KR100315619B1 - 벼에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터의 스크린방법 및 엘리시터를 유효성분으로 하는 벼 병해 방지제 - Google Patents

벼에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터의 스크린방법 및 엘리시터를 유효성분으로 하는 벼 병해 방지제 Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터의 스크린방법 및 벼 병해 방지제를 제공하는 것이다.
본 발명은, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터를 스크린하는 방법에 있어서, 시험식물로서 벼 유식물을 사용하고, 시험시료를 그 벼 유식물의 적당한 부위에 시용하고, 그 식물체에서 생성된 피토알렉신을 지표물질로 사용하여 엘리시터를 스크린하는 것으로 이루어진 엘리시터의 스크린방법, 또한, 벼에 피토알렉신의 생성을 유도하는 작용을 보유한 특정 화합물을 유효성분으로 하는 벼 병해 방지제에 관한 것이다.

Description

벼에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터의 스크린방법 및 엘리시터를 유효성분으로 하는 벼 병해 방지제
일반적으로, 식물은 병원균과 접촉하면 저항성 반응(과민성 반응)을 보이고, 반응부위의 주위의 조직에 병원균에 대한 항균성을 보이는 피토알렉신을 생산하는 것이 공지되어 있다. 벼의 피토알렉신으로서는, 모밀락톤 A,B, 올리자렉신(oryzalexins) A,B,C,D,E,F,S, 사쿠라네친(sakuranetin), 올리자산 A,B, 올리자라이드 A,B가 공지되어 있다. 그 이외에, 본 발명자 등이 발견한 피토카산 A,B,C,D(특허평 7-43520호)가 있다.
식물체 중에서 피토알렉신의 생산을 유도하는 물질은 엘리시터라고 불리우고(Keen, N.T.; 과학 187:74-75(1975)), 지금까지 많은 물질이 식물병원균으로부터 분리되고 있다. 대표적인 엘리시터로는, 다당물질로서 피토프토라 메가스퍼마 에프. 에스피. 글리시네아(Phytophthora megasperma f. sp. glycinea)로부터 분리된 헵타-β-D-글루코피라노시드(glucopyranoside)(sharp, J. K., B. Valentand, P. Albersheim; J. Biol. chem. 259:11321-11336(1984)), 단백물질로서 모닐리니아프럭티콜라(Monilinia fructicolar)로부터 분리된 모니콜링 A(Cruickshank, I. A. M과 D. R. Perrin: Life Sci. 7:449-458(1968), 지질로서 피토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)로부터 분리된 에이코사펜텐산(Bostock, R. M., J. Kuk과 R. A. Laine; Science 212:67-69(1975))이 있다.
상기한 바와 같이, 엘리시터는 식물체 중에서 병해균에 항균성을 나타내는 피토알렉신의 생산을 유도하는 작용을 갖기 때문에, 종래의 농약과는 다른 작용에 의한 안전성이 높은 식물병해방지제의 유효성분으로 이루어질 수 있는 물질이라고 생각되며, 유용한 엘리시터를 발견하는 것 및 유용한 엘리시터를 발견하기 위한 방법으로서, 엘리시터 활성이 있는 물질을 신속하고 간편하게 탐색할 수 있는 새로운 스크린방법이 강구되어지고 있다.
이와 같은 상황에서, 본 발명자는, 상기 종래기술에 비추어서, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 유용한 엘리시터를 탐색하기 위한 새로운 탐색방법을 개발하는 것을 목표로 하여 예의 연구를 적중시킬 수 있었지만, 엘리시터 활성이 있는 벼식물체를 사용하여 스크린하는 방법이 대단히 어렵고, 지금까지 유효한 방법은 확립되어 있다고 할 수 없다. 따라서, 본 발명자는 유효한 방법을 개발하기 위해 다양한 검토를 거듭하던 중, 시험 벼식물의 종류, 벼의 재배방법, 시험시료의 시용방법, 피토알렉신의 분석방법의 기본기술을 새로이 확립하는 것에 성공하여, 이에 의해서 엘리시터 활성이 있는 물질을 스크린하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.
즉, 시험에 사용하는 벼에 대해 검출한 결과, 시험 벼식물의 품종과 종류,재배온도, 습도, 시험 벼식물의 나이, 시험시료의 시용부위 등이 매우 중요하다는 것을 알게 되었고, 각각 최적의 조건을 설정하여 스크린방법으로서 사용할 수 있다는 것이 판명되었다. 또한, 분석하는 피토알렉신에 대해서는, 피토카산과 모밀락톤을 적합한 예로서, 벼식물체에서 생산이 유도되는 피토알렉신의 유출방법과 HPLC에 의한 분석방법을 정하였다.
