DE19936789A1

DE19936789A1 - Neue Pyrrolidinole und ihre Verwendung für die Tumortherapie

Info

Publication number: DE19936789A1
Application number: DE19936789A
Authority: DE
Inventors: Harm Brummerhop; Tatjana Achenbach; Rolf Mueller; Thorsten Bach
Original assignee: Vectron Therapeutics AG
Current assignee: Vectron Therapeutics AG
Priority date: 1999-08-09
Filing date: 1999-08-09
Publication date: 2001-03-01
Also published as: EP1202962A1; WO2001010832A1

Abstract

Das Pyrrolidinalkaloid (+)-Preussin hat ein weites Wirkungsspektrum sowohl gegen filamentlöse Pilze als auch gegen Hefen (1). Seine strukturelle Verwandtheit zu dem Translationsinhibitor Anisomycin führte zur Untersuchung seiner Aktivität gegen Tumorzellen. Es wurde überraschend gefunden, daß Pyrrolidinole, im besonderen das Pyrrolidinol (+)-Preussin eine antitumorale Wirksamkeit hat. Die von (+)-Preussin induzierte Tumorzellzytotoxizität liegt zwischen 1-8 _M (IC 50 -Werte). DOLLAR A Die in Tumorzellen induzierte Apoptose wurde durch eine DNA Leiter (2), PARP-cleavage (3), Annexin-V Bindung (3) und FACS Analyse nachgewiesen. DOLLAR A In niedrigen Konzentrationen füren mit Hilfe unterschiedlicher Methoden synthetisierte Pyrrolidinolderivate zu einer Akkumulation von Zellen in der G 1 Phase. Diese spezifische Inhibierung des G 1 /S Überganges konnte durch Kinaseassays verifiziert werden: Pyrrolidinolderivate, im besonderen (+)-Preussin sind wie das Flavon Flavopiridol (4) CDK2 Kinaseinhibitoren. DOLLAR A Obwohl (+)-Preussin strukturell verwandt mit dem Proteinsyntheseinhibitor (-)-Anisomycin ist, scheint der Wirkungsmechanismus ein anderer zu sein.

Description

4.1 Einleitung

Das Pyrrolidinolalkaloid (+)-Preussin, erstmals von den Mikroorgansimen Preussia sp. und Aspergillus ochraceus isoliert, hat ein weites Wirkungsspektrum sowohl gegen filamentöse Pilze, als auch gegen Hefen [1]. Seine antitumorale Wirksamkeit als Apoptose induzierende Substanz wurde erstmals getestet. Es konnte gezeigt werden, daß Pyrrolidinolderivate in unterschiedlichen humanen Tumorzellen sowohl Apoptose, als auch die Inhibition von Zellwachstum auslösen.

Die Erkenntnis, daß Tumore durch die Blockierung bestimmter Apoptose-Wege entstehen, zeigt, wie wichtig die Erforschung und Entdeckung neuer Chemotherapeutika, die Apoptose in Krebszellen auslösen, ist.

Der Ausdruck Apoptose beschreibt eine kontrollierte, programmierte Abfolge von morphologischen und biologischen Veränderungen in der Zelle, die unser Verständnis sowohl für die normale Embryonalentwicklung, als auch für die Entstehung vieler Krankheiten erweitert hat [5].

Apoptose ist durch systematische Veränderungen, wie eine Verkleinerung des Zellvolumens, Chromatinkondensierung, DNA Fragmentierung, Zelloberflächenveränderungen, die Bildung von membrangebundenen, apoptotischen Körpern und die Aktivierung der sogenannten Caspasen [6-8] gekennzeichnet, die hier als Nachweismethoden beschrieben werden.

4.2 Synthese neuer Pyrrolidinderivate

Der Zugang zu Pyrrolidinen der allgemeinen Formel 1 (Schema 1) ist sowohl nach der Strategie der Forschungsgruppen von T. Bach [9], als auch der Strategie der Forschungsgruppe von S. M. Hecht [10] möglich und hat bereits in der Synthese von (+)-Preussin zum Erfolg geführt.

Schema 1

Pyrrolidine der allgemeinen Formel 1

4.2.1 Zugang nach T. Bach und H. Brummerhop [9]

Startpunkt der Synthese ist kommerziell, erhältliche (S)- beziehungsweise (R)- Pyroglutaminsäure, die in 8 Stufen zu enantiomerenreinen 2,3-Dihydropyrrolen des Typs 2 führt [11]. Umsetzung dieser 2,3-Dihydropyrrole mit aromatischen oder heteroaromatischen Aldehyden in einer [2+2]-Photocycloaddition und anschließender hydrogenolytischer Oxetanöffnung führt zu Pyrrolidinolen des Typs 3, die gegebenenfalls durch Inversion der Hydroxyfunktion [12], Derivatisierung der Hydroxyfunktion und Variation des Stickstoffsubstituenten R₁ zu sämtlichen Diastereomeren und Enantiomeren der Pyrrolidine des Typs 1a und 1b führt (Schema 2).

