EP1202962A1 - Pyrrolidinverbindungen und ihre verwendung zur therapie von hyperproliferativen erkrankungen und von tumorerkrankungen - Google Patents

Pyrrolidinverbindungen und ihre verwendung zur therapie von hyperproliferativen erkrankungen und von tumorerkrankungen

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Publication number
EP1202962A1
EP1202962A1 EP00958405A EP00958405A EP1202962A1 EP 1202962 A1 EP1202962 A1 EP 1202962A1 EP 00958405 A EP00958405 A EP 00958405A EP 00958405 A EP00958405 A EP 00958405A EP 1202962 A1 EP1202962 A1 EP 1202962A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cio
alkenyl
alkyl
aryl
cycloalkenyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00958405A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Harm Brummerhop
Tatjana Achenbach
Rolf Müller
Thorsten Bach
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vectron Therapeutics AG
Original Assignee
Vectron Therapeutics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vectron Therapeutics AG filed Critical Vectron Therapeutics AG
Publication of EP1202962A1 publication Critical patent/EP1202962A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/12—Oxygen or sulfur atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics

Definitions

  • the present invention relates to new pyrrolidine compounds and their use as medicaments, in particular for the therapy of diseases which are characterized by disorders in the induction of cell death or the regulation of the cell cycle.
  • Apoptosis also called programmed cell death, is the controlled sequence of a series of molecular processes that lead to biochemical and morphological changes and ultimately to the death of a cell. It is a means of selective cell killing, which is of crucial importance both in the selection of autoantigenic T cells in the spleen during the formation of the immune system and in normal embryonic development. In accordance with the importance of apoptosis, a disruption in the molecular processes associated with apoptosis is responsible for the development of many diseases (L. Aravind et al., TIBS 1999, 24, 47).
  • Apoptosis is caused by changes such as a reduction in cell volume, chromatin condensation, DNA fragmentation, cell surface changes, the formation of membrane-bound, apoptotic bodies and the activation of the so-called caspases (ES Alnemri et al, Cell 1996, 87, 171; DW Nicholson et al ., N ⁇ twre 1996, 376, 37; C. Widmann et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, 7141; SM Srinivasula et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, 10107). These morphological and biochemical changes can be detected by a number of methods, for example by a DNA ladder (M.
  • Pyrrolidine compounds in particular pyrrolidinol (+) - Preussin, induce apoptosis and are specifically active against tumor cells. While for not transformed cells resulted in only a concentration of 47 uM (IC 5 o) value for the cell cytotoxicity induced (+) - Prussian already at concentrations between 1 -6 uM (IC 50 - values) Tumorzellzytotoxiztician. Thus, tumor cells are 9 to 47 times more sensitive to the pyrrolidine compounds according to the invention than non-transformed cells.
  • the pyrrolidine compounds according to the invention in low concentrations lead to an accumulation of cells in the G] phase of the cell cycle and are therefore also suitable for the treatment of diseases which are characterized by disorders in the regulation of the cell cycle ,
  • the present invention accordingly relates to pyrrolidine compounds of the general formula 1
  • C 1 to C 20 alkyl preferably C 1 to C 5 alkyl, particularly preferably C 1 to C 10 alkyl, especially C 1 alkyl, C 2 to C 1Q alkenyl, preferably C 2 to C 8 Alkenyl, particularly preferably C 2 to C 5 alkenyl, in particular C 2 alkenyl, C to C 0 cycloalkyl, preferably C 3 to C 6 cycloalkyl, C 3 to Cio-cycloalkenyl, preferably C 3 to C 6 -
  • Ci- to C ⁇ alkoxy preferably C 5 - to Cio-alkoxy, particularly preferably C 8 - to Cio-alkoxy, in particular C 9 -alkoxy, optionally substituted; m 0 to 10, preferably 0 to 5, particularly preferably 0 to 2, in particular 0 to 1; R 3 H, Cp to C 2 o-alkyl, preferably Cp to C 5 alkyl, particularly preferably C 1 to C 10 alkyl, in particular C 2 alkyl, C 2 to Cio alkenyl, preferably C 2 to C 8 Alkenyl, particularly preferably C to C 5 alkenyl, in particular C alkenyl, C to Cio cycloalkyl, preferably C 3 to C 6 cycloalkyl, C 3 to Cio cycloalkenyl, preferably C 3 to C 6 -
  • Cycloalkenyl Ci- to C 20 -acyl, preferably Ci- to C ⁇ 5 -acyl, particularly preferably Cp to Cio-acyl, especially d-acyl, (CH 2 ) n -aryl or (CH 2 ) n- heteroaryl, preferably with one or more N, S and / or O heteroatoms, optionally substituted; n 0 to 10, preferably 0 to 5, particularly preferably 0 to 2, in particular
  • R 4 (CH 2 ) aryl or (CH 2 ) heteroaryl, preferably with one or more N, S and / or O heteroatoms, optionally substituted.
  • the pyrrolidine compounds of the present invention accordingly do not comprise any compounds which fall under the formula 1 and in which the substituents have the meanings given above.
  • the present invention further provides a pyrrolidine compound of the general formula 1, the substituent P having the general formula Ia
  • Ci to C 2 o-alkyl preferably C 1 -C 5 -alkyl, particularly preferably d to Cio-alkyl, in particular Cp to C 4 alkyl, C 2 to Cio Alkenyl, preferably C 2 to C 8 alkenyl, particularly preferably C 2 to C 4 alkenyl, C 3 to Cio-cycloalkyl, preferably C to C 6 cycloalkyl, C 3 to Cio-cycloalkenyl, preferably C - to C 6 -cycloalkenyl, Cp to C ⁇ 2 -alkoxy, preferably Cp to C 8 -alkoxy, particularly preferably C ⁇ - to C -alkoxy, especially C 2 -alkoxy, Cp to C 20 -alkoxycarbonyl, preferably Cp to Cio- Alkoxycarbonyl, particularly preferably Cp to C 6 -alkoxycarbonyl, especially Cp to C 3 -alkoxy
  • Another object of the present invention is the use of one or more of the pyrrolidine compound described above as a medicament.
  • the pyrrolidine compounds according to the invention are particularly suitable for the therapy of diseases which are characterized by disorders in the induction of cell death or the regulation of the cell cycle.
  • Another subject is accordingly a medicament which contains one or more of the pyrrolidine compounds described above and optionally suitable auxiliaries and / or additives.
  • Another object of the present invention is the use of one or more pyrrolidine compounds according to general formula 1
  • C ⁇ - to C 2 o-alkyl preferably Cp to C ⁇ 5 -alkyl, particularly preferably Cp to Cio-alkyl, in particular CpAlkyl, C 2 - to Cio-alkenyl, preferably C 2 - to C 8 -alkenyl, particularly preferably C 2 to C 5 alkenyl, in particular C 2 alkenyl, C 3 to Cio-cycloalkyl, preferably C 3 to C 6 cycloalkyl, C 3 to Cio-cycloalkenyl, preferably C 3 to C 6 -
  • R 2 H Cp to C 20 alkyl, preferably C 5 - to -CC alkyl, particularly preferred
  • R 3 is H, Cp to C 2 o-alkyl, preferably Cp to C 5 -alkyl, particularly preferably d- to Cio-alkyl, in particular C 2 -alkyl, C 2 - to Cio-alkenyl, preferably C 2 - to C 8 Alkenyl, particularly preferably to C 5 alkenyl, in particular C 2 alkenyl, C 3 to Cio-cycloalkyl, preferably C 3 to C 6 cycloalkyl, C 3 to Cio-cycloalkenyl, preferably C 3 to C 6 - Cycloalkenyl, Cp to C 2 o-acyl, preferably C ⁇
  • auxiliaries and / or additives for the therapy of diseases which are characterized by disorders in the induction of cell death or the regulation of the cell cycle.
  • Auxiliaries and additives are understood to mean substances which change the solubility, stability, release kinetics and / or the biological half-life of the pyrrolidine compound, such as DMSO or buffer solutions.
  • disorders in the induction of cell death are understood to mean disorders in mechanisms that lead to cell death. These mechanisms primarily include necrosis and apoptosis. A disturbance in the sense of the present invention is present especially when cells are no longer able to initiate and / or carry out apoptosis.
  • the cell cycle is the regulated sequence of a large number of molecular processes, which are also manifested in morphological changes as the cell progresses through the cell cycle and which culminate in the division of the cell.
  • the cell moves through four phases characterized by microscopic observation, the Gp, S, G 2 and M phase.
  • Proteins that play a key role in the course of the cell cycle are the so-called cyclins.
  • the cyclin / cyclin dependent kinase pair cyclin E / cdk2 (cyclin dependent kinase) is active in the GpPhase.
  • S phase also activates Cyclin A / cdk2.
  • Cyclin B which is also associated with cdc2, is activated in the late M phase.
  • the activity of the various cyclin-cyclin-dependent kinase pairs is regulated both by association with other proteins, such as p21 CIP , p27 ⁇ p , pl6 rNK or p57 INK2, and by phosphorylation or dephosphorylation or ubiquitinilation (J. Zwicker and R. Müller, 91; C. Desdouets et al., 115; K. Sauer and CF Lehner, 125; A. Koff and K. Polyak, 141; L.
  • a cell is either caused to advance and divide through the cell cycle or is prevented from dividing and then enters a fifth cell cycle phase, the Go phase or resting phase, or also apoptosis.
  • Disruption of the regulation of the cell cycle in the sense of the present invention is therefore understood to mean all the changes which lead to a cell not performing the physiologically normal regulation of the cell cycle, in particular that a cell enters the cell cycle or remains in the cell cycle, although it does should be in the G 0 phase or should enter the Go phase.
  • the present invention furthermore relates to the use of one or more pyrrolidine compounds of the formula 1, characterized in that the substituent P has the general formula Ia,
  • Cp to C 2 o-alkyl preferably Cp to Cis-alkyl, particularly preferably Cp to Cio-alkyl, in particular Cp to C 4 -alkyl, C 2 - to Cio-alkenyl, preferably C 2 to C 8 alkenyl, particularly preferably C 2 to C 4 alkenyl, C 3 to Cio-cycloalkyl, preferably C 3 to C 6 cycloalkyl, C 3 to Cio-cycloalkenyl, preferably C 3 to C 6 -cycloalkenyl, Cp to C ⁇ 2 alkoxy, preferably Cp to C 8 alkoxy, particularly preferably Cp to C 3 alkoxy, especially C 2 alkoxy, Cp to C o-alkoxycarbonyl, preferably Cp to Cio-alkoxycarbonyl, particularly preferred Cp to C 6 alkoxycarbonyl, in particular Cp to C 3 alkoxycarbonyl, Cp to C 2 o-alkyl, preferably C
  • Another object of the present invention is the use of one or more pyrrolidine compound according to formula 1, characterized in that the substituent P has the general formula Ib,
  • a preferred use of the pyrrolidine compounds described above is characterized in that one or more of the pyrrolidine compounds, optionally together with auxiliaries and / or additives, are used to induce apoptosis.
  • pyrrolidine compounds described above are characterized in that one or more of the pyrrolidine compounds, optionally together with auxiliaries and / or additives, are used for the therapy of hyperproliferative diseases.
  • Hyperproliferative diseases in the sense of the present invention are all diseases which are characterized by cell division, since it is stronger than it would be physiologically normal.
  • Another preferred use of the pyrrolidine compounds described above is characterized in that one or more of the pyrrolidine compounds, optionally together with auxiliaries and / or additives, are used for the therapy of tumors, autoimmune diseases and psoriasis.
  • the pyrrolidine compounds of the present invention induce apoptosis in a number of tumor cell lines.
  • (+) - Preussin induced apoptosis in 8 different tumor cell lines at a concentration of 1 - 5.8 ⁇ M (IC o -values) whereas in non-transformed control cells (NLH3T3) cell cytotoxicity was only observed at a concentration of 47 ⁇ M (Ido-value) .
  • the pyrrolidine compounds described above, in particular Preussin are not only able to efficiently kill tumor cells, they also show a remarkable tumor cell specificity. This differential effect on tumor cells and "normal" cells is usually a prerequisite for the successful use of a new chemotherapy drug.
  • a starting point for the synthesis of the pyrrolidine compounds of the present invention is, for example, commercially available (S) - or (R) - pyroglutamic acid, which is converted into enantiomerically pure 2,3-dihydropyrroles of type 3 in 8 steps (T. Bach and H. Brummerhop, Angew Chem. 1998, 110, 3577; T. Bach and H. Brummerhop, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 3400; T. Bach and H. Brummerhop, J. Prakt. Chem. 1999, 341 , 312).
