CN1124785C - 诱导水稻生成植物抗毒素的诱导剂的筛选方法和以诱导剂为有效成分的水稻病害防除剂 - Google Patents

诱导水稻生成植物抗毒素的诱导剂的筛选方法和以诱导剂为有效成分的水稻病害防除剂 Download PDF

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Abstract

本发明课题提供了诱导水稻生成植物抗毒素的诱导剂的筛选方法以及水稻病害防除剂。具有诱导水稻生成植物抗毒素性质的诱导剂的筛选方法，使用水稻的幼苗作为试验植物，然后将试验样品施用于该水稻幼苗的适宜的部位，以水稻中生成的植物抗毒素作为筛选的指标物质进行诱导剂筛选。本发明还涉及以具有诱导水稻生成植物抗毒素作用的特定化合物作为有效成分的水稻病害防除剂。

Description

诱导水稻生成植物抗毒素的诱导剂的筛选方法 和以诱导剂为有效成分的水稻病害防除剂
本发明涉及具有诱导水稻生成植物抗毒素性质的诱导剂的筛选方法，以及将利用该筛选方法筛选出的诱导剂作为有效成分的水稻病害防除剂等。再详细点说，本发明涉及能迅速而且正确地筛选诱导水稻生成植物抗毒素的诱导剂的方法，该筛选方法是先栽培试验用的水稻，然后将试验样品施用于该水稻的适宜的部位，以水稻中生成的特定的植物抗毒素作为筛选的指标物质进行分析，通过分析，筛选出具有诱导水稻生成植物山扁豆烷(phytocassane)和日本冷杉内酯(momilactone)等植物抗毒素性质的物质的方法。由于这些植物抗毒素对于水稻病害，例如稻瘟病菌、稻纹枯病菌和稻胡麻斑病菌具有很强的抗菌性，所以具有诱导水稻生成植物抗毒素性质的诱导剂作为水稻病害防除剂的有效成分是很有用的。
另外，本发明还涉及用于具有诱导水稻生成植物抗毒素作用的脑苷脂化合物PO8、PO9、R2以及脑苷脂衍生物，以及将一种或两种以上该类物质用作水稻病害防除剂的使用方法，具体讲，该方法是通过将脑苷脂化合物以及其衍生物施用到水稻的叶子上，诱导水稻生成植物山扁豆烷(phytocassane)和日本冷杉内酯(momilactone)等植物抗毒素的方法。由于这些植物抗毒素对于水稻病害，例如稻瘟病菌、稻纹枯病菌和稻胡麻斑病菌具有很强的抗菌性，所以该脑苷脂化合物以及其衍生物作为水稻病害防除剂的有效成分是很有用的。
一般来说，人们知道植物与病原菌一接触，就表现出抗性反应(过敏反应)，在反应部位周围组织产生对病原菌显示出抗菌性的植物抗毒素。作为水稻的植物抗毒素，已知有日本冷杉内酯(momilactone)A、B，稻抗毒素(oryzalexin)A、B、C、D、E、F、S、樱花亭(sakuranetin)，稻酸(oryzalicacid)A、B，稻谷素(oryzalide)A、B。此外，还有本发明等人发现的植物山扁豆烷(phytocassane)A、B、C和D(特愿平7-43520)。
诱导植物体产生植物抗毒素的物质称为诱导剂(elicitor)(Keen，N.T.；《科学》Science 187：74-75(1975))，到目前为止，已经从植物病原菌中分离出了很多诱导剂。其中代表性的诱导剂有多糖类物质、蛋白类物质和脂类物质。多糖类物质有从大雄疫霉Phytophthora megasperma f.sp.glycinea分离出的hepta-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sharp，J.K.，B.Valentand，P.Albersheim；(美)《生物的化学杂志》J.Biol.Chem.259：11321-11336(1984))，蛋白类物质有从Monilinia fructicola分离出的链核胆碱Monicholine A(Cruickshank，I.A.M.和D.R.Perrin；《生命科学》Life Sci.7：449-458(1968))，脂类物质有从致病疫霉Phytophthora infestans分离出的二十碳五烯酸(Bostock，R.M.，J.Kuc和R.A，Laine；《科学》Science 212：67-69(1975))。