상기의 방법에 의해서, 다양한 물질을 시험한 결과, 여러종의 엘리시터 활성이 있는 화합물을 발견하였다.
또한, 본 발명자는, 상기 스크린방법을 이용하여, 엘리시터 활성이 있는 물질을, 미생물 생산물을 대상으로 하여 넓게 스크린한 결과, 식물병원균을 포함한 사상균(絲狀菌)에 넓게 이와 같은 엘리시터 활성을 보유한 물질이 존재한다는 것을 발견하였다.
더욱이, 이 물질을 용매추출, 칼럼크로마토그래피 등의 수단에 의해 따로 분리하고, 3종의 활성물질을 얻어서, 그 구조해석을 행한 결과 그 물질이 하기의 구조식으로 나타나는 세레브로사이드 화합물 PO8, PO9 및 R2 인 것을 밝히고, 또한 이들 물질이 벼 병해 방지제의 유효성분으로서 유효하다는 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
PO8
PO9
R2
본 발명자 등이 엘리시터 활성이 있는 물질로 발견한 세레브로사이드 화합물 PO8, PO9 및 R2의 화학구조에 대해서는, 이미 참고문헌에 보고되어 있으며, PO8은 세레브로사이드 A(Sitrin, R. D. et al.; J. Antibiot 41; 469-480(1988))와, PO9는 PENⅡ(Kawai, G. et al.; Agric. Biol. Chem. 49: 2137-2146(1985))와, 또는 R2는 세레브로사이드 B(Kawai, G. et al.; J. Lipid. Res., 26: 338-343(1985))와 동일한 구조를 갖는다. 그러나, 본 발명에 관한 엘리시터 활성을 보유하는 물질은 참고문헌에 기재되어 있지 않으며, 또한 그 세레브로사이드 화합물이 벼식물에 대해서 벼 병해 방지작용을 갖는다는 것을 밝힌 것은 본 발명자가 최초이다.
본 발명은, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 성질을 갖는 엘리시터의 스크린방법 및 그 스크린 방법에 의해서 스크린된 엘리시터를 유효성분으로 하는 벼 병해 방지제에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터를 신속하고 정확하게 스크린하는 방법에 있어서, 시험용의 벼식물을 재배하고, 시험시료를 그 벼식물의 적당한 부위에 사용하고, 벼식물체 중에서 생성된 특정의 피토알렉신을 스크린의 지표물질로 사용하여 그 분석을 행하고, 이에 의해서, 벼에 피토카산(Pytocassanes), 모밀락톤(Momilactones) 등의 피토알렉신의 생성을 유도하는 성질을 가진 물질을 스크린하는 방법에 관한 것이다. 이들 피토알렉신은, 벼 병해, 예컨대, 벼도열병 병균(이전에 피리큘라리아 오리자에(Pyricularia oryzae)로 불리우던 마그나포르테그리세아(Magnaporthe grisea)), 벼잎마름병 병균(Rhizoctonia solani), 벼엽고(葉枯)병 병균(Cochliobolus miyabeanus)에 강한 항균성을 가지기 때문에, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 성질을 갖는 엘리시터는 벼 병해 방지제의 유효성분으로서 이용된다.
또한, 본 발명은, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 작업을 갖는 세레브로사이드(cerebroside) 화합물 PO8, PO9, R2 및 그 세레브로사이드 유도체에 관한 것이고, 그 물질의 1종류 또는 2종류 이상의 물질을 벼 병해 방지제로서 이용하는 방법, 또한, 세레브로사이드 화합물 및 유도체를 벼의 잎에 널리 이용되는 것에 의해, 벼에서 피토알렉신인 피토카산, 모밀락톤의 생성을 유도시키는 방법에 관한 것이다. 이들 피토알렉신은, 벼의 병해, 예컨대, 벼도열병 병균, 벼잎마름병 병균, 벼엽고병 병균에 강한 항균성을 갖기 때문에, 그 세레브로사이드 화합물 및 유도체는 벼 병해 방지제의 유효성분으로서 이용된다.
도 1은, 본 발명에 관한 세레브로사이드 화합물(PO8)의 적외부 흡수스펙트럼을 나타낸다.
도 2는, 본 발명에 관한 세레브로사이드 화합물(PO9)의 적외부 흡수스펙트럼을 나타낸다.
도 3은, 본 발명에 관한 세레브로사이드 화합물(R2)의 적외부 흡수스펙트럼을 나타낸다.
도 4는, 본 발명에 관한 세레브로사이드 화합물(PO8)의1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는, 본 발명에 관한 세레브로사이드 화합물(PO9)의1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은, 본 발명에 관한 세레브로사이드 화합물(R2)의1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은, 본 발명에 관한 세레브로사이드 화합물(PO8)의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은, 본 발명에 관한 세레브로사이드 화합물(PO9)의13C-NMR 스펙트럼을나타낸다.
