KR820000295B1 - 코엔자임 q의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
본발명은 코엔자임의 제조방법에 관한 것으로 특히 이소펜테닐알콜, 디메틸알릴알콜, 제라니올, 이스펜테닐아세테이트, 디메틸알릴아세테이트, 제라닐아세테이트 및 β-메틸크로톤산 중에서 선택된 최소한 하나의 성분을 함유한 배지내에서 미생물을 배양하고 코엔자임를 생성 획득하는 코엔자임의 제조방법에 관한 것이다. 여기서 "코엔자임"란 일반적으로 다음 구조식(Ⅰ)로 나타내는 퀴논핵의 6위치에 이소프렌 측쇄를 가진 2, 3-디메톡시-5-메틸-1, 4-벤조퀴논류를 의미한다.
본 발명의 목적은 상기 구조식(Ⅰ)에서 n=8,9 및 10인 코엔자임 코엔자임 9및 코엔자임 10의 코엔자임를 제공하는데 있다. 코엔자임는 동물, 식물 및 미생물 등에 널리 분포되어 있고 말초 전자 전달계의 구성인자로서 중요한 역할을 한다.
최근 코엔자임는 의약적 및 생물학적으로 여러가지 질병에 뛰어난 활성을 나타낸다는 것이 확실해 졌다. 특히 코엔자임 1은 인간의 코엔자임는 코엔자임 10이므로 의약으로서 가장 가치있다고 생각된다.
코엔자임를 얻는 방법은 동물이나 식물조직 또는 미생물로부터 추출하거나 화학적으로 합성하는 것으로 생각될 수 있다. 그러나 동물이나 식물조직으로부터 추출하여 대량으로 코엔자임를 생산하는 것은 어려운 일이다. 또한 유기합성에 의해 코엔자임를 생성시키는 것은 수득률이 낮아 어려운 일이다. 이렇게 이런 방법들은 공업적으로는 만족스럽지 못하다. 반면에 미생물로부터 추출해내는 방법은 세포나 코엔자임의 수득면에서 경제적으로 사용될 수 있는 가능성을 가지고 있다.
p-하이드록시 안식향상 및 초산과 그의 염을 배양액에 가했을 때 단위세포당 코엔자임의 함량을 증가시킬 수 있는 것으로 알려졌다. 코엔자임의 이소프렌 측쇄는 생합성에 의해 이스펜테닐-및 디메틸알릴피로포스테이트를 반복 축합시켜 제라닐-및 파르네실 피로포스페이트를 거쳐 제조되는 것으로 알려졌다.
본 발명은 이스펜테닐알콜, 디메틸알릴알콜, 제라니올, 이스펜테닐아세테이트, 디메틸알릴아세테이트, 제라닐아세테이트 또는 β-메틸크로톤산 중의 최소한 하나를 가한 배지내에서 미생물을 배양하여 코엔자임를 생산 획득하는 방법을 제공한다.
우리는 이소펜테일알콜, 디메틸알릴알콜, 제라니올, 이소펜테닐아세테이트, 및 β-메틸크로톤산을 배지에 가했을 때 슈도모나스속에 속하는 미생물에 쉽게 이용되고 이들은 단위세포당 코엔자임의 함량을 현저하게 증가시킬 수 있다는 것을 알았다.
예를들어 코엔자임 10을 생산할 수 있는 미생물에는 슈도모나스 디미누타 ATCC 11568(IAM-1513)등이 있고 코엔자임 9를 생성할 수 있는 미생물에는 슈도모나스 쉬우일킬리엔시스 ATCC 31419(IAM-1126), 슈도모나스 데니트리피칸스 ATCC 13867(IAM-12023), 슈도모나스 올레보란스 ATCC 8062(IAM-1508), 슈도모나스 푸트레파시엔스 ATCC 807(IAM-1509)등이 있고, 코엔자임 8을 생성할 수 있는 미생물에는 슈도모나스 루베센스 ATCC 12099(IAM-1510), 슈도모나스 풀바 ATCC 31418(IAM-1529), 슈도모나스 푸리다 ATCC 4359(IAM-1506) 등이 있다.
