DE112015004182T5 - Antimykotische Zusammensetzung umfassend antimykotisches Peptid und Terpenalkohol - Google Patents

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Keishi Iohara
Makoto Mitarai
Shigeru Abe
Kazumi Hayama
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Teikyo University
Maruha Nichiro Corp
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Abstract

Eine Zusammensetzung mit einer gesteigerten antimykotischen Aktivität, welche Peptide wie ein Protaminhydrolysat umfasst und welche bei niedrigen Kosten für industrielle Verwendung geeignet ist, kann unter Verwendung einer Kombination von einem Protaminhydrolysat und einem Terpenalkohol als ein Wirkstoff einer Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität bereitgestellt werden.

Description

  • Bereich der Technik
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität, umfassend eine Kombination von einem Protaminhydrolysat und einem Terpenalkohol. Die Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität kann weithin in funktionellen Lebensmitteln, Kosmetika, Arzneistoffen, Quasi-Arzneistoffen, usw. zur Vorbeugung oder Behandlung von Pilzinfektionserkrankungen verwendet werden.
  • Stand der Technik
  • Hefen und Fadenpilze sind Eukaryoten und werden als ein Pilz, im Gegensatz zu Bakterien als Prokaryoten, bezeichnet. Einige Pilzspezies zeigen bei Menschen Pathogenität, wobei sie verursachende Mikroorganismen sind, die eine Pilzinfektion verursachen. Unter Pilzen wächst die Pilzgattung Candida weithin in humanen Verdauungstrakten und zeigt normalerweise keine Pathogenität. Jedoch ist bekannt, dass der Pilz Candida verschiedene Erkrankungen verursacht, wenn die Verteidigungsfunktion des Wirts schwächer wird. Insbesondere orale, pharyngeale und ösophageale Candidosen sind Erkrankungen, die allgemein aufgrund von verringerter Speichelsekretion, Diabetes mellitus, chronischer Verabreichung von Antibiotika oder immunsuppressiven Mitteln, Verringerung der Mundhygiene, usw. auftreten.
  • Als das antimykotische Mittel, welches zur Behandlung von Mykosen als ein internes antimykotisches Mittel verwendet wird, werden Amphotericin B als ein Mittel vom Polyen-Typ, Flucytosin als ein Mittel vom Fluorpyridin-Typ, Miconazol als ein Mittel vom Imidazol-Typ (Azol-Typ), Fluconazol als ein Mittel vom Triazol-Typ (Azol-Typ), Itraconazol als ein Mittel vom Azol-Typ, usw. herkömmlicherweise in der klinischen Praxis verwendet. Die Art der erkrankungsverursachenden Pilze, auf welche diese antimykotischen Mittel zielgerichtet sind, und die Arzneistoffempfindlichkeit von jedem der erkrankungsverursachenden Pilze variieren abhängig von jedem antimykotischen Mittel. Die repräsentativen Pilze, auf welche diese antimykotischen Mittel zielgerichtet sind, schließen zum Beispiel die Gattung Candida, die Gattung Cryptococcus, die Gattung Aspergillus, die Gattung Trichophyton, die Gattung Malassezia, die Gattung Coccidioides, usw. ein. Jedoch wird bei Behandlungen unter Verwendung dieser antimykotischen Mittel, obwohl Infektionen durch Pilze temporär geheilt werden, in den meisten Fällen ein Wiederauftreten beobachtet und bei Langzeitverwendung tritt ein arzneistoffresistenter Stamm auf. Folglich führen diese Probleme dazu, dass neue Behandlungsverfahren eingeführt werden müssen. Ferner sind orale Candidosen, welche bei alten Menschen vorgefunden werden, insbesondere bei Trägern von Zahnprothesen, Erkrankungen, die wieder auftreten, sogar wenn eine temporale therapeutische Wirkung beobachtet wird, solange der Grund für die erhöhte Empfindlichkeit nicht beseitigt wird. Es war erforderlich, neue prophylaktische Mittel wie eine Mundspülung, ein funktionelles Lebensmittel, usw. als eine Alternative für das antimykotische Mittel zu entwickeln (Nicht-Patentliteratur 1).
  • Hingegen ist Protamin ein basisches Protein mit einer antimykotischen Aktivität, das von Fischhoden (Fischmilch) erhalten wird, und es ist ein Lebensmittelkonservierungsstoff, der von natürlichen Produkten abgeleitet ist (Patentliteratur 1). Die Fischmilch als ein Rohmaterial für Protamin verfügt über eine Tradition in der Geschichte des Essens und wird als ein Bestandteil des Kochens im Kochtopf gegessen. So wurden ein Test auf akute Toxizität für Mäuse und ein Test auf subchronische Toxizität für Ratten unter Verwendung der Fischmilch durchgeführt (Nicht-Patentliteratur 2). Da ihre Sicherheit bestätigt wurde, ist Protamin ein antibakterielles Mittel, das im Hinblick auf den Sicherheitsaspekt ausgezeichnet ist (Nicht-Patentliteratur 3). Es ist bekannt, dass Protamin eine besonders starke antibakterielle Aktivität gegen Gram-positive Bakterien wie die Gattung Bacillus, Lactobacillus, usw. unter Mikroorganismen zeigt (Nicht-Patentliteratur 4), aber Protamin zeigt eine sehr schwache antimykotische Aktivität gegen Hefen und Fadenpilze (Nicht-Patentliteratur 5).
  • Ein Verfahren von Hydrolysieren von Protamin zum Steigern der antimykotischen Aktivität von Protamin ist bekannt, und es wurde berichtet, dass die folgenden Peptide (1) bis (3) oder Salze davon, welche in dem Hydrolysat enthalten sind, eine antimykotische Wirkung aufweisen (Patentliteratur 1).
    • (1) Ein Peptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1, dargestellt durch Ile Arg Arg Arg Arg Pro Arg Arg, oder ein Salz davon.
    • (2) Ein Peptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, dargestellt durch Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg, oder ein Salz davon.
    • (3) Ein Peptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3, dargestellt durch Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg, oder ein Salz davon.
  • Auf der anderen Seite wurde erkannt, dass ein Peptid, das eine spezielle Aminosäuresequenz enthält, die durch Hydrolysieren von Protamin erhalten wird, in vitro eine hohe antibakterielle Aktivität, aber in vivo eine Tendenz zur Verringerung der Aktivität, insbesondere unter einer hohen Salzkonzentration, zeigte (Nicht-Patentliteratur 1). Dann wurde von einem Verfahren von Synthetisieren eines Peptids für Zirkularisation, um seine antibakterielle Aktivität in vivo zu steigern, berichtet (Nicht-Patentliteratur 6).
  • Auf der anderen Seite ist bekannt, dass bestimmte Arten von ätherischen Pflanzenölen oder Komponenten von ätherischen Ölen die Hautpenetration von anderen Arzneistoffen steigern. Es wurde berichtet, dass, wenn ein antimykotisches Mittel in Kombination mit einem ätherischen Öl oder einem Terpenalkohol mit einer antimykotischen Aktivität zum Steigern der therapeutischen Wirkung von herkömmlichen antimykotischen Mitteln verwendet wurde, sich die Hautpermeabilität eines Arzneistoffes erhöhte und seine Blutkonzentration beträchtlich gesteigert wurde (Patentliteratur 2). Der Terpenalkohol, aufweichen hier Bezug genommen wird, ist ein Monoterpenalkohol mit 10 Kohlenstoffatomen in einem Molekül und ein Sesquiterpenalkohol mit 15 Kohlenstoffatomen in einem Molekül. Zum Beispiel ist bekannt, dass sowohl Palmarosaöl als auch sein Hauptbestandteil Geraniol beträchtlich die Blutkonzentration von Terbinafin, ein antimykotisches Mittel, das auf die Haut verabreicht wird, steigern. Es ist bekannt, dass alle von Lavendelöl und sein Hauptbestandteil Linalool; Patchouliöl und sein Hauptbestandteil Patchoulialkohol; und Öl Lindera umbellata und sein Nebenbestandteil Nerolidol die gleiche Wirkung aufweisen, obwohl deren Ausmaß variiert (Patentliteratur 2).
  • Candidosen auf Haut und Schleimhautmembran, insbesondere orale Candidosen bei alten Menschen und vaginale Candidosen bei Frauen weisen jeweils eine sehr hohe Inzidenzhäufigkeit auf. Im Allgemeinen werden sie durch direktes Inkontaktbringen eines antimykotischen Mittels mit einer betroffenen Fläche behandelt, obwohl sie therapierefraktär sind und dazu neigen, wiederholt aufzutreten. Als ein Ergebnis einer Verwendung des Arzneistoffes für einen langen Zeitraum zum Unterdrücken des Wiederauftretens treten Nebenwirkungen wie Leberfunktionsstörungen auf, und das Risiko des Auftretens eines arzneiresistenten Stammes erhöht sich.