도 9은, 본 발명에 관한 세레브로사이드 화합물(R2)의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
(발명의 요약)
본 발명은, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터의 스크린방법 및 벼 병해 방지제을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터의 스크린방법에 있어서, 시험식물로서 벼 유식물(幼植物)을 사용하고, 시험시료를 그 벼 유식물의 적당한 부위에 시용하고, 그 식물체 중에서 생성된 피토알렉신을 지표물질로 사용하여 엘리시터를 스크린하는 것으로 이루어진 상기 엘리시터의 스크린방법, 또한, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 벼 병해 방지제에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터를 간편하고 고정밀도로 스크린 할 수 있고, 또한, 잔유 독성이 없는 저독성, 무공해의 벼 병해 방지제를 제공할 수 있다.
(발명의 개시)
상기한 바와 같이, 본 발명은 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터를 스크린하는 방법에 관한 것이고, 시험식물로서 벼 유식물을 이용하고, 벼식물체에서 생성된 피토알렉신(피토카산, 모밀락톤 등)을 HPLC에 의해 분석하는 방법에 관한 것이다. 또한, 이 방법에 의해서 얻어진 엘리시터 활성물질에 관한 것이다.
즉, 본 발명의 목적은, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터를 스크린하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, 벼식물 피토알렉신의 피토카산, 모밀락톤 A를 지표물질로 사용하여, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 성질을 보유한 엘리시터를 신속하고 간편하게 탐색하기 위한 스크린방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 작용을 갖는 특정 물질을 유효성분으로 하는 벼 병해 방지제를 제공하는 것이다.
상기 문제를 해결하기 위한 본 발명은, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터를 스크린하는 방법에 있어서, 시험식물로서 벼 유식물을 사용하고, 시험시료를 벼 유식물의 적당한 부위에 시용하고, 그 식물체 중에서 생성된 특정의 피토알렉신을 지표물질로 사용하여 엘리시터를 스크린하는 것을 특징으로 하는 상기 엘리시터의 스크린방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 실시예는, 시험재료를 벼 유식물 잎의 넓은 부위의 선단부분에 적하시용하고, 그 식물체에서 생성된 피토알렉신을 용매추출하고, 벼식물 피토알렉신의 피토카산, 모밀락톤 A를 지표물질로 사용하여 고속액체크로마토(HPLC)에 의해 분석하는 것을 특징으로 하는 상기의 엘리시터의 스크린방법을 적합한 태양으로 한 것이다.
또한, 본 발명은, 상기의 스크린방법에 의해서 스크린된, 벼식물에 피토알렉신의 생성을 유도하는 작용을 가지며, 세레브로사이드 화합물 PO8, PO9, R2 및 그 유도체로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 물질을 유효성분으로 하는 벼 병해 방지제에 관한 것이다.
다음에, 본 발명에 대해 더 상세하게 설명한다.
본 발명자는, 벼식물에서 피토알렉신의 생산을 유도시키는 물질의 스크린방법으로서, 시험 벼식물의 품종, 재배조건, 피토알렉신의 분석조건에 대해 상세하게 검토하였다. 시험에 사용하는 벼의 품종으로는, "아키타코마치(Akitakomachi)", "코시히카리(Koshihikari)" 등이 적합하고, 배토는 벼의 생육에 필요한 질소, 인산, 칼륨비료를 적당하게 함유한 과립상의 배토, 구체적으로는, 호넨스(HONENS) 배토 1호(농업합동협회 국제연맹)를 사용하는 것이 적합하고, 시험 벼식물의 재배조건으로는, 온도, 습도, 조도의 제어가 중요하다는 것을 알게 되었다. 구체적으로는, 예컨대, 싹이 나온 종자를 분획에 심고, 30∼32℃로 암실에서 약 2∼3일 재배하고, 싹이 흙 위에 2∼3cm정도 자란 때에 인공기상실 내로 옮긴다. 인공기상실은 온도 18∼20℃로, 습도 80∼85%, 조도 2000∼3000lux의 조건으로 유지된다. 다음에, 두번째의 본 잎이 나온 단계에서 조도 3000∼4000lux, 습도 95∼100%, 일중 온도 27∼30℃로 바꾸고, 다섯번째 본 잎이 완전히 전개할 때까지 재배한다. 이들 재배조건은 그와 동등의 범위에서 적당히 변경할 수 있다는 것은 말할 필요도 없다. 또한 시험시료는 다섯 번때 본 잎의 넓은 부위 선단부분에 캐필러리 피펫(capillary pipet)을 사용하여 적하시용하는 것이 바람직하다.
