JPH01299268A - 抗真菌性発酵産生物及びその誘導体及びその組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアスペルギラス　オキラセウス（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ　ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）の発酵により産生さ
れる抗真菌性ピロロリジン抗生物質及びその誘導体及び
これらの因子を含む組成物に関するものである。

種々の代謝産物はアスペルギラス　オキラセウスの種々
の分離株より産生されるものとして既に報告されている
。ターナ−、ダブル。

ビー、　（Ｔｕｒｎｅｒ、　Ｗ、Ｂ、）等、“ファンガ
ルメタボライツ■”（“Ｆｕｎｇａｌ　Ｍｅｔａｂｏｌ
ｉｔｅｓ　ｎ　’つ。

頁８７．９０．１２８，１６４，１９８゜３１６．４１
６．　　アカデミツク　プレス（Ａ　ｃａｄｅ　ｍ　ｉ
ｃ　Ｐ　ｒｅｓｓ）　、ロンドン（Ｌ　ｏｎｄｏｎ）　
。

１９８３、ここには、オキラドキシン（ｏｃｈｒａ−ｔ
ｏｘｉｎ）　、キサントメグミン（Ｘａｎｔｈｏｍｅｇ
ｎｉｎ）　。

メレイン（ｍｅｌｌｅｉｎ）　＋　ビオメレイン（ｖｉ
ｏ−ｍｅｌｌｅｉｎ）、　　）リバシジン（ｔｒｙｐａ
ｃｉｄｉｎ）　＊アスピロン（ａｓｐｙｒｏｎｅ）　、
エルゴスタ（ｅｒｇｏｓｔａ）−４，６，８（１４）、
２２−テトラエン−３−オン、フラバコル（ｆｌａｖａ
ｃｏｌ）　、ペニシリン酸及びアスペルギウス酸などが
記載されている。しかし、これらはいづれもピロロリジ
ン化合物ではない。

ピロロリジン抗生物質についての報告もある。これは抗
原虫剤及び抗酵母化合物であり、ストレプトマイセスグ
リセオラス（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅ
ｏｌｕｓ）及びストレプトマイセスロゼオクロモゲネス
（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｇａｙｅｅｓ　ｒｏｓｅｏ−ｃｈｒ
ｏｍｏｇａｎｅｓ）より分離されたものである。ビー、
ニー、ソビン（Ｂ、Ａ、５ｏｂｉｎ）等。

ジェイ、アム、ケム、ツク−（Ｊ　、Ａｉｍ、　Ｃｈｅ
ｗ。

５ｏｃ−）ｙ第７６巻、第４０５３頁（１９５４）；エ
フ、ダブル、タナ−（Ｆ、Ｗ、Ｔａｎｎｅｒ）等、アン
チビオ、アン、（Ａｎｔｉｂｉｏ、　Ａｎｎ、）、第８
０９巻、第１９５４〜５５頁；ニー、ジメネヅ（Ａ　、
　Ｊ　ｉｍｅｎｅｚ）等、″抗生物質″″、第Ｖ巻。

パート２″′抗真核生物及び抗ウイルス性物質の作用機
序″、エフ、エフ、バーン（Ｆ、Ｆ。

Ｈａ　ｈ　ｎ　）編集、第１−９９頁の“アニソマイシ
ン及び関連抗生物質″、スプリンガ一一ベルラグ（Ｓ　
ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ　ｅｒｌａｇ）　ｍベルリン（Ｂ　
ｅｒｌｉｎ）　−ニューヨーク（Ｎｓｗ　　Ｙｏｒｋ）
１９７９゜広範囲な抗真菌性特性を持った、従来とはま
ったく異なった発酵産生物なる抗生物質が、アスペルギ
ラス　オキラセウス微生物の制御培養により獲得される
という発明が今回なされた６発酵産生物としての本抗生
物質はピロロリシノール化合物であるとされており、か
つ本発明は当該発酵産生物及び以下の構造式によって表
わされるアシル化されたその誘導体を示すものである。

式中ＲはＨあるいは低級アルカノイルであり。

さらに期待される抗生物質産生の好ましい方法を示すも
のである。

発酵産生物なる新規抗生物質の構造は、この後に詳細に
述べられているスペクトルデータ、その他の物理学デー
タ、及びアセチル誘導体のスペクトルデータなどが基に
なっている。化合物は２−ベンジル−１−メチル−５−
（ｎ−ノニル）ピロロリジン−３−オルと命名及び同定
されるものである６便宜上、化合物中のＲがＨならば、
以後、これを化合物ＩＡとして表示する。

新規抗生物質、化合物ＩＡ、とは白色、青白色あるいは
淡白色固形物であり、物理学的特性をここに記載する。

量スペクトルデータ 本化合物の分子式はＣ２□Ｈ，、Ｎｏ　（３１７ａｍｕ
）である、これは電子衝撃法による質量スペクトルより
明らかにされたもので１重要なイオンを示すものである
。ｍ／ｚ３１６゜２６３５　（Ｍ−Ｈ：　　計算値　Ｃ
２□Ｈｆｆｉ４Ｎ　０３１６．２６４０）、２９８　　
（３１６−Ｈ，Ｏ）。

２２６．２１６５　（Ｍ　−Ｃ，Ｈ，：　　計算値Ｃｉ
　４　Ｈ２゜Ｎｏ　　２２６．２１７７）　、及び１９
０．１２２４　（Ｍ　−Ｃ，Ｈｌ、：　　計算値Ｃ，，
Ｈ１ｓＮＯ１９０，１２３２）、高速原子衝撃法スペク
トルは擬似分子イオンｍ／ｚ３１８を含み、これは（Ｍ
＋Ｈ）＋に相当する。

モノ−トリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体はビストリー
メチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）
とピリジンの反応により形成されＴＭＳのスペクトルに
は、以下の重要なイオンが含まれている。

