JPH04197186A

JPH04197186A - トロポロン類の製造方法

Info

Publication number: JPH04197186A
Application number: JP2327237A
Authority: JP
Inventors: Yoshifumi Karizume; 慶文狩集; Koji Osada; 光司長田; Akiko Yamane; 山根　明子
Original assignee: Matsushita Electric Works Ltd
Current assignee: Panasonic Electric Works Co Ltd
Priority date: 1990-11-27
Filing date: 1990-11-27
Publication date: 1992-07-16

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は、抗微生物剤の原料等となるトロポロン類を
アスナロ属植物の組織培養から抽出等の方法で取得する
、トロポロン類の製造方法に関する。

〔従来の技術〕

常緑高木針葉種目ヒノキ科アスナロ属植物は、抗微生物
作用を有するα−ツヤプリシン、β−ツヤプリシン（ヒ
ノキチオール）等のトロポロン類等を含有している０通
常、アスナロ属植物のおがくず等からトロポロン類が製
造されている。

他方、発明者らは、アスナロ属植物のカルス組織を培養
することができれば、その力゛ルス組織をトロポロン類
等の抗微生物剤の原料とすることができると考え、検討
を重ねた結果、炭素源、無機成分および植物ホルモンを
必須成分とする培地中でアスナロ属植物のカルス組織を
効率良く培養または継代培養することができることを見
出し、すでに特許出願を行っている（特願昭６３−３２
７０８７号、特願平１−２３６３６０号、特願平２−７
９８０１号等参照）。

また、発明者らは、最近になって、前記の方法によりア
スナロ属植物のカルス組織から誘導した培養細胞を、炭
素源、無機成分および植物ホルモンを必須成分とする継
代用培地中でそのまま培養を延期するか、あるいは、炭
素源、無機成分および植物ホルモンを必須成分とする生
産用培地へ移して培養することにより、培養細胞および
／または培地中にトロポロン類を蓄積させることができ
ることを見出し、すでに特許出願を行っている（特願平
２−２２６８６８号参照）。

〔発明が解決しようとする課題〕

ところが、前述した従来法により培養された細胞株の中
には、生産用培地へ移してもトロポロン類を生産しない
ものがあり、物質生産への転換が不確実であるという問
題があった。

このような事情に鑑み、この発明は、アスナロ属植物の
培養細胞に対して、トロポロン類を確実に生産させるこ
とができる方法を提供することを課題とする。

〔課題を解決するための手段〕

上記課題を解決するため、発明者らは、種々検討を重ね
た。その結果、炭素源、無機成分、および植物ホルモン
とともに真菌類の粉砕菌体および／またはその菌体から
得られた抽出物を含む培地中でアスナロ属植物の培養細
胞を培養するようにすれば、トロポロン類の生産性が向
上することを実験により確認して、この発明を完成した
。

したがって、この発明にかかるトロポロン類の製造方法
は、アスナロ属植物の組織片より誘導した培養細胞を、
炭素源、無機成分および植物ホルモンを必須成分とする
培地中で培養することにより培養細胞および／または培
地中にトロポロン類を生産させるようにする方法であっ
て、前記培地が、真菌類の粉砕菌体および／またはその
菌体から得られた抽出物を含むことを特徴とするもので
ある。

この発明で使用できるアスナロ属植物としては、特に限
定はされないが、ヒノキアスナロが好適である。また、
その組織片も、適宜の部位のものを利用すればよい。

アスナロ属植物から採取した組織片を適宜の方法で培養
し、必要に応じて継代培養する。そして、カルス組織等
の誘導された培養細胞を物質生産へ向かわせる。

アスナロ属植物のカルス組織等の培養細胞を物質生産へ
向かわせる方法としては、たとえば、継代用培地のまま
培養を延期する方法と、生産用培地へ継代して培養する
方法等がある。継代用培地としては、炭素源、無機成分
および植物ホルモンを必須成分とし、培地中に含まれる
炭素源の１０重置％以上がブドウ糖であるような増殖用
培地、あるいは、炭素源、無機成分および植物ホルモン
を必須成分とし、無機成分として含まれるアンモニア性
窒素と硝酸性窒素とのモル比がアンモニア性窒素１に対
し硝酸性窒素４〜８であるような増殖用培地を基本培地
とし、これに、真菌類の粉砕菌体および／またはその菌
体から得られた抽出物を添加することにより調製した培
地が適当である。また、生産用培地としては、Ｂ５培地
（ただし、植物ホルモンとしてオーキシン類が添加され
ているもの）を基本培地とし、これに、真菌類の粉砕菌
体および／またはその菌体がら得られた抽出物を添加す
ることにより調製した培地が適当である。しかし、これ
らに限定されるわけではなく、炭素源、無機成分、およ
び植物ホルモンと、真菌類の粉砕菌体および／またはそ
の菌体がら得られた抽出物とを必須成分とする培地であ
ればよいのである。また、液体培地でもよいし、寒天等
の多糖類を含有させてゲル化させた固体培地でもよいこ
の発明で用いられる培地（以下、これを単に「培地」と
称する。）中の炭素源としては、特に限定はされないが
、たとえば、ショ糖等の炭水化物とその誘導体、脂肪酸
等の有機酸およびエタノール等の１級アルコール等が挙
げられる。