Schema 2

Retrosynthetische Betrachtung zur Synthese von Pyrrolidinen des Typs 1a und 1b

4.2.1.1 Synthese der 2,3-Dihydropyrrole des Typs 2

Von Pyroglutaminsäure ausgehend läßt sich die Toluolsulfonyl-Verbindung 5 in 3 Stufen darstellen [13] und sowohl zum Methyl-substituierten Pyrrolidinon 4a reduzieren [14], als auch im Sinne einer Corey-House-Reaktion mit Cupraten effizient substituieren [15], dadurch wird 5 in Pyrrolidinone des Typs 4b überführt.

Das in 2 Stufen aus Pyroglutaminsäure erhältliche Pyroglutaminol 6 [16] läßt sich durch nucleophile Substitution am Sauerstoffatom ebenfalls einfach zu 4c derivatisieren. Darüber hinaus liefert der entsprechende Aldehyd 7 [17] in einer Wittigreaktion auch Alkenyl- substituierte Pyrrolidinone des Typs 4d (Schema 3).

Schema 3

Synthese substituierter Pyrrolidinone

Die substituierten Pyrrolidinone des Typs 4 lassen sich in einer 4-stufigen Sequenz in die Dihydropyrrole des Typs 2 überführen [11].

Schema 4

Synthese substituierter 2,3-Dihydropyrrole

4.2.1.2. Synthese von Pyrrolidinolen

Cyclische Enamide des Typs 2 lassen sich in einer [2+2]-Photocycloaddition mit aromatischen Aldehyden zu diastereomeren, bicyclischen Verbindungen des Typs 8a und 8b umsetzen [9, 18]. Anschließende hydrogenolytische Oxetanring-Öffnung [18, 19] führt zu Pyrrolidinolen des Typs 9a und 9b, die durch Mitsunobu-Inversion in die diastereomeren Pyrrolidinole 9c und 9d überführt werden (Schema 5).

Schema 5

Synthese von Pyrrolidinolen des Typs 9

Durch Wahl des Startmaterials ((R)- oder (S)-Pyroglutaminsäure) sind beide Enantiomere sämtlicher Diastereomere des Pyrrolidingerüstes der Verbindungsklasse 1 zugänglich. Weitere Modifikation gelingt durch O-Alkylierung und O-Acylierung der Verbindungen des Typs 9. Anschließendes Entschützen des Stickstoffatoms und Substitution mit Halogenverbindungen liefert Pyrrolidine des Typs 1a und 1b (Schema 6).

Schema 6

Synthese von Pyrrolidinen des Typs 1b

4.2.2 Zugang nach M. Overhand und S. M. Hecht [10]

Startpunkt der Synthese ist eine α-Aminosäure. Dabei stehen neben den natürlichen Aminosäuren auch die entsprechenden Enantiomere und nicht-natürliche Aminosäuren, die leicht durch eine Vielzahl synthetischer Methoden [20], wie der Schöllkopf'schen Bislactimethersynthese [21], der asymetrische Strecker-Synthese [22], etc. zugänglich sind. Zunächst wird die Aminosäure 11 mit einer Boc-Schutzgruppe versehen und in das entsprechende Weinreb-Amid 12 [23] überführt (Schema 7).

Schema 7

Synthese des Weinreb-Amids des Typs 12

Umsetzung der Amide des Typs 12 mit Alkinyllithiumverbindungen 13, die leicht durch Lithiierung der Alkine erhältlich sind [24], liefert Ketone des Typs 14, die durch Quecksilber- (II)-acetat in Nitrometan [25] eine 5-endo-dig Cyclisierung eingehen und Pyrrolidinone des Typs 15 liefern (Schema 8).

Schema 8

Synthese der Pyrrolidinone des Typs 15

Die Verbindungen des Typs 15 können diastereoselektiv zu den Pyrrolidinolen des Typs 16a reduziert werden und durch Mitsunobu-Inversion [12] in Pyrrolidinole des Typs 16b transformiert werden.

Verbindungen des Typs 16a, bei denen R₂ = OCH₃ (16c) ist, lassen sich darüber hinaus durch nucleophile Substitution [26] in Pyrrolidinole des Typs 16d und durch Mitsunobu-Inversion in 16e transformieren. Damit sind durch Wahl des Startmaterials alle Enantiomere sämtlicher Diastereomere des Grundgerüstes 1 zugänglich (Schema 9).

Schema 9

Synthese der Pyrrolidinole des Typs 16

Weitere Modifikation gelingt durch O-Alkylierung und O-Acylierung der Verbindungen des Typs 17. Anschließendes entschützen des Stickstoffatoms und Substitution mit Halogenverbindungen R₁-Hal liefert eine große Anzahl Pyrrolidine des Typs 1 (Schema 10).

Schema 10

Synthese der Verbindungsklasse 1

4.3 Beispiel zur Erläuterung des Erfindergedankens 4.3.1 Herstellung von synthetischem (+)-Preussin

Die Synthese von (+)-Preussin erfolgte nach literaturbekannter Vorschrift [9] ausgehend von kommerziell erhältlichem (S)-Pyroglutaminol in neun Stufen und einer Gesamtausbeute von 10%.