３８８．３０３０　（Ｍ＋ＳｉＣ，Ｈ，−Ｈ：計算値Ｃ
，１Ｈ，，Ｎｏ　＋　Ｓ　ｉ　Ｃ，Ｈ，３８，８。

３０３６）、３７４．２８６０　（Ｍ　＋　　５ｉＣ３
Ｈ，−ＣＨ，：　　計算値Ｃ，１Ｈ３，ＮＯ＋Ｓ　１Ｃ
２Ｈ，３７４，２８７９）、２９８．２５６１（Ｍ　＋
　Ｓ　ｉ　Ｃ３Ｈ，−Ｃ，Ｈｌ　：計算値Ｃ１４Ｈ２゜
ＮＯ＋ＳｉＣ，Ｈ，２９８，２５６６）、及び２６２．
１６１９　（Ｍ＋５ｉＣ３Ｈ，−Ｃ，Ｈｌ、：計算値Ｃ
，，Ｈ１，ＮＯ＋　　５ｉＣ３Ｈ，２６２゜１６２７）
、イオン中のシリル基の存在は、ｄｉ。−ＢＳＴＦＡ及
びピリジンにより形成されるパーデユーテロ−ＴＭＳ誘
導体との比較により確認されている。

ＮＭＲデータ ”ＣＮＭＲＣＣＤＣＱ、、室温における、１００ＭＨｚ
でのテトラメチルシランＴＭＳのダウンフィールド　ｐ
ｐｍ）、　　１４．１ｑ。

２２．７ｔ、２６．３ｔ、２９．３ｔ、２９．５８ｔ。

２９．６５ｔ、２９．９ｔ、３１．９ｔ、３３．６ｔ。

３４．８ｔ、３８．６ｑ、３９．３ｔ、６６、Ｏｄ。

７０．４ｄ、７３．７ｄ、１２６．１ｄ、１２８．４（
２ｘ）ｄ、１２９．４　（２ｘ）ｄ、１３９．４Ｓ。

’ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＧＯ，Ｄ、４００ＭＨｚでのＴＭＳ
のダウンフィールドｐｐｍ、対照は６２．０３の溶媒ピ
ーク）、３．１４ｄｄ（ＬＨ，Ｊ＝５．　１３．５）、
　　３．２９ｄｄ（ＬＨ，Ｊ＝１０．１３．５）、３．
４７ｄ、ｔ（１且、Ｊ＝１０．〜４．５）、　　４．３
３　ｄ　ｄ　ｄ（ＩＨ，Ｊ＝１．５，４．３，６．８）
、１．９３（ＬＨ，Ｊ　　＝　　１．５．、　７．２．
　１４．８）。

２．６５ｄｄｄ　　（１且、Ｊ　　＝　　６．８，９，
８゜１４．８）、　　〜３．３１．（ＩＨ，ｏｂｓｃ）
。

〜２．０３　　（ＩＨ，ｍ）、　　〜１．７６　　（Ｌ
Ｈ。

ｍ）、　　〜１．２８　　（〜１４Ｈ−、ｍ）、０．８
８　ｔ（３Ｈ，Ｊ＝６．８）。

（Ｓ＝−重線；　ｄ＝二重線：ｔ＝三重線；ｑ＝四重線
；ｍ＝多重線；ｏｂｓｃ＝不明瞭（多重度シグナル）。

アセチル誘導体（Ｒ＝ＣＨ，Ｃｏ）の”ｃＮＭＲに関す
る特性を以下に示す、”ＣＮＭＲＣＣＤＣＱ、、室温に
おける。１００ＭＨｚでのＴＭＳのダウンフィールド　
ｐｐｍ）。

１４．１ｑ、２１．３ｑ、２２．７ｔ、２６．５ｔ。

２９．３ｔ、２９．．５ｔ、２９．６ｔ、２９．７シ。

３１．８ｔ、３３．９ｔ、３４．６ｔ、３７．９ｑ。

３９．３ｔ、６６．２ｄ、７１．７ｄ、７ａ、３ｄ。

１２６．２ｄ、１２８．４（２ｘ）ｄ、１２８．９（２
Ｘ）ｄ、１３８．９ｓ、１７０．７Ｓ。

構造式Ｉで示されている本発明の化合物は白色あるいは
淡白色の固形物であり、有機溶媒に可溶であり溶液で用
いられる様になっている。更に、分散させて水溶液とし
ても用いられるようになっている。

新規ピロロリシノール抗生物質及びそのアシル誘導体は
酵母や糸状真菌に対して幅広い抗真菌活性スペクトラム
を有している。これらは酵母や真菌感染に対する局所的
治療に適しているばかりでなく、その広範なスペクトラ
ムにより、真菌の制御に際し刃はいかなる場合にも使用
する事ができる。従が−って本化合物番声真菌感染ケヒ
ト及び、動物などに引き起こす真菌の発育を制御するだ
けではなく、アレルゲンや植物の病原あるいは腐敗病を
引き起こしたり、塗料、繊維、木材、材木製品、糸製品
などの製品を劣化させたりする真菌の制御にも使用され
うるちのである。杢化合物は特に植物感染真菌、例えば
アルテルナリアソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　５ｏｌ
ａｎｉ）及びコクリオボラス　ミャベアナス（Ｃｏｃｈ
ｌｉｏｂｏｌｕｓ　ｍ１ｙａｂｅ−ａｎｕｓ）などに対
して有効である。その他、本化合物の使用が有効である
特異的糸状真菌及び酵母には次のものがある。ベルティ
シリウム　セルラエ　（Ｖ　ｅ　ｒ　ｔｉｃｉｌｌｉｕ
　ｍ　５ｅｒｒａｅ）　。

セルコスポーラ　ベテコーラ（Ｃｅ　ｒ　ｃｏｓｐｏｒ
ａｂｅｔｉｃｏｌａ）　、　　セファロスポリウム菌種
、クリプトコツカスローレンチイー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏ
ｃｅｕｓｌａｕｒｅｎｔｉｉ）　、クリプトコツカス　
アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｌｂｉｄｕ
ｓ）、　リゾムコール　ミニヘイ（Ｒｈｉｚｏ　ｍ　ｕ
ｃｏｒ　ｍ　１ｅｈｅｉ）　、　　アスペルギラス　フ
ラブス（Ａ　ｓ　ｐ　ｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕａ
）　。

アスペルギラス　フミガタス（Ａ　ｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、セラトシスティス　ウルミ（
Ｃａｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ　ｕｌｍｉ）などである、更
に、本化合物はストレプトマイセス種などの様な微生物
にも同様に活性を持つものである。