培地中の無機成分としては、特に限定はされないが、た
とえば、窒素、リン、カリウム、ナトリウム、カルシウ
ム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、
銅、コバルト、硫黄、ホウ素、塩素、ヨウ素等の元素を
含む無機塩を挙げることができる。その具体例としては
、特に限定されるわけではないが、たとえば、硝酸カリ
ウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、塩化カリウ
ム、塩化カルシウム、リン酸２水素カリウム、リン酸２
水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム
、硫酸ナトリウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マン
ガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、モリブデン酸ナトリウム、ヨ
ウ化カリウム、ホウ酸、塩化コバルト等の化合物などを
挙げることができる。

この発明では、培地中に、植物ホルモンとして、オーキ
シン類およびサイトカイニン類のうち、少なくともオー
キシン類が含有されていることが必要である。そして、
オーキシン類の濃度が１０−６〜１０−４モル／ｌの範
囲、必要に応じ、サイトカイニン類の濃度が１０−５モ
ル／１以下、好ましくは１０−１モル／ｌ以下の範囲で
培地中に含まれるようにする。

前記オーキシン類としては、特に限定はされないが、た
とえば、α−ナフタレン酢＠　（ＮＡＡ）、インドール
酢酸（ＩＡＡ）　、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（
２，４−Ｄ）　、インドール酪酸（ＩＢＡ）およびこれ
らの誘導体等が挙げられる。また、前記サイトカイニン
類としては、特に限定はされないが、たとえば、カイネ
チン、ベンジルアデニン（ＢＡ）　、ゼアチン等が挙げ
られる。

これらのうち、オーキシン類がα−ナフタレン酢酸また
は２．４−ジクロロフェノキシ酢酸であり、サイトカイ
ニン類がカイネチンまたはベンジルアデニンであると、
特に効率良くアスナロ属植物の組織培養が行える。

培地には、培養細胞のトロボロン類生産性を向上させる
ために、真菌類の粉砕菌体と、その菌体から得られた抽
出物とのうちの少なくとも一方または両方が含まれてい
ることが必要である。

使用できる真菌類としては、特に限定はされないが、た
とえば、タラトスボリウム属菌等が好ましい。真菌類は
、１種のみを用いてもよいし、あるいは、２種以上を併
用してもよい。

なお、真菌類は、通常は、加熱等の処理により死滅させ
た後、粉砕および／または抽出処理が施される。

粉砕菌体の取得方法としては、特に限定はされないが、
たとえば、真菌類を、各種ミキサー、ブレンダー、また
は乳鉢等を用いて粉砕する方法等が挙げられる。

菌体の抽出物を取得する方法としては、特に限定はされ
ないが、水、あるいは、水と親水性有機溶媒との混合溶
媒等の水性溶媒を用い、加熱して抽出する方法等が好ま
しい。この方法によれば、菌体抽出物を培地に添加する
際に簡便であるからである。

なお、培地中には、前述した、炭素源、無機成分、およ
び植物ホルモンと、真菌類の粉砕菌体および／またはそ
の菌体から得られた抽出物とからなる必須成分の他に、
必要に応じて、ビタミン類やアミノ酸類等が含有されて
いてもよい。

上記ビタミン類としては、特に限定はされないが、たと
えば、ビオチン、チアミン、ピリドキシン、ピリドキサ
ール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、アス
コルビン酸、イノシトール、ニコチン酸、ニコチン酸ア
ミド等が挙げられるまた、前記アミノ酸類としては、特
に限定はされないが、たとえば、グリシン、アラニン、
グルタミン酸、システィンおよびフェニルアラニン等が
挙げられる。

培地に含まれる前記各成分の濃度は、通常、炭素源が１
０ないし５０　ｇ／ＩＩ、無機成分が１０−６ないし０
．１モル／１、植物ホルモンが前記所定濃度、ビタミン
類が０．１ないし１５０１ＩＩｇ／１１アミノ酸類が０
ないし１　ｇ／Ｊ！程度であることが望ましいが、炭素
源および植物ホルモン以外の成分の濃度は、特にこれら
に限定されない。