시료를 시용시킨 벼는 다시 1주간 재배한 후, 시용부위의 잎을 가늘게 절단하여 초산에틸, 메탄올 등의 용매로 추출처리를 행한다. 추출물을 HPLC로 분석하고, 예컨대, 피토카산, 모밀락톤에 대해서는, 유지시간 35분 전후의 피토카산 A, 유지시간 43분 전후의 피토카산 B, 유지시간 50분 전후의 모밀락톤 A의 각 피크높이로부터 유도되는 피토알렉신의 양을 구할 수가 있다. 다른 피토알렉신에 대해서도 마찬가지로 분석할 수 있다.
상기 스크린방법은, 기본적으로는 다음과 같은 구성으로 이루어진다.
(1) 시험식물(벼)
① 품종: 아키타코마치, 코시히카리
② 나이: 벼 유식물, 특히, 다섯번째 본잎
③ 재배: 여섯번째 본 잎이 완전히 전개할 때까지 재배
(2) 시험시료의 시용
① 시용부위: 잎의 넓은 부위, 특히 그 선단부분
② 시용방법: 캐필러리 피펫 등으로 적하시용
③ 시용후의 재배기간: 약 1주간
(3) 추출 및 분석
① 시료의 조제: 시용부위의 잎의 넓은 부위를 가늘게 절단
② 추출: 초산에틸, 메탄올 등의 용매추출
③ 분석: HPLC 분석
이 스크린방법에 의해서 후술하는 제2실시예에서 나타내는 것과 같은 화합물이, 벼식물에서 피토알렉신의 생산을 유도시키는 물질로서 발견되었다.
또한, 본 발명자는, 상기 스크린방법을 이용하여, 피토알렉신의 생산을 유도하는 물질을 검색하는 것을 목표로 하여, 벼 잎의 넓은 부위의 잎면에 시료를 도포하여 적시에 재배한 후, 벼식물체에서 생산되는 피토알렉신의 양을 측정하는 시험을 다양하게 실시하는 과정에서, 벼도열병 병균이나 벼잎마름 병균 등 식물병원균을 비롯하여 사상균 균체의 유기용매 추출물이 피토알렉신을 유도하는 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
피토알렉신의 생산을 유도하는 물질인 PO8, PO9는, 벼도열병 병균의 균체를 초산에틸, 아세톤, 에탄올 등의 용매로 추출처리하고, HPLC, 박층크로마토그래피(Thin Layer Chromatography; TLC) 등의 수단에 의해 정제처리하는 것에 의해서 단일 성분의 것으로 분리할 수가 있다.
본 발명에서 사용되는 식물병원균을 배양하는 액체배양으로는, 식물 또는 미생물의 추출물을 사용하는 종래로부터 사상균의 배양에 이용되고 있는 배양이라면 어느 것도 사용할 수 있지만, 바람직하게는, 예컨대, PSY배지 등이 예시된다. 이들 배지에는 감자 등의 식물추출성분 또는 효모의 추출물 등이 이용된다.
PO8, PO9의 추출, 분리의 구체적 공정에서는, 예컨대, 벼도열병 병균의 균체를 산화에틸 등의 용매로 추출 후, TSKgel ODS120A ODS120T(토쇼이사제) 등의 컬럼을 이용한 HPLC에 의한 분획, 응축 건조 등의 제조공정에 의해 정제하고, 따로 분리하는 방법이 적합한 것으로서 예시되지만, 그 방법에 한정하지 않고, 다른 마찬가지의 정제수단을 적당히 조합하여 실시하는 것도 가능하고, 그 정제공정에 대해서 특별히 한정되는 것은 아니다. R2에 대해서도, 마찬가지의 정제수법에 의해 예를 들면 벼잎마름병 병균에 의해 분리·정제된다.
본 발명에 관한 PO8, PO9, R2는 다음과 같은 성질을 보유한다.
1) FAB-MS에 의한 질량분석으로, PO8은 분자량 725, PO9는 분자량 753, R2는 분자량 727을 나타내었다.
2) PO8, PO9, R2는 각각 도 1∼도 3에서 나타내는 적외부 흡수스펙트럼을 나타낸다.
3) PO8, PO9, R2는 각각 도 4∼도 6에서 나타내는1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
4) PO8, PO9, R2는 각각 도 7∼도 9에서 나타내는13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
5) PO8, PO9, R2는 벼식물에서 피토알렉신의 생산을 유도하는 작용을 보유한다. 유도되는 피토알렉신으로는 피토카산 A,B,C,D, 모밀락톤 A,B 등이다. 이들 피토알렉신은 벼도열병 병균, 벼잎마름 병균, 벼엽고 병균에 대한 강한 항균성을 보유하기 때문에, 이러한 물질이 유도된 벼식물은, 병해균의 감염에 대해서 저항성을 나타낸다고 생각된다.
