BRPI0511441B1 - Composições contendo uma partícula de glucano oca ou partícula de parede celular encapsulando um componente de terpeno, métodos de fabricação e uso das mesmas - Google Patents

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Abstract

composições contendo uma partícula de glucano oca ou partícula de parede celular encapsulando um componente de terpeno, métodos de fabricação e uso das mesmas a presente invenção se refere às composições compreendendo uma partícula de glucano oca ou partícula da parede celular encapsulando um componente de terpeno, métodos para sua fabricação e uso.as composições são apropriadas para prevenir e tratar infecções em plantas e em animais, incluindo os seres humanos.

Description

t COMPOSIÇÕES CONTENDO UMA PARTÍCULA DE GLUCANO OCA OU ‘ PARTÍCULA DE PAREDE CELULAR ENCAPSULANDO UM COMPONENTE DE “ » TERPENO, MÉTODOS DE FABRICAÇÃO E USO DAS MESMAS
A presente invenção se refere às composições 5 compreendendo terpenos e partículas de glucano ocas ou partículas da parede celular e métodos para preparação de tais composições. As composições aumentam a estabilidade e atividade e fornecem um veículo apropriado para os terpenos. A invenção também se refere aos métodos de uso de tais composições nos campos médico, veterinário e agrícola.
Os terpenos são compostos químicos que estão dispersos na natureza, principalmente nas plantas como constituintes dos óleos essenciais. Seu bloco de construção é o hidrocarboneto isopreno (C5H8)n. Exemplos de terpenos incluem citral, pineno, nerol, b-ionona, geraniol, carvacrol, eugenol, carvona, terpeniol, anetol, cânfora, mentol, limoneno, nerolidol, farnesol, fitol, caroteno(vitamina AJ , esqualeno, timol, tocotrienol, álcool perilílico, borneol, mirceno, s imeno, careno, terpenona, e linalol.
Os terpenos são classificados como reconhecidos de modo geral como seguros (GRAS) e vêm sendo usados por muitos anos nas indústrias de aromatizantes. O LD50 do citral em ratos é de aproximadamente 5 g/kg, o que é uma indicação adicional da relativa segurança desses compostos. Adicionalmente, os terpenos possuem um intervalo de vida relativamente curto de cerca de 28 dias quando expostos ao oxigênio (por exemplo, ar). Os terpenos serão decompostos em CO2 e água. Essa decomposição ou rompimento dos terpenos demonstra a segurança e não agressão ambiental das
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composições e métodos da invenção.
Foi verificado que os terpenos inibem o crescimento de células cancerígenas, diminuem o tamanho do tumor, diminuem os níveis de colesterol e possuem um efeito biocida nos microorganismos in vitro. Owawunmi, (Letters in Applied Microbiology, 1993, 9{3): 105-108), mostraram que os meios de crescimento com mais de 0,01% de citral reduziram a concentração de E.coli e em 0,08% houve um efeito bactericida. A Patente US número 5.673.468 descreve uma formulação de terpeno, com base em óleo de pinho, usado como um desinfetante ou limpador anti-séptico. A Patente US número 5.849.956 ensina que um terpeno encontrado no arroz possui atividade antifungos. A Patente US número 5.939.050 descreve um produto antimicrobiano para higiene oral com uma combinação de 2 ou 3 terpenos que mostrou efeito sinergístico. Várias Patentes US (Patentes US números 5.547.677, 5.549.901, 5.618.840, 5.629.021, 5.662.957,
5.700.679, 5.730.989) ensinam que determinados tipos de emulsões de óle*o-em-água antimicrobianas, adjuvantes e verificado que os terpenos são agentes antitumor não tóxicos a dieta e eficazes, que atuam através de vários mecanismos de ação (Crowell e outros Crit. Rev. Oncog., 1994, 5 (1): 1-22; Crowell e outros Adv. Exp. Med. Biol. ,
1996, 401:131-136). Os terpenos geraniol, tocotrienol, álcool perilílico, bionona, e d- limoneno, suprimem a atividade da HMG-coA reductase hepática, uma etapa de limitação de ração na síntese do colesterol e diminuem modestamente os níveis de colesterol em animais (Elson e outros, J. Mutr., 1994, 124: 607-614). D-limoneno e possuem propriedades de distribuição. Foi
3/96 geraniol reduziram tumores mamários (Elegbede e outros Carcinogenesis, 1984, 5(5): 661-664; Elegbede e outros, J.
Natl. Câncer Inst., 1986, 6(2): 323-325; Karlson e outros
Anticancer Drugs, 1996, 7(4): 422-429) e suprimiram o crescimento de tumores transplantados (Yu e outros, J. Agri. Food Chem., 1995, 43: 2144-2147).
Foi verificado que os terpenos inibem o crescimento in vitro de bactérias e fungos (Chaumont e outros), Ann. Pharm. Fr., 1992, 50(3): 156-166; Moleyar e outros, Int. J. Food Microbiol, 1992,16(4): 337-342; e Pattnaik e outros
Microbios, 1997,89(358): 39-46) e alguns parasitas internos e externos (Hooser e outros, J. Am. Vet. Med. Assoe., 1986, 189(8): 905-908). Foi verificado que o geraniol inibe o crescimento das cepas de Candida albicans e Saccharomyces cerevisiae por melhora da razão de perda de potássio e interrupção da fluidez da membrana (Bard e outros, Lipids, 1998, 23- (6): 534-538). B-ionona possui atividade antifungos que foi determinada por inibição da germinação do esporo e inibição do crescimento em ágar (Mikhlin e outros, A. Prikl. Biokhim. Mikrobiol, 1983, 19:795-803;
Salt e outros, Adam. Physiol. Molec. Plant Path, 1986, 28: 287-297). Teprenona (geranilgeranilacetona) possui um efeito antibacteriano em fí. pylori (Ishii, Int. J. Med. Microbiol. Virol. Parasitol. Infect. Dis., 1993, 280(1-2): 239-243). Rosanol, um produto comercial com óleo de rosas a 1%, mostrou inibir o crescimento de várias bactérias (Pseudomonas, Staphylococus, E. coli, e H. pylori) . Geraniol é o componente ativo (75%) do óleo de rosas. O óleo de rosas e o geraniol a uma concentração de 2 mg/L inibiram o crescimento in vitro de H. pylori. Alguns
4/96 extratos de ervas medicinais têm mostrado um efeito inibidor em H. pylori, os mais eficazes sendo o angelato de decursinol, decursina, magnolol, berberina, ácido cinâmico, decursinol, e ácido gálico (Bae e outros, Biol. Pharm. Bull., 1998, 21 (9) 990992) . Extratos de caju, ácido anacárdico, e (E)-2-hexenal mostram efeito bactericida contra H. pylori.
Diterpenos, isto é, tricorabdal A (de J?. Trichocarpa) , mostraram um efeito antibacteriano muito forte contra H. pylori (Kadota e outros, Zentralbl. Bakteriol, 1997,287(1); 63-67).
As soluções de 11 terpenos diferentes foram eficazes na inibição do crescimento das bactérias patogênicas em testes in vitro; os níveis variando entre 100 ppm e 1.000 ppm foram eficazes. Os terpenos foram diluídos em água com 1% de polissorbato 20 (Kim e outros, J. Agric. Food Chem., 1995, 43: 2839-2845).
Existem muitos modos diferentes de ação dos terpenos contra os microorganismos; eles poderiam (1) interferir com a camada de fosfolipídeo da membrana celular, (2) prejudicar uma variedade de sistemas de enzima (HMG-reductase) , e (3) destruir ou inativar material genético. Acredita-se · que, devido aos modos de ação dos terpenos serem tão básicos, por exemplo, bloqueio do colesterol, os agentes infecciosos não seriam capazes de constituir uma resistência aos terpenos.
Existem, contudo, várias desvantagens ao uso dos terpenos. Elas incluem:
- os terpenos são líquidos que podem ser difíceis de serem manuseados e inadequados para determinados fins.
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- os terpenos não são muito miscíveis em água e geralmente requerem o uso de detergentes, agentes tensoativos ou outros emulsionantes para preparar emulsões aquosas. Uma solução estável pode, contudo, ser obtida por mistura dos terpenos com cisalhamento alto.
- as formulações de terpeno em pó seco geralmente contêm, apenas, uma baixa porcentagem peso/peso de terpenos.
- os terpenos são propensos à oxidação em sistemas de emulsão aquosa, o que torna o armazenamento de longo prazo um problema.
Existem limitações às técnicas atuais de revestimento por . aspersão, extrusão, acúmulo, encapsulamento molecular e liofilização por aspersão para provisão de sistemas de distribuição do ingrediente.
As paredes celulares da levedura de padeiro são derivadas de células de levedura de padeiro e são compostas de biopolímeros insolúveis β-l,3-glucano, β-l,6-glucano, manano e quitina. Elas são tipicamente microesferas tipicamente de 2-4 micra de diâmetro com uma parede de revestimento que possui apenas 0,2-0,3 mícron de espessura circundando uma cavidade aberta. Esse material possui capacidade considerável de manter líquidos, tipicamente absorvendo 5-25 vezes seu peso em líquido. O revestimento é suficientemente poroso de modo que cargas úteis de até 150.000 Dalton de tamanho podem passar através do revestimento externo e serem absorvidas na cavidade oca da partícula esférica. As paredes celulares da levedura de padeiro possuem várias propriedades únicas, incluindo estabilidade térmica (por exemplo, a 121°C), estabilidade
6/96 de cisalhamento, estabilidade de pH (por exemplo, pH de 212) e em altas concentrações, elas não formam viscosidade significativa. Além de suas propriedades físicas, essa composição contém fibras dietéticas naturais e saudáveis que liberam benefícios cardiovasculares e imunopotencializam a saúde.
Paredes celulares de levedura são preparadas de células de levedura, por extração e purificação da fração em partículas insolúvel dos componentes solúveis da célula de levedura. As paredes celulares de fungos podem ser produzidas de subproduto insolúvel da fabricação de extrato de levedura. Adicionalmente, as células de levedura podem ser tratadas com uma solução aquosa de hidróxido, sem interrupção das paredes celulares de levedura, que digerem a proteína e a porção intracelular da célula, deixando o componente da parede celular da levedura isento de significativa contaminação da proteína e possuindo estrutura de parede celular substancialmente inalterada de glucanos ligados β(1-β) e β(1-3). Uma descrição mais detalhada das partículas de glucano totais e do processo de preparação das mesmas é fornecida por Jamas e outros na Patente' US número 4.810.646 e nos pedidos de patente copendentes Número de Série US 166.929, Número de Série US 297.752 e Número de Série US 297.982. A Patente US número 6.242.594, cedida à Novogen Research Pty Ltd., descreve um método de preparação de partículas de glucano de levedura por extração com álcali, extração com ácido e então extração com um solvente orgânico e finalmente secagem. A US 5.401.727, cedida à AS Biotech-Mackzymal, revela os métodos de obtenção de partículas de glucano de levedura e
7/96 métodos de uso das mesmas para promover resistência em animais aquáticos e como um adjuvante para vacinações. A Patente US número 5.607.677 cedida à Alpha-Beta Technology Inc., revela o uso de partículas de glucano ocas integrais como um pacote de distribuição e adjuvante para a distribuição de uma variedade de agentes farmacêuticos. Os ensinamentos das patentes e pedidos mencionados acima são incorporados aqui como referência.
Outros tipos de células de levedura e fungos possuem paredes celulares que não contêm glucano. As paredes celulares de tais leveduras e fungos podem ser isoladas por técnicas semelhantes àquelas mencionadas acima para obter partículas de parede celular.
Adicionalmente, as paredes de muitas plantas, algas, bactérias e outros microorganismos também compreendem uma parede celular. A estrutura e composição da parede celular variam entre os microorganismos, porém em geral são uma estrutura robusta e relativamenté inerte. É possível obter partículas de parede celular derivadas de tais células através de técnicas convencionais, tais como aquelas mencionadas acima com relação à levedura.
Nós verificamos agora que os terpenos podem ser absorvidos e encapsulados estavelmente dentro das partículas de glucano ocas ou partículas de parede celular. O encapsulamento dos terpenos em tais partículas pode ser obtido por incubação das partículas com o terpeno.
De acordo com a presente invenção, é provida uma composição compreendendo uma partícula de glucano oca ou uma partículas de parede celular encapsulamento um componente terpeno.
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Go
O termo partícula de glucano oca conforme usado aqui inclui qualquer partícula oca compreendendo glucano como um componente estrutural. Assim, especificamente, o termo inclui paredes celulares de levedura (nas formas purificada ou bruta) ou partículas de glucano ocas integrais. O termo partícula de parede celular se refere à partícula compreendendo a parede de uma célula (em uma forma purificada ou bruta) , onde o glucano não é um componente estrutural. Partículas apropriadas incluem as paredes celulares das células de plantas, algas, fungos ou bactérias. As partículas da parede celular geralmente retêm a forma da célula da qual elas se derivaram e assim, como uma partícula de glucano oca, fornecem uma cavidade central oca apropriada para encapsulamento do componente terpeno.
Para a presente invenção, é necessário que a partícula de glucano oca ou partícula de parede celular seja capaz de encapsular estavelmente o componente terpeno. Em geral, isso significa que a partícula de glucano oca ou partícula de parede celular deva ser capaz de manter sua estrutura durante a incubação do componente terpeno (de modo geral o componente terpeno está em uma concentração relativamente alta) , e aquele componente terpeno deve ser capaz de migrar para a partículas. As partículas de glucano ocas e partículas de parede celular são, de modo geral, formadas de materiais relativamente inertes e são porosas e assim presume-se que, em geral, as partículas de glucano ocas e partículas de parede celular sejam capazes de encapsular um componente terpeno.
As composições de acordo com a presente invenção
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são eficazes contra vários agentes infecciosos incluindo bactérias, vírus, micoplasmas, fungos e/ou nematóides.
As composições de acordo com a presente invenção fornecem as vantagens que se seguem:
- maximizar a carga útil de terpeno;
- minimizar a carga útil não encapsulada;
- controlar a estabilidade da carga útil;
- controlar a cinética de liberação da carga útil;
- criar uma forma sólida de um terpeno líquido para aumentar a massa e uniformidade;
- simplificar o manuseio e aplicação dos terpenos;
e
- mascarar o cheiro e gosto do terpeno.
Partículas de glucano ocas ou partículas de parede celular especificamente apropriadas são paredes celulares de fungos, preferivelmente paredes celulares de levedura. Paredes celulares de levedura são preparações de células de levedura que mantêm a estrutura tridimensional da célula de levedura da qual derivam. Assim, elas possuem uma estrutura oca que permite que o componente terpeno seja encapsulado dentro das paredes celulares de levedura. As paredes da levedura podem ser apropriadamente derivadas de células de levedura de padeiro (disponíveis na Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO). As partículas de parede celular de levedura com propriedades desejáveis podem também ser obtidas da Biorigin (São Paulo, Brasil) sob a marca registrada Nutricell MOS 55. Essas partículas são um extrato seco em forma de aspersão de S. cerevisiae.
Partículas alternativas são também conhecidas pelas marcas registradas SAF-Mannan (SAF Agri, Minneapolis, MN) e &L
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Nutrex (Sensient Technologies, Milwaukee, WX) . Essas são partículas de glucano ocas que são a corrente residual insolúvel dos processos de fabricação do extrato de levedura. Durante a produção dos extratos de levedura, os componentes solúveis de células de levedura parcialmente autolizadas são removidas e o resíduo insolúvel é um material apropriado para carregamento de terpeno. Essas partículas de glucano ocas compreendem cerca de 25-35% beta 1,3-glucano peso/peso. Um atributo chave desses materiais é que eles contêm mais de 10% de lipídeo peso/peso e são muito eficazes na absorção dos terpenos. Além disso, como um produto de corrente residual eles são uma fonte relativamente barata de partículas de glucano ocas.
Partículas de glucano ocas, alternativas, que possuem pureza alta são aquelas produzidas pela Nutricepts (Nutricepts Inc., Burnsville, MN) e ASA. Biotech. Essas partículas foram extraídas em álcali, o que remove os componentes intracelulares adicionais, bem como remove a camada de nanoproteína da parede celular, rendendo uma partícula de glucano 50-56% em peso/peso.
Partículas de glucano ocas de pureza superior são as partículas WGP da Biopolymer Engineering. Essas partículas extraídas em ácido o que remove os componentes de levedura adicionais rendendo um produto 75-85% de glucano peso/peso.
Partículas de glucano ocas de pureza muito alta são Adjuvax™ da Alpha-beta Technology, Inc. (Worcester, MA) e glucano microparticulado da Novogen (Stamford, CT) . Essas partículas são extraídas com solvente orgânico, o que remove os lipídeos residuais e assim, as partículas
11/96
compreendem mais de 90% em peso de glucano peso/peso.
Em algumas concretizações, partícula de glucano ou partícula de parede celular de alta pureza podem ser necessárias, por exemplo, onde o controle restrito de possíveis contaminantes é necessário. Nesses exemplos, as partículas de pureza superior seriam preferidas em relação aos produtos menos puros. Para outras concretizações, as partículas menos puras seriam preferidas por razões econômicas; também tendo sido verificado que as partículas são mais eficazes na absorção de terpenos.
Preferivelmente, a partícula de glucano oca ou partícula de parede celular possui um teor de lipídeos leve, tal como, 1 ou 2% peso/peso de lipídeo. O teor de lipídeo leve pode aumentar a capacidade da partícula de encapsular o componente terpeno. Preferivelmente, o teor de lipídeo da partícula de glucano oca ou partícula de parede celular é de 5% peso/peso ou superior, mais preferivelmente 10% peso/peso ou superior.
Opcionalmente o componente terpeno da presente invenção pode estar associado com um agente tensoativo. O agente tensoativo pode ser não iônico, catiônico ou aniônico. Exemplos de agentes tensoativos apropriados incluem lauril sulfato de sódio, polissorbato 20, polissorbato 8 0, polissorbato 4 0, polissorbato 60, éster poliglicerílico, monooleato de poliglicerila, monocaprilato de decaglicerila, dicaprilato de propileno glicol, monoestearato de triglicerol, polioxietilenossorbitano, monooleato, Tween®, Span® 20, Span® 40, Span® 60, Span® 80, Brig 30 ou misturas dos mesmos. 0 agente tensoativo atua mantendo o componente terpeno em uma emulsão e também ajuda
12/96 no encapsulamento do componente terpeno na partícula de glucano oca ou partícula de parede celular.
O componente *terpeno da presente invenção pode compreender um terpeno simples ou mistura de terpenos. Misturas de terpenos podem resultar em efeitos sinergísticos.
termo terpeno conforme usado aqui, se refere não apenas aos terpenos da fórmula (C5H8)n, porém também engloba derivados de terpeno, tais como, aldeídos de terpeno ou polímeros de terpeno. Terpenos naturais e sintéticos estão incluídos, por exemplo, monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos e tetraterpenos. Além disso, referência ao nome simples de um composto englobará os vários isômeros daquele composto. Por exemplo, o termo citral inclui o isômero cis citral-a {ou geranial) e o isômero trans citral-b (ou neral).
Deve ser observado que os terpenos são também conhecidos pelos nomes do extrato ou óleo essencial que contêm os mesmos, por exemplo, óleo de capim limão (contém citral).
Os terpenos que estão livres das regulamentações US e que são listados na regulamentação EPA 40 C.F.R. Parte 152 (incorporada aqui como referência em sua totalidade) são apropriados para uso nessa invenção.