Die Reinheit der als hellgelbes Wachs erhaltenen Verbindung war < 97% (GC). Die analytischen Daten stimmen mit den für den Naturstoff berichten Daten [1b] überein (Massenspektrum, ¹H-NMR,¹³C-NMR, NOESY, Drehwert).

4.3.2 Antitumorale Wirksamkeit von Pyrrolidinolderivaten 4.3.2.1 Material und Methoden Materialien

Fetal-bovine-Serum, Meerrettich Peroxidase-konjugierter Ziege anti-Maus-IgG, Aprotinin, Leupeptin, Camptothecin (Cam) wurden von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) erhalten. Maus monoklonal anti-human p27kip und Caspase 3 (CPP32) Antikörper wurde von Transduction Laboratories, Dianova (Hamburg, Deutschland), mouse monoclonal anti-actin von Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland) und E2F-1 und Cyclin A Antikörper von Santa Cruz (Heidelberg, Deutschland) gekauft. Die ECL Immunoblotanalysereagenzien wurden von Amersham Life Science, Inc. (Braunschweig, Deutschland) und die BIOMAX Filme von Kodak (N. Y., USA) erhalten. Der Annexin-V Kit wurde von Nexins Research B. V (Holland), ATP von Pharmacia Biotech (USA), der PARP Maus-monoklonal Antikörper von Pharmingen, Signal Transduction, Dianova (Hamburg, Deutschland) und der Caspaseinhibitor zVAD-fmk von Biomol (Hamburg, Deutschland) gekauft.

Als Kontrollsubstanz wurde Flavopiridol (FP) [4] verwendet. CDK2 Kinase wurde in mit Baculovirus infizierten SF9-Insektenzellen überexprimiert und aufgereinigt.

Zellen

HeLa, MeWo, MCF-7 (mit 0,9 mg/l Insulin) und A549 wurden in DMEM, PC-3, LNCaP, DU-145 und HL60 in RPMI 1640 Medium kultiviert, je mit 10% Fetal-bovine-Serum, 100 units/ml Penecillin und 100 µg/ml Streptomycin.

Behandlung von Zellen mit Chemotherapeutica

(+)-Preussin, Cam, Anisomycin und FP wurden in DMSO (Ethanol) gelöst und in verschiedenen Konzentrationen in dem Zellkulturmedium verdünnt. Die Konzentrationen an DMSO (Ethanol) im Medium betrug immer weniger als 1% (v/v). Die Zellen wurden für verschiedene Zeiten bei 37°C inkubiert.

Behandlung von Zellen mit dem Caspaseinhibitor zVAD-fmk

Die Zellen wurden 1 Stunde in Vollmedium mit dem Inhibitor (zVAD-fmk; 50 µM Endkonzentration) vorinkubiert und dann mit den Chemotherapeutika, wie oben beschrieben, behandelt.

Präparation von Zellextrakten

Die Zellen von 10 cm Platten wurden geerntet und zweimal in Phosphatsalzpuffer (PBS) gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Pellets in einem gleichen Volumen Puffer mit 20 mM HEPES, pH 7,8; 450 mM NaCl; 0,2 mM EDTA; 25% Glycerol; 5 µM DTT (Dithiothreitol), 5 µM PMSF; 0,5 µg/ml Leupeptin und 5 µg/ml Aprotinin resuspendiert. Die Zellen wurden für 5 min. auf Eis inkubiert und dann durch dreimaliges Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Auftauen in einem 30°C Wasserbad lysiert. Die Lysate wurden bei 13000 × g für 10 min. bei 4°C zentrifugiert und in ein neues Eppendorfcup überführt. Die Proteinkonzentration bestimmt und die Extrakte bei -80°C wurden aufgehoben.

Westernblot-Analyse

Lösliche Proteine wurden auf eine SDS-Polyacrylamid Gel aufgetragen und durch eine Elektrophorese aufgetrennt. Die Proteine wurden durch Elektrophorese auf eine Nitrocellulose geblottet und durch Immunoblotanalyse mit den spezifischen Antikörpern identifiziert. Die Nitrocellulosemembran wurde für 2 Stunden mit den Antikörpern (1 : 1000 verdünnt in PBS mit 5% Milchpulver) inkubiert, 5 × mit PBS gewaschen und durch Meerrettichperoxidase conjugierte Zweitantikörper IgG (1 : 2000 verdünnt) und das enhanced chemiluminescence (ECL) Immunoblot-System visualisiert.

FACS Analysen

Die Zellen wurden von einer 10 cm Platte geerntet, zweimal mit PBS gewaschen, mit 75% Ethanol für 1 Stunde fixiert und mit Hoechst 33258 gefärbt. Die Durchflußzytometrieanalysen wurden an einem FACStarPlus (Becton Dickenson) durchgeführt. Die Zellzyklus DNA Verteilung wurde durch das Cell-fit Program oder manuelle Einteilung bestimmt.