本発明の抗真菌性抗生物質、化合物ＩＡ。

は取得番号ＡＴＣＣ２２９４７としてアメリカン　タイ
プ　カルチャー　コレクション。

１２３０１　　パークローン　ドライブ、ロックビル、
メリーランド２０８５２のカルチャーコレクションに寄
託され、そこより入手可能なニー、オキラセウス（Ａ　
、　ｏ　ｃｈｒａｃａｕｓ）株の培養により産生され、
その培養培地中より当該化合物ＩＡが回収されるという
、一般的な方法で調製される。

本発明においては、以下にこの特異的な株に関する事柄
についておもに、論じているが。

微生物の特性は自然界においても、また人為的にしても
、多種多様をきわめている事はよく知られている。よっ
て、自然界より得られた菌であろうと、変性作用を受け
て作り出された菌１例えばイオン化放射、紫外線照射、
あるいはニトロソグアニジンの様な化学変性の作用を受
けた菌であろうと変種及び変異株を含めて、アスペルギ
ラス　オキラセウスＡＴＣＣ２２９４７のすべての株を
本発明の範囲の中に入れである。

本発明の化合物ＩＡはアスペルギラス　オキラセウスＡ
ＴＣＣ２２９４７の産生株を以下記載の条件下で適切な
栄養培地を用いて好気的発酵法により産生され、その後
に、この発酵培地中より活性成分を回収することにより
調製される。

発酵は微生物によって同化される炭素源や窒素源及び少
量の無機塩類を含む培地を用いて行なわれる。更に、も
し炭素源及び窒素源が併用されているとすれば、常にそ
れらは混合された状態になっている。その様な時でも培
地には微量の金属が添加される。

炭素源としては、グリセロール、砂糖、スターチ及びそ
の他の炭水化物あるいは炭水化物誘導体、例えばデキス
トロース、クエン酸塩、同様にコーンミール、ペクチン
、コーン、タラ肝油などの様な複合栄養素及びその類似
体などがある。培地中で利用される炭素源の正確な量と
は、その培地中の他の成分にいくぶん依存するものであ
るが、通常培地量に対して　０．５から５０％の範囲内
が適切であるとされている。これら炭素源は個々に使用
されたり、あるいは同−培地中で数種が併用されたりも
する。

窒素源としては、アミノ酸グリシン及び硫酸アンモニウ
ム、同様に複合物として、イーストヒドロライゼート、
イーストオートライゼート、トマトペースト、ソイビー
ンミール、コーンステイープリカー、ラード水、トマト
ペースト及び類似体がある０種々の窒素源は培地量に対
して０．２から５０％の範囲内において、単独あるいは
併用して用いられる。

培養培地中に加える栄養無機塩類には、ナトリウム、カ
リウム、マグネシウム、アモニウム、カルシウム、リン
酸塩、硫酸塩、塩化物、炭酸塩、及び類似のイオンを生
ずる。−般的な塩もある。更に、微量金属として、コバ
ルト、マグネシウム、鉄、モリブデン、亜鉛、カドミウ
ム、及び類似金属が同様に含まれる。

期待通りの抗生物質、化合物Ｉａ産生の好ましい発酵方
法の遂行には、目的の発酵培地が炭素源リッチである事
が必要である。“リッチ″とは添加された固形栄養物に
対して約５０から７０％の重さを占める事を意味してい
る。

発酵の遂行上、適切なる培地は固体あるいは液体である
。一つの良好な固体培地には、コーンを主成分にしたも
のがある１代表的な培地を次に示す。

培地　Ａ ひき割りコーン（Ｃｒａｃｋｅｄ　ｃｏｒｎ）　　　　
１０．ＯｇＫ　Ｈ４Ｆ　Ｏ４１，Ｏｍｇ ＭｇＳＯ，・７　Ｈ，０１，Ｏｍｇ 酒石酸ナトリウム　　　　　　　　　１．０菖ｇＦｅＳ
Ｏ，・７Ｈ，ＯＯ，Ｉ　Ｂ ｚｎＳ０４・Ｈ２００，１■ｇ 蒸留水　　　　　　２５ｍＡ 代表的な液体培地を次に示す。

豊里−旦 デキストロース　　　　　　　　　　　１０　　ｇグリ
セロール　　　　　　　　　　１０ｍＥＩコーンステイ
ープリカー　　　　　　　５醜Ｑ（Ｎ　Ｈ４）　２８０
４　　　　　　　　　　　２　　ｇコーンミール　　　
　　　　　　　　　１０　　ｇＣＯＣＱ、・６Ｈ，ＯＬ
ｏｎｇ ソイビーン　ミール　　　　　　　　　５ｇグリシン　
　　　　　　　　　　　　２ｇ蒸留水　　　　　　加え
て１０１００ＯにするｐＨ７，０ 培地　Ｃ デキストロース　　　　　　　　　　　１０　　ｇＫＨ
，Ｐｏ、　　　　　　　　　　　　　　２　　ｇグリセ
ロール　　　　　　　　　　　ｌｏｍＱコーンミール　
　　　　　　　　　　１０　　ｇラード水　　　　　　
　　　　　　　　５ｇＣｏＣＱ、・６Ｈ，０１０Ｂ ペクチン　　　　　　　　　　　　　１０　　ｇポリグ
リコールＰ２Ｏ００２ｍｆｆ１ トマトペースト　　　　　　　　　　　５ｇ蒸留水　　
　　　　加えて１００１００ＯにするｐＨ７，０ 培地　Ｄ グリセロール　　　　　　　　　　１０ｍＡＫＨ，ＰＯ
４２ｇ （ＮＨ４）　２　Ｓ　Ｏ４２ｇ コーンミール　　　　　　　　　　　ｔｏ　　ｇペクチ
ン　　　　　　　　　　　　　１０　　ｇソイビーンミ
ール　　　　　　　　　　５ｇポリグ’Ｊ：１−ＪＬｒ
Ｐ２０００　　　　　　２　ｒｍＱタラ肝油　　　　　
　　　　　　　　　２ｍΩクエン酸ナトリウム　　　　
　　　　　２ｇ蒸留水　　　　　　加えて１０１００Ｏ
にするｐＨ７，０ 本発明の化合物ＩＡ産生の為に、ＡＴＣＣ２２９４７を
含む発酵培地を調製する。抗生物質産生微生物の胞子あ
るいは菌子体を適切なる培地に植菌し、好気的条件下で
培養することである。