Terpenos especificamente apropriados para uso na presente invenção incluem aqueles selecionados do grupo consistindo em citral, pineno, nerol, b-ionona, geraniol, carvacrol, eugenol, carvona terpeniol, anetol, cânfora, nerolidol, farnesol, fitol, (por exemplo L-carvona), mentol, timol, limoneno, caroteno(vitamina AJ , <25
13/96 esqualeno, timol, tocotrienol, álcool perilílico, borneol, mirceno, simeno, careno, terpenona, linalol e misturas dos mesmos.
Preferivelmente os terpenos usados na presente invenção possuem a estrutura geral Ci0Hi6 como esse subgrupo é, de modo geral, mais eficaz contra agentes infecciosos.
Mais preferivelmente o componente terpeno compreende um terpeno selecionado do grupo consistindo em geraniol, timol, citral, carvona (por exemplo L-carvona), eugenol e b-ionona.
O componente terpeno pode compreender apropriadamente timol, como esse terpeno foi mostrado como sendo especificamente eficaz no tratamento ou prevenção de infecções de plantas por fungos.
Outro terpeno especificamente apropriado é citral, que demonstrou eficácia específica contra vários microorganismos.
Uma combinação de geraniol, timol e eugenol demonstrou eficácia específica no combate das infecções das plantas e é assim um componente terpeno especificamente apropriado.
Outras formulações de terpeno que mostraram eficácia superior no tratamento das infecções de plantas incluem (porcentagens em peso/peso):
100% timol;
50% geraniol e 50% timol;
50% eugenol e 50% timol;
33% geraniol, 33% eugenol e 33% timol;
33% eugenol, 33% timol e 33% citral;
25% geraniol, 25% eugenol, 25% timol e
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OG
25% cítral;
20% geraniol, 20% eugenol, 20% citral, 20% tímol e 20% L-carvona.
Consequentemente, um componente terpeno compreendendo qualquer uma das formulações acima é especificamente apropriado para uso na presente invenção.
Em uma concretização o componente terpeno inclui um ou mais terpenos que contêm oxigênio. Citral, por exemplo citral 95, é um terpeno Ci0Ci6 oxigenado, Ci0Hi6O número CAS 5392-40-5 {3,7-dimetil-2,6-octadien-l-al). Uma suspensão estável de citral pode ser formada até cerca de 2.500 ppm. O citral pode ser constituído em uma solução em até cerca de 500 ppm. Uma suspensão estável de partículas de glucano ocas incorporando citral de 50 ppm pode ser formada.
A composição da invenção pode compreender 1 a 99% em volume de terpenos, 0 a 99% em volume de agente tensoativo e 1 a 99% partículas de glucano ocas ou partículas de parede celular. Mais especificamente a composição pode compreender cerca de 10% a cerca de 67% peso/peso de terpenos, cerca de 0,1-10% de agente tensoativo e cerca de 40-90% partículas de glucano ocas ou partículas de parede celular.
Apropriadamente a composição da presente invenção compreende cerca de 500 a cerca de 10.000 ppm de partículas de glucano ocas ou partículas de parede celular, ondas partículas contêm cerca de 1 a cerca de 67% de componente terpeno. Preferivelmente a composição compreende cerca de 1.000 a cerca de 2.000 ppm de partículas de glucano ocas ou partículas de parede celular, ondas partículas contêm cerca de 10 a cerca de 50% dê componente terpeno.
&7
15/96
Composições específicas podem incluir, por exemplo, para bactérias e fungos, partículas de glucano ocas ou partículas de parede celular encapsulando terpenos em agua ou salmoura padrão a 0,9% com até 67% de L-carvona, até 67% de eugenol, até 67% de citral, até 67% de timol e Lcarvona, até 67% de geraniol, ou até 67% de citral e Lcarvona e eugenol, e 1% Tween® 80; para humos, partículas de glucano ocas ou partículas de parede celular encapsulando terpenos em água ou salmoura padrão a 0,9% com até 67% de citral e 1% Tween® 80; ou para micoplasma, partículas de glucano ocas ou partículas de parede celular encapsulando terpenos em água ou salmoura padrão a 0,9% com até 67% de citral, até 67% de L-carvona e eugenol, até 67% de eugenol, até 67% de geraniol, ou até 67% de geraniol, timol, e 1% Tween® 80.
Concentrações de partículas de glucano ocas ou partículas de parede celular encapsulando terpenos de 1, 5,
10, 20, 30, 40, 50 , 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 130,
140, 150 , 160, 175, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350,
375, 400 , 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650,
675, 700 , 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950,
975, 1. 000, 1.100, 1.250, 1.375 , i. 425, 1.500, 1, .600,
1.750, ou 2.000 ppm podem ser usadas como concentrações eficazes nas composições e métodos da presente invenção. Concentrações mesmo maiores (até 25 ppm, isto é, partes por milhão) podem ser obtidas e podem ser úteis na presente invenção.
A composição da presente invenção pode compreender entre cerca de 1 ppm e cerca de 25 ppm (25.000 ppm) do componente terpeno, preferivelmente 100 a 2.000 ppm do
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componente terpeno, por exemplo, 250, 500, 1.000, 2.000 ppm do mesmo.
Os terpenos, agentes tensoativos, e outros componentes da invenção podem ser prontamente adquiridos ou sintetizados usando técnicas de modo geral conhecidas dos químicos de formulações sintéticas.
É altamente preferido que os terpenos usados na presente invenção, por questões de segurança e regulamentares, sejam terpenos de classificação pelo menos alimentícia (conforme, definido pelo FDA USA ou agência reguladora nacional equivalente fora dos Estados Unidos).
Opcionalmente, a composição pode compreender outros componentes ativos de classificação alimentícia, por exemplo, outros agentes antimicrobianos, enzimas ou semelhantes.
Opcionalmente a composição pode compreender agentes ativos adicionais, por exemplo, um agente antimicrobiano, um agente antifungos, um agente inseticida, um agente antiinflamatório, um anestésico ou semelhante. Agentes apropriados incluem:
Antifungos: hidrolases de parede celular (presumindo-se que ela*s não degradem a partícula de glucano oca ou partícula de parede celular), inibidores de síntese de parede celular, antifungos padrão.
Antibacterianos: Anti-sépticos, hidrolases de parede celular, inibidores sintéticos, antibióticos.
- Inseticidas: inseticidas naturais, quitinase.
A composição pode compreender um antioxidante para reduzir a oxidação do terpeno. Um exemplo de tal antioxidante pode ser óleo de alecrim, vitamina C ou
17/96 vitamina Ε.
A composição da presente invenção pode estar na forma de um pó seco. A composição pode ser provida em combinação com um veículo agrícola, alimentício ou farmaceuticamente apropriado ou excipiente em uma forma líquida, sólida ou semelhante a gel.
Para composições sólidas, veículos apropriados incluem classificações farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio e semelhantes. Apropriadamente, a solução está na forma de comprimido ou microesfera. Materiais alimentícios humano e de animais também podem ser um veículo apropriado. Adicionalmente, veículos agrícolas convencionais também seriam usados.
Uma microesfera, comprimido ou outra forma da composição pode também conter, preferivelmente, um agente de dispersão que promove a dispersão da composição quando colocado em um líquido, por exemplo, água. Agentes dispersantes apropriados incluem goma xantana, maltodextrina, alginatos ou semelhantes.
Composições líquidas podem ser preparadas, por exemplo, por dispersão de uma composição em água, salmoura, dextrose aquosa, glicerol, etanol ou semelhante para formar uma solução ou suspensão. Caso desejado, essas composições podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como, agentes umectantes ou emulsionantes, agentes de tamponamento de pH (por exemplo, acetato de sódio, monolaurato de sorbitano, acetato de trietanolamina sódio ou oleato de trietanolamina). Os métodos de preparação de
18/96 tais composições líquidas são conhecidos ou ficarão claros aos versados na arte; por exemplo, vide Remington: The Science e Practice of Pharmacy; Lippincott, Williams & Wilkins; (15 de dezembro de 2000) - que é incorporado aqui como referência. Novamente, uma composição líquida seria preparada por dispersão da composição em um alimento animal ou humano líquido ou substância para beber. Adicionalmente, um excipiente agrícola líquido apropriado poderia ser usado.
Os comprimidos e grânulos são de modo geral preferidos para administração oral. Os comprimidos podem conter ligantes e lubrificantes. Pós finos ou grânulos podem conter agentes de diluição, dispersão e/ou ativos de superfície e podem ser apresentados em água ou em um xarope. As cápsulas ou saches podem conter, convenientemente, uma composição em um estado seco. Soluções ou suspensões não aquosas da composição são também apropriadas e podem conter agentes de suspensão. Quando desejado ou necessário, agentes aromatizantes, preservantes, de suspensão, espessantes ou emulsionantes podem ser adicionados. Naturalmente, seria apropriado utilizar uma substância para comer ou beber como um método de distribuição oral.
A administração parenteral é, de modo geral, caracterizada por inj eção. Para os inj etáveis, será apreciado que, de modo geral, todos os materiais usados em uma composição e qualquer excipiente usado devem ser de classificação farmacêutica. Os injetáveis podem ser preparados de forma convencional, tanto como soluções líquidas, emulsões ou suspensões, formas sólidas
7/
19/96 apropriadas para dissolução, suspensão no líquido antes da injeção ou como emulsões. Uma abordagem alternativa para administração parenteral envolve o uso de um sistema de liberação lenta ou contida, tal que um nível constante de dosagem seja mantido. Vide, por exemplo, a Patente US número 3.710.395, que é incorporada aqui como referência. As preparações para administração parenteral podem conter também tampões, diluentes e outros aditivos apropriados. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais (tais como, óleo de oliva) e ésteres orgânicos injetáveis (tais como, oleato de etila). Veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo salmoura e meios tamponados. Outros veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactado ou óleos. Veículos para uso intravenoso incluem fluido e reabastecedores de nutriente, reabastecedores de eletrólito (tais como, aqueles â base de dextrose de Ringer) e semelhantes. Os preservantes e outros aditivos podem também estar presentes, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e semelhantes.
Para administração tópica podem ser usados líquidos, suspensões, loções, cremes, géis, ungüentos, gotas, supositóríos, aspersões e pós. Os veículos farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e semelhantes podem ser usados, caso necessário ou desejável,
A presente invenção provê, adicionalmente, um
20/96
método para preparação de uma partícula de glucano oca ou partícula de parede celular encapsulando um componente terpeno, o método compreendendo as etapas de;
> a) provisão de um componente terpeno;
b) provisão de uma partícula de glucano oca ou partícula de parede ceJLular;
c) incubação do componente terpeno com a partícula de glucano ou partícula de parede celular sob condições apropriadas para encapsulamento de terpeno; e
d) recuperação da partícula de glucano oca ou partícula de parede celular encapsulando o componente terpeno.
Opcionalmente o método acima pode compreender, adicionalmente, a etapa de secagem das partículas encapsulando o componente terpeno. A secagem pode ser obtida de várias formas, e pode ser feita menção de secagem por liofilização, secagem de leito fluidifiçado, secagem em tambor ou secagem por' aspersão, todos sendo processos bem conhecidos.
Na etapa a) do método acima, o componente terpeno é provido apropriadamente como uma suspensão em um solvente aquoso e opcionalmente, na presença de um agente tensoativo, Apropriadamente o solvente é água. Um agente tensoativo apropriado é o Tween-8 0. (monooleato de polioxietilenosorbitano), e preferivelmente o agente tensoativo está presente em uma concentração de cerca de 0,1 a 10% em volume da mistura de reação total, mais preferivelmente 1%. Alternativamente, o componente terpeno pode ser provido como uma solução verdadeira em um solvente, por exemplo, água. Uma solução verdadeira de
21/96 terpeno em água pode ser obtida por mistura do terpeno em água em cisalhamento alto, até uma solução verdadeira ser obtida. A publicação WO número 03/020024 provê detalhes adicionais da formação de soluções verdadeiras de terpenos em água.
Na etapa b) do método acima, a partícula de glucano oca ou partícula de parede celular é apropriadamente provida como uma suspensão em água ou outro líquido apropriado. Apropriadamente, a suspensão compreende cerca de 1 a 1.000 mg de partículas por mL, preferivelmente 200 a 400 mg/mL. Alternativamente, as partículas podem ser providas como um pó seco e adicionadas à suspensão de terpeno-agente tensoativo.
Alternativamente as partículas são providas em líquido suficiente para hidratar minimamente as partículas, porém não em excesso significativo. O termo volume hidrodinâmico” (HV) é usado para descrever o volume do líquido necessário para hidratar minimamente as partículas. Assim, apropriadamente, as partículas são providas com um volume variando do HV‘ e um volume de uma vez e meia o HV (1,5 HV) . Isso torna a etapa de secagem subsequente mais eficiente. Também, quando um volume baixo de líquido for usado (isto é, ao redor do HV a 1,5 HV), é também possível extrusar o produto acabado na forma de microesfera ou massa, que é conveniente para secagem do leito fluidifiçado.
Foi verificado que o componente terpeno pode ser encapsulado pela partícula de glucano oca ou partícula de parede celular a temperatura ambiente. A razão de encapsulamento contudo, é aumentada para 3 7° C, porém a
7/
22/96 temperatura deveria ser mantida abaixo do ponto de fusão ou temperatura de desnaturaçao de qualquer componente da composição. Condições apropriadas para a etapa c) do método acima são portanto pressão atmosférica a uma temperatura de 20 a 3 7°C. A otimização das condições para uma reação de encapsulamento específica serão uma questão de experimentação de rotina.
A presente invenção provê, adicionalmente, um método para exterminar um microorganismo, o método compreendendo a etapa de:
a) contato do microorganismo com uma composição compreendendo uma partícula de glucano oca ou partícula de parede celular encapsulando um componente terpeno.
Composições apropriadas são aquelas definidas em mais detalhes a seguir.
A presente invenção provê, adicionalmente, um método para prevenir ou tratar uma infecção em um paciente, o método compreendendo a etapa de:
a) administração ao paciente em uma dose terapeuticamente eficaz, de uma composição compreendendo uma partícula de glucano oca ou partícula de parede celular encapsulando um componente terpeno.
Composições apropriadas são aquelas definidas em maiores detalhes acima.
A infecção do paciente pode ser causada por qualquer agente infeccioso. Exemplos desses agentes infecciosos incluem, porém não estão restritos ao Staphylococcus aureus, Aspergillius fumigatus, Mycoplasma iowae, Penicillium sp., e Mycoplasma pneumoniae.
Para administração interna, a composição pode ser
23/96 administrada pelas vias oral, vaginal, retalmente, por inalação ou parenteralmente, por exemplo, pelas vias intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intraretal, intra-arterial, intralinfática, intravenosa, intratecal e intratraqueal. Formulações apropriadas da composição para essas vias são discutidas acima.
Para tratamento externo, a composição pode ser aplicada topicamente, por exemplo, como um creme ou ungüento ou como um pó seco para o tratamento de uma ferida.
A quantidade de terpeno administrada no método acima seria claramente suficiente para obter o resultado desejado, isto é, prevenção e/ou tratamento da infecção, porém não seria a um nível que induzisse sérios efeitos tóxicos ao paciente.
A quantidade da composição administrada naturalmente, dependerá do modo de administração, no paciente sendo tratado, isto é, seu peso, idade, condição, sexo e extensão da doença no indivíduo e do julgamento do médico que a prescreve. A dose, programação de doses e via de administração podem variar. Um versado na técnica seria prontamente capaz de determinar uma quantidade antiinfecciosa para uma dada aplicação com base no conhecimento geral da técnica e dos procedimentos nos Exemplos fornecidos a seguir. Deve ser observado que o termo paciente conforme usado aqui se refere a qualquer indivíduo, tanto humano quanto animal, ao qual o tratamento é aplicado. Assim, o paciente pode ser um animal doméstico (por exemplo, gato, cachorro, etc.), animais de criação (por exemplo, gado, cavalos, porcos, carneiros, cabras,
24/96 etc.) animais de laboratório (por exemplo, camundongos, coelhos, ratos, porquinhos da índia, etc.), pássaros e peixes. Apropriadamente, o indivíduo é um mamífero e especialmente um primata, por exemplo, um ser humano.
Em uma concretização adicional, a presente invenção provê um método para tratamento ou prevenção de uma infecção em uma planta, o método compreendendo a etapa de:
a) administração em uma dose terapeuticamente eficaz, de uma composição compreendendo uma partícula de glucano oca ou partícula de parede celular encapsulando um componente terpeno, a planta ou ao solo nas proximidades da planta.
Composições apropriadas são aquelas definidas em maiores detalhes a seguir.
Os terpenos mostraram eliminar vários agentes patogênicos da plantas (vide WO 03/020024) e, conforme descrito no pedido US copendente número 60/538.627 também exterminam eficazmente nematóides que são parasitas significativos das plantes. Os terpenos sozinhos em suspensão ou solução, contudo, são algo instáveis e degradam rapidamente no solo, assim perdendo sua eficácia.
A incorporação de um componente terpeno em uma partícula de glucano oca ou partícula de parede celular pode reduzir a razão de liberação e degradação do terpeno, aumentando assim a duração da ação do terpeno no solo.
Apropriadamente, a infecção de uma planta que deve ser tratada ou prevenida pelo método acima é a infecção por nematóides.
Outras infecções das plantas que podem ser tratadas ou prevenidas incluem infecções por fungos nas plantas,
25/96 especialmente aqueles afetando a superfície de uma planta. Tais infecções incluem, míldio em lanugem, míldio pulverulento ou apodrecimento por Botrytis; essas infecções afetando especificamente as parreiras.
Em uma concretização, a infecção da planta pode ser causada por um ou mais dos que se seguem: Aspergillius fumigatus, Sclerotínta homeocarpa, Rhizoctonia solani, Colletotrichum graminicola ou Penicillium sp.
Uma vantagem de um tratamento à base de terpeno nas plantas é que ele pode ser aplicado pouco antes da colheita.
Muitos período longo (geralmente 3 semanas) tratamentos convencionais requerem um antes da reentrada na área tratada Isso significa uma desvantagem, pois uma planta doente pouco antes da colheita não pode receber o tratamento convencional, uma vez que não seria possível ser feita a colheita no tempo desejado. As composições da presente invenção podem ser aplicadas a qualquer tempo até a colheita, por exemplo, 21 dias antes da colheita, 14 dias antes da colheita, 7 dias antes da colheita, ou mesmo 3 dias ou menos antes da colheita.
Os terpenos encapsulados mostraram eficácia específica no tratamento do míldio em lanugem, míldio pulverulento ou apodrecimento da das uvas por Botrytis, e assim a presente invenção provê um método para tratar ou prevenir essas doenças.
A prevenção das infecções das plantas pode ser obtida por tratamento regular das plantas com os terpenos encapsulados como uma medida profilática.
Apropriadamente, a composição da presente invenção
26/96 é aplicada por aspersão. Isso é especificamente apropriado para tratamento de uma doença de planta que afeta a superfície da planta. Para aspersão, pode ser usada uma preparação compreendendo 2 g/L da composição em agua. Concentrações de 2 a 4 g/L são especificamente eficazes e concentrações superiores a 4 g/L podem ser usadas conforme necessário. Obviamente, é importante que a concentração da composição usada seja suficiente para exterminar ou inibir o agente que causa a doença, porém não tão alta de modo a danificar a planta sendo tratada.
Quando da aspersão nas plantas, uma razão de 500 L/Ha ou superior é apropriada para cobrir as plantas. Preferivelmente uma razão de 90 0 L/Ha ou superior, mais preferivelmente 1.200 L/Ha ou superior é empregada para assegurar boa copa. Quando parreiras estão sendo tratadas, uma razão de 1.200 L/Ha provou ser apropriadamente eficaz.
