CN1997446A - 含有包封萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的组合物、其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含包封萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的组合物、它们的制备方法和它们的用途。所述组合物适于预防和治疗植物和包括人在内的动物的感染。

Description

含有包封萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的组合物、其制备和使用方法

本发明涉及包含萜和中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的组合物及这些组合物的制备方法。所述组合物提高萜稳定性和活性，并为所述萜提供合适的载体。本发明还涉及在医学、兽医学和农业领域中使用这些组合物的方法。

萜是在自然界中广泛分布的化学化合物，主要在植物中作为精油的成分。它们的结构单元是烃异戊二烯(C₅H₈)_n。萜的实例包括柠檬醛、蒎烯、橙花醇、b-紫罗酮、香叶醇、香芹酚、丁子香酚、香芹酮、terpeniol、茴香脑、樟脑、薄荷醇、苧烯、橙花叔醇、法呢醇、植醇、胡萝卜素(维生素A₁)、角鲨烯、百里酚、生育三烯酚、紫苏子醇、冰片、月桂烯、simene、蒈烯、terpenene和里哪醇。

萜被归类为Generally Recognized as Safe(GRAS)，并且在调味料和香料工业中已经使用多年。柠檬醛在大鼠中的LD₅₀为约5g/kg，这进一步表明这些化合物的相对安全性。此外，一旦暴露于氧(例如空气)，萜具有约28天的相对短暂的寿命。萜会分解为CO₂和水。萜的这种分解或裂解表明本发明的组合物和方法的安全性和环境友好性。

已经发现萜抑制癌细胞生长、减小肿瘤尺寸、降低胆固醇水平并且对体外微生物具有杀灭作用。Owawunmi(Letters in Applied Microbiology，1993，9(3)：105-108)显示，含多于0.01％柠檬醛的生长培养基降低大肠杆菌(E.coli)的浓度，并且在0.08％时具有杀菌作用。美国专利5,673,468描述了一种基于松油的萜制剂，其用作消毒剂或防腐清洁剂。美国专利5,849,956教导了在米中发现的萜具有抗真菌活性。美国专利5,939,050描述了一种口腔卫生抗微生物产品，其含显示协同作用的2种或3种萜的组合。几项美国专利(美国专利5,547,677、5,549,901、5,618,840、5,629,021、5,662,957、5,700,679、5,730,989)教导了某些类型的水包油型乳液具有抗微生物、佐剂和递送性质。已经发现萜是有效且无毒的膳食抗肿瘤剂，它们通过多种作用机理发挥作用(Crowell等人，Crit.Rev.Oncog.，1994，5(1)：1-22；Crowell等人，Adv.Exp.Med.Biol.，1996，401：131-136)。萜香叶醇、生育三烯酚、紫苏子醇、b-紫罗酮和d-苧烯抑制肝HMG-CoA还原酶活性，其是胆固醇合成中的限速步骤，并且适当降低动物中的胆固醇水平(Elson等人，J.Nutr.，1994，124：607-614)。D-苧烯和香叶醇减小乳腺肿瘤(Elegbede等人，Carcinogenesis，1984，5(5)：661-664；Elegbede等人，J.Natl.CancerInst.，1986，76(2)：323-325；Karlson等人，Anticancer Drugs，1996，7(4)：422-429)，并且抑制移植肿瘤的生长(Yu等人，J.Agri.Food Chem.，1995，43：2144-2147)。

还发现萜抑制细菌和真菌的体外生长(Chaumont等人，Ann.Pharm.Fr，1992，50(3)：156-166；Moleyar等人，Int.J.Food Microbiol，1992，16(4)：337-342；和Pattnaik等人，Microbios，1997，89(358)：39-46)和一些体内和体外寄生虫(Hooser等人，J.Am.Vet.Med.Assoc.，1986，189(8)：905-908)。发现香叶醇通过提高钾渗漏速率并破坏膜流动性而抑制白色念珠菌(Candida albicans)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株的生长(Bard等人，Lipids，1998，23(6)：534-538)。通过抑制孢子萌发和在琼脂中的生长抑制确定b-紫罗酮具有抗真菌活性(Mikhlin等人，A.Prikl.Biokhim.Mikrobiol，1983，19：795-803；Salt等人，Adam.Physiol.Molec.Plant Path，1986，28：287-297)。替普瑞酮(戊四烯酮)对幽门螺杆菌(H.pylori)具有抗菌作用(Ishii，Int.J.Med.Microbiol.Virol.Parasitol.Infect.Dis.，1993，280(1-2)：239-243)。已表明Rosanol，一种含1％玫瑰油的市售产品，抑制几种细菌的生长(假单胞菌(Pseudomonas)、葡萄球菌(Staphylococus)、大肠杆菌和幽门螺杆菌)。香叶醇是玫瑰油的活性成分(75％)。玫瑰油和浓度为2mg/L的香叶醇抑制幽门螺杆菌的体外生长。已表明来自草药的一些提取物对幽门螺杆菌具有抑制作用，最有效的是前胡醇当归酸酯、前胡素、木兰醇、小檗碱、肉桂酸、前胡醇和没食子酸(Bae等人，Biol.Pharm.Bull.，1998，21(9)990-992)。已表明来自腰果的提取物、漆树酸和(E)-2-己烯醛对幽门螺杆菌具有杀菌作用。

已表明二萜，即trichorabdal A(来自R.Trichocarpa)对幽门螺杆菌具有极强的抗菌作用(Kadota等人，Zentralbl.Bakteriol，1997，287(1)：63-67)。

在体外测试中，11种不同萜的溶液有效抑制致病菌的生长；在100ppm至1000ppm之间的水平是有效的。用含1％聚山梨醇酯20的水稀释所述萜(Kim等人，J.Agric.Food Chem.，1995，43：2839-2845)。

可能存在萜对抗微生物的不同作用模式；它们可以(1)干扰细胞膜的磷脂双分子层，(2)削弱多种酶系统(HMG-还原酶)，和(3)破坏或灭活遗传物质。相信由于萜的作用模式是如此基础，例如阻断胆固醇，以致感染剂不能建立对萜的耐药性。

但是，使用萜有许多缺点。这些缺点包括：

-萜是液体，这使得它们难以处理并且不适于某些目的。

-萜与水不是非常可混溶，并且其通常需要使用洗涤剂、表面活性剂或其它乳化剂来制备水乳液。但是，通过在高剪切下混合所述萜可以获得稳定溶液。

-干粉萜制剂通常仅含有低重量百分比的萜。

-萜在水乳液系统中趋于氧化，这使长期贮存成问题。

存在对喷雾包衣、挤出、凝聚、分子包封和喷雾干燥/冷却以提供成分递送系统的当前技术的限制。

发面酵母细胞壁来自发面酵母细胞，并且由不溶性生物聚合物β-1，3-葡聚糖、β-1，6-葡聚糖、甘露聚糖和壳多糖组成。它们通常为2-4微米直径的微球，具有厚度仅为0.2-0.3微米的壳壁，壳壁环绕着开放的空穴。这种材料具有可观的液体保持容量，通常吸收5-25倍于其重量的液体。壳是充分多孔的，使尺寸高至150000道尔顿的有效负荷可以通过外壳，并被吸收入球形颗粒的空穴中。发面酵母细胞壁具有几种独特的性质，包括热稳定性(例如高至121℃)、剪切稳定性、pH稳定性(例如pH2-12)以及在高浓度下它们不形成显著的粘度。除了其物理性质外，这种组合物还含有天然和健康的膳食纤维，它们具有心血管和免疫增强的健康益处。

通过从酵母细胞的可溶性成分提取和纯化不溶性微粒部分而从酵母细胞制备酵母细胞壁。可以从酵母抽提物生产的不溶性副产物制备真菌细胞壁。此外，可以用氢氧化物水溶液处理酵母细胞，不破坏酵母细胞壁，氢氧化物水溶液消化细胞的蛋白质和胞内部分，使酵母细胞壁成分避免严重的蛋白质污染，并且具有基本上未改变的β(1-6)和β(1-3)连接的葡聚糖的细胞壁结构。Jamas等人在美国专利4,810,646和共同在审专利申请U.S.Ser.No.166,929、U.S.Ser.No.297,752和U.S.Ser.No.297,982中更详细地描述了完整葡聚糖颗粒及其制备方法。转让给Novogen Research Pty Ltd.的美国专利6,242,594描述了一种通过碱提取、酸提取然后用有机溶剂提取和最后干燥来制备酵母葡聚糖颗粒的方法。转让给AS Biotech-Mackzymal的美国专利5,401,727公开了获得酵母葡聚糖颗粒的方法和使用它们增强水生动物抵抗力和作为疫苗佐剂的方法。转让给Alpha-BetaTechnology Inc.的美国专利5,607,677公开了中空完整葡聚糖颗粒作为递送包装和辅剂用于递送多种药剂的用途。上述专利和申请的教导引入本文作为参考。

其它类型的酵母和真菌细胞的细胞壁不含葡聚糖。可以通过与上述技术相似的技术分离这些酵母和真菌的细胞壁以获得细胞壁颗粒。

此外，许多植物、藻类、细菌和其它微生物的细胞也包括细胞壁。不同微生物的细胞壁的结构和组成不同，但其通常是坚固和相对惰性的结构。通过常规技术如以上关于酵母所提及的技术，可能从这些细胞获得细胞壁颗粒。

我们现已发现，可以将萜吸收并稳定地包封在中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒中。可以通过将颗粒与萜一起温育而将所述萜包封入这些颗粒中。

根据本发明，提供了一种组合物，其包含包封萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒。

本文所用的术语“中空葡聚糖颗粒”包括任何包含葡聚糖作为结构部分的中空颗粒。因此，该术语具体包括(经纯化或粗品形式的)酵母细胞壁或中空完整葡聚糖颗粒。术语“细胞壁颗粒”指(经纯化或粗品形式的)包括细胞的壁的颗粒，其中葡聚糖不是结构部分。合适的颗粒包括植物、藻类、真菌或细菌细胞的细胞壁。细胞壁颗粒通常保留它们所来源于的细胞的形状，因此，像中空葡聚糖颗粒一样，提供适于包封萜成分的中央空穴。

对于本发明，所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒能够稳定地包封所述萜成分是必要的。通常，这意味着在与所述萜成分一起温育的过程中(通常所述萜成分处于相对高的浓度)，所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒必须能够保持其结构，并且所述萜成分必须能够迁移入所述颗粒中。所述中空葡聚糖颗粒和细胞壁颗粒通常从相对惰性的材料形成并且是多孔的，所以可以认为通常中空葡聚糖颗粒和细胞壁颗粒将能够包封萜成分。

本发明的组合物有效对抗各种感染剂，包括细菌、病毒、支原体、真菌和/或线虫。

本发明的组合物可以提供以下优点：

-使萜有效负荷最大化；

-使未包封的有效负荷最小化；

-控制有效负荷稳定性；

-控制有效负荷释放动力学；

-产生液体萜的固体形式，以增加质量(mass)和均匀性；

-简化萜的处理和应用；和

-掩盖所述萜的气味和味道。

特别合适的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒是真菌细胞壁，优选酵母细胞壁。酵母细胞壁是酵母细胞的制剂，其保留它们所来源于的酵母细胞的三维结构。因此它们具有中空结构，其允许将所述萜成分包封在所述酵母细胞壁内。酵母壁可以适当地来源于发面酵母细胞(可得自Sigma ChemicalCorp.，St.Louis，MO)。也可以以商品名Nutricell MOS 55从Biorigin(SaoPaolo，Brazil)获得具有合意性质的酵母细胞壁颗粒。这些颗粒是喷雾干燥的酿酒酵母抽提物。

可选择的颗粒是商品名为SAF-Mannan(SAF Agri，Minneapolis，MN)和Nutrex(Sensient Technologies，Milwaukee，WI)的颗粒。这些颗粒是中空葡聚糖颗粒，其是来自酵母抽提物生产过程的不溶性废物流。在生产酵母抽提物的过程中，部分自溶酵母细胞的可溶性成分被除去，而不溶性残渣是用于萜装载的合适材料。这些中空葡聚糖颗粒包含约25-35重量％β-1，3-葡聚糖。这些材料的关键属性是它们含有多于10重量％脂质，并且非常有效地吸收萜。此外，作为废物流产物，它们是相对廉价的中空葡聚糖颗粒来源。

具有更高纯度的可选择的中空葡聚糖颗粒是由Nutricepts(NutriceptsInc.，Burnsville，MN)和ASA Biotech生产的颗粒。这些颗粒已经过碱提取，其除去额外的细胞内成分并除去细胞壁的外部甘露糖蛋白层，获得50-65重量％葡聚糖的颗粒。

更高纯度的中空葡聚糖颗粒是来自Biopolymer Engineering的WGP颗粒。这些颗粒经酸提取除去额外的酵母成分，获得75-85重量％葡聚糖的产物。

极高纯度的中空葡聚糖颗粒是来自Alpha-beta Technology，Inc.(Worcester，MA)的Adjuvax^TM和来自Novogen(Stamford，CT)的微粒葡聚糖。这些颗粒经有机溶剂提取，其除去残余的脂质，从而使所述颗粒包含多于90重量％葡聚糖。

在一些实施方案中，可能需要高纯度的葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒，例如当需要严格控制可能的污染物时。在这些情况下，更高纯度的颗粒将比其它较低纯度的产品更优选。对于其它实施方案，由于经济原因，较低纯度的颗粒将是优选的；还发现那些颗粒更有效地吸收萜。

优选地，所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒含有少量脂质，如1或2重量％脂质。少量脂质可以增加所述颗粒包封所述萜成分的能力。优选地，所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的脂质含量为5重量％或更高，更优选10重量％或更高。

任选地，本发明的萜成分可以与表面活性剂缔合。所述表面活性剂可以是非离子型、阳离子型或阴离子型的。合适的表面活性剂的实例包括十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚甘油酯、聚甘油一油酸酯、十甘油一辛酸酯(decaglycerylmonocaprylate)、丙二醇二辛酸酯、三甘油一硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯、Tween_、Span_20、Span_40、Span_60、Span_80、Brig 30或其混合物。所述表面活性剂将所述萜成分保持在乳液中，还帮助将所述萜成分包封入所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒中。

本发明的萜成分可以包含单一的萜或多种萜的混合物。多种萜的混合物可以导致协同作用。

本文所用的术语“萜”不仅指式(C₅H₈)_n的萜，而且包括萜衍生物，如萜醛或萜聚合物。包括天然和合成萜，例如单萜、倍半萜、二萜、三萜和四萜。此外，提及单个化合物名称将包括该化合物的各种异构体。例如，术语柠檬醛包括顺式异构体柠檬醛-a(或香叶醛)和反式异构体柠檬醛-b(或橙花醛)。