如上所述，诱导剂由于具有诱导植物体对病原菌产生显示出抗菌性的植物抗毒素的作用，同时又由于具有与以往的农药不同的作用，人们认为它可能成为安全性高的植物病害防除剂的有效成分，人们迫切希望发现有用的诱导剂，以及作为能发现有用诱导剂的方法，即能够迅速而且简便地探索用诱导活性的物质的新的探索方法。
在上述那样的状况下，本发明者等借鉴上述以前的技术，以开发探索诱导水稻生成植物抗毒素的有用的诱导剂的新的探索方法为目标，尽管一直在反复探入研究，但使用水稻进行筛选具有诱导活性的物质的方法是非常难的，可以说到目前为止还没有完全确立筛选的有效方法。而本发明人在为反复进行开发筛选有效方法所进行的各种研究中，在新确立试验水稻的种类，水稻的栽培方法，试验样品的施用方法，植物抗毒素的分析方法等基本技术方面获得了成功，利用这些基本方法和技术使得筛选具有诱导剂活性的物质成为可能。
就是说，对于试验使用的水稻，研究结果表明试验水稻的品种和种类、栽培的温度和温度、试验水稻的龄期、试验样品施用的部位等非常重要，很清楚，将这些条件设定为最适条件，就可以作为筛选方法使用。而关于分析的植物抗毒素，最好是以植物山扁豆烷(phytocassane)和日本冷杉内酯(momilactone)为例，确定诱导水稻中产生的植物抗毒素的提取方法和利用HPLC的分析方法。
利用上述方法试验了各种物质，结果发现了数种具有诱导剂活性的化合物。
另外本发明人使用上述的筛选方法，以微生物产物为对象广泛地筛选具有诱导活性的物质，结果发现在包括植物病原菌的丝状菌中广泛地存在着这样的具有诱导活性的物质。
进一步通过溶剂提取、柱层析等手段对具有诱导活性的物质进行分离，得到3种活性物质，并进行了结构解析，结果表明这3种活性物质是下述结构式表示的脑苷脂化合物PO8、PO9和R2。同时研究结果证明这些物质作为水稻病害防除剂的有效成分是有效的，从而完成了本发明。
本发明人等对于作为具有诱导活性的物质发现的脑苷脂化合物PO8、PO9和R2的化学结构已有报道，PO8与脑苷脂A(Sitrin.R.D.等；《抗生素杂志》J.Antibiot.41；469-480(1988))，PO9和PENII(Kawai.G.等；《农业生物化学》Agric.Biol.Chem.49：2137-2146(1985))，R2与脑苷脂B(Kawai.G.等；《脂质研究杂志》J.Lipid.Res.，26：38-343(1985))具有同一结构。然而就报道的这些物质来说，与本发明有关的诱导活性方面的报道还没有，同时本发明人首次阐明了该脑苷脂化合物对水稻具有防除病害作用。
本发明的课题在于提供诱导于水稻生成植物抗毒素的诱导剂的筛选方法以及水稻病害防除剂。
本发明涉及具有诱导水稻生成植物抗毒素性质的诱导剂的筛选方法，具体讲该筛选方法是以水稻的幼苗作为试验植物，将试验样品施用于该水稻幼苗的适宜的部位，以水稻中生成的植物抗毒素作为筛选的指标物质进行诱导剂筛选的方法，同时本发明还涉及以具有诱导水稻生成植物抗毒素作用的特定化合物作为有效成分的水稻病害防除剂。
利用本发明，可以简便而且高精度地进行诱导水稻生成抗毒素的诱导剂的筛选，同时可以提供无残留毒性的低毒性、无公害的水稻病害防除剂。
如上所述，本发明涉及诱导水稻生成抗毒素的诱导剂的筛选方法，涉及到用水稻幼苗为试验植物，利用HPLC分析水稻中生成的抗毒素(植物山扁豆烷(phytocassane)和日本冷杉内酯(momilactone)的方法。同时还涉及利用本发明获得的具有诱导活性的物质。
就是说，本发明的目的是提供诱导水稻生成抗毒素的诱导剂的筛选方法。
另外，本发明另一个目的是提供以水稻抗毒素植物山扁豆烷(phytocassane)和日本冷杉内酯(momilactone)A作为指标物质，能迅速而且简便地探索具有诱导水稻生成抗毒素性质的诱导剂的筛选方法。
