KR19980702014A - 항균성 테르펜 화합물 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 도열병균 등에 항균성을 나타내는 새로운 디테르펜 화합물과, 항균성 테르펜 화합물의 제조법, 에리시타 활성을 가지는 새로운 피토카산 EL과, 그 제조방법 및 도병해 방제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 벼의 피토알렉신으로서, 도열병균 및 문고병균에 항균성을 나타내고, 아래의 일반식(Ⅰ)
···(Ⅰ)
(단, 식에서 Rl은 H, H 또는 α-H, β-OH, R2는 α-H, β-OH, H, H 또는 O, R3은 O 또는 α-H, β-OH를 나타낸다.)
으로 표시되는 카산(cassane)골격을 가지는 화합물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 벼 유합조직의 액체배양액에 도열병균 혹은 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출물을 첨가하여 항균성 테르펜 화합물을 생산한 후, 이것을 분리하는 것을 특징으로 하는 항균성 테르펜 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은, 벼에 피토알렉신의 생성을 유도하는 활성을 가지고, 또한, 도열병균, 문고병균에 대한 항균활성을 가지는 아래의 구조식(Ⅱ)으로 표시되는 피토카산 EL과, 또한, 벼 유합조직의 액체배양액에 도열병균 또는 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출물을 첨가하여 피토카산 EL을 생산한 후, 이것을 분리하는 피토카산 EL의 제조방법, 더욱이, 피토카산 EL을 유효성분으로 하는 도열병해, 문고병해 방제제에 관한 것이다.
···(Ⅱ)
도열병균 및 문고병균에 강한 항균성을 갖는 디테르펜 화합물 및 그 제조법 등이 제공된다. 또한, 그 화합물은, 도열병해 방제제, 문고병해 방제제의 유효성분으로서 유용하다. 더욱이, 도열병균 및 문고병균의 발병 억제에 유효한 저독성, 무공해의 방제제를 제공하는 것이 가능하다.
Description
식물은, 병원균의 침입, 또는 자외선, 중금속에 의한 작용, 상해 등, 병해의 요인이 되는 각종 스트레스에 대하여, 여러 가지 저항기구에 의해서 자기방어를 하고 있다. 이와 같은 식물의 병해 저항반응에 관여하는 생리 활성물질에는, 항균성물질과 식물호르몬이 있다. 그 중, 전자는 병원균의 발육을 직접적으로 저해하고, 후자는 병징의 발현에 관여하고 있다.
식물의 항균성물질에 관하여는, 종래, 여러 종류의 것이 보고되어 있지만, 그것들은 일반적으로 그 발현기구로부터 프로히비틴(prohibitin), 인히비틴(inhibitin), 포스트 인히비틴(post inhibitin) 및 피토알렉신(phytoalexin)의 4군으로 나누어져 있다. 이 중, 프로히비틴은 건전식물조직에 충분한 농도로 존재하는 항균성물질이고, 인히비틴은 건전식물조직에 저농도로 존재하여, 병원균에 감염된 후에 농도가 증가하는 항균성물질이고, 포스트 인히비틴은 건전식물조직에 존재하여, 그것 자체로는 항균성을 나타내지 않지만, 병원균의 침해를 받으면 간단한 화학변환을 일으키는 향균력을 발휘하는 물질이다. 이 세 물질은, 선재항균성물질로 되어 있다. 이것에 대하여, 피토알렉신은, 건전식물조직에는 존재하지 않고, 병원균에 감염된 후에 처음으로 유도, 합성되는 항균성물질로서, 식물의 병해저항반응에 있어서 주요한 역할을 해내고 있는 동적방어물질이다.
식물은, 병원균과 접촉하면 항체성반응(과민감반응)을 나타내어, 반응부위 주변의 조직에 병원균에 대해 항균성을 보이는 피토알렉신을 생산하는 것이 알려져 있다. 이 피토알렉신의 항균활성자체는 그다지 크지 않지만, 병변부에 이송되어 국부적으로 고농도로 존재하여, 항균력을 발휘한다고 되어 있다. 또한, 피토알렉신은, 건전한 식물조직에 의해서 빠르게 분해된다(시바타 쇼지 편「신편 생물활성 천연물질」, p.66-72, 의치약출판, 1988년, 西村 正暘, 大內 成志編 「식물감염생리학」, p.99-121, 분수당출판, 1990년).
이와 같이, 피토알렉신은, 식물자체로서 생산되는 식물체 유래의 천연물질이고, 더욱이, 건전식물조직에 의하여 용이하게 분해되는 성질을 갖는 것으로 거의 잔류하지 않는 것에서, 최근, 환경보전의 시점에서 소위 저독성, 무공해의 농약으로서 이용이 크게 기대되고, 당 업계에서, 집합항균활성이 높고 우수한 특성을 갖는 피토알렉신의 개발을 강하게 바라는 상황에 있다.
그리고, 피토알렉신의 안에도 벼의 피토알렉신에 관하여는, 지금까지 여러 가지의 연구성과가 보고되어 있지만, 그 대표적인 것으로는, 다음과 같은 것을 들 수 있다.
l)모미락톤 A, B(벼에서의 피토알렉신의 피토카산 생성)
D.Cartwright, P.Langcake, R.J.Pryce, D.P.Leworthy and J.P.Ride : Nature, 267, 511-513(1977)
2)오리자레키신 A(도열병 이병 벼잎보다 새로운 피토알렉신의 오리자레키신 A의 분리)
T.Akatsuka, 0.Kodama, H.Kato, Y.Kono and S.Takeuchi : Agric. Biol. Chem., 47, 445-447(1983)
3)오리자레키신 A, B, C(화학구조의 보고, 단보)
Y.Kono, S.Takeuchi, 0.Kodama and T.Akatsuka : Agric. Biol. Chem., 48, 253-255(1984)
4)오리자레키신 A, B, C(오리자레키신 A, B, C의 분리, 성상, 도열병균에 대한 항균활성)
T.Akatsuka, 0.Kodama, H.Sekido, Y.Kono and S.Takeuchi : Agric. Biol. Chem., 49, 1689-1694(1985)
5)오리자레키신 A, B, C(구조의 상보(詳報))
Y.Kono, S.Takeuchi, 0.Kodama, H.Sekido and T.Akatsuka : Agric. Biol. Chem., 49, 1695-1701(1985)
6)오리자레키신 D(분리, 구조, 활성)
H.Sekido, T.Endo, R.Suga, 0.Kodama, T.Akatsuka, Y.Kono and S.Takeuchi : J.Pesticide Sci., ll, 369-372(1986)
7)오리자레키신 E(자외선 조사 벼에서 새로운 벼 피토알렉신의 오리자레키신 E의 분리, 구조, 활성)
H.Kato, 0.Kodama and T.Akatsuka : Phytochemistry, 33, 79-81(1993)
8)오리자레키신 F(자외선 조사 벼에서 새로운 벼 피토알렉신의 오리자레키신 F의 분리, 구조, 활성)
H.Kato, 0.Kodama and T.Akatsuka : Phytochemistry, 36, 299-301(1994)
9)오리자레키신 S(자외선 조사 벼에서 새로운 벼 피토알렉신의 오리자레키신 S의 분리, 구조)
O.Kodama, W.X.Li, S.Tamogami and T.Akatsuka : Biosci. Biotech. Biochem., 56, 1002-1003(1992)
10)사쿠라네틴(자외선 조사 벼에서 플라바논 골격 피토알렉신의 분리와 도열병균에 대한 활성)
O.Kodama, J.Miyakawa, T.Akatsuka and S.Kiyosawa : Phytochemistry, 31, 3807-3809(1992)
ll)오리자라이드 A(도백엽고병 저항성 품종엽에서 도백엽고병균에 항균성이 있는 오리자라이드 A의 분리 단보)
M.Watanabe, Y.Sakai, T.Teraoka, H.Abe, Y.Kono, J.Uzawa, K.Kobayashi, Y.Suzuki and A.Sakurai : Agric. Biol. Chem., 54, 1103-ll05(1990)
12)오리자라이드 A, B, 오리자릭 산 A(도백엽고병 저항성 품종 벼잎에서 도백엽고병균에 항균성이 있는 오리자라이드 A, B, 오리자릭 산 A의 분리)
Y.Kono, J.Uzawa, K.Kobayashi, Y.Suzuki, M.Uramoto, A.Sakurai, M.Watanabe, T.Teraoka, D.Hosokawa, M.Watanabe and H.Kondo : Agric. Biol. Chem., 55, 803-811(1991)
13)오리자릭 산 B(오리자릭 산 B 및 관련 A, B, C 물질의 구조)
M.Watanabe, Y.Kono, M.Watanabe, J.Uzawa, T.Teraoka, D.Hosokawa, Y.Suzuki, A.Sakurai and M.Teraguchi : Biosci. Biotech. Biochem., 56, 113-ll7(1992)
14)오스테오스페르뭄(Osteospermum)종 식물의 디테르펜 화합물(피토알렉신에는 없지만, 피토카산과 같은 카산(cassane) 골격을 갖는 화합물. 단, 피토카산과는 구조가 다르고, 또한, 생리활성에 관해서의 기재는 아무것도 없다.)
