de carregamento dos seguintes tubos: - Fig. 7 - Tubo 3 - Fig. 8 - Tubo 5 - Fig. 9 - Tubo 6 - Fig. 10 - Tubo 8 - Fig. 11 - Tubo 10 - Fig. 12 - Tubo 11
Tabela 11
Tubo SAF g Emulsão de Terpeno Peso (g) Água (g) Terpeno Livre Fluidez 1 - L-carvona 4,64 4,5 + + 2 1 - - 8,0 - + 3 1 L-carvona 4,64 4,5 - + 4 1 L-carvona 4,64 - - - 5 1 L-carvona 4,64 0, 17 - - 6 1 L-carvona 4,64 0,35 - - 7 1 L-carvona 4,64 0,52 - L 8 1 L-carvona 4,64 0,7 - Mod. 9 1 L-carvona 4, 64 0,87 - Elevada 10 1 L-carvona 4,64 1, 05 - Elevada 11 1 L-carvona 4, 64 1,39 - Elevada 39 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Os resultados ilustrados na Tabela 11 e nas Figs. 7 a 12 demonstram que o carregamento e encapsulamento de terpeno nas partículas ocorreram em todos os rácios de água avaliados. Surpreendentemente, ocorreu carregamento equivalente mesmo quando a reacção de carregamento estava a ter lugar numa reacção com a consistência de uma massa firme, usando a quantidade mínima de água para hidratar as partículas. A ausência de terpeno livre foi observada ao microscópio (Figs. 7 a 12) e no nível reduzido de terpeno nos sobrenadantes, evidenciado por uma marcada redução na turvação do sobrenadante em comparação com o controlo de apenas terpeno.
Estes resultados aumentam o nosso conhecimento das condições para carregar terpenos em partículas ocas de glucano. A flexibilidade para usar um volume mínimo de água para hidratar as partículas durante o processo de carregamento permitirá fazer o carregamento de terpenos em condições em que a mistura de reacção tem uma consistência tipo massa maleável, usando batedeiras convencionais para uso alimentar. A consistência da mistura final carregada de terpeno e rica em sólidos é adequada para a extrusão directa para formar fios de massa e peletes para secagem em leito fluidizado.
As instalações adequadas para uma maior produção desta maneira necessitam de: - Homogeneizador de Gaulin, ou equivalente, para produzir emulsão de terpeno estável. — Tanque de mistura de massa. — Extrusor. - Secador de leito fluidizado.
Exemplo 10 (não de acordo com a invenção) - Avaliação de um agente hidrocolóide intersticial para auxiliar à dispersão em partículas ocas de glucano secas com componente de terpeno encapsulado quando re-hidratadas
Foi adoptado o seguinte protocolo para avaliar o efeito de um hidrocolóide intersticial para aumentar a dispersão de formulações secas de terpeno encapsulado em partículas ocas de glucano a dispersar quando hidratadas. 40 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ - Partículas SAF Mannan™ - Tween 80 a 0,1% - 15 - L-carvona - Goma xantana a 1% p/v em Tween 80 a 1% O efeito de aumentar os níveis de goma xantana na dispersão em água de L-carvona encapsulada em partículas ocas de glucano secas foi avaliado carregando L-carvona em SAF Mannan pela incubação de 1,1 g de uma emulsão de L-carvona (rácio de L-carvona:água:tensioactivo de 0,75:0,3:0,05) com 1 g de SAF Mannan e 4,4 g de Tween 80 a 1%, contendo entre 0 e 1% de goma xantana, como ilustrado na Tabela 12.
Tabela 12
Tubo SAF g Emulsão de L-carvona (g) Tween 80 a 0,1% (g) 1% Xantana (g) Observações Visuais 1 1 1,1 4,4 0 Grumos grandes não uniformes 2 1 1,1 4,33 0,07 Suspensão uniforme 3 1 1,1 4,26 0, 14 Suspensão uniforme 4 1 1,1 4, 12 0,28 Suspensão uniforme 5 1 1,1 3,85 0,55 Suspensão uniforme 6 1 1,1 3,3 1,1 Suspensão uniforme mais fina 7 1 1,1 2,2 2,2 Suspensão uniforme mais fina 8 1 1,1 0 4, 4 Suspensão uniforme mais fina
Os resultados na Tabela 12 e nas Figs. 13 a 20 demonstram que a inclusão de um hidrocolóide de elevado peso molecular durante a secagem do terpeno encapsulado na partícula ajuda na hidratação e na dispersão das micropartícuias numa suspensão uniforme. Outros exemplos destes agentes hidrocolóides são a maltodextrina, os alginatos ou análogos.
Também pode ser útil incluir um revestimento de pelete, para aumentar a estabilidade dos terpenos carregados e para proporcionar uma libertação sustentada do terpeno. 41 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Exemplo 11 (não de acordo com a invenção) - Avaliação da concentração inibitória minima (CIM) de emulsões de terpenos, de terpenos encapsulados em PL de panificação e em SAF Mannan frescas e de terpenos encapsulados em PL de panificação e em SAF Mannan liofilizados contra S. aureus
Os resultados de um protocolo realizado para comparar a CIM de formulações de terpeno encapsulado em partícula oca de glucano fresca versus liofilizada são mostrados abaixo, na Tabela 13. Foi também testada uma emulsão de terpeno simples e os resultados são apresentados para comparação.
Tabela 13 - CIM g/ml de terpenos
Terpeno Emulsão Panificação SAF Mannan Fresca Liofilizada Fresca Liofilizada L-carvona 3,75 0,1 >0,04 0,01 >0, 02 Citral 0,94 0,01 0,05 0,01 >0, 03 L-carvona/Timo1 0,23 0, 01 0,03 0,01 0, 05 Eugenol 0,12 0, 03 0,05 0,01 0, 05 Geraniol 0,47 0, 03 0,06 0,02 >0, 03 L-carvona/Citral/Eugenol 0,23 0,03 0, 06 0, 02 0,05
As conclusões obtidas a partir dos resultados acima indicados foram: - 0 carregamento do terpeno em partículas ocas de glucano parece melhorar a CIM do terpeno. Geralmente, as emulsões de terpeno frescas são - 4 - 375 vezes menos potentes do que as formulações encapsuladas. - Os terpenos carregados em SAF Mannan™ têm um desempenho ligeiramente melhor do que em PL de panificação. - As composições de terpeno carregadas frescas têm um desempenho ligeiramente melhor do que as composições liofilizadas (pode haver alguma volatilização de terpenos das composições secas durante a liofilização). - Os terpenos em emulsões aquosas ficam estáveis durante, pelo menos, 3 semanas. 42 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Exemplo 12 - Eficácia de terpenos encapsulados à escala de instalação-piloto contra a S. aureus
Foram realizados ensaios antimicrobianos com terpenos encapsulados e misturas produzidas à escala de instalação-piloto contra a S. aureus. Tanto as amostras frescas como as amostras liofilizadas de terpeno encapsulado contendo materiais demonstraram fortes actividades antimicrobianas. Os resultados estão resumidos na Tabela 14 abaixo.
Os terpenos foram encapsulados em SAF-Mannan™ numa escala de 2,5 kg. Uma mistura de três terpenos (geraniol, 275 g; eugenol, 385 g; timol, 440 gramas) foi dissolvida e homogeneizada com 100 g de Tween 80 e 8 1 de água. A SAF Mannan™ (2,5 kg) foi adicionada para formar uma suspensão homogénea. A suspensão foi passada por um homogeneizador de Gaulin para reduzir o tamanho das partículas e o homogeneizado foi incubado durante a noite à temperatura ambiente. Uma amostra do terpeno encapsulado foi retirada e armazenada à temperatura ambiente. 0 restante terpeno encapsulado foi então congelado em tabuleiros e liofilizado. O pó de terpeno encapsulado liofilizado foi moído e armazenado à temperatura ambiente.
Tabela 14
Material CIM (ppm) Ensaios de Staphylococcus aureus Controlo invólucro vazio de PGL >2500 Instalação-piloto - Fresco 100 Instalação-piloto - Liofilizado 100 À escala de instalaçao-piloto, as amostras frescas e liofilizadas foram igualmente potentes numa base de terpeno p/p.
Com base nos resultados da preparação em larga escala, a dose eficaz prevista da formulação liofilizada contra S. aureus é de 200 ppm (a formulação contém -50% de terpeno p/p) ou 0,2 g/1 de água. 43 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Exemplo 13 (nao de acordo com a invenção) - Eficácia de terpenos encapsulados contra micobactérias
As emulsões de terpeno foram preparadas do seguinte modo: - Citral - 4,5 g de citral em 1,5 ml de Tween 80 a 3,3%. - L-carvona/eugenol - 2,25 g de L-carvona e 2,25 g de eugenol em 1,5 ml de Tween 80 a 3,3%. - Eugenol - 4,5 g de eugenol em 1,5 ml de Tween 80 a 3,3%. - Geraniol - 4,5 g de geraniol em 1,5 ml de Tween 80 a 3,3%. - Mistura geraniol/timol - 2,25 g de geraniol e 2,25 g de timol em 1,5 ml de Tween 80 a 3,3%. - Emulsão de controlo - 6 ml de Tween 80 a 1%.