提供以具有诱导水稻生成抗毒素作用的特定的物质作为有效成分的水稻病害防除剂也是本发明的一个目的。
本发明为解决上述课题，涉及诱导水稻毒素生成的诱导剂的筛选方法，该诱导剂筛选方法的特征是用水稻幼苗为试验植物，然后将试验样品施用于该水稻幼苗的适宜的部位，以水稻中生成的特定的植物抗毒素作为指标物质进行诱导剂筛选的方法。
而本发明是将特征如下的诱导剂筛选方法作为优选的实施方案，这些特征是：将试验样品滴施于水稻幼苗叶子的前端部分，然后用溶剂提取该植物体中生成的植物抗毒素，以水稻植物抗毒素植物山扁豆烷(phytocassane)和日本冷杉内酯(momilactone)A作为指标物质，利用高效液相色谱(HPLC)进行分析。
另外本发明也涉及到从利用上述筛选方法筛选的具有诱导水稻生成植物抗毒素作用的选自2-吡嗪羧酸、吡啶羧酸、2，6-吡啶二羧酸、2，3-吡啶二羧酸、吡咯-2-羧酸、氧嗪酸、脑苷脂化合物PO8、PO9、R2及其衍生物的一种或2种以上物质作为有效成分的水稻病害防除剂。
下面，就本发明进行更详细的说明。
本发明人就诱导水稻产生植物抗毒素的物质的筛选方法，对试验水稻的品种、栽培条件、植物抗毒素的分析条件等进行了详细的研究。研究结果表明，试验中使用的水稻品种，“秋田小町”Akitakomachi和“越光”Koshihikari等比较合适；培土为含有适宜的水稻生长所必需的氮、磷酸、钾肥的颗粒状培土，具体来说，使用HONENS 1号培土(全农)是合适的，作为试验水稻的栽培条件，控制温度、湿度和照度是重要的。具体来说，例如将出芽的种子植在钵中，在30-32℃的暗室中大约培育2～3天，等到芽伸出土壤表面上大约2～3cm时，移入人工气象室内。人工气象室的条件保持在温度为18～20℃，湿度为80～85％，照度为2000～3000lux的条件下。当第2真叶长出期间，将照度调到3000～4000lux，湿度调到95～100％，白天温度调到27～30℃，一直培育到第5真叶完全展来为止。不用说，这些栽培条件可以在与上述条件同等的范围内进行适当地变更。另外，使用毛细移液管将试验样品滴施在第5真叶的前端部分的滴施方法是最理想的方法。
施用了样品的水稻再栽培一周后，将施用了样品的部分剪碎后，用乙酸乙酯、甲醇等溶剂进行提取，提取物用HPLC分析，例如，就植物山扁豆烷(phytocassane)、日本冷杉内酯(momilactone)的分析来说，从保留时间35分钟左右的植物山扁豆烷(phytocassane)A，保留时间43分钟左右的植物山扁豆烷(phytocassane)B，保留时间50分钟左右的日本冷杉内酯(momilactone)A的各个峰高可以求出诱导的植物抗毒素的量。对于其它的植物抗毒素也可以同样进行分析。
上述筛选方法基本上是由如下一些步骤构成的。1试验植物(水稻)
(1)品种：秋田小町Akitakomachi和越光Koshihikari
(2)令期：水稻幼苗，特别是真叶5龄
(3)栽培：栽培到第6真叶完全展开为止2试验样品的施用
(1)施用部位：叶身，特别是叶子的前端部分
(2)施用方法：用毛细移液管滴施
(3)施用后的栽培期：大约1周3提取和分析
(1)样品的制备：将施用部位剪碎
(2)提取：用乙酸乙酯、甲醇等溶剂提取
(3)分析：用HPLC分析
根据这一筛选方法，发现后面实施例2给出的化合物可以作为诱导水稻产生植物抗毒素的物质。
另外本发明人使用上述筛选方法，以检索能诱导水稻产生植物抗毒素的物质作为目标，将样品涂布于水稻叶身的叶面上之后进行适时栽培，测定水稻中产生的植物抗毒素的量，通过各种各样的试验，证实以稻瘟病和水稻稻纹枯病菌等植物病原菌为代表的丝状菌体的有机溶剂提取物表现出高的诱导植物抗毒素的活性。诱导植物抗毒素产生的物质，例如PO8、PO9可以通过用乙酸乙酯、丙酮和乙醇等溶剂提取，经HPLC、薄层层析等手段进行精制，可以分离得到它们的单一成分。
作为培养本发明中使用的培养植物病原菌的液体培养液，只要是由现有使用的植物或微生物的提取物的丝状菌培养中使用的培养基，无论哪一种都可以用，但优选的是例如PSY培养基等。这些培养基中使用了马铃薯等植物提取成分，或者是酵母提取物等。
