JPH022302A - オウレン属植物の組織培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、オウレンＰＡ４ｉｆ物の組織培養方法に関す
る。

〔従来の技術〕

オウレン属植物の根茎は、消炎性苦味健胃薬として繁用
されるほか、漢方処方薬として多くの処方に配合されて
いる重要な生薬原料である。また、オウレン属植物の根
茎の主要薬効成分であるベルベリンは強い殺菌効果を有
し、細菌性下痢や腸内異常発酵時に広く用いられている
。

オウレンは現在、主に北陸地方や近畿地方、山陰地方の
山間部で、畑地栽培法や林間栽培法によって栽培されて
いるが、根茎の発育が遅いため収穫までに早くても５〜
６年を要し、また発育が自然環境に左右されるため、産
地間で品質のばらつきが生じるなど栽培上の問題も多い
。

そこで栽培法に代わる方法としてオウレン居植物の組織
培養が試みられている。例えば特開昭６１−９２２７号
公報、特開昭６２−３２８８０号公報等に示されている
ように銅イオン、ジベリレン等を培地に添加することに
よってベルベリンの収量を高める方法、特開昭６２−６
６７６号公報に示されるように培地中の溶存酸素量を調
製してベルベリンの収量を高める方法等が提案されてい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明はオウレン属植物の組織培養方法において、ベル
ベリン収量が低い点を改善するもので、特開昭６１−９
２２７号公報、特開昭６２−３２８８０号公報。

特開昭６２−６６７６号公報とは異なる新規な方法を提
供するものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、オウレン属植物のカルスあるいは組織の培養
において、培養液中に滅菌処理した細菌培養後の細菌の
培養液を添加することを特徴とするオウレン属植物の組
織培養方法に関する。

本発明の方法において用いられるオウレン應植物として
は例えばオウレン（競■」−ｌ巴旺匣Ｍａｋｉｎｏ）　
＋セリバオウレン（垣己」−」ユ蛙姐Ｍａｋｉｎｏ　ｖ
ａｒ、ｄｉｓｓｅｃｔａ　Ｎａｋａｉ）　、キクバオウ
レン（販吐亘Ｄ１凹復徂ｖａｒ、　詩匣鮭亜５ａｔａｋ
ｅ）およびコセリバオウレン（販■卦―主望旺卯ｖａｒ
。

勲」狸５ａｔａｋｅ）などを挙げることができる。

本発明の方法においては、上記のオウレン属植物は液体
培地を用いて組織培養される。この組織培養の方法につ
いて以下詳しく説明する。まず、オウレン属植物の根茎
あるいは根９葉などから組織片を切り出し、充分消毒し
て無菌とした後、植物ホルモンとして適切な１度のオー
キシンとサイトカイニンを添加した例えばムラシゲ・ス
クーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ）の固体
培地〔調製方法は例えば「植物組織培養マニュアル」　
（■講談社１９８４年１０月１日発行）に記載されてい
る〕に置床して２０〜３０℃で約１ケ月間培養すると、
組織片の一部が脱分化してカルスが生じる。このように
して得られたオウレン属植物のカルスは前記のムラシゲ
・スクーグ固体培地あるいは液体培地を用いて継代培養
することができる。また継代培養中に分化してきた根茎
状あるいは根状の組織を分難すると、これらの組織もま
た継代培養することができる。本発明は、このようにし
て得られたカルスあるいは培養組織を、以下に詳しく述
べるように液体培地に接種して増殖させ、ベルベリン含
量の高いカルスあるいは培養組織を得るものである。

本発明のオウレン属植物の組織培養に用いる液体培地は
１通常の植物組織培養用の培地でよい。

例えば、前記したムラシゲ・スクーグ培地、リンスマイ
ヤー・スクーグ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ　＆　Ｓｋｏｏｇ
）培地、ヒラ−（Ｈｅｌｌｅｒ）培地、ホワイト（Ｌ＋
１ｈｉｔｅ）培地、ニッチ・ニッチ（Ｎｉｔｓｃｈ　＆
　Ｎ１ｔｓｃｈ）培地。