Foi misturada SAF-Mannan™ (2,5 g) com 3 ml de cada emulsão e 7 ml de Tween 80 a 1% e incubada durante a noite para encapsular os terpenos e as misturas de terpenos. As formulações de terpeno encapsulado foram congeladas e liofilizadas, tendo os pós sido reduzidos a um pó fino. Foram avaliadas suspensões de terpenos encapsulados (25 mg/ml) e emulsões de terpenos não encapsulados quanto à actividade antibacteriana contra micobactérias. Os resultados são apresentados na Tabela 15.
Tabela 15
Material CIM (ppm) Ensaios micobacterianos PGL Citral L 250 PGL L-carvona/Eugenol L 500 PGL Eugenol L 500 PGL Geraniol L 125 PGL Geraniol/Timol L 62,5 Emulsão de Controlo >1000 Emulsão de Citral 35 Emulsão de L-carvona/Eugenol 53 Emulsão de Eugenol 105 Emulsão de Geraniol 70 Emulsão de Geraniol/Timol 53 L = (Liofilizado) 44 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Exemplo 14 (nao de acordo com a invenção) - Actividade nematicida de terpenos encapsulados
Foram feitas preparações de paredes celulares de levedura com citral encapsulado em conformidade com os procedimentos descritos acima. As partículas ocas de glucano continham 17,5% de citral e estavam presentes nas preparações de teste numa concentração de 1000 ppm. Isto significa que os terpenos estavam efectivamente presentes numa concentração de 175 ppm.
Foi adicionado 1,0 ml das preparações de teste a volumes entre 0,1 e 0,15 ml de água contendo nemátodos dos nódulos radiculares. Foi adicionado 1,0 ml de água aos nemátodos como controlo.
Foram feitas observações conforme descrito anteriormente e a taxa de aniquilação (ou seja, percentagem de mortalidade) foi avaliada após 24 e 48 horas. Os resultados apresentados abaixo, na Tabela 16, são uma média de 2 conjuntos de resultados.
Tabela 16 - Actividade nematicida de solução de terpeno encapsulado (17,5% de citral em 1000 ppm)
Taxa de Aniquilação Tempo Teste Controlo 24 h 45 17 48 h 56 21
Os resultados demonstram que as partículas ocas de glucano com terpenos encapsulados são eficazes na aniquilação de nemátodos dos nódulos radiculares numa concentração de partículas de 1000 ppm, o que corresponde a uma concentração de citral de apenas 175 ppm.
Assim, as partículas ocas de glucano com terpenos encapsulados parecem ser tão eficazes enquanto nematicidas como os terpenos em solução ou com tensioactivos. A actividade nematicida é mantida apesar de o terpeno estar encapsulado dentro da partícula. É de antecipar que concentrações mais elevadas de terpenos dentro das partículas ocas de glucano ou concentrações mais elevadas das partículas 45 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ resultem numa taxa de aniquilaçao ainda maior, como é o caso dos terpenos em solução ou com tensioactivos.
Exemplo 15 - Propriedades fungicidas de terpenos encapsulados e não encapsulados
Foram realizados os seguintes protocolos para avaliar as propriedades fungicidas das várias combinações de terpenos e para comparar a eficácia de composições encapsuladas e não encapsuladas.
Avaliação de propriedades antifúngicas de diferentes formulações de terpeno
Usou-se uma análise em placa de microtitulação para avaliar a concentração inibitória minima (CIM) de uma gama de compostos de terpeno contra diferentes organismos patogénicos. A análise usada para cada organismo está descrita detalhadamente mais adiante, mas as caracteristicas gerais importantes são as que se seguem.
Na análise, usam-se dois períodos de incubação para distinguir entre a actividade fungistática (inibição do crescimento) e a actividade fungicida (morte). 0 primeiro período de incubação permite a avaliação da inibição do crescimento, mas não permite distinguir entre a mera prevenção do crescimento e a morte das células. 0 objectivo do segundo período de incubação é dar tempo e nutrientes suficientes para que qualquer célula dormente ou inibida que sobreviva à exposição ao terpeno prolifere. Qualquer célula que tenha sido inibida pelos efeitos fungistáticos deve reagir e crescer durante o segundo período de incubação, ao passo que as células que tenham sido mortas pela exposição aos terpenos não crescerão no novo meio.
Foram feitas experiências de rastreio iniciais com um total de 31 formulações de terpeno diferentes (Tabela 17) . Estas experiências foram repetidas usando um subgrupo de formulações de terpeno fortemente activas (Tabela 18).
Também foi testada uma combinação dos terpenos geraniol, eugenol e timol, num rácio de 2:1:2, encapsulados dentro de 46 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ partículas de glucano; esta amostra é denominada PL-GET e é a única formulação testada de acordo com a invenção. Foi ainda testada uma combinação de geraniol, eugenol e timol não encapsulados, com o mesmo rácio, para comparação com a forma encapsulada.
Análise de CIM usando Saccharomyces cerevisiae
Acrescentou-se S. cerevisiae (5xl05 células/ml num meio de crescimento YPD) a cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços em aliquotas de 100 yL. Pelo menos uma coluna por placa foi designada como controlo de células apenas, não tendo sido acrescentado nenhum terpeno a esses poços. Foram acrescentadas aliquotas (100 μΐ) de diferentes formulações de terpeno à primeira fila das restantes colunas e foram realizadas diluições por desdobramento em série, transferindo 100 μΐ de uma fila para a próxima num total de 7 vezes. Finalmente, foram rejeitados 100 μΐ da última fila, para garantir que todos os poços continham o mesmo volume. As placas de microtitulação foram incubadas estaticamente durante a noite, a 30°C.
Após a incubação, as placas foram classificadas quanto à inibição do crescimento (evidenciado por falta de turvação). A inibição do crescimento (>75%) foi visualmente confirmada por microscopia.
Uma vez determinada a CIM para cada formulação, as placas de microtitulação foram centrifugadas e o meio gasto foi retirado dos poços não turvos. As células foram ressuspensas num meio fresco (100 μΐ) e as placas foram re-incubadas durante a noite, a 30°C. A avaliação da inibição do crescimento foi realizada como anteriormente.
Análise de CIM usando um inoculo misto
As diferentes formulações de terpeno foram diluídas em série na placa de microtitulação de 96 poços, conforme descrito para S. cerevisiae. Foi então adicionado ágar YPD fundido aos poços, juntamente com 5 μΐ de inoculo misto (preparado a partir de folhas de videira com bolor até uma concentração de 5xl04 células/ml). As placas foram incubadas 47 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ estaticamente durante 24 horas à temperatura ambiente e o crescimento de esporos foi avaliado visualmente por microscopia.
Devido à utilização de meio sólido, o segundo periodo de incubação em meio fresco não pôde ser realizado.
Análise de CIM com Colletotrichum graminicola
As diferentes formulações de terpeno foram diluídas em série na placa de microtitulação de 96 poços, conforme descrito para S. cerevisiae. Adicionou-se C. graminicola (300 esporos/poço) aos terpenos diluídos e as placas foram incubadas estaticamente durante 48 horas à temperatura ambiente. A germinação e o crescimento de esporos foram avaliados visualmente por microscopia.
Uma vez determinada a CIM para cada formulação, as placas de microtitulação foram centrifugadas e o meio gasto foi retirado dos poços com crescimento inibido. Os esporos foram ressuspensos num meio fresco (100 μΐ) e as placas foram re-incubadas durante a noite, à temperatura ambiente. A avaliação da inibição do crescimento foi realizada como anteriormente.
Tabela 17* - Valores de CIM e CIM fungicida obtidos a partir da avaliação inicial de 31 formulações de terpeno
Formulação de terpeno3 Saccharomyces cerevisiae Vários micróbios Colletotrichum graminicola CIM CIM Fungicida CIM CIM Fungicida CIM CIM Fungicida 1 Geraniol (G) 500 500 250 NT 63 63 2 Eugenol (E) 500 500 125 NT 25 125 3 Timol (T) 250 250 63 NT 63 500 4 Citral (C) 250 250 63 NT 125 63 5 L-carvona (L) 250 500 63 NT 125 125 6 GE 1000 2000 125 NT 63 250 7 GT 500 500 250 NT 125 63 8 GC 500 500 125 NT 125 250 9 GL 500 500 125 NT 125 125 10 ET 500 500 125 NT 125 125 11 EC 250 1000 31 NT 125 125 12 EL 500 1000 125 NT 125 125 13 TC 500 500 16 NT 63 63 14 TL 500 1000 63 NT 63 63 15 CL 500 500 < 8 NT 63 63 48 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ 16 GET 500 500 23 NT 94 94 17 GEC 250 500 94 NT 94 94 18 GEL 500 1000 188 NT 188 188 19 GTC 500 500 47 NT 188 188 20 GTL 500 1000 94 NT 94 94 21 GCL 250 500 94 NT 47 47 22 ETC 125 250 188 NT 94 94 23 ETL 500 1000 <12 NT 94 94 24 ECL 500 1000 <12 NT 188 188 25 TCL 500 1000 23 NT 94 375 26 GETC 500 1000 125 NT 250 500 27 ETCL 500 1000 63 NT 125 125 28 GTCL 500 1000 125 NT 250 250 29 GECL 500 1000 <16 NT 500 500 30 GETL 1000 1000 125 NT 500 250 31 GECTL 1000 1000 78 NT 625 625 GET (rácio 2:1:2, p/p/p) NT NT 98 NT 78 156 PL-GET(G:E:T, rácio 2:1:2, p/p)b 98 391 98 NT 20 20 NT = não testado; PL-GET = formulação de GET encapsulado em levedura. a As combinações de terpenos foram misturadas num rácio de 1:1 (p/p), salvo indicação em contrário. b CIMs calculadas por teor de terpeno. * PL-GET é a única formulação de acordo com a invenção.