A composição da presente invenção pode ser aplicada alternativamente através da irrigação. Isso é especificamente apropriado para tratamento de nematóides ou outros agentes patogênicos ou parasitas próprios do solo.
Em uma concretização adicional a presente invenção também provê uma composição compreendendo uma partícula de glucano oca ou partícula de parede celular encapsulando um componente terpeno para emprego na prevenção ou tratamento de uma infecção em um paciente ou planta. Composições apropriadas são aquelas definidas em maiores detalhes acima.
Em uma concretização adicional a presente invenção provê o emprego da composição compreendendo uma partícula de glucano oca ou partícula de parede celular encapsulando
7?
27/96 um componente terpeno na fabricação do medicamento para o tratamento da infecção causada por microorganismo. Composições apropriadas são aquelas definidas em maiores detalhes a seguir.
A presente invenção será descrita a seguir com referência aos exemplos que se seguem, não limitantes e
figuras onde: A figura 1 representa um micrográfico óptico das
paredes celulares de levedura vazias;
A figura 2 representa um micrográfico óptico das
paredes celulares de levedura encapsulando L-carvona;
A figura 3 representa um micrográfico óptico das
paredes celulares de levedura encapsulando citral;
A figura 4 representa um micrográfico óptico da
emulsão de terpeno;
A figura 5 representa um micrográfico óptico das
paredes celulares de levedura em água de volume
hidrodinâmico (HV) 7
A figura 6 representa um micrográfico óptico das
paredes celulares de levedura encapsulando terpeno em
volume hidrodinâmico (HV) de 5 vezes de água;
A figura 7 representa um micrográfico óptico das
paredes celulares de levedura encapsulando terpeno em HV de água;
A figura 8 representa um micrográfico óptico das paredes celulares de levedura encapsulando terpeno em HV mais 5% de água;
A figura 9 representa um micrográfico óptico das paredes celulares de levedura encapsulando terpeno em HV mais 10% de água;
28/96
A figura 10 representa um microgrãfico óptico das paredes celulares de levedura encapsulando terpeno em HV mais 20% de água;
A figura 11 representa um micrográfico óptico das paredes celulares de levedura encapsulando terpeno em HV mais 30% de água;
A figura 12 representa um micrográfico óptico das paredes celulares de levedura encapsulando terpeno em HV mais 40% de água.
A figura 13 * representa um micrográfico óptico mostrando a dispersão das partículas de glucano ocas encapsulando um componente terpeno e nenhuma goma xantano.
A figura 14 representa um micrográfico óptico como na figura 13 onde está incluído 0,07 g de goma xantana a 1%.
A figura 15 representa um micrográfico óptico como na figura 13 onde está incluído 0,14 g de goma xantana a 1%.
A figura 16 representa um micrográfico óptico como na figura 13 onde está incluído 0,28 g de goma xantana a 1%.
A figura 17 representa um micrográfico Óptico como na figura 13 onde está incluído 0,55 g de goma xantana a 1%.
A figura 18 representa um micrográfico óptico como na figura 13 onde estão incluídos 1,1 g de goma xantana a 1%.
A figura 19 representa um micrográfico óptico como na figura 13 onde estão incluídos 2,2 g de goma xantana a
1%
29/96
A figura 20 representa um micrográfico óptico como na figura 13 onde estão incluídos 4,4 g de goma xantana a 1%.
A figura 21 mostra uma representação esquemática das áreas de tratamento nos sítios 18 e 20.
A figura 22 mostra uma representação esquemática das áreas de tratamento nos sítios 18 e 20.
A figura 23 mostra uma representação esquemática das áreas de tratamento no sítio 7.
A figura 24 mostra um gráfico ilustrando a comparação das formulações de terpeno encapsulado vs. não encapsulado.
Os exemplos que se seguem são providos para permitir adicionalmente que o versado na arte fabrique ou realize a presente invenção. Eles são puramente exemplificados e não se destinam a limitar o escopo da invenção. A menos que de outra forma indicado, as partes são partes em volume ou partes em peso, conforme indicado, a temperatura está em °C ou está a temperatura ambiente, e a pressão é ou está próxima à pressão atmosférica. Existem inúmeras variações e combinações das composições e condições para fabricação ou uso das mesmas, por exemplo, concentrações de componentes, solventes desejados, misturas de solventes, temperaturas, pressões e outras faixas e condições que podem ser usadas para otimizar os resultados obtidos das composições e métodos descritos. Apenas experimentação razoável e de rotina será necessária para otimizar as mesmas.
Exemplo 1 - Demonstração da carga de terpeno nas partículas de levedura de padeiro e partículas de glucano
30/96 de levedura purificadas
O protocolo que se segue foi realizado para demonstrar que os terpenos seriam carregados nas paredes da célula de levedura e outras partículas de glucano ocas.
As emulsões de citral e L-carvona foram preparadas por mistura de 150 gL de terpeno com 100 gL de Tween 80 a 10% em água e 250 gL de água.
Partículas de levedura de padeiro (YP) ou partículas de glucano de levedura Levacan™, disponíveis na Savory Systems International, Inc., Branchburg, NJ, foram misturadas com água para formar uma suspensão de 250 mg/mL.
500 gL da suspensão de YP ou YGP e 250 gL de emulsão de terpeno foram misturados em conjunto e incubados por toda a noite sob agitação constante. 500 gL de suspensão P ou YGP e 500 gL de água foram usados como um controle. As partículas foram então lavadas com água até estarem isentas da emulsão externa. As preparações de partícula foram então congeladas e liofilizadas até estarem secas.
As partículas foram então reidratadas e examinadas sob microscópio óptico. Os resultados são mostrados nas figuras 1 a 4.
A figura 1 mostra estruturas esféricas com uma área escura em seu centro, essas sendo partículas de glucano ocas vazias. As figuras 2 e 3 mostram estruturas esféricas com uma aparência entumecida com um interior colorido claro, essas são partículas com terpeno encapsulado na cavidade central - citral na figura 2 e L-carvona na figura 3. Nas figuras 2 e 3, pequenas bolhas de terpeno livre podem também ser vistas, por exemplo, na parte superior da
31/96 figura 2, apenas retiradas do centro. A figura 4 mostra a emulsão de terpeno como pequenos bolhas de terpeno suspensas em água.
Exemplo 2 - Determinação dos níveis de carga máximos de citral e L-carvona nas partículas de parede celular de levedura de padeiro (YP)
O protocolo que se segue foi realizado para determinar as quantidades máximas de terpenos que poderíam ser carregadas nas YP.
- emulsões de L-carvona e citral foram preparadas por sonicação de 4,5 g de terpeno com 0,3 mL de água.
- solução a 10% de Tween-80 foi preparada por sonicação de 4,5 g de Tween-80 em 40,5 mL de água.
- a suspensão das YP foi preparada por mistura das YP com água para formar 20 mg/mL de suspensão.
- reações de encapsulamento foram estabelecidas conforme descrito na Tabela 1.
A emulsão de citral ou L-carvona-água foi misturada com YP e agente tensoat ivo Tween 8 0 por toda a noite a temperatura ambiente. As amostras foram centrifugadas a 14.000 x g por 10 minutos e o aparecimento de terpeno livre flutuando sobre a camada aquosa foi classificado. Os resultados são mostrados na coluna à direita marcada como terpeno livre de Tabela 1.
A expressão terpeno livre se refere à presença visível de terpeno na mistura de reação centrifugada. A ausência de terpeno .livre indica absorção completa de terpeno pelas partículas. O volume mais alto de terpeno absorvido pelas partículas, conforme evidenciado pela ausência de terpeno livre, foi registrado como o volume
32/96 máximo de emulsão de terpeno absorvido.
Tabela 1
Tubo 20 mg/Ml YP Emulsão de terpeno Volume 10% Tween-80 Terpeno Livre
gL μβ
1 500 . - - 500 -
2 500 L-carvona 0,5 500 -
3 500 L-carvona 1,65 500 -
4 500 L-carvona 5 495 -
5 500 L-carvona 16,5 483,5 -
6 500 L-carvona 50 450 +
7 500 L-carvona 165 335 +
8 500 L-carvona 500 - +
9 500 Citral 0,5 500 -
10 500 Citral 1,65 500 -
11 500 Citral 5 495 -
12 500 Citral 16,5 483,5 +/-
13 500 Citral 50 450 +
14 500 Citral 165 335 +
15 500 Citral 500 - +
Conforme pode ser visto dos resultados, YP é capaz de absorção e encapsulamento de pelo menos 16,5 L de 5 emulsão de terpeno L-carvona ou de pelo menos 5 L de emulsão de citral por 10 mg de YP.
Exemplo 3 - Demonstração de carga de terpeno aperfeiçoada com agente tensoativo e determinação da razão õtima de Tween-80:Terpeno
O protocolo que se segue foi realizado para demonstrar que a presença de agente tensoativo aperfeiçoa a carga de terpeno e para determinar o nível mínimo de agente tensoativo Tween-80 necessário para reação de carga de YP de terpeno.
33/96 as emulsões de L-carvona e citral foram preparadas por sonicação de 4,5 g de terpeno com 0,3 mL de água.
- solução de Tween-80 a 10% foi preparada por sonicação de
4,5 g de Tween-80 em 40,5 mL de água.
- A suspensão· de YP de padeiro foi preparada por mistura de YP com água para formar suspensão de 250 mg/mL.
As reações de carga foram estabelecidas conforme mostrado na Tabela 2 a seguir.
Emulsão de citral ou L-carvona-água foi misturada com YP com agente tensoativo Tween 80 a 0-10% v/v por toda a noite a temperatura ambiente. As amostras foram centrifugadas a 14.000 x g por 10 minutos e o aparecimento de terpeno livre flutuando sobre a camada aquosa foi classificado. Os resultados são mostrados na coluna à direita marcada como terpeno livre de Tabela 2.
A expressão terpeno livre se refere à presença visível de terpeno nà mistura de reação centrifugada. A ausência de terpeno livre indica absorção completa e encapsulamento de terpeno pelas YP. 0 volume mais alto de terpeno absorvido pelas YP, conforme evidenciado pela ausência de terpeno livre, foi registrado como o volume máximo de emulsão de terpeno absorvido.
Tabela 2
Tubo YP 250 mg/mL Emulsão de Terpeno Volume Tween- 80 a 10% Água Terpeno Livre
ML gL pL
1 500 - - - 500 -
2 500 L-carvona 150 0 350 pouco
34/96
3 500 L-carvona 150 5 345 pouco
4 500 L-carvona 150 10 340 pouco
5 500 L-carvona 150 33 317 Pouco
6 500 L-carvona 150 100 250 -
7 500 L-carvona 150 200 150 -
8 500 L-carvona 150 350 - -
9 500 L-carvona 400 0 100 + +
10 500 L-carvona 400 5 95 + +
11 500 L-carvona 400 10 90 + +
12 500 L-carvòna 400 33 77 + +
13 500 L-carvona 400 100 - +
14 500 L-carvona 400 2 0 μL 100% 30 +
15 500 Citral 113 0 387 +
16 500 Citral 113 5 382 +
17 500 Citral 113 10 377 +
18 500 Citral 113 33 354 Pouco
19 500 Citral 113 100 287 Pouco
20 500 Citral 113 200 187 -
21 500 Citral 113 350 37 -
22 500 Citral 250 0 250 + +
23 500 Citral 250 5 245 + +
24 500 Citral 250 10 240 + +
25 500 Citral 250 33 217 +
26 500 Citral 250 100 150 4-
27 500 Citral 250 20 μL 100% 230 +
Conforme pode ser visto dos resultados a concentração de Tween-80 a 1% (isto é, 100 μΐι de Tween-80 a 10% em 1.000 μΏ de mistura de reação) é suficiente para permitir absorção completa de terpeno na reação acima. Um
Tween-80 a 2% não leva a resultados aperfeiçoados,
35/96 considerando-se que uma concentração de terpeno livre de 0,33% foi observada. Isso indica que:
a) Os terpenos são absorvidos nas partículas de YP na ausência de um agente tensoativo, porém, a presença do agente tensoativo aumenta significativamente a absorção de terpeno.
b) Uma concentração de Tween-80 por volta de 1% é ótima para carga de YP uma vez que assegura carga apropriada enquanto mantêm a carga útil de terpeno das partículas de YP.
Exemplo 4 - Determinação de carga máxima de terpeno e encapsulamento em níveis altos de partículas de parede de célula de levedura de padeiro (YP) protocolo que se segue foi realizado para determinar as quantidades máximas de terpenos que poderíam ser carregadas nas YP em níveis altos de YP.
As emulsões de L-carvona e citral foram preparadas por sonicação de 4,5 g de terpeno com 3 mL: de Tween 80 a 1%.
Solução de Tween-80 a 5% foi preparada por sonicação de 0,5 g de Tween-80 em 9,5 mL de água.
- A suspensão de YP foi preparada por mistura de YP com água para formar süspensão de 250 mg/mL.
- As reações de encapsulamento foram estabelecidas conforme mostrado na Tabela 3.
A emulsão de citral ou L-carvona-água foi misturada com YP e agente tensoativo Tween 80 por toda a noite a temperatura ambiente. As amostras foram centrifugadas a 14.000 x g por 10 minutos e o aparecimento de terpeno livre flutuando sobre a camada aquosa foi classificado. Os
36/96 resultados são mostrados na coluna à direita marcada como terpeno livre de Tabela 3.
Ά expressão terpeno livre se refere à presença visível de terpeno na mistura de reação centrifugada. A ausência de terpeno livre indica absorção completa de terpeno pelas YP. 0 volume mais alto de terpeno absorvido pelas YP, conforme evidenciado pela ausência de terpeno livre, foi registrado como o volume máximo de emulsão de terpeno absorvido.
Tabela 3
Tubo YP 250 Mg/mL Emulsão de Terpeno Volume Tween- 80 a 1% Terpeno livre
pL - ML ML
1 500 ' - - 500 -
2 500 L-carvona 15 485 -
3 500 L-carvona 37,5 462,5 -
4 500 L-carvona 75 425' -
5 500 L-carvona 112,5 387,5
6 500 L-carvona 150 350 Pouco +
7 500 L-carvona 225 275 +
8 500 L-carvona 450 50 +
9 500 Citral 15 485 -
10 500 Citral 37,5 462,5 -
11 500 Citral 75 425 -
12 500 Citral 112,5 387,5 Pouco +
13 500 Citral 150 350 +
14 500 Citral 225 275j +
15 500 Citral 450 50, +
Conforme pode ser visto dos resultados na Tabela 3,
YP são capazes de absorção e encapsulamento terpenos em alta concentração de YP. YP absorveram e encapsularam de
37/96 pelo menos 112,5 L de emulsão de terpeno L-carvona ou de pelo menos 75 L de emulsão de citral por 125 mg de YP. Isso demonstra que a reação- de encapsulamento de terpeno depende da concentração de YP dentro das faixas testadas.
Exemplo 5 - Partículas de crivo disponíveis comercialmente para absorção de terpeno protocolo que se segue foi realizado para analisar as propriedades de carga dos diferentes tipos de partículas. As partículas estudadas eram Partículas de parede celular de Levedura de padeiro (Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO), Nutrex™ Walls (Sensient Technologies, Milwaukee, WI) , SAF-Mannan™ (SAF Agri, Minneapolis, MN) , Nutricept Walls™ (Nutricepts Inc., Burnsville, MN) , Levacan™ (Savory Systems International,
Inc., Branchburg, NJ) e WGP™ (Alpha-beta Technology, Inc. Worcester, MA).
Emulsões de L-carvona e citral foram preparadas por sonicação de 7 g terpeno + 3 mL de Tween-80 a 3,3%.
Tabela 4 a seguir compara a pureza do número de partículas de levedura por mg e a razão de peso/volume dos sólidos empacotados.
Tabela 4
Partícula de levedura % de Pureza de Beta 1,3- glucano Número de partículas/mg Mg de partículas/mL
Padeiro 11,2 4 x 10 250
Nutrex 24,.5 1,7 x 10 58,8
SAF-Mannan 33,4 2,4 x 10 41,7
Nutricepts 55,7 5,2 x 10 37
Levacan 74,6 1 x 10 19,2
WGP 82,1 3,5 X 10 10
38/96
A partir da Tabela 4 pode ser concluído que o número de partículas por mg é inversamente proporcional à pureza. Assim, o número de partículas por mg de WGP é quase dez vezes maior que as YP de padeiro.
As suspensões ΫΡ foram preparadas como se segue:
Suspensão de partícula de parede celular de levedura de padeiro (YP) foi preparada por mistura de 250 mg YP/mL de Tween 80 a 1%.
- Suspensão de Nutrex foi preparada por mistura de 163 mg de Nutrex YGP/mL de Tween 80 a 1%.
- Suspensão de SAF-Mannan foi preparada por mistura de 234 mg de Biospringer YGP/mL de Tween 80 a 1%.
- Suspensão de Nutricepts foi preparada por mistura de 99 mg de Nutricepts YGP/mL de Tween 80 a 1%.
- Suspensão de Levacan foi preparada por mistura de 217 mg de Lev YGP/mL de Tween 80 a 1%.
- Suspensão de WGP foi preparada por mistura de 121 mg de WGP YGP/mL de Tween 80 a 1%.
O volume empacotado das partículas acima é idêntico, o que significa que números iguais de partículas foram ensaiados.
As reações de carga foram estabelecidas conforme mostrado na Tabela 5 e deixadas incubar por toda a noite. As amostras foram centrifugadas a 14.000 x g por 10 minutos e o aparecimento de terpeno livre flutuando sobre a camada aquosa e a cor de terpenos encapsulados na microesfera foram classificados. Os resultados são mostrados nas duas colunas à direita na, Tabela 5. 0 volume mais alto de terpeno absorvido pelas partículas conforme evidenciado pela ausência de terpeno livre foi registrado como o volume
39/96 de emulsão de terpeno absorvido.
Tabela 5
Tubo Partícula Cone Mg/mL pL Emulsão de terpeno Vol pL Tween 80 a 1% pL Terpeno Livre Cor
1 Padeiro 250 500 L-carvona 125 375 - W
2 Nutrex 163 500 L-carvona 125 375 - w
3 SAF-Mannan 234 500 L-carvona 125 375 - w
4 Nutricepts 99 500 L-carvona 125 375 + w
5 Levacan 217 500 L-carvona 125 375 + w
6 WGP 121 500 L-carvona 125 375 + w
7 Padeiro 250 500 Citral 100 375 - -Y
8 Nutrex 163 500 Citral 100 375 - Y
9 SAF-Mannan 234 500 Citral 100 375 - w
10 Nutricepts 99 500 Citral 100 375 + Y
11 Levacan 217 500 Citral 100 375 + int
12 WGP 121 500 Citral 100 375 + int
13 - - - L-carvona 125 875 + -
14 - - - Citral 100 900 + Y
W = branco; Y = amarelo; int = intermediário Foram tiradas as seguintes conclusões a partir dos resultados:
- Partículas purificadas com baixo teor de lipídeo foram menos eficazes na absorção dos terpenos.
- Partículas menos puras foram mais eficazes na absorção de terpenos.
- O produto de degradação amarelo de citral não foi formado quando encapsulado em SAF-Mannan™.
- Com base no carregamento qualitativo no nível de terpeno simples testado, SAF-Mannan™ parece ser a melhor, Nutrex™ a segundo e de- padeiro a terceiro.
Exemplo 6 - Cinêtica de carga de terpeno em vários
40/96
tipos de partículas e temperaturas de incubação diferentes.