본 발명 실시예 사용되는 배지에는 글루코스, 몰라세스 등과 같은 당류와 미생물이 사용할 수 있는 다른 탄소원을 탄소원으로 사용할 수 있다. 황산암모늄, 염화암모늄 등과 같은 무기질소화합물과 콘스팁액, 물고기 추출물, 펩톤, 효모추출물 등과 같은 유기질소화합물을 질소원으로 사용할 수 있다. 또한 무기염류로서 칼륨염, 소디움염, 마그네슘염, 인산 및 황산염 등을 사용할 수 있다.
배양은 보통 pH 4-8, 온도 25-35℃로 공기를 불어 넣으며 교반하면서 10-50시간 동안 진행된다.
이소펜테일알콜, 디메틸알릴알콜, 제라니올, 이소펜테닐아세테이트, 디메틸알릴아세테이트, 제라닐아세테이트 및 β-메틸 크로톤산의 첨가는 원하는 방법으로 원하는 시간 동안 수행할 수 있다.
예를들면 첨가물의 총량을 처음에 또는 배양하는 동안 원하는 성장단계에서 가하거나 발효상태에 따라 조금씩 가한다. 또한 첨가물은 단독으로 또는 다름 첨가물과 함께 사용할 수 있다.
첨가물의 량을 보통 최종농도로서 1×10-5-5×10-3몰/리터, 좋기로는 5×10-5-5×10-4몰/리터이다.
배양후 생성된 코엔자임는 세포로부터 추출되고 다른 물질로부터 분리된다. 예를들면 원심분리하여 얻은 습윤 세포들은 아세톤 등과 같은 친수성 용매로 추출된다. 코엔자임함유분은 석유 에테르 등과 같은 용매속으로 이전되고 코엔자임함유분은 알루미나 컬럼 등을 사용하여 분별정제되고 이렇게 하여 코엔자임는 분리될 수 있다.
본 발명에서 코엔자임의 확인은 본 발명의 생성물은 UV 스펙트럭 융점상을 전환시켜 용매로서 아세톤과 물의 95 : 5 혼합물을 사용한 박층크로마토그라피 및 다른 방법 등으로 표준물질과 비교하여 행할 수 있다.
다음 실시예는 본 발명은 더욱 상세히 설명하기 위한 것이나 본 발명을 이것들로 제한하는 것은 아니다.
[실시예 1]
30리터 발효조에 0.05% KH2PO4, 0.15% Na2HPO4, 0.05MgSO4, 7H2O, 1% 글루코스, 1% 펩톤 및 0.2% 효모추출액을 함유한 pH 7.0의 배지 15리터를 넣었다. 증기 멸균한 다음 에탄올 10미리리터에 용해한 이소펜테닐 알콜 645mg을 가했다.
상기한 배지와 같은 조성을 가진 배지 500미리리터에서 24시간 동안 미리 배양시킨 슈도모나스 쉬우일킬리엔시스 ATCC 31419(IAM-1126)을 상기 배지에 접종시키고 매분 15리터의 공기를 넣으면서 27℃에서 24시간 배양했다. 배양이 끝난 뒤 배양액을 원심분리하여 습윤 세포 418gm(건조세포로는 87gm)을 얻었다.
습윤 세포에 아세톤 2리터를 가하고 교반하면서 추출하고 나서 원심분리하여 세포들을 분리시켰다. 이런 조작을 2번 더 반복했다. 아세톤 추출물을 함께 모아 감압하에 농축하여 아세톤을 증발시켰다. 그런 다음 남은 용액을 석유에테르 1리터씩 3회 추출하고 생긴 석유에테르층을 합하여 물로 씻고 감압하에 건조시키고 농축했다.
잔류유상 물질을 약간의 석유에테르에 용해하고 알루미나 칼럼 크로마토그라피에 넣고 석유에테르와 에틸에테르의 혼합액으로 용출시켰다. 코엔자임를 함유한 위에서 용출액으로부터 용매를 증발시켜 버리고 남은 유상물질을 약간의 에탄올에 용해하고 냉장고속에 정치시키면 코엔자임 9의 결정이 나타났다.
이 결정을 에탄올로 3회 재결정시켜 코엔자임 9결정 142.6미리그램을 얻었다. 반면에 이소펜테일알콜을 가하지 않은 배지 15리터를 사용하여 위와 같은 하고 상기와 같은 방법으로 습윤세포 359gm(건조세포로는)을 얻었다.