Fluoreszenz Mikroskopie

Zellen wurden mit Hoechst 33342 (10 µM) und Propidiumiodid (10 µM) für 10 min. gefärbt und unter dem Floureszenzmikroskop bei einer Wellenlänge von 360 nm analysiert. Da Hoechst 33342 alle Kerne und Propidiumiodid Kerne mit zerstörter Plasmamembran färbt, können Kerne von lebenden, nekrotischen und apoptotischen Zellen als blaue runde, rosa runde und fragmnentierte blaue oder rosane Kerne analysiert werden.

Zytotoxizitätsassays

Die Zellen wurden in 96er Mikrotiterplatten ausplattiert (20.000 Zellen/well). 16 Stunden später wurden serielle Verdünnungen von (+)-Preussin auf die Zellen gegeben und inkubiert. Nach 24 Stunden (oder anderen im Text erwähnten Zeitspannen) wurden die Zellen gewaschen und mit Medium versorgt. Nach 72 Stunden wurden die Zellen mit Krystallviolett gefärbt. Der verbleibende Farbstoff konnte bei einer Wellenlänge von 540 nM an einem ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Lesegerät gemessen werden.

Wells, die nur Zellen und Medium beinhalten, wurden als Negativkontrolle benutzt. Jedes Experiment wurde pro Zellinie mit vier gleichbehandelten Wells durchgeführt und dieses Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander wiederholt. Die Überlebensrate der Zellen wurde wie folgt berechnet:

(Absorption der mit Chemotherapeutika behandelten Zellen)/ (Absorption der unbehandelten Zellen) × 100

Der IC₅₀-Wert wurde als Konzentration an Chemotherapeutika definiert, die in jedem Test benätigt wird, um 50% Reduktion der Absorbtion zu erreichen. Bestimmt wird der IC₅₀-Wert graphisch durch eine "dose-response" Kurve.

Annexin-V Färbung

Die zu untersuchende Zellinie wurde ausplattiert und mit FP oder (+)-Preussin in verschiedenen Konzentrationen behandlet. Die Zellen wurden mit dem Überstand geerntet und zweimal in PBS gewaschen. Nach Aufnahme des Pellets in 440 µl Annexin-V Bindungspuffer wurden 10 µl Annexin FITC (1 : 10 verdünnt mit Annexin-Bindungspuffer) und 50 µl Propidiumiodid (100 µg/ml} zugegeben und 10 min. auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden sofort im FACStar gemessen um unspezifische Bindungen zu vermeiden.

Isolierung von genomischer DNA (DNA Leiter)

HL-60 Zellen wurden in RPMI Medium kultiviert und mit FP (Konrolle) oder (+)-Preussin in verschiedenen Konzentrationen behandelt. Alle Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet in 200 µl eiskaltem Lysispuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM EDTA, 0,2% Triton X-100) aufgenommen. Nach der Extraktion der DNA mit Phenol und Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) wurde die wässrige Lösung mit Ehanol präzipitiert. Das Pellet wurde in 20 µl TE Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA) aufgenommen, 5-10 µl auf ein 2%iges Agarosegel aufgetragen und durch Ethidiumbromid visualisiert.

³⁵S-Methionin Einbau

Eine radioaktive Markierung der Proteine wurde in Zellen durchgeführt, die vorher mit definierten Konzentrationen an (+)-Preussin, Anisomycin und FP behandelt worden sind. Der Einbau wurde in L-Methionin freiem RPMI 1640 Medium mit 7,5 µCi [³⁵S]-ethionin pro 200 µl Medium für die letzten zwei Stunden der Chemotherapeutikainduktion durchgeführt. Die Zellen wurden in methioninfreiem Medium gewaschen und, wie vorher unter Proteinextraktion beschrieben, aufgearbeitet. Trichloressigsäure wurde den Proben zugefügt (10% Endkonzentration) und für 10 min. auf Eis inkubiert, um die Proteine zu präzipitieren. Nach Zentrifugation wurden die Pellets in 50 µl 0.1 M NaOH resuspendiert und mit 3 ml Scintillationsmix versehen. Die Proben wurden am Scintillationsgerät (Beckman, USA) gemessen.

Kinaseassay

0.8 µl der in SF9 überexprimierten und aufgreinigten CDK2 Kinase (2.5 µg) wurden mit 18 µl Kinasepuffer (10 mM MnCl₂, 10 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 20 mM HEPES pH 7.3, Leupeptin, Aprotinin, β-Glycerophosphat, PMSF, DTT und NaF) gemixt und mit 1.25 µl Histon H1 (Sigma) und 1.25 1 mM ATP (Sigma) versetzt. Bei einer Vorinkubation wurde nun das Chemotherapeutikum (FP, Cam, Anisomycin oder (+)-Preussin) hinzugegeben und bei 37°C für 30 min. inkubiert. Nach dieser Vorinkubation wurden 0.25 µl ³²P-(-ATP (10 µCi/µl) dem Gemisch beigefügt und dieses 30 min. bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wurde mit 10 × SDS Probenpuffer gestoppt und auf ein 12% SDS Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Gelelektrohorese wurde das Gel getrocknet und die radioaktive Phosphorylierung des Histon H1 durch einen BIOMAX Film (Kodak, N. Y., USA) sichtbar gemacht.