Tabela 18* - Análise de repetição para determinar valores de CIM e CIM fungicida
Formulação de terpeno3 (por n. °) Saccharomyces cerevisiae Vários micróbios isolados de folhas de videira com bolor b Colletotrichum graminicola CIM CIM Fungicida CIM CIM Fungicida CIM CIM Fungicida T (3) NT NT 63 NT NT NT L (5) NT NT 250 NT NT NT GE (6) NT NT NT NT 125 500 EC (11) 125 250 NT NT NT NT TC (13) NT NT 250 NT 63 250 TL (14) NT NT 500 NT 250 500 CL (15) NT NT 500 NT 125 500 GET (16) NT NT 375 NT 188 375 GEC (17) 250 500 NT NT NT NT GCL (21) 250 500 NT NT 375 750 ETC (22) 125 250 NT NT 94 188 ETL (23) NT NT 375 NT 188 750 ECL (24) NT NT 750 NT NT NT TCL (25) NT NT 750 NT 94 375 ETCL (27) NT NT 500 NT 63 500 49 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ GECL (29) NT NT 1000 NT NT NT PL-GET (G:E: T, rácio 2:1:2, p/p) c 98 195 NT NT 39 156 NT = não testado; PL-GET = formulação de GET encapsulado em levedura. NOTA: As amostras foram analisadas em duplicado. No caso de serem obtidos diferentes entre amostras duplicadas, apresentou-se o valor mais elevado, amostra duplicada diferiu em mais de uma diluição por desdobramento. a As combinações de terpenos foram misturadas num rácio de 1:1 (p/p) indicação em contrário. b 1 x 104 células/ml de suspensão. b CIMs calculadas por teor de terpeno. * PL-GET é a única formulação de acordo com a invenção. valores Nenhuma , salvo
Inoculo misto A utilização de um inoculo misto apresenta uma série de problemas. A variabilidade no conteúdo de esporos entre preparações tem como resultado uma reduzida reprodutibilidade inter-análises e o crescimento de organismos contaminantes dificulta a classificação da germinação dos esporos. As espécies de levedura unicelular são especialmente problemáticas na ocultação do crescimento de esporos. Embora não se tenha conseguido obter dados precisos desta análise, foi observado um efeito inibidor dos terpenos. A identificação de esporos foi mais fácil durante a classificação da análise de repetição do que durante a análise de avaliação inicial, pois foi usado um número maior de esporos (aproximadamente 50/poço versus aproximadamente 10/poço). Portanto, os dados obtidos durante a análise de repetição podem oferecer uma estimativa mais fiável da CIM.
Colletotrichum graminicola
Os valores de CIM geralmente mais elevados obtidos da análise de repetição em comparação com a análise de avaliação inicial podem ser devidos a: • uso de soluções de terpeno com uma semana; • uso de esporos preparados de fresco, que tinham uma maior variabilidade do que os utilizados na análise de avaliação inicial, podendo, portanto, ser mais difíceis de matar. 50 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Comparação de formulações de terpeno como emulsões livres com as mesmas formulações de terpeno quando encapsuladas em partículas ocas de glucano: análises de CIM usando Saccharomyces cerevisiae
Foi adicionado meio de crescimento YPD (100 μΐ) a cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços e aliquotas de diferentes formulações de terpeno foram adicionadas à primeira fila, dando um volume total de 200 μΐ nesta fila. Uma coluna foi designada como controlo de células apenas e não foi acrescentado nenhum terpeno a esses poços. Foram realizadas diluições por desdobramento em série, transferindo 100 μΐ de uma fila para a próxima, num total de 7 vezes. Finalmente, foram rejeitados 100 μΐ da última fila, para garantir que todos os poços continham o mesmo volume. Adicionou-se então S. cerevisiae (5xl05 células/ml em meio de crescimento YPD) a cada poço em aliquotas de 100 μΐ e foi medida a absorvência a 620 nm (A62o) para cada poço, usando um leitor de placa de microtitulação. As placas de microtitulação foram incubadas estaticamente durante a noite, a 3 0 °C.
Após a incubação, a A62o foi medida novamente e as placas foram classificadas quanto à inibição do crescimento (>75%). A inibição do crescimento foi visualmente confirmada por microscopia.
Para as emulsões de terpeno livre, após a determinação da CIM de cada formulação, as placas de microtitulação foram centrifugadas e o meio gasto foi retirado dos poços com crescimento inibido. As células foram ressuspensas num meio fresco (100 μΐ) e as placas foram re-incubadas durante a noite, a 30°C. A avaliação da inibição do crescimento foi realizada como anteriormente.
Os resultados de CIM e CIM fungicida estão resumidos na Tabela 19. 51 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Resultados
Tabela 19* - Valores de CIM e CIM fungicida obtidos a partir da avaliação inicial de 31 formulações de terpeno contra
Saccharomyces cerevisiae
Formulação de terpeno a (n.° referência) Formulações encapsuladas em levedura b' c Emulsões de terpeno livre CIM CIM Fungicida CIM CIM Fungicida G (1) 111 NT 250 250 E (2) 131 NT 125 250 T (3) 115 NT 125 250 C (4) 118 NT 125 250 L (5) 254 NT 250 500 GE (6) 118 NT 250 500 GT (7) 108 NT 125 250 GC (8) 113 NT 125 250 GL (9) 117 NT 250 500 ET (10) 131 NT 125 250 EC (11) 126 NT 125 250 EL (12) 129 NT 125 250 TC (13) 59 NT 63 63 TL (14) 124 NT 63 125 CL (15) 124 NT 125 125 GET (16) 119 NT 63 125 GEC (17) 119 NT 125 250 GEL (18) 121 NT 125 125 GTC (19) 115 NT 125 125 GTL (20) 119 NT 125 125 GCL (21) 234 NT 125 125 ETC (22) 124 NT 125 125 ETL (23) 123 NT 125 125 ECL (24) 63 NT 63 125 TCL (25) 61 NT 125 500 GETC (26) 61 NT 63 250 ETCL (27) 120 NT 63 125 GTCL (28) 124 NT 125 125 GECL (29) 125 NT 125 125 GETL (30) 122 NT 125 250 GECTL (31) 120 NT 125 250 GET (rácio 2:1:2, p/p/p) 125 d NT 125 250 PL-GET (G:E:T, rácio de 2:1:2, p/p) 125 NT 125 c 250 c 52 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ PL-ETC (E:T:C, rácio de 125 NT 125 c 250 c 1: 1:1, p/p) ΝΤ = não testado; PL-GET = formulação GET encapsulada em levedura; PL-ETC = formulação ETC encapsulada em levedura.
As combinações de terpenos foram misturadas num rácio de 1:1 (p/p), salvo indicação em contrário. b Formulações encapsuladas em levedura, salvo indicação em contrário. CIM calculada por teor de terpeno. d Formulação de emulsão não encapsulada. * PL-GET é a única formulação de acordo com a invenção.
Tanto para as emulsões de terpeno como para os terpenos encapsulados em leveduras, as CIM foram tipicamente <125 ppm, com as formulações mais activas a inibirem o crescimento a ~60 ppm. Os valores de CIM obtidos para as emulsões de terpeno foram similares aos obtidos para as respectivas formulações encapsuladas em levedura. Nos casos em que se obtiveram valores diferentes, estes apenas diferiram em aproximadamente uma diluição por desdobramento.
Muitas das emulsões de terpeno livre foram fungicidas à CIM inibidora de crescimento, com a maioria a demonstrar actividade fungicida a uma concentração duas vezes superior.