상기와 같은 방법으로 더욱 진행시키면 81.42미리그람 결정이 얻어졌다. 위와 같은 데이터에 의해 이소펜테일 알콜의 효과를 계산했다.
가하면 발효액 미리리터당 코엔자임 9의 수득이 75% 증가되고 건조세포 매그람당 39% 증가되었다. 이리하여 이소펜테닐 알콜의 첨가는 코엔자임 9의 수득을 증가시키는데 효과가 있음이 명백했다.
[실시예 2]
이소펜테닐 알콜 대신에 제라니올 1.16gm을 사용하여 실시예 1과 같은 방법을 수행시켜 습윤세포 390그람(건조세포로 68gm)이 얻어졌다. 이 습윤세포를 실시예 1에서와 같은 방법으로 진행시켜 코엔자임 9의 결정 104.7미리그람을 얻었다.
반면에 제라니올을 가하지 않은 배지를 사용하여 같은 미생물을 배양시킨 경우 습윤세포 327gm(건조세포로 63gm)이 얻어졌다.
위 실험데이타에 따라 코엔자임 9의 생산에 제라니올의 효과를 비교했다. 배지에 제라니올을 가함으로써 배지 메리리터당 코엔자임 9의 수득율은 41% 증가했고 건조세포 매그람당 30%의 증가를 나타냈다.
[실시예 3]
슈도모나스 루베센스 ATCC 12099(IAM-1510)을 실시예 1에서와 같은 배지와 같은 방법으로 배양시켜 습윤세포 410gm(건조세포 73gm)을 얻었다. 이것을 실시예 2에서와 같은 방법으로 처리하여 코엔자임 858.4미리그람을 얻었다.
[실시예 4]
배지에 조성 중에 글루코스 대신에 소디움아세테이트를 사용하고 이소펜테일알콜 300㎎분을 3회에 걸쳐 총 900㎎을 가하고 실시예 1에서와 같은 방법으로 수도모나스 디미누타 ATCC 11568(IAM-1513)을 배양했다. 이리하여 습윤세포 380gm(건조세포 69gm)을 얻어 실시예 1에서와 같은 조작을 하여 30.5미리그람의 코엔자임 결정을 얻었다. 반면에 같은 미생물을 이소펜테일알콜을 가하지 않은 배지에서 배양한 경우 습윤세포 320gm(건조세포로 61gm)이 얻어졌고 이것으로부터 코엔자임 10결정 19.8미리그람을 얻어졌다.
[실시예 5]
미생물로서 슈도모나스 데니트리피칸스 ATCC 13867(IAM-12023)을 사용하여 실시예 1과 같이 진행시키고 제라니올 1gm씩 2회(모두 2gm) 다른 배양시간에 가했다. 이리하여 습윤세포 395(건조세포로 76gm)이 얻어졌고 계속 실시예 1과 같이 처리하여 코엔자임 9 결정 63.1미리그람을 얻었다.
[실시예 6]
미생물로서 슈도모나스 풀바 ATCC 31418(IAM-1529)을 사용하여 실시예 1과 같이 진행시키고 이소펜테일 알콜을 3회(총 3gm) 각각 다른 배양시간에 가했다. 이리하여 습윤세포 390gm(건조세포로 73gm)을 얻고 나서 실시예 1에서와 같이 처리하여 코엔자임 9 86.4미리그람을 얻었다.
반면에 같은 미생물을 이소펜테일 알콜을 가하지 않은 배지에서 배양시켰더니 습윤세포 350gm(건조세포로 6gm)이 얻어졌고 코엔자임 8결정 60.5미리그람을 얻어다. 상기 데이타 실시예 1에서와 같이 비교해 보았더니 이소펜테닐 매리터당 43%, 건조세포 매그람당 31%의 코엔자임 8수득율 향상을 가져왔다.
[실시예 7]
미생물로서 슈도모나스 루베센스 ATCC 12099(IAM-1510)을 사용하여 실시예 1과 같이 진행시키고 디메틸알릴알콜 645미리그람을 가했다. 이리하여 습윤세포 430gm(건조세포로 80gm)을 얻었고 이것을 실시예 1에서와 같이 처리하여 코엔자임 8 86미리그람을 얻었다. 반면에 같은 미생물을 디메틸알릴 알콜을 가하지 않은 배지에서 배양했더니 습윤세포 390gm(건조세포로 76gm)이 얻어졌고 여기에서 코엔자임 8결정 68미리그람을 얻었다.