4.3.2.2 Ergebnisse (+)-Preussin induziert Apoptose in HL-60 Zellen

Das Ziel dieser Arbeit war zu bestimmen, ob das Antifungizid (+)-Preussin Apoptose in humanen Tumorzellen auslöst. Die molekularen Mechanismen der Apoptose beinhalten Chromatinkondensierung, DNA Fragmentierung, Caspaseaktivierung und Annexin-V Bindung, die hier näher untersucht wurden.

Die Behandlung von Zellen mit 5 µM (+)-Preussin führt zu einer starken Induktion von Apoptose. Dies wurde durch Propidiumiodid-Hoechst Färbung, Annexin-V Färbung und eine sehr charakteristische DNA Leiter bewiesen.

Tabelle 1

Induktion von Apoptose durch (+)-Preussin in HL-60-Zellen

Propidiumiodid-Hoechst Färbung

Etwa 75% der HL-60 Zellen zeigen nach 18 Stunden einen kondensierten Zellkern. Allgemein zeigen Zellen eine punktierte Färbung charakteristisch für Chromatinkondensierung, die während der Apoptose eintritt. Die Induktion von Apoptose in (+)-Preussin behandelten HL- 60 Zellen variiert zwischen 27% (500 nM) und 45% (2,5 µM) (Tabelle 1).

Annexin-V Färbung

Phosphatidylserin ist ein Oberflächenmarker, der nur während der Apoptose an der Oberfläche repräsentiert wird und durch Annexin-V zu detektieren ist. Die Zellen werden mit FITC gekoppeltem Annexin-V behandelt und am FACS Gerät gemessen. Die Ergebnisse korrelieren mit der Propidiumiodid-Hoechst Färbung (Tabelle 1).

DNA Leiter

Da eine DNA Leiter ein charakteristisches Merkmal für Apoptose ist, wurde DNA von (+)-Preussin behandelten Zellen isoliert. Die DNA wurde auf einem Agarosegel aufgetragen und detektiert Als Marker wurde eine 100 bp Leiter benutzt Es wurde DNA von Zellen aufgetragen, die mit verschiedenen Konzentrationen an (+)-Preussin behandelt wurden (0,5-5 µM). Eine charakteristische DNA Leiter ist in 2.5 und 5 µM behandelten Zellen zu erkennen.

Während (+)-Preussin induzierter Apoptose wird Caspase 3 aktiviert und PARP gespalten

Da Caspase 3 ein Protein ist, welches für viele charakteristischen Merkmale der Apoptose wichtig ist, haben wir die Aktivierung von Caspase 3 und den Abbau von PARP, einem wichtigen Reparaturenzym und Substrat von Caspase 3, durch Westernblotanalyse verfolgt (Westernblot wid nicht gezeigt, Daten Tabelle 1). Es wurde sowohl eine Aktivierung von Caspase 3, als auch das 85 kDa grosse, charakteristische Spaltprodukt von PARP in den Proteinextrakten detektiert. Während die Behandlung von HL-60 Zellen mit 5 und 10 µM (+)-Preussin ist das ungespaltene 116 kDa PARP Protein nicht mehr detektierbar, was mit den Beobachtungen aus der Propidiumiodid-Hoechstfärbung korreliert.

zVAD-fmk blockiert (+)-Preussin induzierte Apoptose

Da eine Behandlung mit (+)-Preussin zur Aktivierung von Caspase 3 und der Spaltung von PARP führt, testeten wir die Fähigkeit von zVAD-fmk die Induktion von Apoptose zu blockieren. Vorherige Studien haben vorgeschlagen, Daß Inhibitoren, die auf der Sequenz von spezifischen Spaltungsstellen basieren, fähig sind Apoptose zu inhibieren. Die Zellen wurden, um eine Anhäufung von zVAD-fmk in der Zelle zu ermöglichen, eine Stunde mit dem Inhibitor vorinkubiert und dann mit µM (+)-Preussin für 20 Stunden behandelt. Wie in Tabelle 1 zu erkennen ist, scheint zVAD-fmk Apoptose nicht vollständig zu inhibieren, aber zu einer Verzögerung der Induktion von Apoptose zu führen. Nach 20 Stunden sind nur 15% der Zellen, verglichen zu 75% in den ohne Inhibitor behandelten Zellen, apoptotisch. Interessanterweise steigt der Anteil an nekrotischen Zellen, was für einen alternativen, nekrotischen Zelltod spricht. Nach 73 Stunden sind fast alle Zellen gestorben, unabhängig von einer Präinkubation mit dem Inhibitor.