Ferdinand Bohlmann, Michael Wallmyer, Jasmin Jakupovic and Jurgen Ziesche : Phytochemistry, 22(7), 1645-1651(1983)
이와 같이, 벼의 피토알렉신으로서는, 모미락톤 A, B, 오리자레키신 A, B, C, D, E, F, S, 사쿠라네틴, 오리자릭 산 A, B, 오리자라이드 A, B가 알려져 있지만, 종래, 일반식(Ⅰ)의 구조를 가진 것은 알려져 있지 않다. 또한, 지금까지 (Ⅰ)의 구조를 갖는 디테르페노이트 화합물은 보고된 바가 없다.
또한, 이것들의 피토알렉신은, 벼 식물체로부터 분리되어 있으나, 모미락톤 A, B, 오리자레키신 A, B, C, D에 관하여는 벼의 액체배양 세포로부터 분리하는 방법이 검토되어 있다(특개평 l-218591호 공보). 그러나, 해당 방법은 도열병균을 직접 접종하는 것에 있어, 도열병균 및 감자유행병균의 균체추출물을 이용하는 것이 아니고, 해당 균체추출액의 유효성에 관하여는 완전히 검토되어 있지 않으며, 또한, 생산량도 아주 적기 때문에 도저히 실용화에는 바람직하지 못한 것이었다. 피토카산은, 본 발명자 등이 발견한 새로운 화합물이고, 피토카산 A, B, C, D는, 도열병균 또는 문고병균에 이병한 벼의 저항성 반응부위로부터 채취할 수 있지만, 그 제조법을 포함해서 보고된 바는 없다. 또한, 본 발명자 등이 지금까지 연구한 바에 의하면, 피토카산을 식물병해 방제제로서 이용하기 위해서는, 다량의 벼를 재배하여 병원균을 접종하고, 저항성 반응부위를 모아 유효성분을 분리하는 필요가 있었다.
그러나, 이 방법에서는, 식물의 재배, 병원균의 접종작업 등에 막대한 노동력이 들고, 또 식물체성분과 유효물질의 분리가 번잡한 문제점이 있었다.
더욱이, 피토알렉신을 식물체 내에 생산유도하는 물질은 에리시타로 불리어지고(Keen,N.T. : Science l87 : 74-75(1975)), 지금까지 많은 물질이 식물병원균으로부터 분리되어 있다. 대표적인 에리시타로서는, 다당물질 물질로서 Phytophthora megasperma f. sp. glycinea에서 분리된 헵타-βD겔코피라노시드(Sharp,J.K., B.Valentand, P.Albershim : J. Biol. Chem. 259 : l132111336(1984)), 단백물질로서 Monilinia fructicola에서 분리된 모니코린 A(Cruickshank,I.A.M. and D.R.Perrin : Life Sci. 7 : 449-458(1968)), 지질로서 Phytophthora infestans에서 분리된 에이코사펜타엔 산(Bostock,R.M., J.Kuc and R.A.Laine : Science 212 : 67-69(1981)) 등이 있다.
병원균 유래의 에리시타 외에, 여러 종의 농약, 항생 물질, 중금속 등이 에리시타 활성을 갖는 것으로 알려져 있으나, 피토카산 EL 같은 벼 내의 성분에 에리시타 활성이 있는 것은 지금까지 알려진 바가 없다.
에리시타는, 상기한 바와 같이, 식물체 내에 병해균에 항균성을 보이는 피토알렉신의 생산을 유도하는 것으로 부터, 종래의 합성농약과는 다른 작용에 의한 안정성이 높은 식물병해 방제제로 얻은 것이 기대되지만, 아직 실용화의 예가 적은 것이 실정이므로, 따라서, 당 업계에서는, 그와 같은 피토알렉신의 생산유도물질을 이용한 안정성이 높은 식물병해 방제제를 개발하는 것이 강하게 요구되는 상황에 있다.
본 발명은, 벼의 피토알렉신으로서, 도열병균 및 문고병균에 항균성을 보이는 새로운 디테르펜 화합물의 피토카산에 관한 것으로, 상세하게는, 피토카산 A, B, C 또는 D에 관한 것이다. 본 발명에 관한 피토카산 A, B, C 또는 D는, 도열병균 및 문고병균에 대하여 강한 항균성을 가지고, 도열병 및 문고병으로부터 벼를 보호하기 위해서 유용하다.
또한, 본 발명은, 벼 유합조직의 액체배양액에 도열병균 및 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출물을 첨가하여, 도열병균 등에 항균성을 보이는 테르펜 화합물의 피토카산과 모미락톤을 생산케 한 후, 이것을 분리하는 것으로 이루어지는 항균성 테르펜 화합물의 피토카산 내지 모미락톤을 고생산률로 제조하는 방법에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은, 벼 안에서 추출된 피토알렉신 유도활성을 가지는 새로운 디테르펜 화합물의 피토카산 EL에 관한 것이고, 더욱 상세히는, 벼에 피토알렉신의 생성을 유도하는 활성을 가지고, 또한 그 자체 도열병균, 문고병균에 항균활성을 보이는 피토카산 EL과 그 제조방법 및 잔류독성의 걱정이 없는 저독성, 무공해의 벼 병해방제제에 관한 것이다. 피토알렉신은 이것들의 병해균에 대하는 강한 항균활성을 갖기 때문에, 본 발명에 관한 피토카산 EL을 벼에 시용하는 것에 의하여 도열병, 문고병의 감염을 방어하는 것이 가능하다.
도 l은, 본 발명의 피토카산 A의 적외부 흡수스펙트럼을 나타낸다.
도 2는, 본 발명의 피토카산 B의 적외부 흡수스펙트럼을 나타낸다.
도 3은, 본 발명의 피토카산 C의 적외부 흡수스펙트럼을 나타낸다.
도 4는, 본 발명의 피토카산 D의 적외부 흡수스펙트럼을 나타낸다.
도 5는, 본 발명의 피토카산 A의lH-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은, 본 발명의 피토카산 B의1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은, 본 발명의 피토카산 C의1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은, 본 발명의 피토카산 D의lH-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는, 본 발명의 피토카산 A의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은, 본 발명의 피토카산 B의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 ll은, 본 발명의 피토카산 C의l3C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는, 본 발명의 피토카산 D의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 13은, 본 발명의 피토카산 A의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 14는, 본 발명의 피토카산 B의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 15는, 본 발명의 피토카산 C의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 16은, 본 발명의 피토카산 D의 CD 스펙트럼을 나타낸다.
도 17은, 본 발명에 의해 제조된 피토카산 A의 매스 스펙트럼을 나타낸다.
도 18은, 본 발명에 의해 제조된 피토카산 B의 매스 스펙트럼을 나타낸다.
도 19는, 본 발명에 의해 제조된 피토카산 C의 매스 스펙트럼을 나타낸다.
도 20은, 본 발명에 의해 제조된 피토카산 D의 매스 스펙트럼을 나타낸다.