作为PO8、PO9提取、分离的具体过程，例如可以用乙酸乙酯等溶剂提取稻瘟病菌体后，使用TSKgel ODS120A/IDS120T(东曹社制)等柱子通过HPLC分级，再经浓缩干燥等精制过程等精制分离的方法可以作为理想的方法，但不限于给出的方法，将其它的同样的精制的方法进行适当的组合进行分离和精制也是可能的，所以对于PO8、PO9提取、分离的精制过程并没有特别的限定。对于R2也可以通过同样的精制手法例如从稻纹枯病菌中分离和精制。
本发明涉及的PO8、PO9和R2具有如下的性质。1)通过FAB-MS进行质谱分析，PO8的分子量为725，PO9为753，而R2为727。2)PO8、PO9和R2分别表现出图1～3给出的红外吸收光谱图。3)PO8、PO9和R2分别表现出图4～6给出的1H-NMR光谱图。4)PO8、PO9和R2分别表现出图7～9给出的13C-NMR光谱图。5)PO8、PO9和R2具有诱导水稻产生植物抗毒素的作用。作为诱导的植物抗毒素有植物山扁豆烷(phytocassane)A、B、C、D，日本冷杉内酯(momilactone)A、B等。由于这些植物抗毒素对稻瘟病菌、稻纹枯病菌和稻胡麻斑病菌具有很强的抗菌性，可以认为受到这些物质诱导的水稻对病菌的感染表现出抗性。
本发明涉及的PO8、PO9和R2就象后面实施例的感染表现出抗性。导水稻产生植物抗毒素的性质，所以PO8、PO9和R2作为对稻瘟病菌、稻纹枯病和稻胡麻斑等水稻病害的防除剂的有效成分是有用的。即，将该化合物作成适宜形态的制剂施用于水稻，可以防止水稻病害的发生。
本发明的水稻病害防除剂就象后面实施例给出的那样，根据它们的使用目的，最好是将含有上述有效量的物质做成适宜形态的制剂，制剂的形态和制剂的手段并没有特别的限定。作为将具有诱导水稻生成植物抗毒素作用的化合物施用于水稻的方法，就象后面实施例给出的那样，例如，先将该化合物溶解于含有0.1％Tween 20的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，然后将该溶液喷洒在水稻上，该方法虽然作为理想的方法例示于此，但不限于此，其它的方法也可以利用，将该化合物施用于水稻的制剂的形态，该制剂的施用方式和施用的方法等并没有特别的限定。
附图的简单说明
图1表示本发明涉及的脑苷脂化合物PO8的红外吸收光谱。
图2表示本发明涉及的脑苷脂化合物PO9的红外吸收光谱。
图3表示本发明涉及的脑苷脂化合物R2的红外吸收光谱。
图4表示本发明涉及的脑苷脂化合物PO8的1H-NMR光谱图。
图5表示本发明涉及的脑苷脂化合物PO9的1H-NMR光谱图。
图6表示本发明涉及的脑苷脂化合物R2的1H-NMR光谱图。
图7表示本发明涉及的脑苷脂化合物PO8的13C-NMR光谱图。
图8表示本发明涉及的脑苷脂化合物PO9的13C-NMR光谱图。
图9表示本发明涉及的脑苷脂化合物R2的13C-NMR光谱图。
以下根据实施例具体说明本发明，但本发明并不受以下实施例的任何限定。
实施例1(1)作为试验植物使用的水稻的栽培
用盐水挑选水稻种子(品种：秋田小町Akitakomachi或越光Koshihikari)，去除不好的种子后，使种子发芽。长出芽的种子植入HONENS培土1号(全农)，直径6cm的钵中植入8粒种子，于32℃的暗室中培育大约2～3天。芽大约长出土壤表面2～3cm时，移入人工气象室内的玻璃箱中。人工气象室保持温度为18℃，湿度80％，照度3000lux的条件，水稻钵置于有一定遮光的场所。当第2真叶长出后阶段，将照度调到3000lux，湿度调到100％，白天温度调到27～30℃，一直培育到第5真叶完全展开为止。这样栽培的水稻幼苗供以下试验用。(2)样品的施用和植物抗毒素的诱导
样品如表1给出的那样，准备1～6个样品。