应该注意，也用含有萜的提取物或精油的名称来称呼萜，例如柠檬草油(含有柠檬醛)。

被美国规则豁免且列在EPA规则40 C.F.R.Part 152(被全文引入本文作为参考)的萜适用于本发明。

特别适用于本发明的萜包括选自以下的萜：柠檬醛、蒎烯、橙花醇、b-紫罗酮、香叶醇、香芹酚、丁子香酚、香芹酮(例如L-香芹酮)、terpeniol、茴香脑、樟脑、薄荷醇、百里酚、苧烯、橙花叔醇、法呢醇、植醇、胡萝卜素(维生素A₁)、角鲨烯、百里酚、生育三烯酚、紫苏子醇、冰片、月桂烯、simene、蒈烯、terpenene、里哪醇及其混合物。

优选地，用于本发明的萜具有通式结构C₁₀H₁₆，因为这一亚组通常更有效地对抗感染剂。

更优选地，所述萜成分包含选自香叶醇、百里酚、柠檬醛、香芹酮(例如L-香芹酮)、丁子香酚和b-紫罗酮的萜。

所述萜成分可以合适地包含百里酚，因为已表明这种萜特别有效地治疗或预防真菌植物感染。

另一种特别合适的萜是柠檬醛，其表现对抗多种微生物的特别功效。

香叶醇、百里酚和丁子香酚的组合在对抗植物感染方面表现特别的功效，因此是特别合适的萜成分。

在治疗植物感染方面显示高功效的其它萜制剂包括(重量百分比)：

-100％百里酚；

-50％香叶醇和50％百里酚；

-50％丁子香酚和50％百里酚；

-33％香叶醇、33％丁子香酚和33％百里酚；

-33％丁子香酚、33％百里酚和33％柠檬醛；

-25％香叶醇、25％丁子香酚、25％百里酚和25％柠檬醛；

-20％香叶醇、20％丁子香酚、20％柠檬醛、20％百里酚和20％L-香芹酮。

因此，包含任何以上制剂的萜成分都特别适用于本发明。

在一个实施方案中，所述萜成分包含一种或多种含氧的萜。柠檬醛，例如柠檬醛95，是一种氧化的C₁₀H₁₆萜，C₁₀H₁₆ CAS No.5392-40-5(3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醛)。可以形成高至约2500ppm的柠檬醛的稳定悬浮液。可以将柠檬醛制成高至约500ppm的溶液。可以制备掺入25ppt柠檬醛的中空葡聚糖颗粒的稳定悬浮液。

本发明的组合物可以包含1至99体积％萜、0至99体积％表面活性剂和1至99％中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒。更具体地，所述组合物可以包含约10％至约67重量％萜、约0.1-10％表面活性剂和约40-90％中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒。

合适地，本发明的组合物包含约500至约10000ppm中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒，其中所述颗粒含有约1至约67％萜成分。优选地，所述组合物包含约1000至约2000ppm中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒，其中所述颗粒含有约10至约50％萜成分。

例如，对于细菌和真菌，具体的组合物可以包含包封萜的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒，其在水或标准0.9％盐水中，具有高至67％的L-香芹酮、高至67％的丁子香酚、高至67％的柠檬醛、高至67％的百里酚和L-香芹酮、高至67％的香叶醇或高至67％的柠檬醛和L-香芹酮和丁子香酚以及1％的Tween_80；对于霉菌，具体的组合物可以包含包封萜的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒，其在水或标准0.9％盐水中，具有高至67％的柠檬醛和1％的Tween_80；或者对于支原体，具体的组合物可以包含包封萜的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒，其在水或标准0.9％盐水中，具有高至67％的柠檬醛、高至67％的L-香芹酮和丁子香酚、高至67％的丁子香酚、高至67％的香叶醇或高至67％的香叶醇、百里酚以及1％的Tween_80。

在本发明的组合物和方法中可以用作有效浓度的包封萜的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒浓度为1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、125、130、140、150、160、175、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1250、1375、1425、1500、1600、1750或2000ppm。甚至更高的浓度(高至25ppt，即千分之...)可以得到制备并可以用于本发明。

本发明的组合物可以包含约1ppm至约25ppt(25000ppm)所述萜成分，优选100至2000ppm所述萜成分，例如250、500、1000、2000ppm。

可以容易地购得或使用合成化学家公知的技术合成本发明的萜、表面活性剂和其它成分。

出于安全性和规章原因，高度优选本发明中所用的萜至少是食品级萜(如美国FDA或美国以外的同等管理机构定义)。

任选地，除了所述萜成分外，所述组合物还可以包含其它食品级活性化合物，例如其它抗微生物剂、酶等。

任选地，除了所述萜成分外，所述组合物还可以包含其它活性剂，例如抗微生物剂、抗真菌剂、杀虫剂、抗炎药、麻醉剂等。合适的活性剂包括：

-抗真菌剂：细胞壁水解酶(假设它们不降解所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒)、细胞壁合成抑制剂、标准抗真菌剂。

-抗菌剂：防腐剂、细胞壁水解酶、合成抑制剂、抗生素。

-杀虫剂：天然杀虫剂、几丁质酶。

所述组合物可以包含抗氧化剂以减少所述萜的氧化。这种抗氧化剂的实例可以是迷迭香油、维生素C或维生素E。

本发明的组合物可以是干粉形式。可以与液体、固体或凝胶样形式的农学、食品或药学可接受的载体或赋形剂组合提供所述组合物。

对于固体组合物，合适的载体包括药用级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。合适地，制剂为片剂或小球形式。合适的载体也可以是人或动物食品材料。此外，也可以使用常规农学载体。

所述组合物的小球、片剂或其它固体形式还可以优选地含有分散剂，当将所述组合物放入液体如水中时，所述分散剂促进所述组合物的分散。合适的分散剂包括黄原胶、麦芽糖糊精、藻酸盐等。

例如，通过将所述组合物分散在水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等中以形成溶液或悬浮液，可以制备液体组合物。如果合意，这些组合物可以含有少量无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂(例如乙酸钠、失水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠或油酸三乙醇胺)。对于本领域技术人员，制备这些液体组合物的方法是已知的或着会是明显的；例如参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy；Lippincott，Williams & Wilkins；(December 15，2000)，该文献引入本文作为参考。此外，通过将所述组合物分散在人或动物液体食品或饮料中，可以制备液体组合物。还可以使用合适的农学液体赋形剂。

对于口服给予，通常优选片剂和胶囊剂。片剂可以含有粘合剂和润滑剂。细粉或颗粒可以含有稀释剂、分散剂和/或表面活性剂，并且可以存在于水或糖浆中。胶囊剂或小药袋(sachet)可以方便地含有干燥状态的所述组合物。所述组合物的非水溶液或悬浮液也是合适的，并且可以含有助悬剂。当合意或必需时，可以包含调味剂、防腐剂、助悬剂、增稠剂或乳化剂。当然，使用食品或饮料作为口服递送方法也是适合的。

胃肠外给予通常的特征是注射。对于可注射物，可以理解，通常所述组合物中使用的所有材料和所用的任何赋形剂都必须是药用级的。可以将可注射物制备成常规形式，作为液体溶液、乳液或悬浮液、适于在注射前溶解、悬浮在液体中的固体形式或者作为乳液。用于胃肠外给予的可选择的方法包括使用缓释或延迟释放系统，从而保持稳定的剂量水平。参见例如美国专利3,710,795，该文献引入本文作为参考。胃肠外制剂还可以含有缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。含水载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。其它胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸钠林格氏液(lactatedRinger’s)或固定油。静脉内使用的载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的电解质补充剂)等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。

对于局部给予，可以使用液体、混悬剂、洗剂、乳膏、凝胶剂、软膏剂、滴剂、栓剂、喷雾剂和散剂。如果必需或合意，可以使用常规药用载体、含水基质、粉末基质或含油基质、增稠剂等。

本发明还提供包封萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供萜成分；

b)提供中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒；

c)在适合萜包封的条件下，将所述萜成分和所述葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒一起温育；和

d)回收包封所述萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒。

任选地，以上方法还可以包括干燥包封所述萜成分的所述颗粒的步骤。可以用多种方式实现干燥，并且可以提及冷冻干燥、流化床干燥、转鼓式干燥或喷雾干燥，所有这些都是公知的方法。

在以上方法的步骤a)中，所述萜成分任选地在表面活性剂存在下，以在含水溶剂中的悬浮液的形式提供。合适的所述溶剂为水。合适的表面活性剂为Tween-80(聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)，并且优选所述表面活性剂存在的浓度为总反应混合物的约0.1至10体积％，更优选约1％。或者，可以将所述萜成分以在溶剂如水中的真溶液的形式提供。通过在高剪切下混合萜和水直到获得真溶液，可以获得所述萜在水中的真溶液。公开WO03/020024提供了形成萜在水中的真溶液的更多细节。

在以上方法的步骤b)中，适合地以在水或其它合适液体中的悬浮液的形式提供所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒。合适地，所述悬浮液每毫升包含约1至1000mg颗粒，优选200至400mg/ml。或者，可以以干粉的形式提供所述颗粒，并添加到所述萜-表面活性剂悬浮液中。

或者，可以在最低程度地水化所述颗粒但不显著过量的充足液体中提供所述颗粒。术语“流体力学体积(HV)”用于描述最低程度地水化所述颗粒所需的液体体积。因此，合适地，为所述颗粒提供HV至1.5倍HV(1.5HV)的体积。这使得随后的干燥步骤更有效。而且，当使用小体积液体(即约HV至1.5HV)时，还可能将成品挤出成小球或面条形式，这对于流化床干燥是方便的。

已经发现所述萜成分可以在室温下被所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒包封。虽然包封速率在37℃下会提高，但应该将温度保持在所述组合物的任何成分的沸点或变性温度以下。因此，对于以上方法的步骤c)，合适的条件是大气压和20℃至37℃的温度。对特定包封反应进行条件优化将是常规实验的内容。

本发明还提供杀死微生物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)使所述微生物与包含包封萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的组合物接触。

合适的组合物是以上更详细定义的组合物。

本发明还提供预防或治疗患者的感染的方法，所述方法包括以下步骤：

a)给予所述患者治疗有效剂量的包含包封萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的组合物。

合适的组合物是以上更详细定义的组合物。

所述患者的感染可能由任何感染剂引起。这些感染剂的实例包括但不限于：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、烟曲霉(Aspergilliusfumigatus)、衣阿华支原体(Mycoplasma iowae)、青霉(Penicillium sp.)和肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)。

对于体内给予，可以口服、阴道、直肠、吸入或者通过胃肠外途径给予所述组合物，例如通过皮内、皮下、肌内、腹膜内、直肠内、动脉内、淋巴内、静脉内、鞘内和气管内途径给予。以上讨论了用于这些途径的所述组合物的合适制剂。

对于体外治疗，可以局部施用所述组合物，例如作为乳剂或软膏或者作为干粉施用，用于治疗伤口。

在以上方法中给予的萜的量显然应该足以获得合意的结果，即预防和/或治疗感染，但其水平不应为在患者中引起严重毒性作用的水平。

当然，所给予的组合物的量将取决于给予方式、被治疗的患者(即他们的体重、它们的年龄、状态、性别)和个体中疾病的程度，并取决于处方医师的判断。剂量、给药方案和给予途径是可以变化的。基于本领域的常识和以下给出的实施例中的程序，本领域技术人员将能够容易地确定给定应用的抗感染量。应该注意，本文所用的术语“患者”指向其施用所述治疗的任何个体，人或动物。因此，所述患者可以是驯养动物(例如猫、狗等)、家畜(例如牛、马、猪、羊、山羊等)、实验室动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)、鸟和鱼。合适地，所述个体为哺乳动物，尤其是灵长类动物，例如人。

在其它实施方案中，本发明提供治疗或防止植物感染的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将治疗有效剂量的包含包封萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的组合物给予所述植物或所述植物附近的土壤。

合适的组合物是以上更详细定义的组合物。

已表明萜消除多种植物病原体(参见WO03/020024)，并且如共同在审申请US60/538,627中所述，萜还有效杀死线虫，其是重要的植物寄生虫。但是，萜单独在悬浮液或溶液中有些不稳定，并且在土壤环境中迅速降解，从而失去功效。

将萜成分掺入中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒中可以降低萜释放和降解的速率，从而增加所述萜在土壤中的作用时间。

合适地，要在以上方法中治疗或预防的植物感染为线虫感染。

可以治疗或预防的其它植物感染包括真菌植物感染，尤其是影响植物表面的感染。这些感染包括霜霉病、白粉病或灰霉病(botrytis bunch rot)；这些感染特别地影响葡萄树。

在一个实施方案中，所述植物感染可以由以下一种或多种引起：烟曲霉、Sclerotinta homeocarpa、茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾生毛盘孢(Colletotrichum graminicola)或青霉。

基于萜处理植物的优点是可以在快要收获时施用之。

许多常规处理要求在再次进入处理区域之前有较长的时间(通常为3周)。这意味着不能用常规处理来处理在快要收获时的植物病害发作，因为这样就不可能在合意的时间收获作物。本发明的组合物可以合适地在直至收获的任何时间施用，例如收获前21天、收获前14天、收获前7天或甚至收获前3天或更短。

包封萜显示在处理葡萄的霜霉病、白粉病和灰霉病方面特别的功效，因此本发明提供治疗或预防这些病害的方法。

通过有规律地用包封萜作为预防措施处理植物可以实现植物感染的预防。

合适地，本发明的组合物通过喷雾施用。这对于处理影响植物表面的植物病害是特别合适的。为了喷雾，可以使用在水中包含2g/l组合物的制剂。2至4g/l的浓度是特别有效的，并且可以根据需要使用高于4g/l的浓度。明显地，重要的是所用组合物的浓度足以杀死或抑制致病剂，但不高到伤害被处理的植物。

当喷雾植物时，500L/Ha或更高的比率适于覆盖所述植物。优选使用900L/Ha或更高，更优选1200L/Ha或更高的比率以保证良好覆盖。当处理葡萄树时，证明1200L/Ha的比率是合适有效的。

或者，可以通过灌溉施用本发明的组合物。这特别合于处理线虫或其它土传病原体或寄生虫。

在其它实施方案中，本发明还提供包含包封萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的组合物，其用于预防或治疗患者或植物的感染。合适的组合物是以上更详细定义的组合物。

在其它实施方案中，本发明提供包含包封萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的组合物在制备用于治疗由微生物引起的感染的药物中的用途。合适的组合物是以上更详细定义的组合物。