培地の調製法としては、特に限定はされないが、たとえ
ば、従来より植物の組織培養に用いられている培地、た
とえば、ムラシゲ・スクーグ培地、リンスマイヤー・ス
クーグ培地、ホワイト培地、ガンボルグＢ−５培地、二
ソチ・エッチ培地などを基本培地として、炭素源、およ
び植物ホルモンと、真菌類の粉砕菌体および／またはそ
の菌体から得られた抽出物の他、必要に応じて、ビタミ
ン類やアミノｒ！１１類等の前記各成分を添加して調製
する方法等が挙げられる。なお、前記基本培地には元々
前記無機成分が含まれているが、必要に応じて、さらに
無機成分を適宜添加してもよい。

前記培地による培養は、特に限定されるわけではないが
、たとえば、温度２０〜３０℃で、必要に応じて、５０
〜１５０ｒｐｍの攪拌を行って、７〜３０日間行う。取
得しようとするトロポロン類、の量をできるだけ多くす
るためには、培養細胞のトロポロン類の生産が活発にな
る前に培養をやめるよりも、そのように活発になってか
ら適宜の時期にトロポロン類の取得を行う方がよい。

前述したような培地中で培養を行うことにより、アスナ
ロ属植物のカルス組織等の培養細胞が生産したトロポロ
ン類は、抽出等の方法により、細胞および／または培地
より取得できる。抽出法でのエステル類、エーテル類、
ベンゼン類、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素類等
の有機溶媒を使用できる。溶媒の種類によっては、加熱
したり、還流抽出したりするなどして、抽出の効率を上
げることができる。また、培地からの抽出法としては、
酢酸エチル、塩化メチレン、ｎ−ヘキサン、エチルエー
テル、トルエン等の水と混ざらない性質の有機溶媒を用
いて抽出を行い、容易にトロポロン類を有機溶媒中に溶
は込ませ、取得することができる。なお、抽出法の他に
、水蒸気蒸留法等でもトロポロン類を効率良く取得する
ことができる。

〔作　　　用〕

炭素源、無機成分、および植物ホルモンとともに、真菌
類の粉砕菌体および／またはその菌体から得られた抽出
物を含む培地中でアスナロ属植物の培養細胞を培養する
ようにすると、従来法では生産用培地に移してもトロポ
ロン類を生産させることができなかった細胞株に対して
も、トロポロン類を確実に生産させることができ、トロ
ポロン類の生産量が増加するため、培養細胞のトロポロ
ン類の生産性が向上する。

〔実　施　例〕

以下に、この発明の具体的な実施例および比較例を示す
が、この発明は、以下の実施例に限定されない。

以下の実施例で用いたクラドスポリウム属菌の菌体粉砕
物（分散液）およびその菌体抽出物は、以下のようにし
て調製した。

タラトスボリウム属菌として、クラドスポリウム・クラ
ドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　Ｃ１ａ
ｄ。

５ｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）　　（Ｉ　Ｆ　Ｏ６３４１）を
用いた。バレイショ煎汁寒天培地（日永製薬■製）によ
り培養した該菌菌体（生重量的４ｇ）をかき取り、これ
を、蒸留水ｌＯ−の入ったフラスコに入れ、湿熱滅菌器
で２０分間処理した。処理後の菌体は、クリーンベンチ
内で滅菌蒸留水で洗浄し、寒天培地を取り除いた後、滅
菌蒸留水２〇−中で、ガラス棒を用いてすりつぶすこと
によって、菌体粉砕物の分散液を調製した。

一方、菌体抽出物は、前記と同様にして、菌体を死滅さ
せ、洗浄した後、蒸留水５０ｄを用いて１００℃で１時
間抽出処理し、菌体を濾別した後、濾液を湿熱滅菌器で
２０分間処理することによって調製した。

また、以下の実施例および比較例における培養は、すべ
て、２５℃、暗所、１００ｒｐｍ　（Ｄ回転振盪で行っ
た。β−ツヤプリシン（ヒノキチオール）の定量は、ガ
スクロマトグラフィーで行い、この鉄錯体であるヒノキ
チンの定量は、液体クロマトグラフィーで行った。ガス
クロマトグラフィーと液体クロマトグラフィーの各測定
条件を以下に示す。

ガスクロマトグラフィー装置：島原ＧＣ−９Ａカラム：ＣＢＰＩ−Ｗ１２０−１００　（島原）インジ
ェクション温度：２５０℃ カラム温度：１００〜２７５℃ （昇温速度１０℃／分）゛　クロマトグーフィー装置：ヒユーレットパラカード１０９０カラム：　Ｈｙ
ｐｅｒｃｉｌ　ＯＤＳ　　１０　Ｑｘ４．５ｍ液相：０
．０１Ｍギ酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ５）／Ｔ
ＨＦ　（１／１）また、以下の実施例および比較例で用いたＢ−５培地（
液体培地）の組成は、第１表に示す通りであった。