シエンク・ヒルデブランド（Ｓｃｈｅｎｋ　＆Ｈｉｌｄ
ｅｂｒａｎｄｔ　）培地、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ
）　Ｂ　５培地などが挙げられるが、本発明では、この
中でも特にガンボルダＢ５培地を用いることが好ましい
。また通常の植物ｆｆｌ織培養でなされているように、
これらの培地成分にさらに糖源としてショ糖。

ブドウ糖などを１０〜５０ｍｇ／１２の濃度で添加して
用いることができる。なお、これらの培地の調製方法は
、例えば前記「植物組織培養マニュアル」に記載されて
いる。

本発明の方法においては、継代培養されたカルスあるい
は培養組織を前記した組織培養用の液体培地に接種して
増殖させるものであるが、その際該液体培地中に滅菌処
理した細菌培養後の細菌の培養液が添加される。ここで
用いる細菌としてはダラム陽性ないしはダラム陰性の各
種細菌（例えば、大腸菌、乳ｒａ菌、枯草菌等）が挙げ
られるが、実用的には非病原性の細菌を用いることが好
ましい。細菌培養に用いる培養液の組成は、前記した一
般的な植物組織培養用培地を用いることができ。

一般細菌用完全培地（ブイヨン培地）なども用いること
ができる。後者の細菌培養用培地の調製方法は１例えば
「微生物実験マニュアル」　〔■講談社１９８６年１０
月２０日発行〕に記載されている。これらの培養液に細
菌を接種して通常の方法、すなわち２０〜３５℃の温度
で２４時間程度振どう培養した後、、ｍ菌が充分増殖し
た培養液を加圧滅菌器（オートクレーブ）で滅菌処理し
て添加用の細菌培養液とする。

以上のような方法で調製した滅菌処理後の細菌培養液を
、組織培養中のオウレン属植物のカルスの培地に添加す
る。添加する時期としては、オウレン属植物のカルスの
増殖サイクルにおける対数増殖期後期ないし定常期初期
が最も好ましい。これは、オウレン属植物のカルスでは
対数増殖期後期から定常期初期にわたって、ベルベリン
の生合成能が最も高まるからである。

滅菌後の細菌の培養液は、これを添加した後の培地ＩＱ
あたり細菌数が１０″個以上の濃度になるように添加す
るのが好ましい。

細菌の培養液を添加する際に、炭素源としてシヨ糖、ブ
ドウ糖等を１〜２０　ｇ　／　Ｑの濃度となるように添
加し、また窒素源としてカサミノ酸、ペプトンなどのタ
ンパク質の加水分解物等を０．１〜２ｇ／Ｑの濃度で添
加すると、細菌培養液の添加によるオウレン属植物のカ
ルスのベルベリン含量増加効果がさらに高まる。

本発明のオウレン属植物の組織培養は、１５℃ないし３
５℃、好ましくは２０℃ないし３０℃の温度でおこなう
のが効果的である１５℃未満の温度あるいは３５℃を超
える温度で培養してもよいが、カルスの増殖速度が遅く
なる。

〔実施例〕

実施例１ セリバオウレンの根茎を切り出し、７０％エタノール水
溶液に約１０秒浸してから、さらに１％次亜塩素酸溶液
に約２０分間浸して外面を殺菌し、無菌水で充分洗浄後
、無菌的に約５ｍｍ角の移植片を切り出した。この移植
片をｌｏｎｇ／ρの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸と
Ｏ，１ｍｇ／Ｑ　のカイネチンと３０　ｇ　／　１１の
ショ糖を含むムラシゲ・スクーグの固体培地（ｐＨ，５
，８，ジェランガム０．２％）に移え付け、２５℃、暗
所にて培養し。

約３週間後背色のカルスを得た。このセリバオウレンの
カルスを上記のムラシゲ・スクーグ培地で４週間ごとに
植えつぎ、安定した増殖を示す黄色のカルス株を得た。

次にガンボルダＢ５液体培地（ｐＨ，５，８シヨ１１３
０　ｇ　／　Ｑ　）　２０　ｍ　ｍをｌｏｏｍＱのエル
レンマイヤーフラスコに入れた後、加圧滅菌器を用いて
１２０℃で２０分間保持して滅菌処理を行い、カルス培
養に用いる液体培地を調製した。