现在将参考以下非限制性实施例和附图进一步描述本发明，在附图中：

图1表示空酵母细胞壁的光学显微照片。

图2表示包封L-香芹酮的酵母细胞壁的光学显微照片。

图3表示包封柠檬醛的酵母细胞壁的光学显微照片。

图4表示萜乳液的光学显微照片。

图5表示在流体力学体积(HV)的水中的酵母细胞壁的光学显微照片。

图6表示在5倍流体力学体积(HV)的水中的包封萜的酵母细胞壁的光学显微照片。

图7表示在HV的水中的包封萜的酵母细胞壁的光学显微照片。

图8表示在HV+5％的水中的包封萜的酵母细胞壁的光学显微照片。

图9表示在HV+10％的水中的包封萜的酵母细胞壁的光学显微照片。

图10表示在HV+20％的水中的包封萜的酵母细胞壁的光学显微照片。

图11表示在HV+30％的水中的包封萜的酵母细胞壁的光学显微照片。

图12表示在HV+40％的水中的包封萜的酵母细胞壁的光学显微照片。

图13表示显示包封萜成分且不含黄原胶的干燥的中空葡聚糖颗粒的分散的光学显微照片。

图14表示在包含0.07g1％黄原胶时如图13中的光学显微照片。

图15表示在包含0.14g1％黄原胶时如图13中的光学显微照片。

图16表示在包含0.28g1％黄原胶时如图13中的光学显微照片。

图17表示在包含0.55g1％黄原胶时如图13中的光学显微照片。

图18表示在包含1.1g1％黄原胶时如图13中的光学显微照片。

图19表示在包含2.2g1％黄原胶时如图13中的光学显微照片。

图20表示在包含4.4g1％黄原胶时如图13中的光学显微照片。

图21显示在位置18和20上的处理区域的图示。

图22显示在位置18和20上的处理区域的图示。

图23显示在位置7上的处理区域的图示。

图24显示对比经包封与未包封萜制剂的图。

提供以下实施例以进一步使本领域普通技术人员能够制备或实施本发明。它们完全是示例性的，并非用于限制本发明的范围。除非另有说明，份数为所述的体积份或重量份，温度为摄氏度(℃)或处于环境温度，而压力为处于或接近大气压。组合物及其制备或使用条件存在许多变化和组合，例如成分浓度、合意的溶剂、溶剂混合物、温度、压力和可以用于优化从所述组合物和方法获得的结果的其它范围和条件。优化它们仅需要合理和常规的实验。

实施例1-证明萜装载到发面酵母颗粒和纯化的酵母葡聚糖颗粒中

实施以下方案以证明萜会装载到酵母细胞壁和其它中空葡聚糖颗粒中。

通过混合150μl所述萜和100μl 10％Tween 80的水溶液和250μl水来制备柠檬醛和L-香芹酮的乳液。

将可得自Savory Systems International，Inc.，Branchburg，NJ的发面酵母颗粒(YP)或Levacan^TM酵母葡聚糖颗粒(YGP)与水混合，形成250mg/ml悬浮液。

将500μl所述YP或YGP悬浮液和250μl所述萜乳液一起混合，并在持续搅拌下温育过夜。用500μl YP或YGP悬浮液和500μl水作为对照。然后用水洗涤所述颗粒，直到没有外部乳液。然后将颗粒制剂冷冻并冷冻干燥直到干燥。

然后将所述颗粒再水化，并在光学显微镜下检查。结果示于图1至4中。

图1显示于其中心有黑暗区域的球形结构，这些是空的中空葡聚糖颗粒。图2和3显示具有肿胀外观和浅色内部的球形结构，这些是萜被包封在中央空穴中的颗粒，在图2中萜为柠檬醛，而在图3中萜为L-香芹酮。在图2和3中还可以看到游离萜的小斑点，例如在图2的顶部，就在中央的左侧。图4显示萜乳液，其为悬浮在水中的萜小泡。

实施例2-确定发面酵母细胞壁颗粒(YP)中的最高柠檬醛和L-香芹酮装载 水平

实施以下方案以确定装载到YP中的萜的最大量。

-通过将4.5g所述萜与0.3ml水一起超声来制备L-香芹酮和柠檬醛乳液。

-通过将4.5g Tween-80在40.5ml水中超声来制备10％Tween-80溶液。

-通过将YP与水混合以形成20mg/ml悬浮液来制备YP悬浮液。

-如表1所述进行包封反应。

在室温下将柠檬醛或L-香芹酮-水乳液与YP和Tween 80表面活性剂混合过夜。将样品在14000xg下离心10分钟，并评价漂浮在水层上的游离萜的外观。结果示于表1标为游离萜的右手栏中。

表述“游离萜”指在经离心的反应混合物中存在可见的萜。不存在游离萜表明所述萜完全被所述颗粒吸收。将由不存在游离萜证明被所述颗粒吸收的萜的最大体积记录为被吸收的萜乳液的最大体积。

表1

试管	20mg/ml YP	萜乳液	体积	10％Tween-80	游离萜
							μl		μl	μl
1	500	-	-	500	-
						2	500	L-香芹酮	0.5	500	-
3	500	L-香芹酮	1.65	500	-
						4	500	L-香芹酮	5	495	-
5	500	L-香芹酮	16.5	483.5	-
						6	500	L-香芹酮	50	450	+
7	500	L-香芹酮	165	335	+
						8	500	L-香芹酮	500	-	+
9	500	柠檬醛	0.5	500	-
						10	500	柠檬醛	1.65	500	-
11	500	柠檬醛	5	495	-
						12	500	柠檬醛	16.5	483.5	+/-
13	500	柠檬醛	50	450	+
						14	500	柠檬醛	165	335	+
15	500	柠檬醛	500	-	+

从该结果可以看出，每10mg YP能够吸收和包封至少16.5μl L-香芹酮萜乳液或至少5μl柠檬醛乳液。

实施例3-证明用表面活性剂改善萜装载以及确定最佳Tween-80：萜比率

实施以下方案以证明表面活性剂的存在改善萜装载，并确定YP萜装载反应所需的Tween-80表面活性剂的最低水平。

-通过将4.5g所述萜和0.3ml水一起超声来制备L-香芹酮和柠檬醛乳液。

-通过将4.5g Tween-80在40.5ml水中超声来制备10％Tween-80溶液。

-通过将YP与水混合以形成250mg/ml悬浮液来制备发面YP悬浮液。

如下表2所示进行装载反应。

在室温下将柠檬醛或L-香芹酮-水乳液与含0-10％v/v Tween 80表面活性剂的YP混合过夜。将样品在14000xg下离心10分钟，并评价漂浮在水层上的游离萜的外观。结果示于表2标为游离萜的右手栏中。

表述“游离萜”指在经离心的反应混合物中存在可见的萜。不存在游离萜表明所述萜完全被所述YP吸收。将由不存在游离萜证明被所述YP吸收的萜的最大体积记录为被吸收的萜乳液的最大体积。

表2

试管	250mg/ml YP	萜乳液	体积	10％Tween-80	水	游离萜
								ml		μl	μl	μl
1	500	-	-	-	500	-
							2	500	L-香芹酮	150	0	350	Sl
3	500	L-香芹酮	150	5	345	Sl
							4	500	L-香芹酮	150	10	340	Sl
5	500	L-香芹酮	150	33	317	Sl
							6	500	L-香芹酮	150	100	250	-
7	500	L-香芹酮	150	200	150	-
							8	500	L-香芹酮	150	350	-	-
9	500	L-香芹酮	400	0	100	++
							10	500	L-香芹酮	400	5	95	++
11	500	L-香芹酮	400	10	90	++
							12	500	L-香芹酮	400	33	77	++
13	500	L-香芹酮	400	100	-	+
							14	500	L-香芹酮	400	20μl 100％	30	+
15	500	柠檬醛	113	0	387	+
							16	500	柠檬醛	113	5	382	+
17	500	柠檬醛	113	10	377	+
							18	500	柠檬醛	113	33	354	Sl
19	500	柠檬醛	113	100	287	Sl
							20	500	柠檬醛	113	200	187	-
21	500	柠檬醛	113	350	37	-
							22	500	柠檬醛	250	0	250	++
23	500	柠檬醛	250	5	245	++
							24	500	柠檬醛	250	10	240	++
25	500	柠檬醛	250	33	217	+
							26	500	柠檬醛	250	100	150	+
27	500	柠檬醛	250	20μl 100％	230	+

Sl＝轻微

从该结果可以看出，Tween-80浓度为1％(即1000μl反应混合物中含100μl 10％Tween-80)足以允许在上述反应中萜的完全吸收。2％Tween-80不引起结果的改善，而用0.33％的浓度观察到游离萜。这表明：

a)当不存在表面活性剂时，萜被吸收到YP颗粒中，但存在表面活性剂显著增加萜吸收。

b)约1％的Tween-80浓度对于YP装载是最佳的，因为其保证适当的装载，同时使YP颗粒的萜有效负荷最大化。

实施例4-确定在高发面酵母细胞壁颗粒(YP)水平下的最大萜装载和包封

实施以下方案以确定在高YP水平下装载到YP中的萜的最大量。

-通过将4.5g所述萜和3ml 1％Tween一起超声来制备L-香芹酮和柠檬醛乳液。

-通过将0.5g Tween-80在9.5ml水中超声来制备5％Tween-80溶液。

-通过将YP与水混合以形成250mg/ml悬浮液来制备YP悬浮液。

-如下表3所示进行包封反应。

在室温下将柠檬醛或L-香芹酮-水乳液与YP和Tween 80表面活性剂混合过夜。将样品在14000xg下离心10分钟，并评价漂浮在水层上的游离萜的外观。结果示于表3标为游离萜的右手栏中。

表述“游离萜”指在经离心的反应混合物中存在可见的萜。不存在游离萜表明所述萜完全被所述YP吸收。将由不存在游离萜证明被所述YP吸收的萜的最大体积记录为被吸收的萜乳液的最大体积。

表3

试管	250mg/ml YP	萜乳液	体积	1％Tween-80	游离萜
							μl		μl	μl	-
1	500	-	-	500	-
						2	500	L-香芹酮	15	485	-
3	500	L-香芹酮	37.5	462.5	-
						4	500	L-香芹酮	75	425	-
5	500	L-香芹酮	112.5	387.5	-
						6	500	L-香芹酮	150	350	Sl+
7	500	L-香芹酮	225	275	+
						8	500	L-香芹酮	450	50	+
9	500	柠檬醛	15	485	-
						10	500	柠檬醛	37.5	462.5	-
11	500	柠檬醛	75	425	-
						12	500	柠檬醛	112.5	387.5	Sl+
13	500	柠檬醛	150	350	+
						14	500	柠檬醛	225	275	+
15	500	柠檬醛	450	50	+

从表3中的结果可以看出，在高YP浓度下，YP能够吸收和包封萜。每125 mg YP吸收和包封至少112.5μl L-香芹酮萜乳液或至少75μl柠檬醛乳液。这证明在所测试的范围内萜包封反应不依赖于YP浓度。实施例5-筛选用于萜吸收的市售颗粒

实施以下方案以分析不同类型的颗粒的装载性质。所研究的颗粒是发面酵母细胞壁颗粒(Sigma Chemical Corp.，St.Louis，MO)、Nutrex^TM Walls(Sensient Technologies，Milwaukee，WI)、SAF-Mannan^TM(SAF Agri，Minneapolis，MN)、Nutricept Walls^TM(Nutricepts Inc.，Burnsville，MN)、Levacan^TM(Savory Systems International，Inc.，Branchburg，NJ)和WGP^TM(Alpha-beta Technology，Inc.Worcester，MA)。

通过将7g萜+3ml 3.3％Tween-80超声来制备L-香芹酮和柠檬醛乳液。

下面的表4比较了纯度与酵母颗粒数/mg和填充的(packed)固体重量/体积比。

表4

酵母颗粒	纯度 ％β-1，3-葡聚糖	颗粒数/mg	mg颗粒/ml
				Bakers	11.2	4×107	250
Nutrex	24.5	1.7×108	58.8
				SAF Mannan	33.4	2.4×108	41.7
Nutricepts	55.7	5.2×108	37
				Levacan	74.6	1×108	19.2
WGP	82.1	3.5×108	10

从表4可以得出结论，颗粒数/mg与纯度成反比。因此，每mg WGP的颗粒数几乎比发面YP高10倍。

如下制备所述YP悬浮液：

-通过混合250mg YP/ml 1％Tween 80来制备发面酵母细胞壁颗粒悬浮液(YP)。

-通过混合163mg Nutrex YGP/ml 1％Tween 80来制备Nutrex悬浮液。

-通过混合234mg Biospringer YGP/ml 1％Tween 80来制备SAFMannan悬浮液。

-通过混合99mg Nutricepts YGP/ml 1％Tween 80来制备Nutricepts悬浮液。

-通过混合217mg Lev YGP/ml 1％Tween 80来制备Levacan悬浮液。

-通过混合121mg WGP YGP/ml 1％Tween 80来制备WGP悬浮液。

以上颗粒的填充体积(packed volume)一样，这意味着测定了相同数目的颗粒。

如表5所示进行装载反应，并温育过夜。将样品在14000xg下离心10分钟，并评价漂浮在水层上的游离萜的外观和小球中包封萜的颜色。结果示于表5的两个右手栏中。将由不存在游离萜证明被颗粒吸收的萜的最大体积记录为被吸收的萜乳液的体积。

表5

试 管	颗粒	浓度 mg/ ml	μl	萜乳液	体 积 μl	10％Tween 80 μl	游离 萜	颜 色
									1	Baker’s	250	500	L-香芹酮	125	375	-	W
2	Nutrex	163	500	L-香芹酮	125	375	-	W
									3	SAFMannan	234	500	L-香芹酮	125	375	-	W
4	Nutricepts	99	500	L-香芹酮	125	375	+	W
									5	Levacan	217	500	L-香芹酮	125	375	+	W
6	WGP	121	500	L-香芹酮	125	375	+	W
									7	Baker’s	250	500	柠檬醛	100	375	-	Y
8	Nutrex	163	500	柠檬醛	100	375	-	Y
									9	SAFMannan	234	500	柠檬醛	100	375	-	W
10	Nutricepts	99	500	柠檬醛	100	375	+	Y
									11	Levacan	217	500	柠檬醛	100	375	+	int
12	WGP	121	500	柠檬醛	100	375	+	int
									13	-	-	-	L-香芹酮	125	875	+	-
14	-	-	-	柠檬醛	100	900	+	Y

W＝白色；Y＝黄色；sl＝轻微；int＝中等

从该结果可以得到以下结论：

-具有低脂质含量的纯化的颗粒在吸收萜方面效率较低。

-纯度较低的颗粒在吸收萜方面更有效。

-当包封在SAF-Mannan^TM中时，没有形成柠檬醛的黄色降解产物。

-根据所测试的单一萜水平的定性装载，SAF Mannan^TM似乎最佳，Nutre^TM第二，而Baker′s第三。

实施例6-萜装载到不同类型的颗粒中的动力学和不同温育温度

采用以下方案比较不同类型的酵母颗粒的装载动力学。

-通过将7g萜和3ml 3.3％Tween-80一起超声来制备L-香芹酮和柠檬醛乳液。

-通过将1ml 10％Tween-80在10ml水中超声来制备1％Tween-80溶液。

-通过将5g发面YP与20ml 1％Tween-80混合来制备发面YP。

-通过混合2g Nutrex^TM YGP和20ml 1％Tween-80来制备Nutrex^TMYGP悬浮液。

-通过混合2g SAF Mannan^TM和20ml 1％Tween-80来制备SAFMannan^TM悬浮液。

如表6中所示进行装载反应。

在室温或37℃下将反应物温育1、3、6、9和24小时。在温育后，将样品在14000xg下离心10分钟，并评价漂浮在水层上的游离萜的外观。结果示于表6的两个右手栏中。将由不存在游离萜证明被所述颗粒吸收的萜的最大体积记录为被吸收的萜乳液的体积。在24小时时评价包封小球的颜色。