第１表一実施例１− Ｂ−５培地が１００ｍ７入った三角フラスコに、ヒノキ
アスナロの培養細胞３ｇと、菌体粉砕物の分散液１献と
を入れ、３週間培養した。

その後、細胞を回収し、凍結乾燥した後、酢酸エチル１
００献を用いて、６０℃で２時間抽出処理し、酢酸エチ
ルを留去することによって、抽出物を得た。

一実施例２一実施例１において、菌体粉砕物の分散液１−の代わりに
菌体抽出物（液状）ｌｄを用いるようにした以外は実施
例１と同様にして、培養および抽出を行った。

一比較例１一実施例１において、菌体粉砕物の分散液を用いないよう
にした以外は実施例１と同様にして、培養および抽出を
行った。

一実施例３− Ｂ−５培地中でトロボロン類の生産能が不安定になった
ヒノキアスナロの培養細胞の株３ｇを用い、これを、菌
体粉砕物の分散液１　ｖｒｌとＢ−５培地１００ｄとが
入った三角フラスコに入れ、３週間培養した。

その後、細胞を回収し、凍結乾燥した後、酢酸エチル１
００ｔＺを用いて、６０℃で２時間抽出処理し、酢酸エ
チルを留去することによって、抽出物を得た。

一比較例２一実施例３において、菌体粉砕物の分散液を用いないよう
にした以外は実施例３と同様にして、培養および抽出を
行った。

以上の実施例１〜３で使用した菌体粉砕物の分散液また
は菌体抽出物（液状）の量と、実施例１〜３および比較
例１〜２で培養された細胞の乾重量、その培養細胞から
得られた抽出物の量、その抽出物に含まれるβ−ツヤプ
リシン（ヒノキチオール）およびヒノキチンの量を第２
表に示した。

第２表（（１）実施例３および比較例２では、培養細胞として
、Ｂ−５培地中でトロポロン類の製造が不安定になった
細胞株を用いた。

第２表にみるように、下記■、■が確認された■　真菌
類の菌体粉砕物またはその菌体抽出物を培地に含ませる
ことにより、トロポロン類の生産量が増加する（実施例
１．２と比較例１との対比）。

■　真菌類の菌体粉砕物を培地に含ませることにより、
トロポロン類の生産が不安定な細胞に対してもトロポロ
ン類を生産させることができる（実施例３と比較例２と
の対比）。

〔発明の効果〕この発明にかかるトロポロン類の製造方法によれば、抗
微生物剤として有用な多量のトロポロン類を、従来法に
比べて、確実に得ることができる代理人　弁理士　　松
　本　武　彦手続補正書（眺平成　３年　２月２０日１．１９牛の１す尺ｗＰ２−３２７２３７号２、発明の名称トロポロン類の製造方法３、補正をする者事件との関係　　　特許出願人住　　　所　　　　大阪府門真市大字門真１０４８番地
名　称（５８３）松下電工株式会社４、代理人氏　　名　　（７３４６）弁理士　松　本　　武　彦ヒ
３゛ヲー）゛チ１□を　、−二　。

５、補正により増加する項数　　　　　　　　　　　　
　　　　　−一　　−な　　　し６、補正の対象明細書７、補正の内容 ■　明細書第１４頁第３行に［洗浄した後、蒸留水５０
ｄ」とあるを、「洗浄し、粉砕した後、蒸留水５０−」
と訂正する。

■　明細書第１４頁下から第４行に「カラム：ＣＢＰＩ
−Ｗ１２０−１００　（島津）」とあるを、いずれも「
カラム：　ＣＢＰＩ−Ｗｌ　２−１００（島津）」と訂
正する。

Claims

【特許請求の範囲】１　アスナロ属植物の組織片より誘導した培養細胞を、
炭素源、無機成分、および植物ホルモンを必須成分とす
る培地中で培養することにより培養細胞および／または
培地中にトロポロン類を生産させるようにする方法であ
って、前記培地が、真菌類の粉砕菌体および／またはそ
の菌体から得られた抽出物を含むことを特徴とするトロ
ポロン類の製造方法。２　アスナロ属植物が、ヒノキア
スナロである請求項１記載のトロポロン類の製造方法。３　トロポロン類が、α−ツヤプリシンおよびβ−ツヤ
プリシン（ヒノキチオール）である請求項１または２記
載のトロポロン類の製造方法。４　真菌類が、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒ
ｉｕｍ）属菌である請求項１、２、または３記載のトロ
ポロン類の製造方法。