후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 관한 PO8, PO9, R2는, 벼식물에서 항균성 물질인 피토알렉신의 생산을 유도하는 성질을 보유하기 때문에, PO8, PO9, R2는 벼도열병, 벼잎마름병, 벼엽고병 등의 벼 병해에 대한 방지제의 유효성분으로서 유용하다. 즉, 그 화합물을 적당한 형태의 제제로 하여 벼식물에 시용하는 것에 의해, 벼 병해의 발생을 방지할 수가 있다.
후술하는 실시예에서 나타내는 바와 같이, 본 발명의 벼 병해 방지제는, 그 사용목적에 따라서, 상기 유효량을 함유하는 적당한 형태로 제제화하면 좋고, 그 형태, 제제수단 등에 특별히 한정되는 것은 아니다. 후술하는 실시예에서 기술한 바와 같이, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 작용을 보유하는 화합물을 벼식물에 시용하는 방법으로는, 예컨대, 그 화합물을 0.1%의 트윈(Tween) 20을 함유한 20mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해하여, 그 용액을 벼식물에 분무산포하는 방법이 적합한 것으로 예시되지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 그 이외의 방법도사용될 수 있으며, 그 화합물을 벼식물에 시용하기 위한 제제의 형태, 그 사용형태, 시용방법 등에도 한정되는 것이 없다.
(발명을 실시하기 위한 최량의 형태)
이하에, 실시예에 의거하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이하의 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
(1) 시험식물로서 이용하는 벼식물의 재배
벼의 종자(품종: 아키타코마치, 코시히카리)를 소금물에 절여서, 선별하여 불량한 종자를 제거한 후, 싹이 나오도록 하였다. 싹이 나온 종자를, 호넨스(HONENS)재배 1호(농업합동협회 국제연맹)를 채운, 직경 6cm의 분획에 8개 심고, 32℃의 암실에서 약 2∼3일 재배하였다. 싹은 토양표면으로부터 2∼3cm정도 자란 때에 인공기상실 내의 유리상자 내로 옮겼다. 인공기상실은 온도 18℃, 습도 80%, 조도 3000lux의 조건으로 유지하였지만, 벼식물 분획은 약간 차광된 장소에 위치하게 하였다. 다음에, 두번째 본 잎이 나온 단계에서 조도 3000lux, 습도 100%, 일중 온도 27∼30℃의 조건으로 바꾸고, 다섯번째 본잎이 완전히 전개할 때까지 재배하였다. 이와 같이 하여 재배한 벼 유식물을 이하의 시험에 이용하였다.
(2) 시료의 시용과 피토알렉신의 유도
시료는, 표 1에 나타낸 바와 같이, 시료 1∼6을 준비하였다.
시료용액 20㎕를, 캐필러리 피펫을 이용하여, 상기와 같이 하여 재배한 벼 유식물의 다섯번째 본잎의 넓은 부위 선단부분에 10방울씩 시용하였다. 시료를 0.1%의 트윈 20을 함유한 20mM 인산 완충액(pH 7.0)에 소정 농도 용해하여 피토알렉신 유도시험에 이용하였다.
시료를 시용한 벼는 습도 80%, 조도 2000lux, 야간온도 18℃, 주간온도 23℃의 인공기상실에서 3일간 재배하였다. 더욱이 낮의 습도를 100%로 설정하여 4일간 재배하였다.
(3) 피토알렉신의 추출과 분석
시료를 시용한 벼 잎의 넓은 부위를 8매 채취하고, 가늘게 자른 후, 초산에틸-0.1N Na2CO3혼합액(1:1)을 10ml 부가하여 밤동안에 진탕 하에서 추출을 행하였다. 추출물을 원심분리(5000rpm, 4℃, 20분)에 의해 분리하고, 상등액(초산에틸상)을 분리하여 농축 건조하였다. 건조한 추출물을 0.4ml의 에탄올로 용해하고, 또 0.6ml의 0.02NHCl을 부가혼합하였다. 이것을 원심처리하여 얻은 상청액 100㎕을 HPLC 분석에 사용하였다. HPLC의 조건은 이하에 나타낸 대로이다.
컬 럼: TSK-gel ODS 120T(4.6mm×300mm)
용 매: 아세토니트릴-물(45:55) (용적비)
유 속: 1.2ml/분
온 도: 50℃
검출기: UV 280nm(피토카산) /215nm(모밀락톤)
(4) 결과
상기의 방법에 따라 넓게 화합물을 스크린한 결과, 하기의 시료 1∼6로 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 작용을 알아내었다.