Estes resultados demonstram que os terpenos encapsulados em partículas de glucano são, pelo menos, tão eficazes a matar fungos como as formas não encapsuladas. Além disso, as composições encapsuladas usadas podem ter tido potência reduzida devido ao facto de terem sido armazenadas durante 45 dias a 4°C e ao facto de terem um teor de terpeno subóptimo, de ~4% p/p. A análise para determinar a actividade fungicida envolve um passo de centrifugação, que tenta separar as células microbianas de quaisquer resíduos de terpeno no meio de crescimento, produzindo um pelete de células no fundo do poço. Este pelete é então ressuspenso em meio fresco e incubado uma segunda vez na ausência de terpeno. No entanto, a centrifugação não consegue discriminar entre células microbianas e partículas de levedura; portanto, quando se usam terpenos encapsulados em levedura, o pelete de células também vai conter partículas de levedura com terpeno carregado. Consequentemente, tanto as partículas de levedura como as células microbianas são então ressuspensas no meio fresco. 53 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Considera-se que este problema de metodologia não afecta os resultados obtidos nas experiências descritas acima pelos motivos que se seguem. • Em experiências anteriores, foram usadas emulsões de terpeno em vez de partículas de levedura com terpeno carregado e a actividade fungicida foi claramente demonstrada. • Os terpenos encapsulados são libertados por difusão e é rapidamente alcançado um equilíbrio entre a concentração de terpenos encapsulados e a concentração de terpenos libertados no meio circundante. Assim, após a centrifugação e ressuspensão em meio fresco, a concentração de terpeno libertado no meio de crescimento é, provavelmente, muito inferior à necessária para a actividade de inibição de crescimento. • Não houve crescimento quando o conteúdo do poço da CIM fungicida foi colocado num meio de crescimento de ágar sólido. Quando colocado num meio de crescimento sólido, a difusão de qualquer terpeno residual pelo grande volume da placa de ágar resulta numa concentração de terpeno local que é demasiado baixa para provocar inibição do crescimento. A falta de crescimento do conteúdo do poço da CIM fungicida deve, portanto, ser devida à actividade fungicida inicial. Em contrapartida, quando foi obtida uma CIM inferior à CIM fungicida e o conteúdo do poço da CIM foi colocado num meio de crescimento de ágar sólido, foi observado crescimento, indicando um efeito fungistático.
Exemplo 16 - Preparação de composições de terpeno encapsulado para ensaios de campo 0 objectivo do seguinte protocolo era encapsular uma composição de terpeno em partículas ocas de glucano para posteriores ensaios de campo.
Materiais:
Timol (fornecido por Alpha-Gamma Corporation), eugenol (fornecido por Alpha-Gamma Corporation), geraniol (fornecido 54 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ por Alpha-Gamma Corporation) , Tween 80 a 1% (fornecido por Alpha-Gamma Corporation) , partículas de parede celular de levedura, goma xantana.
As partículas de parede celular de levedura foram adquiridas em Biorigin (São Paulo, Brasil) com a designação comercial Nutricell MOS 55 e foram produzidas pela Açucareira Quatá S.A, Usina Quatá, Quatá - São Paulo - Brasil - Código Postal 19780 000. As partículas são um extracto de parede celular seca por nebulização de S. cerevisiae e são um pó fluido de cor de bege clara a acastanhada.
Protocolo: 0 seguinte protocolo foi adequado para 1 kg de partículas, mas pode ser simplesmente aumentado para uma maior produção. 1. Preparar a mistura de terpeno: misturar 375 gramas de geraniol + 525 gramas de eugenol + 600 gramas de timol e agitar num frasco de vidro. 2. Preparar 6,2 1 de Tween 80 a 1% misturando 62 gramas de Tween 80 em 6,2 1 de água numa cuba branca de 10 litros (2 galões). Misturar para formar solução. 3. Juntar 6,2 gramas de goma xantana à solução de Tween e agitar para dissolver. 4. Preparar a emulsão de terpeno misturando 1,5 kg de mistura de terpeno + 6,2 1 de Tween 80 a 1% / 0,1% de goma xantana em cuba branca usando a batedeira Polytron. 5. Juntar 1000 gramas de partículas de parede celular de levedura - misturar usando misturador de tinta para formar uma suspensão uniforme. 6. Juntar a emulsão de terpeno do passo 4 às partículas de parede celular de levedura, misturando sempre para formar uma consistência fina tipo maionese. 7. Verter a mistura de terpeno em latas e incubar durante a noite.
Resultados: Foram obtidos geraniol, eugenol e timol encapsulados em partículas ocas de glucano sob a forma de pasta. A pasta foi facilmente convertida num pó seco por técnicas convencionais de secagem por nebulização. A pasta é a composição "líquida" mencionada nos protocolos que se seguem e o "pó" é a forma seca por nebulização. 55 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Exemplo 17 - Ensaios de campo de composição de terpeno encapsulado sobre o míldio
Nas uvas, o míldio é provocado pelo fungo Plasmopara vitícola, que infecta vinhas de todo o mundo e pode provocar perdas devastadoras aos viticultores em termos de rendimento das culturas e de qualidade do vinho. 0 fungo ataca os frutos e todas as partes verdes da videira, fazendo secar as folhas e apodrecer as flores e os bagos. A doença manifesta-se por manchas irregulares de cor amarelo-pálida ou amarelo-esverdeada na superfície superior das folhas, com um crescimento fúngico denso, branco-acinzentado, do tipo algodão a cobrir a parte inferior das lesões da folha. Os bagos também podem ficar cobertos pelo míldio e, dependendo do tempo da infecção, podem tornar-se castanhos e moles ou podem não amolecer de todo. 0 míldio propaga-se pela dispersão de esporos pelo vento e pela chuva e precisa de condições húmidas para haver infecção. É especialmente problemático em ambientes com humidade elevada. São recomendadas medidas preventivas para a gestão da doença, com aplicações precoces de fungicidas seguidas de aplicações repetidas a intervalos adequados. Surgiu resistência a alguns tratamentos e, embora o desenvolvimento da resistência possa ser minimizado pelo uso alternado de diferentes fungicidas, continua a ser um problema. 0 objectivo deste ensaio era investigar a eficácia da formulação de terpeno encapsulado do Exemplo 16 (PGL-GET), fornecida como uma formulação líquida ou em pó (seca por nebulização), na prevenção do míldio nas uvas.
Quatro talhões adjacentes, cada um dos quais com 0,1 ha, foram identificados no local 20 da vinha Kir-Yianni.
Kir-Yianni é uma vinha de 35 ha a 300 m de altitude. Está limitada por um carvalhal misto a norte e a oeste e por pomares e vinhas a sul e a este.
Os quatro talhões tinham sido todos tratados com vários produtos antes da aplicação da formulação de terpeno. A 26 de Junho de 2004, dois dos quatro talhões foram pulverizados com 56 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ a formulação de terpeno em pó, numa dose de 0,5 g/1 ou 2 g/1 (ver ilustração esquemática na Figura 21). Um terceiro talhão foi tratado com calda bordalesa convencional mais enxofre molhável e o restante talhão ficou sem tratamento. As videiras de cada talhão foram monitorizadas para detecção de sinais de míldio durante a semana seguinte.
Outros quatro talhões adjacentes, cada um dos quais com 0,1 ha, foram identificados no local 18 da vinha Kir-Yianni. Os quatro talhões tinham sido todos tratados com vários produtos antes da aplicação da formulação de terpeno. A 26 de Junho de 2004, dois dos quatro talhões foram pulverizados com a formulação líquida de terpeno, numa dose de 1 g/1 ou 4 g/1 (Figura 21) (nota: 1 g da formulação líquida de terpeno tem um volume de 1 ml). Dos dois talhões restantes, um ficou sem tratamento e outro foi pulverizado com Mikal®, um tratamento convencional para o míldio, a 28 de Junho de 2004. As videiras de cada talhão foram monitorizadas para detecção de sinais de míldio durante a semana seguinte.
Em ambos os locais, o produto de terpeno foi aplicado à taxa de 1200 1/ha.
Foram registadas as seguintes fases de crescimento das uvas: - abrolhamento, 26 de Março de 2004 - floração, 1 de Junho de 2004 - pintor, 6 de Agosto de 2004
As aplicações do estudo tiveram lugar antes do pintor. A estação de crescimento vegetativo de 2004 foi excepcionalmente tardia e foi húmida do princípio ao fim. A pressão de doença por míldio foi extremamente elevada, os níveis de podridão cinzenta foram elevados e a pressão de oídio foi moderada. As formulações líquidas e em pó de PGL-GET foram armazenadas à temperatura ambiente. Não foram usadas condições especiais de armazenamento. 57 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Detalhes dos produtos comparadores
Ensaio de formulação em pó: calda bordalesa, produzida por Manica Spa, Itália, embalada na Grécia por Moscholios Chemicals SA; enxofre molhável.
Ensaio de formulação liquida: Mikal® (fosetil-al 50%, folpete 25%), produzido por Bayer CropScience, distribuído na Grécia por Bayer Hellas SA. Os produtos comparadores foram aplicados do seguinte modo: uma aplicação antes do abrolhamento, numa dosagem de 15 g/1, seguida de duas ou mais aplicações por ano numa dosagem de 6,5 g/1. Foi usada uma taxa de pulverização de 1000 1/ha para as três aplicações.
Ensaio de formulação em pó: aplicou-se calda bordalesa (2 g/1) e enxofre molhável (2,2 g/1) a 26 de Junho de 2004.
Ensaio de formulação líquida: aplicou-se Mikal (3,2 g/1) a 28 de Junho de 2004.
As videiras foram examinadas visualmente, procurando sintomas de míldio. O inicio da doença foi marcado por uma média de duas manchas gordurosas por folha. Considerou-se que os tratamentos que preveniram o aparecimento de mais manchas ofereceram protecção eficaz contra o míldio.
Resultados
Formulação em pó de PGL-GET (seca por nebulização) O tratamento convencional da calda bordalesa ofereceu uma boa protecção contra o míldio. Foram observados ligeiros sintomas de míldio nas videiras de controlo. A concentração de 0,5 g/1 de produto de terpeno não ofereceu protecção e a concentração de 2 g/1 de produto de terpeno ofereceu uma protecção apenas ligeiramente superior à do controlo. Nota: a pressão de doença neste local era muito baixa devido ao recente tratamento pesticida.