一方、これとは別にムラシゲ・スクーグ液体培地（ｐＨ
，５，８、ショ糖３０ｇ／Ｑ）２０ｍ１２をｌｏｏｍＱ
のエルレンマイヤーフラスコに入れた後、同様に滅菌処
理を行った。このムラシゲ・スクーグ液体培地に大腸菌
（ＡＴＣＣ２５９２２）を白金耳で接種し、３７℃で２
０時時間上う培養を行い。

大腸菌を１ｍ（ｌあたり５　Ｘ　Ｉ　Ｏ’個含む培養液
を得た。この培養液を高圧滅菌器で１２０℃、２０分間
の滅菌処理を行い、オウレンのカルスの培地に添加する
細菌の培養液を調製した。

先に調製したカルス培養用のガンボルダＢ５液体培地に
、継代培養４週間同のセリバオウレンのカルスをフラス
コあたり乾重量で約３０ｍｇ移植し。

２５℃、暗所で３週間振どう培養した。

この培養条件において、カルスの増殖サイクルの対数増
殖期後期にあたる培養３週間同に、カルスの培地に上記
した滅菌処理後の大腸菌の培養液を、無菌的にフラスコ
あたり２ｍ（Ｉ添加し、さらに１週間同条件で培養を続
けた。

培養後のカルスを濾別し、６０℃で１０時間乾燥させて
乾燥重量を測定した結果、フラスコあたりの乾燥重量は
０．２３　ｇ　であった、この乾燥カルスからメタノー
ルで可溶成分を抽出し、その抽出液を薄層クロマトグラ
フィーで分析してカルスのベルベリン含量を分析した結
果、フラスコあたりのベルベリン量は３．４ｍｇ　であ
った。またカルスの乾燥重量あたりのベルベリン含量は
１５ｍｇ／ｇ乾重量であった。

実施例２ 実施例１の方法により調製した滅菌処理後の大腸菌の培
養液（大腸菌数５　Ｘ　１０’個／　ｍ　Ｑ培養液）を
１００ｍＱとり、これにショ糖ｌｏｇとカサミノ酸２ｇ
を加えて溶解し、さらに高圧滅菌器で １２０℃、２０分間の滅菌処理を行い、ショ糖とカサミ
ノ酸を添加した大腸菌の培養液を調製した。

この大腸菌の培養液を、実施例１に記載した方法により
３週間液体振とう培養したセリバオウレンのカルスの培
地にフラスコあたり２ｍｇ無菌的に添加し、さらに１週
間同条件で培養を続けた。

実施例１に記載した方法により培養後のカルスの乾燥重
量を測定した結果、フラスコあたり０．２６　ｇであっ
た。またフラスコあたりのベルベリン含量は４．７ｍｇ
、カルスの乾燥重量あたりのベルベリン含量は１８ｍｇ
／ｇ乾重量であった。

比較例 実施例１に記載した方法により、得られたカルスを同様
にガン水ルグＢ５液体培地に移植し、大腸菌培養液の添
加をおこなわずに４週間２５℃。

暗所で振どう培養した。

培養後の細胞を濾別し乾燥重量を測定した結果、フラス
コあたり０．２１　ｇ　であった。またフラスコあたり
のベルベリン含量は２．５ｍｇ、カルスの乾燥重量あた
りのベルベリン含量はｔ２ｍｇ／ｇ乾重量であった。

〔発明の効果〕

本発明に係るオウレン属植物の組織培養方法によれば、
オウレン属植物のカルスあるいは培養組織のベルベリン
含量を高めることができ、従来法に比べてベルベリンを
大量に効率よく生産することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、オウレン属植物のカルスあるいは組織の培養におい
   て、培養液中に滅菌処理した細菌培養後の細菌の培養液
   を添加することを特徴とするオウレン属植物の組織培養
   方法。 ２、滅菌処理した細菌培養後の細菌の培養液を添加する
   際に炭素源と窒素源を添加することを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載のオウレン属植物の組織培養方法。