使用毛细移液管将样品溶液各20μl滴施于上述栽培的水稻幼苗的第5真叶的前端部分的10个点上。样品按所设定的浓度溶解于含有0.1％Tween 20的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，供植物抗毒素诱导试验用。
施用了样品的水稻在湿度为80％、照度为2000lux、夜间温度为18℃、白天温度为23℃的人工气象室中栽培3天。然后将白天的湿度设定为100％后再栽培4天。(3)植物抗毒素的提取和分析
采取8枚施用了样品的水稻叶子，剪碎后，加入10ml乙酸乙酯-0.1N Na2CO3混合液(1∶1)，进行过夜的振荡提取。提取物经离心分离(5000rpm、4℃/20分钟)，取上清液(乙酸乙酯相)浓缩干燥。干燥的提取物溶解于0.4ml的乙醇中，然后再加入0.6ml的0.02N HCl进行混合。将混合液离心，得到的上清液100μl供HPLC分析用。HPLC的条件如下。柱子：TSK-gel ODS 120T(4.6mm×300mm)溶剂∶乙腈-水(45∶55)(体积比)流速：1.2ml/min检测器：UV 280nm(植物山扁豆烷(phytocassane))/215nm(日本冷杉内酯(momilactone))(4)结果
按照上述方法广泛地进行化合物的筛选，筛选结果确认下面的1～6个样品有诱导植物抗毒素生成的作用。1)2-吡嗪羧酸(2-Pyrazinecarboxylic acid)2)吡啶羧酸(Picolinic acid)3)2，6-吡啶二羧酸(2，6-Pyridinedicarboxylic acid)4)2，3-吡啶二羧酸(2，3-Pyridinedicarboxylic aicd)5)吡咯-2-羧酸(Pyrrole-2-carboxylic acid)6)氧嗪酸(Oxonic acid，钾盐)1.2-Pyrazinecarboxylic acid2.Picolinic acid3.2，6-Pyridinedicarboxylic acid4.2，3-Pyridinedicarboxylic acid
Figure C9719539600123
5.Pyrrole-2-carboxylic acid
Figure C9719539600124
6.Oxonic acid，钾盐
实施例2表1
                        诱导产生的植物抗毒素量样品号    样品浓度                         植物抗毒素量(μg/g叶)
        (％)            植物山扁烷A         植物山扁烷B        日本冷杉内酯A
                      (phytocassane A)    (phytocassane B)    (momilactone A)1         0.1                 1.3                 5.6                 5.72         0.1                 4.9                 10.5                7.83         0.                  2.6                 9.8                 11.74         0.1                 2.6                 8.0                 13.35         0.1                 3.1                 5.7                 11.76         0.1                 20.2                28.9                18.8
如表1所示的那样，很清楚，样品1～6具有诱导水稻植物抗毒辣素生成的作用，作为水稻病害防除剂的有效成分是有用的。
实施例3