表6：

试管	T ℃	颗粒	浓度 mg/ml	μl	萜乳液	体积 μl	1％Tween 80	游离萜					颜色
														1	Rt	Baker’s	250	3500	L-香芹酮	788	2712	1	3	6	9	24	W
2	37	Baker’s	250	3500	L-香芹酮	788	2712	+	-	-	-	-	W
														3	Rt	Nutrex	100	3500	L-香芹酮	1050	2450	+	-	-	-	-	W
4	37	Nutrex	100	3500	L-香芹酮	1050	2450	+	-	-	-	-	W
														5	Rt	SAF	100	3500	L-香芹酮	1050	2450	+	-	-	-	-	W
6	37	SAF	100	3500	L-香芹酮	1050	2450	＜+	-	-	-	-	W
														7	Rt	Baker’s	250	3500	柠檬醛	525	2975	＜+	-	-	-	-	Y
8	37	Baker’s	250	3500	柠檬醛	525	2975	+	-	-	-	-	VY
														9	Rt	Nutrex	100	3500	柠檬醛	788	2712	+	-	-	-	-	Y
10	37	Nutrex	100	3500	柠檬醛	788	2712	+	-	-	-	-	VY
														11	Rt	SAF	100	3500	柠檬醛	788	2712	+	-	-	-	-	W
12	37	SAF	100	3500	柠檬醛	788	2712	+	-	-	-	-	W

白色，W；黄色，Y；极黄，VY；室温，Rt

从表6中所示的结果和其它观察可以得到以下结论：

·萜装载反应花费1至3小时。

·萜装载在37℃下比在室温下更迅速地发生。

·由于两个原因，SAF Mannan^TM似乎是更优选的颗粒：

-更快和更完全地吸收两种萜。

-在37℃下24小时后，由不存在柠檬醛降解特征性的黄色证明柠檬醛在装载时保持稳定。

实施例7-筛选多种单一萜和萜组合的颗粒装载

采用以下方案比较发面YP与SAF Mannan^TM的装载效率。

如下制备萜乳液：

-L-香芹酮-4.5g L-香芹酮于1.5ml 3.3％Tween-80中。

-柠檬醛-4.5g柠檬醛于1.5ml 3.3％Tween-80中。

-百里酚/L-香芹酮混合物(T/L)-2.25g百里酚和2.25g L-香芹酮于1.5ml 3.3％Tween-80中。

-丁子香酚-4.5g丁子香酚于1.5ml 3.3％Tween-80中。

-香叶醇-4.5g香叶醇于1.5ml 3.3％Tween-80中。

-柠檬醛/L-香芹酮/丁子香酚混合物(C/L/E)-1.5g柠檬醛、1.5g L-香芹酮、1.5g丁子香酚于1.5ml 3.3％Tween-80中。

将萜∶水∶表面活性剂比率为0.75∶0.3∶0.05的乳液用于这些实验中。

如表7和8所示，在室温下将增加体积的萜乳液与250mg/ml发面YP或250mg/ml SAF Mannan^TM混合过夜。将样品在14000xg下离心10分钟，并评价漂浮在水层上的游离萜的外观。将由不存在游离萜证明被发面YP或SAF Mannan^TM吸收的萜乳液的最大体积记录为被吸收的萜乳液的体积。记录小球中包封萜的颜色。表7和8中的结果显示，所有单一萜和萜组合都有效地装载到发面YP或SAF Mannan颗粒中。

表7-不同萜和萜混合物的发面YP装载评价

试管	Baker (μl)	萜乳液	体积 (μl)	1％Tween-80 (μl)	游离萜	颜色
							1	500	-	-	500	-	W
2	500	L-香芹酮	15	485	-	W
							3	500	L-香芹酮	37.5	462.5	-	W
4	500	L-香芹酮	7	425	+/-	W
							5	500	L-香芹酮	112.5	387.5	+/-	W
6	500	L-香芹酮	150	350	+	W
							7	500	L-香芹酮	225	275	+	W
8	500	L-香芹酮	450	50	++	W
							9	500	柠檬醛	15	485	-	Y
10	500	柠檬醛	37.5	462.5	-	Y
							11	500	柠檬醛	75	425	-	Y
12	500	柠檬醛	112.5	387.5	+/-	Y
							13	500	柠檬醛	150	350	+	Y
14	500	柠檬醛	225	275	+	Y
							15	500	柠檬醛	450	50	+	Y
16	500	T/L	15	485	-	W
							17	500	T/L	37.5	462.5	-	W
18	500	T/L	75	425	-	W
							19	500	T/L	112.5	387.5	+/-	W
20	500	T/L	150	350	+	W
							21	500	T/L	225	275	+	W
22	500	T/L	450	50	+	W
							23	500	丁子香酚	15	485	-	W
24	500	丁子香酚	37.5	462.5	-	W
							25	500	丁子香酚	75	425	-	W
26	500	丁子香酚	112.5	387.5	+/-	W
							27	500	丁子香酚	150	350	+	W
28	500	丁子香酚	225	275	+	W
							29	500	丁子香酚	450	50	+	W
30	500	香叶醇	15	485	-	W
							31	500	香叶醇	37.5	462.5	-	W
32	500	香叶醇	75	425	-	W
							33	500	香叶醇	112.5	387.5	+	W
34	500	香叶醇	150	350	+	W
							35	500	香叶醇	225	275	+	W
36	500	香叶醇	450	50	+	W

37	500	C/L/E	15	485	-	Y
							38	500	C/L/E	37.5	462.5	-	Y
39	500	C/L/E	75	425	-	Y
							40	500	C/L/E	112.5	387.5	+/-	Y
41	500	C/L/E	150	350	+	Y
							42	500	C/L/E	225	275	+	Y
43	500	C/L/E	450	50	+	Y

表8-不同萜和萜混合物的SAF Mannan装载评价

试管	SAF (μl)	萜乳液	体积	1％Tween-80 (μl)	游离萜	颜色
							1	500	-	-	500	-	W
2	500	L-香芹酮	15	485	-	W
							3	500	L-香芹酮	37.5	462.5	-	W
4	500	L-香芹酮	75	425	-	W
							5	500	L-香芹酮	112.5	387.5	-	W
6	500	L-香芹酮	150	350	+/-	W
							7	500	L-香芹酮	225	275	+/-	W
8	500	L-香芹酮	450	50	+	W
							9	500	柠檬醛	15	485	-	W
10	500	柠檬醛	37.5	462.5	-	W
							11	500	柠檬醛	75μl	425	-	W
12	500	柠檬醛	112.5	387.5	-	W
							13	500	柠檬醛	150	350	+/-反转的	W
14	500	柠檬醛	225	275	+反转的	W
							15	500	柠檬醛	450	50	+反转的	W
16	500	T/L	15	485	-	W
							17	500	T/L	37.5	462.5	-	W
18	500	T/L	75	425	-	W
							19	500	T/L	112.5	387.5	-	W
20	500	T/L	150	350	+/-	W
							21	500	T/L	225	275	+	W
22	500	T/L	450	50	+	W
							23	500	丁子香酚	15	485	-	W
24	500	丁子香酚	37.5	462.5	-	W
							25	500	丁子香酚	75	425	-	W
26	500	丁子香酚	112.5	387.5	+/-	W

27	500	丁子香酚	150	350	+	W
							28	500	丁子香酚	225	275	+	W
29	500	丁子香酚	450	50	+	W
							30	500	香叶醇	15	485	-	W
31	500	香叶醇	37.5	462.5	-	W
							32	500	香叶醇	75	425	-	W
33	500	香叶醇	112.5	387.5	-	W
							34	500	香叶醇	150	350	-	W
35	500	香叶醇	225	275	-反转的	W
							36	500	香叶醇	450	50	+反转的	W
37	500	C/L/E	15	485	-	W
							38	500	C/L/E	37.5	462.5	-	W
39	500	C/L/E	75	425	-	W
							40	500	C/L/E	112.5	387.5	-	W
41	500	C/L/E	150	350	-	W
							42	500	C/L/E	225	275	+/-	W
43	500	C/L/E	450	50	+	W

反转的＝相反转-固体漂浮在顶部-不含游离油；W＝白色；Y＝黄色

从该结果得到以下观察：

-所有萜看来都装载入发面YP和SAF Mannan中。

-SAF Mannan的萜装载容量高于发面YP的。

-萜的两和三向混合物看来也被有效地装载。

-萜丁子香酚的密度看来高于颗粒和水的，因为发现它与小球缔合。

-对于SAF Mannan，更高的装载水平和更轻的颗粒导致在柠檬醛和香叶醇的情况下装载颗粒漂浮在水层的表面上。

-SAF Mannan保护柠檬醛不被氧化，但发面YP没有这种保护。

确定每种颗粒类型的近似最大装载，并示于下面的表9和10中。装载百分比表示装载的萜量与存在的颗粒量的比率(重量比)。

表9-在发面YP中的最大萜装载

萜	装载体积μl	装载％w/w
			L-香芹酮	37.5	33.3
柠檬醛	75	67％
			百里酚/L-香芹酮1∶1	75	67％
丁子香酚	75	67％
			香叶醇	75	67％
柠檬醛/L-香芹酮/丁子香酚(1∶1∶1)	75	67％

表10-在SAF Mannan中的最大萜装载

萜	装载体积μl	装载％w/w
			L-香芹酮	112.5	100％
柠檬醛	150	133％
			百里酚/L-香芹酮1∶1	112.5	100％
丁子香酚	112.5	100％
			香叶醇	150	133％
柠檬醛/L-香芹酮/丁子香酚(1∶1∶1)	150	133％

实施例8-评价在水乳液和包封萜制剂中的萜稳定性

通过观察柠檬醛制剂的黄色氧化产物形成来评价萜稳定性。如表5-8的右手栏中所示，柠檬醛乳液和柠檬醛包封发面YP随时间而黄色不断增加。但是，在SAF Mannan^TM中包封柠檬醛增加柠檬醛稳定性，这由黄色随时间减少或不存在黄色证明。

实施例9-在最少量的水中装载萜

进行以下方案评价如下可能性，即可以在极高酵母颗粒(YP)固体水平下将萜装载和包封到YP中，以允许将装载制剂直接挤出到流化床干燥器中。确定完全水化SAF Mannan^TM颗粒的最小水量为3.53g水/g固体。这定义了所述颗粒的流体力学体积(HV)或水吸收容量。在这样的水量下，水化颗粒具有硬面团的稠度，其是触变性的，即像蛋黄酱一样剪切稀化。添加水至超过HV 40％导致可流动的稠糊。以3 X HV的水进行以上实施例中所用的标准反应。

进行一系列萜(L-香芹酮)装载反应，保持颗粒∶萜∶Tween(1∶0.44∶0.04)的比率不变，并将系统中的水量从HV(3.53g)变为HV+40％水(4.92g)。对照是标准装载系统，其使用3 X HV的水、仅颗粒和仅萜的反应。在温育过夜后，用显微镜评价混合物样品的游离萜和吸收到所述颗粒中的萜的证据，并通过评价15分钟内在反转试管中的流动来评价材料流动性。此外，通过用5 X HV水化反应混合物，涡旋以使颗粒完全分散并离心以沉积颗粒包封的萜，来评价游离油的存在。结果示于表11和图7至12中。图7至12显示以下试管的装载结果：

-图7-试管3

-图8-试管5

-图9-试管6

-图10-试管8

-图11-试管10

-图12-试管11

表11

试管	SAF g	萜乳液	重量(g)	水(g)	游离萜	流动性
							1	-	L-香芹酮	4.64	4.5	+	+
2	1	-	-	8.0	-	+
							3	1	L-香芹酮	4.64	4.5	-	+
4	1	L-香芹酮	4.64	-	-	-
							5	1	L-香芹酮	4.64	0.17	-	-
6	1	L-香芹酮	4.64	0.35	-	-
							7	1	L-香芹酮	4.64	0.52	-	轻微
8	1	L-香芹酮	4.64	0.7	-	中等
							9	1	L-香芹酮	4.64	0.87	-	高
10	1	L-香芹酮	4.64	1.05	-	高
							11	1	L-香芹酮	4.64	1.39	-	高

表11和图7至12中所示的结果证明，在所评价的所有水比率下都发生萜装载和包封到所述颗粒中。令人惊讶地，即使在使用最小量的水水化所述颗粒的具有硬面团的稠度的反应物中进行装载反应，也发生等价的装载。用显微镜观察到不存在游离萜(图7至12)，并且萜在上清液中的水平较低，这由所述上清液相对于仅萜对照的显著稠度降低证明。

这些结果扩展了我们对将萜装载到中空葡聚糖颗粒中的条件的理解。在装载过程中可以使用最小体积的水来水化所述颗粒，这种适应性将允许在反应混合物是可延展面团样稠度的条件下，使用标准食品级扫描曲面揉面机(swept surface dough mixer)装载所述萜。装载着高固体萜的最终混合物的稠度适于直接挤出以形成用于流化床干燥的面条和小球。

放大以此方式的生产的合适的设备需要：

-Gaulin均质器或等价物以产生稳定的萜乳液。

-扫描曲面揉面槽。

-挤出机。

-流化床干燥器。

实施例10-评价间充水胶体(interstitial hydrocolloid)试剂帮助包封萜成分 的干燥中空葡聚糖颗粒再水化时分散

采用以下方案评价间充水胶体增加干燥中空葡聚糖颗粒包封萜制剂再水化时分散的效果。

-SAF Mannan^TM颗粒

-0.1％Tween 80

-L-香芹酮

-黄原胶-1％w/v于0.1％Tween 80中。

如表12所示，通过温育1.1g L-香芹酮乳液(L-香芹酮∶水∶表面活性剂比率为0.75∶0.3∶0.05)与1g SAF Mannan和含有0-1％黄原胶的4.4g 0.1％Tween 80，将L-香芹酮装载到SAF Mannan中，评价提高黄原胶水平对干燥中空葡聚糖颗粒包封的L-香芹酮在水中分散的影响。

表12

试 管	SAF g	L-香芹酮乳 液(g)	0.1％Tween-80 (g)	1％黄原胶 (g)	视觉观察
						1	1	1.1	4.4	0	不均匀的大块
2	1	1.1	4.33	0.07	均匀悬浮液
						3	1	1.1	4.26	0.14	均匀悬浮液
4	1	1.1	4.12	0.28	均匀悬浮液
						5	1	1.1	3.85	0.55	均匀悬浮液
6	1	1.1	3.3	1.1	更细的均匀悬浮液
						7	1	1.1	2.2	2.2	更细的均匀悬浮液
8	1	1.1	0	4.4	更细的均匀悬浮液