[실시예 8]
미생물로서 슈도모나스 풀바 ATCC 31418(IAM-1529)를 사용하여 실시예 1과 같이 진행시키고 β-메틸크로톤산 750미리그람을 가하였더니 습윤세포 540그람(건조세포로 105그람)이 이것을 실시예 1과 같이 처리하여 코엔자임 8 결정 102미리그람을 얻었다.
[실시예 9]
미생물로서 슈도모나스 올레보란스 ATCC 8062(IAM-1508)을 사용하여 실시예 1과 같이 진행시키고 디메틸알릴아세테이트 960미리그람을 가하였다. 이렇게 하여 습윤세포 490그람(건조세포로 94그람)을 얻었고, 실시예 1에서와 같이 처리하여 코엔자임 9 결정 96미리그람을 얻었다.
[실시예 10]
미생물로서 슈도모나스 쉬우릴킬리엔시스 ATCC 31419(IAM-1126)을 사용하여 실시예 1과 같이 진행시키며 제라닐아세테이트 1147gm을 가하였다. 이리하여 습윤세포 530그람(건조세포도 93그람)을 얻고 이것을 실시예 1과 같이 처리하여 코엔자임 9 결정 120미리그람을 얻었다. 반면에 같은 미생물을 제라닐아세테이트를 가하지 않은 배지에서 배양시켰더니 습윤세포 525그람(건조세포 90그람)을 얻고 여기에서 코엔자임 9결정 98그람을 얻었다.
상기 데이타로부터 실시예 1에서와 같이 비교해 보았더니 제라닐아세테이트의 부가는 배지 매리터당 23%, 건조세포 매그람당 19%의 수득율 향상을 나타냈다.
[실시예 11]
미생물로서 슈도모나스 데니트리피칸스 ATCC 13867(IAM-12023)을 사용하고 이소펜테일 아세테이트 960미리그람과 제라닐아세테이트 1.47그람의 혼합물을 가하여 실시예 1에서와 같이 진행시켰더니 습윤세포 480그람(건조세포를 96그람)이 얻어졌고, 실시예 1과 같이 처리하여 코엔자임 9 결정 115미리그람을 얻었다.
상기 데이터에 따라 실시예 1에서와 같이 비교했더니 이소펜테닐 아세테이트와 제라닐 아세테이트의 첨가로 배양액 매리터당 51%, 건조세포 매그람당 54%들 만큼의 코엔자임 9수득량 향상을 나타냈다.
[실시예 12]
이소펜테일 아세테이트 960미리그람과 디메틸알릴아세테이트 960미리그람을 가하는 것을 제외하고는 실시예 4에서와 같은 방법으로 슈도모나스 디미니타 ATCC 11568(IAM-1513)을 배양시켰다. 이리하여 습윤세포 495그람(건조세포로 98그람)을 얻고 이것을 실시예 1에서와 같이 처리하여 코엔자임 10결정 53미리그람을 얻었다.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR7802677A KR820000295B1 (ko) | 1978-09-02 | 1978-09-02 | 코엔자임 q의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR7802677A KR820000295B1 (ko) | 1978-09-02 | 1978-09-02 | 코엔자임 q의 제조방법 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR820000295B1 true KR820000295B1 (ko) | 1982-03-19 |
Family
ID=19208593
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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KR7802677A KR820000295B1 (ko) | 1978-09-02 | 1978-09-02 | 코엔자임 q의 제조방법 |
Country Status (1)
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KR (1) | KR820000295B1 (ko) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100738681B1 (ko) * | 2007-04-11 | 2007-07-12 | 대상 주식회사 | 코엔자임 q10의 생산성이 우수한 변이주 및 코엔자임q10의 생산방법 |
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1978
- 1978-09-02 KR KR7802677A patent/KR820000295B1/ko active
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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KR100738681B1 (ko) * | 2007-04-11 | 2007-07-12 | 대상 주식회사 | 코엔자임 q10의 생산성이 우수한 변이주 및 코엔자임q10의 생산방법 |
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