  • Referenzliste
  • Patentliteratur
    • Patentliteratur 1: Japanisches Patent Nr. 4520477
    • Patentliteratur 2: JP-A Nr. 2010-126532
  • Nicht-Patentliteratur
    • Nicht-Patentliteratur 1: Abe shigeru: Development of mouse oral candidiasis model and application thereof, Fungus Journal, 45, 227–231 (2004)
    • Nicht-Patentliteratur 2: Tada yukie, et al.: Subchronic toxicity test by rat of naturaI preservative milt Protein, Tokyo Metropolitan Institute of Public Health, jährlicher Forschungsbericht, 49, 267–276 (1998)
    • Nicht-Patentliteratur 3: Iohara keiji, Nemoto erika: Use of milt protein (protamine) for food, monatliche Veröffentlichung von Food Chemical, Ausgabe April, 24–32 (2006)
    • Nicht-Patentliteratur 4: Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 50, 1715 (1984)
    • Nicht-Patentliteratur 5: Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 52, 1061 (1986)
    • Nicht-Patentliteratur 6: 57. Hauptversammlung von The Japanese Society for Medical Mycology, Abstraktsammlung des akademischen Meetings, 98 (2013)
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Problem, das durch die Erfindung gelöst wird
  • Eine Behandlung unter Verwendung eines Peptids, das durch Hydrolysieren von Protamin erhalten wird, und eines Bestandteils eines ätherischen Öls hat den Vorteil, dass Nebenwirkungen und das Risiko des Auftretens eines arzneistoffresistenten Stammes niedrig sind. Jedoch weisen solche natürlich vorkommenden Bestandteile im Allgemeinen in manchen Fällen eine niedrigere antimykotische Aktivität als antimykotische Mittel mit einer chemisch synthetisierten Nicht-Peptidverbindung als einen Wirkstoff auf. Folglich ist es notwendig, die antimykotische Aktivität in solchen vorstehenden Fällen weiter zu steigern. Ferner war Zyklisierung eines Peptids zum Sicherstellen einer Aktivität in vivo unter hoher Salzkonzentration wie in Nicht-Patentliteratur 6 offenbart nicht für eine industrielle Verwendung eines antimykotischen Mittels bei niedrigen Kosten geeignet, da die Synthese eines zyklisierten Peptids hohe Kosten mit sich bringt.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung, die als einen Wirkstoff ein Protaminhydrolysat umfasst und eine antimykotische Aktivität aufweist, wobei die Zusammensetzung eine weiter verbesserte antimykotische Aktivität zeigt und für eine industrielle Verwendung bei niedrigen Kosten geeignet ist.
  • Mittel zur Lösung des Problems
  • Die Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität (antimykotische Zusammensetzung) gemäß der vorliegenden Erfindung ist gekennzeichnet durch Umfassen eines Protaminhydrolysats und eines Terpenalkohols als einen Wirkstoff.
  • Die vorliegende Erfindung schließt ferner die folgenden Ausführungsformen ein.
    • (1) Ein antimykotisches Mittel, umfassend die vorstehend beschriebene antimykotische Zusammensetzung.
    • (2) Ein Lebensmittelprodukt, enthaltend die vorstehend beschriebene antimykotische Zusammensetzung.
    • (3) Ein pharmazeutisches Produkt oder ein Arzneistoff oder ein quasi-pharmazeutisches Produkt oder ein Quasi-Arzneistoff, umfassend die vorstehend beschriebene antimykotische Zusammensetzung.
    • (4) Ein Kosmetikum, enthaltend die vorstehend beschriebene antimykotische Zusammensetzung.
    • (5) Ein Verfahren von Verwenden der vorstehend beschriebenen antimykotischen Zusammensetzung als ein Wirkstoff zum Erhalten einer antimykotischen Aktivität in der Herstellung eines Lebensmittelprodukts oder eines Kosmetikums.
    • (6) Ein Verfahren von Verwenden der vorstehend beschriebenen antimykotischen Zusammensetzung als ein Wirkstoff zum Erhalten einer antimykotischen Aktivität in der Herstellung eines pharmazeutischen Produkts oder eines quasi-pharmazeutischen Produkts.
  • Wirkung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung kann eine Zusammensetzung bereitstellen, welche nicht nur eine beträchtlich gesteigerte antimykotische Aktivität durch eine synergistische Wirkung eines Protaminhydrolysats, das durch Hydrolyse von Protamin erhalten wird, mit einem Terpenalkohol aufweist, sondern auch eine sehr hohe Sicherheit aufweist, ohne Probleme wie das Auftreten eines arzneistoffresistenten Stammes oder einer Nebenwirkung. Die beabsichtigten Verwendungen des betreffenden Antimykotikums schließen Materialien für die Mundpflege mit einer antimykotischen Wirkung (Mundspülung, Zahncreme, Zahnprothesen-Reinigungsmittel, usw.), pharmazeutische Produkte gegen Pilzinfektionserkrankungen wie Dekubitus, vaginale Candidose, ösophageale Candidose, usw. (antimykotisches Mittel), quasi-pharmazeutische Produkte (Mundspülung, Mundreinigungsmittel, medizinisches Zahnpulver, usw.) und Kosmetika (Salbe, Flüssigkeit, Suspension, Emulsion, Aerosol, Schaum, Granula, Pulver, Tablette, Kapsel, usw.) ein. Orale Candidose ist ein Symptom, das besonders bei alten Menschen und Patienten mit trockenem Mund auftritt, und Erfordernisse dafür sind in der weiter alternden Gesellschaft groß. Darüber hinaus ist es möglich, die vorliegende Erfindung nicht nur bei oraler Candidose zu verwenden, sondern auch bei anderen Pilzinfektionserkrankungen wie Candidosen wie Dekubitus, vaginale Candidose, ösophageale Candidose, usw., Malasseziose, Cryptococcus-Infektion, usw., wobei es möglich ist, pathologische Zustände zu verbessern und zu behandeln und Infektion vorzubeugen. Da Protamin in einer Liste von bestehenden Additiven für Lebensmittelkonservierungsstoffe beschrieben wird, ist es möglich, Protamin nicht nur in pharmazeutischen Produkten und quasi-pharmazeutischen Produkten, sondern auch in Mundspülungen und funktionellen Lebensmitteln wie gesunden Lebensmittelprodukten oder Lebensmittel-Produkten für spezielle Gesundheitsverwendung zu verwenden, und es besteht der Vorteil, dass Protamin leicht erhältlich und für Patienten leicht zu verwenden ist.
  • Kurze Erläuterung der Zeichnungen
  • 1 ist ein Graph, der den relativen Wert einer antibakteriellen Aktivität bei in vitro-Bewertung, wenn ein Protaminhydrolysat und Hinokitiol in Kombination verwendet werden, zeigt.
  • 2 ist ein Graph, der den relativen Wert einer antibakteriellen Aktivität bei in vitro-Bewertung, wenn ein Protaminhydrolysat und Terpinen-4-ol in Kombination verwendet werden, zeigt.
  • 3 ist ein Graph, der den relativen Wert einer antibakteriellen Aktivität bei in vitro-Bewertung, wenn ein Protaminhydrolysat und Geraniol in Kombination verwendet werden, zeigt.
  • 4 ist ein Graph, der den relativen Wert einer antibakteriellen Aktivität bei in vitro-Bewertung, wenn ein Protaminhydrolysat und Menthol in Kombination verwendet werden, zeigt.
  • 5 ist ein Graph, der den relativen Wert einer antibakteriellen Aktivität bei in vitro-Bewertung, wenn ein Protaminhydrolysat und Zimtaldehyd in Kombination verwendet werden, zeigt.
  • 6 ist ein Graph, der den relativen Wert einer antibakteriellen Aktivität bei in vitro-Bewertung, wenn ein Protaminhydrolysat und Caprinsäure in Kombination verwendet werden, zeigt.
  • 7 ist ein Graph, der den relativen Wert einer antibakteriellen Aktivität bei in vitro-Bewertung, wenn ein Protaminhydrolysat alleine verwendet wird, zeigt.
  • 8 ist ein Bild, das den Wert eines Zungen-Score bei in vivo-Bewertung, wenn ein Protaminhydrolysat und Hinokitiol in Kombination verwendet werden, zeigt (*: p < 0,05 gemäß Steel Dwass-Verfahren).