PO8、PO9的制备(1)稻瘟病菌的培养
将剥了皮的马铃薯200g切碎，加入1L蒸馏水，于121℃进行60分钟的高压灭菌处理。高压灭菌处理后，用纱布将固形物过滤除去，制备成1L的滤液。然后向滤液中加入2％的蔗糖和0.5％的酵母提取液，制备成PSY培养基。按照每瓶装200ml将培养基分装到500ml的三角烧瓶中。于121℃下进行40分钟的灭菌，然后向冷却的培养基中接种稻瘟病菌(race031株)。于26℃下进行7天的振荡培养(150rpm)。(2)PO8、PO9的提取、精制
培养结束后，用纱布过滤培养物，收集稻瘟病菌菌体。然后加入菌体重量5倍量左右的蒸馏水，将pH遇到10.5，加入与水等体积的乙酸乙酯，进行搅拌、提取。分离乙酸乙酯相，在减压条件下，蒸馏除去乙酸乙酯，得到油状的残渣。将残渣溶解于85％的乙醇中，制备的样品液注入TSKgel ODS 120A HPLC柱(21.5mm×375mm，东曹社制)，用91％的乙醇(10ml/min)洗脱。PO8在保留时间25分钟前后，PO9在保留时间30分钟前后被洗脱出来。分别收集各自的级分，用同一根柱子再进行一次层析。PO8用81％乙醇(10ml/min)于保留时间60分钟前后，PO9用86％乙醇(10ml/min)在保留时间40分钟前后被洗脱出来。收集各个级分使用TSK gel ODS 120T柱(21.5mm×375mm，东曹社制)，进行HPLC，用95％的乙腈(10ml/min)进行分级，PO8在保留时间43分钟前后，PO9在保留时间60分钟前后被洗脱出来。分别收集各个级分，蒸馏掉溶剂，得到PO8、PO9的纯品。
实施例4
R2的制备
将稻纹枯病菌于稻瘟病菌同样的条件下培养并使用乙酸乙酯进行粗提取，回收的级分供HPLC分析试验用。通过HPLC一次精制，使用TSKgel ODS 120A柱(21.5mm×375mm，东曹社制)，R2用91％乙醇(10ml/min)在保留时间26分钟前后被洗脱出来。作为二次精制，用86％乙醇(10ml/min)再进行层析，R2在保留时间50分钟前后被洗脱出来。再使用TSK gel ODS 120T柱(21.5mm×375mm，东曹社制)，以乙腈和乙醇分别含有46.5％的混合液作为洗脱液，用10ml/min的流速进行分级，R2在保留时间53分钟前后被洗脱出来，完全被精制。
实施例5
利用PO8、PO9和R2进行植物抗毒素的诱导(1)植物抗毒素的产生
将实施例1中得到的PO8、PO9和R2溶解于含有0.1％的Tween20的20mM磷酸缓冲液(pH6.5)中，制备100ppm的样品溶液。将各种浓度的样品溶液和不含样品的溶剂施用于用钵栽培的水稻(品种：秋田小町Akitakomachi)上，然后测定诱导植物抗毒素产生的活性。这种情况下，施用的部位为完全展开的第5真叶的前端部分，在隔开适当的距离的10个点上用毛细移液管滴施20μl(每一叶)的各个样品溶液。(2)植物抗毒素的提取
将用样品溶液处理的水稻在人工气象室中培养7天后，取8片处理叶，剪碎后，加入10ml的乙酸乙酯-0.1N碳酸钠混合液(1∶1，pH10)，振荡过夜。取乙酸乙酯相，浓缩干燥，再溶解于4ml的乙醇中。(3)利用HPLC进行分析
在上述溶液中加入0.02N HCl 0.6ml混合后，进行离心分离处理。从得到的上清液中取100μl供HPLC分析。
HPLC的条件如下。柱子：TSK-gel ODS 120T(4.6mm×300mm东曹社制)溶H；乙腈-水(45∶55)(体积比)流速：1.2ml/min温度：50℃检测器：UV 280nm(phytcassane)/215nm(momilactone)
下面的表2中给出了诱导产生的植物抗毒素的量。就象表2的结果所表明的那样，本发明涉及的PO8、PO9和R2表现出具有诱导水稻高浓度产生植物抗毒素(植物山扁豆烷(phytocassane)A、B，日本冷杉内酯(momilactone)A、B)的活性。表2