O protocolo que se segue foi adotado para comparar a cinética de carga dos vários tipos de partículas de levedura.
Emulsões de L-carvona e citral foram preparadas por sonicação de 7 g terpeno com 3 mL de Tween-80 a 3,3%·.
Solução de Tween- 80 a 1 % foi preparada por sonicação de 1 mL de Tween-80 a 10% em 10 mL de água.
- YP de padeiro foi preparada por mistura de 5 g de YP de padeiro em 20 mL de Tween-80 a 1%.
Suspensão de YGP Nutrex™ foi preparada por mistura de 2 g de YGP Nutrex™ YGP em 20 mL de Tween-80 a 1%.
Suspensão de SAF-Mannan™ foi preparada por mistura de 2 g de SAF-Mannan™ em 20 mL de Tween-80 a 1%.
As reações de carga foram ajustadas conforme mostrado na Tabela 6.
As reações foram incubadas por 1, 3, 6, 9 e 24 horas a temperatura ambiente ou 3 70 C. Após incubação as amostras foram centrifugadas a 14.000 x g por 10 minutos e o aparecimento de terpeno livre flutuando sobre a camada aquosa foi classificado. Os resultados são mostrados nas duas colunas à direita da Tabela 6. 0 volume mais alto de terpeno absorvido pelas partículas conforme evidenciado pela ausência de terpeno livre foi registrado como o volume de emulsão de emulsão de terpeno absorvido. A cor da microesfera encapsulada foi classificada em 24 horas.
Tabela 6
41/96
Tubo Temp •c Partícula conc. mg/rn L μΙ, Emulaão de Terpeno Vol μΕ Tween- 80 a 1% Terpeno Livre (h) Cor
1 3 € 9 24
1 Temp. Amb. Padei ro 250 3.500 L-carvona 788 2.712 + - - - - w
2 37 Padeiro 250 3.500 L-carvona 788 2.712 + - - - - w
3 Temp. Amb. Nutrex 100 3,500 L-carvona 1.050 2.450 + - - - - w
4 37 Nutrex 100 3.500 L-carvona 1.050 2.450 + - - - - w
5 Temp. Amb. SAP 100 3.500 L-carvona 1.050 2.450 <4 * - - - w
6 37 SAP 100 3.500 L-carvona 1.050 2.450 < + - - - - w
7 Temp. Amb, Padeiro 250 3.500 Citral 525 2.975 + - - - - Y
8 37 Padei ro 250 3.500 Citral 525 2.975 + - - - - VY
9 Temp. Amb. Nutrex 100 3.500 Citral 788 2.712 + - - - - Y
10 37 Nutrex 100 3.500 Citral 788 2.712 + - - - - VY
11 Temp. Amb, SAP 100 3.500 Citral 788 2.712 + - - - - w
12 37 SAP 100 3.500 Citral 788 2.712 + - - - - w
W = branco; Y = amarelo; VY = muito amarelo.
As conclusões que se seguem e outras observações podem ser obtidas dos resultados mostrados na Tabela 6:
- A reação de carga de terpeno acontece em 1 e 3 horas.
- A carga de terpeno ocorre mais rápido a 37°C que a temperatura ambiente.
- SAF-Mannan™ parecem ser as partículas preferidas por duas razões:
- Absorção de mais rápida e completa de ambos terpenos.
- Citral permanece estável quando carregado conforme evidenciado pela ausência da cor amarela, característica de degradação de citral, após 24 horas a
37°C.
Exemplo 7 - Classificação de uma faixa de terpenos simples e combinações de terpeno para carregamento de
42/96
TV partícula
O protocolo que se segue foi adotado para comparar a eficácia da carga de YP de padeiro vs. SAF-Mannan™.
A emulsão de terpenos foi preparada como se segue:
- L-carvona - 4,5 g de L-carvona em 1,5 mL de
Tween-80 a 3,3%.
- Citral - 4,5 g de citral em 1,5 mL de Tween-80 a
3,3%.
- Mistura de Timol/L-carvona (T/L) - 2,25 g de timol e 2,25 g de L-carvona em 1,5 mL de Tween-80 a 3,3%.
- Eugenol - 4,5 g de eugenol em 1,5 mL de Tween-80 a 3,3%.
- Geraniol - 4,5 g de geraniol em 1,5 mL de Tween80 a 3,3%.
- Mistura de Citral/L-carvona/Eugenol (C/L/E) - 1,5 g de citral, 1,5 g de L-carvona, 1,5 g de eugenol em 1,5 mL de Tween-80 a 3,3%.
Emulsões compostas de razão de terpeno:água:agente tensoativo de 0,75:0,3:0,05 foram usadas para esses experimentos.
Volumes crescentes de emulsão de terpeno foram misturados com 250 mg/mL YP de padeiro ou 250 mg/mL SAFMannan™ por toda a noite a temperatura ambiente conforme mostrado nas Tabelas 7. e 8. As amostras foram centrifugadas a 14.000 x g por 10 minutos e o aparecimento de terpeno livre flutuando sobre a camada aquosa foi classificado. Ό volume mais alto de emulsão de terpeno absorvido pela YP de padeiro ou de SAF-Mannan™ conforme evidenciado pela ausência de terpeno livre foi registrado como o volume de emulsão de terpeno absorvido. A cor dos terpenos
43/96 encapsulados na microesfera foi registrada. Os resultados nas Tabelas 7 e 8 mostram que todas as combinações simples e de terpeno foram eficazmente carregadas em ambas partículas de SAF-Mannan ou de YP de padeiro.
Tabela 7 - Avaliação da carga de YP de padeiro de diferentes terpenos e misturas de terpeno
Tubo Padei ro (μΐΟ Emulsão de terpeno Vol (pL) Tween- 80 a 1%(pL) Terpeno Livre Cor
1 500 - - 500 - W
2 500 L-carvona 15 485 - W
3 500 L-carvona 37,5 462,5 - w
4 500 L-carvona 7 425 +/- w
5 500 L-carvona 112,5 387,5 +/- w
6 500 L-carvona 150 350 + w
7 500 L-carvona 225 275 + W
8 500 L-carvona 450 50 ++ W
9 500 Citral 15 485 - Y
10 500 Citral 37,5 462,5 - Y
11 500 Citral 75 425 - Y
12 500 Citral 112,5 387,5 +/- Y
13 500 Citral 150 350 + Y
14 500 Citral 225 275 + Y
15 500 Citral 450 50 + Y
16 500 T/L 15 485 - w
17 500 T/L 37,5 462,5 - w
18 500 T/L 75 425 - w
19 500 T/L . 112,5 387,5 +/- w
20 500 T/L 150 350 + w
21 500 T/L 225 275 + w
22 500 T/L 450 50 + w
23 500 Eugenol 15 485 - w
44/96
24 500 Eugenol 37,5 462,5 - w
25 500 Eugenol 75 425 - w
26 500 Eugenol 112,5 387,5 + /- w
27 500 Eugenol 150 350 + w
28 500 Eugenol 225 275 + w
29 500 Eugenol 450 50 + w
30 500 Geraniol 15 485 - w
31 500 Geraniol 37,5 462,5 - w
32 500 Geraniol 75 425 - w
33 500 Geraniol 112,5 387,5 + w
34 500 Geraniol 150 350 + w
35 500 Geraniol 225 275 + w
36 500 Geraniol 450 50 + w
37 500 C/L/E 15 485 - Y
38 500 C/L/E 37,5 462,5 - Y
39 500 C/L/E 75 425 - Y
40 500 C/L/E 112,5 387,5 +/- Y
41 500 C/L/E 150 350 + ' Y
42 500 C/L/E 225 275 + Y
43 500 C/L/E 450 50 + Y
Tabela 8 - Avaliação de carga de SAF-Mannan de terpenos e misturas de terpenos diferentes
Tubo SAF (μΐ) Emulsão de Terpeno Volume Tween-80 a 1% (pL) Terpeno Livre Cor
1 500 - - 500 - w
2 500 L-carvona 15 485 - w
3 500 L-carvona 37,5 462,5 - ' w
4 500 L-carvona 75 425 - w
5 500 L-carvona 112,5 387,5 - w
6 500 L-carvona 150 350 + /- w
7 500 L-carvona 225 275 + /~ w
7?
45/96
8 500 L-carvona 450 50 + W
9 500 Citral 15 485 - W
10 500 Citral 37,5 462,5 - w
11 500 Citral 75 μΕ 425 - w
12 500 Citral 112,5 387,5 - w
13 500 Citral 150 350 1-/- Invertido w
14 500 Citral 225 275 + Invertido w
15 500 Citral 450 50 + Invertido w
16 500 T/L 15 485 - w
17 500 T/L 37,5 462,5 - w
18 500 T/L 75 425 - w
19 500 T/L 112,5 387,5 - w
20 500 T/L 150 350 +/- w
21 500 T/L 225 275 + w
22 500 T/L 450 50 + w
23 500 Eugenol 15 485 - w
24 500 Eugenol 37,5 462,5 - w
25 500 Eugenol 75 425 - w
26 500 Eugenol 112 , 5 3 87,5 +/- w
27 500 Eugenol 150 350 + w
28 500 Eugenol 225 275 + w
29 500 Eugenol 450 50 + w
30 500 Geraniol 15 485 - w
31 500 Geraniol 37,5 462,5 - w
32 500 Geraniol 75 425 - w
33 500 Geraniol 112,5 387,5 - w
34 500 Geraniol 150 350 - w
35 500 Geraniol 225 275 Invertido w
46/96
36 500 Geraniol 450 50 + Invertido W
37 500 C/L/E 15 485 - w
38 500 C/L/E 37,5 462,5 - w
39 500 C/L/E 75 425 - w
40 500 C/L/E 112 , 5 3 87 ,5 - w
41 500 C/L/E 150 350 - w
42 500 C/L/E 225 275 + /- w
43 500 C/L/E 450 50 + w
Invertido - fase invertida - flutuação de sólidos na parte superior
- sem óleo livre; W = branco, Y « amarelo
A partir dos resultados, as observações que se 5 seguem foram realizadas:
- Todos os terpenos pareceram carregar na YP de padeiro e SAF-Mannan.
- SAF-Mannan tem uma capacidade de carga de terpeno maior que a YP de padeiro.
- As misturas de dois e três modos de terpenos também parecem carregar eficazmente.
- O terpeno Eugenol parece ter uma densidade maior que as partículas e a água como ele foi encontrado associado a microesfera.
- Para SAF-Mannan, os níveis de carga maiores e partículas mais leves resultaram em partículas carregadas flutuando sobre a superfície da camada aquosa para citral e geraniol.
- Citral foi protegido da oxidação por SAF-Mannan, porém não pela YP de padeiro.
A carga máxima aproximada para cada tipo de partícula foi determinada e é mostrada nas Tabelas 9 e 10 a
47/96 seguir. A porcentagem carregada representa uma razão da quantidade de terpeno carregada para uma quantidade de partícula presente (peso para peso).
Tabela 9 - Carga máxima de terpeno em YP de padeiro
Terpeno Volume carregado pL % Carregado peso/peso
L-carvona 37,5 33,3
Citral 75 67%
Timol/L-carvona 1:1 75 67%
Eugenol 75 67%
Geraniol 75 67%
Citral/L-carvona/ Eugenol (1:1:1) 75 67%
Tabela 10 - Carga máxima de terpeno em SAF-Mannan
Terpeno Volume carregado gL % Carregada peso/peso
L-carvona 112,5 100%
Citral 150 133%
Timol/L-carvona 1:1 112,5 100%
Eugenol 112,5 100%
Geraniol 150 133%
Citral/L-carvona/ Eugenol (1:1:1) 150 133%
Exemplo 8 - Avaliação da estabilidade do terpeno nas emulsões aquosas e formulações de terpeno encapsulado
A estabilidade do terpeno foi avaliada por observação das formulações de citral para a formação do 10 produto de oxidação de cor amarela. Conforme observado na coluna à direita nas Tabelas 5-8, as emulsões de citral e YP de padeiro encapsuladas desenvolveram uma cor progressivamente amarela com o passar do tempo. Contudo, o encapsulamento de citral em SAF-Mannan™ aumentou a $00
48/96 estabilidade do citral, conforme evidenciado pela redução ou ausência de cor amarela com o tempo.
Exemplo 9 - Carga de Terpenos em ãgua mínima
O protocolo que se segue foi realizado para avaliar a possibilidade de realização do carregamento de terpeno e encapsulamento na YP em um nível alto de sólidos de partículas de levedura (YP) para permitir a extrusão direta da formulação carregada em um secador de leito fluidificado. A quantidade mínima de água para hidratar completamente as partículas de SAF-Mannan™ foi determinada como sendo de 3,53 g de água por g de sólidos Isso define o volume hidrodinâmico (HV) ou capacidade de absorção de água das partículas. Nesse nível de água, as partículas hidratadas possuem uma consistência de massa rígida que é tixotrópica, isto é, cisalhamento fino como maionese. A adição de água até 40% acima de HV resulta em uma pasta escoável e espessa. A reação padrão que foi usada nos exemplos acima, foi realizada em 3 x HV de água.
Uma série de reações de carregamento de terpeno (Lcarvona) foi realizada mantendo a razão da partícula:terpeno:Tween (1:0,44:004) constante e variando a quantidade de água no sistema a partir de HV (3,53 g) para HV + 40% de água (4,92 g). Os controles foram o sistema de carregamento padrão que utiliza 3 x HV de água, reações apenas de partículas e apenas de terpeno. Seguindo-se a incubação por toda a noite, amostras das misturas foram avaliadas microscopicamente quanto a terpeno livre e evidência de absorção de terpeno pelas partículas e quanto as características de escoamento do material, por avaliação do fluxo nos tubos invertidos por mais de 15 minutos. Além
49/96 /(?/ disso, a presença de óleo livre foi avaliada por hidratação da mistura de reação com 5 x HV, vortexação para obter uma dispersão completa das partículas e centrifugação para sedimentar o terpeno encapsulado na partícula. Os resultados são mostrados na Tabela 11 e figuras 7 a 12. As figuras 7 a 12 mostram os resultados do carregamento dos seguintes tubos:
- figura 7 - tubo 3
- figura 8 - tubo 5
- figura 9 - tubo 6
- figura 10 - tubo 8
- figura 11 - tubo 10
- figura 12 - tubo 11 Tabela 11
Tubo SAF g Emulsão de Terpeno Peso <g> Água <g) Terpeno Livre Fluxo
1 - L-carvona 4,64 4,5 + +
2 1 - - 8,0 - +
3 1 L-carvona 4,64 4,5 - +
4 1 L-carvona 4,64 - - -
5 1 L-carvona 4,64 0,17 - -
6 1 L-carvona 4,64 0,35 - -
7 1 L-carvona 4,64 0,52 - Leve
8 1 L-carvona 4,64 0,7 - Mod.
9 1 L-carvona 4,64 0,87 - Alto
10 1 L-carvona 4,64 1,05 - Alto
11 1 L-carvona 4,64 1,39 - Alto
Os resultados mostrados nas Tabelas 11 e figuras 7 a 12 demonstram que a carga de terpeno e encapsulamento nas partículas ocorreu em todas as razões de água avaliadas. Surpreendentemente, carregamento equivalente ocorreu mesmo
50/96 /οΆ quando a reação de carregamento aconteceu em uma reação com a consistência de massa rígida usando uma quantidade mínima de água para hidratar as partículas. A ausência de terpeno livre foi observada microscopicamente (figura 7a 12) e no nível inferior de terpeno nos sobrenadantes, conforme evidenciado pela redução marcante na turvação do sobrenadante quando comparada apenas ao controle de terpeno.
Esses resultados estendem nosso entendimento das condições para carga de terpenos nas partículas de glucano ocas. A flexibilidade do uso de um volume mínimo de água para hidratar as partículas durante o processo de carga permitirá carregamento dos terpenos sob condições onde a mistura de reação possui uma consistência semelhante a massa maleável usando misturadores de massa de varredura de superfície de classificação alimentícia padrão. A consistência da mistura altamente carregada de terpenos sólidos final é apropriada para extrusão direta de modo a formar massas e microesferas para secagem do leito fluidifiçado.
Instalações apropriadas para produção em grande escala necessitariam de:
Homogeneizador Gaulin ou equivalente para produção de emulsão de terpeno estável.
Tanque de mistura de massa de varredura de superfície
- Extrusor
- Secador de leito fluidifiçado.
Exemplo 10 - Avaliação de um agente hidroco1 õi de intersticial que auxilia a dispersão das partículas de /103
51/96 glucano ocas e secas, encapsulando um componente terpeno quando as mesmas são reidratadas protocolo que se segue foi adotado para avaliar o efeito de um hidrocolôide intersticial no aumento da dispersão das formulações de terpeno encapsulado em partícula de glucano o‘ca e seca quando hidratada.
- partículas de SAF-Mannan™
- 0,Tween 80 a 1%
- L-carvona
- Goma xantana - 1% peso/volume em Tween 80 a 0,1%
O efeito de aumento dos níveis de goma xantana em água na dispersão de L-carvona encapsulado em partícula de glucano oca seca foi avaliado pelo carregamento de Lcarvona em SAF-Mannan por incubação de 1,1 g de uma emulsão de L-carvona (razão de L-carvona:água:agente tensoativo de 0,75:0,3:0,05) com 1 g de SAF-Mannan e 4,4 g de Tween 80 a 0,1% contendo 0 - 1% de goma xantana conforme mostrado na Tabela 12.
Tabela 12
Tubo SAF g Emulsão de L-carvona <g> Tween-80 a 0,1% <g> Xantana a 1% (g) Observações visuais
1 1 1,1 4,4 0 Grumos grandes não uniformes
2 1 1,1 4,33 0,07 Suspensão uniforme
3 1 1,1 4,26 0,14 Suspensão uniforme
4 1 1,1 4,12 0,28 Suspensão uniforme
5 1 1,1 3,85 0,55 Suspensão uniforme
6 1 1,1 3,3 1,1 Finer Uniform suspension
7 1 1,1 2,2 2,2 Suspensão uniforme mais fina
52/96
8 1 1,1 0 4,4 Suspensão uniforme mais fina
Os resultados da Tabela 12 e figuras 13 a 20 demonstram que a inclusão de hidrocolóide de peso molecular alto durante a secagem do terpeno encapsulado na partícula auxilia a hidratação e dispersão das micropartículas em uma suspensão uniforme. Outros exemplos de tais agentes hidrocolóides são maltüdextrina, alginatos ou semelhantes.
Também pode ser desejável incluir um revestimento da microesfera para aumentar a estabilidade dos terpenos carregados e para fornecer uma distribuição prolongada de terpeno.
Exemplo 11 - Avaliação da concentração inibidora mínima (MIC) das emulsões de terpeno, YP de padeiro frescas e terpenos encapsulados em SAF-Mannan e YP de padeiro liofilizada além de terpenos encapsulados em SAF-Mannan contra S. aureus
Os resultados do protocolo realizado para comparar a MIC de formulações de terpeno encapsulado na partícula de glucano oca fresca vs. liofilizada são mostrados na Tabela
13. Uma emulsão de terpeno simples foi também testada e os resultados são mostrados para comparação.
Tabela 13 MIC gg/mL de terpeno
Terpeno Emulsão De Padeiro SAF-Mannan
Fresca Liofili zada Fresca Liofili zada
L-carvona 3,75 0,1 >0,04 0,01 >0,02
Citral 0,94 0,01 0,05 0,01 >0,03
L-carvona/ Timol 0,23 0, 01 0, 03 0,01 0,05
Eugenol 0,12 0,03 0,05 0,01 0,05
^05
53/96
Geraniol 0,47 0,03 0,06 0,02 >0,03
L-carvona/ Citral/Eugenol 0,23 0,03 0,06 0,02 0,05
As conclusões que se seguem foram obtidas dos resultados acima:
- A carga de terpeno nas partículas de glucano ocas parece melhorar a MIC do terpeno. De modo geral, as emulsões de terpeno frescas são -4 - 375 vezes menos potentes em relação às formulações encapsuladas.