一般的な方法として、まず最初に、栄養培地で作られて
いる斜面寒天培地中より、培養用の保存菌を取り出し、
シード菌産生用栄養培地中へ植菌し、好ましくは２段階
のシード菌作製過程を経て、抗真菌剤産生用のシード菌
となる微生物を発育させることである。代表的なシード
用培地には以下の成分が含まれている。

シード　　地 コーンステイープリカー　　　　　　５ｇトマトペース
ト　　　　　　　　　　４０　　ｇオート麦粉　　　　
　　　　　　　　１０　　ｇグルコース　　　　　　　
　　　　　１０　　ｇ微量元素混合物　　　　　　　　
　ｌＯ鳳Ｑ蒸留水　　　　　加えて１０００ｍｇにする
ｐＨ６，８ 微量元素混合物 Ｆ　ｅ　Ｓｏ、　・７Ｈ，０１ｇ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２０１ｇ ＣｕＣＱ、・２Ｈ，Ｏ２５ａ＋ｇ ＣａＣＱ、　　　　　　　　　　　　　１００ｍｇＨ３
Ｂ　０．　　　　　　　　　　　　　　５６　＋ｍｇ（
ＮＨ４）、Ｍｏ、Ｏ，、・４Ｈ２０１９Ｈｚ　ｎ　Ｓ　
Ｏａ　・７　Ｈａ　Ｏ２００＠ｇ蒸留水　　　加えて１
０００ｍＱにする次の様な方法で行なう、つまりアスペ
ルギラス　オキラセウスＡＴＣＣ２２９４７の斜面寒天
培地中保存菌を適切な液体栄養シード用培地中に植菌し
、ｐＨは５から８．１の間、最適な範囲は６から７．５
．この植菌されたフラスコを室温で、約１５℃から約３
０℃、好ましくは２０℃から２８℃、静置あるいは振盪
により培養する。振盪する時は、４００ｒｐｍまでとし
て、好ましくは、約２００から２２Ｏｒｐｍである。培
養を２日から３０日にわたって行なう、好ましくは　２
日　から１４日間。十分な発育が見られたら、たいたい
２日から５日、この培養増殖菌を抗真菌剤産生用のプロ
ダクション用培地中へ移植する。

しかしながら、好ましい方法として、第二段階の発酵を
行なう場合、その培養増殖菌の一部を、同様の条件下で
植苗培養する。しかし−船釣に約１日から３日の短期培
養で十分である。そしてこの第二段階での増殖菌をプロ
ダクション用培地中へ移植する。

培養増殖菌が移植された産生用発酵培地を３日から３０
日間培養する。通常７日から１４日、振盪培養が好まし
いが、静置でもかまわない。発酵を好気的に行ない、そ
の温度範囲は約２０℃から約４０℃とする。空気送入を
毎分的２．０から５．０Ｑとし、振盪の速度は２００か
ら５０Ｏｒｐｍである。至適条件としては、約２４℃か
ら約３０℃の温度範囲にコントロールすることであり、
約２４℃−２８℃が最も好ましい温度である。本化合物
産生に適した栄養培地のｐＨは広範囲で、約５．０から
８．５まで、とる事が出来るが好ましい範囲は約６．０
から７．５である。期待通りの化合物産生に対する、適
切な培養が終了したら１次はこの後に、より詳細に記載
しである方法で発酵培地中より目的物質を回収するこ・
とである。

活性物質を以下のステップにより回収する。

（１）アルコールを当該培地中へ加え、振拌、浸潤させ
る０次にも濾過して、活性成分をアルコール性溶液とし
て回収する。

（２）水をアルコール性溶液に加え、本°来の水性溶液
に転換する。あるいはメタノ ール除去により濃縮し、その後で任意 に水を加える。

（３）水不溶性有機溶媒を加える０例えば水不溶性酸素
化有機溶媒あるいは芳香族 もしくはハロゲン化炭化水素溶媒など を水性溶液あるいは残留物に添加し。

その水不溶性溶媒中で、これら活性成 分の抽出物や分配物を完全に混和させ る。そして次にこの非水性溶液の分離 及び濃縮を行なう。

（４）ステップ（３）で得られた物質を、クロマトグラ
フィーによる分画を行なう ために、クロマトグラフィーに対して、吸着１分配する
。カンシタ　アルビカ ンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）に対して活
性を示す活性成分をその溶出液中より 集め濃縮する。化合物ＩＡとして回収する。

正確にはこれらステップは、発酵方法において、液体培
地を用いたか、固体培地か、あるいは使用溶媒種、及び
使用吸着剤の種類などによって、多少変更しうるもので
ある。

固体培地による発酵においては、第１ステツプとして、
アルコール性溶媒を発酵培地中に加え、よく混合した後
、濾過し、この水性アルコールＦ液を回収し、濃縮する
ことである。このｔ炉液は水不溶性酸素化有機溶媒、あ
るいは芳香族もしくはハロゲン化炭化水素溶媒で抽出、
分配される。得られた水不溶性溶媒の溶液を濃縮し、少
なくとも１回はカラムにかける。通常１分配クロマトグ
ラフィーを併用して、吸着クロマトグラフィーにより、
数回の分にステップをふむ。

次に、液体培地による発酵においては、菌糸体形成物を
その発酵培地中よりｔ濾過により回収し、この菌糸体の
かたまりにアルコールを加える。アルコールで十分にこ
の菌糸体を混合する。ミ戸適した後、を炉液を集め、濃
縮する。そして上記記載の固体培地からの分離方法にそ
って、アルコール性水性溶液を水不溶性酸素化有機溶媒
あるいは芳香族もしくはハロゲン化炭化水素溶媒でよく
混和し、その溶媒中で産生物の抽出、分配を行なう。そ
して得られた溶液をクロマトグラフィーによって分離す
る。