  • Type 3 2,3-dihydropyrroles can be synthesized as follows. Starting from pyroglutamic acid, the toluenesulfonyl compound 6 can be prepared in 3 stages (E. Hardegger, H. Ott, He / v. Chim. Acta 1955, 38, 312) and both reduced to the methyl-substituted pyrrolidinone 5a (B. Ringdahl et al., J. Med. Chem. 1985, 28, 1760) as well as in the sense of a Corey-House reaction with cuprates (J. Ackermann et al. He / v. Chim. Acta 1990, 73, 122; M Matthes and C. Tamm, He / v. Chim. Acta 1991, 74, 1585) thereby 6 is converted into pyrrolidinones of type 5b.
  • R 2 C 2 -C 20 alkyl, CH 2 - (C 3 -C 10 cycloalkyl), CH 2 - (C 3 -C 10 cycloalkenyl), CH 2 aryl, CH 2 heteroaryl
  • R 2 C 2 -C 20 alkenyl
  • Scheme 3 Synthesis of substituted pyrrolidinones
  • the substituted pyrrolidinones of type 5 can be converted into the dihydropyrroles of type 3 in a 4-step sequence (T. Bach and H. Brummerhop, 1999, supra).
  • R 2 hydrogen, CC 20 alkyl, CH 2 - (C 3 -C 10 cycloalkyl), CH 2 - (C 3 -C 10 cycloalkenyl), CH 2 aryl, CH 2 -O- (CpC 20 - Alkyl), CH 2 -0- (C 3 -C-, 0- cycloalkyl), CH 2 -0- (C 3 -C 1 o-cycloalkenyl), CH 2 -0- (C 1 -C 2 o-acyl ), CH 2 -0-aryl, CH 2 -0-heteroaryl, C 2 -C 2 o-alkylene
  • the cyclic enamides of type 3 can be converted in a [2 + 2] photocycloaddition with aromatic aldehydes to give diastereomeric, bicyclic compounds of types 9a and 9b (T. Bach and H. Brummerhop, Angew. Chem. 1998, 110, 3577; T. Bach and H. Brummerhop, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 3400).
  • Subsequent opening of the hydrogenolytic oxetane ring leads to pyrrolidinols of type 10a and 10b, which are converted into the diastereomeric pyrrolidinols 10c and lOd are transferred (Scheme 5).
  • R 2 hydrogen, CC 20 alkyl, (MeOH)
  • Ar aryl, heteroaryl, 2.K 2 C0 3 , (MeOH) optionally substituted
  • Another starting point for the synthesis of the pyrrolidine compounds of the present invention is, for example, an ⁇ -amino acid (M. Overhand and SM Hecht, J Chem. 1994, 59, 4721).
  • ⁇ -amino acid M. Overhand and SM Hecht, J Chem. 1994, 59, 4721.
  • enantiomers and non-natural amino acids which can easily be obtained using a variety of synthetic methods (RM Williams, Synthesis of Optically Active ⁇ -Amino Acids, Pergamon Press, Oxford 1989; H.-J. Altenbach in Organic Synthesis Highlights, editor: J. Mulzer, H.-J. Altenbach, M. Braun, K. Krohn, VCH, Weinheim 1991, 300), as the Schöllkopf see bislactimethersynthesis (U. Schöllkopf, Top.
  • the amino acid 12 is provided with a Boc protective group and into the corresponding Weinreb amide 13 (S. Nahm and SM Weinreb, Tetrahedron Lett. 1981, 22, 3815; J.-A. Fehrentz and B. Castro, Synthesis 1983, 676) transferred (Scheme 7).
  • Type 16 compounds can be reduced diastereoselectively to type 17a pyrrolidinols and transformed into type 17b pyrrolidinols by Mitsunobu inversion (O. Mitsunobu, supra).
  • By choosing the starting material all enantiomers of all diastereomers of skeleton 1 are accessible (Scheme 9).
  • (+) - Preussin was synthesized according to the synthesis described by T. Bach and H. Brummerhop (Angew. Chem. 1998, 110, 3577; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 3400).
  • S commercially available (S) -pyroglutaminol 19 (see Scheme 11)
  • the w-nonyl side chain was built up by nucleophilic suspension with a di - «- octyl cuprate.
  • the endocyclic double bond was formed after acylation of pyrrolidinone 21 with methyl chloroformate.
  • the pyrrolidinone 22 was first reduced to the half-aminal with LiBEt 3 H, which was not isolated, but instead was transacetalated directly to the N, O-acetal 23 using dimethoxypropanone in the presence of camphorsulfonic acid. This was converted into dihydropyrrole 24 using an Et ⁇ zPr 2 / TMSOTf elimination method.
  • (+) - Preussin was completed by converting the main diastereomer 25a into pyrrohdinol 26 by hydrogenolysis.
  • the reduction of the methoxycarbonyl group with LiAlH 4 to the methyl group went smoothly and (+) - Preussin 27 could be isolated as a light yellow oil.
  • the overall yield over nine stages was 10%.
  • the purity of the compound obtained as a light yellow wax was> 97% (GC).
  • the analytical data agree with the data reported for the natural product (JH Johnson et al., J. Antibiot. 1989, 42, 1184) (mass spectrum, ⁇ -NMR, 13 C-NMR, NOESY, rotation value).
  • the Annexin-V kit was developed by Nexins Research BN (Holland), ATP by Pharmacia Biotech (USA), the PARP monoclonal mouse antibody by Pharmingen, Signal Transduction, Dianova (Hamburg, Germany) and the caspase inhibitor zVAD-fmk by Biomol (Hamburg, Germany) received.
  • Flavopiridol (H.H. Sedlacek et al., Int. J. Oncol. 1996, 9, 1143) was used as the control substance. Cdk2 kinase was overexpressed and purified in SF9 insect cells infected with baculovirus.
  • HeLa, MeWo, MCF-7 (with 0.9 mg / 1 insulin), ⁇ IH3T3 and A549 were cultivated in DMEM, PC-3, LNCaP, DU-145 and HL60 in RPMI 1640 medium, each with 10% fetal-bovine- Serum, 100 units / ml penecillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin.
  • (+) - Preussin, Cam, Anisomycin and FP were dissolved in DMSO (ethanol) and diluted in various concentrations in the cell culture medium.
  • concentration of DMSO (ethanol) in the medium was always less than 1% (v / v).
  • the cells were incubated at 37 ° C for different times.
  • Treatment of cells with the caspase inhibitor zVAD-fmk The cells were preincubated with the inhibitor (zVAD-fmk; 50 ⁇ M final concentration) in full medium for 1 hour and then treated with the chemotherapeutic agents as described above.
  • the cells from 10 cm plates were harvested and washed twice in phosphate salt buffer (PBS). After the last washing step, the pellets were placed in an equal volume of buffer with 20 mM HEPES, pH 7.8; 450 mM NaCl; 0.2 mM EDTA; 25% glycerol; 5 ⁇ M DTT (dithiothreitol), 5 ⁇ M PMSF; 0.5 ⁇ g / ml leupeptin and 5 ⁇ g / ml aprotinin resuspended. The cells were kept for 5 min. Incubated on ice and then lysed by freezing three times in liquid nitrogen and thawing in a 30 ° C water bath. The lysates were at 13000 x g for 10 min. Centrifuged at 4 ° C and transferred to a new Eppendorf tube. The protein concentration was determined and the extracts at -80 ° C. were kept.
  • PBS phosphate salt buffer
  • Soluble proteins were applied to an SDS-polyacrylamide gel and by
  • the proteins were then blotted onto a nitrocellulose by electrophoresis and identified by immunoblot analysis with the specific antibodies in each case.
  • the nitrocellulose membrane was incubated for 2 hours with the antibodies (1: 1000 diluted in 1 x PBS with 5% milk powder), washed 5 times with 1 x PBS and diluted with horseradish peroxidase-conjugated IgG (1: 2000 diluted) and enhanced chemiluminescence (ECL ) Immunoblot system visualized.
  • the cells were harvested from a 10 cm plate, washed twice with PBS, fixed with 75% ethanol for 1 hour and stained with Hoechst 33258.
  • the flow cytometry analyzes were carried out on a FACStarPlus (Becton Dickenson) carried out.
  • the cell cycle DNA distribution was determined by the cell-fit program or manual classification.
  • Fluorescence microscopy cells were washed with Hoechst 33342 (10 ⁇ M) and propidium iodide (10 ⁇ M) for 10 min. colored and analyzed under the fluorescence microscope at a wavelength of 360 nm. Since Hoechst 33342 stains all nuclei and propidium iodide nuclei with destroyed plasma membrane, nuclei from living, necrotic and apoptotic cells could be analyzed as blue round, pink round and fragmented blue or pink nuclei.
  • the cells were plated in 96 microtiter plates (20,000 cells / well). 16
  • the IC 5 o-value was defined as the concentration of chemotherapeutic agents was needed in each test, to achieve strength at a 50%> reduction of absorption.
  • the IC 50 value was determined graphically by a "dose-response" curve.
  • the cell line to be examined was plated out and treated with FP or (+) - Preussin in various concentrations.
  • the cells were harvested with the supernatant and washed twice in PBS. After the pellet had been taken up in 440 ⁇ l annexin-V binding buffer, 10 ⁇ l annexin FITC (1:10 diluted with annexin binding buffer) and 50 ⁇ l propidium iodide (100 ⁇ g / ml) were added and incubated on ice for 10 min FACStar measured to avoid non-specific bindings.
  • HL-60 cells were cultured in RPMI medium and treated with FP (control) or (+) - Preussin in various concentrations. All cells were collected by centrifugation and the pellet was taken up in 200 ⁇ l ice-cold lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.2% Triton X-100). After extraction of the DNA with phenol and phenol chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1), the aqueous solution was precipitated with ethanol.
  • the pellet was taken up in 20 ⁇ l TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA), applied to 5-10 ⁇ l on a 2% agarose gel and visualized by ethidium bromide and UV radiation.
  • TE buffer 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA
  • the proteins were radiolabelled in cells that had previously been treated with defined concentrations of (+) - Preussin, Anisomycin and FP.
  • the installation was carried out in L-methionine-free RPMI 1640 medium with 7.5 ⁇ Ci [ 35 S] -methionine per 200 ⁇ l medium for the last two hours of chemotherapy induction.
  • the cells were washed in methionine-free medium and worked up as previously described under protein extraction. Trichloroacetic acid was added to the samples (10%> final concentration) and for 10 min. incubated on ice to get the proteins precipitate. After centrifugation, the pellets were resuspended in 50 ⁇ l 0.1 M NaOH and provided with 3 ml scintillation mix. The samples were measured on a scintillation machine (Beckman, USA).
  • (+) - Preussin induces apoptosis in HL-60 cells
  • the molecular mechanisms of apoptosis involve
  • Table 1 Induction of apoptosis by (+) - Preussin in HL-60 cells
  • HL-60 cells show a condensed nucleus after 18 hours. Generally, cells show a dotted staining characteristic of chromatin condensation that occurs during apoptosis.
  • the induction of apoptosis in (+) - Preussin-treated HL-60 cells varies between 27% (500 nM) and 45% (2.5 ⁇ M) (Table 1).
  • Phosphatidylserine is a surface marker that is only presented on the surface during apoptosis and can be detected by Annexin-V.
  • the cells are treated with FITC-coupled Annexin-V and measured on the FACS device. The results correlate with the Propidium iodide-Hoechst staining (Table 1). DNA ladder
  • DNA from (+) - Preussin treated cells was isolated. The DNA was applied to an agarose gel and detected. A 100 bp ladder was used as the marker. DNA from cells was applied which were treated with various (+) - Preussin concentrations (0.5 - 5 ⁇ M). A characteristic DNA ladder is cells that have been treated with 2.5 and 5 ⁇ M.
  • caspase 3 is a protein that is important for many characteristic features of apoptosis
  • the activation of caspase 3 and the breakdown of PARP, an important repair enzyme and substrate of caspase 3 were followed by Western emblot analysis (see Table 1). Both activation of caspase 3 and the 85 kDa, characteristic cleavage product of PARP were detected in the protein extracts.
  • the uncleaved 116 kDa PARP protein was no longer detectable, which correlates with the observations from the maximum propidium iodide staining.
