JPH04108392A - トロポロン類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、抗微生物剤の原料などとなるトロポロン類
をアスナロ属植物の組織培養から抽出等の方法で取得す
る、トロポロン類の製造方法に関する。

〔従来の技術〕

常緑高木針葉槽目ヒノキ科アスナロ属植物は、抗微生物
作用を有するヒノキチオール等のトロポロン類を含有し
ている。通常、アスナロ属植物のおがくずなどからトロ
ポロン類が製造されている他方、発明者らは、アスナロ
属植物のカルス組織を培養すれば、カルス組織を抗微生
物剤の原料に供することができると考え、カルス組織を
培養する方法について検討した結果、炭素源、無機成分
および植物ホルモンを必須成分とする培地でアスナロ属
植物のカルス組織を効率浴培養または縫代培養すること
ができることを見出し、すでに特許出願を行っている（
特願昭６３−３２７０８７号、特願平１−２３６３６０
号、特願平２−７９８０１号等参照）。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、カルス組織のトロポロン類の生産に関す
る有効な知見はこれまで得られてぃなかった。

そこで、この発明は、抗微生物剤の原料などとするに十
分な量のトロポロン類をアスナロ属植物の組織培養より
取得する方法を提供することを課題とする。

〔課題を解決するための手段〕

上記課題を解決するため、この発明は、アスナロ属植物
の組織片より誘導した培養細胞を、炭素源、無機成分お
よび植物ホルモンを必須成分とする培地中で培養するこ
とにより培養細胞および／または培地中に蓄積されるト
ロボロン類を取得するトロポロン類の製造方法を提供す
る。

発明者らの研究によれば、炭素源、無機成分および植物
ホルモンを必須成分とする培地で、効率よく継代培養を
継続しうるアスナロ属植物のカルス組織を用い、このカ
ルス組織を物質生産へと向かわせることにより、抗微生
物剤の原料とするに十分な量のトロボロン類を得ること
に成功した。

この発明で用いるアスナロ属植物としては、たとえば、
ヒノキアスナロなどが挙げられるが、これに限定するも
のではない。また、その組織片も適宜の部位をものを利
用すればよい。

アスナロ属植物から採取した組織片を適宜の方法で培養
し、必要に応して継代培養する。そして、カルス組織な
どの誘導された培養細胞を物質生産へ向かわせる。

アスナロ属植物のカルス組織などの培養細胞を物質生産
へ向かわせる方法としては、たとえば、継代用培地のま
ま培養を延期する方法と、生産用培地へ継代して培養す
る方法がある。継代用培地としては、発明者らが見出し
た増殖用培地〔特願平１−２３６３６０号（炭素源、無
機成分および植物ホルモンを必須成分とし、培地中に含
まれる炭素源の１０重量％以上がブドウ糖であるような
増殖用培地）、特願平２−７９８０１号参照（炭素源、
無機成分および植物ホルモンを必須成分とし、無機成分
として含まれるアンモニア性窒素と硝酸性窒素のモル比
がアンモニア性窒素１に対し硝酸性窒素４〜８であるよ
うな増殖用培地）〕が適当であり、生産用培地としては
、Ｂ５培地（ただし、オーキシン類が添加されているも
の）が適当だが、特にこれらに限定されない。この発明
で用いられる培地は、炭素源、無機成分および植物ホル
モンを４・須成分とする培地であればよく、液体培地で
もよいし、寒天などの多糖類を含有させてゲル化させた
固体培地でもよい。

培地中の炭素源としては、特に限定されないが、ブドウ
糖、ショ糖等の炭水化物とその誘導体、脂肪酸等の有機
酸およびエタノール等の１級アルコールなどを例示でき
る。

培地の無機成分としては、特に限定されないが、たとえ
ば、窒素、リン、カリウム、ナトリウム、カルシウム、
マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、銅、
コバルト、硫黄、ホウ素、塩素、ヨウ素等の元素を含む
無機塩を挙げることができる。その具体例としては、硝
酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、塩化
カリウム、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リ
ン酸２水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモ
ニウム、硫酸ナトリウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫
酸マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、モリブデン酸ナトリウ
ム、ヨウ化カリウム、ホウ酸、塩化コバルト等の化合物
などを挙げることができる。

この発明では、培地に、植物ホルモンとして、オーキシ
ン類およびサイトカイニン類のうち少なくともオーキシ
ン類が含有されていることが必要である。そして、オー
キシン類の濃度がｌｏ−６〜１０−４モル／ｌの範囲、
必要に応じ、サイトカイニン類の濃度が１０−’モル／
ｌ以下、好ましくは１０１モル／１以下の範囲で培地中
に含まれるようにする。