1) 2-피라진카르복시산(2-Pyrazinecarboxylic acid)
2) 피콜린산(Picolinic acid)
3) 2,6-피리딘디카르복시산(2,6-Pyridinedicarboxylic acid)
4) 2,3-피리딘디카르복시산(2,3-Pyridinedicarboxylic acid)
5) 피롤-2-카르복시산(Pyrrole-2-carboxylic acid)
6) 옥손산(Oxonic acid, potassium salt)
1) 2-피라진카르복시산(2-Pyrazinecarboxylic acid)
2) 피콜린산(Picolinic acid)
3) 2,6-피리딘디카르복시산(2,6-Pyridinedicarboxylic acid)
4) 2,3-피리딘디카르복시산(2,3-Pyridinedicarboxylic acid)
5) 피롤-2-카르복시산(Pyrrole-2-carboxylic acid)
6) 옥손산(Oxonic acid, potassium salt)
(실시예 2)
[표 1]
표 1에 나타낸 바와 같이, 시료 1∼6는, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 작용을 보유하고, 벼 병해 방지제의 유효성분으로서 유용하다는 것이 밝혀졌다.
(실시예 3)
PO8, PO9의 제조
(1) 벼 도열병 병균의 배양
껍질을 벗긴 감자 200g을 가늘게 절단하고, 1L의 증류수를 첨가하여, 121℃, 60분간, 오토클레이브(autoclave)처리를 행하였다. 오토클레이브처리 후, 고형물을 거즈로 여과하고, 1L의 여과액을 조제하였다. 여과액에 2%의 사카로스(saccharose)와 0.5%의 효모엑기스를 부가하여 PSY배지를 제조하였다. 그 배지를 500mm용 삼각플라스크에 각각 200ml씩 나누어 따르고, 121℃에서 40분간 살균하고 냉각하였다. 냉각한 배지에, 벼 도열병 병균(레이스031주)을 접종하고, 26℃로 7일간 진탕(150rpm)에서 배양을 행하였다.
(2) PO8, PO9의 추출 및 정제
배양 종료후, 배양물을 거즈로 여과하고, 벼 도열병 병균의 균체를 채취하였다. 균체 중량의 5배량 정도의 증류수를 첨가하고, pH10.5로 조정한 후, 물과 같은 용량의 초산에틸을 첨가하여 교반하에서 추출하였다. 초산에틸상을 분리하고, 감압하에서, 초산에틸을 제거하는 것에 의해, 오일상의 잔유물을 얻었다. 잔유물을 85% 에탄올에 용해시켜 조제한 시험액을, TSKgel ODS120A의 HPLC컬럼(21.5mm×375mm, 토쇼이사제)에 주입하고, 91%에틸(10ml/분)로 용출하였다. PO8은 유지시간(retention time) 25분 전후, PO9는 유지시간 30분 전후에서 용출되었다. 각각의 분획을 모으고, 같은 컬럼에서 다시 크로마토그래피를 행하였다. PO8은 81%에틸(10ml/분)로 유지시간 60분 전후, PO9는 86%에틸(10ml/분)로 유지시간 40분 전후에서 용출되었다. 또한, 각각의 분획을 모으고, TSKgel ODS120T 컬럼(21.5mm×375mm, 토쇼이사제)을 이용하여 HPLC를 행하고, 95% 아세토니트릴(10ml/분)로 분획하였더니, PO8은 유지시간 43분 전후, PO9는 유지시간 60분 전후에서 용출되었다. 각각의 분획을 모으고, 증류하여 용매를 제거하였더니, 순수한 PO8, PO9 생성물이 얻어졌다.
(실시예 4)
R2의 제조
벼잎마름병 병균을 벼도열병 병균과 같은 조건하에서 배양하고 초산에틸에 의한 조추출(粗抽出)을 행한 후, 회수된 분획을 HPLC로 함께 시험하였다. HPLC에 의한 1차정제로서, TSKgel ODS120A의 컬럼(21.5mm×375mm, 토쇼이제)을 이용하였더니, R2는 91% 에틸(10ml/분)로 유지시간 26분 전후에서 용출되었다. 2차정제로서 86% 에탄올(10ml/분)로 다시 크로마토그래피를 행하였더니, R2는 유지시간 50분 전후에서 용출되었다. 또한, TSKgel ODS120T의 컬럼(21.5mm×375mm, 토쇼이사제)을 이용하여 아세토니트릴과 에탄올을 각각 46.5% 함유한 혼합액을 용리액으로서 10ml/분의 유속으로 분화하면, R2는 유지시간 53분 전후에서 용출되어 완전히 정제되었다.