固体栄養培地中より、あるいは菌糸体の集合物中より、
まず最初に、活性成分を抽出するという時に用いられる
アルコール性溶媒とは、メタノール、エタノール、イソ
プロパツール、等の低級アルコール類であり、好ましく
はメタノールである。

メタノール溶液中より活性成分を抽出あるいは分配する
際に使用される水不溶性非極性有機溶媒としては、酢酸
エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル類
、及びメチルエチルケトン、などの様なケトン類などが
ある。しかしながら塩化メチレンなどのハロゲン化炭化
水素や、ベンゼンあるいはトルエンなどの芳香族炭化水
素なども使用される。

好ましくは脂肪族エステルである。

クロマトグラフィーによる分離は非イオン性樹脂を用い
た一般的なカラムクロマトグラフィーによって行なわれ
る。抗生物質、化合物ＩＡ、を含む分画部分はカンジダ
　アルビカンスに対するバイオオートグラフィーによっ
て検出される。尚、固体培地中からの分離においては、
通常クロマトグラフィーによる分離ステップは１回以上
行なわれる。

吸着剤としてはシリカゲルが好ましいが、その他の吸着
が用いられる時もある６シリカゲルにはグレードやサイ
ズに多数のタイプがあり、それらは市販されている（イ
ー、メルク（Ｅ、Ｍｅｒｋ）ｒイー、エム、サイエンス
（ＥｏＭ、５ｃｉｅｎｃｅ）の　キーセルゲル（Ｋ　ｉ
ｅｓｅｌｇｅｌ）など）。その他の吸着剤、例えばアル
ミナ、スチレン−ジビニルベンゼン重合体などが、ダイ
アイオンＨＰ−２０，ＨＰ−３０，ＨＰ−４０（ミツビ
シケミカルインダストリーズ、Ｌｔｄ、）及びアンバー
ライトＸＡＤ−２，ＸＡＤ−４，ＸＡＤ−１６（ローム
　アンド　ハース　Ｃｏ）として市販されており、使用
可能である。

分配クロマトグラフィーは吸着クロマトグラフィーとの
併用により用いられる。分配クロマトグラフィーに使用
される素材とは、化学的に修飾されたデキストランであ
り、ファルマシアよりセファデックスとして多数のグレ
ード品が提供されている。

要求通りの産物を含んでいる発酵物から抽出あるいは分
配されてきた物質はイソクラティックな段階勾配あるい
は連続勾配系により分画される。吸着剤としてシリカゲ
ルを用いた時は、エステル、特にエステル／アルカン混
合液つまり酢酸エチル／ヘキサンの混合液が溶出液とし
て、有効である。また吸着剤としてデキストランを用い
た時は、クロロヒドロカーボン／ヒドロカーボン／アル
コールの溶媒系が使用される。とりわけ、塩化メチレン
／ヘキサン／メタノールが、最つども、有効であった。

好ましい方法としては、数種のグレードのシリカゲルを
吸着クロマトグラフィーに、そして、セファデックスを
分配クロマトグラフィーに使用して、分離することであ
る。

各クロマトグラフィーによる分離から得られた、産生物
を豊富に含む分画部分はカンジダアルビカンスによるア
ッセイで検定され、更に精製したり、あるいは回収する
為に、それら分画物を集め、濃縮する。最終的な精製段
階としては、セファデックスＬＨ−２０゜塩化メチレン
／ヘキサン／メタノール（ｌＯ：１０：１）、流速は約
２ｍ２／分の低速、による分配クロマトグラフィーが好
ましい。そして溶出してきた部分を濃縮し、抗生物質産
物として回収する。

Ｒが低級アルカノイル基である本発明の化合物は、塩基
の存在下で化合物ＩＡとアシル化因子との反応により調
製される。アシル化剤として好ましいものには、酸無水
物及び酸ハロゲン化物などがある。アシル基がアセチル
ならば、アセチルハロゲン化物や無水酢酸が用いられる
。またアシル基が高級ならば。

アシルハロゲン化物が好ましい。

反応は塩基性有機溶媒であるピリジンやピコリン中など
で行なれ、また、同様に、第三アミノ塩基を有する芳香
族炭化水素中でも行なわれる。無水酢酸の場合、過剰の
無水酢酸は、十分な第三アミノ塩基中で水素受容体とな
る溶媒として用いられる。

好ましい方法としては、化合物ＩＡをピリジン中に溶解
し、酸無水物あるいは酸ハロゲン化物を、室温で滴下し
、あるいは、冷却しながら加えて、要求通りの産物を得
るものである。産生の回収は一般的な常法に従がって行
なわれるものとする。

本発明による化合物がもつ幅広い抗真菌活性をディスク
拡散法をはじめとして種々のフィラメント状真菌及び酵
母に対する化合物ＩＡの活性を測定する代表的なアッセ
イ結果と伴にここに示すものである。これらアッセイに
用いられる微生物は標準的な微生物学的操作により、２
週間ごとに連続移植して、ポテトデキストロース寒天（
デイフコ）上に維持されているフィラメント状真菌保存
株及び２０％液状グリセロール中に一８０℃で凍結保存
されている酵母株などである。

植菌されるアッセイ用の寒天プレートはアッセイ株のタ
イプにより、それぞれ調製される。フィラメント状真菌
としての接種菌は湿性滅菌済みダクロン綿棒で保存菌プ
レートの表面よりかきとり調製する。そして胞子及び菌
子体を１０ｍｆｌの滅菌ポテトデキストロース培地（Ｐ
ＤＢ）中に懸濁し、６６０ｎｍにおける透過率が７０％
になるまで培養する。

接種菌が酵母ならば、−昼夜培養により調製される。そ
してＰＤＢで培養菌を希釈し、最終濃度を６６０ｎｍで
の透過率が４０％あるいは７０％になる様に調製する。

アッセイプレートの調製は接種菌を適当なモルテン寒天
培地で、最終濃度が４％になるまで希釈し、４５℃まで
冷却する。

試料を　６．２ｍｍフィルターペーパーディスク（２５
＋ｎＱ／デイスク）にのせ、２４℃で風乾する。そして
このディスクを滅菌ビンセットで植菌アッセイプレート
上に置き、更に２５％の滅菌液性ジメチルスルホキサイ
ド（ＤＭＳＯ）で湿めらせる。このアッセイプレートを
その後、２８℃あるいは　３７℃で２４時間インキュベ
ーションする。インキュベーション後、阻止ゾーンを測
定し記録する。