도 21은, 본 발명에 의해 제조된 모미락톤 A의 매스 스펙트럼을 나타낸다.
도 22는, 본 발명에 의해 제조된 모미락톤 B의 매스 스펙트럼을 나타낸다.
도 23은, 본 발명의 피토카산 EL의 적외부 흡수스펙트럼을 나타낸다.
도 24는, 본 발명의 피토카산 EL의1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 25는, 본 발명의 피토카산 EL의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 26은, 본 발명의 피토카산 EL의 CD 스펙트럼(Circular Dichroism, 원편광 이색성)을 나타낸다.
이러한 상황 중에, 본 발명자 등은, 식물의 저항성 반응에 의해 생산되는 새로운 피토알렉신 관련물질을 널리 탐색하여, 그것들의 연구를 쌓아온 결과, 지금까지 보고되어 있지 않은 새로운 디테르펜 화합물을 찾아냄과 더불어, 그 새로운 화합물이 도열병균 및 문고병균에 대하여 강한 항균성을 보이는 것을 발견하였다. 즉, 본 발명자 등은, 도열병균, 문고병균에 감염된 벼가 저항성반응(과민감반응)을 보이는 식물체의 부위(잎부, 줄기부)에 있어서, 도열병균 및 문고병균에 항균성이 있는 물질이 생산되는 것을 발견하고, 또한 그 활성물질을 용매추출, 컬럼 크로마토그래피 등의 수단에 의해 분리하는 것은 성공하였다. 따라서, 이것들의 항균성물질이 아래의 일반식(Ⅰ)의 구조를 가진 새로운 물질의 피토카산 A, B, C, D인 것과, 더욱이 이것들의 물질이 도열병 방제제 및 문고병 방제제의 유효성분으로서 유용한 것을 밝혔다.
본 발명은, 벼의 피토알렉신이고, 도열병균 및 문고병균에 항균성을 보이는 새로운 디테르펜 화합물의 피토카산 A, B, C 또는 D를 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
본 발명은, 도열병균에 대하여 강한 항균성을 가지고, 도열병해 방제제의 유효성분으로서 유용한 새로운 물질을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
본 발명은, 문고병균에 대하여 강한 항균성을 가져, 문고병해 방제제의 유효성분으로서 유용한 새로운 물질을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
또한, 본 발명자 등은, 식물성분의 제조에 사용되는 것이 많은 식물의 유합조직 액체배양법에 착안하여, 벼 유합조직 배양액에 도열병균 및 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출물을 피토카산 및 모미락톤 유도물질로서 첨가하여 배양하는 방법을 시험한 결과, 도열병균 및 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출물을 사용하는 것보다, 단기간에 다량의 피토카산 내지 모미락톤을 용이하게 고생산률로 얻을 수 있는 것을 발견하였다.
본 발명은, 벼의 유합조직 배양액에 도열병균 및 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출물을 피토카산 유도물질로서 첨가하여 피토카산을 생산케 한 후, 이것을 분리하는 것을 특징으로 하는 피토카산의 제조법을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
본 발명은, 벼의 유합조직 배양액에 도열병균 및 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출물을 모미락톤 유도물질로서 첨가하여 모미락톤을 생산케 한 후, 이것을 분리하는 것을 특징으로 하는 모미락톤의 제조법을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
더욱, 본 발명자 등은, 벼 내에 피토알렉신을 생산, 유도시키는 물질을 여러 가지 검색한 결과, 벼 성분의 한 가지가 이와 같은 활성을 가지는 것을 새롭게 찾아내었다. 또한, 이 물질은, 병원균에 대하여 항균성을 가지는 것과, 벼의 유합조직 배양에 의해서 효율이 좋게 생산되는 것을 찾아내었다. 더욱이, 이 물질을 용매추출, 컬럼 크로마토그래피 등의 수단에 의해 분리하여 그 구조해석을 한 결과, 그 물질은, 아래의 구조를 갖는 새로운 물질 피토카산 EL인 것을 밝히고, 또한, 본 물질이 도열병균, 문고병 방제제로서 유효한 것을 밝혔다.
본 발명은, 벼에 피토알렉신의 생산을 유도하는 에리시타에 있고, 또한 도열병균, 문고병균에 항균성을 보이는 새로운 물질 피토카산 EL을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
본 발명은, 벼의 유합조직 배양액으로부터 피토카산 EL을 채취하는 것에 의하여 피토카산 EL을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
본 발명은, 피토카산 EL을 벼에 사용하는 것에 의해 도열병균, 문고병해를 방제하는 것이 가능한 도열병해, 문고병해 방제제를 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
상기한 과제를 해결하는 본 발명의 제l실시예는, 벼의 피토알렉신으로서, 도열병균 및 문고병균에 항균성을 보이고, 아래의 일반식(Ⅰ)으로 나타내는 디테르펜 화합물 피토카산 A, B, C 또는 D에 관하는 것이다(단, 식에서 R1, R2, R3은 아래의 각 치환기를 나타낸다.).
···(Ⅰ)
R1 | R2 | R3 | |
피토카산 A | H, H | α-H, β-OH | O |
피토카산 B | α-H, β-OH | α-H, β-OH | α-H, β-OH |
피토카산 C | α-H, β-OH | H, H | α-H, β-OH |
피토카산 D | H, H | O | α-H, β-OH |
상기한 바와 같이, 본 발명에 관한 피토카산 A, B, C, D는, 도열병균 및 문고병균에 감염된 벼가 저항성반응(과민감반응)을 보이는 식물체의 부위(잎부, 줄기부)에 있어서 생산되는 식물체 유래의 물질인 것에서, 그 활성물질은 그와 같은 벼의 식물체의 잎부, 줄기부 등의 적정 부위를 모아, 이것을 출발재료로서, 초산에틸, 메탄올, 에탄올, 아세톤 등의 용매로 추출처리하고, 컬럼 크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피 등의 수단에 의해 정제 처리하는 것에 따라서 단일성분의 것으로서 분리하는 것이 가능하다.
정제의 구체적 과정으로서는, 예를 들어, 용매로 추출한 후, 셋푸팩 C-18의 컬럼 크로마토그래피에 의한 흡착 및 용출처리에 의해 피토카산 화분을 분리하고, 다음에, TSKgel ODSl20 등의 컬럼에 의한 고속액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 분화, 농축건고조작 등의 정제과정에 의해, 정제, 분리하는 방법이 좋은 것으로 예시되지만, 그 방법에 한하지 않고, 다른 동일 정제수단을 적정 조합하여 실시하는 것도 가능하며, 그 정제과정에 관하여는 특히 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 피토카산 A, B, C, D는, 새로운 물질이고, 다음과 같은 성질을 갖는다.
1)피토카산 A, B, C, D는, 어느 것이나 무색의 껌 형상물질로, 아세톤, 클로로포름, 메탄올, 에탄올에 녹을 수 있고, 계면활성제를 포함하는 물에 100ppm 전후의 농도로 용해한다.
2)고분해능 질량분석에 의한 정밀분자량은, 아래와 같다.
피토카산 A : 316.2052(C20H2803으로서의 계산치 316.2065)
피토카산 B(수소 l원자 부가한 것으로 하고) : 335.2286(C20H3104로서의 계산치 335.2223)
피토카산 C : 318.2164(C20H3003으로서의 계산치 318.2133)
피토카산 D : 316.2048(C20H2803으로서의 계산치 316.2065)
3)피토카산 A, B, C, D는, 도 l~4에 나타낸 적외부 흡수스펙트럼을 나타낸다.
4)피토카산 A, B, C, D는, 도 5~8에 나타낸1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
5)피토카산 A, B, C, D는, 도 9~12에 나타낸13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
6)피토카산 A, B, C, D는, 도 13~16에 나타낸 CD 스펙트럼(Circular Dichroism, 원편광 이색성)을 나타낸다.
7)피토카산 A, B, C, D는, 도열병균의 포자의 발아를 저해하는 성질을 가져, 이를 벼에 시용하면, 도열병균의 발생을 저해할 수 있다. 도열병균의 포자의 발아를 50%저해하는 피토카산의 농도는, 피토카산 A가 10ppm, 피토카산 B가 3ppm, 피토카산 C가 6ppm, 피토카산 D가 20ppm 이다.