  • (+) - Preussin induces apoptosis in HL-60 cells. It was therefore tested whether (+) - Preussin also shows effects in other tumor cell lines. All rapidly growing cells should be susceptible to an effect of (+) - Preussin, since (+) - Preussin affects the cell cycle (see cell cycle analyzes).
  • Three different prostate carcinoma cell lines PC-3, DU-145 and LNCaP were tested and after incubating the cells for 48 hours with (+) - Preussin, the IC 50 values varied between 3 and 5.8 ⁇ M (Table 2). The immobilized but not transformed cell line NUT3T3 was used as a control.
  • the IC 5 o-value is for this Zelllmie at 47 uM (see Table 2) and 9- up to 47 times higher than in the tumor cell lines tested.
  • the induction of apoptosis is p53 independent because the cell lines PC-3 and DU-145 p53 are negative. Similar observations were made in the lung and breast carcinoma cell lines A549 and MCF-7 (Table 2).
  • Cell cycle analysis (+) - Preussin triggers cell cycle blocking in Gi at low concentrations (0.2 - 2 ⁇ M).
  • the cell cycle phase was determined using FACS analyzes. The number of cells in the Gi phase is higher in all tumor cell lines tested than in the control.
  • (+) - Preussin blocks cells in Gi
  • kinase assays were carried out with the G ⁇ specific kinase cdk2.
  • cdk2 kinase inhibitor FP In comparison with the cdk2 kinase inhibitor FP, a significant inhibition of the kinase activity was qualitatively evident after the addition of (+) - Preussin.
  • (+) - Preussin is a weaker competitive inhibitor than FP.
  • the analysis of the kinase activity indicates that (+) - Preussin is a selective cdk2 kinase inhibitor.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Pyrrolidinverbindungen der allgemeinen Formel (1): und ihre Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Therapie von Erkrankungen, die durch Störungen in der Induktion des Zelltodes oder der Regulation des Zellzyklusses gekennzeichnet sind, wie z.B. hyperproliferative Erkrankungen, Tumore und Psoriasis.

Description

PYRROLIDINVERBINDUNGEN UND IHRE VERWENDUNG ZUR THERAPIE VON HYPERPROLIFERATIVEN ERKRANKUNGEN UND VON TUMORERKRANKUNGEN
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Pyrrolidinverbindungen und ihre Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Therapie von Erkrankungen, die durch Störungen in der Induktion des Zelltodes oder der Regulation des Zellzyklusses gekennzeichnet sind.
Die exakte Kontrolle von Ort und Zeitpunkt der Zellteilung ist für das Funktionieren und die Überlebensfähigkeit aller multizellulären Organismen von entscheidender Bedeutung. So ist es nicht überraschend, daß eine Nielzahl von Erkrankungen mit einer gestörten Kontrolle der Zellteilung einhergehen. Beispielsweise führt die unkontrollierte Zellteilung, die auch Hyperproliferation genannt wird, zu so verschiedenen Erkrankungen wie Tumorerkrankungen und Psoriasis. Während man schon seit geraumer Zeit die molekularen Mechanismen untersucht, die für das beschleunigte Wachstum von beispielsweise Tumorzellen verantwortlich sind, ist erst in den letzten Jahren die Erkenntnis gewachsen, daß zur Tumorenstehung neben der fehlgesteuerten Aktivierung von wachstumsfördernden Prozessen gleichzeitig auch wachstumshindernde Mechanismen deaktiviert werden müssen. Ein wichtiger wachstumshindernder Mechanismus ist die Apoptose.
Die Apoptose, die auch programmierter Zelltod genannt wird, ist die kontrollierte Abfolge einer Reihe von molekularen Prozessen, die zu biochemischen und morphologischen Veränderungen und schließlich zum Tod einer Zelle führen. Sie ist ein Mittel der selektiven Zelltötung, das sowohl bei der Selektion autoantigenen T-Zellen in der Milz während der Bildung des Irnmunsystems, als auch bei der normalen Embryonalentwicklung von entscheidender Bedeutung ist. Entsprechend der Bedeutung der Apoptose ist eine Störung der molekularen Prozesse, die mit der Apoptose einhergehen, für die Entstehung vieler Krankheiten verantwortlich (L. Aravind et al., TIBS 1999, 24, 47). Apoptose ist durch Veränderungen, wie beispielsweise eine Verkleinerung des Zellvolumens, Chromatinkondensierung, DNA-Fragmentierung, Zeiloberflächenveränderungen, die Bildung von membrangebundenen, apoptotischen Körpern und die Aktivierung der sogenannten Caspasen (E. S. Alnemri et al, Cell 1996, 87, 171; D.W. Nicholson et al., Nαtwre 1996, 376, 37; C. Widmann et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, 7141 ; S. M. Srinivasula et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, 10107) gekennzeichnet. Diese morphologischen und biochemischen Veränderungen können durch eine Reihe von Verfahren nachgewiesen werden, wie beispielsweise durch eine DNA-Leiter (M. Herrmann et al., supra), PARP-cleavage (C. Widmann et al., supra), Annexin- V-Bindung (C. Widmann et al., supra) und Fluoreszenz- aktivierte-Zellsortierung (FACS)-Analyse.
Die Erkenntnis, daß beispielsweise Tumore durch die Blockierung bestimmter wachstumshindernder Mechanismen entstehen, hat die Suche nach Arzneimitteln, die diese Mechanismen induzieren, beflügelt. Die Bedeutung dieses Therapieansatzes wurde auch durch Untersuchungen über die molekulare Grundlage der Wirkung bereits bekannter Chemotherapeutika untermauert, in denen gezeigt werden konnte, daß viele bekannte Chemotherapeutika, wie beispielsweise c/s-Platin, Apoptose induzieren (D.L. Evans und C. Dive, Cancer Res. 1993, 5321, 33).
Von dem Pyrrolidinolalkaloid (+)-Preussin, das erstmals aus den Mikroorganismen Preussia sp. und Aspergillus ochraceus isoliert wurde, war bisher nur bekannt, das es eine antifungizide Wirkung auf filamentöse Pilze und auf Hefen entfaltet (US 4,847,284; R. E. Schwartz et al., J. Antibiot. 1988, /, 1774; j. H. Johnson et al, J. Antibiot. 1989, 42, 1184).
Im Rahmen dieser Erfindung konnte nun überraschend gezeigt werden, daß
Pyrrolidinverbindungen, insbesondere das Pyrrolidinol (+)-Preussin, Apoptose induzieren und spezifisch gegen Tumorzellen wirksam sind. Während für nicht transformierte Zellen erst eine Konzentration von 47 μM (IC5o-Wert) zur Zellzytotoxizität führte, induzierte (+)-Preussin bereits bei Konzentrationen zwischen 1 -6 μM (IC50- Werte) Tumorzellzytotoxizität. Somit sind Tumorzellen 9- bis 47-mal empfindlicher gegenüber den erfindungsgemäßen Pyrrolidin- Verbindungen, als nicht transformierte Zellen.
Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Pyrrolidin- verbindungen in niedrigen Konzentrationen zu einer Akkumulation von Zellen in der G] -Phase des Zellzyklus führen und dadurch auch zur Behandlung von Erkrankungen geeignet sind, die durch eine Störungen in der Regulation des Zellzyklusses gekennzeichnet sind.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demnach Pyrrolidinverbindung der allgemeinen Formel 1,
in der die Substituenten unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben:
Ri H, Cj- bis C20-Alkyl, vorzugsweise Ci- bis Ci5-Alkyl, besonders bevorzugt Ci- bis Cio-Alkyl, insbesondere Ci-Alkyl, C2- bis CiQ-Alkenyl, vorzugsweise C2- bis C8-Alkenyl, besonders bevorzugt C2- bis C5-Alkenyl, insbesondere C2-Alkenyl, C - bis Cι0-Cycloalkyl, vorzugsweise C3- bis C6- Cycloalkyl, C3- bis Cio-Cycloalkenyl, vorzugsweise C3- bis C6-
Cycloalkenyl, Ci- bis C20-Alkoxycarbonyl, vorzugsweise Ci- bis C15- Alkoxycarbonyl, besonders bevorzugt Ci- bis Cι0-Alkoxycarbonyl, insbesondere Ci-Alkoxycarbonyl, CH2-Aryl, CH2-Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S- und/oder O-Heteroatomen, Aryl oder Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S- und/oder O-Heteroatomen, gegebenenfalls substituiert; R2 Ci- bis C20-Alkyl, vorzugsweise C5- bis Cij-Alkyl, besonders bevorzugt C8- bis Cι2-Alkyl, insbesondere C9-Alkyl, C2- bis Cι0- Alkenyl, vorzugsweise C5- bis CiQ-Alkenyl, besonders bevorzugt C8- bis Cio- Alkenyl, insbesondere C9-Alkenyl, C3- bis Cio-Cycloalkyl, vorzugsweise C3- bis C6-Cycloalkyl, C3- bis Cio-Cycloalkenyl, vorzugsweise C - bis C6- Cycloalkenyl, CH2-(C2- bis Cio-Alkenyl), vorzugsweise CH2-(C - bis Cio- Alkenyl), besonders bevorzugt CH2-(C8- bis Cι0-Alkenyl), insbesondere
CH2-(C9-Alkenyl), CH2-(C3- bis Cio-Cycloalkyl), vorzugsweise CH2-(C3- bis Cö-Cycloalkyl), CH2-(C3- bis Cio-Cycloalkenyl), vorzugsweise CH2- (C - bis C6-Cycloalkenyl), (CH2)m-Aryl, (CH2)m-Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S- und/oder O-Heteroatomen, CH2-O-(Cr bis C2o-Alkyl), vorzugsweise CH2-O-(C5- bis Cι5-Alkyl), besonders bevorzugt CH2-O-(C8- bis C,2-Alkyl), insbesondere CH2-O-(C9-Alkyl), CH2-O-(Cι- bis C20-Acyl), vorzugsweise CH2-O-(C5- bis Cι5-Acyl), besonders bevorzugt CH -O-(C - bis Cι2-Acyl), insbesondere CH -O-(C9- Acyl), CH2-O-(C2- bis Cio-Alkenyl), vorzugsweise CH2-O-(C5- bis Cio- Alkenyl), besonders bevorzugt CH2-O-(C8- bis Cio-Alkenyl, insbesondere
CH2-O-(C9- Alkenyl), CH2-O-(C3- bis Cio-Cycloalkyl), vorzugsweise CH2- O-(C3- bis C6-Cycloalkyl), CH2-O-(C3- bis Cio-Cycloalkenyl), vorzugsweise CH2-O-(C3- bis C6-Cycloalkenyl), CH2-O-(Aryl), CH2-O- (Heteroaryl), vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S- und/oder O- Heteroatomen, oder Ci- bis Cι -Alkoxy, vorzugsweise C5- bis Cio-Alkoxy, besonders bevorzugt C8- bis Cio-Alkoxy, insbesondere C9-Alkoxy, gegebenenfalls substituiert; m 0 bis 10, vorzugsweise 0 bis 5, besonders bevorzugt 0 bis 2, insbesondere 0 bis 1; R3 H, Cp bis C2o-Alkyl, vorzugsweise Cp bis Cι5-Alkyl, besonders bevorzugt Ci- bis Cio-Alkyl, insbesondere C2-Alkyl, C2- bis Cio-Alkenyl, vorzugsweise C2- bis C8-Alkenyl, besonders bevorzugt C - bis C5-Alkenyl, insbesondere C -Alkenyl, C - bis Cio-Cycloalkyl, vorzugsweise C3- bis C6- Cycloalkyl, C3- bis Cio-Cycloalkenyl, vorzugsweise C3- bis C6-
Cycloalkenyl, Ci- bis C20-Acyl, vorzugsweise Ci- bis Cι5-Acyl, besonders bevorzugt Cp bis Cio-Acyl, insbesondere d-Acyl, (CH2)n-Aryl oder (CH2)n-Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S- und/oder O-Heteroatomen, gegebenenfalls substituiert; n 0 bis 10, vorzugsweise 0 bis 5, besonders bevorzugt 0 bis 2, insbesondere
0;
R4 (CH2)-Aryl oder (CH2)-Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S- und/oder O-Heteroatomen, gegebenenfalls substituiert.