測定はバックグランドゾーンとは異なる増殖部分の最先
端のヘリまでとする。阻止ゾーンは以下のごとく限定さ
れる。綿毛状（Ｆ）−ディスクのまわりは綿毛状のへり
を持ち中心部は透明である。不明瞭（Ｈ）−全域にわた
り不明瞭、わずかに不明瞭（Ｓ）−阻止ゾーン全体にお
いて若干の発育に対する見分けがつく。及び非常に不明
瞭（Ｖ）−バックグランドと阻止ゾーンとの見分けがほ
とんどつかない、限定がなされていないゾーンとは全域
にわたり透明であることを示す。代表的な結果を次のテ
ーブルに記載した。

培養菌番号　培地ａ　温　度　　　　微　生　物　種℃ ＭＹ３４　　　　ＹＥＤ　　　２８　　　サツカロミセ
ス　セレビシェＭＹ９９２　　　ＹＥＤ　　　２８　　
　カンジダ　アルビカンスＭＦ４６２６　　　ＰＤＡ　
　　２８　　　コクリオボラス　ミャベアナスＭＦ４４
２　　　ＹＥＤ　　　２８　　　アスペルギラス　ニゲ
ルＭＦＩＩ　　　　Ｐ、ＤＡ　　　２８　　　アスペル
ギラス　ニゲルＭＦ３５６０　　　　ＰＤＡ　　　２８
　　　トリコデルマ　リグノルムＭＦ１９９６　　　Ｐ
ＤＡ　　　２８　　　ウスチラゴ　ゼアエＭＦ４０４２
　　　ＰＤＡ　　　２８　　　セラトシスティス　ウル
ミＭ　Ｆ　３５５０　　　Ｐ　Ｄ　Ａ　　　２８　　　
アルテルナリア　ソラニＭＦ３７９４　　　ＰＤＡ　　
　２８　　　ベルチシリウム　セラエＭＦ４６４１　　
　　ＰＯＡ　　　２８　　　ケファロスブリウム種ＭＦ
４６０８　　　ＰＤＡ　　　２８　　　セルコスポーラ
　ベチコーラＭＹ１０１２　　　ＳＤＡ　　　３７　　
　カンジダ　トロピカリスＭＹ１０２８　　　ＳＤＡ　
　　３７　　　カンジダ　アルビカンスＭＹ３２１　　
　　ＳＤＡ　　　２８　　　トルロスポラ　ハンゼニイ
ーＭＹ４１０　　　ＰＤＡ　　　２８　　　サツカロミ
セス　セレビシェ化合物ＩＡの濃度 １１０００ｕ／ｍＱ）　　５００ｕ　／ｖａＱ　　　２
５０　　ｇ／ｍＱ）２０Ｓ　　　　　　　１７ｓ　　　
　　　１５３１２ＨＩＯＨ９Ｖ ４０Ｆ　　　　　　　３６Ｓ　　　　　　３２３１３８
　　　　　　１０Ｈ８Ｖ １２Ｓ　　　　　　　ＩＯ３８Ｈ １９１（１６Ｈ１３Ｖ ２７Ｓ　　　　　　　２４Ｓ　　　　　　２０Ｓ２３Ｆ
　　　　　　　２０Ｓ　　　　　　１７）（３２Ｆ　　
　　　　　３０Ｆ　　　　　　２９８２１Ｆ　　　　　
　　１７ｓ　　　　　　１３Ｈ９Ｆ　　　　　　　　８
Ｖ　　　　　　　０２０Ｈ１８Ｈ１５Ｈ ２５Ｆ　　　　　　　２１Ｆ　　　　　　１８ＦＩ　Ｏ
Ｈ８Ｖ　　　　　　　０ １４Ｓ　　　　　　　１２８　　　　　　９Ｈ１１Ｓ　
　　　　　　８８　　　　　　０ＭＹ１０７４　　　Ｓ
ＤＡ　　　２８　　　クリプトコッ力スラウレンラＭＹ
Ｉ１００　　　ＳＤＡ　　　３７　　　カンジダ　シュ
ードトロビ力ＭＹ１０７０　　　ＳＤＡ　　　２８　　
　クリプトコツカス　アルビダＭＹ１０７３　　　ＳＤ
Ａ　　　２８　　　クリプトコツカス　ラウリンＭＹ１
０７７　　　ＳＤＡ　　　２８　　　クリプトコツカス
　ラウリンＭＹ１１１３　　　ＳＤＡ　　　２８　　　
クルイベロミセス　フラギリＭＹ１０５５　　　ＳＤＡ
　　　２８　　　カンジダ　アルビカンスＭＦ４７８４
　　　　ＰＤＡ　　　３７　　　リグノムコール　ミニ
ヘイＭＦ３８３　　　ＰＤＡ　　　２８　　　アスペル
ギラス　フラブスＭＦ４８３９　　　ＰＤＡ　　　２８
　　　アスペルギラス　フミガタスａ　デイフコ　ＰＤ
Ａ＝ポテトデキストロース寒天；ＹＥＤ＝酵母エキスデ
キストロース −イー　　　２２Ｓ　　　　　　　　　　　１７Ｓ　　
　　　　　　　１５Ｓリス　　　１６Ｓ　　　　　　　
　１３Ｓ　　　　　　　　８ＳＸ　　　　　　　１２Ｈ
９Ｖ　　　　　　　　　　　Ｏティー　　１９Ｈ１５Ｈ
１３Ｈ テイー　　１７Ｈ１５Ｈ１２Ｈ ス　　　　　　１４　Ｓ　　　　　　　　　　１０８　
　　　　　　　　　８Ｈ９Ｖ　　　　　　　　　　　　
　８Ｖ　　　　　　　　　　　０９Ｈ７Ｖ　　　　　　
　　　　　０ １５３　　　　　　　　　　１２Ｓ　　　　　　　　　
　　９Ｈ１４８８Ｈ０ ３ＤＡ＝サブローデキストロース寒天；本化合物は特に
コクリオボラス　ミャベナス及びアルテルナリア　ソラ
ニなどの微生物に対して効果的であり１６μｇ　／　ｍ
　Ｑという低濃度でそれぞれ１７５及び１３Ｈという阻
止ゾーンが測定観察された。