  • 9 ist ein Graph, der die Ergebnisse bei in vitro-Bewertung, wenn ein Protaminhydrolysat und Hinokitiol in Kombination verwendet werden, zeigt.
  • 10 ist ein Graph, der die Ergebnisse bei in vitro-Bewertung, wenn ein Protaminhydrolysat und Hinokitiol in Kombination verwendet werden, zeigt.
  • 11 ist ein Graph, der die Ergebnisse bei in vitro-Bewertung von verschiedenen Protamin-Abbauprodukten zeigt.
  • 12 ist ein Bild, das die Ergebnisse einer Betrachtung eines Zungengewebeschnitts durch ein optisches Mikroskop, wenn ein Protaminhydrolysat und Hinokitiol in Kombination verwendet werden, zeigt.
  • Beschreibung von Ausführungsformen
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass, wenn ein Protaminhydrolysat, das durch Hydrolysieren von Protamin erhalten wird, und ein Terpenalkohol in Kombination zum Lösen des vorstehend beschriebenen Problems von natürlich vorkommenden Bestandteilen verwendet wurden, eine antimykotische Aktivität beträchtlich gesteigert wurde und dass die gesteigerte Wirkung eine synergistische Wirkung war, die über eine additive Wirkung, welche durch die einfache kombinierte Verwendung verursacht wird, hinausging, was zu der vorliegenden Erfindung führte.
  • Obwohl es bereits bekannt war, dass alle von einem Protaminhydrolysat und einem Terpenalkohol eine Wirkung gegen Candida aufweisen, wenn sie einzeln verwendet werden, wurde über einen Befund, dass eine antimykotische Aktivität synergistisch gesteigert wurde, als diese in Kombination verwendet wurden, bisher noch nicht berichtet. Im Allgemeinen steht die Definition einer synergistischen Wirkung, wenn ein Mikroorganismus in Kombination mit einer antibakteriellen Substanz verwendet wird, für einen Fall, der eine signifikant größere Wirkung zeigt als die Summe der einzelnen Wirkungen der zwei Mittel. Ein Kriterium für die Bewertung der Gegenwart oder Abwesenheit einer synergistischen Wirkung ist der FIC-Index (anteilsmäßige Hemmung/Konzentration-Index), bestimmt aus MIC-Werten von zwei Mitteln. Der FIC-Index kann durch die folgende Formel (1) bestimmt werden.
  • Verfahren zur Bestimmung des FIC-Index
  • FIC-Index = A1/A0 + B1/B0 (1) A0: MIC, wenn Mittel A alleine verwendet wird
    A1: MIC von Mittel A, wenn Mittel A und Mittel B in Kombination verwendet werden
    B0: MIC, wenn Mittel B alleine verwendet wird
    B1: MIC von Mittel B, wenn Mittel A und Mittel B in Kombination verwendet werden Bewertung einer synergistischen Wirkung durch den FIC-Index
    FIC ≤ 0,5: synergistische Wirkung
    0,5 < FIC ≤ 1,0: additive Wirkung
    1,0 < FIC ≤ 2,0: keine Beziehung
    2,0 < FIC: antagonistische Wirkung
  • Ferner haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, dass sich die synergistische Wirkung zum Verbessern einer antimykotischen Aktivität durch die kombinierte Verwendung eines Protaminhydrolysats und eines Terpenalkohols nicht nur in einem herkömmlichen in vitro-Bewertungssystem manifestierte, sondern auch in einem biologischen Modell unter Verwendung eines Mausmodells für orale Candidose, und darauf basierend haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die vorliegende Erfindung vervollständigt. Das heißt, dass gefunden wurde, dass, wenn ein Protaminhydrolysat und ein Terpenalkohol oral in Kombination verabreicht wurden, die Bildung von einem weißen moosartigen Belag auf einer Mauszunge signifikant unterdrückt wurde, und dass eine antimykotische Wirkung synergistisch verbessert wurde, basierend auf einem Phänomen, dass ein weißer moosartiger Belag (Candida-Pilzhyphe) auf einer Zunge beobachtet wurde, als ermöglicht wurde, dass orale Candidose bei der Maus auftritt. Zusätzlich haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestätigt, dass ein Protaminhydrolysat eine antibakterielle Aktivität gegen Pilze der Gattung Malassezia aufweist.
  • Ätherische Öle als ein Testmaterial, welches in Kombination mit einem Protaminhydrolysat verwendet wird, wurden zuerst in dem in vitro-Bewertungssystem zum Untersuchen der vorstehend beschriebenen synergistischen Wirkung gescreent. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass eine antimykotische Aktivität durch Verwenden eines Protaminhydrolysats in Kombination mit einem Terpenalkohol wie Hinokitiol, Terpinen-4-ol, Geraniol, Menthol, usw. synergistisch verbessert wird. Hingegen wurde keine Verbesserung einer antimykotischen Aktivität bei der kombinierten Verwendung mit ätherischen Ölen wie Zimtaldehyd und Caprinsäure, die nicht als Terpenalkohole klassifiziert werden, bestätigt. Dann wurde die kombinierte Verwendung eines Protaminhydrolysats und von Hinokitiol in einem biologischen Modell unter Verwendung einer Modellmaus für orale Candidose bewertet. Als ein Ergebnis wurde eine bemerkenswerte Verbesserung des Zungen-Score aufgrund einer synergistischen Wirkung erkannt und das Aufrechterhalten der synergistischen Aktivität unter hoher in vivo-Salzkonzentration wurde bestätigt. Wie vorstehend beschrieben zogen die Erfinder der vorliegenden Erfindung in Betracht, dass die kombinierte Verwendung eines Protaminhydrolysats und eines Terpenalkohols in praktischer Hinsicht gegenüber herkömmlichen Technologien einen erfinderischen Schritt einbezieht, basierend auf der antimykotischen Wirkung, die bei der gleichen Dosierung oder bei einer viel niedrigeren Dosierung im Vergleich mit den verwendeten Mengen, als die herkömmlichen Peptidzusammensetzungen oder die herkömmlichen ätherischen Öle verwendet wurden, verbessert ist. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die vorliegende Erfindung durch die vorstehende Überlegung erreicht.
  • Als Nächstes wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
  • Protamin als ein Rohmaterial eines Protaminhydrolysats ist ein stark basisches Protein, das in der Form eines Nucleoprotamin vorhanden ist, gebunden an Deoxyribonucleinsäure im Samenzellkern von Fisch wie Lachs, Hering, Forelle, usw., und wird zum Beispiel Salmin (Lachs), Clupein (Hering), usw. abhängig von einem Unterschied des Rohmaterials genannt, und obwohl die Struktur leicht voneinander variiert, kann jedes Protamin verwendet werden.
  • Zur Hydrolyse von Protamin kann alternativ eine Säure, eine Base oder ein proteolytisches Enzym verwendet werden. Zersetzung durch eine Kombination davon kann verwendet werden, aber die Verwendung eines proteolytischen Enzyms ist wünschenswert. Genauer werden die folgenden Prozeduren verwendet.
  • Im Falle einer Hydrolyse mit einer Säure oder einer Base wird ein Protamin unter einer Bedingung, so dass ein Peptid mit einer beabsichtigten Größe (Länge) erhalten wird, in der Gegenwart einer starken Säure oder einer starken Base erwärmt. Die Produkte werden neutralisiert und so kann ein Peptid mit einer beabsichtigten Größe (Länge) erhalten werden.
  • Deionisiertes Wasser wird zu einem Protamin gegeben und Natriumhydroxid oder Salzsäure wird zugegeben, um den pH-Wert auf einen Wert einzustellen, bei welchem eine enzymatische Aktivität erhalten wird, bevorzugt auf den optimalen pH-Wert. Die Reaktionslösung wird bei einer Temperatur erwärmt, bei welcher eine enzymatische Aktivität erhalten wird, wobei bevorzugt bei der optimalen Temperatur eines Enzyms erwärmt wird, dann wird ein Enzym zugegeben und eine enzymatische Umsetzung wird während Rühren durchgeführt. Nach der Vollendung der Umsetzung wird die Reaktionsflüssigkeit bei 80 bis 100°C erwärmt und thermisch 5 bis 60 Minuten lang deaktiviert und der pH-Wert wird auf den neutralen Bereich eingestellt, dann wird die Reaktionsflüssigkeit gefriergetrocknet, so dass ein Protaminhydrolysat erhalten werden kann. Es ist bevorzugt, dass die enzymatische Hydrolysereaktion durchgeführt wird, bis ein argininreiches Peptid, bestehend aus etwa 5 bis 14 Aminosäureresten, erhalten wird, und durch therm ische Deaktivierung des Enzyms gestoppt wird.