表12和图13至20中的结果证明，在干燥颗粒包封的萜的过程中包含高分子量水胶体有助于微粒水化和分散成均匀悬浮液。这些水胶体试剂的其它实例是麦芽糖糊精、藻酸盐等。

还可能值得做的是包括小球包衣以增加装载的萜的稳定性，并提供萜的持续释放。

实施例11-评价萜乳液、新鲜发面YP和SAF Mannan包封的萜和冷冻干 燥的发面YP和SAF Mannan包封的萜对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的最 小抑制浓度(MIC)

下面的表13显示为比较新鲜的和冷冻干燥的中空葡聚糖颗粒包封的萜制剂而实施的方案的结果。还测试了简单的萜乳液，并显示结果用于比较。

表13  MICμg/ml萜

萜	乳液	Bakers		SAF Mannan
						新鲜	冷冻干燥	新鲜	冷冻干燥
		L-香芹酮	3.75	0.1	＞0.04					0.01	＞0.02
柠檬醛	0.94					0.01	0.05	0.01	＞0.03
		L-香芹酮/百里酚	0.23	0.01	0.03					0.01	0.05
丁子香酚	0.12					0.03	0.05	0.01	0.05
		香叶醇	0.47	0.03	0.06					0.02	＞0.03
L-香芹酮/柠檬醛/丁子香酚	0.23					0.03	0.06	0.02	0.05

从以上结果得出的结论是：

-将萜装载到中空葡聚糖颗粒中看来提高萜MIC。一般而言，新鲜萜乳液的功效比包封制剂低约4-375倍。

-装载到SAF Mannan^TM中的萜表现稍好于装载到发面YP中的。

-新鲜装载的萜组合物表现稍好于冷冻干燥的组合物(在冷冻干燥过程中可能会从干燥组合物中挥发掉一些萜)。

-水乳液中的萜稳定至少3周。

实施例12-中试规模的包封萜对抗金黄色葡萄球菌的功效

用中试规模生产的包封萜和混合物对金黄色葡萄球菌进行抗微生物测定。含有新鲜和冷冻干燥的包封萜样品的材料都显示强抗微生物活性。结果总结于下表14中。

以2.5kg规模将萜包封到SAF-Mannan^TM中。用100g Tween-80和8L水溶解和匀化三种萜(香叶醇275g；丁子香酚385g；和百里酚，440g)的混合物。添加SAF-Mannan^TM(2.5Kg)以形成均匀的悬浮液。使所述悬浮液通过Gaulin均质器以减小颗粒尺寸，并将均匀混合物在室温下温育过夜。取出包封萜的样品，并贮存在室温下。然后在盘中将剩余的包封萜冷冻并冷冻干燥。将冷冻干燥的包封萜粉末研磨并贮存在室温下。

表14

材料	MIC(ppm)
		金黄色葡萄球菌测定
YGP空壳对照	＞2500
		中试-新鲜	100
中试-冷冻干燥	100

在中试规模下，以萜重量计，新鲜和冷冻干燥的样品具有相等的功效。

基于大规模制备的结果，冷冻干燥制剂对金黄色葡萄球菌的预期有效剂量为200ppm(所述制剂含有约50重量％的萜)或0.2g/L水。

实施例13-包封萜对抗分枝杆菌的功效

如下制备萜乳液：

-柠檬醛-4.5g柠檬醛于1.5ml 3.3％Tween-80中。

-L-香芹酮/丁子香酚-2.25g L-香芹酮和2.25g丁子香酚于1.5ml3.3％Tween-80中。

-丁子香酚-4.5g丁子香酚于1.5ml 3.3％Tween-80中。

-香叶醇-4.5g香叶醇于1.5ml 3.3％Tween-80中。

-香叶醇/百里酚混合物-2.25g香叶醇和2.25g百里酚于1.5ml 3.3％Tween-80中。

-对照乳液-6ml 1％Tween-80。

将SAF-Mannan^TM(2.5g)与3ml每种乳液和7ml 1％Tween 80混合，并温育过夜，以包封所述萜和萜混合物。将包封萜制剂冷冻并冷冻干燥，并将粉末研磨成细粉。测定包封萜的悬浮液(25mg/ml)和未包封萜乳液对抗分支杆菌的抗菌活性。结果列于表15中。

表15

材料	MIC(ppm)
		分支杆菌测定
YGP柠檬醛FD	250
		YGP L-香芹酮/丁子香酚FD	500
YGP丁子香酚FD	500
		YGP香叶醇FD	125
YGP香叶醇/百里酚FD	62.5
		对照乳液	＞1000
柠檬醛乳液	35
		L-香芹酮/丁子香酚乳液	53
丁子香酚乳液	105
		香叶醇乳液	70
香叶醇/百里酚乳液	53

FD＝(冷冻干燥)

实施例14-包封萜的杀线虫活性

根据上述程序制备酵母细胞壁包封的柠檬醛制剂。中空葡聚糖颗粒含有17.5％柠檬醛，并且所述颗粒在测试制剂中的浓度为1000ppm。这意味着萜的有效浓度为175ppm。

将1.0ml测试制剂添加到0.1至0.15ml含有根结线虫的水中。向所述线虫中添加1.0水作为对照。

如前所述进行观察，并且在24和48小时后评价杀伤率(即死亡百分比)。下表16中所示的结果是2批结果的平均值。

表16-包封萜溶液(17.5％柠檬醛，1000ppm)的杀线虫活性

	杀伤率
			时间	测试	对照
24h	45	17
			48h	56	21

结果证明，当颗粒浓度为1000ppm(相当于柠檬醛浓度仅为175ppm)时，包封萜的中空葡聚糖颗粒有效地杀死根结线虫。

因此，包封萜的中空葡聚糖颗粒作为杀线虫剂看来与溶液中的萜或与表面活性剂一同的萜同样有效。尽管萜被包封在所述颗粒中，但仍然保留了杀线虫活性。可以预期，萜在所述中空葡聚糖颗粒中的更高浓度或者所述颗粒的更高浓度会导致甚至更高的杀伤率，就像在溶液中的萜或与表面活性剂一同的萜的情况一样。

实施例15-包封和未包封萜的杀真菌性质

进行以下方案评价各种萜组合的杀真菌性质，并比较包封和未包封组合物的功效。

评价不同萜制剂的杀真菌性质

使用微量滴定板测定评价多种萜化合物对抗不同致病微生物的最小抑制浓度(MIC)。下文更详细地描述用于每种微生物的测定，但重要的一般特征如下。

测定使用两个温育期以区别抑制(static)活性(生长抑制)和杀灭(杀死)活性。第一个温育期允许评价生长抑制，但不能区别仅仅阻止细胞生长和杀死细胞。第二个温育期的目的是允许存活于萜暴露的任何休眠或受抑制的细胞有足够的时间和养分以增殖。被真菌抑制作用抑制的任何细胞都应在第二个温育期内反应并生长，而被萜暴露杀死的细胞则不会在新鲜培养基中生长。

用总共31种不同的萜制剂进行初始筛选试验(表17)。用具有强活性的萜制剂子集重复这些试验(表18)。

还测试了包封在葡聚糖颗粒中的比率为2∶1∶2的香叶醇、丁子香酚和百里酚萜组合；该样品称为YP-GET。还测试了相同比率的未包封香叶醇、丁子香酚和百里酚组合，用于与包封形式比较。

使用酿酒酵母的MIC测定

向96孔微量滴定板的每个孔中添加100μL酿酒酵母等分试样(5×10⁵个细胞/mL，在YPD生长培养基中)。将每板的至少一栏指定为仅细胞对照，不向这些孔中添加萜。向其余栏的第一行添加不同萜制剂的等分试样(100μL)，并通过从一行向下一行转移100μL来进行系列2倍稀释，总共7次。最后，为了保证所有孔中含有相同的体积，从最后一行弃去100μL。在30℃下将微量滴定板静止温育过夜。

在温育后，评价板的生长抑制(由缺少浊度证明)。通过显微镜视觉证明生长抑制(≥75％)。

一旦确定每种制剂的MIC，就将微量滴定板离心，并且从不混浊的孔中除去用过的培养基。将细胞再悬浮于新鲜培养基(100μL)中，并在30℃下将所述板再温育过夜。如前进行生长抑制的评价。

使用混合接种物的MIC测定

如关于酿酒酵母所述，在96孔微量滴定板中系列稀释不同的萜制剂。然后将熔化的YPD琼脂和5μL混合接种物(从发霉的葡萄叶制成浓度为5×10⁴个细胞/mL)一起添加到孔中。将所述板在室温下静止温育24小时，并通过显微镜视觉评价孢子生长。

由于使用固体培养基，所以不能进行在新鲜培养基中的第二个温育期。

使用禾生毛盘孢的MIC测定

如关于酿酒酵母所述，在96孔微量滴定板中系列稀释不同的萜制剂。将禾生毛盘孢(300个孢子/孔)添加到经稀释的萜中，并将所述板在室温下静止温育48小时。通过显微镜视觉评价孢子萌发和生长。

一旦确定每种制剂的MIC，就将微量滴定板离心，并从生长受抑制的孔中除去用过的培养基。将孢子再悬浮于新鲜培养基(100μL)中，并将所述板在室温下再温育过夜。如前进行生长抑制的评价。

表17-从31种萜制剂的初始筛选中获得的MIC和杀真菌MIC值

	萜制剂a	酿酒酵母		混合微生物		禾生毛盘孢
								MIC	杀灭MIC	MIC	杀灭MIC	MIC	杀灭MIC
		1	香叶醇(G)	500	500	250	NT							63	63
2	丁子香酚(E)							500	500	125	NT	125	125
		3	百里酚(T)	250	250	63	NT							63	500
4	柠檬醛							250	250	63	NT	125	63

	(C)
								5	L-香芹酮(L)	250	500	63	NT	125	125
6	GE	1000	2000	125	NT	63	250
								7	GT	500	500	250	NT	125	63
8	GC	500	500	125	NT	125	250
								9	GL	500	500	125	NT	125	125
10	ET	500	500	125	NT	125	125
								11	EC	250	1000	31	NT	125	125
12	EL	500	1000	125	NT	125	125
								13	TC	500	500	16	NT	63	63
14	TL	500	1000	63	NT	63	63
								15	CL	500	500	≤8	NT	63	63
16	GET	500	500	23	NT	94	94
								17	GEC	250	500	94	NT	94	94
18	GEL	500	1000	188	NT	188	188
								19	GTC	500	500	47	NT	188	188
20	GTL	500	1000	94	NT	94	94
								21	GCL	250	500	94	NT	47	47
22	ETC	125	250	188	NT	94	94
								23	ETL	500	1000	≤12	NT	94	94
24	ECL	500	1000	≤12	NT	188	188
								25	TCL	500	1000	23	NT	94	375
26	GETC	500	1000	125	NT	250	500
								27	ETCL	500	1000	63	NT	125	125
28	GTCL	500	1000	125	NT	250	250
								29	GECL	500	1000	≤16	NT	500	500
30	GETL	1000	1000	125	NT	500	250
								31	GECTL	1000	1000	78	NT	625	625
									GET(2∶1∶2比率，w/w/w)	NT	NT	98	NT	78	156
	YP-GET(G∶E∶T比例为2∶1∶2，w/w)b	98	391	98	NT	20	20

NT，未测试；YP-GET，酵母包封的GET制剂

^a除非另有说明，萜组合以1∶1(w/w)的比率混合

^b按萜含量计算的MIC

表18-重复测定以确定MIC和杀真菌MIC值

萜制剂a(按编号)	酿酒酵母		从发霉的葡萄叶分离的混合微生物		禾生毛盘孢
							MIC	杀灭MIC	MIC	杀灭MIC	MIC	杀灭MIC
	T(3)	NT	NT	63	NT	NT							NT
L(5)							NT	NT	250	NT	NT	NT
	GE(6)	NT	NT	NT	NT	125							500
EC(11)							125	250	NT	NT	NT	NT
	TC(13)	NT	NT	250	NT	63							250
TL(14)							NT	NT	500	NT	250	500
	CL(15)	NT	NT	500	NT	125							500
GET(16)							NT	NT	375	NT	188	375
	GEC(17)	250	500	NT	NT	NT							NT
GCL(21)							250	500	NT	NT	375	750
	ETC(22)	125	250	NT	NT	94							188
ETL(23)							NT	NT	375	NT	188	750
	ECL(24)	NT	NT	750	NT	NT							NT
TCL(25)							NT	NT	750	NT	94	375
	ETCL(27)	NT	NT	500	NT	63							500
GECL(29)							NT	NT	1000	NT	NT	NT
	YP-GET (G∶E∶T比率为2∶1∶2，w/w)c	98	195	NT	NT	39							156

NT，未测试；YP-GET，酵母包封的GET制剂

说明：样品平行测定两次。如果两份样品获得不同的值，则报告较高的值。

没有两份样品差别大于一个2倍稀释

^a除非另有说明，萜组合以1∶1(w/w)的比率混合

^b1×10⁴个细胞/mL贮备悬浮液

^c按萜含量计算的MIC

混合接种物

使用混合接种物存在许多问题。制剂的孢子含量变化导致测定间的重复性较差，并且污染微生物的生长妨碍孢子萌发的评价。单细胞酵母种类在掩盖孢子生长方面特别成问题。虽然不能从该测定获得精确的数据，但也观察到了萜的抑制作用。

与初始筛选测定相比，在评价重复测定时鉴别孢子更容易，因为使用了更大量的孢子(约50个孢子/孔相对约10个孢子/孔)。因此，在重复测定过程中获得的数据可能提供更可靠的MIC评价。

禾生毛盘孢

与初始筛选测定相比，从重复测定获得了通常更高的MIC值，这可能是因为：

·使用放置1周的萜溶液

·使用新鲜制备的孢子，与初始筛选测定中使用的孢子相比，它们具有更高的存活力，因此可能更难杀死。

比较作为游离乳液的萜制剂和包封在中空葡聚糖颗粒中的相同萜制剂：酿酒酵母MIC测定

向96孔微量滴定板的每个孔中添加YPD生长培养基(100μL)，并向第一行添加不同萜制剂的等分试样，使该行中的总体积达到200μL。将一栏指定为仅细胞对照，并且不向这些孔中添加萜。通过从一行向下一行转移100μL来进行系列2倍稀释，总共7次。最后，为了保证所有的孔中含有相同的体积，从最后一行弃去100μL。然后向每个孔中添加100μL酿酒酵母等分试样(5×10⁵个细胞/mL，在YPD生长培养基中)，并用微量滴定板计数器测量每个孔在620nm的吸光度(A₆₂₀)。在30℃下将微量滴定板静止温育过夜。