8)피토카산 A, B, C, D는, 문고병균 균사의 신장을 저해하는 성질을 가져, 이들을 벼에 시용하면, 벼의 문고병의 발생을 저해할 수 있다. 문고병균 균사의 신장을 저해하는 피토카산의 농도에 관하여는, 피토카산 A가 17ppm에서 균사 신장이 꽤 저해되어, 피토카산 B가 생기는 15ppm 및 피토카산 C가 10ppm에서 균사의 신장이 완전히 저해된다. 피토카산 D에서는 50ppm에서 균사의 신장이 꽤 저해된다.
본 발명의 피토카산 A, B, C, D는, 아래의 실시예에 나타낸 도열병균 감염방어시험 및 문고병균의 균사신장 저해시험의 결과로부터 명백하듯이, 도열병균 포자의 발아 및 균사의 신장을 저해하는 성질, 문고병균 균사의 신장을 저해하는 성질을 갖고 있고, 이들은, 도열병해 방제제, 문고병해 방제제의 유효성분으로서 유용하다. 본 발명의 피토카산 A, B, C, D는, 상기한 각종 성질을 가지므로, 그 화합물을 적정 형태의 약제로 하여 벼에 시용하는 것보다, 도열병의 발생, 문고병의 발생을 억제하는 것이 가능하다. 그 화합물을 벼에 시용하기 위한 약제의 형태, 그 사용형태, 시용방법 등은, 특히 한정되는 것이 아니고, 가령, 상기한 도열병균 포자의 발아를 50% 저해하는 농도를 기준으로서, 그 화합물을 유효성분으로 하는 적정 분량 및 형태의 약제를 조제하여, 보통 방법에 의하여 시용하는 것이 좋다.
본 발명의 피토카산 A, B, C, D는, 벼의 식물체 내에 생산되는 천연기원의 물질이고, 더구나 건전식물조직에 의해서 용이하게 분해되어, 거의 잔류하지 않는 성질을 가지므로, 도열병균 및 문고병균에 대하는 높은 항균활성을 갖는 것뿐만 아니라, 특히, 환경보전의 시점에서 그 개발이 기대되는 소위 저독성, 무공해의 항균제로서 사용하는 것으로 그 유용성은 대단히 현저한 것이다.
또한, 상기한 과제를 해결하는 본 발명의 제2실시예는, 벼 유합조직의 액체배양액에 도열병균 및 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출물을 첨가하여 항균성 테르펜 화합물을 생산한 후, 그것을 분리하는 것을 특징으로 하는 항균성 테르펜 화합물의 제조방법에 관한 것이다. 본 방법에서 사용되는 벼 유합조직의 액체배지는, 탄소원, 질소원, 무기염류, 비타민, 식물 호르몬 등으로 이루어지는 종래부터 벼의 조직배양에 사용하고 있는 배지이면 어느 것이나 사용하지만, 바람직하게는, DK 배지이다.
이들의 배지에는 탄소원으로서 자당 등의 탄수화물이 이용되고, 무기염류, 질소원으로서, 초산카리, 유산암모늄, 염화칼슘, 아스파라긴 산, 글루타민 등이 사용된다. 또한, 비타민류로서는 니코틴 산, 염산티아민, 염산피리독신 등이 이용된다. 식물 호르몬으로서는, 2, 4-D, 카이네틴, 압시직 산, 인돌초산 등이 적정 이용된다.
사용하는 벼의 품종, 조직부위는 특히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 코시히까리 종자보다 조제한 유합조직에 있다. 벼 유합조직을 형성시키기 위해서는, 보통 방법에 준하여 행하는 것이 좋고, 특별히 한정되는 것이 아니나, 적절히는 가령 벼 종자의 왕겨를 제외한 배유와 배의 부위를 상기 액체배지에 2,4-D를 배량 가하여, 아스파라긴 산, 글루타민을 제외한 배지에 의해 무균적으로 배양하면 좋고, 가령 pH5.8, 25℃에서 30일간 암실에서 정치 배양하는 것에 의해, 벼 유합조직이 형성된다.
본 방법에 있어서는, 벼 유합조직의 액체배양액에 도열병균 또는 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출물을 첨가하여 항균성 테르펜 화합물을 유도시킨다.
피토카산의 유도물질에 도열병균, 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출성분의 조제방법은, 좋은 것을 나타내면, 예를 들어 다음과 같은 것이다. 호밀 액체배지(1L중, 호밀 종자60g의 물 추출물과 사카로스 20g, 이스트엑기스 2g을 포함하는)에 각각의 균주를 접종하여, 도열병균은 28℃에서 5~7일 진탕 배양, 감자유행병균은 18℃에서 1개월 정치 배양한다. 각각의 배양액을 여과하여, 균체를 나눈다. 약50g의 균체에 180㎖의 물을 가하여 호모지나이사로 마쇄하고 초음파로 파쇄 후, 오토클레이브(121℃, 60분)로 열분해한다. 분해물을 원심 분리하여 얻어지는 상정액을 피토카산 유도물질 시료로 하여 이용한다. 모미락톤 유도물질도, 같은 실시예로 하여 조제할 수 있다. 균체추출성분의 조제방법은, 상기 방법에 한하지 않고, 그것과 동일 효과의 것이면 같이 사용할 수 있는 것은 말할 필요도 없다.
유합조직의 배양액에 상기의 피토카산 및 모미락톤 유도물질을 첨가 후, 수 일간 배양하여 상정액을 원심 분리한다. 상정액을 초산에틸 등의 용매로 추출, 용매를 유거하여 조피토카산 및 모미락톤의 혼합물을 얻을 수 있다. 피토카산 A, B, C, D의 각 성분량, 모미락톤 A, B의 각 성분량은, 고속액체 크로마토그래피로 확인할 수가 있고, 또한, 상당하는 각 성분의 피크를 취함으로써 각 성분을 한 번에 얻을 수 있다. 피토카산의 분리를 위한 HPLC의 조건은, 아래와 같다.
컬럼 : TSK-gel ODS l20T(4.6㎜ × 300㎜)
용매 : 아세토니트릴(45) : 물(55)(용적비)
유속 : l㎖/min
검출기 : UV 280㎚
또한, 모미락톤에 관하여는, 아래와 같다.
컬럼 : TSK-gel ODS l20T(4.6㎜ × 300㎜)
용매 : 아세토니트릴(45) : 물(55)(용적비)
유속 : l㎖/min
검출기 : UV 215㎚
본 발명의 피토카산 A, B, C, D는, 상기한 배양의 상정액을 출발재료로서, 상기와 같이 하여, 초산에틸, 메탄올, 에탄올, 아세톤 등의 용매로 추출 처리하여, 컬럼 크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피 등의 수단에 의해 정제 처리함으로써 단일 성분의 것으로서 분리할 수 있다.
한편, 모미락톤 A, B는, 벼 종자의 발아를 억제하여, 도열병균에 항균성을 보이는 물질로서 알려져 있고, 모미락톤 A, B의 분자식과 분자량은, 아래에 나타낸다.
모미락톤 A C20H2603314
모미락톤 B C20H2604330
또, 모미락톤 A, B는, 아래의 화학구조를 가진다.
모미락톤 A, B는, 상기한 배양의 상정액을 출발재료로서, 상기 피토카산의 경우와 동일 실시예로 하여 정제할 수 있다.
아래의 실시예에 나타낸 바와 같이, 모미락톤 A, B의 생산량은, 종래 법에 의하면, 배양액 l㎖ 당 0.245㎍, 0.864㎍이었으나, 본 발명에 의하면, 3.3㎍, 10.5㎍이므로, 생산량이 현저히 증대하여, 종래 고생산률화를 달성하는 것이 곤란하던 모미락톤의 생산량을 대폭 개선할 수 있게 되었다.