本発明における抗真菌的特性は、真菌の制御が必要とさ
れている場所、物、ヒト、などに対して、この構造式１
なる化合物の抗真菌物質として適応使用を効果的なもの
にしている。構造式■なる化合物の使用量は化合物その
もの、及び制御すべき真菌、投与される時の状況などに
依存している。

構造式Ｉなる化合物は、医薬品として使用する際におい
ても薬学的に許容される、生物学的不活性担体と伴に、
抗真菌性の治療用組成物として調合された時、より有効
的な抗真菌的特性を示すものである。

この組成物は通常の調剤技術に従がって、生物学的不活
性担体、−船釣には表面活性分散剤と伴に調合されるも
のであるが、本質的には、ヒトあるいは動物に感染する
病原体の制御に用いるのか、あるいは土壌または植物な
どの農業面における真菌の制御に用いるのかによって、
あるいは無生物なる物質に見られる真菌の制御に用いる
のかによって、その調剤方法は変化するものである。

新規構成物は活性成分を重量パーセントで、好ましくは
５％以上含むものであり、濃縮した組成物ならば１５％
５％以上含るものである。組成物の調製において、構造
式Ｉなる化合物は、適切なかつ一般的な担体と伴に、十
分に混合されるものである。

非治療的な使用に際しては１本発明の産生物を単独ある
いは不活性担体との混合物として使用される。不活性担
体には、微細粉末乾燥物、水性希釈剤、増量剤、充填剤
、調製剤、及び賦形剤、更に種々の粘土、珪藻土、滑石
等、あるいは水またはエタノール、イソプロパツール、
ケロセン、ベンゼン、トルエン及びその他石油蒸留分画
物などの低級アルコール類である１種々の有機溶媒及び
これらの混合物などがある。

次に治療的な使用においては１本発明の産生物を、治療
を目的とした投与に対して適切な担体と伴に構成される
ものである。その様な担体には、水、グリコール、オイ
ルアルコールなどの液体でありそれらは緩衝作用を持っ
た塩化ナトリウム、デキストロースを含み。

さらに種々の懸濁剤、安定剤、可溶化剤あるいは分散剤
などがある。固体の担体物質としては、スターチ、砂糖
、カオリン、エチルセルロース、炭酸カルシウム、炭酸
ナトリウム、リン酸カルシウム、カオリン、滑石、ラク
トース、及びステアリン酸カルシウムの様な潤滑剤、結
合剤、崩壊剤などがある。

本化合物は局所にも使用される。その様な適応に際して
、薬は常法どおりにクリームや軟膏としての形態をとる
ものである６例えば白色石油、アンヒトラスラノリンセ
チル　アルコール、コールド　クリーム、グリセリルモ
ノステアレート、ローズ水及び類似物質となる。通常５
％のクリームあるいは溶液として調製され、治療すべき
部分に適応する。本抗真菌性組成物は真菌を制御すべき
場所において有効利用される。

以下の実施例は本発明を説明するものであるが限定する
ものではない。

実施例　Ｉ 固相フラスコ発酵 シード用培地（シード用培地工）をＮａＯＨでｐＨ６，
８に調整し、滅菌する。アメリカン　タイプ　カルチャ
ー　コレクションより入手の斜面寒天培地中保存のニー
、オキラセウスＡＴＣＣ２２９４７なる菌を上記滅菌済
み５０ｍＡ培地中へ植菌し２８℃で３日間回転振盪（２
１２ｐｐｍ、２インチ幅）培養する。ニー、オキラセウ
スの発育がこの培地中で行なわれる。

その後、シード培地培養より２　ｍ　Ｑの菌液を以下の
培地成分を含む２５０ｍＱのバッフルなしのエーレンマ
イヤーフラスコ中に移植する ひき割りコーン　　　　　　　　１０．０グラムＫＨ２
ＰＯ４１，ＯＢ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈ，０１，Ｏｌｌ１ｇ酒石酸ナ
トリウム　　　　　　　　１．０　ｆｆ１ｇＦｅ５０．
・７Ｈ２００，１ｍｇ Ｚ　ｎ　Ｓ　Ｏ４・Ｈ２Ｏ０，１ｍｇ 蒸　　留　　水　　　　　　　　　　　　　　　　２５
ｍｆｌ移植後、このフラスコを２５℃で１４日間回転振
盪（２２Ｏｒｐｍ、２インチ幅）培養し、発酵培地中に
抗生物質なるものを産出する。

実施例　■ 遼ＩＬ竪− 二一、オキラセウス、ＡＴＣＣ２２９４７の凍結保存菌
を斜面寒天培地より集めて、実施例Ｉと同様の成分を含
むシード用培地５０ｍＱ中へ植菌する。このシード用フ
ラスコを２８℃で４８時間回転振盪（２２０ｒｐｍ）培
養する。その内の２％（１，０＋＋＋Ｑ）相当量の菌液
を上記記載のシード培地５００ｍＱを含む２Ｑ用のバッ
フルなしのエーレンマイヤーフラスコ中へ移植する。そ
して更に２８℃で２４時間回転振盪（２００ｒｐｍ）培
養する。

産生用培地は蒸留水中に以下の成分を含むものとする。

デキストロース　　　　　　　　　１０．０ｇ／Ｑグリ
セロール　　　　　　　　　１０．０ｇ／１２コーンス
テイープリカー　　　　　５．０ｇ／Ｑ（ＮＨ４）、Ｓ
Ｏ２２，Ｏｇｉ コーンミール　　　　　　　　　　１０．０ｇ／ＱＣｏ
　Ｃ２ｘ　・６　Ｈ２Ｏ１０，Ｏｍｇ／　Ｑソイビーン
ミーフレ　　　　　　　　５．０ｇ／１２グリシン　　
　　　　　　　　　　２．０ｇ／ＱＰ−２０００消泡剤
（Ｄｏｗ）　　　　　３．０ｍＱ／Ｑこの培地をｐ　Ｈ
７、０に調整して、滅菌する。