在温育后，再次测量A₆₂₀，并评价板的生长抑制(≥75％)。通过显微镜视觉证明生长抑制。

对于游离萜乳液，一旦确定了每种制剂的MIC，就将微量滴定板离心，并从生长受抑制的孔中除去用过的培养基。将细胞再悬浮于新鲜培养基(100μL)中，并将所述板在30℃下再温育过夜。如前进行生长抑制的评价。

MIC和杀真菌MIC结果总结于表19中。

结果

表19-从筛选31种萜制剂获得的对酿酒酵母的MIC和杀真菌MIC值

萜制剂a(编号)	酵母包封的制剂b，c		游离萜乳液
					MIC	杀灭MIC	MIC	杀灭MIC
	G(1)	111	NT	250					250
E(2)					131	NT	125	250
	T(3)	115	NT	125					250
C(4)					118	NT	125	250
	L(5)	254	NT	250					500
GE(6)					118	NT	250	500
	GT(7)	108	NT	125					250
GC(8)					113	NT	125	250
	GL(9)	117	NT	250					500
ET(10)					131	NT	125	250
	EC(11)	126	NT	125					250
EL(12)					129	NT	125	250
	TC(13)	59	NT	63					63
TL(14)					124	NT	63	125
	CL(15)	124	NT	125					125
GET(16)					119	NT	63	125
	GEC(17)	119	NT	125					250
GEL(18)					121	NT	125	125
	GTC(19)	115	NT	125					125
GTL(20)					119	NT	125	125
	GCL(21)	234	NT	125					125
ETC(22)					124	NT	125	125
	ETL(23)	123	NT	125					125
ECL(24)					63	NT	63	125
	TCL(25)	61	NT	125					500
GETC(26)					61	NT	63	250
	ETCL(27)	120	NT	63					125
GTCL(28)					124	NT	125	125
	GECL(29)	125	NT	125					125
GETL(30)					122	NT	125	250
	GECTL(31)	120	NT	125					250
	GET(2∶1∶2比率，w/w/w)	125d	NT	125					250
YP-GET(G∶E∶T比率为2∶1∶2，w/w)c					125	NT	125c	250c
	YP-ETC(E∶T∶C比率为1∶1∶1，w/w)	125	NT	125c					250c

NT，未测试；YP-GET，酵母包封的GET制剂；YP-ETC，酵母包封的ETC制剂

^a除非另有说明，萜组合以1∶1(w/w)的比率混合

^b除非另有说明，为酵母包封的制剂

^c按萜含量计算的MIC

^d未包封的乳液制剂

对于萜乳液和酵母包封的萜，MIC典型地≤125ppm，其中活性最强的制剂在约60ppm下抑制生长。从萜乳液获得的MIC值与从它们各自的酵母包封制剂获得的MIC值相似。当获得不同的值时，它们仅相差约一个2倍稀释。

在生长抑制MIC下，许多游离萜乳液都是杀真菌的，其中大多数在高2倍的浓度下显示杀真菌活性。

这些结果证明，包封在葡聚糖颗粒中的萜至少与未包封形式一样有效地杀死真菌。此外，所用的包封组合物可能具有降低的功效，因为它们已经在4℃下贮存了45天，并且具有约4重量％的次佳(sub-optimal)萜含量。

确定杀真菌活性的测定包括离心步骤，其通过在孔底部产生细胞小球而试图分离微生物细胞和生长培养基中的任何残余萜。然后将该小球再悬浮于新鲜培养基中，并在无萜存在下温育第二次。但是，离心步骤不能区分微生物细胞和酵母颗粒，因此当使用酵母包封的萜时，细胞小球还会含有装载萜的酵母颗粒。结果是，然后酵母颗粒和细菌细胞均被再悬浮于新鲜培养基中。

出于以下原因，认为这种方法学不影响在上述实验中获得的结果。

·在前面的实验中，使用萜乳液而不是装载萜的酵母颗粒，并且已清楚地显示了杀真菌活性。

·包封萜通过扩散被释放，并且在周围培养基中迅速达到包封萜浓度和释放萜浓度之间的平衡。因此，在离心和再悬浮于新鲜培养基中后，生长培养基中释放萜的浓度可能大大低于生长抑制活性所需要的浓度。

·当将杀真菌MIC孔的内容物铺到固体琼脂生长培养基上时，没有生长。当铺到固体生长培养基上时，任何残余的萜扩散通过大体积的琼脂板导致局部萜浓度太低以至于不引起生长抑制。因此，杀真菌MIC孔的内容物缺少生长必然是因为初始杀真菌活性。相反，当获得低于杀真菌MIC的MIC并且将MIC孔的内容物铺到固体琼脂生长培养基上时，观察到了生长，表明真菌抑制作用。

实施例16-制备用于田间试验的包封萜组合物

以下方案的目的是将萜组合物包封到中空葡聚糖颗粒中，用于随后的田间试验。

材料：

百里酚(由Alpha-Gamma Corporation供应)

丁子香酚(由Alpha-Gamma Corporation供应)

香叶醇(由Alpha-Gamma Corporation供应)

1％Tween-80(由Alpha-Gamma Corporation供应)

酵母细胞壁颗粒

黄原胶

酵母细胞壁颗粒以商品名Nutricell MOS 55得自Biorigin(Sao Paolo，Brazil)，并由Acucareira QuatáS.A，Usina Quatá，Quatá-Sao Paolo-Brazil-邮政编码19780 000生产。所述颗粒是喷雾干燥的酿酒酵母细胞壁提取物，是浅米色至茶色的自由流动粉末。

方案：以下方案适于1Kg颗粒，但可以简单地放大到更大的生产。

1.制备萜混合物一在玻璃烧瓶中混合375克香叶醇+525克丁子香酚+600克百里酚并搅拌。

2.通过在2加仑白色桶中混合62克Tween 80和6.2L水来制备6.2L1％Tween 80。混合以形成溶液。

3.将6.2克黄原胶添加到Tween溶液中并搅拌使溶解。

4.通过在白色桶中用polytron混合器混合1.5Kg萜混合物+6.2L 1％Tween 80/0.1％黄原胶来制备萜乳液。

5.添加1000克酵母细胞壁颗粒一用涂料混合器混合以形成均匀的悬浮液。

6.将步骤4的萜乳液添加到所述酵母细胞壁颗粒中，同时混合以形成稀蛋黄酱样稠度。

7.将萜混合物倾入罐中并温育过夜。

结果：获得包封在中空葡聚糖颗粒中的香叶醇、丁子香酚和百里酚，其为糊状物。通过常规喷雾干燥技术将所述糊状物容易地转化为干燥粉末。在以下方案中将所述糊状物称为“液体”组合物，而所述“粉末”指喷雾干燥形式。

实施例17-包封萜组合物对霜霉病的田间试验

在葡萄中，霜霉病由真菌葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)引起，其在世界范围内感染葡萄园，并且在作物产量和葡萄酒质量方面可以引起葡萄种植者的毁灭性损失。该真菌攻击葡萄树的果实和所有绿色部分，引起叶子枯萎以及花和浆果腐烂。该病害的表现为叶的上表面上的不规则浅黄色或黄绿色斑点，伴有密集的白-灰、棉花样真菌生长，其覆盖叶损伤的下面。浆果也可能被霜霉生长所覆盖，并且取决于感染时间，可能变成棕色并软化，或者可能根本不变软。霜霉病通过风和雨分散孢子而传播，并且感染需要潮湿的环境。在高湿度的环境中其特别成问题。推荐预防性措施来控制该病害，即早期施用杀真菌剂，然后以恰当的间隔重复施用。已经对一些处理产生了耐药性，虽然通过轮换使用不同的杀真菌剂可以使耐药性的发生最小化，但其仍然是个问题。

本试验的目的是调查作为液体或粉末(喷雾干燥)制剂供应的实施例16的包封萜制剂(YGP-GET)用于预防葡萄霜霉病的功效。

在Kir-Yianni葡萄园中，在位置20上标出每个覆盖0.1ha的四个相邻地块。

Kir-Yianni是35ha的葡萄园，海拔300m。其在北边和西边以混合橡木林为边界，且南面和东面是果园和葡萄园。

在施用所述萜制剂之前，已经用多种产品处理所有四个地块。在2004年6月26日，以0.5g/L或2g/L的剂量向所述四个地块中的两个喷雾萜粉末制剂(参见图21中的示意图)。用常规Bordeaux混料加可湿性硫处理第三个地块，而剩余地块不作处理。在随后的一周中监测每个地块中葡萄树的霜霉病病征。

在Kir-Yianni葡萄园的位置18上标出每个覆盖0.1ha的另外四个相邻地块。在施用所述萜制剂之前，已经用多种产品处理所有四个地块。在2004年6月26日，以1g/L或4g/L的剂量向所述四个地块中的两块喷雾萜液体制剂(图21)(说明：1g所述萜液体制剂的体积为1ml)。对于剩余两个地块，一个不作处理，而另一个在2004年6月28日喷雾Mikal^_，其是对霜霉病的常规处理。在随后的一周中监测每个地块中葡萄树的霜霉病病征。

对于两个位置，都以1200L/ha的比率施用所述萜产品。

记录葡萄的以下生长阶段：

-发芽，2004年3月26日

-开花，2004年6月1日

-转色期(veraison)，2004年8月6日

在转色期前进行研究施用。

2004年生长季节异常迟，并且一直都很潮湿。来自霜霉病的病害压力极高，灰霉病(botrytis)水平升高，而白粉病压力适中。粉末和液体YGP-GET制剂都贮存在室温下。没有使用特别的贮存条件。

比较产品的细节

粉末制剂试验：Bordeaux混料，由Manica Spa，Italy生产，由MoscholiosChemicals SA在希腊包装；可湿性硫。

液体制剂试验：Mikal^_(乙磷铝50％，灭菌丹25％)，由BayerCropScience生产，由Bayer Hellas SA在希腊分装。如下施用所述比较产品：在发芽前以15g/L的剂量施用一次，然后每年以6.5g/L的剂量再施用两次。全部三次施用所用的喷雾比率都为1000L/ha。

粉末制剂试验：在2004年6月26日施用Bordeaux混料(2g/L)和可湿性硫(2.2g/L)。

液体制剂试验：在2004年6月28日施用Mikal(3.2g/L)。

视觉检查葡萄树的霜霉病症状。该病害发作的标志是每片叶子上平均有两块油性斑点。认为阻止更多斑点出现的处理提供对抗霜霉病的有效保护。

结果

YGP-GET粉末制剂(喷雾干燥)

Bordeaux混合物的常规处理提供对抗霜霉病的良好保护。在对照葡萄树中观察到霜霉病的轻微症状。0.5g/L萜产品浓度没有提供保护，而2g/L萜产品浓度仅提供稍好于对照的保护。说明：因为近期的杀虫剂处理，在该位置的病害压力非常低。

在溶解粉末制剂时遇到了困难，因为其非常细，导致在空气中分散。这可能不利地影响产品的功效。

YGP-GET液体制剂

当以4g/L的剂量施用时，该萜产品提供对抗暴露树冠上的霜霉病的极好保护。1g/L剂量没有提供保护。在对照地块中观察到严重的霜霉病症状。

该液体制剂易于使用，并且具有舒适的气味。

讨论

因为霜霉病对作物产量和葡萄酒质量的影响，其可以引起葡萄种植者的毁灭性损失。对该病害的控制集中在预防上，因为一旦发生病害，感染就可以迅速传播。在喷雾粉末制剂的位置，YGP-GET在较低剂量(0.5g/L)下未表现出功效，而2g/L的剂量不如常规处理有效。在该位置，近期的杀虫剂施用导致病害压力低，这可能限制了该萜处理的表观功效。但是，认为萜产物的剂量低于2g/L是不够的。

在喷雾液体制剂的位置，4g/L的较高剂量水平提供对暴露树冠的极好保护。在该位置的过度植物生长导致对外部较新分枝的处理比对生长在树冠内部的较老分枝更有效。用该萜产品完全覆盖叶是有用的，因为该处理不是系统的。估计使用该萜处理，比用于常规系统处理的体积增加约30％会获得良好覆盖。

结论：

向叶施用浓度为4g/L的YGP-GET液体制剂高度有效地控制霜霉病。0.5g/L粉末和1g/L液体的较低浓度无效。

实施例18-包封萜组合物对白粉病的田间试验

葡萄的白粉病由真菌葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)引起，并且导致葡萄树生长减慢、果实质量降低和葡萄树的越冬性降低。在酿酒葡萄中，仅3％的浆果感染水平就可以影响葡萄酒质量。该病害的特征是叶子上真菌生长的白-灰小斑点，其扩大成白色粉状被覆。该真菌生长还可以发生在浆果上，浆果可能破裂。与需要温暖潮湿条件的霜霉病相反，白粉病是较干燥生长季节中的问题，因为它喜欢潮湿的荫凉区域但不是多雨的气候条件。推荐预防性措施以控制白粉病，其中早期施用杀真菌剂，然后以适当的间隔重复使用。

本研究的目的是调查施用YGP-GET组合物预防葡萄中的白粉病的功效。

在Kir-Yianni葡萄园中，在位置18上标出每个覆盖0.1ha的三个相邻地块。在2004年7月19日，以2ml/L的剂量向所述三个地块中的一个喷雾YGP-GET液体制剂，而一块不作处理。用Equesion(2.5g/L)、Alliete(0.9g/L)和Punch(0.075mL/L)的常规处理喷雾剩余地块(参见图22)。在随后的一周中监测每个地块中葡萄树的白粉病病征。

在Kir-Yianni葡萄园的位置20上标出每个覆盖0.1ha的另外三个相邻地块。在2004年7月20日，以2ml/L的剂量向所述三个地块中的一个喷雾YGP-GET液体制剂，而剩余两个地块不作处理(参见图22)。在随后的一周中监测每个地块中葡萄树的白粉病病征。

在两个位置上，所述地块以前都已用多种产品处理过，包括预先施用萜产品。

以1200L/ha的比率施用所有的萜处理以保证完全覆盖。

记录葡萄的以下生长阶段：

-发芽，2004年3月26日

-开花，2004年6月1日

-转色期，2004年8月6日

在转色期前进行研究施用。

2004年生长季节异常迟，并且一直都很潮湿。来自霜霉病的病害压力极高，灰霉病水平升高，而白粉病压力适中。

比较产品的细节

在位置20不使用比较产品。下面详述描述在位置18使用的比较处理。

Punch^_(氟硅唑40％)，DuPont。

在2004年7月19日，根据生产商的使用说明，以0.075ml/L的剂量施用Punch，作为白粉病的预防性处理。

附加产品的细节

在位置20不使用附加产品。下面详述描述在位置18使用的附加产品。

Equesion系统(噁唑酮菌22.5％加霜脲氰30％)

Alliete(乙磷铝80％)