- Terpenos carregados em SAF-Mannan™ têm desempenho ligeiramente melhor que as YP de padeiro.
- As composições de terpeno carregadas frescamente possuem desempenho ligeiramente melhor em relação às composições liofilizadas {pode haver alguma volatilização dos terpenos a partir das composições secas durante liofilização).
- Os terpenos nas emulsões aquosas são estáveis por pelo menos 3 semanas.
Exemplo 12 - Eficácia de terpenos encapsulados em escala de planta piloto contra S, aureus.
Ensaios antimicrobianos foram realizados com terpenos encapsulados e misturas produzidas em escalas de planta piloto contra 5. aureus. Ambas as amostras de terpeno encapsulado fresco e liofilizado contendo materiais demonstraram atividades antimicrobianas fortes. Os resultados são resumidos na Tabela 14 abaixo.
Os terpenos foram encapsulados em SAF-Mannan™ a uma escala de 2,5 kg. Uma mistura de três terpenos {Geraniol, 275 g; Eugenol, 385 g; e timol, 440 g foi dissolvida e homogeneizada com 100 g de Tween-80 e 8 L de água.
54/96
HOC
SAF-Mannan™ (2,5 kg) foi adicionado para realizar uma suspensão homogênea. A suspensão passou através do homogeneizador Gaulin para reduzir o tamanho da partícula e o homogenato foi incubado por toda a noite a temperatura ambiente. Uma amostra de o terpeno encapsulado foi removida e armazenada a temperatura ambiente. 0 terpeno encapsulado restante foi então congelado em bandejas e liofilizado. O pó encapsulado de terpeno liofilizado foi moído e armazenado a temperatura ambiente.
Tabela 14
Material MIC (PPM)
Ensaios d.e Staphylococcus aureus
controle de revestimento de YGP vazias >2500
Planta Piloto - Fresco 100
Planta Piloto - Liofilizado 100
Na escala da planta piloto, ambas as amostras fresca e liofilizada eram igualmente potentes com base em terpeno peso/peso.
Com base nos resultados de preparação em larga escala, a dose eficaz prevista da formulação liofilizada contra S. aureus é de 200 ppm (a formulação contém 50% de terpeno peso/peso) ou 0,2 g/L de água.
Exemplo 13 - Eficácia dos terpenos encapsulados contra Mycobacterium
Emulsões de terpeno foram preparadas como se segue:
- Citral - 4,5 g de citral em 1,5 mL de Tween-80 a
3,3%.
- L-carvona/eugenol - 2,25 g de L-carvona e 2,25 g de Eugenol em 1,5 mL de Tween-80 a 3,3%.
/07
55/96
- Eugenol - 4,5 g de eugenol em 1,5 mL de Tween-80 a 3,3%.
- Geraniol - 4,5 g de geraniol em 1,5 mL de Tween80 a 3,3%.
- Mistura de geraniol/timol - 2,25 g de geraniol e
2,25 g de timol em 1,5 mL de Tween-80 a 3,3%.
- Emulsão de controle - 6 mL de Tween-80 a 1%. SAF-Mannan® (2,5 g) foi misturado com 3 mL de cada emulsão e 7 mL de Tween 80 a 1% e incubado por toda a noite 10 para encapsular os terpenos e misturas de terpenos. As formulações de terpeno encapsulado congeladas e liofilizadas e os pós moídos em um pó fino. As suspensões de terpenos encapsulados (25 mg/mL) e emulsões de terpeno não encapsulado foram analisadas quanto a atividade antibacteriana contra Mycobacterium. Os resultados são apresentados na Tabela 15.
Tabela 15
Material MIC (ppm)
Ensaios com Mycobacteri um
Citral liofilizado em YGP 250
L-Carvona/Eugenol liofilizados em YGP 500
Eugenol liofilizado em YGP 500
Geraniol liofilizado em YGP 125
Geraniol/Timol liofilizado em YGP 62,5
Emulsão de controle >1.000
Emulsão de Citral - 35
Emulsão de L-carvona/Eugenol 53
Emulsão de Eugenol 105
Emulsão de Geraniol 70
Emulsão de Geraniol/Timol 53
Exemplo 14 - Atividade nematicida dos terpenos
56/96 foZ encapsulados
As preparações de paredes celulares de levedura encapsulando citral foram obtidas de acordo com os procedimentos descritos acima. As partículas de glucano ocas continham 17,5% de citral e as partículas estavam presentes nas preparações de teste a uma concentração de 1.000 ppm. Isso significa que os terpenos estavam efetivamente presentes em uma concentração de 175 ppm.
1,0 mL das preparações de teste foram adicionados a 0,1 a 0,15 mL de água contendo nematóides de nó de raiz. 1,0 mL de água foi adicionado aos nematóides como controle.
Foram feitas observações conforme descrito anteriormente e a razão de extermínio avaliada (isto é, porcentagem de extermínio) após 24 e 48 horas. Os resultados mostrados na Tabela 16 são uma ponderação de dois conjuntos de resultados.
Tabela 16 - Atividade nematicida da solução de terpeno encapsulada (17,5 % citral ® 1.000 ppm
Razão de Extermínio
Tempo Teste Controle
24 h 45 17
48 h 56 21
Os resultados demonstram que partículas de glucano ocas encapsulando terpenos são eficazes no extermínio dos nematóides em nó de raiz em uma concentração de partículas de 1.000 ppm, o que corresponde a uma concentração de citral de apenas 175 ppm.
Assim, partículas de glucano ocas encapsulando terpenos parecem ser tão eficazes quanto os terpenos em solução ou com agente tensoativo como nematicida. A
57/96
atividade nematicida é mantida a despeito do terpeno ser nanoencapsulado dentro da partícula. Pode ser esperado que concentrações maiores de terpenos dentro das partículas de glucano ocas ou concentrações maiores das partículas resultem em uma razão de extermínio mesmo maior, como é o caso dos terpenos em solução ou com agente tensoativo.
Exemplo 15 - Propriedades fungicidas dos terpenos encapsulados e não encapsulados
Os protocolos que se seguem foram realizados para avaliar as propriedades fungicidas das várias combinações de terpeno e para comparar a eficácia das composições encapsuladas e não encapsuladas.
Avaliação das propriedades antifungo de diferentes formulações de terpeno
Um ensaio de placa de microtitulação foi usado para avaliar a concentração inibidora mínima (MIC) de uma faixa de compostos contra diferentes organismos patogênicos. O ensaio empregado para cada organismo foi descrito em detalhes a seguir, porém as características gerais importantes são como se segue.
O ensaio utiliza dois períodos de incubação para distinguir entre atividades estáticas (inibição do crescimento) e cida (extermínio). O primeiro período de incubação permite avaliar o crescimento da inibição, porém não pode distinguir entre prevenção meramente do crescimento e o extermínio das células. A finalidade do segundo período de incubação é permitir tempo suficiente e nutrientes para proliferação de quaisquer células dormentes ou inibidas que sobrevivam à exposição ao terpeno. Quaisquer células que tenham sido inibidas pelos efeitos
58/96 fungicidas responderíam e cresceríam durante o segundo período de incubação, considerando-se que as células exterminadas por exposição aos terpenos, não crescerão no meio fresco.
Os experimentos de classificação iniciais foram realizados usando um total de 31 formulações de terpeno diferentes (Tabela 17).. Esses experimentos foram repetidos usando um subconjunto de formulações de terpeno fortemente ativas (Tabela 18).
Uma combinação dos terpenos geraniol, eugenol e timol em uma razão de 2:1:2 encapsulados dentro das partículas de glucano foi também testada; a amostra sendo referida como YP-GET. Uma combinação de geraniol, eugenol e timol não encapsulada na mesma razão também foi testada em comparação com a forma encapsulada.
Ensaio da MIC empregando Saccharomyces cerevisiae
S. cerevisiae (5 χ 105 células/mL em meio de crescimento de YPD) foi adicionada a cada poço da placa de microtitulação de 96 ‘poços em alíquotas de 100 pL. Pelo 20 menos uma coluna por placa foi designada como controle apenas de célula e nenhum terpeno foi adicionado a esses poços. Alíquotas (100 pL) de diferentes formulações de terpeno foram adicionadas à primeira fileira das colunas remanescentes, e diluições dobradas em série foram 25 realizadas transferindo 100 pL de uma coluna para a próxima um total de 7 vezes. Finalmente, 100 pL foram descartados da última fileira, a fim de garantir que todos os poços contivessem o mesmo volume. Placas de microtitulação foram incubadas estatisticamente por toda a noite a 30°C.
0 Seguindo-se a incubação, as placas foram
59/96 classificadas quanto a inibição do crescimento (evidenciado por uma falta de turvação) . A inibição do crescimento (s 75%) foi visualmente confirmada por microscópio.
Uma vez que a MIC tenha sido determinada para cada formulação, as placas de microtitulação foram centrifugadas e o meio gasto foi removido dos poços não turvos. As células foram ressuspensas em meio fresco (100 pL) e as placas foram re-incubadas por toda a noite a 30°C. Avaliação da inibição de crescimento foi realizada conforme anteriormente.
Ensaio da MIC empregando um inócuo misto
As diferentes formulações de terpeno foram diluídas em série na placa de microtitulação de 96 poços conforme descrito para 3. cerevisiae. Ágar de YPD fundido foi então adicionado aos poços, em conj unto 5 μΐι de inócuo misto (preparado de folhas de uva com mofo a uma concentração de 5 χ 104 células/mL). As placas foram incubadas estatisticamente por 24 horas a temperatura ambiente e o crescimento do esporo foi avaliado visualmente pelo microscópio.
Devido ao uso do meio sólido, o segundo período de incubação no meio fresco não pode ser realizado.
Ensaio de MIC empregando Colletotrichum graminicola
As diferentes formulações de terpeno foram diluídas em série na placa de microtitulação de 96 poços conforme descrito para S. cerevisiae. C. graminicola (300 esporos/poço) foi adicionada aos terpenos diluídos e as placas foram incubadas estatisticamente por 48 horas a temperatura ambiente. A germinação e o crescimento dos esporos foram acompanhados visualmente por microscópio.
60/96
Uma vez que a MIC foi determinada para cada formulação, as placas de microtitulação foram centrifugadas e o meio gasto foi removido dos poços que inibiram crescimento. Os esporos foram ressuspensos em meio fresco (100 μίΛ e as placas foram reincubadas por toda a noite a temperatura ambiente. A avaliação da inibição do crescimento foi realizada como anteriormente.
Tabela 17 - Valores da MIC e MIC fungicida obtidos da classificação de 31 formulações de terpeno.
Formulação de Terpeno* Saccharomyce a Cerevisiae Micróbios misturados Colletotrichum graminlcola
MIC MIC Cida MIC MIC Cida MIC MIC Cida
1 Geraniol (G) 500 500 250 NT 63 63
2 Eugenol (E) 500 500 125 NT 125 125
3 Timol (T) 250 250 63 NT 63 500
4 Citral ÍC) 250 250 63 NT 125 63
5 L-carvona (L) 250 500 63 NT 125 125
6 GE 1000 2000 125 NT 63 250
7 GT 500 500 250 NT 125 63
8 GC 500 500 125 NT 125 250
9 GL 500 500 125 NT 125 125
10 ET 500 500 125 NT 125 125
11 EC 250 1000 31 NT 125 125
12 EL 500 1000 125 NT · 125 125
13 TC 500 500 16 NT 63 63
14 TL 500 1000 63 NT 63 63
15 CL 500 500 _<8 NT 63 63
16 GET 500 500 23 NT 94 94
17 GEC 250 500 94 NT 94 94
18 GEL 500 1000 188 NT 188 188
19 GTC 500 500 47 NT 188 188
20 GTL 500 1000 94 NT 94 94
21 GCL 250 500 94 NT 47 47
22 ETC 125 250 188 NT 94 94
23 ETL 500 1000 «12 NT 94 94
//3
61/96
24 ECL 500 1000 sl2 NT 188 188
25 TCL 500 1000 23 NT 94 375
26 GETC 500 1000 125 NT 250 500
27 ETCL 500 1000 63 NT 125 125
28 GTCL 500 1000 125 NT 250 250
29 GECL 500 1000 al6 NT 500 500
30 GETL 1000 1000 125 NT 500 250
31 GECTL 1000 1000 78 NT 625 625
GET (razão 2:1:2 peso/peso/pes o) NT NT 98 NT 78 156
YP-GET (razão G : E : T de 2:1:2, peso/peso)b 98 391 98 NT 20 20
NT, não testado; YP-GET, formulação de GET encapsulada em levedura.
a As combinações de terpeno foram misturadas em uma razão de 1:1 (peso/peso) a menos que de outra forma indicado.
b MICs calculadas pelo teor de terpeno.
Tabela 18 - Ensaio repetido para determinar valores de MIC e MIC fungicida
Formulação de Terpeno ‘ (por número) Saccharomycee cerevialae Micróbios misturados isolados de folhas de uva com mofob colletotríchum graminlcola
MIC MIC ' Cida MIC MIC Cida MIC MIC Cida
T (3) NT NT 63 NT NT NT
L (5) NT NT 250 NT NT NT
GE (6) NT NT NT NT 125 500
EC (11) 125 250 NT NT NT NT
TC (13) NT NT 250 NT 63 250
TL (14) NT NT 500 NT 250 500
CL (15) NT NT 500 NT 125 500
62/96
Μ/
GET (16) NT NT 375 NT 188 375
GEC (17) 250 500 NT NT NT NT
GCL (21) 250 500 NT NT 375 750
ETC (22) 125 . 250 NT NT 94 188
ETL (23) NT NT 375 NT 188 750
ECL (24) NT NT 750 NT NT NT
TCL (25) NT NT 750 NT 94 375
ETCL (27) NT NT 500 NT 63 500
GECL (29) NT NT 1000 NT NT NT
YP-GET (razão G:E:T de 2:1:2, peso/peso)c 98 195 NT NT 39 156
NT, não testado; YP-GET, formulação de GET encapsulada em levedura.
Observação: As amostras foram ensaiadas em duplicata. Se valores diferentes fossem obtidas entre as amostras em duplicata, o valor maior seria apresentado. Nenhuma amostra em duplicada diferiu em mais de duas vezes a diluição.
a As combinações de terpeno foram misturadas em uma razão 1:1 (peso/peso) a menos que de outra forma indicado.
b Suspensão de estoque de 1 x 104 células/mL.
c MICs calculadas por teor de terpeno.
Inócuo misto
O emprego de inócuos mistos apresenta vários problemas. A capacidade de variação no teor de esporos entre as preparações resulta em capacidade de reprodução pobre entre os ensaios e o crescimento de organismos contaminantes impede o armazenamento da germinação de esporos. As espécies de levedura unicelulares são especificamente problemáticas no mascaramento do crescimento do esporo. Embora a data precisa não possa ser
63/96 obtida desse ensaio, um efeito inibidor de terpenos foi observado.
A identificação dos esporos durante a classificação do ensaio de repetição foi mais fácil que durante o ensaio de classificação, uma‘vez que um número grande de esporos foi usado. Embora dados precisos não pudessem ser obtidos desse ensaio, foi observado um efeito inibidor dos terpenos.
Colietotrichum graminicola
Os valores de MIC geralmente maiores obtidos do ensaio de repetição em comparação ao ensaio de classificação inicial se devem:
- ao uso de soluções de terpeno de uma semana
- uso de esporos preparados recentemente, os quais tinham uma viabilidade maior em relação aos usados no ensaio de classificação inicial e não poderiam, portanto, ser exterminados facilmente.
Comparação das formulações de terpeno como emulsões livres com as mesmas formulações de terpeno quando encapsuladas em partículas de glucano ocas: ensaios de MIC de Saccharomyces cerevieiae
Meio de crescimento de YPD (100 μΐ^ foi adicionado a cada poço da placa de microtitulação de 96 poços e alíquotas de diferentes formulações de terpeno foram adicionadas à primeira fileira, fornecendo um volume total de 200 μΐ. nessa fileira. Uma coluna foi designada como controle apenas de célula e nenhum terpeno foi adicionado a esses poços. Diluições dobradas em série foram realizadas transferindo 100 μΕ de uma coluna para a próxima em um total de 7 vezes. Finalmente, 100 gL foram descartados da
64/96 hG última fileira, de modo a garantir que todos os poços contivessem o mesmo volume. S. cerevisiae (5 χ 105 células/mL em meio de crescimento de YPD) foi então adicionado a cada poço em alíquotas de 100 gL, e a absorvência a 620 nm (A62o) foi medida para cada poço usando um leitor de placa de microtitulação. As placas de microtitulação foram incubadas estatisticamente por toda a noite a 30°C.
Seguindo-se a incubação, ο A620 foi medido novamente e as placas foram classificadas quanto a inibição do crescimento (;* 75%) . A inibição do crescimento foi confirmada visualmente pelo microscópio.
Para a emulsão livre de terpenos, uma vez que MIC havia sido determinada para cada formulação, as placas de microtitulação foram centrifugadas e o meio gasto foi removido dos poços que inibiram crescimento. As células foram suspensas em meio fresco (100 μΏ) e as placas foram incubadas novamente por toda a noite a 30°C. A avaliação da inibição do crescimento foi realizada como anteriormente.
Os resultados da MIC e MIC fungicida são resumidos na Tabela 19.
Resultados
Tabela 19 - Valores de MIC e MIC fungicida obtidos da classificação de 31 formulações de terpeno contra Saccharomyces cerevisiae _
Formulação de Terpeno A(Número da Referência) Formulações encapsuladas em levedura b' 0 Emulsões de terpeno livre
MIC MIC Clda MIC MIC Clda
G (1) 111 NT 250 250
E (2) 131 NT 125 250
T (3) 115 NT 125 250
65/96
c (4) 118 NT 125 250
L (5) 254 NT 250 500
GE (6) 118 NT 250 500
GT (7) 108 NT 125 250
GC (8) 113 NT 125 250
GL (9) 117 NT 250 500
ET (10) 131 NT 125 250
EC (11) 126 NT 125 250
EL (12) 129 NT 125 250
TC (13) 59 NT 63 63
TL (14) 124 NT 63 125
CL (15) 124 NT 125 125
GET (16) 119 NT 63 125
GEC (17) 119 NT 125 250
GEL (18) 121 NT 125 125
GTC (19) 115 NT 125 125
GTL (20) 119 NT 125 125
GCL (21) 234 NT 125 125
ETC (22) 124 NT 125 125
ETL (23) 123 NT 125 125
ECL (24) 63 NT 63 125
TCL (25) 61 NT 125 500
GETC (26) 61 NT 63 250
ETCL (27) 120 NT 63 125
GTCL (28) 124 NT 125 125
GECL (29) / 125 NT 125 125
GETL (30) 122 NT 125 250
GECTLÍ31) 120 NT 125 250
GET (razão 125a NT 125 250
2:1:2,
peso/peso/p
eso)
YP-GET 125 NT 125° 250
(razão
G:E:T de
2:1:2,
peso/peso)
a As combinações de terpeno foram misturadas em uma razão 1:1 (peso/peso) a menos que de outra forma indicado.
b Formulações encapsuladas em levedura a menos que 5 de outra forma indicado.
c MIC calculada por teor de terpeno.
d Formulação em emulsão não encapsulada
Para ambos as emulsões de terpeno e terpenos encapsulados em levedura as MICs foram tipicamente s 125 ppm, com a maior parte das formulações ativas inibindo o crescimento a ~60 ppm. Os valores de MIC obtidos para as emulsões de terpeno foram semelhantes aos obtidos para suas respectivas formulações encapsuladas em levedura. Quando valores diferentes foram obtidos, eles apenas diferiram em uma diluição aproximadamente dobrada.
