CN111937885B - 吡啶-2,3-二羧酸的应用 - Google Patents
吡啶-2,3-二羧酸的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物农业领域，公开了吡啶‑2,3‑二羧酸的应用，具体公开了吡啶‑2,3‑二羧酸在制备抑制甘薯长喙壳菌生长的制剂中的应用及甘薯黑斑病治疗和防治上的应用。本发明将吡啶‑2,3‑二羧酸应用于治疗和/或预防甘薯黑斑病的制剂中，通过抑制甘薯长喙壳菌细胞膜中麦角固醇的合成的独特方式达到杀菌的目的。本发明无需复杂分子操作，制剂中主要活性物质吡啶‑2,3‑二羧酸为天然来源，可以采用生物法生产，对环境友好。除此之外，本发明提供了一种治疗和/或预防甘薯黑斑病的制剂，该制剂为浓度为5mM的吡啶‑2,3‑二羧酸水溶液，pH为3～5，该制剂相对于其他浓度制剂而言，治疗和/或预防效果最佳，且制备方法简单。
Description
技术领域
本发明涉及生物农业领域，涉及吡啶-2,3-二羧酸的应用，尤其涉及吡啶-2,3-二羧酸在制备抑制甘薯长喙壳菌生长的制剂中的应用及甘薯黑斑病预防和治疗上的应用。
背景技术
由于富含多种维生素和具有独特的营养价值，甘薯产业在粮食产业上占有举足轻重的地位，被称为“抗癌之王”。中国的甘薯产量位居世界首位，近年来随着甘薯种植规模扩大，甘薯病害也愈加严重，其中甘薯黑斑病是危害甘薯产业最严重的真菌性病害之一。甘薯黑斑病是由甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata) 引起的真菌性病害，该病在甘薯幼苗期、生长期和储藏期都有可能发生，引起死苗、烂床、烂窖，造成极其严重的损失。甘薯的块根是主要的可食用部分，病薯块根迅速氧化褐变，产生黑色的斑点并且带苦味，人畜食之可能会引起中毒，因此该病的防治刻不容缓。
目前，市场上没有防治该病的专用药剂，生产上常采用培育无毒苗、合理轮作、种植前用1.0％硫酸铜液或2％的氢氧化钠溶液浸5～10min等方法防治该病。这些方法虽然能获得较好的防治效果，但需要的周期长，价格昂贵，且化学药剂的使用导致的农药问题和环境污染问题日益突出。因此，开发低毒、环保、廉价的杀真菌剂，对于防治甘薯黑斑病、推进甘薯产业稳定发展，具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供吡啶-2,3-二羧酸的应用，使其抑制甘薯长喙壳菌生长效果显著，同时可用于相关药物的制备中。
吡啶-2,3-二羧酸是一种天然产物(2,3-Pyridinedicarboxylic acid，QA)，分子式为C7H5NO4，结构式如下式所示：
本发明经过研究发现，吡啶-2,3-二羧酸可抑制名为甘薯长喙壳菌的植物病原真菌的生长，故提出了吡啶-2,3-二羧酸在制备抑制甘薯长喙壳菌生长的制剂中的应用。
根据应用，本发明提供了一种抑制植物中的甘薯长喙壳菌生长的制剂，该制剂的活性成分为对吡啶 -2,3-二羧酸。
作为优选，所述制剂为吡啶-2,3-二羧酸水溶液。
更优选地，所述吡啶-2,3-二羧酸水溶液的浓度不小于5mM。
更优选地，所述吡啶-2,3-二羧酸水溶液的pH为3～5。
本发明以水为对照，采用5mM吡啶-2,3-二羧酸水溶液喷洒后接种甘薯长喙壳菌菌饼的甘薯(预防组， 2天后后观测甘薯长喙壳菌的生长情况)和接种甘薯长喙壳菌菌饼后喷洒吡啶-2,3-二羧酸水溶液的甘薯(治疗组，1天后后观测甘薯长喙壳菌的生长情况)，发现预防组中对照甘薯接种部位病菌生长较严重，受侵害程度大，经吡啶-2,3-二羧酸水溶液预防处理后，甘薯长喙壳菌生长受到显著抑制，黑斑病感染程度减轻；治疗组中对照甘薯接种甘薯长喙壳菌部位产生黑色斑块甚至腐烂情况，而经5mM吡啶-2,3-二羧酸治疗处理后，甘薯长喙壳菌的生长几乎完全被抑制，可有效治疗黑斑病。
与现有技术相比，本发明将吡啶-2,3-二羧酸应用于治疗和/或预防甘薯黑斑病的制剂中，通过抑制甘薯长喙壳菌的麦角固醇合成的独特方式达到杀菌的目的。本发明无需复杂分子操作，制剂中主要活性物质吡啶-2,3-二羧酸为天然来源，可以采用生物法生产，对环境友好。除此之外，本发明提供了一种治疗和/或预防甘薯黑斑病的制剂，该制剂为浓度不小于5mM的吡啶-2,3-二羧酸水溶液，pH为3～5，该制剂相对于其他浓度制剂而言，治疗和/或预防效果最佳，且制备方法简单。