在2004年7月19日，施用Equesion(2.5g/L)和Alliete(0.9g/L)，作为白粉病的预防性处理。根据生产商的使用说明确定剂量。

该比较产品和附加产品表示综合病害控制方案中的常规处理。

视觉检查葡萄树的白粉病症状。

结果：

位置18

在对照地块中约20％的梗和茎为黑色，表明中度感染白粉病。在常规处理地块和萜处理地块，所有的茎和梗都是绿色的，表明已经提供了足够的保护。

位置20

在任何地块中都没有观察到白粉病感染的迹象。

附加观察

在生长季节结束时，位置18和20的地块总的来说显示比该葡萄园的其余部分更少的病害压力。

由于葡萄树生长减慢、果实质量降低和葡萄树越冬性降低，白粉病感染引起种植者的重大损失。此外，低至3％的浆果感染水平就可以影响葡萄酒质量。对该病害的控制集中在预防上，因为一旦发生病害，感染就可以迅速传播。在本研究中，在位置18施用萜产品YGP-GET有效地防止白粉病感染，并且该萜产品表现出的控制水平与所述常规处理提供的控制水平相当。但是，因为不存在白粉病感染，所以来自位置20的结果是不确定的。这种没有感染可能是因为在该研究之前广泛施用了杀虫剂，其导致病害压力低。

在位置18和20的病害压力水平较低提示在这些位置较早施用萜处理可能在长期感染控制方面是有益的。

结论：

YGP-GET有效预防白粉病感染，其控制水平与常规处理提供的控制水平相当。

实施例18-包封萜组合物对白粉病的其它田间试验

该研究旨在进一步研究YGP-GET处理Grimson无核鲜食葡萄中白粉病的功效。

在2004年7月1日施用Cisteine时，由于疏忽而未对Tsigaras葡萄园(在Kir-Yianni葡萄园以南约80km)上的0.1ha小区进行处理。后来这小区中的葡萄树在叶、茎和葡萄上显示严重的白粉病症状。在2004年7月12日，以1200 l/ha的比率向该未处理小区喷雾3ml/L YGP-GET液体制剂，并向该葡萄园的其余部分喷雾比较产品Rogana。在24小时后评价葡萄树的白粉病症状。

在高lyre棚架系统中排列葡萄树。

比较产品的细节

Rogana(腈苯唑5％，binocap 16％)，由BASF(BASF Agro Hellas S.A.，Athens，Greece)生产。在2004年7月12日，将Rogana施用到Tsigaras葡萄园，作为白粉病的处理。根据生产商的使用说明确定剂量。

视觉检查葡萄树的白粉病症状。

结果

在施用YGP-GET之前，严重白粉病的症状明显。在施用YGP-GET后仅24小时，白粉病的白花就变成了黑色，表明有效的杀真菌活性。因为此时有效地停止了病害，所以没有施用进一步的处理。YGP-GET显示与常规处理相当的功效。

讨论：

在本研究中，使用YGP-GET快速并有效地处理已发生的白粉病感染。在施用后仅24小时，通过施用该萜产品就停止了以前严重的白粉病感染，其功效与常规处理相当。

从本研究获得的初步数据提示，除了显示预防能力外，YGP-GET还能有效处理已发生的真菌感染。

实施例19-包封萜组合物对白粉病的其它田间试验

背景和基本原理

在本试验中，作为使用有机产品控制白粉病的Tasmanian葡萄园(Frogmore Creek Vineyard，Hathaway Trading Pty Ltd，Box 187，RichmondTAS 7025，Australia)实验程序的一部分，研究YGP-GET的使用。本研究的目的是调查在有机控制Chardonnay葡萄园的白粉病中，施用YGP-GET的短期功效。

在该试验中，在2005年2月7日用萜产品YGP-GET处理葡萄树(Chardonnay品种)或不作处理(对照)。虽然受到以前有机处理的抑制，但试验前白粉病的严重性仍然处于商业上明显无法接受的水平，并且在6个活性处理小区和6个对照小区中同样严重。作物阶段为约E-L 33-34(转色期前)。

向6个Chardonnay小区喷雾YGP-GET(4mL/L)(液体制剂)，这些小区以前曾用牛奶处理过。用六个Chardonnay小区作为未处理的对照，但它们以前曾用油/乳清处理过。每个小区中葡萄树的数目典型地为7。

在本方案中所用的YGP-GET组合物的细节在表20中给出。

表20-在本研究中所用的制剂批次

原料混合物细节	重量，lbs	重量％
			香叶醇	323.52	6.88
丁子香酚	161.76	3.44
			百里酚	323.52	6.88
酵母颗粒	722.13	15.35
			黄原胶	3.17	0.07
聚山梨醇酯	3.17	0.07
			水	3166.62	67.32
总计	4703.89	100.00

在萜处理前3天和处理后3天评价白粉病的严重性。在每个小区中，任意选择20串葡萄(每个侧面(panel side)10串)，并将病害严重性评价为被活性霉菌菌落覆盖的串的面积百分比。不可能做进一步的评价，因为随后种植者又向整个试验区域喷雾了硫和基于植物油的喷雾助剂(SynertrolHorti Oil)。

待处理植物的数量/面积

测试产品：向6个Chardonnay小区(总计约42棵葡萄树)施用YGP-GET(4mL/L)，这些小区以前用牛奶处理过。

对照：不向作为对照的6个Chardonnay小区(总计约42棵葡萄树)使用处理，但它们以前用油/乳清处理过。

种植方法

地块B2的vitis vinifera(Chardonnay)葡萄树：用弓形藤条垂直投射定位。

种植排列

间距：行间距2.5m，葡萄树间距1.25m(行内)，每公顷3200棵葡萄树。行方向为从北向南。

树冠密度

使用点样方(point-quadrat)法表征试验前Chardonnay葡萄树的树冠密度(表21)。在2005年1月13日，在以前用硫处理或未处理的Chardonnay小区内，选择代表性的树冠部分进行测量。在每个处理前对6个小区各自进行十次测量(即经硫处理小区总计60次测量，未处理的对照小区总计60次测量)。此外，测量3个直立芽(每个小区)的节点长度和数目。

表21-试验前Chardonnay葡萄树的树冠密度

处理前	空隙(％)	叶层数目(LLN)	内部叶(％)	内部串(％)	节点的平均数目	平均芽长度(cm)
							未处理	12	1.5	22	26	21	110
硫	5	2.0	27	40	21	104
							最优值	20-40％	≤1.0-1.5	＜10％	＜40％	NA	NA

NA，不适用

一般条件

与未处理的对照相比，以前用实验材料处理这些小区抑制白粉病。但是，认为白粉病的水平在商业上是无法接受的，虽然其水平在经牛奶处理和经油/乳清处理小区中是相等的。

施用方法、剂量和方案

在2005年2月7日，用连接软管卷盘和泵的手工喷枪施用YGP-GET处理(4mL/L)，所述泵安在多用途车的平台上。以1500-1600kPa(200-230psi)的泵压力推进喷雾，递送约63mL/秒。使用常规处理的标准喷雾体积(约900L/ha)。

按被活性霉菌菌落覆盖的葡萄串的面积(％)估计，评价在每个小区中任意选择的20串(每个侧面10串)的白粉病的严重性。在2005年2月4日，即施用YGP-GET处理前3天评价病害严重性，并且在2005年2月10日，即施用萜后3天再次评价。

用反正弦转换转换数据以获得平均分离。

结果

在处理前，在6个要用萜处理的小区中，Chardonnay葡萄串的白粉病平均严重性(20.4％)与6个对照小区中的白粉病平均严重性(23.2％；表22)相似。基于这些数据的反正弦转换的统计分析发现，处理前病害的严重性没有显著性差异(表23)。

但是，在处理后三天，在YGP-GET处理的串上白粉病的平均严重性为23.8％，而对照上为37.8％(表22)。这些数据的反正弦转换显示萜处理的葡萄串有利地具有统计学显著性差异，其活性霉菌菌落覆盖的面积更小(p＝0.058；表23)。

表22.用YGP-GET处理前和处理后Chardonnay串的平均白粉病严重性(％)

2005年2月7日施用的处理	平均严重性
			2005年2月4日	2005年2月10日
	YGP-GET	20.4			23.8
无			23.2	37.8

表23.数据的反正弦转换后处理的统计分离

2005年2月7日施用的处理	平均严重性(SEM)
			2005年2月4日	2005年2月10日
	YGP-GET	0.2063(0.03857)			0.2411(0.04303)
无			0.2401(0.08534)	0.3954(0.07852)
		t＝0.36df＝10p＝0.726双侧检验：差异不显著			t＝1.72df＝10p＝0.058单侧检验：未处理＞经处理

讨论：

葡萄树感染白粉病可能由于对葡萄树的生长和耐久力以及果实和葡萄酒质量的有害影响而引起种植者的显著损失。在有机控制的葡萄园中，种植者正在寻找诸如元素硫的处理的替代。

本研究在Tasmania，Australia的有机葡萄园中调查了作为液体制剂的包封萜制剂(4mL/L)在控制白粉病方面的功效。虽然在施用萜前仅3周时已经使用了其它实验处理，但认为白粉病感染水平在商业上仍然是无法接受的。在用YGP-GET处理Chardonnay葡萄树后三天，被处理的葡萄上的白粉病的严重性就显著低于未处理对照上的。尽管未处理对照的感染严重性在处理前和处理后评价的6天内恶化，但是在经处理的葡萄树中其保持不变。因此，YGP-GET看来减缓了在处理前已经充分存在孢子化白粉病菌落的葡萄串上病害增加的速率。推测起来，菌落扩张受到抑制，虽然已有菌落在一定程度上仍在继续形成孢子。不可能进行更长期的功效评价，因为随后种植者向全部试验地块喷雾了硫。

这些鼓舞人心的结果证明了YGP-GET在控制葡萄树的白粉病方面的功效。

实施例20-包封萜组合物对灰霉病的田间试验

葡萄的灰霉病由灰色葡萄孢(Botrytis cinerea)，一种引起果实产量严重损失的常见真菌引起。浆果是主要的感染位置，但该病害也可以感染花和叶。起初，受感染浆果出现软化和水化，并且在高湿度和湿气条件下可能被灰色真菌生长所覆盖。受感染浆果随时间枯萎和脱落。灰霉病喜欢空气循环差的潮湿条件，且裂口或受损的浆果对感染的传播尤其敏感。对灰霉病的控制策略包括在生长季节中促进良好的空气循环、防止损伤和在合适的时间施用杀真菌剂。

本研究的目的是调查YGP-GET在处理葡萄灰霉病感染方面的功效。

不能用常规农药处理(在施用Teldor^_后3周)于2004年10月中旬Kir-Yianni葡萄园中出现的灰霉病，因为相关的再进入时间限制会阻止计划的收获。因此，在该葡萄园的位置7上标出两个相邻的0.1ha的小区，并在2004年10月12日，用4mL/L YGP-GET液体制剂处理这些小区中的一个，而另一个不作处理(参见图23)。在3天后收获作物，并确定每个小区的受感染浆果的比率(占总产量的重量百分比)。然后在发酵罐中混合来自经处理和未处理小区的未感染浆果。

在施用所述萜制剂前已经用多种产品处理过位置7，但仍然出现了灰霉病感染。

以1200l/ha的比率向葡萄树一次施用4ml/L YGP-GET液体制剂。

记录葡萄的以下生长阶段：

-发芽，2004年3月26日，

-开花，2004年6月1日

-转色期，2004年8月6日

-收获，2004年10月15日

本研究施用在收获前3天进行。

2004年生长季节异常迟，且一直很潮湿。来自霜霉病的病害压力极高，白粉病压力适中，而灰霉病水平升高。

此时施用YGP-GET以评价它对抗灰霉病感染的潜在功效，由于收获前的杀虫剂时间限制，不能用其它方式处理灰霉病感染。

在施用萜产品前，对位置的视觉评价显示灰霉病感染的迹象。在收获后，将浆果陈列在传送带上，并且在压碎前手工分离受感染浆果和未受感染浆果。计算每个小区的受感染浆果的比例，以占总产量的百分比(重量)表示。

结果

在施用YGP-GET前，对该位置的视觉评价显示灰霉病感染的迹象。在收获后(施用YGP-GET后3天)，经处理和未处理小区的受感染浆果的比例分别为13％和23％。测试面积不足以评价统计学显著性；但是，YGP-GET处理明显减慢了病害的进程。

将来自未处理和经萜处理小区的未受感染浆果混合不影响发酵。

讨论

对灰霉病的常规处理必须在收获前3周停止，给作物产量和质量的严重损害的发生留下了时间。开发可以施用到收获时或者与现有产品相比可以持续至接近收获的处理会导致作物产量和葡萄酒质量的显著改善，这对种植者将相当有益。在本研究中，在收获前仅3天用萜产品YGP-GET处理显著减慢已发生的灰霉病感染的进程，导致在经萜处理小区中受感染浆果的比例低于未处理小区中的。此外，虽然在接近收获时使用YGP-GET，但将经处理和未处理的葡萄组合不影响发酵。

这些结果提示，YGP-GET有效减少已发生的灰霉病感染的影响，并且可以在接近收获时使用，而没有对随后发酵的有害影响。

实施例21-评价包封萜处理已发生的霜霉病，随后评价葡萄质量

在25/08/04，以1000g/250升的比率施用组合物，进行YGP-GET试验。

对由于霜霉病而100％感染并遭受严重叶损失的Cabernet Sauvignon葡萄园进行喷雾。所有剩余叶都感染了霜霉病斑点，证据是叶上部有黄色斑点并且叶底部有绒毛生长；霜霉病的典型迹象。许多叶几乎完全变黄，表明严重感染。这种叶损失和感染通常延迟葡萄的成熟，并且在许多情况下葡萄根本不完全成熟到满足酿酒目的。

偶尔在葡萄树中观察到的完全未成熟(即直径约1cm的深绿色硬浆果，卵形)串表明该葡萄树可能在转色期前受到感染，可能是在开花期或更早。早期没有使用过铜(Bordeaux或碱式硫酸铜)。该葡萄园在以前收获时受到严重感染，以至于没有从Cabernet Sauvignon产出作物。去年的叶损失为100％，尽管曾试图用碳酸氢钾处理以接触杀死霜霉病，然后施用Stilbourin作为长期系统保护。

在19/09/04，摘下在本试验中处理的葡萄并压碎，对果汁进行以下观察(表24)：

表24

	对照	经处理	期望
				pH	3.28	3.30	3.3-3.5
TA	0.92	0.85	0.7-0.75
				Brix	17.4	18.7	20-22

这些结果表明，来自经处理葡萄树的葡萄比来自未处理葡萄树的葡萄更成熟。对葡萄本身的观察表明，未处理葡萄平均起来颜色更浅，一些葡萄具有透明的桃色/紫色/绿色，表明葡萄刚刚过转色期，而经处理的葡萄平均起来为深紫色且不透明，是完全或接近完全成熟的葡萄所典型的。