Muitas das emulsões de terpeno livre eram fungicidas na MIC inibidora de crescimento, com a maioria mostrando atividade fungicida em uma concentração superior dobrada.
Esses resultados demonstram que os terpenos encapsulados em partículas de glucano são pelo menos tão eficazes no extermínio de fungos quanto as formas não encapsuladas. Adicionalmente, as composições encapsuladas usadas podem ter tido a potência reduzida, devido ao fato de terem sido armazenadas por 45 dias a 4°C e possuindo um teor de terpeno subótimo de -4% peso/peso.
67/96
O ensaio para determinar a atividade fungicida envolve uma etapa de centrifugação que tenta separar as células microbianas de qualquer terpeno residual no meio de crescimento por produção de uma microesfera de células na parte inferior do poço. Essa microesfera é então ressuspensa no meio fresco e incubada por um segundo tempo na ausência de terpeno. Contudo, a etapa de centrifugação não pode discriminar entre células microbianas e partículas de levedura, portanto, quando os terpenos encapsulados na levedura são empregados, a microesfera celular também conterá partículas de levedura carregadas no terpeno. Como resultado, ambas as partículas de levedura e células microbianas são então ressuspensas no meio fresco.
Essa questão de metodologia não é considerada como afetando os resultados obtidos nos experimentos descritos acima pelas seguintes razões:
Nos experimentos anteriores, a emulsão de terpenos foi usada ao invés de partículas de levedura carregadas com terpeno e atividade fungicida foi claramente mostrada.
Os terpenos encapsulados são liberados por difusão e um equilíbrio entre a concentração de terpenos encapsulados e a concentração de terpenos liberados no meio circundante é rapidamente alcançado. Assim, seguindo-se a centrifugação e a ressuspensão no meio fresco, a concentração de terpeno liberado no meio de crescimento provavelmente estará bem abaixo daquela necessária para a atividade inibidora de crescimento.
- Não houve crescimento quando o teor do poço da MIC fungicida foi colocado em placa sobre meio de
68/96 crescimento de ágar. Quando colocado na placa sobre o meio de crescimento sólido, a difusão de qualquer terpeno residual através de todo o grande volume da placa de ágar resulta em uma concentração de terpeno local que é muito baixa para causar inibição do crescimento. A falta de crescimento do conteúdo do poço da MIC fungicida deve portanto ser devida à atividade fungicida inicial. Em contraste, quando é obtida uma MIC inferior aquela MIC fungicida e o teor do poço da MIC é colocado sobre meio de crescimento de ágar sólido, o crescimento é observado, indicando um efeito fungicida.
Exemplo 16 - Preparação das composições de terpeno encapsuladas para experimentos de campo
A finalidade do protocolo que se segue foi o de encapsular uma composição de terpeno nas partículas de glucano ocas para experimentos de campo subsequentes.
Materiais:
Timol (fornecido pela Alpha-Gamma Corporation)
Eugenol {fornecido pela Alpha-Gamma Corporation)
Geraniol {fornecido pela Alpha-Gamma Corporation)
Tween-80 a 1% (fornecido pela Alpha-Gamma Corporation)
Partículas de parede celular de levedura
Goma xantana.
As partículas da parede celular de levedura foram obtidas da Biorigin (São Paulo, Brasil) sob a marca registrada Nutricell MOS 55, e foram fabricadas pela Açucareia Quatá S.A. Usina Quatá - São Paulo, Brasil, código postal 19780 000. As partículas são um extrato de parede de célula seco por aspersao de S. cerevisiae e são
69/96
Μ um pó de escoamento livre de cor bege clara a marrom.
Protocolo: O protocolo que se segue era apropriado para 1 kg de partículas, porém pode simplesmente ser escalonado para produção maior.
1. Prepare a mistura de terpeno - misture 375 g de Geraniol + 525 g de Eugenol + 600 g de Timol e agitação em um frasco de vidro.
2. Prepare 6,2 L de Tween 80 a 1% por mistura de 62 g de Tween 80 em 6,2 L de água em uma cesta branca de 7,58 L. Misturar para formar a solução.
3. Adicione 6,2 g de goma xantana à solução de Tween e agite para dissolver.
4. Prepare a emulsão de terpeno por mistura de 1,5 kg de mistura de terpeno + 6,2 L de Tween 80 a 1%/goma xantana a 0,1% em cuba branca usando um misturador Polytron.
5. Adicione 1.000 g de partículas de parede celular de levedura - misture usando misturador de tinta para formar suspensão uniforme.
6. Adicione a emulsão de terpeno da etapa 4 às partículas de parede celular de levedura, enquanto misturando para formar uma consistência semelhante a maionese fina.
7. Derrame a mistura de terpeno nas latas e incube por toda a noite.
Resultados: Geraniol, eugenol e timol encapsulados nas partículas ocas de glucano foram obtidos como uma pasta. A pasta foi facilmente convertida no pó seco por técnicas de secagem por aspersão convencionais. A pasta é a composição líquida referida nos protocolos que se seguem
70/96 e o pó está na forma seca por aspersão.
Exemplo 17 - Experimentos de campo da composição de terpeno encapsulada em míldio em lanugem
Nas uvas, o míldio em lanugem é causado pelo fungo Plasmopara viticola, que infecta as parreiras no mundo inteiro e pode causar perdas por devastação para os que cultivam as uvas em termos de rendimento da colheita e qualidade do vinho. O fungo ataca os frutos e toda parte verde da parreira, fazendo com que as folhas murchem e as flores e frutos apodreçam. A doença se manifesta como manchas amarelo pálido irregulares ou manchas amarelo esverdeadas na superfície superior das folhas com crescimento de fungo semelhante a algodão, branco acinzentado e denso, cobrindo o lado inferior das lesões das folhas. Os frutos podem também ser cobertos com o crescimento em lanugem e dependendo do tempo da infecção, podem ser tornar marrons e moles ou podem não amolecer. O míldio em lanugem é disperso através da dispersão dos esporos pelo vento e pela chuva, e requer condições úmidas para infecção. Ele é particularmente problemático nos ambientes com alta umidade. Medidas preventivas são recomendadas para controle da doença, com aplicações precoces de fungicidas seguido por aplicações repetidas em intervalos apropriados. A resistência pode surgir para alguns tratamentos, e embora o desenvolvimento da resistência possa ser minimizado por rodízio do uso de diferentes fungicidas, ainda permanece o problema.
A finalidade dessa experiência foi investigar a eficácia da formulação de terpeno encapsulada do Exemplo 16 (YGP-GET) fornecida como uma formulação líquida ou em pó
71/96
(seca por aspersão) para a prevenção do míldio em lanugem nas uvas.
Quatro blocos adj acentes, cada um cobrindo 1 há, foram identificados no sítio 20 no vinhedo de Kir-Yianni.
Kir-Yianni é um vinhedo de 3 5 hectares em uma elevação de 300 metros. Ele é rodeado por uma floresta de carvalhos mista ao norte e oeste e se estende por orquidários e vinhedos ao sul e leste.
Todos os quatro blocos foram tratados com múltiplos produtos antes da aplicação da formulação de terpeno. Em 26 de junho de 2004, dois dos quatro blocos foram aspergidos com a formulação em pó de terpeno a uma dose de 0,5 g/L ou 2 g/L (vide ilustração esquemática na figura 21) . Um terceiro bloco foi tratado com mistura Bordeaux convencional, mais enxofre umectável e o bloco remanescente foi deixado sem tratamento.
As parreiras em cada bloco foram monitoradas quanto a sinais de míldio em lanugem na semana seguinte.
Quatro blocos adjacentes adicionais, cada um cobrindo 0,1 ha, foram identificados no sítio 18 no vinhedo de Kir-Yianni. Todos os quatro blocos foram tratados com múltiplos produtos antes da aplicação da formulação de terpeno. No dia 26 de junho de 2004, dois dos quatro blocos foram aspergidos com a formulação líquida de terpeno em uma dose de 1 g/L ou 4 g/L (figura 21) (observação: 1 g da formulação líquida de terpeno possui um volume de 1 mL). Dos dois blocos restantes, um foi deixado sem tratamento e um foi aspergido com Mikal®, um tratamento convencional para míldio em lanugem, em 28 de junho de 2004. Os vinhedos em cada bloco foram monitorados quanto aos sinais de míldio
72/96 de lanugem pela semana que se seguiu.
Para ambos os sítios, o produto de terpeno foi aplicado a uma razão de 1.200 L/ha.
Os estágios que se seguem de crescimento das uvas foram registrados:
- ruptura do botão, 26 de março de 2004
- flor, 1° de junho de 2004 - frutificação, 6 de agosto de 2004
As aplicações do estudo aconteceram na préfrutificação.
A estação de crescimento de 2004 foi excepcionalmente tardia e foi completamente úmida. A pressão da doença do míldio pulverulento foi extremamente alta, os níveis de Botrytis foram elevados e a pressão do míldio pulverulento foi moderada.
Ambas as formulações de YGP-GET em pó e líquida foram armazenadas a temperatura ambiente. Nenhuma condição de armazenamento especial foi utilizada.
Detalhes dos Produtos de Comparação
Experiência com formulação em pó: Mistura Bordeaux, fabricada pela Manica Spa, Itália, embalada na Grécia pela Moscholios Chemicals AS; enxofre umectável.
Experiência com formulação líquida: Mikal® {fosetil-al a 50%, folpet a 25%), fabricado pela Bayer CropScience, distribuído na Grécia pela Bayer Hellas SA. Os produtos de comparação foram aplicados como se segue: uma aplicação antes do rompimento do botão a uma dosagem de 15 g/L seguido por duas aplicações por ano a uma dosagem de 6,5 g/L. A razão de aspersão de 1.000 L/ha foi usada para todas as três aplicações.
73/96
146
Experiência com formulação em pô: Mistura Bordeaux (2 g/L) e enxofre umectável (2,2 g/L) foram aplicados em 26 de junho de 2004.
Experiência com formulação líquida: Mikal (3,2 g/L) foi aplicada em 28 de junho de 2004.
Os vinhedos foram examinados visualmente quanto aos sintomas de míldio em lanugem. 0 início da doença foi marcado por uma média de duas manchas oleosas por folha. Os tratamentos que preveniram o aparecimento de manchas adicionais foram considerados como fornecendo proteção eficaz contra míldio em lanugem.
Resultados
Formulação em pó YGP-GET (seca por aspersao)
O tratamento convencional da mistura Bordeaux forneceu boa proteção contra míldio em lanugem. Os sintomas do míldio em lanugem foram observados nos vinhedos de controle. A concentração do produto terpeno de 0,5 g/L não forneceu proteção e a concentração do produto de terpeno de 2 g/L forneceu proteção apenas ligeiramente melhor em relação ao controle. Observação: a pressão da doença nesse sítio foi muito baixa em razão do recente tratamento com pesticida.
Foram encontradas dificuldades na dissolução da formulação em pó uma vez que era muito fina, resultando em dispersão no ar. Isso pode ter afetado adversamente a eficácia do produto.
Formulação líquida de YGP-GET
Quando administrado a uma dosagem de 4 g/L, o produto de terpeno forneceu excelente proteção contra míldio em lanugem na copa exposta. Nenhuma proteção foi
74/96 fornecida pela dosagem de 1 g/L. Sintomas sérios de míldio em lanugem foram observados no bloco de controle.
A formulação líquida foi fácil de ser usada e tinha um odor agradável.
Discussão
Míldio em lanugem pode causar perdas por devastação a quem cultiva os vinhedos, em razão de seus efeitos no rendimento da colheita e qualidade do vinho. 0 controle da doença tem foco na prevenção, porque, uma vez estabelecida, a infecção pode espalhar rapidamente. No sítio aspergido com a formulação em pó, YGP-GET não exibiu eficácia em dosagem inferior (0,5 g/L) e uma dose de 2 g/L foi menos eficaz que o tratamento convencional. Nesse sítio, as aplicações de pesticida recentes resultaram em pressão da doença baixa, o que pode ter limitado a eficácia aparente do tratamento com terpeno. Contudo, foi considerado que uma dosagem inferior a 2 g/L de produto de terpeno era inadequada.
No sítio aspergido com a formulação líquida, uma excelente proteção da copa exposta foi fornecida pelo nível de dosagem superior de 4 g/L. 0 crescimento vegetativo em excesso nesse sítio resultou em tratamento mais eficaz dos ramos externos mais novos em comparação ao crescimento mais antigo na copa interna. A copa foliar completa do produto de terpeno é útil, uma vez que o tratamento não é sistêmico. Estima-se que um aumento de cerca de 30% em relação ao volume usado para os tratamentos sistêmicos convencionais obtenha boa cobertura usando o tratamento com terpeno.
Conclusões:
75/96 /27
Aplicação foliar da formulação líquida de YGP-GET foi altamente eficaz no controle do míldio em lanugem a uma concentração de 4 g/L. Concentrações inferiores de 0,5 g/L de pó e 1 g/L de líquido não foram eficazes.
Exemplo 18 - Experimentos de campo da composição de terpeno encapsulada no míldio pulverulento
Míldio pulverulento das uvas é causado pelo fungo Uncinula necator, e causa reduções no crescimento das parreiras, qualidade do fruto e resistência das parreiras ao inverno. Nas uvas para vinhos, um nível de infecção de apenas 3¾ dos frutos podem afetar a qualidade do vinho. A doença é caracterizada por pequenos pontos branco acinzentados de crescimento de fungo que se alastram em um revestimento branco pulverulento sobre as folhas. O crescimento do fungo pode também ocorrer nos frutos, que podem se partir. Contrário ao míldio em lanugem que requer condições úmidas e quentes, o míldio pulverulento pode ser um problema nas estações de crescimento mais secas, uma vez que áreas sombreadas e úmidas são favoráveis, porém não em condições de tempo chuvoso. As medidas preventivas são recomendadas para o controle do míldio pulverulento, com aplicações precoces de fungicidas repetidamente em intervalos apropriados.
Esse estudo objetiva investigar a eficácia da aplicação da composição de YGP-GET para prevenção do míldio pulverulento nas uvas.
Três blocos recentes, cada um cobrindo 0,1 ha foram identificados no sítio 18 no vinhedo Kir-Yianni. Em 19 de julho de 2004, um dos três blocos foi aspergido com a formulação líquida de YGP-GET a uma dose de 2 mL/L e um foi
76/96 deixado sem tratamento. 0 bloco remanescente foi aspergido com o tratamento convencional de Equesion® (2,5 g/L),
Alliete® (0,9 g/L) e Punch® (0,075 mL/L) (vide figura 22). As uvas em cada bloco foram monitoradas quanto aos sinais do míldio pulverulento na semana seguinte.
Três blocos adicionais e adj acentes, cada um cobrindo 0,1 ha, foram identificados no sítio 20 no vinhedo de Kir-Yianni. Em 20 de julho de 2004, um dos três blocos foi aspergido com a formulação líquida de YGP-GET a uma dosagem de 2 mL/L e os dois blocos restantes foram deixados sem tratamento (vide figura 22) . As uvas em cada bloco foram monitoradas quanto aos sinais de míldio pulverulento na semana seguinte.
Em ambos os sítios, os blocos haviam sido tratados anteriormente com vários produtos, incluindo uma aplicação anterior do produto de terpeno.
Todos os tratamentos com terpeno foram aplicados a uma razão de 1.200 L/ha para garantir cobertura completa.
Os estágios de crescimento das uvas que se seguem foram registrados:
- rompimento do botão, 26 de março de 2004
- floração, 1° de junho de 2004
- frutificação, 6 de agosto de 2004
As aplicações do estudo aconteceram na préfrutificação.
A estação de crescimento de 2004 foi excepcionalmente tardia e completamente umedecida. A pressão da doença do míldio em lanugem foi extremamente alta, os níveis de Botrytis foram elevados e a pressão do míldio pulverulento foi moderada.
77/96
Detalhes dos Produtos de Comparação
Nenhum produto de comparação foi usado no sítio 20. O tratamento de comparação usado no sítio 18 é detalhado a seguir.
Punch® (flusilazol 40%), DuPont.
Em 19 de julho de 2004, Punch® foi aplicado a uma dosagem de 0,075 mL/L como um tratamento preventivo para o míldio pulverulento de acordo com as instruções do fabricante.
Detalhes dos Produtos Adicionais
Nenhum produto adicional foi usado no sítio 20. Os produtos adicionais usados no sítio 18 são detalhados a seguir.
Sistema Equesion® (famoxadona a 22,5% mais cimoxanil a 30%) Alliete® (fosetil-al a 80%)
No dia 19 de julho de 2004, Equesion® (2,5 g/L) e Alliete® (0,9 g/L) foram aplicados como tratamentos preventivos para míldio em lanugem. A dose foi determinada de acordo com as instruções do fabricante.
Os produtos de comparação e adicionais representam tratamentos convencionais na programação de gerenciamento de praga integrada
As parreiras foram examinadas visualmente quanto aos sintomas de míldio pulverulento.
Resultados:
Sitio 18
Aproximadamente 20% dos pedúnculos e hastes no bloco de controle estavam pretos, indicando infecção moderada por míldio pulverulento. Em ambos o bloco de tratamento convencional e no bloco tratado com terpeno,
78/96 todas as hastes e ramos estavam verdes, indicando que a proteção adequada havia sido fornecida.
Sitio 20
Nenhuma evidência de infecção míldio pulverulento foi observada em quaisquer dos blocos.
Observações adicionais
Ao final da estação de crescimento, os blocos nos sítios 18 e 20 mostraram geralmente menos tensão devido à doença que o restante do vinhedo.
As infecções por míldio pulverulento causam perdas consideráveis aos cultivadores através de reduções no crescimento da parreira, qualidade do fruto e resistência da uva ao inverno. Adicionalmente, a qualidade do vinho pode ser afetada por um nível de infecção de tão pouco quanto 3% dos frutos. O controle da doença foca a prevenção, porque, uma vez estabelecida, a infecção pode difundir rapidamente. Nesse estudo, a aplicação de produto de terpeno YGP-GET no sítio 18 preveniu eficazmente a infecção por míldio pulverulento, e o nível de controle exibido pelo produto de terpeno foi comparável ao provido pelo tratamento convencional. Os resultados do sítio 20 não são conclusivos, contudo, devido à falta de infecção por míldio pulverulento. Essa falta de infecção é provavelmente devida à aplicação extensa de pesticidas antes do estudo, o que resultou em baixa pressão da doença.
nível mais baixo de tensão devido à doença nos sítios 18 e 20 sugere que o tratamento precoce com terpeno aplicado a esses sítios pode ter sido benéfico no controle da infecção a longo prazo.
Conclusões:
79/96
YGP-GET preveniu eficazmente a infecção por míldio pulverulento, com um nível de controle comparável ao provido pelo tratamento convencional.
Exemplo 18 - Experiências de campo adicionais da composição de terpeno encapsulada no míldio pulverulento
O estudo teve como obj etivo investigar adicionalmente a eficácia de YGP-GET para o tratamento do míldio pulverulento nas uvas de mesa Grimson Seedless.