  • Bestandteile, die in dem wie vorstehend beschrieben erhaltenen Protaminhydrolysat enthalten sind, können als ein Wirkstoff einer antimykotischen Zusammensetzung verwendet werden. Deshalb kann das Protaminhydrolysat in den nachstehend aufgelisteten Formen verwendet werden.
    • (1) Eine Reaktionsflüssigkeit mit einem pH-Wert, der nach thermischer Deaktivierung des vorstehend beschriebenen Enzyms eingestellt wird.
    • (2) Ein gefriergetrocknetes Produkt der vorstehend beschriebenen Reaktionsflüssigkeit.
    • (3) Eine Zubereitung, die durch Entfernen eines Enzymproteins von der vorstehend beschriebenen Reaktionsflüssigkeit oder dem vorstehend beschriebenen gefriergetrockneten Produkt erhalten wird.
    • (4) Eine Zubereitung, die durch Überführen des Peptids in seine Salzform in der vorstehenden Reaktionsflüssigkeit, dem vorstehenden gefriergetrockneten Produkt oder der vorstehenden Zubereitung erhalten wird.
  • Das proteolytische Enzym, das zur Hydrolyse in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, schließt zum Beispiel Enzyme, die durch die Gattung Bacillus (zum Beispiel Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus, Bacillus licheniform is, usw.) hergestellt werden, Enzyme, die durch die Gattung Aspergillus (zum Beispiel Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus melleus, usw.) hergestellt werden, Enzyme, die durch die Gattung Rhizopus (zum Beispiel Rhizopus niveus, Rhizopus delemar, usw.) hergestellt werden, Pepsin, Pancreatin, Papain, usw. ein. Diese Enzyme können jeweils einzeln verwendet werden oder zwei oder mehr von ihnen können kombiniert werden. Das proteolytische Enzym ist klassifiziert in eine Endopeptidase, welche spezifisch eine innere Sequenz eines Proteins erkennt und ausschneidet, und eine Exopeptidase, welche immer 1 bis 2 Aminosäurereste vom Ende abschneidet. Deshalb ist es möglich, verschiedene Peptidketten durch eine Kombination einer Endopeptidase und einer Exopeptidase zu bilden, wie notwendig. Im Falle einer Hydrolyse mit einem Enzym wird ein Enzym in einer Menge von 0,001 bis 10 Masse-%, bezogen auf ein Substrat, zugegeben und die Lösung wird auf den optimalen pH-Wert de(s/r) verwendeten Enzym(s/e) eingestellt und die Hydrolyse wird durchgeführt.
  • Ein Peptid, das in einem Protaminhydrolysat enthalten ist, kann, falls notwendig, in die Form eines Salzes mit einer anorganischen Säure oder einer organischen Säure oder eines Salzes mit einer anorganischen Base oder einer organischen Base umgewandelt werden und als ein Wirkstoff eines antimykotischen Mittels verwendet werden. Die Säure und die Base können abhängig von den Verwendungen des Salzes ausgewählt werden, und wenn die Verwendung in Lebensmittelprodukten, Kosmetika, pharmazeutischen Produkten, usw. in Betracht gezogen wird, sind pharmazeutisch verträgliche Salze, welche nachstehend aufgelistet sind, bevorzugt. Die Säureadditionssalze schließen zum Beispiel Hydrochloride, Nitrate, Sulfate, Methansulfonate, p-Toluolsulfonate und ferner Salze mit Dicarbonsäuren wie Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, usw., ferner Salze mit Monocarbonsäuren wie Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, usw. ein. Die anorganischen Basen, welche zur Bildung eines Salzes einer in der vorliegenden Erfindung erhaltenen Peptidverbindung geeignet sind, schließen zum Beispiel Hydroxide, Carbonate, Bicarbonate, usw. von Ammonium, Natrium, Lithium, Calcium, Magnesium, Aluminium, usw. ein. Die Salze mit einer organischen Base schließen zum Beispiel Mono-, Di- und Trialkylaminsalze wie Methylamin-, Dimethylamin- und Triethylamin-, Mono-, Di- und Trihydroxyalkylaminsalze, Guanidinsalze, N-Methylglucosaminsalze, usw. ein. Ein Protaminhydrolysat mit einer Peptidkomponente, die in die Form eines Salzes umgewandelt wurde, ist auch im Protaminhydrolysat gemäß der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
  • Die Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung ist die antimykotische Zusammensetzung, die ein Protaminhydrolysat und einen Terpenalkohol als den Wirkstoff umfasst, und es ist bevorzugt, dass der Wirkstoff aus einem Protaminhydrolysat und einem Terpenalkohol besteht.
  • Das Peptid mit einer antimykotischen Aktivität, welches durch Hydrolyse eines Protamins erhalten wird, schließt Peptide ein, die in die folgenden (1) bis (6) klassifiziert sind. Deshalb ist das Protaminhydrolysat, welches mit einem Terpenalkohol kombiniert wird, bevorzugt eines, das mindestens eine Peptidverbindung (nämlich Peptid oder sein Salz), ausgewählt aus den folgenden Gruppen (1) bis (6), enthält.
    • (1) Ein Peptid besteht aus einer Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1, dargestellt durch Ile Arg Arg Arg Arg Pro Arg Arg, und ein Salz davon.
    • (2) Ein Peptid besteht aus einer Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2, dargestellt durch Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg, und ein Salz davon.
    • (3) Ein Peptid besteht aus einer Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3, dargestellt durch Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg, und ein Salz davon.
    • (4) Ein Peptid besteht aus einer Aminosäuresequenz, die durch Deletion von 1 bis 6 Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 erhalten wird, oder ein Salz davon.
    • (5) Ein Peptid besteht aus einer Aminosäuresequenz, die durch Deletion von 1 bis 4 Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3 erhalten wird, oder ein Salz davon.
    • (6) Ein Peptid besteht aus einer deletierten Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3, dargestellt durch Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg (SEQ ID Nr. 4), Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg (SEQ ID Nr. 5) oder Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg (SEQ ID Nr. 6), oder ein Salz davon.
  • Das Protaminhydrolysat ist stärker bevorzugt eines, das mindestens eine Peptidverbindung, ausgewählt aus den vorstehend beschriebenen Gruppen (1) bis (3), enthält. Ein Protaminhydrolysat, das mindestens eine Peptidverbindung, ausgewählt aus der vorstehend beschriebenen Gruppe (1), mindestens eine Peptidverbindung, ausgewählt aus der vorstehend beschriebenen Gruppe (2), und mindestens eine Peptidverbindung, ausgewählt aus der vorstehend beschriebenen Gruppe (3), enthält, ist ferner bevorzugt.
  • Zwei oder mehr der Protaminhydrolysate mit einer antimykotischen Aktivität und mit unterschiedlichen Formulierungen können gemischt und verwendet werden.
  • Als Nächstes ist der in der vorliegenden Erfindung verwendete Terpenalkohol bevorzugt ein Monoterpenalkohol mit 10 Kohlenstoffatomen in einem Molekül oder ein Sesquiterpenalkohol mit 15 Kohlenstoffatomen in einem Molekül. Es gibt weitere ätherische Öle und Komponenten von ätherischen Ölen mit einer antimykotischen Aktivität, aber von allen wird berichtet, dass sie Nebenwirkungen aufweisen und mit einem Sicherheitsproblem verbunden sind. Zum Beispiel führen alle von Zimtrindenöl und sein Bestandteil Zimtaldehyd, Zitronengrasöl und sein Bestandteil Citral, Time-Öl und sein Bestandteil Thymol und Oreganoöl und sein Bestandteil Carvacrol zu starker Hautirritation. Ferner, obwohl Rosmarinöl und sein Bestandteil Campher, Grüne Minze-Öl und sein Bestandteil Carvon, usw. eine antimykotische Aktivität aufweisen, wurde berichtet, dass jedes davon eine irritierende Wirkung auf das zentrale Nervensystem hat. Hingegen verursachen Terpenalkohole wie Geraniol, Linalool und Nerolidol keine Nebenwirkungen, die besonders beachtet werden sollten, und weisen eine hohe Sicherheit auf. Ferner sind sie für die kombinierte Verwendung mit einem Protaminhydrolysat am besten geeignet, da sie eine hohe antimykotische Aktivität wie vorstehend beschrieben aufweisen.