더욱이, 상기한 과제를 해결하는 본 발명의 제3실시예는, 벼에 피토알렉신의 생성을 유도하는 활성을 가지고, 또한 도열병균, 문고병균에 대하는 항균활성을 가지는 아래의 구조식으로 나타내는 피토카산 EL에 관한 것이고, 또한, 벼 유합조직의 액체배양액에 도열병균 또는 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출물을 첨가하여 피토카산 EL을 생산한 후, 이것을 분리하는 것을 특징으로 하는 상기 피토카산 EL의 제조방법, 더욱이 상기의 피토카산 EL을 유효성분으로 하는 도열병해, 문고병해 방제제에 관한 것이다.
본 발명자 등은, 피토알렉신을 생산, 유도시키는 물질을 탐색하는 것을 목표로서, 벼의 잎면에 시료를 도포하여 적정시 재배 후, 벼 내에 생산된 피토알렉신의 량을 측정하는 시험을 여러 가지 실시하는 과정에서, 도열병균 또는 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출물을 첨가한 벼 유합조직의 액체배양액으로부터의 용매추출물이 피토알렉신을 유도하는 높은 활성을 보이는 것을 인정하였다. 따라서, 그 유효성분(피토카산 EL)은, 예를 들면, 벼 유합조직의 액체배양액에 도열병균 또는 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출물을 첨가하여 적정시 배양함으로써 생산할 수 있고, 그 후 피토카산 EL이 생산된 것을 확인하기 위해, 배양액을, 예를 들어 초산에틸, 클로로포름, 에틸에테르 등의 비수용성 유기용매로서 추출 처리하여, 고속액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피 등의 수단에 의해 정제 처리하는 것으로 단일 성분의 것으로서 분리할 수 있다.
유합조직의 배양액에 상기의 피토카산 EL 유도물질시료를 가하여, 이것을 수 일간 배양하여, 그 상정액을 분리한다. 피토카산 EL 정제의 구체적 과정으로서는, 예를 들어 상정액을 초산에틸 등의 용매로 추출 처리한 후, 추출성분을 TSKgel ODS 120A(도소사제(製)), ODS 120T(도소사제) 등으로 고속액체 크로마토그래피에 의한 분화, 농축건고 등의 정제 과정으로 정제하여, 분리하는 방법이 좋은 것으로 하여 예시되지만, 그 방법에 한하지 않고, 다른 동일 실시예의 정제수단을 적정 조합하여 실시하는 것도 가능하고, 그 정제 과정에 관하여 특히 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 피토카산 EL은, 새로운 물질이고, 다음과 같은 성질을 갖는다.
l)피토카산 EL은 무색의 껌 형상 물질로, 아세톤, 클로로포름, 메탄올, 에탄올에 녹을 수 있고, 물에 100ppm 전후의 농도로 용해한다.
2)피토카산 EL의 고분해능 질량분석에 의한 정밀분자량은 316.2062(C20H2803으로서의 계산치 316.2065)를 나타낸다.
3)피토카산 EL은 도 23에 나타낸 적외부 흡수스펙트럼을 나타낸다.
4)피토카산 EL은 도 24에 나타낸1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
5)피토카산 EL은 도 25에 나타낸13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
6)피토카산 EL은 도 26에 나타낸 CD 스펙트럼(Circular Dichroism, 원편광 이색성)을 나타낸다.
7)피토카산 EL은, 벼에 피토알렉신의 생산을 유도하는 성질을 나타낸다. 유도되는 피토알렉신으로서는 피토카산 A, B, C, D, 모미락톤 A, B 등이다. 이것들의 물질은 도열병균, 문고병균에 대하는 강한 항균활성을 갖기 위하여, 이들 물질의 유도를 받은 벼는, 병해균에 대하여 저항성을 나타내는 것으로 생각된다.
8)피토카산 EL은, 도열병균의 포자의 발아 및 균사의 신장을 저해하는 작용을 갖는다. 포자의 발아를 50% 저해하는 피토카산 EL의 농도는 7ppm이고, 또한 그 농도에서 균사의 신장은 꽤 저해된다.
9)피토카산 EL은, 10ppm의 농도에서 문고병균의 균사의 신장을 저해한다.
본 발명의 피토카산 EL 은, 아래의 실시예에 나타낸 바와 같이, 벼에 항균성물질의 피토알렉신 생산을 유도하는 성질, 도열병균의 포자의 발아 및 균사의 신장을 저해하는 성질, 또한 문고병균의 균사의 발아를 저해하는 성질을 가지는 것부터, 피토카산 EL은, 도열병해 방제제, 문고병해 방제제의 유효성분으로서 유용하다. 피토카산 EL은, 상기한 각종 성질을 가지는 것에서, 그 화합물을 적정 형태의 약제로 벼에 시용하는 것보다, 도열병의 발생 및 문고병의 발생을 억제할 수 있다. 본 발명의 약제는, 아래의 실시예로 나타낸 바와 같이, 그 사용목적에 따라, 상기 유효량을 포함하는 형태로 적정 형태로 제제화(製劑化)하면, 그 형태, 제제수단 등은 특히 한정되지 않는다.
그 화합물을 벼에 시용하는 방법으로서는, 아래의 실시예 10에서 기술한 바와 같이, 예를 들어 그 화합물을 0.l%의 트윈20을 포함하는 pH5.5의 20mM 인산완충액에 용해하여, 그 용액을 벼에 분무 살포하는 방법 등이 좋은 것으로 예시되지만, 이것으로 한정되지 않고, 그 밖의 방법으로도 좋고, 그 화합물을 벼에 시용하기 위한 약제의 형태, 그 사용형태, 시용방법 등은 특히 한정되는 것은 아니다.
다음에, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 그 실시예에 의해서 조금도 한정되는 것은 아니다.
(실시예 l)
(피토카산 A, B, C, D의 분리)
Rhizoctonia solani(문고병균)에 감염된 벼(코시히까리)의 줄기부 2kg을 모아, 이것을 초산에틸로 추출 후, 추출성분을 미리포아리밋텟드사제(製) 세쯔부팍 C-l8에 흡착시켜, 이것을 40% 에탄올로 용출하여, 피토카산 화분을 분리하였다. 다음에, 이것을 시료로서, 고속액체 크로마토그래피를 이용하여, 3단계의 분리조작을 하는 것에 의해 정제를 하였다. 제l단계로서 도소사제(製) TSKgel ODS-120A에 시료를 주입하고, 52.5% 에탄올에 의하여 용출하여, 피토카산 화분을 분리하였다. 제2단계로서 도소사제 TSKgel ODS-120A에 시료를 주입하여, 60% 아세토니트릴에 의하여 용출하여, 피토카산 화분을 분리하였다. 제3단계로서 도소사제 TSKgel ODS-120T에 시료를 주입하여, 50% 아세토니트릴에 의하여 용출하여 피토카산 B, C를, 55% 아세토니트릴에 의하여 용출하여 피토카산 A를, 60% 아세토니트릴에 의하여 용출하여 피토카산 D를 분리하였다. 각 단계 컬럼조건에서의 피토카산 A, B, C, D의 유지시간(분)을 표 1에 나타낸다.
컬럼 조건 | 유지시간 (분) | |||
피토카산 A | 피토카산 B | 피토카산 C | 피토카산 D | |
ODS-120A 52.5% 에탄올 | 38 | 44 | 44 | 44 |
ODS-120A 60% 아세토니트릴 | 37 | 37 | 37 | 44 |
ODS-120T 50% 아세토니트릴 | 48 | 45 | ||
ODS-120T 55% 아세토니트릴 | 45 | |||
ODS-120T 60% 아세토니트릴 | 44 |
이상의 3단계의 고속액체 크로마토그래피에 의한 분화에 의해, 각각 단일의 피토카산 화분으로서, 피토카산 A 약20mg, 피토카산 B 약10mg, 피토카산 C 약3mg, 피토카산 D 약8mg을 얻었다.
한편, 피토카산 A, B, C, D의 적외부 흡수스펙트럼,1H-NMR 스펙트럼,13C-NMR 스펙트럼 및 CD 스펙트럼을 도 1~16에 나타낸다.