(실시예 5)
PO8, PO9, R2에 의한 피토알렉신의 유도
(1) 피토알렉신의 생산
실시예 1에서 얻은 PO8, PO9, R2를 트윈 20을 0.1% 함유한 20mM 인산 완충액(pH 6.5)에 용해하고, 100ppm의 시료용액을 제조하였다. 이 각 농도의 시료용액 및 시료를 함유하지 않은 용매액을, 화분에서 재배한 벼식물(품종:아키타코마치)에 시용하고, 피토알렉신 생산의 유도 활성을 측정하였다. 이 경우, 시용부위는 완전히 전개한 다섯번째 잎이 넓은 부위 선단부분으로 하고, 그 적당한 간격을 둔 10곳에 캐필러리 피펫을 이용하여 각 시료용액을 20㎕(1잎 부근) 적하시용하였다.
(2) 피토알렉신의 추출
시료용액으로 처리한 벼식물을 인공기상실에서 7일간 재배 후, 처리잎을 8매로 하여, 얇게 절단할 후, 초산에틸-0.1N 탄산나트륨 혼합액(1:1, pH10)을 10ml 첨가하여 밤동안에 진탕시켰다. 초산에틸상을 분리하여 농축 건조한 후, 4ml의 에탄올에 다시 용해시켰다.
(3) HPLC에 의한 분석
이 용액에 0.02 NHCl을 0.6ml 첨가하여 혼합한 후, 원심분리처리를 행하였다. 얻어진 상등액 중 100㎕를 HPLC에 의한 분석에 이용하였다.
HPLC의 조건은 하기에 기재한 바와 같다.
컬 럼: TSK-gel ODS120T(4.6mm×300mm, 토쇼이사제)
용 매: 아세토니트릴(45:55) (용적비)
유 속: 1.2ml/분
온 도: 50℃
검출기: UV 280nm(피토카산)/ 215nm(모밀락톤)
다음의 표 2에, 유도된 피토알렉신의 양을 나타낸다. 표 2의 결과로부터 명백하듯이, 본 발명에 관한 PO8, PO9, R2는 벼식물에서 피토알렉신(피토알렉신 A,B, 메밀락톤 A,B)을 고농도로 유도하는 활성을 보유한 것으로 나타났다.
[표 2]
(실시예 6)
벼 도열병 방지 시험
(1) 방법
8개의 벼식물(품종:아키타코마치) 종자를 각 화분에 파종하여, 인공기상실에서 재배하고, 세 번째 내지 네번째 본 잎 단계에서 그 유식물에 시료의 분무처리를 행하였다. 1구역당 5개 화분으로 하여, PO8을 0.1%의 트윈 20을 함유한 20mM 인산완충액(pH 7.0)으로 용해(50㎍/ml)시켜, 1개의 화분주위에 2ml를 그 유식물에 분무하였다. 또한, 대조로서 0.1%의 트윈 20을 함유한 20mM(pH 7.0) 및 물을 그 유식물에 분무처리하였다. 처리후, 실온에서 2시간 방치하여 잎면을 건조시켜서 다시 인공기상실에서 재배하였다. 약액처리 3일 후 유식물의 표면에 벼 도열병 병균(레이스007주:친화성주)의 분생포자(分生胞子) 현탁액을 분무하였다. 그 후, 암흑의 가습실에서 36시간 방치하여 그 병원균으로 감염시켰다. 그 후, 인공기상실로 옮겨 재배를 계속하고, 5일 후에 각 구역의 제4의 본잎에 발생한 이병성(罹病性) 병반(病斑)을 측정하는 것에 의해 방지효과를 판정하였다.
(2) 결과
그 결과, 물만을 산포한 구역의 이병성 병반수가 1잎 주위에서 21.8개 검출하였고, 시료를 함유하지 않은 인산 완충액을 분무한 구역에서는 1잎 주위에 19.3개로 되었다. 이에 대해서, PO8 산포 구역에서는 1잎 주위의 병반수가 2.7개였고, PO8에서 명백한 발명제어효과가 발견되었다. 특히 개별적으로 시험한 PO9, R2에 대해서도 같은 방지효과가 발견되었다.
(실시예 7)
벼엽고병 방지 시험제
(1) 방법
벼도열병 방지 시험과 같은 조건(시험식물의 재배, 시료의 시용방법 및 병원균 감염법)에서, PO9의 벼엽고병에 대한 방지효과를 조사하였다. 단, 방지효과를 판정하기 위한 병반수의 판정은, 벼엽고병 병균 분생포자 현탁액을 분무하고 2일 후에 행하였다.