Foram encontradas dificuldades na dissolução da formulação em pó, uma vez que este era muito fino, resultando na dispersão no ar. Isto pode ter afectado negativamente a eficácia do produto. 58 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Formulação líquida de PGL-GET
Quando administrado a uma dose de 4 g/1, o produto de terpeno ofereceu uma protecção excelente contra o míldio no coberto exposto. A dosagem de 1 g/1 não ofereceu nenhuma protecção. Foram observados sintomas graves de míldio no talhão de controlo. A formulação líguida foi fácil de usar e tinha um odor agradável.
Discussão 0 míldio pode provocar perdas devastadoras para os viticultores por causa dos seus efeitos sobre o rendimento das culturas e a gualidade do vinho. A gestão da doença concentra-se na prevenção porgue, uma vez estabelecida, a infecção pode alastrar rapidamente. No local pulverizado com a formulação em pó, as PGL-GET não mostraram eficácia na dosagem mais baixa (0,5 g/1) e a dose de 2 g/1 foi menos eficaz do que o tratamento convencional. Neste local, as aplicações recentes de pesticida resultaram numa baixa pressão da doença, o que pode ter limitado a eficácia aparente do tratamento de terpeno. No entanto, considerou-se que uma dose inferior a 2 g/1 do produto de terpeno era inadequada.
No local pulverizado com a formulação líquida, foi oferecida protecção excelente do coberto exposto pelo nível de dose mais elevado, de 4 g/1. O crescimento vegetativo excessivo neste local resultou num tratamento mais eficaz dos ramos exteriores mais novos, por comparação com os ramos mais velhos da parte interior do coberto. A cobertura foliar completa pelo produto de terpeno é útil, uma vez que o tratamento não é sistémico. Estima-se que um aumento de aproximadamente 30% sobre o volume utilizado nos tratamentos sistémicos convencionais proporcionaria uma boa cobertura, usando o tratamento com terpeno. 59 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Conclusões : A aplicação foliar da formulação líquida de PGL-GET foi altamente eficaz no controlo do míldio numa concentração de 4 g/1. As concentrações mais baixas de 0,5 g/1 (em pó) e 1 g/1 (líquido) não foram eficazes.
Exemplo 18 - Ensaios de campo de composição de terpeno encapsulado sobre o oídio O oídio das uvas é provocado pelo fungo Uncinula necator e provoca reduções no crescimento da videira, na qualidade do fruto e na resistência das videiras ao Inverno. Em uvas para vinho, um nível de infecção de apenas 3% dos bagos pode afectar a qualidade do vinho. A doença caracteriza-se por pequenas manchas de cor branca a cinzenta de crescimento fúngico, que aumentam para uma camada superficial branca pulverulenta sobre as folhas. O crescimento fúngico também pode ocorrer nos bagos, que podem rachar. Em contraste com o míldio, que precisa de condições quentes e húmidas, o oídio pode ser um problema em estações de crescimento mais secas, uma vez que prefere áreas ensombradas com humidade mas não condições de chuva. São recomendadas medidas preventivas para a gestão do oídio, com aplicações precoces de fungicidas seguidas de aplicações repetidas a intervalos adequados.
Este estudo pretendia investigar a eficácia da aplicação da composição de PGL-GET na prevenção do oídio das uvas.
Três talhões adjacentes, cada um dos quais com 0,1 ha, foram identificados no local 18 da vinha Kir-Yianni. A 19 de Julho de 2004, um dos três talhões foi pulverizado com a formulação líquida de PGL-GET, numa dose de 2 ml/1, e um ficou sem tratamento. O talhão restante foi pulverizado com o tratamento convencional de Equation (2,5 g/1), Alliete (0,9 g/1) e Punch (0,075 ml/1) (ver Fig. 22). As videiras de cada talhão foram monitorizadas para detecção de sinais de oídio durante a semana seguinte.
Outros três talhões adjacentes, cada um dos quais com 0,1 ha, foram identificados no local 20 da vinha Kir-Yianni. A 20 de Julho de 2004, um dos três talhões foi pulverizado 60 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ com a formulação líquida de PGL-GET, numa dose de 2 ml/1, e os dois talhões restantes ficaram sem tratamento (ver Fig. 22) . As videiras de cada talhão foram monitorizadas para detecção de sinais de oídio durante a semana seguinte.
Em ambos os locais, os talhões tinham sido previamente tratados com vários produtos, incluindo uma aplicação prévia de produto de terpeno.
Todos os tratamentos com terpeno foram aplicados a uma taxa de 1200 1/ha para garantir uma cobertura completa.
Foram registadas as seguintes fases de crescimento das uvas: - abrolhamento, 26 de Março de 2004 - floração, 1 de Junho de 2004 - pintor, 6 de Agosto de 2004
As aplicações do estudo tiveram lugar antes do pintor. A estação de crescimento vegetativo de 2004 foi excepcionalmente tardia e foi húmida do princípio ao fim. A pressão de doença por míldio foi extremamente elevada, os níveis de podridão cinzenta foram elevados e a pressão de oídio foi moderada.
Detalhes dos produtos comparadores Não foi usado nenhum produto comparador no local 20. O tratamento comparador usado no local 18 está pormenorizado abaixo.
Punch® (flusilazol 40%), DuPont. A 19 de Julho de 2004, foi aplicado Punch numa dose de 0,075 ml/1 como tratamento preventivo do oídio, seguindo as instruções do fabricante.
Detalhes de produtos adicionais Não foram usados produtos adicionais no local 20. Os produtos adicionais usados no local 18 estão pormenorizados abaixo. 61 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Sistema Equesion (famoxadona 22,5% mais cimoxanil 30%) e Alliete (fosetil-al 80%). A 19 de Julho de 2004, aplicou-se Equation (2,5 g/1) e Alliete (0,9 g/1) como tratamentos preventivos do mildio. A dose foi determinada de acordo com as instruções do fabricante.
Os produtos comparador e adicional representam tratamentos convencionais no cronograma de gestão integrada de pragas.
As videiras foram examinadas visualmente, procurando sintomas de oídio.
Resultados:
Local 18
Aproximadamente 20% dos pedúnculos e caules no talhão de controlo estavam pretos, indicando infecção de oídio moderada. Tanto no talhão de tratamento convencional como no talhão tratado com terpeno, todos os caules e cachos estavam verdes, indicando que tinha sido dada uma protecção adequada.
Local 20 Não foi observada qualquer evidência de infecção por oídio em nenhum dos talhões.
Observações adicionais
No final da estação de crescimento, os talhões nos locais 18 e 20 mostraram, de modo geral, menos pressão devida a doença do que o resto da vinha.
As infecções por oídio provocam perdas consideráveis aos viticultores, pelas reduções do crescimento da videira, da qualidade do fruto e da resistência das videiras ao Inverno. Além disso, a qualidade do vinho pode ser afectada por um nível de infecção de apenas 3% dos bagos. A gestão da doença concentra-se na prevenção porque, uma vez estabelecida, a infecção pode alastrar rapidamente. Neste estudo, a aplicação 62 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ do produto de terpeno PGL-GET no local 18 preveniu eficazmente a infecção por oídio e o nível de controlo exibido pelo produto de terpeno foi comparável ao proporcionado pelo tratamento convencional. No entanto, os resultados do local 20 são inconclusivos, devido à falta de infecção por oídio. Esta falta de infecção deve-se, provavelmente, à vasta aplicação de pesticidas antes do estudo, o que provocou uma baixa pressão de doença. O nível mais baixo de stress devido à doença nos locais 18 e 20 sugere que o tratamento de terpeno precoce aplicado nestes locais pode ter sido benéfico para o controlo da infecção a longo prazo.
Conclusões: A PGL-GET preveniu eficazmente a infecção por oídio, com um nível comparável do controlo ao oferecido pelo tratamento convencional.
Exemplo 18 - Ensaios de campo adicionais de composição de terpeno encapsulado sobre o oídio
Este estudo pretendia investigar a eficácia da aplicação de PGL-GET no tratamento do oídio nas uvas de mesa Grimson Seedless.
Um talhão de 0,1 ha na vinha Tsigaras (aproximadamente a 80 km a sul da vinha Kir-Yianni) foi inadvertidamente deixado sem tratamento durante a aplicação de cisteína a 1 de Julho de 2004. As videiras neste talhão mostraram posteriormente graves sintomas de oídio nas folhas, caules e uvas. A 12 de Julho de 2004, o talhão não tratado foi pulverizado com 3 ml/1 de formulação líquida de PGL-GET à taxa de 1200 1/ha e o resto da vinha foi pulverizada com o produto comparador Rogana. As videiras foram avaliadas quanto aos sintomas de oídio após 24 horas.
As videiras foram conduzidas num sistema de latada alta. 63 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Detalhes do produto comparador
Rogana (fenbuconazol 5%, binocap 16%), produzido por BASF (BASF Agro Hellas SA, Atenas, Grécia). A 12 de Julho de 2004, aplicou-se Rogana à vinha Tsigaras como tratamento do oídio. A dose foi determinada de acordo com as instruções do fabricante.