附图说明
图1为0mM(对照组)、3mM、5mM、10mM浓度吡啶-2,3-二羧酸制备得到的PDA培养基培养得到的链格孢菌(Alternaria alternata)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和梨树腐烂病病菌(Valsa pyri) 菌落直径柱状图；
图2为在含有0mM、3mM、5mM和10mM浓度的吡啶-2,3-二羧酸的PDA固体培养基上的甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)生长情况图；
图3为对照组(0mM QA)和3mM QA组甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)经pH为3.0、4.0、 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0培养后，1μL菌液中的细胞总数柱状图；
图4为以红薯片和紫薯作为研究对象，预防组与治疗组中对照实验和QA处理实验得到的甘薯长喙壳菌的生长情况图。
其中，图4A为以红薯片为实验对象，预防组与治疗组中对照实验和QA处理实验得到的甘薯长喙壳菌的生长情况图；
图4B为以紫薯为实验对象，预防组与治疗组中对照实验和QA处理实验得到的甘薯长喙壳菌的生长情况图。
具体实施方式
本发明公开了吡啶-2,3-二羧酸的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：吡啶-2,3-二羧酸的抗真菌活性检测
PDA培养基配方如表1所示。先将马铃薯洗净去皮，再称取200g切成小块，加水煮烂(煮沸20～30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，再加入20g葡萄糖，定容至1L后均分为4份，每份250mL，各加入5g琼脂后，分别加入0mg、125.25mg、208.75mg、417.5mg的吡啶-2,3-二羧酸，115℃灭菌20min 后，倒平板，得到吡啶-2,3-二羧酸终浓度分别为0mM、3mM、5mM和10mM的PDA培养基平板各18～20 块。
菌饼制备：将斜面保存的链格孢菌(Alternaria alternata)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和梨树腐烂病病菌(Valsa pyri)菌株分别接种于不含吡啶-2,3-二羧酸的PDA固体培养基平板中，于28℃恒温培养箱避光培养3天，用直径3mm的打孔器于菌落边缘切取，制备成菌饼备用。将不同菌种制备的菌饼均接种于含不同浓度吡啶-2,3-二羧酸的PDA培养基中心位置(设置三个平行)，于28℃恒温培养箱避光培养，当含0mM吡啶-2,3-二羧酸的PDA培养基中的菌落边缘接近平板边缘时，测定各平板中的菌落直径，菌落直径柱状图如图1所示，图1为0mM、3mM、5mM、10mM浓度吡啶-2,3-二羧酸制备得到的PDA 培养基培养得到的链格孢菌、灰葡萄孢菌、甘薯长喙壳菌、禾谷镰刀菌、核盘菌和梨树腐烂病病菌菌菌落直径柱状图。根据图1可发现，所有菌种中，仅甘薯长喙壳菌的菌落直径随着PDA培养基中吡啶-2,3-二羧酸浓度的增加，菌落直径明显降低，当吡啶-2,3-二羧酸浓度为3mM时，菌落直径仅为对照组(0mM) 的60％，说明3mM吡啶-2,3-二羧酸对甘薯长喙壳菌的抑制率为60％(抑制率＝(对照组测得直径-3mM QA 组测得直径)/对照组测得直径)，浓度为5mM、10mM时，菌落直径为0，说明当吡啶-2,3-二羧酸浓度大于5mM时，可完全抑制甘薯长喙壳菌菌丝生长。
观察甘薯长喙壳菌在其中一组浓度为0mM、3mM、5mM、10mM的吡啶-2,3-二羧酸制备的PDA培养基上的生长情况，结果如图2所示，图2为在含有浓度为0mM、3mM、5mM、10mM的吡啶-2,3-二羧酸的PDA固体培养基上的链格孢菌生长情况图，根据该图也可以发现，相对于对照组(0mM)，当吡啶-2,3-二羧酸浓度为3mM时，甘薯长喙壳菌菌落直径明显变小，当浓度大于5mM时甘薯长喙壳菌停止生长，说明吡啶-2,3-二羧酸可有效抑制甘薯长喙壳菌菌丝生长。