(2) 결과
그 결과, 물을 산포한 대조구역의 병반수는 1잎 주위에 51.3개인 것에 대해, PO9를 25㎍/ml의 농도로 산포시용한 구역에서는 1잎 주위에 13.4개였고, PO9를 50㎍/ml의 농도로 산포시용한 구역에서는 1잎 주위에 10.8개이어서, PO9에 명백한 발병제어효과가 있음이 발견되었다.
상기한 실시예는, 본 발명에 의한 세레브로사이드 화합물 PO8, PO9 또는 R2가 벼의 병해방지제로서 유용하다는 것을 나타낸다.
(실시예 8)
(제제예1; 액제)
본 발명의 엘리시터 활성을 보유한 물질과 다른 성분을 이하의 배합비율로 배합하여 일반적인 방법에 의해 제제를 조제하였다.
PO8 0.25%
트윈 20(와코준야쿠사제) 5%
20mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0) 94.75%
이것을 사용할 때에는, 상기 액제를 50∼200배로 희석하여 산포한다.
(제제예2;수화제)
본 발명의 엘리시터 활성을 보유한 물질과 다른 성분을 이하의 배합비율로 배합하여 일반적인 방법에 의해 수화제를 조제하였다.
PO9 5%
SORUPOLU 8070 10%
(음이온 계면활성제: 토호카가쿠 코오교오사제)
NEW CALUGEN WG-2 5%
(음이온 계면활성제: 타케모토 유시사제)
카르복시메틸셀룰로오스 3%
중성무수황산나트륨 16%
점토 61%
이것을 사용할 때에는, 상기 제제를 500∼4000배로 희석하여 산포한다.
(제제예3;분제)
본 발명의 엘리시터 활성을 보유한 물질과, 다른 성분을 이하의 배합비율로 배합하여 일반적인 방법에 의해 분제를 조제하였다.
R2 3%
화이트카본 1%
인산 디이소프로필 2%
활석 94%
(제제예4;분산제)
본 발명의 엘리시터 활성을 보유한 물질과 다른 성분을 이하의 배합비율로 배합하여 일반적인 방법에 의해 분산제를 조제하였다.
PO8 5%
폴리에틸렌글리콜 10%
크산탄 건(xanthan gun) 0.4%
NEW CALUGEN FS-1 6%
(비이온형 계면활성제: 타케모토 유시사제)
NEW CALUGEN FS-4 10%
(음이온 계면활성제: 타케모토 유시사제)
실리콘 0.2%
물 68.4%
이것을 사용할 때에는, 상기 제제를 500∼4000배로 희석하여 산포한다.
본 발명은, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 물질의 스크린방법 및 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 작용을 하는 특정물질을 유효성분으로 하는 벼 병해 방지제 등에 관한 것이고, 본 발명에 의하여, 다음과 같은 효과가 얻어진다.
1) 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터를 간편하고 고정밀도로 스크린할 수가 있다.
2) 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터를 스크린하기 위한 지표물질로서 벼 피토알렉신의 피토카산, 메밀락톤 A를 사용하는 방법 및 그 분석방법이 제공된다.
3) 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 작용을 보유한 특정물질을 유효성분으로 하는 벼 병해 방지제가 제공된다.
4) 피토알렉신이 벼도열병 병균, 벼잎마름병 병균, 벼엽고 병균 등에 대한 항균성을 보유하고 있기 때문에, 본 발명의 스크린방법으로 선발된 물질은 벼도열병, 벼잎마름병, 벼엽고병 등의 벼 병해 방지제의 유효성분으로서 유용하다.

Claims (3)

  1. 시험식물로서 벼 유식물을 사용하고, 시험시료를 그 벼 유식물의 적당한 부위에 시용하고, 그 식물체에서 생성된 특정의 피토알렉신을 지표물질로 사용하여 엘리시터를 스크린하는 것을 특징으로 하는 벼에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터의 스크린방법.
  2. 제1항에 있어서, 시험시료를 벼 유식물의 잎이 넓은 부위 선단부분에 적하시용하고, 그 식물체에서 생성된 피토알렉신을 용매추출하고, 벼식물 피토알렉신인 피토카산, 메밀락톤 A를 지표물질로 사용하여 고속액체크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석을 행하는 것을 특징으로 하는 벼에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 엘리시터의 스크린방법.
  3. 청구항 1항에 기재된 스크린방법에 의해서 스크린된 후, 벼식물에서 피토알렉신의 생성을 유도하는 작용을 보유하는 세레브로사이드 화합물 PO8, PO9, R2 및 그 유도체로부터 선택되는 것 중에서 1종 또는 2종 이상의 물질을 유효성분으로서 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 벼 병해 방지제.
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