As videiras foram examinadas visualmente, procurando sintomas de oídio.
Resultados
Eram evidentes sintomas graves de oídio antes da aplicação de PGL-GET. Apenas 24 horas após a aplicação de PGL-GET, a camada branca do oídio tornou-se preta, indicando actividade antifúngica efectiva. Como a doença foi efectivamente parada nesta altura, não foram aplicados mais tratamentos. A PGL-GET mostrou eficácia comparável à do tratamento convencional.
Discussão:
Neste estudo, uma infecção de oídio estabelecida foi tratada de forma rápida e eficaz utilizando PGL-GET. Apenas 24 horas após a aplicação, a anteriormente grave infecção por oídio foi detida pela aplicação do produto de terpeno, com eficácia comparável à do tratamento convencional.
Os dados preliminares obtidos deste estudo sugerem que a PGL-GET pode ser eficaz no tratamento de infecções fúngicas estabelecidas, para além de demonstrar capacidade preventiva.
Exemplo 19 - Ensaios de campo adicionais de composição de terpeno encapsulado sobre o oídio
Antecedentes e Fundamentos
No presente ensaio, o uso de PGL-GET foi investigado como parte de um programa experimental de controlo do oídio usando produtos orgânicos numa vinha da Tasmânia (vinha Frogmore Creek, Hathaway Trading Pty Ltd, Box 187, Richmond 64 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ TAS 7025, Austrália). Ο objectivo deste estudo era investigar a eficácia a curto prazo da aplicação de PGL-GET no controlo orgânico do oídio em videiras Chardonnay.
Neste ensaio, as videiras (da variedade Chardonnay) foram tratadas com o produto de terpeno PGL-GET ou ficaram sem tratamento (controlo) a 7 de Fevereiro de 2005. Embora suprimido por tratamentos orgânicos prévios, a gravidade do oídio antes do ensaio estava num nível considerado inaceitável em termos comerciais e era equivalente nos 6 talhões de tratamento activo e nos 6 talhões de controlo. A fase da cultura era aproximadamente E-L 33-34 (pré-pintor). A PGL-GET (4 ml/1 (formulação líquida)) foi pulverizada em 6 talhões de Chardonnay, que tinham sido previamente tratados com leite. Seis talhões de Chardonnay serviram como controlo sem tratamento, mas tinham sido previamente tratados com óleo/soro de leite. 0 número de videiras por talhão era tipicamente 7.
Os detalhes da composição da PGL-GET usada neste protocolo são apresentados na Tabela 20.
Tabela 20 - Formulação do lote usado no presente estudo
Informações da matéria-prima da mistura Peso em libras % por peso Geraniol 323,52 6,88 Eugenol 161,76 3,44 Timol 323,52 6,88 Partículas de levedura 722,13 15,35 Xantana 3,17 0,07 Polissorbato 3,17 0,07 Água 3166,62 67,32 TOTAL 4703,89 100,00 A gravidade do oídio foi avaliada 3 dias antes do tratamento com terpeno e novamente 3 dias após o tratamento. Em cada talhão, 20 cachos de uvas foram seleccionados aleatoriamente (10 cachos por face) e a gravidade da doença foi estimada como a área percentual dos cachos coberta com colónias de míldio activas. Não foi possível mais nenhuma avaliação, porque o viticultor pulverizou posteriormente toda a área do ensaio com enxofre e um adjuvante de pulverização com base em óleo vegetal (Synertrol Horti Oil). 65 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ Número/área de plantas a tratar
Produto de teste: PGL-GET (4 ml/1) a aplicar em 6 talhões de Chardonnay (no total de aproximadamente 42 videiras), que tinham sido tratados previamente com leite.
Controlo: não foi aplicado nenhum tratamento a 6 talhões de Chardonnay (total de aproximadamente 42 videiras) a serem usados como controlo, mas tinham sido tratados previamente com óleo/soro de leite. Métodos de cultivo
Videiras de Vitis vinifera (Chardonnay) no talhão B2: condução vertical com canas arqueadas.
Disposição da cultura
Espaçamento: distância de 2,5 m entre fileiras e 1,25 m entre videiras (dentro da fileira), com 3200 videiras por hectare. A orientação das fileiras era de norte para sul.
Densidade do coberto O método ponto-quadrante foi usado para caracterizar a densidade do coberto das videiras Chardonnay antes do ensaio (Tabela 21) . Foram tiradas medidas a 13 de Janeiro de 2005, seleccionando-se secções representativas do coberto com os talhões de Chardonnay que tinham sido tratados previamente com enxofre ou que tinham sido deixados por tratar. Foram feitas dez medições em cada um dos 6 talhões de cada tratamento prévio (ou seja, um total de 60 medições para os talhões tratados com enxofre e 60 medições para os talhões de controlo não tratados). Além disso, foram medidos o comprimento e o número de nós em 3 rebentos verticais (por talhão). 66 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Tabela 21 - Densidade do coberto das videiras Chardonnay antes do ensaio
Tratamento prévio Lacunas (%) Número de camada de folhas (NCF) Folhas interiores (%) Cachos interiores (%) Número médio de nós Comprimento médio de rebentos (cm) Sem tratamento 12 1,5 22 26 21 110 Enxofre 5 2, 0 27 40 21 104 Valores óptimos 20-40% <1,0-1,5 <10% <40% NA NA NA = não aplicável.
Condição geral 0 tratamento prévio destes talhões com materiais experimentais suprimiu o oídio em comparação com o controlo não tratado. No entanto, o nível de oídio foi considerado comercialmente inaceitável, embora equivalente nos talhões tratados com leite e com óleo/soro de leite. Método de aplicação, dose e regime 0 tratamento com PGL-GET (4 ml/1) foi aplicado a 7 de Fevereiro de 2005 com uma pistola manual ligada a um carretel de mangueira e bomba montada num veículo utilitário. O líquido foi pulverizado com uma pressão de bomba de 1500-1600 kPa (200-230 psi), com um débito de aproximadamente 63 ml/segundo. Foi usado o volume padrão de spray para os tratamentos convencionais (aproximadamente 900 1/ha). A gravidade do oídio, estimada como a área (%) dos cachos de uvas cobertos com colónias de oídio activas, foi avaliada em 20 cachos seleccionados aleatoriamente dentro de cada talhão (10 cachos por face) . A gravidade da doença foi avaliada a 4 de Fevereiro de 2005, 3 dias antes da aplicação do tratamento com PGL-GET, e novamente a 10 de Fevereiro de 2005, 3 dias após a aplicação de terpeno.
Os dados foram transformados usando transformação arco-seno para obter a separação das médias. 67 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Resultados
Antes do tratamento, a gravidade média do oidio nos cachos de uvas Chardonnay nos 6 talhões a serem tratados com terpeno (20,4%) era similar à dos 6 talhões de controlo (23,2%; Tabela 22). A análise estatística baseada na transformação arco-seno destes dados revelou que não havia diferença significativa na gravidade da doença antes do tratamento (Tabela 23).
No entanto, três dias depois do tratamento a gravidade
média do oídio era de 23,8% nos cachos tratados com PGL-GET versus 37,8% nos de controlo (Tabela 22) . A transformação arco-seno destes dados revelou uma diferença estatisticamente significativa a favor dos cachos de uvas tratados com terpeno, que tinham uma menor área coberta com colónias de oídio activas (p = 0,058; Tabela 23).
Tabela 22 - Gravidade média do oídio (%) em cachos de Chardonnay antes e depois do tratamento com PGL-GET
Tratamento aplicado a 7 Fev. 2005 Gravidade média A 4 Fev. 2005 A 10 Fev. 2005 PGL-GET 20,4 23,8 Nenhum 23,2 37, 8
Tabela 23 - Separaçao estatística de tratamentos após transformação arco-seno dos dados
Tratamento aplicado a 7 Fev. 2005 Gravidade média (GM) A 4 Fev. 2005 A 10 Fev. 2005 PGL-GET 0,2063 (0,03857) 0,2411 (0,04303) Nenhum 0,2401 (0,08534) 0,3954 (0,07852) t = 0,36 df = 10 p = 0,726 Teste bilateral: diferença não significativa t = 1,72 df = 10 p = 0,058 Teste unilateral: não tratado > tratado
Discussão: A infecção de videiras com oídio pode provocar perdas consideráveis aos viticultores, através de efeitos prejudiciais sobre o crescimento e a resistência da videira, bem como sobre a qualidade do fruto e do vinho. Em vinhas de 68 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ produção orgânica, os viticultores procuram alternativas a tratamentos como o enxofre elementar.