实施例2：不同pH对3mM吡啶-2,3-二羧酸抗甘薯长喙壳菌性能的影响。
甘薯长喙壳菌菌饼制备方法同实施例1。
大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基配方如表2所示，共需配置14瓶40mL的大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基，各组分加入40mL蒸馏水后于121℃湿热法灭菌1h。
表2大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基配方(40mL)
| 试剂 | 质量 |
| 蜂蜜 | 600mg |
| 胰蛋白胨 | 200mg |
| 大麦 | 100mg |
| 蒸馏水 | 40mL |
诱导分生孢子产生并提取：待灭菌后的大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基冷却至室温后，在超净台上每瓶接种两份菌饼，置于28℃，200rpm摇床上震荡培养24h。然后，分别将每瓶菌液以4℃，10,000×g离心10min，弃上清液得到分生孢子。
将分生孢子分别用50mL pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的YEDP溶液重悬，每个pH梯度设置两瓶，一瓶中加入25.05mg QA配置成终浓度为3mM QA的YEDP液体培养基，另一瓶作为0mM QA 对照组，于28℃，200rpm培养3h后用移液枪吸取1μL菌液在显微镜下对分生孢子凝集形成的聚集体进行计数。YEDP溶液配方如表3所示，依靠HCl和NaCO3调节YEDP培养基的pH。
表3 YEDP培养基配方(50mL)
| 试剂 | 质量 |
| 酵母提取物 | 0.15g |
| 胰蛋白胨 | 0.50g |
| 葡萄糖 | 1.00g |
| 蒸馏水 | 50mL |
计数结果如图3所示，图3为对照组(0mM QA)和3mM QA组甘薯长喙壳菌经pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0培养后，1μL菌液中的细胞总数柱状图。由图2可见，当培养基pH<5(pH＝3,4) 时，3mM QA对甘薯长喙壳菌生长的抑制能力(抑制能力＝(对照组聚集体总数-3mM QA组聚集体总数) /对照组聚集体总数)随着pH的下降增强，pH＝3时，3mM浓度的吡啶-2,3-二羧酸对甘薯长喙壳菌的生长抑制能力最大。此外，培养基pH>5(pH＝6,7,8,9)时，随着pH的增加，虽然3mM QA对甘薯长喙壳菌生长的抑制能力降低，但仍然能发挥抑菌作用。这些结果表明QA的pH适用范围远超于一般抗真菌剂，具有无可比拟的优越性。
实施例3：以吡啶-2,3-二羧酸为主要成分的药物对甘薯黑斑病进行预防和治疗。
菌饼制备方法同实施例1，大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基同实施例2。
吡啶-2,3-二羧酸溶液配置：向50mL灭菌水中加入41.75mg QA配置终浓度为5mM的吡啶-2,3-二羧酸水溶液，调节pH为4.0。
菌液制备：将接种两份菌饼的大麦-蜂蜜-蛋白胨培养基在28℃，200rpm摇床上震荡培养24h后，以 4℃，10,000×g离心10min收集分生孢子，并在30mL无菌水中重悬，可先吸取1μL菌液制作装片，置于显微镜下计数，再加适量无菌水稀释至分生孢子浓度约为1×108个/mL。
预防组：取8个生长状况相似的完整紫薯，均分用于对照实验(4个)和QA处理实验(4个)。将红薯用无菌手术刀切成均匀大小的红薯片(8片)均分用于对照实验(4片)和QA处理实验(4片)。
对照实验(0mM QA)：
将水均匀喷洒至紫薯(4个)和红薯片(4片)上，待其干燥后用无菌手术刀在每个紫薯表面挖1mm2的小孔，每个紫薯上正反两面各两个小孔，每个小孔接种5μL菌液；在每个红薯片中心位置用已消毒的镊子放置一份菌饼。用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，放入28℃培养箱中，2天后检测疾病进程。
QA处理实验(5mM QA)：