品尝这些葡萄显示，经处理的葡萄具有成熟Cabernet Sauvignon典型的更完全的葡萄味，而未处理的葡萄没有该完全的葡萄味。未处理的葡萄具有青苹果的涩味，表明苹果酸/酒石酸比率可能较高，不适于优良的酿酒。

将这些葡萄压碎并去茎，准备从这些葡萄制造葡萄酒，以证明这些葡萄的差异，并证明经处理的葡萄对于酿酒的适合性。葡萄种植者担心这种处理会影响葡萄酒的风味，但按照我的建议，他在施用YGP-GET后的那天品尝了经处理的葡萄，并且没有发现残存的味道或气味。

果汁的颜色进一步证明了经处理和未处理葡萄的差异。未处理葡萄的汁是浅绿色/无色的(有些像白葡萄酒果汁)，而来自经处理葡萄的果汁是成熟Cabernet Sauvignon葡萄刚压碎后典型的桃色。这些结果表明，通过杀死和停止霜霉病再感染，YGP-GET至少在短期内在夏季后期葡萄园处理中有效。

进一步研究YGP-GET在控制霜霉病方面的长期功效会是有用的，但所得结果显示YGP-GET是有用的处理。

晚期发作霜霉病可以完全摧毁作物，并且目前没有能在收获前短期施用并保持其能力以提供保护的有效处理。YGP-GET的显著功效是提供快速杀死，并且与其它接触杀真菌剂相比在更长时间内保持这种功效的能力。

在该市场中有许多抗真菌剂，它们具有对抗霜霉病的确定跟踪记录，但是它们在施用后都需要一些时间才能收获作物。如果温度升至高于85_，则不能使用一些处理(像含硫产品)。含铜杀真菌剂的植物毒性还主要取决于葡萄的品种。接触杀真菌剂没有长期作用，所以通常需要第二次施用更长效的杀真菌剂，但其可能受有关规章(例如PHI或REI)的限制。

用于霜霉病的许多常规处理具有再进入限制(REI和/或PHI)，这意味着种植者不能施用这些处理，因为害怕他将施用一些像PHI为66天的代森锰锌的农药；那么种植者就不能在最成熟的时候收获他的葡萄。

认为霜霉病是密西西比以东产出许多差葡萄酒的主要原因。在这个迅速成长的行业中，YGP-GET可以允许受到影响的葡萄适当地成熟，并在最成熟的时候被摘下。

有利地，YGP-GET应该符合各种“有机”委员会(许多是自己指定的)批准这种产品适用于在“有机”原则下栽培的葡萄的标准。这在美国和全世界快速成长的市场份额中打开了另一个适当的位置。

实施例22-体外评价包封和未包封萜的杀真菌性质

进行了进一步的测试以评价实施例15中所述的31种未包封萜制剂和葡聚糖颗粒包封的制剂16和22。

为了进行这些测定，将20000个孢子放在1/3浓度的马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)中，并添加足量的所选萜制剂以得到10至1000ppm的浓度。将这些测试材料放在含灰色葡萄孢(B.c.)孢子的分离无菌加盖微量离心管中，温育24小时，然后通过离心回收所述孢子，并弃去萜溶液。用无菌水漂洗孢子/生物质，再次离心，然后吸收回300μl 1/3浓度的PDB中，并转移到96孔板中。随时间测量长成菌丝体的存活孢子的光密度。将杀真菌活性定义为在24小时萜暴露后杀死全部20000个孢子，这由不存在菌丝体生长证明。

结果提示，在目前的测试条件下，某些制剂没有统计学显著水平的杀真菌性(结果未显示)。这些制剂为：

1、2、4、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、19、20、21、23、24、25、27、28、29、30。关于组合物的细节，参考实施例15(表17)。

在表26中列出了最有效化合物的最小抑制浓度。

表25

材料	最小抑制浓度(ppm)	材料	最小抑制浓度(ppm)
				3	＜1000；＞750	7	＜1000；＞750
10	＜1000；＞500*	13	＜1000；＞750
				16	＜1000；＞750	22	＜750；＞500
26	＜1000；＞750	31	＜1000；＞750

^*在不同的测试中，没有生长的最低浓度为500或750ppm

化合物在水中和包封在中空葡聚糖颗粒中的对比测试

根据前面描述的技术制备包封在中空葡聚糖颗粒中的制剂16(香叶醇、丁子香酚和百里酚)和22(丁子香酚、百里酚和柠檬醛)的样品。然后使用前面关于未包封制剂所述的方案评价包封和未包封制剂的杀真菌性质。

与悬浮在水中的萜相比，包封萜制剂的结果非常不同，如图24所示。

最小有效浓度示于下表26中。

表26

材料	在悬浮液中的MIC	在酵母颗粒中的MIC
			16	＜1000，＞750	＜100，＞250
22	＜750，＞500	＜500，＞250

因此，材料16和22当在水悬浮液中时和当包封在葡聚糖颗粒中时的结果非常不同。(说明：如后面所述，悬浮在水中的萜的结果有些可变性，上述实验是其实例)。MIC值是来自几个试验的复合。重要地，包封萜制剂的结果没有遇到与萜水悬浮液相关的可变性的问题。对悬浮在水中的萜进行五个分离的测试，对YP进行三个分离的测试。

包封萜制剂容易地与水混合，并使萜制剂缓慢释放到水介质中。这导致孢子更长时问地暴露于所述萜。

遇到了监测未包封萜制剂在测试介质中的悬浮的问题，这可能影响了这方面的结果。

Claims (84)

1.组合物，其包含包封萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒。

2.权利要求1的组合物，其中所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒是真菌细胞壁。

3.权利要求2的组合物，其中所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒是酵母细胞壁。

4.权利要求3的组合物，其中所述酵母细胞壁来自发面酵母细胞。

5.前述权利要求之任一项的组合物，其中所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒是来自酵母抽提物制备过程的不溶性废产物。

6.前述权利要求之任一项的组合物，其中所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒已经过碱提取。

7.前述权利要求之任一项的组合物，其中所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒已经过酸提取。

8.前述权利要求之任一项的组合物，其中所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒已经过有机溶剂提取。

9.前述权利要求之任一项的组合物，其中所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的脂质含量为1％或更高。

10.权利要求9的组合物，其中所述中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的脂质含量为5重量％或更高。

11.权利要求10的组合物，其中所述脂质含量为10重量％或更高。

12.前述权利要求之任一项的组合物，其中所述萜成分包含选自以下的一种或多种萜：柠檬醛、蒎烯、橙花醇、b-紫罗酮、香叶醇、香芹酚、丁子香酚、香芹酮(例如L-香芹酮)、terpeniol、茴香脑、樟脑、薄荷醇、百里酚、苧烯、橙花叔醇、法呢醇、植醇、胡萝卜素(维生素A₁)、角鲨烯、百里酚、生育三烯酚、紫苏子醇、冰片、月桂烯、simene、蒈烯、terpenene、里哪醇或其混合物。

13.前述权利要求之任一项的组合物，其中所述萜成分包含具有通式结构C₁₀H₁₆的萜。

14.前述权利要求之任一项的组合物，其中所述萜成分包含选自香叶醇、百里酚、柠檬醛、香芹酮(例如L-香芹酮)、丁子香酚、b-紫罗酮或其混合物的一种或多种萜。

15.前述权利要求之任一项的组合物，其中所述萜成分包含香叶醇、百里酚和丁子香酚的混合物。

16.权利要求14的组合物，其中所述萜成分包含100％百里酚。

17.权利要求14的组合物，其中所述萜成分包含50重量％香叶醇和50重量％百里酚。

18.权利要求14的组合物，其中所述萜成分包含50重量％丁子香酚0和50重量％百里酚。

19.权利要求14的组合物，其中所述萜成分包含33重量％香叶醇、33重量％丁子香酚和33重量％百里酚。

20.权利要求14的组合物，其中所述萜成分包含33重量％丁子香酚、33重量％百里酚和33重量％柠檬醛。

21.权利要求14的组合物，其中所述萜成分包含25重量％香叶醇、25重量％丁子香酚、25重量％百里酚和25重量％柠檬醛。

22.权利要求14的组合物，其中所述萜成分包含20重量％香叶醇、20重量％丁子香酚、20重量％柠檬醛、20重量％百里酚和20重量％L-香芹酮。

23.前述权利要求之任一项的组合物，其中所述萜成分与表面活性剂组合。

24.前述权利要求之任一项的组合物，其中所述表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚甘油酯、聚甘油一油酸酯、十甘油一辛酸酯、丙二醇二辛酸酯、三甘油一硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯、Tween_、Span_20、Span_40、Span_60、Span_80、Brig30或其两种或多种的混合物。

25.前述权利要求之任一项的组合物，其包含1至99体积％萜、0至99体积％表面活性剂和1至99体积％中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒。

26.权利要求25的组合物，其包含约10至约67重量％萜、约0.1至约10重量％表面活性剂和约40至约90重量％中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒。

27.前述权利要求之任一项的组合物，其适于杀死细菌或真菌。

28.前述权利要求之任一项的组合物，其适于杀死霉菌。

29.前述权利要求之任一项的组合物，其适于杀死支原体。

30.前述权利要求之任一项的组合物，其中所用的萜是食品级的。

31.前述权利要求之任一项的组合物，其包含额外的食品级活性化合物。

32.权利要求31的组合物，其中所述额外的食品级活性化合物为抗微生物剂或酶。

33.前述权利要求之任一项的组合物，其包含抗微生物剂、抗真菌剂、杀虫剂、抗炎药或麻醉剂。

34.前述权利要求之任一项的组合物，其还包含抗氧化剂。

35.权利要求34的组合物，其中所述抗氧化剂为迷迭香油、维生素C或维生素E。

36.前述权利要求之任一项的组合物，其为干粉形式。

37.权利要求1至35之任一项的组合物，其为小球、片剂或其它固体形式。

38.前述权利要求之任一项的组合物，其包含分散剂，当将所述组合物放入液体中时，所述分散剂促进所述组合物的分散。

39.前述权利要求之任一项的组合物，其与液体、固体或凝胶样形式的农学、食品或药学可接受的载体或赋形剂组合。

40.权利要求1至35之任一项的组合物，其悬浮或溶解在液体中。

41.权利要求40的组合物，其中所述液体为水。

42.权利要求40或41的组合物，其包含约500至约10000ppm中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒，其中所述颗粒含有约1至约67％萜成分。

43.权利要求42的组合物，其包含约1000至约2000ppm中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒，其中所述颗粒含有约10至约50重量％萜成分。

44.权利要求40至43之任一项的组合物，其包含约1ppm至约25ppt萜成分。

45.权利要求44的组合物，其包含约100至约1000ppm萜成分。

46.权利要求1至39之任一项的组合物，其分散在水、盐水、右旋糖水溶液、甘油或乙醇中，形成溶液或悬浮液。

47.前述权利要求之任一项的组合物，其包含润湿剂、乳化剂或pH缓冲剂。

48.前述权利要求之任一项的组合物，其分散在人或动物液体食品或饮料中。

49.前述权利要求之任一项的组合物，其为适于口服给予的形式。

50.权利要求1至46之任一项的组合物，其为适于肠胃外给予的形式。

51.权利要求1至46之任一项的组合物，其为适于局部给予的形式。

52.包封萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供萜成分；

b)提供中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒；

c)在适合萜包封的条件下，将所述萜成分与所述葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒一起温育；和

d)回收包封所述萜成分的所述葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒。

53.权利要求52的方法，其还包括干燥包封所述萜成分的所述葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的步骤。

54.权利要求53的方法，其中通过冷冻干燥、流化床干燥、转鼓式干燥或喷雾干燥来实现干燥。

55.权利要求52至54之任一项的方法，其中在步骤a)中提供的萜成分为在含水溶剂中的悬浮液。

56.权利要求55的方法，其中将萜成分与表面活性剂组合提供。

57.权利要求56的方法，其中所述表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯，其浓度为总反应混合物的约0.1至10体积％。

58.权利要求52至54之任一项的方法，其中在步骤a)中提供的萜成分为在含水溶剂中的真溶液。

59.权利要求52至58之任一项的方法，其中在步骤b)中提供的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒为在水或其它合适液体中的悬浮液。

60.权利要求59的方法，其中每毫升所述悬浮液包含约1至1000mg葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒。

61.权利要求59的方法，其中所述颗粒分散在流体力学体积(HV)至1.5HV液体的体积中。

62.权利要求52至58之任一项的方法，其中在步骤b)中提供的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒为干粉。

63.权利要求52至62之任一项的方法，其中在步骤c)中反应在大气压和约20至37℃的温度下进行。

64.杀死微生物的方法，所述方法包括以下步骤：

-使所述微生物与包含包封萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的组合物接触。

65.治疗或预防植物感染的方法，所述方法包括以下步骤：

-将治疗有效剂量的包含包封萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的组合物给予所述植物或所述植物附近的土壤。

66.权利要求65的方法，其中所述植物感染由线虫引起。

67.权利要求65的方法，其中所述植物感染由真菌引起。

68.权利要求67的方法，其中所述真菌为霜霉病、白粉病或灰霉病。

69.权利要求65至68之任一项的方法，其中所述植物为葡萄树。

70.权利要求65至69之任一项的方法，其中在从所述植物收获作物前21天或更短的时间给予所述组合物。

71.权利要求70的方法，其中在收获前14天或更短的时间给予所述组合物。

72.权利要求71的方法，其中在收获前7天或更短的时间给予所述组合物。

73.权利要求72的方法，其中在收获前3天或更短的时间给予所述组合物。

74.权利要求65至73之任一项的方法，其中通过喷雾施用所述组合物。

75.权利要求74的方法，其中以500L/Ha或更高的比率喷雾所述组合物。

76.权利要求75的方法，其中以900L/Ha或更高的比率喷雾所述组合物。

77.权利要求76的方法，其中以1200L/Ha或更高的比率喷雾所述组合物。

78.权利要求65至73之任一项的方法，其中通过灌溉给予所述组合物。

79.本发明还提供预防或治疗患者的感染的方法，所述方法包括以下步骤：

-给予所述患者治疗有效剂量的包含包封萜成分的中空葡聚糖颗粒或细胞壁颗粒的组合物。

80.权利要求79的方法，其中所述患者的感染由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、烟曲霉(Aspergillius fumigatus)、衣阿华支原体(Mycoplasma iowae)、青霉(Penicillium sp.)或肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)引起。

81.权利要求80的方法，其中通过口服、阴道、直肠、吸入、局部或胃肠外途径给予所述组合物。

82.包含包封萜成分的中空葡聚糖颗粒的组合物，其用于预防或治疗患者或植物的感染。

83.包封萜成分的中空葡聚糖颗粒在制备用于治疗患者的感染的药物中的用途。

84.权利要求83的用途，其中所述感染由烟曲霉、Sclerotintahomeocarpa、茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾生毛盘孢(Colletotrichumgraminicola)或青霉引起。

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