Este estudo investigou a eficácia das formulações de terpeno encapsulado (4 ml/1) numa formulação liquida no controlo do oidio numa vinha orgânica na Tasmânia, Austrália. Embora outros tratamentos experimentais tivessem sido usados há apenas 3 semanas antes da aplicação de terpeno, o nível de infecção por oídio continuava a ser considerado comercialmente inaceitável. Três dias depois do tratamento de videiras de Chardonnay com PGL-GET, a gravidade do oidio nas uvas tratadas era significativamente inferior à verificada nas de controlo não tratadas. A gravidade da infecção no controlo não tratado piorou durante os 6 dias entre as avaliações pré- e pós-tratamento, mas manteve-se estável nas videiras tratadas. Portanto, a PGL-GET parece ter abrandado o ritmo de aumento da doença nos cachos de uvas que tinham colónias de oídio a formar esporos bem estabelecidas antes do tratamento. Presumivelmente, a expansão da colónia foi inibida, embora as colónias existentes continuassem a formar esporo até um determinado grau. Não foi possível uma avaliação da eficácia mais alargada no tempo, porque o viticultor pulverizou seguidamente toda a área do ensaio com enxofre.
Estes resultados encorajadores demonstram a eficácia da PGL-GET no controlo do oídio nas videiras.
Exemplo 20 - Ensaios de campo de composição de terpeno encapsulado sobre a podridão cinzenta A podridão cinzenta das uvas é provocada por Botrytis cinerea, um fungo comum que pode provocar graves perdas de produtividade de frutos. Os bagos são o local predominante de infecção, embora a doença também possa afectar flores e folhas. Inicialmente, os bagos infectados parecem moles e aguados e podem ficar cobertos por um crescimento fúngico cinzento em condições de elevada humidade. Com o tempo, os bagos infectados murcham e caem. A podridão cinzenta prefere condições húmidas com pouca circulação de ar e os bagos rachados ou danificados estão particularmente susceptíveis à propagação da doença. As estratégias de gestão da podridão cinzenta incluem a promoção de uma boa circulação de ar, a 69 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ prevenção dos ferimentos e a aplicaçao de fungicidas em alturas adequadas durante a estação de crescimento. 0 objectivo deste estudo era investigar a eficácia da PGL-GET no tratamento da infecção por podridão cinzenta em uvas. 0 surgimento de podridão cinzenta na vinha Kir-Yianni em meados de Outubro de 2004 (3 semanas após uma aplicação de
Teldor®) não pôde ser tratado com agroquimicos convencionais por causa das restrições de tempo de re-entrada associadas, que impediriam a vindima prevista. Foram, portanto, identificados dois talhões adjacentes de 0,1 ha no local 7 da vinha e, a 12 de Outubro de 2004, um destes talhões foi tratado com 4 ml/1 de formulação liquida de PGL-GET e o outro permaneceu por tratar (ver Fig. 23). A colheita foi feita 3 dias mais tarde e a proporção de bagos infectados foi determinada para cada talhão (peso percentual da produção total). Os bagos não infectados dos talhões tratados e não tratados foram depois misturados no tanque de fermentação. O local 7 tinha sido tratado com vários produtos antes da aplicação da formulação de terpeno, mas continuava a apresentar infecção por podridão cinzenta.
As videiras receberam uma única aplicação de 4 ml/1 de formulação liquida de PGL-GET à taxa de 1200 1/ha.
Foram registadas as seguintes fases de crescimento das uvas: - abrolhamento, 26 de Março de 2004 - floração, 1 de Junho de 2004 - pintor, 6 de Agosto de 2004 - colheita, 15 de Outubro de 2004
As aplicações do estudo tiveram lugar 3 dias antes da colheita. A estação de crescimento vegetativo de 2004 foi excepcionalmente tardia e foi húmida do principio ao fim. A pressão de doença por míldio foi extremamente elevada, a 70 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ pressão de oídio foi moderada e os níveis de podridão cinzenta foram elevados. A PGL-GET foi aplicada neste momento para avaliar a sua potencial eficácia contra uma infecção de podridão cinzenta que não poderia ter sido tratada de outro modo, devido às restrições temporais do uso de pesticidas antes da colheita. A avaliação visual do local antes da aplicação do produto de terpeno revelou evidências de podridão cinzenta. Depois da colheita, os bagos foram dispostos num tapete rolante e os bagos infectados foram manualmente separados dos bagos não infectados antes de serem esmagados. A proporção de bagos infectados foi calculada como percentagem da produção total (por peso) para cada talhão.
Resultados A avaliação visual do local antes da aplicação de PGL-GET revelou evidências de podridão cinzenta. Após a colheita (3 dias depois da aplicação de PGL-GET), as proporções de bagos infectados foram de 13% e 23% nos talhões tratados e não tratados, respectivamente. As áreas testadas não foram suficientes para avaliar o significado estatístico; no entanto, o tratamento com PGL-GET abrandou a progressão da doença. A fermentação não foi afectada pela mistura dos bagos não infectados dos talhões não tratados e tratados com terpeno.
Discussão
Os tratamentos convencionais da podridão cinzenta têm de ser interrompidos 3 semanas antes da colheita, o que deixa tempo para ocorrerem danos consideráveis no rendimento da produção e na qualidade. O desenvolvimento de um tratamento que possa ser usado até à colheita, ou que possa ser continuado até mais perto da colheita do que os produtos existentes, poderia resultar em melhorias significativas no rendimento das culturas e na qualidade do vinho, e seria consideravelmente benéfico para os viticultores. Neste estudo, o tratamento com o produto de terpeno PGL-GET 71 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ diminuiu visivelmente a progressão de uma infecção por podridão cinzenta estabelecida apenas 3 dias antes da colheita, resultando numa menor proporção de bagos infectados no talhão tratado com terpeno do que no talhão não tratado. Além disso, apesar do uso de PGL-GET perto da colheita, a fermentação não foi afectada pela combinação de uvas tratadas e não tratadas.
Estes resultados sugerem que a PGL-GET é eficaz na redução do impacto de infecções por podridão cinzenta estabelecida e pode ser usada perto da colheita sem efeitos prejudiciais na posterior fermentação.
Exemplo 21 - Avaliação de terpenos encapsulados quanto ao tratamento de míldio estabelecido e avaliação subsequente da qualidade das uvas
Foi conduzido um ensaio de PGL-GET a 25/08/04, aplicando a composição à taxa de 1000 g por 250 litros.
Foi pulverizada uma vinha de Cabernet Sauvignon que estava 100% infectada e sofria de substancial perda de folhagem devido ao míldio. As folhas que restavam estavam infectadas com manchas de míldio, evidenciadas pela mancha amarela na parte de cima da folha e o crescimento felpudo na parte de baixo da folha; a indicação clássica do míldio. Muitas das folhas estavam quase totalmente amarelas, indicando uma infecção substancial. Esta perda de folhagem e a infecção em geral atrasam a maturação das uvas e, em muitos casos, as uvas nunca amadurecem totalmente para fins de produção de vinho. A observação da presença de cachos totalmente verdes (ou seja, bagos duros verde-escuros com 1 cm de diâmetro e de forma oval) nas videiras indicava que, provavelmente, as videiras tinham sido infectadas antes do pintor e, provavelmente, na floração ou antes. Não foi usada nenhuma aplicação inicial de cobre (calda bordalesa ou sulfato de cobre básico). Esta vinha estava fortemente infectada na vindima anterior, ao ponto de não ter sido produzida nenhuma colheita de Cabernet Sauvignon. A perda de folhas no ano anterior foi de 100%, apesar do tratamento com bicarbonato de 72 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ potássio, numa tentativa de matar o míldio por contacto, seguido de aplicação de Stilbourin para uma protecção sistémica a longo prazo. A 19/09/04, as uvas tratadas neste ensaio foram colhidas e esmagadas e foram feitas as seguintes observações no mosto (Tabela 24):
Tabela 24
Controlo Tratado Desejável PH 3,28 3,30 3,3-3,5 TA 0, 92 0,85 0,7-0,75 Brix 17, 4 18,7 20-22
Estes resultados indicam que as uvas das videiras tratadas são mais maduras do que as das videiras não tratadas. A observação das uvas em si indicou que as uvas não tratadas eram, em média, de cor mais clara, algumas com uma tonalidade transparente rosada/arroxeada/esverdeada, indicadora de uvas que tinham acabado de passar o pintor, enquanto que as uvas tratadas eram roxas escuro, em média, e opacas, o que é típico de uvas totalmente maduras ou quase totalmente maduras. A prova destas uvas revelou que as uvas tratadas tinham um paladar frutado mais rico, típico de uvas Cabernet Sauvignon maduras, enquanto que as uvas não tratadas não tinham o paladar totalmente frutado. As uvas não tratadas tinham um sabor amargo a maçãs verdes, indicando um provável rácio de ácido málico/tartárico inadequado para a produção de um bom vinho.
Estas uvas foram esmagadas e desengaçadas, como preparação para a produção de um vinho a partir destas uvas, para demonstrar a diferença destas uvas e para demonstrar que as uvas tratadas eram adequadas para a produção de vinho. O viticultor temia que este tratamento afectasse o sabor do vinho, embora, seguindo a nossa sugestão, tenha provado uvas tratadas no dia seguinte à aplicação de PGL-GET e não tenha detectado nenhum sabor ou aroma persistente. A diferença entre as uvas tratadas e não tratadas é demonstrada ainda na cor do mosto. O sumo das uvas não 73 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ tratadas era esverdeado claro/descolorido (quase como o mosto de um vinho branco), enquanto que o mosto das uvas tratadas tinha uma cor rosada típica de uvas Cabernet Sauvignon maduras imediatamente após o esmagamento. Estes resultados indicam que a PGL-GET é eficaz no tratamento de vinhas no final do Verão, matando o míldio e impedindo a re-infecção, pelo menos a curto prazo.