Bei der bereits bekannten Pyrrolidinverbindungen (+)-Preussin haben die Substituenten gleichzeitig die folgende Bedeutung: Ri = CH , R2 = n-C9Hι9, R3= H und R4= CH2-C6H . Weitere bekannte Verbindungen, die unter die allgemeine Formel 1 fallen und für die bisher nicht beschrieben wurde, daß sie zur Therapie von Erkrankungen, die durch Störungen in der Induktion des Zelltodes oder der Regulation des Zellzyklusses ausgelöst sind, verwendet werden können, haben Substituenten, die gleichzeitig die folgende Bedeutung haben Ri = CH , R2 = n- C9H!9, R3= Ci- bis C5-Alkyl oder Ci- bis C5-Acyl und P = CH2-C6H5, Ri = CH3, COOCH3 oder COOC6H5, R2 = C9-Alkenyl, R3 = H und R4 = CH2-C6H5 oder R, = CH3, COOCH3, COOCH2CH3, COOtertButyl oder COOCH2-C6H5, R2 = n-C9H,9, R3 = H oder C2-Acyl und R = CH2-C6H5. Die Pyrrolidinverbindungen der vorliegende Erfindung umfassen demnach keine Verbindungen, die unter die Formel 1 fallen und bei denen die Substituenten die vorangehend aufgeführten Bedeutungen haben. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Pyrrolidinverbindung nach der allgemeinen Formel 1, wobei der Substituent P die allgemeine Formel la hat
und wobei die Substituenten R5, R , R7, R8 und R9 unabhängig voneinander gleichzeitig oder verschieden die folgenden Bedeutungen haben:
F, CI, Br, H, Ci- bis C2o-Alkyl, vorzugsweise C|- bis Cι5-Alkyl, besonders bevorzugt d- bis Cio-Alkyl, insbesondere Cp bis C4-Alkyl, C2- bis Cio-Alkenyl, vorzugsweise C2- bis C8-Alkenyl, besonders bevorzugt C2- bis C4-Alkenyl, C3- bis Cio-Cycloalkyl, vorzugsweise C - bis C6-Cycloalkyl, C3- bis Cio-Cycloalkenyl, vorzugsweise C - bis C6-Cycloalkenyl, Cp bis Cι2-Alkoxy, vorzugsweise Cp bis C8-Alkoxy, besonders bevorzugt C\- bis C -Alkoxy, insbesondere C2-Alkoxy, Cp bis C20-Alkoxycarbonyl, vorzugsweise Cp bis Cio-Alkoxycarbonyl, besonders bevorzugt Cp bis C6-Alkoxycarbonyl, insbesondere Cp bis C3-Alkoxycarbonyl, Cp bis C20-Alkylamino, vorzugsweise Cp bis Cio-Alkylamino, besonders bevorzugt Cp bis C6-Alkylamino, insbesondere Cp bis C3-Alkylamino, Cp bis Cι2-Dialkylamino, vorzugsweise Cp bis C8-Dialkylamino, besonders bevorzugt Cp bis C3-Dialkylamino, insbesondere C2-Dialkylamino, (CH2)P-Aryl oder (CH2)p-Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert; p 0 bis 5, vorzugsweise 0 bis 3, besonders bevorzugt 0 bis 2, insbesondere 0 bis l. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Pyrrolidinverbindung nach der allgemeinen Formel 1, wobei der Substituent R die allgemeine Formel lb hat,
CH2 Rio lb
und wobei Rι0:
2-Furyl, 3-Furyl, 2-Thiophenyl, 3-Thiophenyl, 2-Oxazolyl, 4- Oxazolyl, 5- Oxazolyl, 1-Pyrrolyl, 2-Pyrrolyl, 3-Pyrrolyl, 1-Pyrazolyl, 3-Pyrazolyl, 4-Pyrazolyl, 5-Pyrazolyl, 1-Imidazolyl, 2-Imidazolyl, 4-Imidazolyl, 5-Imidazolyl, 1-Triazolyl, 3-Triazolyl, 5-Triazolyl, 2-Pyridinyl, 3-Pyridinyl, 4-Pyridinyl, 2-Pyridazinyl, 3- Pyridazinyl, 2-Pyrimidinyl, 4-Pyrimidinyl, 5-Pyrimidinyl, 2-Pyrazinyl oder 3- Pyrazinyl, gegebenenfalls substituiert, bedeutet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer oder mehrerer der im vorangehenden beschriebenen Pyrrolidinverbindung als Arzneimittel. Die erfindungsgemäßen Pyrrolidinverbindungen sind insbesondere zur Therapie von Erkrankungen geeignet, die durch Störungen in der Induktion des Zelltodes oder der Regulation des Zellzyklusses gekennzeichnet sind.
Ein weiterer Gegenstand ist demnach ein Arzneimittel, das eine oder mehrere der vorangehend beschriebenen Pyrrolidinverbindungen und gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe enthält.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer oder mehrerer Pyrrolidinverbindung nach der allgemeinen Formel 1
in der die Substituenten unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben:
Ri H, C\- bis C2o-Alkyl, vorzugsweise Cp bis Cι5-Alkyl, besonders bevorzugt Cp bis Cio-Alkyl, insbesondere CpAlkyl, C2- bis Cio-Alkenyl, vorzugsweise C2- bis C8-Alkenyl, besonders bevorzugt C2- bis C5-Alkenyl, insbesondere C2-Alkenyl, C3- bis Cio-Cycloalkyl, vorzugsweise C3- bis C6- Cycloalkyl, C3- bis Cio-Cycloalkenyl, vorzugsweise C3- bis C6-
Cycloalkenyl, Cp bis C2o-Alkoxycarbonyl, vorzugsweise Cp bis Q - Alkoxycarbonyl, besonders bevorzugt Cp bis Cio-Alkoxycarbonyl, insbesondere CpAlkoxycarbonyl, CH2-Aryl, CH2-Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S- und/oder O-Heteroatomen, Aryl oder Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S- und/oder O-Heteroatomen, gegebenenfalls substituiert;
R2 H, Cp bis C20-Alkyl, vorzugsweise C5- bis Cι -Alkyl, besonders bevorzugt
C8- bis Cι2-Alkyl, insbesondere C9-Alkyl, C2- bis Cio-Alkenyl, vorzugsweise C5- bis Cio-Alkenyl, besonders bevorzugt C8- bis Cio- Alkenyl, insbesondere C9- Alkenyl, C - bis Cio-Cycloalkyl, vorzugsweise
C3- bis C6-Cycloalkyl, C3- bis Cio-Cycloalkenyl, vorzugsweise C - bis C6- Cycloalkenyl, CH2-(C2- bis Cio-Alkenyl), vorzugsweise CH2-(C - bis Cio- Alkenyl), besonders bevorzugt CH2-(C8- bis Cio-Alkenyl), insbesondere CH -(C9-Alkenyl), CH2-(C3- bis Cio-Cycloalkyl), vorzugsweise CH2-(C3- bis C6-Cycloalkyl), CH2-(C - bis Cio-Cycloalkenyl), vorzugsweise CH2-
(C3- bis Cö-Cycloalkenyl), (CH2)m-Aryl, (CH )m-Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S- und/oder O-Heteroatomen, CH -O-(Cp bis C2o-Alkyl), vorzugsweise CH2-O-(C5- bis Cι5-Alkyl), besonders bevorzugt CH2-O-(C8- bis Cι2-Alkyl), insbesondere CH2-O-(C9-Alkyl), CH2-O-(Cp bis C2o-Acyl), vorzugsweise CH2-O-(C5- bis Cι5-Acyl), besonders bevorzugt CH2-O-(C8- bis d2-Acyl), insbesondere CH2-O-(C9- Acyl), CH2-O-(C2- bis Cio-Alkenyl), vorzugsweise CH2-O-(C5- bis Cio- Alkenyl), besonders bevorzugt CH2-O-(C8- bis Cio-Alkenyl, insbesondere
CH2-O-(C9-Alkenyl), CH2-O-(C3- bis Cio-Cycloalkyl), vorzugsweise CH2- O-(C3- bis C6-Cycloalkyl), CH2-O-(C3- bis Cio-Cycloalkenyl), vorzugsweise CH2-O-(C3- bis C6-Cycloalkenyl), CH2-O-(Aryl), CH2-O- (Heteroaryl), vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S- und/oder O- Heteroatomen, oder bis Cι2-Alkoxy, vorzugsweise C5- bis Cio-Alkoxy, besonders bevorzugt C8- bis Cio-Alkoxy, insbesondere C9-Alkoxy, gegebenenfalls substituiert; m 0 bis 10, vorzugsweise 0 bis 5, besonders bevorzugt 0 bis 2, insbesondere 0 bis 1; R3 H, Cp bis C2o-Alkyl, vorzugsweise Cp bis Ci5-Alkyl, besonders bevorzugt d- bis Cio-Alkyl, insbesondere C2-Alkyl, C2- bis Cio-Alkenyl, vorzugsweise C2- bis C8-Alkenyl, besonders bevorzugt - bis C5-Alkenyl, insbesondere C2- Alkenyl, C3- bis Cio-Cycloalkyl, vorzugsweise C3- bis C6- Cycloalkyl, C3- bis Cio-Cycloalkenyl, vorzugsweise C3- bis C6- Cycloalkenyl, Cp bis C2o-Acyl, vorzugsweise C\- bis Cι5-Acyl, besonders bevorzugt C\- bis Cio-Acyl, insbesondere CpAcyl, (CH2)n-Aryl oder
(CH2)π-Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S- und/oder
O-Heteroatomen, gegebenenfalls substituiert; n 0 bis 10, vorzugsweise 0 bis 5, besonders bevorzugt 0 bis 2, insbesondere 0; j H, Cp bis C2o-Alkyl, vorzugsweise C2- bis d5-Alkyl, besonders bevorzugt C2- bis Cio-Alkyl, insbesondere C3- bis C6-Alkyl, C2- bis Cio-Alkenyl, vorzugsweise C3- bis C8-Alkenyl, besonders bevorzugt C - bis C -Alkenyl, insbesondere C3-Alkenyl, C3- bis Cio-Cycloalkyl, vorzugsweise C3- bis C6- Cycloalkyl, C3- bis Cio-Cycloalkenyl, vorzugsweise C3- bis C6- Cycloalkenyl, Cp bis C2o-Alkoxycarbonyl, vorzugsweise C2- bis C15- Alkoxycarbonyl, besonders bevorzugt C2- bis Cio-Alkoxycarbonyl, insbesondere C3- bis C6-Alkoxycarbonyl, (CH2)0-Aryl oder (CH2)0- Heteroaryl, vorzugsweise mit einem oder mehreren N-, S- und/oder O- Heteroatomen, gegebenenfalls substituiert; o 0 bis 10, vorzugsweise 0 bis 5, besonders bevorzugt 0 bis 3, insbesondere
1,
gegebenenfalls zusammen mit Hilfs- und/oder Zusatzstoffen, zur Therapie von Erkrankungen, die durch Störungen in der Induktion des Zelltodes oder der Regulation des Zellzyklusses gekennzeichnet sind.
Unter Hilfs- und Zusatzstoffen werden Substanzen verstanden, die die Löslichkeit, Stabilität, Freisetzungskinetik und/oder die biologische Halbwertzeit der Pyrrolidinverbindung verändern, wie beispielsweise DMSO oder Pufferlösungen.
Unter Störungen in der Induktion des Zelltodes werden Störungen in Mechanismen verstanden, die zum Absterben der Zelle fuhren. Zu diesen Mechanismen zählen vor allem Nekrose und Apoptose. Eine Störung im Sinne der vorliegenden Erfindung liegt vor allem dann vor, wenn Zellen nicht mehr dazu in der Lage sind die Apoptose einzuleiten und/oder durchzuführen.