  • Ätherische Pflanzenöle und Komponenten davon, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind wie nachstehend beschrieben. Hinoki-Öl und sein Hauptbestandteil Hinokitiol, Teebaumöl und sein Hauptbestandteil Terpinen-4-ol, Palmarosaöl und sein Hauptbestandteil Geraniol, Pfefferminzöl und sein Hauptbestandteil Menthol und sein Derivat, Lavendelöl und sein Hauptbestandteil Linalool, Patchouliöl und sein Hauptbestandteil Patchoulialkohol, Öl Lindera umbellata und sein Nebenbestandteil Nerolidol. Mentholderivate schließen Menthyllactat, Menthoxypropandiol, Menthylhydroxybutyrat, Menthoxyfuran, Menthylglucosid, usw. ein. Ferner kann jedes der ätherischen Pflanzenöle wie Palisanderöl, Wohlriechende Pelargonie-Öl, Zitroneneukalyptusöl, Pfefferminzöl und Neroli-Öl auch verwendet werden, da die gleichen Wirkungen erwartet werden.
  • Als der Monoterpenalkohol wird bevorzugt mindestens einer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hinokitiol, Geraniol, Terpinen-4-ol, Menthol, Mentholderivat und Linalool, verwendet. Es ist weiter bevorzugt, dass der Monoterpenalkohol Hinokitiol, Geraniol, Terpinen-4-ol, Menthol, Mentholderivat oder Linalool ist.
  • Als der Sesquiterpenalkohol ist/sind Patchoulialkohol und/oder Nerolidol bevorzugt.
  • Die antimykotische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Lösen oder Suspendieren eines Massepulvers (zum Beispiel gefriergetrocknetes Produkt) eines Protaminhydrolysats direkt in einem ätherischen Öl oder einer Komponente eines ätherischen Öls erhalten werden. Die so erhaltene Zusammensetzung kann als ein antimykotisches Mittel verabreicht werden, jedoch in praktischer Hinsicht können eine Salbe oder ein Einreibemittel wie Creme und Gel oder externe Zubereitungen wie ein Sprayprodukt einfach verwendet werden. Die antimykotische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann mindestens eines von einem Exzipienten, einem Verdünnungsmittel, einem Träger, usw. abhängig von ihrer Verabreichungsform enthalten.
  • Das ätherische Öl oder die Komponente des ätherischen Öls können in der Form einer vollständig klaren Flüssigkeit unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels wie Ethanol und Propylenglycol zubereitet werden. Das ätherische Öl oder die Komponente des ätherischen Öls können auch in Wasser unter Verwendung eines wässrigen Gels wie Gel Nature oder eines Dispergiermittels für ätherisches Öl wie ein Lösungsvermittler suspendiert werden. Wenn privat oder zuhause verwendet, ist es im Hinblick auf Irritation und Wirtschaftlichkeit praktisch, wenn das ätherische Öl oder die Komponente des ätherischen Öls vorher mit einem Trägeröl verdünnt wird und die resultierende Flüssigkeit verabreicht wird. Das Trägeröl für diesen Zweck schließt Pflanzenöle wie Heizöl, Jojobaöl, Süßmandelöl, Neemöl, St. John's Wort-Öl, usw. ein. Ferner, wenn eine antimykotische Zusammensetzung in ein Fußbad von heißem Wasser gegeben wird, wird die gleiche Wirkung erwartet.
  • Die antimykotische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, die sowohl ein Protaminhydrolysat als auch einen Terpenalkohol als einen Wirkstoff umfasst, weist eine hohe antimykotische Aktivität gegen mindestens einen Pilz auf, und insbesondere Pilze der Gattung Candida und der Gattung Malassezia als erkrankungsverursachende Pilze von Pilzinfektionserkrankungen sind als das Target bevorzugt, und zusätzlich können zum Beispiel die Gattung Cryptococcus, die Gattung Aspergillus, die Gattung Trichophyton, die Gattung Coccidioides, usw. als das Target angenommen werden. Die antimykotische Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung eines Pilzstammes, der zu diesen Gattungen gehört, gemäß einem einfachen Verfahren, zum Beispiel gemäß einem Verfahren, welches in den später beschriebenen Beispielen erwähnt wird, bestätigt werden.
  • Da man annimmt, dass eine Peptidverbindung nur schwerlich einen arzneistoffresistenten Stamm erzeugt, wird ein Protaminhydrolysat geeigneterweise als der Hauptbestandteil eines Mittels zum Vorbeugen von Pilzerkrankungen verwendet. Ferner, da Sicherheit für ein Protaminhydrolysat und einen Terpenalkohol bestätigt wurden, sind diese als ein Wirkstoff einer antimykotischen Zusammensetzung geeignet. Die antimykotische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann in Lebensmittelprodukten, pharmazeutischen Produkten, quasi-pharmazeutischen Produkten und Kosmetika als ein Wirkstoff eines antimykotischen Mittels enthalten sein, um Wirkungen wie Prophylaxe, Linderung, Behandlung, usw. von Pilzinfektionserkrankungen zu erhalten. Ferner kann die antimykotische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung als ein Wirkstoff einer Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Pilzinfektionserkrankungen verwendet werden. Die antimykotische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann als ein Wirkstoff in einem Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Pilzinfektionserkrankungen verwendet werden, wobei es Verabreichung einer wirksamen Menge der antimykotischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung an den Probanden von Prophylaxe und/oder Behandlung von Pilzinfektionserkrankungen umfasst.
  • Die Formulierung der antimykotischen Zusammensetzung ist nicht besonders eingeschränkt. Zum Beispiel schließen typische Formulierungen von internen Zubereitungen oder externen Zubereitungen Salbe, Flüssigkeit, Suspension, Emulsion, Aerosol, Schaum, Granula, Pulver, Tablette, Kapsel und Spray ein. Die Formulierung kann auch ein gefriergetrocknetes Material oder Granula sein, welche in physiologischer Salzlösung oder einem geeigneten Pufferfluid (zum Beispiel PBS) gelöst werden, um eine Arzneistoffflüssigkeit direkt vor ihrer Verwendung als eine Injektion, usw. herzustellen. Die Herstellungsverfahren zur Herstellung der unterschiedlichen Arzneistoffformulierungen (Zusammensetzungen) können per se gemäß den herkömmlichen bekannten Verfahren aus den Materialien, umfassend ein Protaminhydrolysat und einen Terpenalkohol (Wirkstoffe) und verschiedene Träger (sekundäre Bestandteile), durchgeführt werden. Da solche Herstellungsverfahren kein Charakteristikum der vorliegenden Erfindung sind, wurde die detaillierte Erläuterung davon weggelassen. Die detaillierten Informationsquellen bezüglich der Beschreibungen schließen zum Beispiel Comprehensive Medicinal Chemistry, herausgegeben von Corwin Hansch, veröffentlicht von Pergamon Press (1990) ein.
  • Die Gehalte eines Protaminhydrolysats mit antimykotischer Aktivität und eines Terpenalkohols als ein Wirkstoff in einer antimykotischen Zusammensetzung können aus einem Bereich, in welchem die synergistische Wirkung von ihnen, auf die in der vorliegenden Erfindung abgezielt wird, erhalten wird, abhängig von ihrer Verwendung ausgewählt werden. Ferner können die Mischungsmengen dieser Wirkstoffe gleichermaßen aus einem Bereich ausgewählt werden, um so die synergistische Wirkung, die in pharmazeutischen Produkten, quasi-pharmazeutischen Produkten, Lebensmittelprodukten und Kosmetika erhalten werden kann, als die Aufgaben, für welche die Funktion als ein antimykotisches Mittel bereitgestellt wird, zu erhalten.
  • Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte antimykotische Zusammensetzung kann gemäß dem Verfahren und der Dosierung entsprechend ihrer Formulierung und Aufgaben verwendet werden. Zum Beispiel kann die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte antimykotische Zusammensetzung in der Formulierung einer flüssigen Zubereitung durch intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intradermale oder intraperitoneale Injektion oder Kolonspülung verabreicht werden. Die Zusammensetzung in einer festen Formulierung wie Tablette, usw. kann oral verabreicht werden. Eine flüssige Zubereitung, welche eine relativ große Menge an einem Protaminhydrolysat enthält, (zum Beispiel 1 bis 100 mg/mL, ausgedrückt als die Menge einer Peptidverbindung) kann direkt auf die Oberflächen der Targets gesprüht werden, oder die Oberflächen der Targets können mit Verbandsmull, einem Lappen oder Papier, welche mit der flüssigen Zubereitung(en) benetzt sind, abgewischt werden, wenn die antimykotische Zusammensetzung für Desinfektion (Sterilisierung) der Oberfläche von Haut, der Innenseite der Mundhöhle, der Innenseite der Vagina oder der Oberfläche eines Sanitärprodukts; oder für Lebensmittelkonservierung verwendet wird. Die vorstehenden Verwendungen sind nur Beispiele, und die gleichen Formulierungen und die gleichen Verfahren für die Verwendungen wie jene für die herkömmlichen Peptidantibiotika und die Agrarzusammensetzungen, die quasi-pharmazeutischen Produkte, usw., welche ein Peptid als eine Komponente enthalten, können verwendet werden. Zum Beispiel sind für Krebspatienten und AIDS-Patienten, welche sich einer Strahlentherapie unterziehen, Prophylaxe und Behandlung von Infektionserkrankungen aufgrund von Mikroorganismen wichtige Angelegenheiten. Die hier offenbarte antimykotische Zusammensetzung kann eine hohe antimykotische Wirkung gegen Pilze (zum Beispiel Pilz Candida) als eine Ursache einer Infektionserkrankung zeigen. Aus diesem Grund ist die antimykotische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung als der Hauptbestandteil eines antimykotischen Mittels nützlich.