Seria útil mais investigação sobre a eficácia a longo prazo da PGL-GET para controlar o míldio, mas os resultados apresentados mostram que a PGL-GET é um tratamento útil. 0 míldio de aparecimento tardio pode arruinar completamente uma cultura e, actualmente, não há tratamentos eficazes que possam ser aplicados pouco antes da vindima e que mantenham a sua capacidade de oferecer protecção. 0 grande poder da PGL-GET é a capacidade de oferecer uma aniquilação rápida e manter esta eficácia ao longo de um período de tempo mais prolongado do que outros fungicidas por contacto. Há uma série de antifúngicos neste mercado que têm funcionado comprovadamente contra o míldio, mas precisam todos de algum tempo depois da aplicação antes de se poder fazer a colheita. Alguns tratamentos (como os produtos que contêm enxofre) não podem ser usados se a temperatura subir acima dos 85°F. A fitotoxicidade dos fungicidas que contêm cobre também é significativa, dependendo da variedade da uva. Os fungicidas de contacto não têm um efeito a longo prazo, pelo que é frequentemente necessária a aplicação de um fungicida de acção mais prolongada, mas esta pode ser limitada pelos regulamentos relevantes (por exemplo, Intervalo Pré-Colheita (IPC) ou Intervalo de Entrada Restringida (IER)).
Muitos tratamentos convencionais contra o míldio têm uma entrada restringida (IER e/ou IPC), o que significa que o viticultor não pode aplicar o tratamento, com receio de aplicar algo como Mancozeb, que tem um IPC de 66 dias; o viticultor ficaria, então, impossibilitado de colher as suas uvas no pico da maturação. 74 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ Ο míldio está implicado como causa primária dos muitos vinhos fracos a serem produzidos a leste do Mississippi. A PGL-GET poderia permitir às uvas afectadas amadurecerem adequadamente e serem apanhadas no pico da maturação nesta indústria em rápido crescimento.
Vantajosamente, a PGL-GET deverá ser elegível para aprovação pelos vários comités "orgânicos" (muitos autonomeados) , pois este produto é adequado para uso em uvas cultivas ao abrigo de normas "orgânicas". Isto abre outro nicho num segmento de mercado em rápido crescimento nos EUA e a nível mundial.
Exemplo 22 - Avaliação in vitro das propriedades fungicidas de terpenos encapsulados e não encapsulados (apenas a formulação 16 em forma encapsulada pertence ao invento)
Foram conduzidos mais testes para avaliar as 31 preparações de terpeno não encapsulado descritas no Exemplo 15 e preparações 16 e 22 encapsuladas em partículas de glucano.
Para realizar estes ensaios, foram colocados 20000 esporos em caldo de dextrose de batata (PDB - "Potato Dextrose Broth") de potência 1/3 e foram adicionadas quantidades suficientes de formulações seleccionadas de terpeno, para dar concentrações que variaram entre 10 e 1000 ppm. Estes materiais de teste foram colocados em diferentes tubos de Eppendorf esterilizados com esporos de Botrytis cinerea (B.c.), incubados durante 24 horas, e os esporos foram depois recuperados por centrifugação, tendo as soluções de terpeno sido rejeitadas. Os esporos/biomassa foram lavados com água estéril, centrifugados novamente e, depois, novamente retomados em 300 μΐ do PDB de potência 1/3 e transferidos para placas de 96 poços. A densidade óptica dos esporos sobreviventes que evoluíram para micélios foi medida ao longo do tempo. A actividade fungicida é definida como a aniquilação total dos 20000 esporos após 24 horas de exposição ao terpeno, evidenciada pela ausência de crescimento de micélios.
Os resultados sugerem que certas formulações não foram fungicidas a um nível estatisticamente significativo sob as 75 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ presentes condiçoes de teste (resultados nao apresentados). Estas foram: 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30. Consultar Exemplo 15 (Tabela 17) para informações sobre as composições. A concentração inibitória mínima dos compostos mais eficazes é apresentada na Tabela 26.
Tabela 25
Material Concentração inibitória mínima (ppm) Material Concentração inibitória mínima (ppm) 3 <1000; >750 7 <1000; >750 10 <1000; >500* 13 <1000; >750 16 <1000; >750 22 <750; >500 26 <1000; >750 31 <1000; >750 * Em diferentes testes, a concentração mais baixa que deu ausência de crescimento foi 500 ou 750 ppm.
Teste comparativo de compostos em água e encapsulados em partículas ocas de glucano
Foram preparadas amostras de formulações 16 (geraniol, eugenol e timol) e 22 (eugenol, timol e citral) encapsuladas em partículas ocas de glucano de acordo com técnicas anteriormente descritas. As propriedades fungicidas foram então avaliadas para as formulações encapsuladas e não encapsuladas, usando o protocolo anteriormente descrito para as formulações não encapsuladas.
Os resultados foram bastante diferentes com as formulações de terpeno encapsulado em comparação com os terpenos suspensos em água, como ilustra a Fig. 24. A concentração eficaz mínima é apresentada abaixo, na Tabela 26.
Tabela 26
Material CIM em suspensão CIM em partículas de levedura 16 <1000, >750 <100, >250 22 <750, >500 <500, >250 76 ΕΡ 2 338 332/ΡΤ
Assim, os resultados com os materiais 16 e 22 são bastante diferentes quando numa suspensão aquosa e quando testados encapsulados em partículas de glucano. (Nota: como mencionado adiante, houve alguma variabilidade nos resultados com os terpenos suspensos em água; a experiência acima mencionada é um exemplo disso.) Os valores de CIM são compostos a partir de vários ensaios. É importante notar que os resultados com formulações de terpeno encapsulado não sofrem dos problemas de variabilidade associados às suspensões de terpeno aquosas. Houve cinco testes diferentes de terpenos suspensos em água e três com as PL.
As formulações de terpeno encapsuladas são prontamente miscíveis na água e oferecem uma formulação de libertação lenta de terpeno no meio aquoso. Isto resulta num tempo de exposição mais alargado dos esporos aos terpenos.
Foram encontrados problemas na monitorização das formulações de terpeno não encapsulado em suspensão nos meios de teste, problemas que podem afectar os resultados a este respeito. 0 presente pedido é um pedido divisionário baseado num pedido de patente europeia anterior, N° 05744354.1, o qual por seu vez derivou do pedido PCT WO 2005/113128 AI.
Lisboa, 2014-05-07

Claims (15)

  1. ΕΡ 2 338 332/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Composição que compreende uma partícula oca de glucano ou partícula oca de parede celular que encapsula um componente de terpeno, em que o componente de terpeno compreende uma mistura de geraniol, timol e eugenol.
  2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a partícula oca de glucano ou partícula oca de parede celular é uma parede celular fúngica.
  3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o teor lipídico da partícula oca de glucano ou partícula de parede celular é de 5% p/p ou superior.
  4. 4. Composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que o componente de terpeno está associado com um tensioactivo.
  5. 5. Composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, que compreende de 10 a 67% p/p de terpenos, de 0,1 a 10% p/p de tensioactivo e de 40 a 90% p/p de partículas ocas de glucano ou partículas ocas de parede celular.
  6. 6. Composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, que compreende um agente antimicrobiano, um agente antifúngico, um agente insecticida, um agente anti-inflamatório ou um anestésico.
  7. 7. Composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, sob a forma de um pó seco, pelete, comprimido ou outra forma sólida.
  8. 8. Composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, que compreende um agente de dispersão que promove a dispersão da composição quando colocada num líquido.
  9. 9. Composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, que compreende um portador ou excipiente aceitável nos domínios agrícola, alimentar ou farmacêutico numa forma líquida, sólida ou de tipo gel. ΕΡ 2 338 332/ΡΤ 2/2
  10. 10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, suspensa ou dissolvida num liquido.
  11. 11. Método de preparação de uma partícula oca de glucano ou partícula oca de parede celular que encapsula um componente de terpeno, em que o referido método compreende os passos de: a) proporcionar um componente de terpeno que compreende geraniol, eugenol e timol; b) proporcionar uma partícula oca de glucano ou partícula oca de parede celular; c) incubar o componente de terpeno com a partícula de glucano ou partícula oca de parede celular à pressão atmosférica a uma temperatura de 20 a 37°C; e d) recuperar a partícula de glucano ou partícula oca de parede celular que encapsula o componente de terpeno.
  12. 12. Método não terapêutico para matar um microorganismo, em que o referido método compreende o passo de • colocar o referido microorganismo em contacto com uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
  13. 13. Método para tratar ou prevenir a infecção de uma planta, em que o referido método compreende o passo de: • administrar, numa dose terapeuticamente eficaz, uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, na planta ou no solo na proximidade da planta.
  14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a infecção da planta é causada por um nemátodo ou um fungo.
  15. 15. Utilização de uma composição que compreende uma partícula oca de glucano ou partícula de parede celular que encapsula um componente de terpeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, no fabrico de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma infecção causada por um microorganismo. Lisboa, 2014-05-07
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