Der Zellzyklus ist die geregelte Abfolge einer Vielzahl molekularer Prozesse, die sich beim Fortschreiten der Zelle durch den Zellzyklus auch in morphologischen Änderungen manifestieren und die schließlich in der Teilung der Zelle kulminieren. Die Zelle bewegt sich dabei durch vier auf Grund mikroskopischer Beobachtung charakterisierter Phasen, der Gp, S-, G2 und M-Phase. Proteine, denen eine Schlüsselfunktion beim Ablauf des Zellzyklusses zukommen sind die sogenannten Cycline. In der GpPhase ist beispielsweise das Cyclin/Cyclin- abhängige-Kinase Paar Cyclin E/cdk2 (cyclin dependent kinase) aktiv. Beim Übergang in die S-Phase wird zusätzlich Cyclin A/cdk2 aktiv. In der G2-Phase wiederum wechselt Cyclin A seinen Kinasepartner und assoziiert mit cdc2. In der späten M-Phase wird Cyclin B, das auch mit cdc2 assoziiert, aktiviert. Die Aktivität der verschiedenen Cyclin Cyclin-abhängige-Kinase Paare wird sowohl durch die Assoziation mit weiteren Proteinen, wie beispielsweise p21CIP, p27ιαp, pl6rNK oder p57INK2 als auch durch Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung oder Ubiquitinilierung reguliert (J. Zwicker und R. Müller, 91 ; C. Desdouets et al., 115; K. Sauer und C.F. Lehner, 125; A. Koff und K. Polyak, 141 ; L. Meijer 351; alle in Progress in Cell Cycle Research Volume 1 (Herausgeber: L. Meijer, S. Guidet und H.Y. Lim Tung) Plenum Press, New York und London 1995). Durch die Kontrolle dieser Prozesse wird eine Zelle entweder veranlaßt durch den Zellzyklus fortzuschreiten und sich zu teilen oder sie wird daran gehindert sich zu teilen und tritt dann in eine fünfte Zellzyklusphase, die Go-Phase oder Ruhephase, oder auch in die Apoptose ein.
Ein Großteil der menschlichen Körperzellen befindet sich in der Go-Phase des Zellzyklusses und nur bestimmte Zelltypen, wie beispielsweise Epithelzellen oder Blutzellen teilen sich regelmäßig. Viele Zelltypen besitzen jedoch noch das Potential sich zu teilen und tun dies unter bestimmten Bedingungen, wie beispielsweise Hautzellen nach Verletzung oder Brustdrüsenzellen während der Schwangerschaft. Unter Störung der Regulation des Zellzyklusses im Sinne der vorliegenden Erfindung werden demnach alle die Änderungen verstanden, die dazu führen, daß eine Zelle nicht die physiologisch normale Regulation des Zellzyklusses vornimmt, insbesondere das eine Zelle in den Zellzyklus eintritt oder im Zellzyklus verbleibt, obwohl sie sich in der G0-Phase befinden sollte oder in die Go-Phase eintreten sollte.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer oder mehrerer Pyrrolidinverbindung gemäß Formel 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent P die allgemeine Formel la hat,
wobei die Substituenten R5, Rό, R7, R8 und R9 unabhängig voneinander gleichzeitig oder verschieden die folgenden Bedeutungen haben:
F, CI, Br, H, Cp bis C2o-Alkyl, vorzugsweise Cp bis Cis-Alkyl, besonders bevorzugt Cp bis Cio-Alkyl, insbesondere Cp bis C4-Alkyl, C2- bis Cio-Alkenyl, vorzugsweise C2- bis C8-Alkenyl, besonders bevorzugt C2- bis C4-Alkenyl, C3- bis Cio-Cycloalkyl, vorzugsweise C3- bis C6-Cycloalkyl, C3- bis Cio-Cycloalkenyl, vorzugsweise C3- bis C6-Cycloalkenyl, Cp bis Cι2-Alkoxy, vorzugsweise Cp bis C8-Alkoxy, besonders bevorzugt Cp bis C3-Alkoxy, insbesondere C2-Alkoxy, Cp bis C o-Alkoxycarbonyl, vorzugsweise Cp bis Cio-Alkoxycarbonyl, besonders bevorzugt Cp bis C6-Alkoxycarbonyl, insbesondere Cp bis C3-Alkoxycarbonyl, Cp bis C2o-Alkylamino, vorzugsweise C\- bis Cio-Alkylamino, besonders bevorzugt Cp bis C6-Alkylamino, insbesondere Cp bis C3-Alkylamino, Cp bis Cι2-Dialkylamino, vorzugsweise Cp bis C8-Dialkylamino, besonders bevorzugt d- bis C3-Dialkylamino, insbesondere C2-Dialkylamino, (CH2)P-Aryl oder (CH2)p-Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert; p 0 bis 5, vorzugsweise 0 bis 3, besonders bevorzugt 0 bis 2, insbesondere 0 bis 1,
gegebenenfalls zusammen mit Hilfs- und/oder Zusatzstoffen, zur Therapie von Erkrankungen, die durch Störungen in der Induktion des Zelltodes oder der Regulation des Zellzyklusses gekennzeichnet sind. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer oder mehrerer Pyrrolidinverbindung gemäß Formel 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent P die allgemeine Formel lb hat,
lb
wobei Rι0:
2-Furyl, 3-Furyl, 2-Thiophenyl, 3-Thiophenyl, 2-Oxazolyl, 4- Oxazolyl, 5- Oxazolyl, 1-Pyrrolyl, 2-Pyrrolyl, 3-Pyrrolyl, 1-Pyrazolyl, 3-Pyrazolyl, 4-Pyrazolyl, 5-Pyrazolyl, 1-Imidazolyl, 2-Imidazolyl, 4-Imidazolyl, 5-Imidazolyl, 1-Triazolyl, 3-Triazolyl, 5-Triazolyl, 2-Pyridinyl, 3-Pyridinyl, 4-Pyridinyl, 2-Pyridazinyl, 3- Pyridazinyl, 2-Pyrimidinyl, 4-Pyrimidinyl, 5-Pyrimidinyl, 2-Pyrazinyl oder 3- Pyrazinyl, gegebenenfalls substituiert, bedeutet, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs- und/oder Zusatzstoffen, zur Therapie von Erkrankungen, die durch Störungen in der Induktion des Zelltodes oder der Regulation des Zellzyklusses gekennzeichnet sind.
Eine bevorzugte Verwendung, der im vorangehenden beschriebenen Pyrrolidinverbindungen ist dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere der Pyrrolidinverbindungen, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs- und/oder Zusatzstoffen, zur Induktion von Apoptose verwendet werden.
Eine weitere bevorzugte Verwendung, der im vorangehenden beschriebenen Pyrrolidinverbindungen ist dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere der Pyrrolidinverbindungen, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs- und/oder Zusatzstoffen, zur Therapie von hyperproliferativen Erkrankungen verwendet werden. Hyperproliferative Erkrankungen im Sinn der vorliegenden Erfindung sind alle Erkrankungen, die durch Zellteilung gekennzeichnet sind, daie stärker ist, als es physiologisch normal wäre.
Eine weitere bevorzugte Verwendung, der im vorangehenden beschriebenen Pyrrolidinverbindungen ist dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere der Pyrrolidinverbindungen, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs- und/oder Zusatzstoffen, zur Therapie von Tumoren, Autoimmunerkrankungen und Psoriasis verwendet werden.
Die Pyrrolidinverbindungen der vorliegenden Erfindung induzieren in einer Reihe von Tumorzellininen Apoptose. Insbesondere (+)-Preussin induzierte in 8 verschiedenen Tumorzellininen bei Konzentration von 1 - 5,8 μM (IC o- Werte) Apoptose während in nicht transformierten Kontrollzellen (NLH3T3) erst bei einer Konzentration von 47 μM (Ido-Wert) Zellzytotoxizität beobachtet wurde. Somit sind die vorangehend beschriebenen Pyrrolidinverbindungen, insbesondere Preussin nicht nur dazu in der Lage Tumorzellen effizient abzutöten, sie zeigen auch noch eine bemerkenswerte Tumorzellspezifität. Dieser differenzielle Effekt auf Tumorzellen und „normale" Zellen ist in der Regel Voraussetzung für die erfolgreiche Verwendung eines neuen Chemotherapeutikums.
Die Pyrrolidinverbindungen bei denen der Rest Rt in Pyrrolidinverbindungen des Typs 1 die Bedeutung, die für die Substituenten la oder lb angegeben sind, hat, werden im folgenden auch durch die Formeln 2a und 2b dargestellt.
Schema 1: Pyrrolidinverbindungen der allgemeinen Formel 2a und 2b, die aus der allgemeinen Formel 1 unter Hinzufügung der Substituenten la und lb abgeleitet sind.
Ein Startpunkt der Synthese der Pyrrolidinverbindungen der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise kommerziell erhältliche (S)- beziehungsweise (R)- Pyroglutaminsäure, die in 8 Stufen zu enantiomerenremen 2,3-Dihydropyrrolen des Typs 3 umgesetzt wird (T. Bach und H. Brummerhop, Angew. Chem. 1998, 110, 3577; T. Bach und H. Brummerhop, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 3400; T. Bach und H. Brummerhop, J. Prakt. Chem. 1999, 341, 312). Die Umsetzung dieser 2,3-Dihydropyrrole mit aromatischen oder heteroaromatischen Aldehyden in einer [2+2]-Photocycloaddition und anschließender hydrogenolytischer Oxetanöffhung führt zu Pyrrolidinolen des Typs 4, die gegebenenfalls durch Inversion der Hydroxyfunktion (O. Mitsunobu, Synthesis 1981, 1), Derivatisierung der Hydroxyfunktion und Variation des Stickstoffsubstituenten Ri zu sämtlichen Diastereomeren und Enantiomeren der Pyrrolidinverbindungen des Typs 2a und 2b umgesetzt werden können (Schema 2).
Schema 2: Retrosynthetische Betrachtung zur Synthese von Pyrrolidinverbindungen des Typs 2a und 2b Die 2,3-Dihydropyrrole des Typs 3 können wie folgt synthetisiert werden. Von Pyroglutammsäure ausgehend läßt sich die Toluolsulfonyl-Verbindung 6 in 3 Stufen darstellen (E. Hardegger, H. Ott, He/v. Chim. Acta 1955, 38, 312) und sowohl zum Methyl-substituierten Pyrrolidinon 5a reduzieren (B. Ringdahl et al. , J. Med. Chem. 1985, 28, 1760) als auch im Sinne einer Corey-Ηouse-Reaktion mit Cupraten effizient substituieren (j. Ackermann et al. He/v. Chim. Acta 1990, 73, 122; M. Matthes und C. Tamm, He/v. Chim. Acta 1991, 74, 1585) dadurch wird 6 in Pyrrolidinone des Typs 5b überfuhrt.
Das in 2 Stufen aus Pyroglutammsäure erhältliche Pyroglutaminol 7 (S. Saijo et al. Chem. Pherm. Bull. 1980, 28, 1449) läßt sich durch nucleophile Substitution am Sauerstoffatom ebenfalls einfach zu 5c derivatisieren. Darüber hinaus liefert der entsprechende Aldehyd 8 (G. Rassu et al., Tetrahedron Lett. 1994, 35, 4019) in einer Wittigreaktion auch Alkenyl-substituierte Pyrrolidinone des Typs 5d (Schema 3).
5a
R2 = C2-C20-Alkyl, CH2-(C3-C10-Cycloalkyl), CH2-(C3-C10-Cycloalkenyl), CH2-Aryl, CH2-Heteroaryl
5b
l), ryl
R2 = C2-C20-Alkenyl
8 5d
Schema 3: Synthese substituierter Pyrrolidinone Die substituierten Pyrrolidinone des Typs 5 lassen sich in einer 4-stufιgen Sequenz in die Dihydropyrrole des Typs 3 überführen (T. Bach und H. Brummerhop, 1999, supra).
"I . BuLi TMSOTf,
2. CICOOR LiEt3BH DMP, CSA /Pr2NEt
N R2 (THF) (CH2CI2) (CH2CI2) (CH2CI2)
R2 = Wasserstoff, C C20-Alkyl, CH2-(C3-C10-Cycloalkyl), CH2-(C3-C10-Cycloalkenyl), CH2-Aryl, CH2-O-(CpC20-Alkyl), CH2-0-(C3-C-, 0-Cycloalkyl), CH2-0-(C3-C1 o-Cycloalkenyl), CH2-0-(C1 -C2o-Acyl),CH2-0-Aryl, CH2-0-Heteroaryl, C2-C2o-Alkerιyl
Schema 4: Synthese substituierter 2,3- Dihydropyrrole
Die cyclischen Enamide des Typs 3 lassen sich in einer [2+2]-Photocycloaddition mit aromatischen Aldehyden zu diastereomeren, bicyclischen Verbindungen des Typs 9a und 9b umsetzen (T. Bach und H. Brummerhop, Angew. Chem. 1998, 110, 3577; T. Bach und H. Brummerhop, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 3400). Anschließende hydrogenolytische Oxetanring-Öffhung (T. Bach, Tetrahedron Lett. 1994, 35, 1855; T. Bach, Liebigs Ann. 1995, 1045) führt zu Pyrrolidinolen des Typs 10a und 10b, die durch Mitsunobu-Inversion in die diastereomeren Pyrrolidinole 10c und lOd überfuhrt werden (Schema 5).