(실시예 2) (도열병균감염 방어시험)
벼(품종 10석) 종자를 배양토를 채운 화분에 l화분 당 8알맹이 파종하여, 4, 5잎 전개기까지 길러, 각 12화분을 l구로서 3구를 시험한다. 트윈(tween) 20을 500ppm 포함하는 물에 피토카산 A 6ppm의 용액 및 피토카산 B 3ppm의 용액을 조제하였다. 물 및 각 시료용액을 30㎖씩 각 구의 벼에 분무하여, 실온으로 4시간 방치하여 잎면을 건조시켰다. 이 잎면에, 도열병균 레이스 007주(친화성주)의 포자현탁액을 50㎖씩 각 구에 분무한 후, 가습, 암흑의 조건 하에서, 24시간 방치하여 접종처리를 행하였다. 그 후, 그것들을 인공기상실에 옮겨 재배하여, 5일 후에 각 구의 감염잎과 무감염잎의 매수를 세어, 도열병균의 발병을 비교하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
시료구 | 무감염 잎수 (매) | 감염 잎수 (매) | 발병률 (%) |
대조 | 178 | 88 | 49 |
피토카산 A | 178 | 54 | 30 |
피토카산 B | 184 | 36 | 20 |
물처리구에서는, 무감염잎수가 178매에 대하여 감염잎수가 88매로, 발병률은 49%, 피토카산 A에서는, 무감염잎수가 178매에 대하여 감염잎수가 54매로, 발병률은 30%, 피토카산 B에서는, 무감염잎수가 184매에 대하여 감염잎수가 36매로, 발병률은 20%이고, 피토카산 A, B의 도열병의 발병억제 효과가 분명히 확인되었다. 한편, 피토카산 C, D에 관해서 동일 형태의 시험을 하였으므로, 거의 같은 결과가 얻어졌다.
(실시예 3)(도열병균의 균사신장 저해시험)
도열병균(Pyricularia oryzae 레이스 007)의 포자를 트윈 20을 100ppm 함유하는 물로 부유액을 조제하여, 그 25㎕를 홀 대물경 플레이트에 놓았다. 그 플레이트 상의 포자를 28℃, 6시간 배양하여, 포자를 발아시켰다. 따로 피토카산의 시료를, 트윈 20을 500ppm 함유하는 물에 소정농도로 녹였다. 플레이트 상의 발아한 포자부유액에, 소정농도의 피토카산 수용액 25㎕를 가한 시료구, 및 트윈 20을 500ppm 함유하는 물 25㎕를 가한 대조구를 조제하여, 이들을 28℃에서 하루 밤 배양하여, 균사의 신장상태를 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.
시료구 | 균사장이 대조구의 약 50%를 나타낸 피토카산 농도(ppm) |
대조 | - |
피토카산 A | 10 |
피토카산 B | 3 |
피토카산 C | 6 |
피토카산 D | 20 |
균사 길이가 대조구의 약50%을 나타낸 시료구의 시료농도는, 피토카산 A에서는 10ppm, 피토카산 B에서는 3ppm, 피토카산 C에서는 6ppm, 피토카산 D에서는 20ppm 이었다.
(실시예 4)(문고병균의 균사신장 저해시험)
시판의 포테토데키스토로스 한천배지(영연화학주식회사제(製)) 3.9g을 100㎖에 녹여, 2㎖씩 시험관에 넣고, 121℃, 15분간 오토클레이브로 살균한 후, 60℃로 냉각하였다. 다른 피토카산 시료를, 트윈 20을 500ppm 함유하는 물에 소정농도로 녹인 후, 무균여과 하였다. 피토카산 용액을 한천배지의 용액에 가하여 균일하게 혼합하여 샬레에 흘리고, 소정농도의 시료를 함유하는 한천 플레이트를 조제하였다. 또한, 대조로서, 각 피토카산 시료를 함유하지 않은 상당량의 트윈 20을 500ppm 함유하는 물을 한천배지에 가한 대조의 플레이트를 조제하였다.
이들의 샬레 플레이트의 중앙에, 문고병균(Rhizoctonia solani)을 배양한 한천배지의 소편을 두고, 28℃에서 배양하여 40시간 후의 균사의 신장을 관찰하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다. 한편, 균사는 저해가 없으면 중앙의 접종원을 중심으로 신장하여, 원형의 균총(菌叢)을 형성한다.
시료구 | 피토카산 농도 (ppm) | 균총의 직경 (㎜) |
대조 | - | 18 |
피토카산 A | 17 | 5 |
피토카산 B | 15 | - |
피토카산 C | 10 | - |
피토카산 D | 50 | 5 |
대조 플레이트의 균총의 직경이 18㎜인데 대하여, 피토카산 A 17ppm 구에서는 5㎜이고, 피토카산 B 15ppm 구 및 피토카산 C 10ppm 구에서는 균사의 신장은 인정되지 않았다. 피토카산 D 50ppm 구에서는 균총의 직경은 5㎜ 농도이었다.
(실시예 5)(항균성 테르펜 화합물의 제조)
l)벼의 유합조직의 형성
벼(코시히까리) 종자의 왕겨 부분을 제거한 배 및 배유부분을, 70% 에탄올 액과 l% 차아염소산 조달용액으로 살균한 후, DK 배지에서 아스파라긴 산, 글루타민을 제한 2, 4-D를 2배량과 아가로스를 1% 가한 배지에 심었다. 30일 후에 유합조직이 유도되기 때문에, 이것을 액체배지에 옮긴다.
2)벼의 유합조직의 증식
벼(코시히까리)의 유합조직을 DK 배지(lL 중, 수크로스 30g, KNO30.809g, (NH4)SO40.066g, NaH2PO4·2H20 0.312g, CaCl2·2H20 0.148g, MgSO4·7H20 0.246g, Fe-EDTA 0.02g, 비타민류 0.101g, 글리신 2mg, 아스파라긴 산 0.7g, 글루타민 0.7g, 2, 4-D lmg, 그 밖의 염, MnS04·4~6H20, ZnS04·7H20, CuSO4·5H20, Na2MoO4·2H20, H3BO3의 필요량을 포함하는 액체배지)에, pH5.8, 25℃, 14일간, 선회배양(90rpm, 25℃, 3,0001ux)하여 증식시켰다. 이 유합조직을 적량에, 스퍼텔로 잘게 짓이기고, 20mesh의 철망을 통과하는 유합조직만을 구별하였다.
3)피토카산의 제조
구별한 유합조직을 500㎖의 삼각 플라스크에 넣어 90㎖의 DK 배지를 가하고, 2일간 선회배양(90rpm, 25℃, 3,000lux)을 한 후, 배양액에 무균여과한 감자유행병균의 균체추출 성분용액 l㎖을 가하여, 또한 4일간 선회배양을 계속하였다. 배양종료 후, 배양액을 원심 분리하여(12,000rpm) 얻어진 상정액에 같은 양의 초산에틸을 가하여 피토카산을 추출하여, 추출액을 감압 아래, 농축건고 하였다. 농축물을 적량으로, 에탄올 40%의 용액에 용해하여 고속액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 피토카산 각 성분량은 표 5와 같았다.
피토카산의 종류 | 피토카산의 생산량 ㎍/배양상정액 1㎖ |
피토카산 A | 6.3 |
피토카산 B | 0.6 |
피토카산 C | 15.4 |
피토카산 D | 1.2 |
피토카산의 각 성분을 HPLC에서 분화 후, 상당하는 피크 부분을 취하여 농축건고 하였다. 소량의 아세톤에 용해하여, 가스 크로마토그래피 질량분석계로 분석한 결과, 각각의 분자량에 상당하는 분자이온 피크를 나타내는 매스 스펙트럼이 얻어진다(도 17~20). 또, 도열병균의 균체 추출성분을 사용하여 동일 형태로 실시한 바, 거의 같은 결과가 얻어졌다.