Uma área de 0,1 ha no vinhedo de Tsigaras (cerca de 80 km ao sul do vinhedo de Kir-Yianni) foi inadvertidamente deixada sem tratamento durante uma aplicação de Cisteína em 1° de julho de 2004. Os vinhos nessa área mostram subsegüentemente graves sintomas de míldio pulverulento nas folhas, hastes e uvas. No dia 12 de julho de 2004, a área não tratada foi aspergida com 3 mL/L da formulação líquida de YGP-GET a uma razão de 1.200 1/ha e o restante do vinhedo foi aspergido com o produto de comparação Rogana. As parreiras foram avaliadas quanto aos sintomas de míldio pulverulento após 24 horas.
As parreiras foram tratadas em um sistema lyre trellis superior.
Detalhes do Produto de Comparação
Rogana (fenbuconazol a 5%, binocap a 16%) , fabricado pela BASF (BASF Agro Hellas S.A., Athens, Grécia) . Em 12 de julho de 2004, Rogana foi aplicado ao vinhedo Tsigaras como um tratamento para o míldio pulverulento. A dose foi determinada de acordo com as instruções do fabricante.
As parreiras foram visualmente examinadas quanto aos sintomas de míldio pulverulento.
80/96
Resultados
Sintomas graves de míldio pulverulento foram evidentes antes da aplicação de YGP-GET. Apenas 24 horas após a aplicação de YGP-GET, a floração branca do míldio pulverulento se tornou preta, indicando atividade antifungo eficaz. Como a doença foi efetivamente tratada nessa época, nenhum tratamento adicional foi aplicado. IGP-GET mostrou eficácia comparável ao tratamento convencional.
Discussão:
Nesse estudo, uma infecção por míldio pulverulento instalada foi tratada rápida e eficazmente usando YGP-GET. Apenas 24 horas após a aplicação, a infecção por míldio pulverulento anteriormente grave foi curada por aplicação do produto de terpeno, com eficácia comparável ao tratamento convencional.
Os dados preliminares obtidos desse estudo sugerem que YGP-GET pode ser eficaz no tratamento das infecções por fungos estabelecidas, além de mostrar capacidade preventiva.
Exemplo 19 - Experimentos de campo adicionais da composição de terpeno encapsulada no míldio pulverulento
Histórico e Racionalização
No experimento corrente, o uso de YGP-GET foi investigado como parte de um programa experimental de vinhedo na Tasmânia (Frogmore Creek Vineyard, Hathaway Trading Pty Ltd, Box 187, Richmond TAS 7025, Austrália) para controlar o míldio pulverulento usando produtos orgânicos. O obj etivo desse estudo era investigar a eficácia de curta duração da aplicação de YGP-GET no controle orgânico do míldio pulverulento nas uvas para /33
81/96 vinho Chardonnay.
Nesse experimento, as uvas para vinho (variedade Chardonnay) foram tanto tratadas com produto de terpeno YGP-GET ou deixadas sem tratamento (controle) no dia 7 de fevereiro de 2005. Embora suprimida pelos tratamentos orgânicos anteriores, o pré-experimento, a gravidade do míldio pulverulento estava a um nível considerado inaceitável comercialmente e era equivalente nas seis áreas de tratamento ativo e 6 áreas de controle. O estágio da colheita foi aproximadamente E-L 33-34 (pré-frutificação).
YGP-GET (4 mL/L) (formulação líquida) foi aspersido nas 6 áreas de Chardonnay, que haviam sido tratadas anteriormente com leite. Seis áreas de Chardonnay serviram como controles não tratados, porém elas haviam sido tratadas anteriormente' com óleo/soro. O número de parreiras por área era tipicamente de 7.
Detalhes da composição de YGP-GET usada nesse controle são fornecidos na Tabela 20.
Tabela 20 - Formulação da batelada usada no presente estudo
Detalhes da mistura de matéria prima Peso em kg % em peso
Geraniol 146,75 6,88
Eugenol ! 73,37 3,44
Timol 146,75 6,88
Partículas de levedura 327,56 15,35
Xantana 1,44 0,07
Polissorbato 1,44 0,07
Água 1.436,35 67,32
82/96
TOTAL 2.133,65 100,00
A gravidade do míldio pulverulento foi avaliada 3 dias antes do tratamento com terpeno e novamente 3 dias após o tratamento. Em cada área, 20 cachos de uva foram selecionados aleatoriamente (10 cachos por lado do painel) e a gravidade da doença foi estimada como a porcentagem da área dos cachos coberta com as colônias de míldio ativas. Nenhuma avaliação adicional foi possível em razão do cultivador ter aspergido subseqüentemente toda a área do experimento com enxofre e um adjuvante de aspersão à base de óleo vegetal (Synertrol Horti Oil).
Número/área de plantas a serem tratadas
Produto de Teste: YGP-GET (4 mL/L) a ser aplicado às 6 áreas de Chardonnay (total de cerca de 42 parreiras), que haviam sido tratadas anteriormente com leite.
Controle: Nenhum tratamento foi aplicado às 6 áreas de Chardonnay (total de cerca de 42 parreiras) a serem usadas como controles, porém elas foram tratadas anteriormente com óleo/soro.
Métodos de Cultivo
Parreiras Vi tis vinifera (Chardonnay) no Bloco B2: posicionamento vertical do broto com bastão arcado.
Disposição do Cultivo
Espaçamento: Distância de 2,5 m entre as fileiras e 1,25 m entre parreiras (dentro da fileira),* com 3.200 parreiras por hectare. Orientação da fileira era do norte para o sul.
Densidade da copa
O método de. ponto-quadratim foi usado para caracterizar a densidade da copa no pré-experimento com as
83/96 /à5 parreiras Chardonnay (tabela 21) . As medições foram feitas em 13 de janeiro de 2005 por seleção das seções representativas da copa dentro das áreas de Chardonnay que haviam sido tanto previamente tratadas com enxofre quanto deixadas sem tratamento. Dez medições foram realizadas em cada uma das 6 áreas de cada tratamento anterior (isto é, um total de 60 medições para as áreas tratadas com enxofre e 60 medições para as áreas de controle não tratadas). Além disso, o comprimento e número dos nódulos em 3 brotos ascendentes (por área) foram medidos.
Tabela 21 - Densidade da copa no pré-experimento com as uvas Chardonnay
Antes do tratameno Fendas (%) Número de camadas foliares (LLN) Folhas internas M Cachos internos (%) Número médio de nódulos Comprimento médio do broto (cm)
Não tratadas 12 1/5 22 26 21 110
Enxofre 5 2.0 27 40 21 104
Vai. ótima 20- 40% si,o-r,5 <10% <40% NA NA
NA - não aplicável Condição Geral
0 tratamento anterior dessas áreas com materiais experimentais suprimiu o míldio pulverulento em comparação ao controle não tratado. Contudo, o nível do míldio pulverulento foi considerado comercialmente inaceitável, embora equivalente em ambas as áreas tratada com leite e com óleo/soro.
Método de aplicação, dosagem e regime 0 tratamento com YGP-GET (4 mL/L) foi aplicado no
84/96 dia 7 de fevereiro de 2005 com uma pistola manual conectada a uma mangueira de bobina e bomba montadas em uma bandeja plana em um veículo utilitário. A aspersão foi propelida com uma pressão de bomba de 1.500 a 1.600 kPa, distribuição de cerca de 63 mL/segundo. Foi empregado o volume de aspersão padrão para tratamentos convencionais (cerca de 900 L/ha).
A gravidade do míldio pulverulento, estimada como a área (%) de cachos de uva cobertos com as colônias de míldio ativas, foi avaliada para 20 cachos selecionados aleatoriamente dentro de cada área (10 cachos por lado do painel) . A gravidade da doença foi avaliada no, dia 4 de fevereiro de 2005, 3 dias antes da aplicação do tratamento com YGP-GET e novamente no dia 10 de fevereiro de 2005, 3 dias após aplicação com terpeno.
Os dados foram transformados usando transformação de coseno inverso para obter separações ponderadas.
Resultados
Antes do tratamento, a gravidade média do míldio pulverulento nos cachos de uva Chardonnay nas 6 áreas a serem tratadas com terpeno (20,4%) era semelhante aquela nas 6 áreas de controle (23,2 %; tabela 22). Análise estatística com base na transformação de coseno inverso desses dados mostrou que não houve diferença significativa na gravidade da doença antes do tratamento (tabela 23).
Três dias após o tratamento, contudo, a gravidade média do míldio pulverulento foi de 23,8% nos cachos tratados com YGP-GET vs. 37,8% nos controles (tabela 22). A transformação do coseno inverso desses dados mostrou uma diferença significativa a favor dos cachos de uva tratados
85/96 com terpeno, que tinham uma área menor coberta com colônias de míldio ativo (p = 0,058; tabela 23).
Tabela 22 - Gravidade média do míldio pulverulento (%) nos cachos de uva Chardonnay antes e após tratamento com YGP-GET
Tratamento aplicado em 07/02/2005 Gravidade ponderada
Em 04/02/2005 em 10/02/2005
YGP-GET 20,4 23,8
Nenhum 23,2 37,8
Tabela 23. Separação estatística dos tratamentos seguindo-se transformação de co-seno inverso dos dados
Tratamento aplicado em 07/02/2005 Gravidade Ponderada (SEM)
Em 04/02/2005 em 10/02/2005
YGP-GET 0,2063 (0,03857) 0,2411 (0,04303)
Nenhum 0,2401 (0,08534) 0,3954 (0,07852)
fc = 0,36 df = 10 p = 0,726 Teste nos 2 lados: Diferença insignificante t = 1,72 df = 10 p = 0,058 Teste em 1 lado: Não tratado > tratado
Discussão:
A infecção nas parreiras com míldio pulverulento 10 pode causar perdas consideráveis aos cultivadores através dos efeitos prejudiciais ao crescimento das uvas e resistência, bem como na qualidade do fruto e do vinho. Nos vinhedos controlados organicamente, os cultivadores estão
86/96
pesquisando alternativas para tratamentos, tais como, como enxofre elementar.
Esse estudo investigou a eficácia das formulações de terpeno encapsuladas (4 mL/L) como uma formulação líquida no controle do míldio pulverulento em um vinhedo orgânico na Tasmânia, Austrália. Embora outros tratamentos experimentais tenham sido usados por tão pouco tempo quanto 3 semanas antes da aplicação do terpeno, o nível da infecção por míldio pulverulento foi ainda considerada comercialmente inaceitável. Três dias após o tratamento das parreiras de Chardonnay com YGP-GET, a gravidade do míldio pulverulento nas uvas tratadas foi significativamente menor em relação aos controles não tratados. Embora a gravidade da infecção nos controles não tratados piorasse durante os 6 dias entre as avaliações de pré e pós tratamento, ela permaneceu estável nas parreiras tratadas. Portanto, YGPGET pareceu ter abaixado a razão de aumento da doença nos cachos de uva que possuíam colônias bem estabelecidas de míldio pulverulento esporulando antes do tratamento. Presumivelmente, a expansão da colônia foi inibida, embora as colônias existentes continuassem a esporular um pouco. Avaliação de longo prazo da eficácia não foi possível porque o cultivador aspergiu, subseqüentemente, toda a área do experimento com enxofre.
Esses resultados encorajadores demonstram a eficácia de YGP-GET no controle do míldio pulverulento nas parreiras.
Exemplo 20 - Experimentos de campo da composição de terpeno encapsulada em Botrytis apodrecimento das uvas por Botrytis é causado por
ΖΊ/36
Botrytis cinerea, um fungo comum que pode causar sérias perdas no rendimento dos frutos. Os frutos são o sítio predominante da infecção, embora a doença possa também . afetar as flores e- folhas. Inicialmente, os frutos infectados parecem moles e aguados e podem ficar cobertos com o crescimento do fungo em condições de alta umidade. Com o tempo, os frutos murcham e caem. As condições úmidas favorecem o Botrytis, com fraca circulação de ar e frutos divididos ou lesionados são especificamente suscetíveis a dispersão da infecção. As estratégias de gerenciamento para o Botrytis incluem promoção de boa circulação de ar, prevenção de ferimentos e aplicação de fungicidas nas épocas apropriadas durante a estação de crescimento.
O objetivo desse estudo foi o de investigar a J 15 eficácia de YGP-GET no tratamento da infecção por Botrytis nas uvas.
A emergência do Botrytis no vinhedo Kir-Yianni em meados de outubro de 2004 (3 semanas após a aplicação de
Teldor®) não poderia ser tratada com agroquímicos convencionais em razão das restrições do tempo de reaplicação associadas o que poderia impedir a colheita planejada. Duas áreas adjacentes de 0,1 ha foram portanto identificadas no sítio 7 do vinhedo e, no dia 12 de outubro
de 2004, uma dessas áreas foi tratada com 4 mL/L de
25 formulação líquida de YGP-GET e a outra foi deixada sem
tratamento (vide figura 23) . A colheita foi realizada 3
dias mais tarde e a proporção de frutos infectados foi
determinada em cada área (porcentagem em peso do rendimento total). Os frutos não infectados de ambas as áreas tratadas e não tratadas foram então misturados no tanque de
88/96
fermentação.
sítio 7 foi tratado com vários produtos antes da aplicação da formulação de terpeno, porém ainda mostrou infecção por Botrytis.
As parreiras receberam uma aplicação simples de 4 mL/L de formulação líquida de YGP-GET a uma razão de 1.200
L/ha.
Os estágios de crescimento das uvas que se seguem foram registrados:
- rompimento do botão, 26 de março de 2004
- floração, 1° de junho de 2004
- frutificação, 6 de agosto de 2004
- colheita, 15 de outubro de 2004
As aplicações do estudo aconteceram 3 dias antes da colheita.
A estação de crescimento de 2004 foi excepcionalmente tardia e completamente umedecida. A pressão da doença do míldio em lanugem foi extremamente alta, a pressão do míldio pulverulento foi moderada Todos os tratamentos com terpeno foram aplicados a uma razão de 1.200 L/ha para garantir cobertura completa.
Os estágios de crescimento das uvas que se seguem foram registrados:
- rompimento do botão, 26 de março de 2004
- floração, 1° de junho de 2004
- frutificação, 6 de agosto de 2004
As aplicações do estudo aconteceram na préfrutificação.
A estação ’ de crescimento de 2004 foi excepcionalmente tardia e completamente umedecida. A
89/96 /6/ pressão da doença do míldio em lanugem foi extremamente alta, a pressão do míldio pulverulento foi moderada e os níveis de Botrytis foram elevados.
YGP-GET foi aplicado nessa época para avaliar sua eficácia em potencial contra infecção por Botrytis, que não poderia de outra forma ter sido tratado em razão das restrições para uso de pesticida antes da colheita.
Avaliação visual do sítio antes da aplicação do produto de terpeno revelou evidência de infecção por Botrytis. Após a colheita, os frutos foram colocados sobre uma correia transportadora e os frutos infectados foram manualmente separados dos frutos não infectados antes da moagem. A proporção de frutos infectados foi calculada como uma porcentagem do rendimento total (em peso) para cada área.
Resultados
A avaliação visual do sítio antes de aplicação de YGP-GET revelou evidência de infecção por Botrytis. Seguindo-se a colheita- (3 dias após aplicação de YGP-GET), as proporções de frutos infectados foram de 13% e 23% nas áreas tratadas e não tratadas, respectivamente. As áreas testadas não foram suficientes para avaliar o significado estatístico; contudo, o tratamento com YGP-GET tornou a progressão da doença claramente lenta.
A fermentação não foi afetada por mistura dos frutos não infectados das áreas tratadas e não tratadas com terpeno.
Discussão
Tratamentos convencionais para Botrytis devem ser cessados 3 semanas antes da colheita, deixando tempo
90/96 considerável para ocorrência de dano considerável ao rendimento da colheita e qualidade. 0 desenvolvimento de um tratamento que possa ser usado até a colheita ou que possa ser continuado mais próximo a colheita que os produtos existentes, resultaria em aperfeiçoamentos significativos no rendimento da colheita e qualidade do vinho, e seriam de benefício considerável para os cultivadores. Nesse estudo, o tratamento com YGP-GET de produto de terpeno tornou visualmente lenta a progressão da infecção por Botrytis estabelecida, apenas 3 dias antes da colheita, resultando em uma porção menor de frutos infectados na área tratada com terpeno que na área não tratada. Adicionalmente, a despeito do uso de YGP-GET próximo à colheita, a fermentação não foi afetada pela combinação das uvas tratadas e não tratadas.
Esses resultados sugerem que YGP-GET é eficaz na redução do impacto das infecções de Botrytis estabelecidas e pode ser usado próximo â colheita, sem efeitos prejudiciais na fermentação subsequente.
Exemplo 21 - Avaliação dos terpenos encapsulados para tratamento de .míldio em lanugem estabelecido e subsequente avaliação da qualidade da uva
Um experimento de YGP-GET foi realizado em 25/08/2004 aplicando a composição a uma razão de 1.000 g por 250 litros.
Um vinhedo de Cabernet Sauvignon que havia sido 100% infectado e sofrendo de perda substancial das folhas devido ao míldio em lanugem foi aspergido. Quaisquer folhas restantes foram infectadas com manchas de míldio em lanugem conforme evidenciado pela mancha amarela na parte superior
91/96 da folha e o crescimento de lanugem na parte inferior da folha; a indicação clássica do míldio em lanugem. Muitas folhas estavam quase totalmente amarelas indicando infecção substancial. Essa perda de folhas e a infecção em geral retardam a maturidade das uvas e em muitos casos as uvas nunca amadurecem completamente para o fim de fabricação dos vinhos.
Observação de cachos totalmente imaturos (isto é, frutos verde escuro ~1 cm de diâmetro e de forma oval) ocasionalmente nas parreiras indicaram que as parreiras estavam provavelmente infectadas antes da frutificação e provavelmente na floração ou antes. Nenhuma aplicação de cobre (Bordeaux ou sulfato de cobre básico) anterior foi empregada. Esse vinhedo foi pesadamente infectado na colheita anterior ao ponto de nenhuma colheita ser produzida para Cabernet Sauvignon. A perda das folhas no último ano foi de 100% a despeito do tratamento com bicarbonato de potássio, na tentativa de exterminar o míldio em lanugem, seguido por aplicação de Stilbourin para proteção sistêmica de longo prazo.
Em 19/09/2004 as uvas tratadas nesse experimento foram colhidas e moídas e as observações que se seguem foram feitas com relação ao mosto (Tabela 24):
Tabela 24
Controle Tratadas Desejável
pH 3,28 3,30 3,3-3,5
TA 0, 92 0,85 0,7-0,75
Brix 17,4 18,7 20-22
Esses resultados indicam que as uvas das parreiras tratadas estão mais maduras que aquelas das parreiras não
92/96 tratadas. A observação* das uvas propriamente indicou que as uvas não amadurecidas eram, em média, de cor mais clara, algumas com matriz rosado/púrpura/verde, indicativo de uvas após a frutificação, considerando-se que as uvas tratadas eram de cor púrpura escura em média e opacas, tipicamente uvas completa ou quase completamente maduras.
O gosto dessas uvas revelou que as uvas tratadas tinham um gosto típico completamente frutado de Cabernet Sauvignon madura, considerando-se que as uvas não tratadas não tinham um gosto completamente frutado. As uvas não tratadas tinham um gosto ácido de maçã verde indicando uma provável razão de ácido málico/tartárico alta inadequada para a fabricação de vinho de boa qualidade.