ここへ、先の菌液の５％（２，５ｍ１２）相当量を、各
々１０Ｑのプロダクション用培地を含む、４台の１４−
リッター用発酵装置へ移植する。発酵は２８℃で、２．
０から５．０Ｑ／分の空気流入を伴ない、９０時間、２
００から５０Ｏｒｐｍで撹拌培養する。発酵培地中に抗
生物質なるものが産出される。

実施例　■ 固　　酵培地　からの化ム　ＩＡの　離実施例Ｉ　の発
酵培地成分の割合に対して３５ｇのコーンを十分に含む
、各々２５０ミリリツターのフラスコ３５本の固体発酵
培地中から発酵産生物を回収する方法は、まず最初に各
フラスコに１００ミリリツターのメタノールを加え撹拌
しながら固体培地をバラバラにして室温で一晩浸潤させ
る。次にこれらをζ濾過して２６０ミリリツターのミ炉
液を得る。

この菌子体を再びメタノールで抽出し、ζ濾過して２５
００ミリリツターのミ炉液を得る。

第１段階の抽出より得られたｐ液（２６００ｍ　Ｑ　）
に６５０ミリリツターの水と３２５０ミリリツターの塩
化メチレンを加え、混合液の比率を４：１：５メタノー
ル抽出物／水／塩化メチレンとし、２相分配を行なう。

塩化メチレン／メタノール相とメタノール／水相とに分
離する。塩化メチレン／メタノール相に全抗真菌性活性
が含まれている事がシー。

アルビカンスＭＹ９９２に対する発育阻止ゾーンを測定
する寒天ディスク拡散アッセイ法により確認されている
。

第２段階のメタノール抽出物（２５００＋ａＩ２Ｆ液）
についても同様操作を行ない、両者の塩化メチレン／メ
タノール相を集め濃縮、乾燥し、得られた残留物を酢酸
エチル１００ｍＡに溶解する。これを酢酸エチルを溶出
液とするＩＱのシリカゲルクロマトグラフィー（イー・
メルク　グレード６２．６０−２００メツシユ）にかけ
る。抗生物質としての産生物を十分に含む両分（シー、
アルビカンスによるバイオオートグラフィーにより確認
）をやはり酢酸エチルを溶出液とする２００ミリリツタ
ーのシリカゲルクロマトグラフィー（イーエムサイエン
ス、キーセルゲル６０２３０−４００メツシユ）に再度
かける。

２回目のシリカゲルりロマトグラフィーから得られる産
生物を豊富に含む両分で集め、濃縮、乾燥する。得られ
た残留物をヘキサン／塩化メチレン／メタノール（１０
：１０：１）なる混合溶媒２ミリリツターに溶解し。

同様溶媒系を用いて１００ミリリツターのセファデック
スＬＨ−２０のクロマトグラフィーにかける。このクロ
マトグラフィーにより得られた産生物を豊富に含む両分
を集め、濃縮し、１８．９　　ミリグラムの産生物を得
る。

この産生物は化合物ＩＡとして特徴づけられ、先に述べ
た様に物理学的特性を有するものである。

去１■１−毀 ２−ベンジル−１−メチル−５−（ｎ−ノニル）ピロロ
リジン−３−オルを　１６．６ミリグラム（５Ｘ１０−
’モル）ピリジン中で溶解し、室温において無水酢酸（
０，５４ｇ）を１０滴加える０反応産生物として２−ベ
ンジル−１−メチル−５−（ｎ−ノニル）ピロロリジン
−３−イルアセテートを得る０反応産生物を常法により
溶媒を蒸発させる事により反応混合液中より回収する。

乾燥後、先の記載にある様なＮＭＲ特性を本物質は示す
ものである。

去１」Ｌ−！ ピリミジン中に塩化プロピオニルあるいはｔ−ブチリル
クロライドを含ませて、同様反応を行ない、以下に示す
化合物を調製する。

（１）２−ベンジル−１−メチル−５−ノニル−ピロロ
リジン−３−イルプロピオ ネート （２）２−ベンジル−１−メチル−５−ノニル−ピロロ
リジン−３−イルｔ−ブチ レート 去１１＠　　Ｖｌ 局所的抗真菌剤として適している軟膏の調製は５ｇの２
−ベンジル−１−メチル−５−（ｎ−ノニル）−ピロロ
リジン−３−オルを市販されているポリエチレン／炭化
水素ゲル１００ｇに完全に分散させて行なう。

尚、６ｇの２−ベンジル−１−メチル−５−（ｎ−ノニ
ル）ピロロリジン−３−イルアセテートと１００ｇのポ
リエチレン炭化水素ゲルを用いても同様に軟膏が調製さ
れる。

叉胤叢−！ 非−製薬的な抗真菌剤としての使用には粉末としての形
態がとられ、２−ベンジル−１−メチル−５−（ｎ−ノ
ニル）ピロロリジン−３−オルとすでに分散されている
コーティングクレイをそれぞれ５０％重量ずつよく混合
する。

叉直五−！ 以下調製の液状構成物も抗真菌剤として用いられる。

（１）２−ベンジル−１−メチル− ５−（ｎ−ノニル）ピロロリ ジン−３−オル　　　　　　２５％重量キサンタンガム
　　　　　　０．６％重量水　　　　　　　　　　　　
　７４．４％重量（２）２−ベンジル−１−メチル− ５−（ｎ−ノニル）ピロロリジ シー３−イルアセテート　　２０％重量ポリエチレング
リコール２００　８０％重量手続補正書 平成１年５月１５日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の構造式で示され、式中Ｒは水素あるいは低級ア
   ルコールである化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２、Ｒが水素である請求項１記載の化合物。 ３、Ｒがアセチルである請求項１記載の化合物。 ４、生物学的不活性担体物質を添加した請求項１記載の
   化合物よりなる抗真菌性組成物質。 ５、担体物質が製薬学的に許容されている担体である請
   求項４記載に従がう組成物。 ６、次の構造式なる化合物を産生する方法において、ア
   スペルギラスオキラセウス属なる微生物を炭素源を十分
   に含む発酵培地中で培養することより成る方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ７、発酵培地中より当該化合物を回収する段階を含む請
   求項６記載の方法。