4)모미락톤의 제조
구분한 유합조직을 500㎖의 3각 플라스크에 넣어 90㎖의 DK 배지를 가하고, 2일간 선회배양(90rpm, 25℃, 3,000lux)을 한 후, 배양액에 무균여과한 감자유행병균의 균체추출 성분용액 l㎖을 가하여, 4일간 선회배양을 계속하였다. 배양종료 후, 배양액을 원심 분리하다(12,000rpm) 얻어진 상정액에 동량의 초산에틸을 가하여 모미락톤을 추출하여, 추출액을 감압 아래, 농축건고하였다. 농축물을 적량으로, 에탄올 40%의 용액에 용해하여 고속액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 모미락톤 각 성분량은 표 6과 같았다. 또, 종래법(도열병균을 직접 접종하는 방법)에 의해 생산되는 모미락톤 A, B의 생산량은, 각각, 0.245㎍/㎖, 0.864㎍/㎖ 정도인 것에서, 본 발명에 의한 모미락톤의 생산량은 종래법과 비교하여 대단히 고생산률의 것도 있다.
모미락톤의 종류 | 모미락톤의 생산량 ㎍/배양상정액 1㎖ |
모미락톤 A | 3.3 |
모미락톤 B | 10.6 |
모미락톤의 각 성분을 HPLC에서 분화 후, 상당하는 피크부분을 취하여 농축건고하였다. 소량의 아세톤에 용해하여, 가스 크로마토그래피 질량분석계로 분석한 결과, 각각의 분자량에 상당하는 분자이온 피크를 나타내는 매스 스펙트럼이 얻어진다(도 21~22). 또, 도열병균의 균체추출성분을 사용하여 동일 형태로 실시하였으므로, 거의 같은 결과가 얻어졌다.
(실시예 6)(피토카산 EL의 제조)
1)벼의 유합조직의 증식
벼(품종 : 코시히까리)의 유합조직을 DK배지(lL 중 수크로스 30g, KNO30.809g, (NH4)S040.066g, NaH2PO4·2H20 0.312g, CaCl2·2H20 0.148g, MgSO4·7H20 0.246g, Fe-EDTA 0.02g, 비타민류 0.101g, 글리신 2mg, 아스파라긴 산 0.7g, 글루타민 0.7g, 2, 4-D lmg, 및 그 밖의 염으로서, MnSO4·4~6H20, ZnSO4·7H20, CuSO4·5H20, Na2MoSO4·2H20, H3BO4의 필요량을 함유하는 액체배지)에, pH5.8, 25℃의 조건으로 선회배양(90rpm, 25℃, 3,0001ux)하여 증식시켰다. 그 유합조직을 적량으로, 스파텔로 잘게 짓이겨, 20mesh의 철망을 통과하는 유합조직만을 구별하였다.
2)피토카산 EL의 생산량
구별한 유합조직을 500㎖의 삼각플라스크에 넣어, 이것에 90㎖의 DK배지를 가하고, 2일간 25℃에서 선회배양(90rpm, 25℃, 3,0001ux)을 한 후, 배양액에 무균여과한 감자유행병균의 균체추출 성분용액 l㎖을 가하여, 4일간 선회배양을 계속하였다. 배양종료 후, 배양액을 원심기에 걸쳐서(ll,500rpm, 2hr)상정액을 분리하였다.
3)피토카산 EL의 추출, 정제
상정액에, 탄산나트륨을 가하고 pHl0.7에 조정한 후에, 동량의 초산에틸을 가하여 피토카산 EL을 추출하여, 추출액을 농축건고하였다. 잔사를 에탄올에 용해하여, 이것을 시료용액으로서, 2단계의 고속액체 크로마토그래피에 의한 분리, 정제를 하였다. 즉, 제1단계로서, 시료용액을 TSKge1 ODS-120A의 컬럼(21.5㎜×375㎜, 도소사제(製))에 주입하여, 55% 아세토니트릴에 의하여 용출(10㎖/min)하였다. 유지시간 41분 전후의 피토카산 EL 화분을 모아, 이것을 농축건고하여, 잔사를 에탄올에 용해하였다. 다음에, 제2단계로서, 그 시료용액을 TSKgel ODS-120T의 컬럼(21.5㎜×375mm, 도소사제)에 주입하여, 50% 아세토니트릴에 의하여 용출(10㎖/min)하였다. 유지시간 46분 전후의 피토카산 EL 화분을 모아, 이것을 농축건고하는 것에 의해 단일 피토카산 EL이 얻어졌다. lL의 배양상정액으로부터 약3mg의 피토카산 EL이 얻어졌다.
(실시예 7)(피토카산 EL에 의한 피토알렉신의 유도)
l)피토알렉신의 생산
실시예 l에서 얻은 피토카산 EL을 트윈20(화광순약사제(製))을 0.l% 함유하는 인산완충액(20mM, pH5.5)에 녹여서, 10, 20ppm의 시료용액을 조제하였다. 이 각 농도의 시료용액 및 시료를 포함하지 않은 용매액을, 포트로 재배한 벼(품종 : 코시히까리)에 시용하여, 피토알렉신 생산의 유도활성을 측정하였다. 이 경우, 시용부위는 완전 전개한 제6잎의 선단부분으로 하여, 그 적정 간격을 잇는 10점에 모세관 피펫으로 각 시료용액 20㎕를(l잎 당) 적하 시용하였다.
2)피토알렉신의 추출
시료용액으로 처리한 벼를 인공기상실에서 7일간 배양 후, 8매의 잎을, 잘게 자르고, 이것에 초산에틸 5㎖과 0.1규정탄산 나트륨액 5㎖(pHl0)을 가하여, 하루 밤 진탕하였다. 초산에틸 층을 취하여 이것을 농축건고하고, 잔사를 0.4㎖의 에탄올을 가하여 용해하였다.
3)HPLC에 의한 분석
이 용액에 0.02규정의 염산을 0.6㎖가하고, 혼합하여, 원심기에 걸어, 얻어진 상정액중 100㎕을 고속액체 크로마토그래피에 의한 분석에 제공하였다. HPLC의 조건은 아래와 같다.
컬럼 : TSK-gel ODS l20T(4.6mm×300mm, 도소사제)
용매 : 아세토니트릴(45) : 물(55)(용적비)
유속 : l.2㎖/min
온도 : 50℃
검출기 : UV 280㎚(피토카산), 215㎚(모미락톤)
다음 표 7에, 유도된 피토알렉신 양을 나타낸다. 표 7의 결과로부터 명백하듯이, 본 발명의 피토카산 EL은, 벼에 피토알렉신(피토카산 A, B, C, D, 피토카산 EL, 모미락톤 A, B)을 높은 레벨의 생성량으로 유도하는 활성을 갖는 것과 판명하였다.
피토카산EL 농도 (㎍/㎖) | 유도된 피토알렉신 양 (㎍/g잎) | ||||||
피토카산 A | 피토카산 B | 피토카산 C | 피토카산 D | 피토카산 EL | 모미락톤 A | 모미락톤 B | |
0 | 1.3 | 1.5 | 0.3 | 0.1 | 0.2 | 6.2 | 0.8 |
20 | 11.4 | 15.6 | 8.6 | 2.2 | 5.4 | 33.4 | 5.1 |
40 | 21.3 | 12.5 | 10.1 | 4.1 | 12.7 | 42.1 | 6.9 |
(실시예 8)(도열병균의 균사신장 저해시험)
l)방법
도열병균(Pyricularia oryzae 레이스 007)의 포자를 트윈20(화광순약사제(製))을 100ppm 함유하는 물에 현탁하여 부유액을 조제하여, 그 25㎕를 홀 대물경 플레이트에 놓았다. 플레이트를 28℃에서, 6시간 배양하여, 포자를 발아시켰다. 다른 피토카산 EL의 시료를 트윈20을 500ppm 함유하는 물에 소정농도로 녹였다. 플레이트 상의 발아한 포자부유액에, 소정농도의 피토카산 EL의 수용액25㎕을 가한 시료구 및 트윈20을 500ppm 함유하는 물 25㎕를 가한 대조구를 조제하여, 각 구를, 각각 28℃에서 하루 밤 배양 후, 각 구에서의 균사의 신장상태를 현미경으로 관찰하였다.