前記オーキシン類としては、たとえば、α−アフタレン
酢酸（ＮＡＡ）　、インドール酢酸（ＩＡＡ）　、２．
４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４Ｄ）、インドール
酪酸（ＩＢＡ）およびこれらの誘導体などを、また、前
記サイトカイニン類としては、たとえば、カイネチン、
ヘンシルアデニン（ＢＡ）、ゼアチンなどがそれぞれ挙
げられるが、特にこれらに限定されるものではない。こ
れらのうち、オーキシン類がα−ナフタレン酢酸または
２，４−ジクロロフェノキシ酢酸であり、サイトカイニ
ン類がカイネチンまたはヘンシルアデニンであると、特
に効率良くアスナロ属植物の組織培養が行える。

なお、培地には、炭素源、無機成分および植物ホルモン
の必須成分の他に、必要に応じて、ビタミン類やアミノ
酸類等か含有されていてもよい。

上記ビタミン類としては、ビオチン、チアミン、ピリド
キシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、パントテン
酸カルシウム、アスコルビン酸、イノシトール、ニコチ
ン酸、ニコチン酸アミドなどが例示できるが、特にこれ
らに限定されるものではない。

また、前記アミノ酸類としては、たとえば、グリシン、
アラニン、グルタミン酸、システィンおよびフェニルア
ラニンなどが挙げられるが、特にこれらに限定されるも
のではない。

培地に含まれる前記各成分の濃度は、通常、炭素源が１
０ないし５０　ｇ／ｌ、無機成分が１０−’ないし０．
１モル／１、植物ホルモンが前記所定濃度、ビタミン類
が０．１ないし１５０■／１、アミノ酸類がＯないし１
ｇ７１程度であることが望ましいが、炭素源および植物
ホルモン以外の成分の濃度は、特にこれらに限定されな
い。

培地の調製法としては、従来より植物の組織培養に用い
られている培地、たとえば、ムラシゲ・スクーグ培地、
リンスマイヤー・スクーグ培地、ホワイト培地、ガンボ
ルグＢ−５培地、ニッチ・エッチ培地などを基本培地と
して、炭素源、および植物ホルモンの他、必要に応じて
、ビタミン類やアミノ酸類等の前記各成分を添加して調
製する方法が例示できるが、特に限定されない。なお、
前記基本培地には元々前記無機成分が含まれているが、
必要に応じて、さらに無機成分を適宜添加するようにし
てもよい。

前記培地による培養は、たとえば、温度２０〜３０℃で
必要に応じて５０〜１５０ｒｐｍの攪拌を行って７〜３
０日間行われるが、これらの条件に限定されない。取得
するトロボロン類の量をより多くするという点からは、
培養組織のトロボロン類の生産が活発になる前に培養を
やめるのではなく、そのように活発になってから適宜の
時期にトロボロン類の取得を行う方が良い。

上記のような培地で培養を行うことによりアスナロ属植
物のカルス組織などの培養組織が生産したトロボロン類
は、抽出等の方法により細胞および／または培地より取
得できる。抽出法ではメタノール等のアルコール類、酢
酸エチル等のエステル類、エーテル類、ベンゼン類、塩
化メチレン等のハロゲン化炭化水素類といった有機溶媒
を使用できる。溶媒の種類によっては加熱したり、還流
抽出するなどして抽出の効率を上げることができる。ま
た、培地からの抽出法としては、酢酸エチル、塩化メチ
レン、ｎ−ヘキサン、エチルエーテル、トルエン等の水
と混ざらない性質の有機溶媒を用いて液液抽出を行い、
容易にトロボロン類を有機溶媒中に溶は込ませ、取得す
ることができる。なお、抽出法の他に水蒸気蒸留法など
でもトロボロン類を効率良（取得することができる。

〔作　　　用〕

炭素源、無機成分および植物ホルモンを必須成分とする
培地で、効率よく継代培養しうるアスナロ属植物のカル
ス組織などの培養細胞の培養を延期したり、または、そ
の培養細胞を生産用培地に移したりするなどしてトロボ
ロン類を細胞中および／または培地中に蓄積させ、抽出
法等によりトロボロン類を取得するようにしている。こ
れにより、抗微生物剤の原料として使用するに十分なト
ロボロン類を供給することができる。

〔実　施　例〕

以下に、この発明の具体的な実施例を示す、が、この発
明は下記実施例に限定されない。下記実施例における培
養は、すべて、２５℃、暗所、１００　ｒｐｍの回転振
とうで行われた。ヒノキチオールおよびα−ツヤプリシ
の定量はガスクロマトグラフィーで行い、これらの鉄錯
体であるヒノキチンの定量は液体クロマトグラフィーで
行った。また、抽出物量等はすべて培地１００−あたり
に換算して表示した。ガスクロマトグラフィーと液体ク
ロマトグラフィーの測定条件を以下に示す。