  • Die Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung zum Durchführen von Vorbeugung, Linderung, Behandlung, usw. schließen die Verwendungen in einem Lebensmittelprodukt, einem funktionellen Lebensmittelprodukt, einem pharmazeutischen Produkt, einem quasi-pharmazeutischen Produkt oder einem Kosmetikum ein, wie die Zugabe der antimykotischen Zusammensetzung zu Gummis, körnigen Konditorwaren, Tablettenkuchen, Filmen, Sprays, gesundheitsunterstützenden Lebensmittelprodukten, Lebensmitteln für spezielle Gesundheitsverwendungen, Hilfsmitteln für Mund- oder Zahnhygiene, Zahnprothesenreinigungsmitteln und Zahnprothesen-Stabilisierungszusammensetzungen; und verschiedenen Formulierungen wie Mundspülungen, Mundreinigungsmitteln, medizinischen Zahnpulvern, Lotionen, Cremes, Pulvern, Emulsionen, Sprays, Verbänden, usw.
  • BEISPIELE
  • Als Nächstes werden die bevorzugten Ausführungsformen zum Durchführen der vorliegenden Erfindung im Detail durch Zeigen der Beispiele beschrieben, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf die folgenden Beispiele eingeschränkt.
  • Die folgenden Pilzstämme sind von den folgenden Instituten erhältlich. Die Pilzstämme zum Testen einer antimykotischen Aktivität sind nicht auf die nachstehend aufgelisteten Stämme eingeschränkt, und allgemein verwendete Stämme können verwendet werden.
    • – Candida albicans NBRC1594 Unabhängige Verwaltungsbehörde National Institute of Technology and Evaluation, Biotechnology Center (Kontaktname: Biological Resource Utilization Promotion Division) Adresse: 2-5-8 Kazusakamatari Kisarazu Stadt, Chiba Präfektur 292-0818, Japan (http://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/)
    • – Candida albicans TIMM1768 und Malassezia fur fur TIMM10020 Medical Fungus Research Center der Teikyo Universität Adresse: 359 Otsuka Hachioji city, Tokio 192-0395, Japan (http://www.teikyo-u.ac.jp/timm/research/r01.html?page=research)
  • (Beispiel 1)
  • (Herstellung von Protaminhydrolysat durch enzymatischen Abbau von Protamin)
  • Zu 50 g Protamin, abgeleitet von Fischmilchen von Ketalachs (Oncorhynchus keta) (Proserve; hergestellt von Maruha Nichiro Corporation), wurden 80 ml deionisiertes Wasser gegeben, und Natriumhydroxid wurde zu dem resultierenden Gemisch gegeben, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen. Die Lösung wurde auf 65°C erwärmt, dann wurden 1,5 mg Thermolysin (hergestellt von Nacalai Tesque Inc., abgeleitet von Bacillus thermoproteolyticus) zugegeben, und eine enzymatische Umsetzung wurde während Rühren 2 Stunden lang durchgeführt. Nach der Vollendung der Umsetzung wurde die Reaktionsflüssigkeit auf 95°C erwärmt und 30 Minuten lang thermisch deaktiviert, und der pH-Wert wurde auf 8,5 eingestellt. Danach wurde die Reaktionsflüssigkeit gefriergetrocknet, um ein Protaminhydrolysat zu erhalten.
  • (Beispiel 2)
  • (Isolierung einer aktiven Fraktion von Protaminhydrolysat und Analyse eines aktiven Peptids)
  • Das gemäß Beispiel 1 hergestellte Protaminhydrolysat wurde in einer Lösung mit 50000 ppm unter Verwendung von deionisiertem Wasser zubereitet, dann wurde jede Fraktion unter den folgenden Trennungsbedingungen unter Verwendung von HPLC isoliert. Die Aktivität gegen Candida der Fraktionen wurde unter Verwendung von Candida albicans NBRC1594 bewertet, und zwei aktive Fraktionen wurden erhalten. Ferner wurden diese aktiven Fraktionen einer LCMS-IT-TOF-Analyse unterworfen, und die Strukturen der folgenden drei Peptide wurden bestimmt.
    • (1) Ile Arg Arg Arg Arg Pro Arg Arg (8 Reste; Molekulargewicht: 1164,7541)
    • (2) Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg (13 Reste; Molekulargewicht: 1780, 0966)
    • (3) Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg (14 Reste; Molekulargewicht: 1879,1650).
  • <HPLC-Trennungsbedingung>
    • – HPLC-System: hergestellt von Shimadzu Corporation, Prominence-Reihe (Systemsteuerung: CBM-20A, Autosampler: SIL-10AF, Lösungsförderpumpe: LC-8A × 2 Pumpen, Säulenofen: CTO-20A, PDA-Detektor: SPD-M20A (Messwellenlänge: 190 bis 400 nm))
    • – Fließgeschwindigkeit: 1,0 mL/min
    • – mobile Phase A: 0,1% Trifluoressigsäure
    • – mobile Phase B: Acetonitril
    • – Säule: Inertsil ODS-2 5 μm 4,6 mm × 250 mm (hergestellt von GL Science Inc.)
    • – Gradient: linearer Gradient von 0 Volumen-% Flüssigkeit B nach 15 Volumen-% Flüssigkeit B in einem Bereich von 0 bis 60 Minuten
    • – Detektionswellenlänge: 214 nm.
  • <LCMS-IT-TOF-Analysebedingung>
    • – HPLC-System: hergestellt von Shimadzu Corporation, Prominence-Reihe (Systemsteuerung: CBM-20A, Autosampler: SIL-20A, Lösungsförderpumpe: binäre Pumpe LC-20AB, Säulenofen: CTO-20A, PDA-Detektor: SPD-M20A (Messwellenlänge: 190 bis 400 nm))
    • – Fließgeschwindigkeit: 0,2 mL/min
    • – mobile Phase A: 0,1% Ameisensäure (hergestellt von Kanto Chemical Co., Inc., für LC-MS)
    • – mobile Phase B: Acetonitril (hergestellt von Kanto Chemical Co., Inc., für LC-MS) Säule: Atlantis HILIC Silica, 3 μm-Säule (hergestellt von Waters)
    • – Gradient: linearer Gradient von 60 Volumen-% Flüssigkeit B nach 0 Volumen-% Flüssigkeit B in einem Bereich von 0 bis 30 Minuten Einspritzvolumen: 10 μL
    • – IT-TOFMS-System: hergestellt von Shimadzu Corporation, LCMS-IT-TOF (Ionisationsmodus: ESI-, Fließgeschwindigkeit des atomisierten Gases: 1,5 L/min, Trocknungsgasdruck: 0,15 MPa, angelegte Spannung: 4,5 kV, CDL-Temperatur: 200°C, BH-Temperatur: 200°C, Messbereich MS: m/z 500 bis 2.000).
  • (Beispiel 3)
  • (In vitro-Screening von Material, welches eine synergistische Wirkung ausübt) Stamm
  • Candida albicans TIMM1768 Testmaterial
  • Hinokitiol (hergestellt von Kiseitech Co., Ltd.), Terpinen-4-ol (hergestellt von Tokyo Chemical Industry, Co., Ltd.), Geraniol (hergestellt von Kanto Chemical Co., Inc.), Menthol (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Zimtaldehyd (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und Caprinsäure (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurden einzeln in RPMI-Medium gelöst, so dass die Konzentration in einem Testmaterial 0,008, 0,04, 0,2, 1 mg/mL betrug, und das gemäß Beispiel 1 hergestellte Protaminhydrolysat wurde gelöst, so dass die Konzentration des Protaminhydrolysats in einem Testmaterial 0, 0,125, 2,0 mg/mL betrug, und die Lösungen wurden dem Test unterworfen. Ferner wurden Lösungen von 0,002, 0,008, 0,031, 0,125, 0,5, 2, 8, 32 mg/mL unter Verwendung des Protaminhydrolysats einzeln dem Test unterworfen.