9a 9b
H2, Pd(OH)2/C
R2 = Wasserstoff, C C20-Alkyl, (MeOH)
C H2-(C3-C1 o-Cycloalkyl ),
CH2-(C3-C10-Cycloalkenyl), HO
CH2-Aryl, CH2-O-(C C20-Alkyl),
CH2-O-(C3-C10-Cycloalkyl), A
CH2-O-(C3-C10-Cycloalkenyl),
CH2-0-(CpC2o-Acyl),CH2-0-Aryl,
CH2-0-Heteroaryl,
C2-C20-Alkenyl 10a 10b
1.PPh3, DEAD,
PhCOOH
Ar = Aryl, Heteroaryl, 2.K2C03, (MeOH) gegebenenfalls substituiert
10c lOd
Schema 5: Synthese von Pyrrolidinolen des Typs 10
Durch Wahl des Startmaterials ((R)- oder (S)-Pyroglutaminsäure) sind beide Enantiomere sämtlicher Diastereomere des Pyrrolidingerüstes der Verbindungsklasse 1 zugänglich.
Weitere Modifikation gelingt durch O-Alkylierung und O-Acylierung der Verbindungen des Typs 10. Anschließendes Entschützen des Stickstoffatoms und Substitution mit Halogenverbindungen liefert Pyrrolidine des Typs 2a und 2b (Schema 6). Alkyl = tBu
10 11 2b
R-i = Wasserstoff, R2 = Wasserstoff, C C20-Alkyl, R3 = Wasserstoff, C C20-Alkyl, C2-C10-Alkenyl, CH2-(C3-C10-Cycloalkyl), C C20-Alkyl, C3-Cι0-Cycloalkyl, CH2-(C3-C10-Cycloalkenyl), C2-C10-Alkenyl, C3-C10-Cycloalkenyl, CH2-Aryl, CH2-O-(C C20-Alkyl), C3-C10-Cycloalkyl, C1-C2o-Alkoxycarbonyl, CH2-O-(C3-C10-Cycloalkyl), C3-C-ι 0-Cycloalkenyl, CH2-Aryl, CH2-Heteroaryl, CH2-O-(C3-C10-Cycloalkenyl), C C20 Acyl, Aryl, Aryl, Heteroaryl, CH2-0-(C C2o-Acyl),CH2-0-Ary, Heteroaryl, CH2-Aryl, gegebenenfalls substituiert CH2-0-Heteroaryl, CH2-Heteroaryl,
C2-C20-Alkenyl gegebenenfalls substituiert
Ar = Aryl, Heteroaryl, R4 = CH2-Aryl,CH2-(2-Furyl), CH2-(3-Furyl), CH2-(2-Thiophenyl), gegebenenfalls substituiert CH2-(3-Thiophenyl), CH2-(2-Oxazolyl), CH2-(4- Oxazolyl), CH2-(5-Oxazolyl), CH2-(1-Pyrrolyl), CH2-(2-Pyrrolyl), CH2-(3-Pyrrolyl), CH2-(1-Pyrazolyl), CH2-(3-Pyrazolyl), CH2-(4-Pyrazolyl), CH2-(5-Pyrazolyl), CH2-(1-lmidazolyl), CH2-(2-lmidazolyl), CH2-(4-lmidazolyl), CH2-(5-lmidazolyl), CH2-(1-Triazolyl), CH2-(3-Triazolyl), CH2-(5-Triazolyl), CH2-(2-Pyridinyl), CH2-(3-Pyridinyl), CH2-(4-Pyridinyl), CH2-(2-Pyridazinyl), CH2-(3-Pyridazinyl), CH2-(2-Pyrimidinyl), CH2-(4-Pyrimidinyl), CH2-(5-Pyrimidinyl), CH2-(2-Pyraziπyl), CH2-(3-Pyrazinyl), gegebenenfalls substituiert;
Schema 6: Synthese von Pyrrolidinen des Typs 2b
Ein weiterer Startpunkt der Synthese der Pyrrolidinverbindungen der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise eine α- Aminosäure (M. Overhand und S. M. Hecht, J Chem. 1994, 59, 4721). Dabei stehen neben den natürlichen Aminosäuren auch die entsprechenden Enantiomere und nicht-natürliche Aminosäuren, die leicht durch eine Vielzahl synthetischer Methoden (R. M. Williams, Synthesis of Optically Active α-Amino Acids, Pergamon Press, Oxford 1989; H.-J. Altenbach in Organic Synthesis Highlights, Herausgeber: j. Mulzer, H.-J. Altenbach, M. Braun, K. Krohn, VCH, Weinheim 1991, 300), wie der Schöllkopf sehen Bislactimethersynthese (U. Schöllkopf, Top. Curr. Chem. 1983, 65, 109), der asymmetrische Strecker-Synthese (M. S. Iyer et al., J Am. Chem. Soc. 1996, 118, 4910; M. S. Sigman und E. N. Jacobsen, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 5315) etc. zugänglich sind.
Zunächst wird die Aminosäure 12 mit einer Boc-Schutzgruppe versehen und in das entsprechende Weinreb-Amid 13 (S. Nahm und S. M. Weinreb, Tetrahedron Lett. 1981, 22, 3815; J.-A. Fehrentz und B. Castro, Synthesis 1983, 676) überfuhrt (Schema 7).
Me
Schema 7: Synthese des Weinreb-Amids des Typs 13
Umsetzung der Amide des Typs 13 mit Alkinyllithiumverbindungen 14, die leicht durch Lithiierung der Alkine erhältlich sind (R. H. Boutin, H. Rapoport, J. Org. Chem. 1986, 51, 5320) liefert Ketone des Typs 15, die durch Quecksilber-(LT)- acetat in Nitrometan (R. C. Larock und L. W. Harrison, J Am. Chem. Soc. 1984, 106, 4218; E. Harding und T. H. Tiner in Comprehensive Organic Synthesis (Herausgeber: B. M. Trost), Pergamon, New York 1990, Vol.6, 363) eine 5-endo- dig Cyclisierung eingehen und Pyrrolidinone des Typs 16 liefern (Schema 8).
O °x H9CI
9 LiC≡CR2 BocHN U Hg(OAc)2 %-Y
BocHN l OMe i→ B°CHNY . - R L
Y ? 14 i ^R CH3N02 R4 R2
R4 CH3 14 K κ2 Boc 13 15 16
Schema 8: Synthese der Pyrrolidinone des Typs 16
Die Verbindungen des Typs 16 können diastereoselektiv zu den Pyrrolidinolen des Typs 17a reduziert werden und durch Mitsunobu-Inversion (O. Mitsunobu, supra) in Pyrrolidinole des Typs 17b transformiert werden. Verbindungen des Typs 17a, bei denen R2 = OCH3 (17c) ist, lassen sich darüber hinaus durch nucleophile Substitution (H. de Koning, W. N. Speckamp in Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), 4te Aufl., Herausgeber: G. Heimchen, R.W. Hoffmann, J. Mulzer, E. Schaumann), Thieme, Stuttgart 1995, Vol. E 21, 1952) in Pyrrolidinole des Typs 17d und durch Mitsunobu-Inversion in 17e transformieren. Damit sind durch Wahl des Startmaterials alle Enantiomere sämtlicher Diastereomere des Grundgerüstes 1 zugänglich (Schema 9).
16 17a 17b
17c 17d 17e
Schema 9: Synthese der Pyrrolidinole des Typs 17
Weitere Modifikation gelingt durch O-Alkylierung und O-Acylierung der Verbindungen des Typs 17. Anschließendes Entschützen des Stickstoffatoms und Substitution mit Halogenverbindungen Rt-Hal liefert eine große Anzahl Pyrrolidine des Typs 1 (Schema 10).
R2
17 18
R^ = Wasserstoff, R2 = Wasserstoff, R3 = Wasserstoff, C C20-Alkyl, -O-(C C20-Alkyl), C C20-Alkyl, C C20-Alkyl, C2-C10-Alkenyl, C3-C10-Cycloalkyl, C2-C10-Alkenyl, C3-C10-Cycloalkyl, C3-C10-Cycloalkenyl, C3-C10-Cycloalkyl, C3-C10-Cycloalkenyl, C2-C20-Alkenyl, Aryl, C3-C10-Cycloalkenyl, C1-C20-Alkoxycarbonyl, Heteroaryl, CH2-Aryl, CrC20 Acyl, Aryl, CH2-Aryl, CH2-Heteroaryl, CH2-Heteroaryl, Heteroaryl, CH2-Aryl, Aryl, Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert CH2-Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert gegebenenfalls substituiert
R4 = Wasserstoff, C C20-Alkyl, C2-C10-Alkenyl,C3-C10-Cycloalkyl, C3-C10-Cycloalkenyl, (CH2)n-Aryl, (CH2)n-Heteroaryl, Aryl, Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert n = 0 bis 10
Schema 10: Synthese der Verbindungsklasse 1
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung lediglich näher beschreiben ohne sie zu beschränken.
Die Beschreibung, Ansprüche und Zusammenfassung der Prioritätsanmeldung DE 199 36 789.2, die am 9. August 1999 eingereicht wurde, werden hierin durch Bezugnahme aufgenommen. Alle Publikationen, auf die in dieser Anmeldung verwiesen wird, werden hierin ebenfalls durch Bezugnahme aufgenommen.
Beispiele
1. Herstellung von synthetischem (+)-Preussin
Die Synthese von (+)-Preussin erfolgte gemäß der von T. Bach und H. Brummerhop beschriebenen Synthese (Angew. Chem. 1998, 110, 3577; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1998, 37, 3400). Ausgehend von kommerziell erhältlichem (S)-Pyroglutaminol 19 (siehe Schema 11) wurde nach Tosylierung des primären Alkohols zum Tosylat 20 die w-Nonylseitenkette durch eine nucleophile Susbstitution mit einem Di-«-octylcuprat aufgebaut. Die endocyclische Doppelbindung wurde nach Acylierung des Pyrrolidinons 21 mit Chlorameisensäuremethylester gebildet. Hierzu wurde zunächst das Pyrrolidinon 22 mit LiBEt3H zum Halbaminal reduziert, das nicht isoliert, sondern direkt mit Dimethoxypropanon in Gegenwart von Camphersulfonsäure zum N,O-Acetal 23 umacetalisiert wurde. Dieses wurde nach einer Eliminierungsmethode mit EtΝzPr2/TMSOTf in das Dihydropyrrol 24 überfuhrt.
Die Paterno-Büchi-Reaktion des Dihydopyrols 24 mit Benzaldehyd verlief glatt und lieferte drei Produkte. Bei einem der Produkte handelte es sich den NMR- Spektren zufolge um ein 2-Aminooxetan, das wegen seiner Säurelabilität nicht isoliert werden konnte. Die beiden anderen Produkte waren zueinander diastereomere 3-Amino-oxetane und wurden in 53% und 12% Ausbeute erhalten. Gemäß NOESY-NMR-Studien sind diese beiden Produkte (25a und 25b) am Oxetanring all-c/s-substituiert. Die Synthese von (+)-Preussin wurde vervollständigt indem das Hauptdiastereomer 25a durch Hydrogenolyse in das Pyrrohdinol 26 überführt wurde. Die Reduktion der Methoxycarbonylgruppe mit LiAlH4 zur Methylgruppe verlief glatt und (+)-Preussin 27 konnte als hellgelbes Öl isoliert werden. Die Gesamtausbeute über neun Stufen betrug 10%. Die Reinheit der als hellgelbes Wachs erhaltenen Verbindung war > 97% (GC). Die analytischen Daten stimmen mit den für den Naturstoff berichten Daten (J. H. Johnson et al., J. Antibiot. 1989, 42, 1184) überein (Massenspektrum, Η- NMR,13C-NMR, NOESY, Drehwert).