Essas uvas tiveram as hastes retiradas e foram moídas para preparação da produção do vinho, de modo a demonstrar a diferença dessas uvas e para demonstrar a adequação das uvas tratadas a fabricação de vinhos. O cultivador das uvas ficou ciente de que esse tratamento poderia afetar o sabor do vinho, embora por nossa sugestão ele provou as uvas tratadas um dia após a aplicação de YGPGET e não comprovou diferença no sabor ou aroma.
A diferença nas uvas tratadas e não tratadas é adicionalmente demonstrada na cor do mosto. O suco das uvas não tratadas era de cor esverdeada/incolor (algo como um mosto de vinho branco) considerando-se que o mosto das uvas tratadas tinha cor rosada típica das uvas Cabernet Sauvignon imediatamente após a trituração. Esses resultados indicam que YGP-GET foi eficaz no tratamento de vinhedos do último verão por extermínio e parada da reinfecção por míldio em lanugem, pelo menos a curto prazo.
93/96
Pesquisa adicional sobre a eficácia de longo prazo de YGP-GET no controle do míldio em lanugem seria útil, porém os resultados apresentados mostram que YGP-GET é um tratamento útil.
O míldio de lanugem de início tardio pode arruinar completamente a colheita e não existe atualmente tratamentos eficazes que possam ser aplicados a curto prazo antes da colheita e que mantenham sua capacidade de prover proteção. A grande vantagem de YGP-GET é a capacidade de prover um extermínio rápido e manter sua eficácia por um período maior que outros fungicidas de contato.
Existem no mercado vários antifungos que possuem um registro de pista estabelecido contra o míldio em lanugem, porém todos necessitam de um tempo após a aplicação antes da colheita ser realizada. Alguns tratamentos (como produtos contendo enxofre) não podem ser usados se a temperatura for superior a 29,4°C. A fitotoxicidade dos fungicidas contendo cobre é também significativa, dependendo da variedade da uva. Os fungicidas de contato não possuem um efeito de longo prazo, de modo que uma segunda aplicação de um fungicida ativo por mais tempo é freqüentemente necessária, porém pode ser restrita por regulação relevante (por exemplo, PHI ou REI).
Muitos tratamentos convencionais para míldio em lanugem possuem uma reaplicação restrita (REI e ou PHI) o que s ignif ica que o cultivador não pode aplicar o tratamento com receio de aplicar algo como Mancozeb, que possui um PHI de 66 dias; o cultivador então ficará incapaz de colher suas uvas na maturidade.
O míldio em lanugem está implicado como a causa
94/96 primária de muitos vinhos fracos que são produzidos no leste do Mississipi. YGP-GET permitiria que as uvas afetas amadurecessem completamente e fossem colhidas na maturidade nessa indústria que cresce rapidamente.
Vantajosamente, YGP-GET seria elegível para aprovação pelos vários comitês orgânicos (muitos auto promocionais) sendo adequado para uso nas uvas em crescimento de acordo com as diretrizes orgânicas, isso abre outra porta em um segmento de mercado que cresce rapidamente nos Estados Unidos e mundialmente.
Exemplo 22 - Avaliação in vitro das propriedades fungicidas de terpenos encapsulados e não encapsulados
Testes adicionais foram conduzidos para avaliar as 31 preparações de terpeno não encapsuladas estabelecidas no Exemplo 15 e preparações 16 e 22 encapsuladas em partículas de glucano.
Para conduzir esses ensaios 20.000 esporos foram colocados em caldo de dextrose de batata de 1/3 de resistência (PDB) e quantidades suficientes de formulações de terpeno selecionadas foram adicionadas para fornecer concentrações variando de 10 a 1.000 ppm. Esses materiais de teste foram colocados em tubos Ependorf tampados, estéreis e separados com esporos de Botrytis cinerea (B.c.) incubados por 24 horas, então os esporos foram recuperados por centrifugação e as soluções de terpeno foram descartadas. Os esporos/biomassa foram enxaguados com água estéril, centrifugados novamente e então tomados de novo em 300 gL de PDB a 1/3 · de resistência e transferidos para placas de 96 poços. A densidade óptica dos esporos sobreviventes crescendo dentro das micelas foi medida com o
95/96 passar do tempo. A atividade fungicida é definida como extermínio total de 20.000 esporos após 24 horas de exposição ao terpeno, conforme evidenciado pela ausência de crescimento de micela.
Os resultados sugerem que determinadas formulações não eram fungicidas a um nível estatisticamente significativo sob as presentes condições de teste (resultados não mostrados). Elas foram: 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30. Vide o Exemplo 15 (Tabela 17) para detalhes das composições.
A concentração mínima inibidora para os compostos mais eficazes foi estabelecida na tabela 26.
Tabela 25
Material Concentração Material Concentração
inibidora (ppm) mínima inibidora (ppm) mínima
3 <1000; >750 7 <1000; >750
10 <1000; >500* 13 <1000; >750
16' <1000; >750 22 <750; >500
26 <1000; >750 31 <1000; >750
*Nos testes diferentes, a menor concentração que não fornece crescimento foi de 500 ou 750 ppm.
Teste comparativo dos compostos em água e encapsulados nas partículas ocas de glucano
As amostras das formulações 16 (geraniol, eugenol e timol) e 22 (eugenol, timol e citral) encapsuladas nas partículas ocas de glucano foram preparadas de acordo com as técnicas descritas anteriormente. As propriedades fungicidas foram então avaliadas quanto as formulações
96/96 encapsuladas e não encapsuladas usando o protocolo previamente descrito para as formulações não encapsuladas.
Os resultados foram completamente diferentes com formulações de terpeno encapsuladas quando comparados aos terpenos suspensos em água, conforme mostrado na figura 24.
A concentração eficaz mínima é mostrada abaixo na
Tabela 26.
Tabela 26
Material MIC na suspensão MIC nas partículas de levedura
16 <1000, >750 <100, >250
22 <750, >500 <500, >250
Assim, os resultados com materiais 16 e 22 são muito diferentes quando na suspensão aquosa e quando testados encapsulados nas partículas de glucano. (Observação: conforme mencionado anteriormente, houve alguma variação nos resultados com terpenos suspensos em água, o experimento citado acima é um exemplo disso). Os valores da MIC são compósitos de vários experimentos. De modo importante, os resultados com formulações de terpeno não sofrem os problemas de variação associados às suspensões de terpeno aquosas. Foram obtidos cinco testes separados de terpenos suspensos em água e três com as YPs.
As formulações de terpeno encapsuladas são prontamente miscíveis em água e fornecem formulação de terpeno de liberação lenta no meio aquoso. Isso resulta em tempo de exposição mais longo dos esporos aos terpenos.
Foram encontrados problemas de monitoramento das formulações de terpeno não encapsuladas em suspensão nos meios de teste, os quais podem ter afetado os resultados.

Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composição caracterizada por compreender uma partícula de glucano oca ou partícula da parede celular oca encapsulando um componente de terpeno, em que o componente de terpeno compreende um ou mais terpenos selecionados do grupo consistindo em geraniol e timol e em que a partícula de glucano oca ou partícula da parede celular oca é derivada a partir de uma célula de levedura.
  2. 2. Composição, de acordo a reivindicação 1, caracterizada pelo fato da partícula de glucano oca ou partícula da parede celular ser uma parede celular de levedura.
  3. 3. Composição, de acordo a reivindicação 2, caracterizada pelo fato da parede da célula de levedura ser derivada de uma célula de levedura de Baker.
  4. 4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato da partícula de glucano oca ou partícula da parede celular ser um produto residual insolúvel de um processo de fabricação de extrato de levedura.
  5. 5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato da partícula de glucano oca ou partícula da parede celular ter sido extraída com álcali.
  6. 6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato da partícula de glucano oca ou partícula da parede celular ter sido extraída com ácido.
  7. 7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato da partícula
    Petição 870190023209, de 11/03/2019, pág. 10/23
    2/11 de glucano oca ou partícula da parede celular ter sido extraída com solvente orgânico.
  8. 8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato da partícula
    5 de glucano oca ou partícula da parede celular possuir um teor de lipídeo de 1% ou superior.
  9. 9. Composição, de acordo a reivindicação 8, caracterizada pelo fato do teor de lipídeos da partícula de glucano oca ou partícula da parede celular ser de 5% em
    10 peso/peso ou superior. 10. Composição, de acordo a reivindicação 9, caracterizada pelo fato do teor de lipídeos ser de 10 % em peso/peso ou superior. 11. Composição, de acordo com qualquer uma das 15 reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato do componente de terpeno compreender um terpeno que possui a fórmula geral: C10H16 12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato do 20 componente de terpeno compreender ainda eugenol. 13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato do componente de terpeno compreender uma mistura de geraniol, timol e eugenol. 25 14. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato do componente de terpeno compreender 100% de timol. 15. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato do 30 componente de terpeno compreender 50% de geraniol e 50 % de
    Petição 870190023209, de 11/03/2019, pág. 11/23
    3/11 timol em peso/peso.
    16. Composição, de acordo a reivindicação 12, caracterizada pelo fato do componente de terpeno compreender 50% de eugenol e 50% de timol em peso/peso.
    5 17. Composição, de acordo a reivindicação 12, caracterizada pelo fato do componente de terpeno compreender 33% de geraniol, 33% de eugenol e 33% de timol em peso/peso.
    18. Composição, de acordo a reivindicação 12, 10 caracterizada pelo fato do componente de terpeno compreender 33% de eugenol, 33% de timol e 33% de citral em peso/peso.
    19. Composição, de acordo a reivindicação 12, caracterizada pelo fato do componente de terpeno
    15 compreender 25% de geraniol, 25% de eugenol, 25% de timol e 25% de citral em peso/peso.
    20. Composição, de acordo a reivindicação 12, caracterizada pelo fato do componente de terpeno compreende 20% de geraniol, 20% de eugenol, 20% de citral, 20% de
    20 timol e 20% de L-carvona em peso/peso.
    21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato do componente de terpeno estar associado a um agente tensoativo.
    25 22. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato do agente tensoativo ser selecionado do grupo consistindo em lauril sulfato de sódio, polissorbato 20, polissorbato 80, polissorbato 40, polissorbato 60, éster poliglicerílico,
    30 monooleato de poliglicerila, monocaprilato de
    Petição 870190023209, de 11/03/2019, pág. 12/23
    4/11 decaglicerila, dicaprilato de propileno glicol, monoestearato de triglicerol, monooleato de polioxietilenossorbitano, monolaurato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano, monoestearato de sorbitano,
    5 monooleato de sorbitano, lauril éter de polioxietileno (4) ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos.
    23. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada por compreender 1 a 99% em volume de terpenos, 0 a 99% em volume de agente
  10. 10 tensoativo e 1 a 99% de partículas de glucano ocas. 24. Composição, de acordo a reivindicação 23, caracterizada por compreender 10 a 67% de terpenos em peso/peso, 0,1 a 10% de agente tensoativo em peso/peso e 40 a 90% de partículas de glucano ocas em peso/peso.
    15 25. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada por ser apropriada para exterminar bactérias ou fungos.
    26. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada por ser apropriada
    20 para exterminar mofo.
    27. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada por ser apropriada para exterminar micoplasma.
    28. Composição, de acordo com qualquer uma das 25 reivindicações 1 a 27, caracterizada pelo fato dos terpenos usados serem de classificação alimentícia.
    29. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada por compreender um composto ativo adicional de classificação alimentícia.
    30 30. Composição, de acordo com a reivindicação 29,
    Petição 870190023209, de 11/03/2019, pág. 13/23
    5/11 caracterizada pelo fato do composto ativo adicional de classificação alimentícia ser um agente ou enzima antimicrobiana.
    31. Composição, de acordo com qualquer uma das
    5 reivindicações 1 a 30, caracterizada por compreender um agente antimicrobiano, um agente antifungos, um agente inseticida, um agente antiinflamatório ou um anestésico.
    32. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, 10 antioxidante. caracterizada por compreender um 33. Composição, de acordo a reivindicação 32,
    caracterizada pelo fato do antioxidante ser óleo de alecrim, vitamina C ou vitamina E.
    34. Composição, de acordo com qualquer uma das
    15 reivindicações 1 a 33, caracterizada por estar na forma de um pó seco.
    35. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizada por se encontrar em forma de microesfera, comprimido ou outra forma sólida.
    20 36. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizada por compreender um agente de dispersão que promove a dispersão da composição quando colocada em um líquido.
    37. Composição, de acordo com qualquer uma das
    25 reivindicações 1 a 36, caracterizada por estar combinado com um veículo agrícola, alimentício ou farmaceuticamente aceitável ou excipiente em uma forma líquida, sólida ou semelhante a gel.
    38. Composição, de acordo com qualquer uma das uma
    30 das reivindicações 1 a 33, caracterizada por ser suspensa
    Petição 870190023209, de 11/03/2019, pág. 14/23
    6/11 ou dissolvida em um líquido.
    39. Composição, de acordo a reivindicação 38, caracterizada pelo fato do líquido ser água.
    40. Composição, de acordo com a reivindicação 38 ou
    5 39, caracterizada por compreender partículas de glucano ocas ou partículas de parede celular de 500 a 10.000 ppm, em que as partículas contêm 1 a 67% de componente de terpeno.
    41. Composição, de acordo a reivindicação 40,
    10 caracterizada por compreender partículas de glucano ocas ou partículas de parede celular de 1.000 a 2.000 ppm, em que as partículas contêm 10 a 50% de componente de terpeno em peso/peso.
    42. Composição, de acordo com qualquer uma das
    15 reivindicações 38 a 41, caracterizada por compreender entre
    1 ppm e 25 ppt do componente de terpeno.
    43. Composição, de acordo a reivindicação 42, caracterizada por compreender entre 100 a 1.000 ppm do componente de terpeno.
    20 44. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada por ser dispersa em água, salmoura, dextrose aquosa, glicerol ou etanol para formar uma solução ou suspensão.
    45. Composição, de acordo qualquer uma das
    25 reivindicações 1 a 44, caracterizada por incluir um agente umectante, um agente emulsionante ou um agente de tamponamento de pH.
    46. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizada por ser dispersa em um
    30 alimento líquido para seres humanos ou animais ou
    Petição 870190023209, de 11/03/2019, pág. 15/23
    7/11 substância para beber.
    47. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 46, caracterizada por estar na forma apropriada para administração oral.
    5 48. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizada por estar na forma apropriada para administração parenteral.
    49. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizada por estar na forma
    10 apropriada para administração tópica.
    50. Método para preparação de uma partícula de glucano oca ou partícula da parede celular oca encapsulando um componente de terpeno conforme definida na reivindicação 1, o método caracterizado por compreender as etapas de:
    15 a) provisão de um componente de terpeno, em que o componente de terpeno compreende um ou mais terpenos selecionados do grupo consistindo em geraniol e timol;
    b) provisão de uma partícula de glucano oca ou partícula da parede celular oca derivada de células de
    20 levedura;
    c) incubação do componente de terpeno com a partícula de glucano ou partícula da parede celular sob condições desejáveis para encapsulamento do terpeno; e
    d) recuperação da partícula de glucano ou partícula 25 da parede celular encapsulando o componente de terpeno.
    51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado por compreender ainda a etapa de secagem da partícula de glucano ou partícula da parede celular encapsulando o componente de terpeno.
    30 52. Método, de acordo com a reivindicação 51,
    Petição 870190023209, de 11/03/2019, pág. 16/23
    8/11 caracterizado pelo fato da secagem ser obtida por liofilização, secagem de leito fluidificado, secagem em tambor ou secagem por aspersão.
    53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 52, caracterizado pelo fato de, na etapa a) o componente de terpeno ser provido como uma suspensão em um solvente aquoso. 54. Método, de acordo com a reivindicação 53,
    caracterizado pelo fato do componente de terpeno ser
    10 provido em associação com um agente tensoativo.
    55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato do agente tensoativo ser monooleato de polioxietilenossorbitano, a uma concentração de 0,1 a 10% em volume da mistura de reação total.
    15 56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 52, caracterizado pelo fato de, na etapa a) o componente ser provido como uma solução verdadeira no solvente aquoso.
    57. Método de acordo com qualquer uma das
    20 reivindicações 50 a 56, caracterizado pelo fato de na etapa
    b) a partícula de glucano oca ou partícula da parede celular ser provida como uma suspensão em água ou outro líquido apropriado.
    58. Método, de acordo com a reivindicação 57,
    25 caracterizado pelo fato da suspensão compreender aproximadamente 1 a 1.000 mg de partículas de glucano ou partículas da parede celular por mL.
    59. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato das partículas serem dispersas em
    30 um volume a partir do volume hidrodinâmico volume (HV) para
    Petição 870190023209, de 11/03/2019, pág. 17/23
    9/11
    1,5 HV do líquido.
    60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 56, caracterizado pelo fato de na etapa
    b) a partícula de glucano oca ou partícula da parede 5 celular ser provida como um pó seco.
    61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 60, caracterizado pelo fato de na etapa
    c) a reação ser realizada em pressão atmosférica, a uma temperatura de 20 a 37°C.
    10 62. Método para tratar ou prevenir infecção de uma planta, o método caracterizado por compreender a etapa de:
    - administração, em uma dose terapeuticamente eficaz, de uma composição conforme definida na reivindicação 1, compreendendo uma partícula de glucano oca ou partícula da
    15 parede celular oca encapsulando um componente de terpeno, à planta ou ao solo próximo a planta, em que o componente de terpeno compreende um ou mais terpenos selecionados do grupo consistindo em geraniol e timol e em que a partícula de glucano oca ou partícula de parede celular oca é
    20 derivada de uma célula de levedura.
    63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato da infecção da planta ser causada por um nematóide.
    64. Método, de acordo com a reivindicação 62,
    25 caracterizado pelo fato da infecção de uma planta ser causada por um fungo.
    65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato do fungo ser míldio em lanugem, míldio pulverulento ou “botrytis bunch rot”.
    3 0 66. Método, de acordo com qualquer uma das
    Petição 870190023209, de 11/03/2019, pág. 18/23
    10/11 reivindicações 62 a 65, caracterizado pelo fato da planta ser uma parreira.
    67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 66, caracterizado pelo fato da 5 composição ser administrada 21 dias ou menos antes da colheita da planta. 68 . Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato da composição ser administrada 14 dias ou menos antes da colheita. 10 69. Método, de acordo com a reivindicação 68,
    caracterizado pelo fato da composição ser administrada 7 dias ou menos antes da colheita.
    70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato da composição ser administrada 3
    15 dias ou menos antes da colheita.
    71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 70, caracterizado pelo fato da composição ser administrada por aspersão.
    72. Método, de acordo com a reivindicação 71, 20 caracterizado pelo fato da composição ser aspergida a uma razão de 500 L/Ha ou superior.
    73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato da composição ser aspergida a uma razão de 900 L/Ha ou superior.
    25 74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato da composição ser aspergida a uma razão de 1.200 L/Ha ou superior.
    75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 70, caracterizado pelo fato da
    30 composição ser administrada através de irrigação.
    Petição 870190023209, de 11/03/2019, pág. 19/23
  11. 11/11
    76. Composição caracterizada por compreender uma partícula de glucano oca encapsulando um componente de terpeno para uso na prevenção ou tratamento de uma infecção em uma planta em que a composição é definida conforme
    5 qualquer uma das reivindicações 1 a 49.
BRPI0511441A 2004-05-20 2005-05-20 composições contendo uma partícula de glucano oca ou partícula de parede celular encapsulando um componente de terpeno, métodos de fabricação e uso das mesmas BRPI0511441B8 (pt)

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