  • Bewertungsverfahren
  • Der Stamm C. albicans TIMM1768 wurde jeweils in einer Menge von 200 μL in eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen gegeben, so dass 2,5 × 105 Zellen/Vertiefung vorlagen, und 2,5 bis 3,5 Stunden lang bei 37°C unter 5% CO2 kultiviert. Nach der Kultivierung wurde jedes Medium unter Absaugung entfernt und jedes Testmaterial wurde in einer Menge von 200 μL/Vertiefung zugegeben. Nachdem bei 37°C 10 Minuten lang still stehengelassen wurde, wurde jede Probelösung unter Absaugung entfernt, und RPMI-Medium wurde in einer Menge von 200 μL/Vertiefung zugegen, und es wurde 2,5 Stunden lang bei 37°C unter 5% CO2 kultiviert. Nach der Kultivierung wurde jede Probe mit Kristallviolett angefärbt und die Extinktion bei 620 nm wurde gemessen. Die antibakterielle Aktivität wurde als der relative Wert von jedem Versuchsabschnitt, wenn die Extinktion der Leerprobe 1 war, angegeben.
  • Ergebnis
  • Die Ergebnisse einer in vitro-Bewertung, als ein Protaminhydrolysat und Terpenalkohole in Kombination verwendet wurden, sind in den 1 bis 6 gezeigt, und das Ergebnis einer in vitro-Bewertung, als ein Protaminhydrolysat einzeln verwendet wurde, ist in 7 gezeigt. In den 1 bis 6 repräsentiert ♦ das Ergebnis einer einzelnen Verwendung von Terpenalkoholen, ∎ repräsentiert das Ergebnis der kombinierten Verwendung mit einem Protaminhydrolysat 0,125 mg/mL beziehungsweise Δ repräsentiert das Ergebnis der kombinierten Verwendung mit einem Protaminhydrolysat 2,0 mg/mL.
  • Hinokitiol zeigte eine antibakterielle Aktivität sogar bei einzelner Verwendung, und es wurde angenommen, dass eine synergistische Wirkung beim Verbessern der Aktivität durch die kombinierte Verwendung mit einem Protaminhydrolysat erkannt wird. Obwohl Terpinen-4-ol, Geraniol und Menthol geringe Aktivität zeigten, als sie einzeln verwendet wurden, wurde die Aktivität durch die kombinierte Verwendung mit einem Protaminhydrolysat leicht verbessert, weshalb angenommen wurde, dass eine synergistische Wirkung vorliegt. Zimtaldehyd und Caprinsäure zeigten geringe antibakterielle Aktivität, als sie einzeln verwendet wurden, und eine synergistische Wirkung durch die kombinierte Verwendung mit einem Protaminhydrolysat wurde nicht erkannt. Obwohl bekannt ist, dass Caprinsäure eine starke antimykotische Aktivität zeigt, wurde angenommen, dass Caprinsäure keine ausreichende antimykotische Wirkung zeigen konnte, da die Kontaktzeit des Arzneistoffes mit dem Pilz auf nur 10 Minuten festgelegt war, da dieses in vitro-Bewertungssystem in vivo nachahmt.
  • Basierend auf den vorstehend beschriebenen Ergebnissen wurde bestätigt, dass ein Protaminhydrolysat eine synergistische Wirkung mit Terpenalkoholen wie Hinokitiol, Terpinen-4-ol, Geraniol, usw. unter den ätherischen Ölen zeigt.
  • (Beispiel 4)
  • (Bestätigung einer Wirkung im in vivo-Bewertungssystem)
  • Stamm
    • Candida albicans TIMM1768
  • Labortier
    • ICR-Maus, weiblich, 6 Wochen alt (erzeugt von Charles River Laborstories Japan, Inc.)
  • Testmaterial
    • Protaminhydrolysat, hergestellt gemäß Beispiel 1
    • Hinokitiol (hergestellt von Kiseitech Co., Ltd.)
  • Gruppenzusammenstellung
    • Negativkontrolle (1% Methylcellulose), sechs Mäuse
    • Protaminhydrolysat 25 mg/mL (1% Tween 80), sechs Mäuse
    • Hinokitiol 0,4 mg/mL (1% Tween 80), sechs Mäuse
    • Hinokitiol 2 mg/mL (1% Tween 80), sechs Mäuse
    • Protaminhydrolysat 25 mg/mL + Hinokitiol 0,4 mg/mL (1% Tween 80), sechs Mäuse
    • Protaminhydrolysat 25 mg/mL + Hinokitiol 2 mg/mL (1% Tween 80), sechs Mäuse
  • Bewertungsverfahren
  • Am Tag vor der Injektion von C. albicans wurden 100 mg/kg eines immunsuppressiven Mittels (Prednisolon) subkutan injiziert. Um zu verhindern, dass andere Pilze als C. albicans injiziert wurden, war Chlortetracyclin-Hydrochlorid im Trinkwasser in 15 mg/mL enthalten, und dem Tier wurde eine freie Aufnahme von Wasser ermöglicht. Am Tag der Injektion wurden 14,4 mg/kg Chlorpromazin-Hydrochlorid intramuskulär injiziert, dann wurde C. albicans mit flüssigem FBS-RPMI-Medium verdünnt, so dass 2 × 108 Zellen/mL vorlagen, und die verdünnte Pilzflüssigkeit wurde mit einem Wattestäbchen in die Mundhöhle der Maus eingebracht. Dann wurden 3, 24, 27 Stunden nach der Injektion 50 μL von jedem Testmaterial unter Verwendung einer Oralsonde (Sonde) verabreicht. Dann wurde die Maus 48 Stunden nach der Infektion getötet und ein Score des Zustandes der Zunge wurde erstellt. Der Zungen-Score war 0 Punkte, als ein weißer moosartiger Belag visuell überhaupt nicht erkannt wurde, 1 Punkt, als ein weißer moosartiger Belag in Bereichen von 20% oder weniger der Zunge bestätigt wurde, 2 Punkte bei 21 bis 90%, 3 Punkte bei 91% oder mehr und 4 Punkte bei 91% oder mehr und als ein Überzug aus einem weißen moosartigen Belag bestätigt wurde.
  • Ergebnis
  • Das Ergebnis einer in vivo-Bewertung der kombinierten Verwendung eines Protaminhydrolysats und von Hinokitiol ist in 8 gezeigt. Eine signifikante Verbesserung des Symptom-Score einer Zunge mit C. albicans-Infektion durch eine Kombination eines Protaminhydrolysats 25 mg/mL und von Hinokitiol 2,0 mg/mL wurde bestätigt, wobei der Score im Vergleich mit einem Fall einer einzelnen Verwendung von jedem Material beträchtlich verbessert war, so dass eine Verbesserung einer antimykotischen Aktivität durch eine synergistische Wirkung bestätigt wurde. Betreffend ein Protaminhydrolysat wurde ein Wirkmechanismus von Anhaften an der Oberfläche eines Pilzkörpers und Aufweisen von Bakteriostase bei niedriger Konzentration vorgeschlagen, wogegen betreffend Hinokitiol von Hemmung von Membranfunktionen und Respirationssuppressionswirkung berichtet wurde. Im Hinblick auf einen solchen Unterschied bei ihren Mechanismen wurde in Betracht gezogen, dass die kombinierte Verwendung eines Protaminhydrolysats und von Hinokitiol nicht nur eine einfache additive Wirkung verursachte, sondern eine synergistische Wirkung zur Steigerung der antibakteriellen Aktivität verursachte.
  • (Referenzbeispiel 1)
  • (Bestätigung einer Wirkung für den Pilz Malassezia)
  • Stamm
    • Malassezia fur fur TIMM10020
  • Bewertungsverfahren
  • Malassezia fur fur, kultiviert in MLNA-Medium, wurde durch physiologische Salzlösung auf McFarland 1.0 eingestellt, und 100 μL der hergestellten Flüssigkeit und 50 μL Olivenöl wurden auf einer MLNA-Agarplatte verteilt. Im Zentrum einer Petrischale wurden 50 μL einer Testprobe (ein Protaminhydrolysat, zubereitet mit sterilem Wasser auf 40 mg/mL) auf eine Papierscheibe mit 8 mm für einen antibiotischen Test getropft und es wurde 7 Tage lang bei 32°C kultiviert.
  • Ergebnis
  • Ein Ring von Hemmung von 14 mm × 14 mm (die Papierscheibe hatte eine Dicke von 8 mm) wurde um die Papierscheibe, auf welche 50 μL des Protaminhydrolysats (40 mg/mL) getropft worden waren, beobachtet. Es wurde bestätigt, dass das Protaminhydrolysat eine antibakterielle Wirkung auf den Pilz Malassezia hatte, da ein Ring von Hemmung um steriles Wasser als eine Kontrolle nicht beobachtet wurde.