25a 26 27
Schema 11: Synthese des (+)-Preussins: a) TsCl, Pyridin, 25°C, 5 h; b) Li2Cu(nC8H,7)2CN, THF/Hexan (2/1), -78°C •> 25°C, 16h; c) BuLi, THF/Hexan (4/1), -78°C * 0°C, 1 h; ClCOOMe, -78°C •> 0°C, 3 h; d) LiBEt3H THF, -78°C * 0°C, 3 h; e) Me2C(OMe)2, CSA, CH2Cl2, 0°C 0,5 h; f) TMSOTfi EtNiPr2, CH2Cl2, 0°C, 0,5 h; g) H2, Pd(OH)2/C, MeOH, 25°C, 3,5 h; h) LiAlH4, THF, 66° C, 2,5 h. - CSA — Camphersulfonsäure, Tf = Trifluormethansulfonyl, TMS = Trimethylsilyl, Ts = Toluol-4-sulfonyl
2. Antitumorale Wirksamkeit von Pyrolidinolderivaten
Materialien Fötales Kälberserum, Meerrettich Peroxidase-konjugierter Ziege anti-Maus-IgG, Aprotinin, Leupeptin, Camptothecin (Cam) wurden von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) erhalten. Monoklonaler Maus anti-humaner p27Fαp Antiköφer und Caspase 3 (CPP32) Antiköφer wurden von Transduction Laboratories, Dianova (Hamburg, Deutschland), Monoklonaler Maus anti-Actin Antiköφer wurde von Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland) und E2F-1 und Cyclin A Antiköφer von Santa Cruz (Heidelberg, Deutschland) erhalten. Die ECL Immunoblotanalysereagenzien wurden von Amersham Life Science, Inc. (Braunschweig, Deutschland) und die BIOMAX Filme von Kodak (N.Y., USA) erhalten. Das Annexin-V Kit wurde von Nexins Research BN (Holland), ATP von Pharmacia Biotech (USA), der PARP monoklonale Maus Antiköφer von Pharmingen, Signal Transduction , Dianova (Hamburg, Deutschland) und der Caspaseinhibitor zVAD-fmk von Biomol (Hamburg, Deutschland) erhalten.
Als Kontrollsubstanz wurde Flavopiridol (FP) (H. H. Sedlacek et al., Int. J. Oncol. 1996, 9, 1143) verwendet. Cdk2 Kinase wurde in mit Baculovirus infizierten SF9- Insektenzellen überexprimiert und aufgereinigt.
Zellen
HeLa, MeWo , MCF-7 (mit 0,9 mg/1 Insulin), ΝIH3T3 und A549 wurden in DMEM, PC-3, LNCaP, DU- 145 und HL60 in RPMI 1640 Medium kultiviert, je mit 10 % Fetal-bovine-Serum, 100 units/ml Penecillin und 100 μg/ml Streptomycin.
Behandlung von Zellen mit Chemotherapeutica
(+)-Preussin, Cam, Anisomycin und FP wurden in DMSO (Ethanol) gelöst und in verschiedenen Konzentrationen in dem Zellkulturmedium verdünnt. Die Konzentrationen an DMSO (Ethanol) im Medium betrug immer weniger als 1% (v/v). Die Zellen wurden für verschiedene Zeiten bei 37° C inkubiert. Behandlung von Zellen mit dem Caspaseinhibitor zVAD-fmk Die Zellen wurden 1 Stunde in Vollmedium mit dem Inhibitor (zVAD-fmk; 50 μM Endkonzentration) vorinkubiert und dann mit den Chemotherapeutika, wie oben beschrieben, behandelt.
Präparation von Zellextrakten
Die Zellen von 10 cm Platten wurden geerntet und zweimal in Phosphatsalzpuffer (PBS) gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Pellets in einem gleichen Volumen Puffer mit 20 mM HEPES, pH 7,8; 450 mM NaCl; 0,2 mM EDTA; 25% Glycerol; 5 μM DTT (Dithiothreitol), 5 μM PMSF; 0,5 μg/ml Leupeptin und 5 μg/ml Aprotinin resuspendiert. Die Zellen wurden für 5 min. auf Eis inkubiert und dann durch dreimaliges Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Auftauen in einem 30°C Wasserbad lysiert. Die Lysate wurden bei 13000 x g für 10 min. bei 4° C zentrifugiert und in ein neues Eppendorfgefäß überfuhrt. Die Proteinkonzentration bestimmt und die Extrakte bei -80°C wurden aufgehoben.
Westernblot- Analyse
Lösliche Proteine wurden auf eine SDS-Polyacrylamid Gel aufgetragen und durch
Elektrophorese aufgetrennt. Die Proteine wurden anschließend durch Elektrophorese auf eine Nitrocellulose geblottet und durch Immunoblotanalyse mit den jeweils spezifischen Antiköφern identifiziert. Die Nitrocellulosemembran wurde für 2 Stunden mit den Antiköφern (1 :1000 verdünnt in 1 x PBS mit 5% Milchpulver) inkubiert, 5x mit 1 x PBS gewaschen und durch Meerrettichperoxidase-konjugierte Zweitantiköφer IgG (1:2000 verdünnt) und das Enhanced Chemiluminescence (ECL) Immunoblot-System visualisiert.
FACS-Analysen
Die Zellen wurden von einer 10 cm Platte geerntet, zweimal mit PBS gewaschen, mit 75%o Ethanol für 1 Stunde fixiert und mit Hoechst 33258 gefärbt. Die Durchflußzytometrieanalysen wurden an einem FACStarPlus (Becton Dickenson) durchgeführt. Die Zellzyklus DNA- Verteilung wurde durch das Cell-fit Program oder manuelle Einteilung bestimmt.
Fluoreszenz Mikroskopie Zellen wurden mit Hoechst 33342 (10 μM) und Propidiumiodid (10 μM) für 10 min. gefärbt und unter dem Floureszenzmikroskop bei einer Wellenlänge von 360 nm analysiert. Da Hoechst 33342 alle Kerne und Propidiumiodid Kerne mit zerstörter Plasmamembran färbt, konnten Kerne von lebenden, nekrotischen und apoptotischen Zellen als blaue runde, rosa runde und fragmentierte blaue oder rosane Kerne analysiert werden.
Zytotoxizitätsassays
Die Zellen wurden in 96er Mikrotiteφlatten ausplattiert (20.000 Zellen/well). 16
Stunden später wurden serielle Verdünnungen von (+)-Preussin auf die Zellen gegeben und inkubiert. Nach 24 Stunden (oder anderen im Text erwähnten Zeitspannen) wurden die Zellen gewaschen und mit Medium versorgt. Nach 72 Stunden wurden die Zellen mit Krystallviolett gefärbt. Der verbleibende Farbstoff konnte bei einer Wellenlänge von 540 nM an einem ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Lesegerät gemessen werden. Wells, die nur Zellen und Medium beinhalten, wurden als Negativkontrolle benutzt. Jedes Experiment wurde pro Zelllinie mit vier gleichbehandelten Wells durchgeführt und dieses Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander wiederholt. Die Überlebensrate der Zellen wurde wie folgt berechnet: (Absoφtion der mit Chemotherapeutika behandelten Zellen) / (Absoφtion der unbehandelten
Zellen) x 100 Der IC5o-Wert wurde als Konzentration an Chemotherapeutika definiert, die in jedem Test benötigt wurde, um eine 50%>ige Reduktion der Absorbtion zu erreichen. Der IC50-Wert wurde graphisch durch eine "dose-response" Kurve bestimmt. Annexin-N-Färbung
Die zu untersuchende Zelllinie wurde ausplattiert und mit FP oder (+)-Preussin in verschiedenen Konzentrationen behandlet. Die Zellen wurden mit dem Überstand geerntet und zweimal in PBS gewaschen. Nach Aufnahme des Pellets in 440 μl Annexin- V Bindungspuffer wurden 10 μl Annexin FITC (1 :10 verdünnt mit Annexin-Bindungspuffer) und 50 μl Propidiumiodid (100 μg/ml} zugegeben und 10 min. auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden sofort im FACStar gemessen um unspezifische Bindungen zu vermeiden.
Isolierung von genomischer DNA (DNA-Leiter)
HL-60 Zellen wurden in RPMI-Medium kultiviert und mit FP (Kontrolle) oder (+)-Preussin in verschiedenen Konzentrationen behandelt. Alle Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet in 200 μl eiskaltem Lysispuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM EDTA, 0,2% Triton X-100) aufgenommen. Nach der Extraktion der DNA mit Phenol und Phenol Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) wurde die wäßrige Lösung mit Ethanol präzipitiert. Das Pellet wurde in 20 μl TE Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) aufgenommen, 5-10 μl auf ein 2%iges Agarosegel aufgetragen und durch Ethidiumbromid und UV- Bestrahlung visualisiert.
35S Methionin Einbau
Eine radioaktive Markierung der Proteine wurde in Zellen durchgeführt, die vorher mit definierten Konzentrationen an (+)-Preussin, Anisomycin und FP behandelt worden sind. Der Einbau wurde in L-Methionin freiem RPMI 1640 Medium mit 7,5 μCi [35S]-Methionin pro 200 μl Medium für die letzten zwei Stunden der Chemotherapeutikainduktion durchgeführt. Die Zellen wurden in methioninfreiem Medium gewaschen und, wie vorher unter Proteinextraktion beschrieben, aufgearbeitet. Trichloressigsäure wurde den Proben zugefügt (10%> Endkonzentration) und für 10 min. auf Eis inkubiert, um die Proteine zu präzipitieren. Nach Zentrifugation wurden die Pellets in 50 μl 0,1 M NaOH resuspendiert und mit 3 ml Scintillationsmix versehen. Die Proben wurden am Scintillationsgerät (Beckman, USA) gemessen.
Kinaseassay
2 μl der in SF9 überexprimierten und aufgreinigten cdk2 Kinase wurden mit 18 μl Kinasepuffer (10 mM MnCl2, 10 mM MgCl2, 10 mM KC1, 20 mM HEPES pH 7,3, Leupeptin, Aprotinin, ß-Glycerophosphat, PMSF, DTT und NaF) gemixt und mit 1,25 μl Histon Hl (Sigma) und 1,25 mM ATP (Sigma) versetzt. Bei einer Vorinkubation wurde nun das Chemotherapeutikum (FP, Cam, Anisomycin oder (+)-Preussin) hinzugegeben und bei 37°C für 30 min. inkubiert. Nach dieser Vorinkubation wurden 0,25 μl 32P-(-ATP (10 μCi/μl) dem Gemisch beigefügt und dieses 30 min. bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wurde mit lOx SDS Probenpuffer gestoppt und auf ein 12% SDS Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Gelelektrohorese wurde das Gel getrocknet und die radioaktive Phosphorylierung des Histon Hl durch einen BIOMAX Film (Kodak, N. Y., USA) sichtbar gemacht.
(+)-Preussin induziert Apoptose in HL-60 Zellen Die molekularen Mechanismen der Apoptose beinhalten
Chromatinkondensierung, DNA Fragmentierung, Caspaseaktivierung und Annexin-V Bindung, die hier näher untersucht wurden.
Die Behandlung von Zellen mit 5 μM (+)-Preussin führt zu einer starken Induktion von Apoptose. Dies wurde durch Propidiumiodid-Hoechst Färbung, Annexin-V Färbung und eine sehr charakteristische DNA Leiter bewiesen.
Tabelle 1: Induktion von Apoptose durch (+)-Preussin in HL-60-Zellen
Propidiumiodid-Hoechst Färbung
Etwa 75%o der HL-60 Zellen zeigen nach 18 Stunden einen kondensierten Zellkern. Allgemein zeigen Zellen eine punktierte Färbung charakteristisch für Chromatinkondensierung, die während der Apoptose eintritt. Die Induktion von Apoptose in (+)-Preussin behandelten HL-60 Zellen variiert zwischen 27% (500 nM) und 45% (2,5 μM) (Tabelle 1).
Annexin- V-Färbung
Phosphatidylserin ist ein Oberflächenmarker, der nur während der Apoptose an der Oberfläche präsentiert wird und durch Annexin-V zu detektieren ist. Die Zellen werden mit FITC gekoppeltem Annexin-V behandelt und am FACS-Gerät gemessen. Die Ergebnisse korrelieren mit der Propidiumiodid-Hoechst Färbung (Tabelle 1). DNA-Leiter
Da eine DNA-Leiter ein charakteristisches Merkmal für Apoptose ist, wurde DNA von (+)-Preussin behandelten Zellen isoliert. Die DNA wurde auf einem Agarosegel aufgetragen und detektiert Als Marker wurde eine 100 bp Leiter benutzt Es wurde DNA von Zellen aufgetragen, die mit verschiedenen (+)- Preussin Konzentrationen behandelt wurden (0,5 - 5 μM). Eine charakteristische DNA Leiter ist Zellen zu erkennen, die mit 2,5 und 5 μM behandelt wurden.