                 诱导产生的植物抗毒素量样品名    样品浓度                    植物抗毒素量(μg/g叶)
      (μg/ml)       植物山扁烷A       植物山扁烷B       日本冷杉内酯A
                   (phytocassane A)  (phytocassane B)  (momilactone A+B)对照       0               0.4               1.4                4.0(缓冲液)PO8        100             10.9              6.9                28.6PO9        100             7.7               5.2                22.8R2         100             11.8              7.3                32.7
实施例6
稻瘟病防除试验(1)方法
每一钵中种入8粒水稻种子(品种：秋田小町Akitakomachi)，然后在人工气象室中培育，在本叶3、4令苗阶段，进行样品的喷雾处理。每一区5钵，将PO8溶解于含有0.1％的Tween20的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)中(50μg/ml)，每一钵喷施2ml该溶液。在对照组喷施有0.1％的Tween20的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)和水。处理后，于室温下放置2小时，使叶面干燥，再于人工气象室中培育。向药液处理3天后的苗的表面喷施稻瘟病菌(race 007株，亲和性株)的分生孢子悬浊液。然后移入人工气象室继续培育，5天后通过测定各区的第4叶上发生的罹病性病斑，判定防除效果。(2)结果
结果在只喷施水的区的罹病性病斑数每叶检测出21.8个，而在喷施不含样品的磷酸缓冲液的区，每叶检测出19.3个。与对照相比，在喷施PO8区，每叶的病斑数是2.7个，确认PO8具有明显的抑制发病的效果。喷施了PO9和R2也同样可以看出大致同样的防除效果。
实施例7
稻胡麻斑病菌防除试验剂(1)方法
在于稻瘟病防除试验同样的条件(被检测植物的栽培、样品的施用方法以及病原菌感染法)下，考查PO9对稻褐斑病菌的防除效果。不过为判定防除效果的病斑数的测定要在喷施稻褐斑病菌分生孢子悬浊液2天后进行。(2)结果
结果在只喷施水的的对照区的病斑数每叶51.3个，而在以25μg/ml浓度喷施了PO9的区中每叶的病斑数是13.4个，在以50μg/ml浓度喷施了PO9的区中每叶的病斑数是10.8个，确认PO9具有明显的抑制发病的效果。
就象上述实施例所给出的那样，可知通过使用本发明所涉及的PO8、PO9或R2作为有效成分做成水稻病害防除剂是有用的。实施例8
制剂1液体制剂
将本发明的具有诱导活性的物质与其它成分按以下配比通过常规方法制备液体制剂。
PO8                                   0.25％
Tween20(和光纯药社制)                 5％
20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)               94.75％
使用的时候，将上述液剂稀释50～200倍后施用。制剂2可湿性粉剂
将本发明的具有诱导活性的物质与其它成分按以下配比通过常规方法制备可湿性粉剂。
PO9                                              5％
SORUPOLU 8070                                    10％(阴离子表面活性剂：东邦化学工业社制)