  • (Beispiel 5)
  • (Detaillierte Analyse bezüglich einer Verwendung in Kombination mit Hinokitiol) Stamm
    • Candida albicans TIMM1768
  • Testmaterial
  • Hinokitiol (hergestellt von Kiseitech Co., Ltd.) wurde in RPMI-Medium gelöst, so dass die Konzentration in jedem Testmaterial 0, 0,004, 0,008, 0,016, 0,031, 0,063, 0,125, 0,25, 0,5 oder 1 μg/mL betrug, und das gemäß Beispiel 1 hergestellte Protaminhydrolysat wurde gelöst, so dass die Konzentration des Protaminhydrolysats in jedem Testmaterial 0, 0,156, 0,313, 0,625, 1,25, 2,5, 5 oder 10 μg/mL betrug, und sie wurden dem Test unterworfen.
  • Bewertungsverfahren
  • Der Stamm C. albicans TIMM1768 wurde mit RPMI-Medium verdünnt, so dass 5,0 × 103 Zellen/mL vorlagen, dann wurde er jeweils in einer Menge von 100 μL in eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Die Protaminhydrolysat-Lösung wurde jeweils in einer Menge von 50 μL/Vertiefung zugegeben, dann wurde Hinokitiol jeweils in einer Menge von 50 μL/Vertiefung zugegeben. Nach einer Kultivierung 16 Stunden lang bei 37°C unter 5 % CO2 wurde jede Probe mit Kristallviolett angefärbt und die Extinktion bei 620 nm wurde gemessen. Die Hemmaktivität wurde aus dem relativen Wert von jedem Versuchsabschnitt berechnet, wobei die Extinktion einer Negativkontrolle (keine Zugabe von Protaminhydrolysat und Hinokitiol) 1 war. Ferner wurden auch FIC-Werte zusammen bei den Konzentrationen von Hinokitiol (hergestellt von Kiseitech Co., Ltd.) und jeweils einem Protaminhydrolysat ”Pro”, gezeigt in Tabelle 1, berechnet.
  • Ergebnis
  • Die Ergebnisse einer in vitro-Bewertung, als ein Protaminhydrolysat und Hinokitiol in Kombination verwendet wurden, sind in 9 und 10 gezeigt. Die Ergebnisse der berechneten FIC-Indexwerte sind in 1 gezeigt. Tabelle 1 IC90
    Hinokitiol Pro FIC
    0 5,95 1,00
    0,001 5 0,84
    0,004 3,9 0,66
    0,008 3,8 0,65
    0,016 2,95 0,52
    0,031 3,2 0,58
    0,055 2,5 0,49
    0,063 2,45 0,49
    0,125 2,35 0,56
    0,25 2,3 0,71
    0,5 1,65 0,93
    0,63 1,25 1,03
    0,73 0,625 1,05
    0,8 0,313 1,09
    0,54 0,156 0,73
    0,77 0 1,00
  • Als ein Ergebnis wurde eine synergistische Wirkung von FIC ≤ 0,5 bei der Kombination eines Protaminhydrolysats und von Hinokitiol bei niedriger Konzentration beobachtet.
  • Basierend auf den vorstehend beschriebenen Ergebnissen wurde bestätigt, dass ein Protaminhydrolysat mit Hinokitiol eine synergistische Wirkung zeigt.
  • (Beispiel 6)
  • (In vitro-Bewertung von Protaminhydrolysat, welches von Fischmilch von anderen Fischen abgeleitet ist)
  • Stamm
  • Candida albicans TIMM1768
  • Testmaterial
  • Ein gemäß Beispiel 1 hergestelltes Protaminhydrolysat, abgeleitet von jedem Fisch (Buckellachs, Hering), und ein Bromelain, ein Abbauprodukt von einem Protamin, das von Lachsfischmilchen abgeleitet ist, wurden in RPMI-Medium verdünnt, so dass die Konzentration von dem Protaminhydrolysat in jedem Testmaterial 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 oder 160 μg/mL betrug, und sie wurden dem Test unterworfen.
  • Bewertungsverfahren
  • Der Stamm C. albicans TIMM1768 wurde mit RPMI-Medium verdünnt, so dass 5,0 × 103 Zellen/mL vorlagen, dann wurde er jeweils in einer Menge von 100 μL in eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Eine Protaminhydrolysat-Lösung wurde jeweils in einer Menge von 50 μL/Vertiefung zugegeben, dann wurde RPMI-Medium jeweils in einer Menge von 50 μL/Vertiefung zugegeben. Nach einer Kultivierung 16 Stunden lang bei 37°C unter 5% CO2 wurde jede Probe mit Kristallviolett angefärbt und die Extinktion bei 620 nm wurde gemessen. Die Hemmaktivität wurde aus dem relativen Wert von jedem Versuchsabschnitt berechnet, wobei die Extinktion einer Negativkontrolle (keine Zugabe von Protaminhydrolysat) 1 war.
  • Ergebnis
  • Die Ergebnisse einer in vitro-Bewertung von verschiedenen Protaminhydrolysaten sind in 11 gezeigt.
  • Alle Testmaterialien zeigten eine Aktivität, die äquivalent zum von Lachsfischmilch abgeleiteten Protaminhydrolysat war. Dieses Ergebnis zeigt die Einsatzflexibilität der Protamin-Abbauprodukte für die Fischarten.
  • (Beispiel 7)
  • (Bestätigung einer Wirkung der kombinierten Verwendung in einem in vivo-Bewertungssystem)
  • Stamm, Labortier, Testmaterial, Gruppenzusammenstellung, Bewertungsverfahren Derselbe Stamm, das gleiche Labortier, das gleiche Testmaterial, dieselbe Gruppenzusammenstellung und dasselbe Bewertungsverfahren wie in Beispiel 4 wurden verwendet.
  • Von jeder Maus, die 48 Stunden nach der Injektion getötet wurde, wurde ein Zungengewebeschnitt durch ein einfaches Verfahren hergestellt und angefärbt, dann mit einem optischen Mikroskop fotografiert, um ein angefärbtes Bild zu erhalten.
  • Ergebnis
  • Das Ergebnis einer Betrachtung des Zungengewebes, als ein Protaminhydrolysat und Hinokitiol in Kombination verwendet wurden, ist in 12 gezeigt. Auch auf dem Zungengewebebild verblieb eine Pilzhyphe in der Schleimhautmembran auf der Zungenoberfläche, als ein Protamin-Abbauprodukt einzeln verwendet wurde, wogegen Pilzhyphe-Suppression klar im Versuchsabschnitt der kombinierten Verwendung bestätigt wurde.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (11)

  1. Eine Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität, welche ein Protaminhydrolysat und einen Terpenalkohol als einen Wirkstoff umfasst.
  2. Die Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität gemäß Anspruch 1, wobei das Protaminhydrolysat mindestens eine der Peptidverbindungen, bestehend aus dem Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz von einer von SEQ ID Nr. 1 bis 3 besteht, und Salze davon enthält: SEQ ID Nr. 1: Ile Arg Arg Arg Arg Pro Arg Arg SEQ ID Nr. 2: Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg SEQ ID Nr. 3: Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg.
  3. Die Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Terpenalkohol mindestens einer, ausgewählt aus Monoterpenalkoholen oder Sesquiterpenalkoholen, ist.
  4. Die Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität gemäß Anspruch 3, wobei der Monoterpenalkohol Hinokitiol, Geraniol, Terpinen-4-ol, Menthol, Mentholderivat oder Linalool ist.
  5. Die Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität gemäß Anspruch 4, wobei der Sesquiterpenalkohol ein Patchoulialkohol oder Nerolidol ist.
  6. Ein antimykotisches Mittel, umfassend die Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.
  7. Ein Lebensmittel, enthaltend die Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.
  8. Ein pharmazeutisches Produkt oder ein quasi-pharmazeutisches Produkt, umfassend die Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.
  9. Ein Kosmetikum, enthaltend die Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.
  10. Ein Verfahren von Verwenden der Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 als ein Wirkstoff zum Erhalten einer antimykotischen Aktivität in der Herstellung eines Lebensmittelprodukts oder eines Kosmetikums.
  11. Ein Verfahren von Verwenden der Zusammensetzung mit einer antimykotischen Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 als ein Wirkstoff zum Erhalten einer antimykotischen Aktivität in der Herstellung eines pharmazeutischen Produkts oder eines quasi-pharmazeutischen Produkts.
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