Bei (+VPreussin induzierter Apoptose wird Caspase 3 aktiviert und PARP gespalten
Da Caspase 3 ein Protein ist, welches für viele charakteristischen Merkmale der Apoptose wichtig ist, wurde die Aktivierung von Caspase 3 und der Abbau von PARP, einem wichtigen Reparaturenzym und Substrat von Caspase 3, durch Westemblotanalyse verfolgt (siehe Tabelle 1). Es wurde sowohl eine Aktivierung von Caspase 3, als auch das 85 kDa große, charakteristische Spaltprodukt von PARP in den Proteinextrakten detektiert. Während die Behandlung von HL-60 Zellen mit 5 und 10 μM (+)-Preussin war das ungespaltene 116 kDa PARP Protein nicht mehr detektierbar, was mit den Beobachtungen aus der Propidiumiodid-Hoechstfärbung korreliert.
Zytotoxizität von (+)-Preussin in verschiedenen humanen Zelllinien (+)-Preussin induziert Apoptose in HL-60 Zellen. Es wurde deshalb getestet, ob (+)-Preussin auch in anderen Tumorzelllinien Effekte zeigt. Alle schnellwachsenden Zellen sollten für einen Effekt von (+)-Preussin empfänglich sein, da (+)-Preussin den Zellzyklus beeinflußt (siehe Zellzyklusanalysen). Drei verschiedene Prostatakarzinomzellinien (PC-3, DU- 145 und LNCaP) wurden getestet und nach einer Inkubation der Zellen für 48 Stunden mit (+)-Preussin variierten die IC50- Werte zwischen 3 und 5,8 μM (Tabelle 2). Als Kontrolle wurde die zwar immortalisierte aber nicht transformierte Zelllinie NUT3T3 verwendet. Der IC5o-Wert liegt für diese Zelllmie bei 47 μM (siehe Tabelle 2) und damit 9- bis 47-mal höher als in den getesteten Tumorzelllinien. Die Induktion von Apoptose ist p53 unabhängig, da die Zelllinien PC-3 und DU-145 p53 negativ sind. In den Lungen und Brustkarzinomzelllinien A549 und MCF-7 wurden ähnliche Beobachtungen gemacht (Tabelle 2).
Tabelle 2: ICso-Werte von (+)-Preussin-behandelten Zelllinien
Zellzyklusanalysen (+)-Preussin löst in niedrigen Konzentrationen (0,2 - 2 μM) eine Zellzyklusblockierung in Gi aus. Die Zellzyklusphase wurde mit FACS-Analysen bestimmt. Die Anzahl der Zellen, die sich in der Gi -Phase befinden, ist in allen getesteten Tumorzellinien höher als in der Kontrolle.
Analyse von zellzyklusspezifischen Proteien
Es wurden Westernblotanalysen verschiedener zellzyklusrelevanter Proteine in (+)-Preussin behandelten Zellextrakten durchgeführt (Tabelle 1). Da nach FACS- Analysen der Anteil an Zellen in der Gi -Phase erhöht war, wurden Gj spezifische Protein untersucht. Die Westernblotaanalyse zeigte eine Erhöhung der Proteinexpression des Gi spezifischen Zellzyklusinhibitors p27ιαp und eine schwache Expression von S-Phase spezifischen Proteinen wie Cyclin A und dem Transkriptionsfaktor E2F-1. Das Expressionsmuster dieser Proteine unterstützt die These, daß (+)-Preussin auch ein spezifischer Zellzyklusinhibitor ist.
Kinaseassays
Da (+)-Preussin Zellen in Gi blockiert, wurden Kinaseassays mit der G\ spezifischen Kinase cdk2 durchgeführt. Im Vergleich mit dem cdk2 Kinaseinhbitor FP war nach Zugabe von (+)-Preussin qualitativ eine deutliche Inhibierung der Kinaseaktivität zu erkennen. Es wurden auch kompetetive Studien durchgeführt, bei denen zu erkennen war, daß (+)-Preussin ein schwächerer kompetitiver Inhibitor als FP ist. Die Analyse der Kinaseaktivität deutet daraufhin, daß (+)-Preussin ein selektiver cdk2 Kinaseinhibitor ist.

Claims

Ansprüche
Pyrrolidinverbindung der allgemeinen Formel 1,
in der die Substituenten unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben:
Ri H, Ci- bis C20-Alkyl, C2- bis Cio-Alkenyl, C3- bis Cio-Cycloalkyl, C3- bis Cio-Cycloalkenyl, Ci- bis C2o-Alkoxycarbonyl, CH2-Aryl, CH2-Heteroaryl, Aryl oder Heteroaryl;
R2 Ci- bis C20-Alkyl, C2- bis Ct0-Alkenyl, C3- bis Cio-Cycloalkyl, C3- bis Cio-Cycloalkenyl, CH2-(C2- bis Cio-Alkenyl), CH2-(C3- bis Cio-
Cycloalkyl), CH2-(C3- bis Cio-Cycloalkenyl), (CH2)m-Aryl, (CH2)m- Heteroaryl, CH2-O-(C,- bis C20-Alkyl), CH2-O-(Cr bis C20-Acyl), CH2-O-(C2- bis Cio-Alkenyl), CH2-O-(C3- bis C,0-Cycloalkyl), CH2-O-(C3- bis Cio-Cycloalkenyl), CH2-O-(Aryl), CH2-O- (Heteroaryl) oder Ci- bis Cι -Alkoxy; m 0 bis 10
R3 H, Ci- bis C20-Alkyl, C2- bis Cio-Alkenyl, C3- bis Cio-Cycloalkyl, C3- bis Cio-Cycloalkenyl, Cp bis C2o-Acyl, (CH2)n-Aryl oder (CH2)n-Heteroaryl; n 0 bis 10
R (CH2)-Aryl oder (CH2)-Heteroaryl;
wobei die Substituenten nicht gleichzeitig die folgende Bedeutung haben:
R3 H, Cp bis C5-Alkyl oder Cp bis C5-Acyl, und
oder
Ri CH3, COOCH3 oder COOC6H5
R2 C9-Alkenyl
R3 H, und
R4 CH2-C6H5
oder
Ri CH3, COOCH3, COOCH2CH3, COOtertButyl oder COOCH2-C6H5
R2 n-CgHjg
R3 H oder C2-Acyl, und
R CH2-C6H .
Pyrrolidinverbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent R4 die allgemeine Formel la hat,
wobei die Substituenten R5, R^, R7, R8 und R9 unabhängig voneinander gleichzeitig oder verschieden die folgenden Bedeutungen haben:
F, CI, Br, H, Cp bis C20-Alkyl, C2- bis Cio-Alkenyl, C3- bis C10- Cycloalkyl, C - bis Cio-Cycloalkenyl, Cp bis Cι -Alkoxy, Cp bis C2o-
Alkoxycarbonyl, Cp bis C20-Alkylamino, Cp bis Cι2-Dialkylamino, (CH2)P-Aryl oder (CH2)p-Heteroaryl; p 0 bis 5.
3. Pyrrolidinverbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent R4 die allgemeine Formel lb hat,
lb
wobei Rio:
2-Furyl, 3-Furyl, 2-Thiophenyl, 3-Thiophenyl, 2-Oxazolyl, 4- Oxazolyl, 5- Oxazolyl, 1-Pyrrolyl, 2-Pyrrolyl, 3-Pyrrolyl, 1-Pyrazolyl, 3-Pyrazolyl, 4- Pyrazolyl, 5-Pyrazolyl, 1-Imidazolyl, 2-Imidazolyl, 4-Imidazolyl, 5-
Imidazolyl, 1-Triazolyl, 3-Triazolyl, 5-Triazolyl, 2-Pyridinyl, 3-Pyridinyl, 4-Pyridinyl, 2-Pyridazinyl, 3-Pyridazinyl, 2-Pyrimidinyl, 4-Pyrimidinyl, 5- Pyrimidinyl, 2-Pyrazinyl oder 3-Pyrazinyl bedeutet.
4. Verwendung einer oder mehrerer Pyrrolidinverbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 als Arzneimittel.
5. Arzneimittel, das eine oder mehrere Pyrrolidinverbindungen gemäß einem der Ansprüche 1-3 und gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe enthält. Verwendung einer oder mehrerer Pyrrolidinverbindung nach der allgemeinen Formel 1
in der die Substituenten unabhängig voneinander folgende Bedeutung haben: Ri H, Cp bis C20-Alkyl, C2- bis Cio-Alkenyl, C3- bis Cio-Cycloalkyl,
C - bis Cio-Cycloalkenyl, Cp bis C20-Alkoxycarbonyl, CH2-Aryl,
CH2-Heteroaryl, Aryl oder Heteroaryl; R2 H, Cp bis C20-Alkyl, C2- bis Cio-Alkenyl, C3- bis Cι0-Cycloalkyl,
C3- bis Cio-Cycloalkenyl, CH2-(C2- bis Cio-Alkenyl), CH2-(C3- bis Cio-Cycloalkyl), CH2-(C3- bis C,0-Cycloalkenyl), (CH2)m-Aryl,
(CH2)m-Heteroaryl, CH2-O-(Cp bis C20-Alkyl), CH2-O-(Cp bis
C20-Acyl), CH2-O-(C2- bis Cι0-Alkenyl), CH2-O-(C3- bis Cι0-
Cycloalkyl), CH2-O-(C3- bis Cio-Cycloalkenyl), CH2-O-(Aryl),
CH2-O-(Heteroaryl) oder Cp bis C)2-Alkoxy; m 0 bis 10
R3 H, Cp bis C20-Alkyl, C2- bis Cio-Alkenyl, C3- bis Cio-Cycloalkyl,
C - bis Cio-Cycloalkenyl, Cp bis C2o-Acyl, (CH2)n-Aryl oder (CH2)n-Heteroaryl; n 0 bis 10 R4 H, Cp bis C20-Alkyl, C2- bis Cio-Alkenyl, C3- bis Cio-Cycloalkyl,
C - bis Cio-Cycloalkenyl, Cp bis C2o-Alkoxycarbonyl, (CH2)0-Aryl oder (CH2)o-Heteroaryl; o 0 bis 10, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs- und/oder Zusatzstoffen, zur Therapie von Erkrankungen, die durch Störungen in der Induktion des Zelltodes oder der Regulation des Zellzyklusses gekennzeichnet sind.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent R4 die allgemeine Formel la hat,
wobei die Substituenten R5, R , R7, R8 und R9 unabhängig voneinander gleichzeitig oder verschieden die folgenden Bedeutungen haben:
F, CI, Br, H, Cp bis C20-Alkyl, C2- bis Cio-Alkenyl, C3- bis C,0- Cycloalkyl, C - bis Cio-Cycloalkenyl, Cp bis Cι2-Alkoxy, Cp bis C2o- Alkoxycarbonyl, Cp bis C2o-Alkylamino, Cp bis Cι2-Dialkylamino, (CH2)p-Aryl oder (CH2)p-Heteroaryl; p 0 bis 5.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent Ri die allgemeine Formel lb hat,
CH2 R 10 lb wobei Rio."
2-Furyl, 3-Furyl, 2-Thiophenyl, 3-Thiophenyl, 2-Oxazolyl, 4- Oxazolyl, 5- Oxazolyl, 1-Pyrrolyl, 2-Pyrrolyl, 3-Pyrrolyl, 1-Pyrazolyl, 3-Pyrazolyl, 4- Pyrazolyl, 5-Pyrazolyl, 1 -Imidazolyl, 2-Imidazolyl, 4-hnidazolyl, 5-
Imidazolyl, 1-Triazolyl, 3-Triazolyl, 5-Triazolyl, 2-Pyridinyl, 3-Pyridinyl, 4-Pyridinyl, 2-Pyridazinyl, 3-Pyridazinyl, 2-Pyrimidinyl, 4-Pyrimidinyl, 5- Pyrimidinyl, 2-Pyrazinyl, 3-Pyrazinyl oder Aryl bedeutet.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 6-8, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere der Pyrrolidinverbindungen, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs- und/oder Zusatzstoffen, zur Induktion von Apoptose verwendet werden.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 6-8, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere der Pyrrolidinverbindungen, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs- und/oder Zusatzstoffen, zur Therapie von hypeφroliferativen Erkrankungen verwendet werden.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere der Pyrrolidinverbindungen, gegebenenfalls zusammen mit Hilfsund/oder Zusatzstoffen, zur Therapie von Tumoren, Autoimmunerkrankungen und Psoriasis verwendet werden.
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