ガスクロマ　ブーツ　− 装置：品性ＧＣ−９Ａ カラム：ＣＢＰｌ−Ｗ１２０−１００　（品性）インジ
ェクション温度＝２５０℃ カラム温度：１００〜２７５℃ （昇温１０°Ｃ／分） スプリット法（３０秒、５０−７分） ゞ　クロマトブーツ　− 装！、ヒューレソトパソカード１０９０カラム：　　１
（ｙｐｅｒｃｉｌ　ＯＤＳ　　１００　ｘ４．６ｍ液相
：０．０１Ｍギ酸−トリエチルアミンバッファー／ＴＨ
Ｆ　（１／１） 下記実施例で用いた培地の組成は第１表に示すとおりで
あった（ｐＨ５，８で実施した）。

第　　１ 表 一実施例１ 継代用培地１００１を３００が容三角フラスコに入れ、
これにヒノキアスナロカルス２ｇを入れて培養した。培
養２週間で継代するところを４週間培養し、細胞を回収
して凍結乾燥後、酢酸エチル１００献で６０℃、２時間
抽出し、酢酸エチルを留去して抽出物を得た。細胞の生
重量および乾重量、抽出物量ならびに含まれるヒノキチ
オールおよびヒノキチンの量を第２表に示した。

実施例２ 継代用培地１００献で２週間培養したヒノキアスナロカ
ルスを、Ｂ５培地３００１を入れた２ｊ２容三角フラス
コに継代用培地ごとフラスコ２本分移しく細胞量Ｌｏｇ
）、混合培地５００ｍ７として２週間培養した。細胞を
回収し、実施例１と同様にして抽出物を得た。また、培
地を酢酸エチル２００−で液液抽出し抽出物を得た。細
胞の生重量および乾重量、細胞および培地からの抽出物
量ならびに含まれるヒノキチオール、ヒノキチンおよび
α−ツヤプリシンの量を第２表に示した。

実施例３ 継代用培地１００献で２週間培養したヒノキアスナロカ
ルス３ｇをＢ５培地１００１に入れ、２週間培養した。

細胞を回収し、実施例１と同様にして抽出物を得た。細
胞の生重量および乾重量、抽出物量ならびに含まれるヒ
ノキオールおよびヒノキチンの量を第２表に示した。

実施例４ 実施例３で用いたヒノキアスナロカルスと異なる株のカ
ルスを継代用培地１００社で２週間培養した後、Ｂ５培
地１００献に細胞量３ｇを移し、２週間培養した。細胞
と培地をろ別し、それぞれから実施例２と同様にして抽
出物を得た。細胞の生重量および乾重量、細胞および培
地からの抽出物量ならびに含まれるヒノキチオール、ヒ
ノキチンおよびα−ツヤプリシンの量を第２表に示した
。

実施例５ 実施例２および４の細胞からの抽出物（以下、実施例２
からの抽出物をＡ、実施例４からのものをＢと言う）を
用いて以下のようにして抗菌試験を行った。すなわち、
滅菌溶解させた寒天培地２０献に寒天が固まる前にＡお
よびＢ（ア七トン溶液）を１ｏｏｏｐｐｍおよび２００
０ｐｐｍ含有されるようにそれぞれ添加して、よく混合
した。

寒天が固まった後、これらの寒天培地に、あらかじめ試
験管斜面培地で培養しておいた供試菌を白金耳で画線し
、それぞれの寒天培地を２８℃、湿度９５％で１週間培
養し、各画の生育の有無を調べた。供試菌は次の２つを
用いた。

■　アスペルギウス・ニゲルＩＦＯ６３４１■　サツカ
ロマイセス・セレウ゛イシエーＩＦＯ０２０３ また、寒天培地は、バレイショ煎汁寒天培地（日永製薬
■製）を用いた。

結果を第３表に示す。

第３表にみるように、供試菌が生育せず、実施例で得ら
れた抽出物が抗微生物剤の原料に供するに十分であるこ
とがわかる。

〔発明の効果〕

この発明は、アスナロ属植物のカルス組織などの培養細
胞を培養することにより、その細胞中および／または培
地中にトロポロン類を蓄積させ、これを抽出法等により
取得する、トロポロン類の製造方法である。この発明の
方法により得られる抽出物は、実施例の結果にみるよう
に、抗微生物剤の原料に供するに十分である。この発明
によれば、画期的なトロポロン類製造方法が可能となっ
た。

月目糸Ａ停甫正書（自発） 平成 ２年１１月２７日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　アスナロ属植物の組織片より誘導した培養細胞を、
   炭素源、無機成分および植物ホルモンを必須成分とする
   培地中で培養することにより培養細胞および／または培
   地中に蓄積されるトロポロン類を取得するトロポロン類
   の製造方法。 ２　アスナロ属植物がヒノキアスナロである請求項１記
   載のトロポロン類の製造方法。 ３　トロポロン類が、α−ツヤプリシンおよびβ−ツヤ
   プリシン（ヒノキチオール）である製造方法１または２
   記載のトロポロン類の製造方法。