NEW CALUGEN WG-2                                 5％(阴离子表面活性剂：竹本油脂社制)
羧甲基纤维素                                     3％
中性无水硫酸钠                                   16％
粘土                                             61％
使用的时候，将上述制剂稀释500～4000倍后施用。制剂例3粉剂
将本发明的具有诱导活性的物质与其它成分按以下配合比例通过常规方法制备粉剂。
R2                                              3％
白炭黑                                          1％
磷酸二异丙酯                                    2％
滑石                                            94％制剂例4流体制剂
将本发明的具有诱导活性的物质与其它成分按以下配比通过常规方法制备流体制剂。
PO8                                     5％
聚乙二醇                                10％
(夹)氧杂蒽树胶                          0.4％
NEW CALUGEN FS-1(非离子型表面活性剂：竹本油脂社制)          10％
NEW CALUGEN FS-4                        10％(阴离子型表面活性剂：竹本油脂社制)
聚硅氧烷                                0.2％
水                                      68.4％
使用的时候，将上述制剂稀释500～4000倍后施用。
本发明涉及诱导水稻生成植物抗毒素的物质的筛选方法，以及将具有诱导水稻生成植物抗毒素作用的特定物质作为有效成分的水稻病害防除剂等。使用本发明可以得到如下的效果。1)可以简便而且高精度地筛选诱导水稻生成植物抗毒素的诱导剂。2)提供用作为了筛选诱导水稻生成植物抗毒素的诱导剂的指标物质的phytocassane和momilactone A的使用方法及其分析方法。3)提供以具有诱导水稻生成植物抗毒素作用的特定物质作为有效成分的水稻病害防除剂。4)由于植物抗毒素对于稻瘟病菌、稻纹枯病菌和稻胡麻斑病菌等病菌具有很强的抗菌性，所以利用本发明的筛选方法选择出来的物质作为稻瘟病菌、稻纹枯病菌和稻胡麻斑病菌等水稻病害防除剂的有效成分是很有用的。

Claims (6)

1.一种诱导水稻生成植物抗毒素性质的诱导剂的筛选方法，其特征在于，作为试验植物使用的是水稻的幼苗，然后将用于测试的样本施用于该水稻幼苗的适宜的部位，以水稻中生成的特定植物抗毒素作为筛选的指标物质进行诱导剂的筛选，所述特定植物抗毒素选自山扁豆烷和/或日本冷杉内酯。
2.权利要求1记载的诱导剂筛选方法，其特征是将试验样品滴施于水稻幼苗叶身的前端部分，然后用溶剂提取该植物体中生成的植物抗毒素，以水稻植物抗毒素植物山扁豆烷和日本冷杉内酯A作为指标物质进行高效液相色谱分析。
3.水稻病害防除方法，其特征是通过权利要求1的筛选方法鉴定诱导水稻植物生成植物抗毒素的诱导剂，然后将该诱导剂施加到水稻植物上。
4.权利要求3记载的水稻病害防除方法，其特征是诱导剂选自脑苷脂化合物PO8、PO9、R2及其衍生物。
5.水稻病害防除方法，其特征是将有效量的通过权利要求1记载的诱导剂筛选方法筛选出来的具有诱导水稻生成植物抗毒素作用的一种或2种以上物质施加到水稻上。
6.权利要求5记载的水稻病害防除方法，其特征是诱导剂选自脑苷脂化合物PO8、PO9、R2及其衍生物。
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