Zytotoxizität von (+)-Preussin in verschiedenen humanen Tumorzelllinien

(+)-Preussin induziert Apoptose in HL-60 Zellen. Es wurde deshalb getestet, ob (+)-Preussin auch in anderen Tumorzelllinien Effekte zeigt. Alle schnell-wachsenden Zellen sollten für einen Effekt von (+)-Preussin empfänglich sein, da (+)-Preussin den Zellzyklus beeinflußt (siehe Zellzyklusanalysen). Drei verschiedene Prostatakarzinomzellinien (PC-3, DU-145 und LNCaP) wurden getestet und nach einer Inkubation der Zellen für 48 Stunden mit (+)-Preussin variierten die IC₅₀ Werte zwischen 3 und 5,5 µM (Tabelle 2). Die Induktion von Apoptose ist p53 unabhängig, da die Zelllinien PC-3 und DU-145 p53 negativ sind. In den Lungen und Brustkarzinomzelllinien A549 und MCF-7 wurden ähnliche Beobachtungen gemacht (Tabelle 2).

Tabelle 2

IC₅₀- Werte von (+)-Preussin-behandelten Tumorzelllinien

³⁵S-Methionineinbau

Da (+)-Preussin strukturell mit dem Proteinbiosyntheseinhibitor Anisomycin verwandt ist, wurde der Methabolismus von (+)-Preussin behandelten Zellen untersucht. Trotz der strukturellen Verwandtheit beider Moleküle ist (+)-Preussin ein nur schwacher Proteinsyntheseinhibitor (Daten nicht gezeigt), der durch andere Mechanismen Apoptose auslöst.

Zellzyklusanalysen

(+)-Preussin löst in niedrigen Konzentrationen (0,2-1 µM) eine Zellzyklusblockierung in G1 aus. (FACS Analysen, Daten werden nicht gezeigt). Die Anzahl von Zellen in der G1-Phase ist in allen getesteten Tumorzellinien höher als in der Kontrolle.

Analyse von zellzyklusspezifischen Proteien

Es wurden Westernblotanalysen verschiedener zellzyklusrelevanter Proteine in (+)-Preussin behandelten Zellextrakten durchgeführt (Westernblot nicht gezeigt, Daten Tabelle 1). Da nach FACS Analysen der Anteil an Zellen in der G1-Phase erhöht war, wurden G1spezifische Protein untersucht. Die Westernblotaanalyse zeigt eine Erhöhung der Proteinexpression des G1spezifischen Zellzyklusinhibitors p27 und eine schwache Expression von S-Phase spezifischen Proteinen wie Cyclin A und dem Transkriptionsfaktor E2F-1. Das Expressionsmuster dieser Proteine unterstützt die These, daß (+)-Preussin ein spezifischer Zellzyklusinhibitor ist.

Kinaseassays

Da (+)-Preussin Zellen in G1 blockiert, wurden Kinaseassays mit der G1 spezifischen Kinase cdk2 durchgeführt. Qualitativ ist im Vergleich mit dem CDK2 Kinaseinhbitor FP eine deutliche Inhibierung der Kinaseaktivität nach Zugabe von (+)-Preussin zu erkennen. Es wurden auch kompetetive Studien durchgeführt, bei denen zu erkennen war, daß (+)-Preussin ein schwächerer kompetitiver Inhibitor ist als FP. Diese genauen Analyse der Kinaseaktivität beweist direkt, daß (+)-Preussin ein selektiver CDK2 Kinaseinhibitor ist.