将5mM吡啶-2,3-二羧酸水溶液均匀喷洒至紫薯(4个)和红薯片(4片)上，待其干燥后用无菌手术刀在每个紫薯表面挖1mm2的小孔，每个紫薯上正反两面各两个小孔，每个小孔接种5μL菌液；在每个红薯片中心位置用已消毒的镊子放置一份菌饼。用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，放入28℃培养箱中，2 天后检测疾病进程。
治疗组：取8个生长状况相似的完整紫薯，均分用于对照实验(4个)和QA处理实验(4个)。将红薯用无菌手术刀切成均匀大小的红薯片(8片)均分用于对照实验(4片)和QA处理实验(4片)。
对照实验(0mM QA)：
用无菌手术刀在4个紫薯表面挖1mm2的小孔，每个紫薯上正反两面各两个小孔，每个小孔接种5μL 菌液；在4个红薯片中心位置用已消毒的镊子放置一份菌饼。干燥后用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，放入28℃培养箱中，1天后取出，并将水均匀喷洒至紫薯(4个)和红薯片(4片)上。干燥后重新用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，放入28℃培养箱中，1天后检测疾病进程。
QA处理实验(5mM QA)：
用无菌手术刀在4个紫薯表面挖1mm2的小孔，每个紫薯上正反两面各两个小孔，每个小孔接种5μL 菌液；在4个红薯片中心位置用已消毒的镊子放置一份菌饼。干燥后用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，放入 28℃培养箱中，1天后取出，并将5mM吡啶-2,3-二羧酸水溶液均匀喷洒至紫薯(4个)和红薯片(4片) 上。干燥后重新用保鲜膜缠绕固定并保持湿润，放入28℃培养箱中，1天后检测疾病进程。
从预防组与治疗组中对照实验和QA处理实验得到的紫薯和红薯片中各选择一份拍照，照片如图4所示。图4为以红薯片(A)和紫薯(B)作为研究对象，预防组与治疗组中对照实验和QA处理实验得到的甘薯长喙壳菌的生长情况图。根据图4A可知，预防组中，对照实验(0mM QA)得到的红薯片多处出现因感染甘薯长喙壳菌而产生的黑色斑块，而5mM QA处理实验组红薯片仅在接种菌饼出现直径极小的病菌菌落，说明QA可有效预防甘薯黑斑病；治疗组中，对照实验组(0mM QA)红薯片大面积出现白色菌丝，说明甘薯长喙壳菌生长旺盛，而5mM QA处理实验组红薯片仅在甘薯长喙壳菌菌饼接种部位以及红薯片边缘出现白色菌丝，说明QA可有效防止甘薯黑斑病的扩散。根据图4B可知，预防组中，对照实验(0mM QA)得到的紫薯出现大面积因感染甘薯长喙壳菌而产生的黑色斑块甚至腐烂，而5mM QA处理实验组紫薯仅在接种菌液的小孔附近出现直径极小的病菌菌落，说明QA可有效预防甘薯黑斑病；治疗组中，对照实验组(0mM QA)紫薯表面几乎完全被甘薯长喙壳菌感染，产生黑色斑块甚至腐烂情况，而 5mM QA处理实验组紫薯仅在甘薯黑接种菌液的小孔附近出现直径极小的病菌菌落，说明QA可有效防止甘薯黑斑病的扩散。
可以认为，在感染甘薯长喙壳菌前喷洒吡啶-2,3-二羧酸水溶液，能保护甘薯免受病菌侵害。对于感染甘薯黑斑病的甘薯，喷洒吡啶-2,3-二羧酸水溶液能有效控制病害扩散。
本发明的实施例中，单位符号mM为mmol/L，M为mol/L。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.吡啶-2,3-二羧酸在抑制甘薯长喙壳菌生长中的应用。
2.一种抑制甘薯长喙壳菌生长的制剂在治疗和/或预防甘薯黑斑病中的应用，其特征在于，所述制剂的活性成分为吡啶-2,3-二羧酸。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制剂为吡啶-2,3-二羧酸溶液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述吡啶-2,3-二羧酸溶液的浓度不小于5mM。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述吡啶-2,3-二羧酸溶液的pH为3~5。
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