2)결과
그 결과, 피토카산 EL을 포함하는 시료구에서는, 도열병균의 균사의 신장이 저해되어, 피토카산 EL이 도열병균의 균사의 신장을 저해하는 작용을 갖는 것과 구분하였다. 또한, 균사길이가 대조구의 약50%를 나타내는 피토카산 EL의 농도는 7ppm 이었다.
(실시예 9)(문고병균의 균사신장 저해시험)
1)방법
시판의 포테토데키스토로스 한천배지(영연화학주식회사제(製)) 3.9g을 100㎖의 물에 녹여, 이 한천배지의 용액을 2㎖씩 시험관에 넣어, 121℃에서, 15분간 오토클레이브로 살균 후, 60℃에서 냉각하였다. 다른 피토카산 EL의 시료를 트윈20을 500ppm 함유하는 물에 소정농도로 녹인 후, 무균여과한다. 피토카산 EL의 용액을 한천배지의 용액에 가하여 균일하게 혼합하여 샬레에 흘리고, 피토카산 EL을 10ppm 함유하는 한천 플레이트를 조제하였다. 또한, 대조로서, 피토카산 EL을 함유하지 않은 상당량의 500ppm의 트윈20 수용액을 한천배지에 가한 대조의 플레이트를 조제하였다. 이들의 샬레의 플레이트의 중앙에, 문고병균(Rhizoctonia solani)을 배양한 한천배지의 소편을 두고, 28℃에서 배양하여 40시간 후 균사의 신장을 관찰하였다. 균사는 저해가 없으면 중앙의 접종원을 중심으로 신장하여 원형의 균총을 형성한다.
2)결과
그 결과, 피토카산 EL을 포함하는 시료로서는, 문고병균의 균사의 신장이 저해되어, 피토카산 EL이 문고병균 균사의 신장을 저해하는 작용을 갖는 것으로 구분하였다. 또한, 대조 플레이트의 균총의 직경이 18mm에 대하여, 피토카산 EL 10ppm 구에서는 균사의 신장은 인정되지 않았다.
(실시예 10)(도열병균감염 방어시험)
l)방법
벼(품종 : 코시히까리)종자를 배토를 채운 화분에 l화분 당 8알 파종하여, 6잎 전개기까지 길러, 각 18화분을 1구로 하여, 2구를 시험에 제공하였다. 피토카산 EL을 트윈20(화광순약사제(製)) 0.1% 함유하는 인산완충액(20mM, pH5.5)에 35ppm이 되도록 녹여, 시료용액을 조제하였다. 트윈20을 0.l% 포함하는 인산완충액 및 시료용액 50m1씩 각 구의 벼에 분무하고, 약23℃에서 24시간 방치하여 잎면을 건조시켰다. 이 잎면에, 도열병균(Pyricularia oryzae 레이스 007주(친화성주)의 포자현탁액을 50㎖씩 각 구에 분무 후, 가습, 암흑 하의 조건에서, 24시간 방치하여 접종처리를 하였다. 그 후, 인공기상실에 옮겨 재배하여, 5일 후에 각 구 벼잎 상에 관찰되는 회색병 얼룩수를 세어(18포트, 144주에서의 벼 일주 당의 평균 병 얼룩 수), 도열병균의 발병도를 비교하였다.
2)결과
그 결과, 벼 일주 당의 평균병 얼룩 수는 트윈20을 0.1% 함유하는 인산완충액의 처리구에서는 2.17개인데 대하여, 피토카산 EL의 시료용액 처리구에서는 0.91개이고, 피토카산 EL의 도열병의 발병억제 효과가 분명히 인정되었다.
(실시예 ll)(도열병해 방제제)
피토카산 EL 및 다른 성분을 아래의 배합비율로 배합하여 보통 방법에 의해 액제를 조제하였다.
피토카산 EL : 35㎍/㎖
트윈20(화광순약사제(製)) : 500ppm
인산칼륨완충액(20mM, pH5.5) : 100㎖
(실시예 12)(문고병해 방제제)
피토카산 EL 및 다른 성분을 아래의 배합비율로 배합하여 보통 방법에 의해 액제를 조제하였다.
피토카산 EL : 35㎍/㎖
트윈20(화광순약사제) : 500ppm
인산칼륨완충액(20mM, pH5.5) : l00㎖
본 발명은, 벼의 피토알렉신으로서, 도열병균 및 문고병균에 항균성을 나타내는 새로운 디테르펜 화합물의 피토카산 A, B, C 또는 D 에 관한 것이며, 아래와 같은 효과가 얻어진다.
(l)도열병균 및 문고병균에 대하여, 강한 항균성을 갖는 새로운 디테르펜 화합물이 제공된다.
(2)피토카산 A, B, C, D는, 도열병균 및 문고병균에 대하여 강한 항균활성을 갖는 것으로, 그 화합물은, 도열병해 방제제, 문고병해 방제제의 유효성분으로서 유용하다.
(3)소위 잔류문제의 걱정이 없는 저독성, 무공해의 방제제를 제공하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명에 관한 항균성 테르펜 화합물의 제조법은 액체배지룰 사용하기 때문에, 탱크배양이 가능하고 대량의 시료를 조제하는 것이 가능하다. 또한, 추출원료로서 유합조직 배양액의 상정액을 사용하기 때문에, 벼 식물체에 비하여 마쇄작업이 불필요하고, 색소의 혼입도 적기 때문에, 추출 정제작업이 용이하도록 대량시료의 조제가 용이하게 할 수 있다.
더욱이, 유도물질로서 도열병균 또는 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출액을 사용하는 것으로서, 항균성 테르펜 화합물의 생산량을 현저히 향상시키는 것이 가능하다.
더욱이, 본 발명에 관한 피토카산 EL은, 벼에 피토알렉신을 생성을 유도하는 에리시타 활성을 갖는 것이며, 또한 도열병균, 및 문고병균에 대하는 항균활성을 가지는 것으로, 아래와 같은 효과가 얻어진다.
(l)벼에 피토알렉신의 생산을 유도하고, 도열병균 및 문고병균에 항균성을 가지는 새로운 디테르펜 화합물이 제공된다.
(2)피토카산 EL의 효율적인 제조방법이 제공된다.
(3)피토카산 EL은, 벼에 피토알렉신의 생산을 유도하고, 또한 도열병균 및 문고병균에 항균성을 가지는 것이므로, 그 화합물은 도열병해 방제제 및 문고병해 방제제의 유효성분으로서 유용하다.
(4)소위 잔류독성의 문제가 없는 저독성, 무공해의 벼병해 방제제를 제공할 수 있다.
Claims (8)
- 벼의 피토알렉신으로서, 도열병균 및 문고병균에 항균성을 나타내며, 아래의 일반식(Ⅰ)···(Ⅰ)(단, 식에서 R1은 H, H 또는 α-H, β-OH, R2는 α-H, β-OH, H, H 또는 0, R3은 0 또는 α-H, β-OH를 나타낸다.)으로 나타낸 카산(cassane) 골격을 가지는 화합물.
- 벼 유합조직의 액체배양액에 도열병균 또는 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출물을 첨가하여 항균성 테르펜 화합물을 생산케 한 후, 이것을 분리하는 것을 특징으로 하는 항균성 테르펜 화합물의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 항균성 테르펜 화합물이, 피토카산 A, B, C 또는 D에 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제2항에 있어서, 항균성 테르펜 화합물이, 모미락톤 A 또는 B에 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 벼에 피토알렉신의 생성을 유도하는 활성을 가지고, 또한 도열병균, 문고병균에 대하는 항균활성을 가지는 아래의 구조식(Ⅱ)···(Ⅱ)으로 나타낸 피토카산 EL.
- 제5항에 있어서, 벼 유합조직의 액체배양액에 도열병균 또는 감자유행병균 등의 식물병원균의 균체추출물을 첨가하여 피토카산 EL을 생산케 한 후, 이것을 분리하는 것을 특징으로 하는 피토카산 EL의 제조방법.
- 제5항의 피토카산 EL을 유효성분으로 하는 도열병해 방제제.
- 제5항의 피토카산 EL을 유효성분으로 하는 문고병해 방제제.
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