4.3.2.3 Literatur

1. [1] (a) R. E. Schwartz, J. Liesch, O. Hensens, L. Zitano, S. Honeycutt, G. Garrity, R. A. Fromtling, J. Onishi, R. Monaghan, J Antibiot. 1988, 41, 1774; (b) J. H. Johnson, D. W. Phillipson, A. D. Kahle, J. Antibiot. 1989, 42, 1184.
2. [2] M. Herrmann, H.-M. Lorenz, R. Voll, M. Grünke, W. Woith, J. R. Kalden, Nucl. Acid Res. 1994, 22, 5506.
3. [3] C. Widmann, S. Gibson, G. L.. Johnson, J. Biol. Chem. 1998, 273, 7141.
4. [4] (a) S. Brüsselbach, D. M. Nettelbeck, H. H. Sedlacek, R. Müller, Int. J. Cancer 1998, 77, 146; (b) H. H. Sedlacek, J. Czech, R. Naek, G. Kaur, P. Worland, M. Lossiewicz, B. Parker, B. Carlson, A. Smith, A. Senderowicz, E. Sausville, Int. J. Oncol. 1996, 9, 1143.
5. [5] L. Aravind, V. M. Dixit, E. V. Koonin, TIBS 1999, 24, 47.
6. [6] E. S. Alnemri, D. J. Livingston, D. W. Nicholson, G. S. Salvesen, N. A. Thornberry, W. W. Wong, J. Yuan, Cell 1996, 87, 171.
7. [7] D. W. Nicholson, A. Ambereen, N. A. Thornberry, J. P. Vaillancourt, Nature 1996, 376, 37.
8. [8] S. M. Srinivasula, M. Ahmad, M. MacFarlane, Z. Luo, Z. Huang, T. Fernandes- Alnemri, E. Alnemri, J. Biol. Chem. 1998, 273, 10107.
9. [9] T. Bach, H. Brummerhop, Angew. Chem. 1998, 110, 3577; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 3400.
10. [10] M. Overhand, S. M. Hecht, J. Org. Chem. 1994, 59, 4721.
11. [11] T. Bach, H. Brummerhop, J. Prakt. Chem. 1999, 341, 312.
12. [12] O. Mitsunobu, Synthesis 1981, 1.
13. [13] E. Hardegger, H. Ott, Helv. Chim. Acta 1955, 38, 312.
14. [14] B. Ringdahl, R. Amstutz, B. Karlen, M. Roch, D. J. Jenden, J. Med. Chem. 1985, 28, 1760.
15. [15] (a) J. Ackermann, M. Matthes, C. Tamm, Helv. Chim. Acta 1990, 73, 122; (b) M. Matthes, C. Tamm, Helv. Chim. Acta 1991, 74, 1585.
16. [16] S. Saijo, M. Wada, J. Himizu, A. Ishida, Chem. Pherm. Bull. 1980, 28, 1449.
17. [17] G. Rassu, L. Pinna, P. Spanu, F. Ulgheri, G. Casiraghi, Tetrahedron Lett. 1994, 35, 4019.
18. [18] H. Brummerhop, Diplomarbeit, Universität Marburg 1997.
19. [19] (a) T. Bach, Tetrahedron Lett. 1994, 35, 1855; (b) T. Bach, Liebigs Ann. 1995, 1045.
20. [20] (a) R. M. Williams, Synthesis of Optically Active α-Amino Acids, Pergamon Press, Oxford 1989; (b) H.-J. Altenbach in Organic Synthesis Highlights (J. Mulzer, H.-J. Altenbach, M. Braun, K. Krohn) VCH, Weinheim 1991, 300.
21. [21] U. Schöllkopf, Top. Curr. Chem. 1983, 65, 109.
22. [22] M. S. Iyer, K. M. Gigstad, N. D. Namder, M. Lipton, J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 4910; (b) M. S. Sigman, E. N. Jacobsen, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 5315.
23. [23] (a) S. Nahm, S. M. Weinreb, Tetrahedron Lett. 1981, 22, 3815; (b) J.-A. Fehrentz, B. Castro, Synthesis 1983, 676.
24. [24] R. H. Boutin, H. Rapoport, J. Org. Chem. 1986, 51, 5320.
25. [25] (a) R. C. Larock, L. W. Harrison, J. Am. Chem. Soc. 1984, 106, 4218; (b) K. E. Harding T. H. Tiner in Comprehensive Organic Synthesis (Ed.: B. M. Trost), Pergamon, New York 1990, Vol. 6, 363.
26. [26] H. de Koning, W. N. Speckamp in Methoden der Organischen Chemie (Houben- Weyl), 4te Aufl. (Eds.: G. Helmchen, R. W. Hoffmann, 3. Mulzer, E. Schaumann), Thieme, Stuttgart 1995, Vol. E 21, 1952.

Claims

1. Substituierte Pyrrolidine der allgemeinen Formel 1,
in der die Variablen unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben:
R₁ Wasserstoff, C₁-C₂₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₃-C₂₀-Cycloalkyl, C₃-C₁₀-Cycloalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxycarbonyl, -CH₂-Aryl, -CH₂-Heteroaryl, Aryl, Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert;
R₂ Wasserstoff, C₁-C₂₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₃-C₁₀-Cycloalkyl, C₃-C₁₀-Cycloalkenyl, CHr-(Cr-C₁₀-Alkenyl), CH₂-(C₃-C₁₉-Cycloalkyl), CH₂-(C₃-C₁₃-Cycloalkenyl), -(CH₂)_m-Aryl, (CH₂)_m-Heteroaryl, CH₂-O-(C₁-C₂₀-Alkyl), CH₂-O-(C₁-C₂₀-Acyl), CH₂-O-(C₂-C₁₀-Alkenyl), CH₂-O-(C₃-C₁₀-Cycloalkyl), CH₂-O-(C₃-C₁₀-Cycloalkenyl), CH₂-O-(Aryl), CH₂-O-(Heteroaryl), C₁-C₁₂-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert;
m 0 bis 10
R₃ Wasserstoff, C₁-C₂₀-Mkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₃-C₁₀-Cycloalkyl, C₃-C₁₀-Cycloalkenyl, C₁-C₂₀-Acyl, Aryl, Heteroaryl, (CH₂)_n-Aryl, (CH₂)_n- Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert;
n 0 bis 10
R₄ Wasserstoff, C₁-C₂₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₃-C₁₀-Cycloalkyl, C₃-C₁₀-Cycloalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxycarbonyl, -(CH₂)_o-Aryl, -(CH₂)_o- Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert;
o 0 bis 10

2. Verwendung von substituierten Pyrrolidinen nach Anspruch 1) als Arzneimittel.

3. Substituierte Pyrrolidine nach Anspruch 1) und 2) als Tumortherapeutikum.

4. Substituierte Pyrrolidine nach einem der Ansprüche 1)-3), dadurch gekennzeichnet, daß die substituierten Pyrrolidine die allgemeine Formel 1a aufweisen,
wobei die Substituenten unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben:
R₁ Wasserstoff, C₁-C₂₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₃-C₁₀-Cycloalkyl, C₃-C₁₀-Cycloalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxycarbonyl, -CH₂-Aryl, -CH₂-Heteroaryl, Aryl, Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert;
R₂ Wasserstoff, C₁-C₂₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₃-C₁₀-Cycloalkyl, C₃-C₁₀-Cycloalkenyl, CH₂-(C₂-C₁₀-Alkenyl), CH₂-(C₃-C₁₀-Cycloalkyl), CH₂-(C₃-C₁₀-Cycloalkenyl), -(CH₂)_m Aryl, (CH₂)_m Heteroaryl, CH₂-O-(C₁-C₂₀-Alkyl), CH₂-O-(C₁-C₂₀-Acyl), CH₂-O-(C₂-C₁₀-Alkenyl), CH₂-O-(C₃-C₁₀-Cycloalkyl), CH₂-O-(C₃-C₁₀-Cycloalkenyl), CH₂-O-(Aryl), CH₂-O-(Heteroaryl), C₁-C₁₂-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert;
m 0 bis 10
R₃ Wasserstoff, C₁-C₂₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₃-C₁₀-Cycloalkyl, C₃-C₁₀-Cycloalkenyl, C₁-C₂₀-Acyl, Aryl, Heteroaryl, (CH₂)_n-Aryl, (CH₂)_n- Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert;
n o bis 10
R₅ Fluor, Chlor, Brom, Wasserstoff, C₁-C₂₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₃-C₁₀- Cycloalkyl, C₃-C₁₀-Cycloalkenyl, C₁-C₂₂-Alkoxy, C₁-C₂₀-Alkoxycarbonyl, C₁-C₂₀-Alkylamino, C₁-C₁₂-Dialkylamino, Aryl, Heteroaryl, gegebenen falls substituiert;
p 0 bis 5

5. Substituierte Pyrrolidine nach einem der Ansprüche 1)-3), dadurch gekennzeichnet, daß die substituierten Pyrrolidine die allgemeine Formel 1b aufweisen,
wobei die Substituenten unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben:
R₁ Wasserstoff, C₁-C₂₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₃-C₁₀-Cycloalkyl, C₃-C₁₀-Cycloalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxycarbonyl, -CH₂-Aryl, -CH₂-Heteroaryl, Aryl, Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert;
R₂ Wasserstoff, C₁-C₂₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₃-C₁₀-Cycloalkyl, C₃-C₁₀-Cycloalkenyl, CH₂-(C₂-C₁₀-Alkenyl), CH₂-(C₃-C₁₀-Cycloalkyl), CH₂-(C₃-C₁₀-Cycloalkenyl), -(CH₂)_m-Aryl, (CH₂)_m-Heteroaryl, CH₂-O-(C₁-C₂₀-Alkyl), CH₂-O-(C₁-C₂₀-Acyl), CH₂-O-(C₂-C₁₀-Alkenyl), CH₂-O-(C₃-C₁₀-Cycloalkyl), CH₂-O-(C₃-C₁₀-Cycloalkenyl), CH₂-O-(Aryl), CH₂-O-(Heteroaryl), C₁-C₁₂-Alkoxy, Aryl, Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert;
m 0 bis 10
R₃ Wasserstoff, C₁-C₂₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₃-C₁₀-Cycloalkyl, C₃-C₁₀-Cycloalkenyl, C₁-C₂₀-Acyl, Aryl, Heteroaryl, (CH₂)_n-Aryl, (CH₂)_n- Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert;
n o bis 10
R₄ Wasserstoff, C₁-C₂₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₃-C₁₀-Cycloalkyl, C₃-C₁₀-Cycloalkenyl, C₁-C₂₀-Alkoxycarbonyl, -(CH₂)_o-Aryl, -(CH₂)_o- Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert;
0 o bis 10
Ar 2-Furyl, 3-Furyl, 2-Thiophenyl, 3-Thiophenyl, 2-Oxazolyl, 4- Oxazolyl, 5-Oxazolyl, 1-Pyrrolyl, 2-Pyrrolyl, 3-Pyrrolyl, 1-Pyrazolyl, 3-Pyrazolyl, 4-Pyrazolyl, 5-Pyrazolyl, 1-Imidazolyl, 2-Imidazolyl, 4-Imidazolyl, 5-Imidazolyl, 1-Triazolyl, 3-Triazolyl, 5-Triazolyl, 2-Pyridinyl, 3-Pyridinyl, 4-Pyridinyl, 2-Pyridazinyl, 3-Pyridazinyl, 2-Pyrimidinyl, 4-Pyrimidinyl, 5-Pyrimidinyl, 2-Pyrazinyl, 3-Pyrazinyl, Aiyl, gegebenenfalls substituiert.