CN112266370B - 二萜类衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明利用现代分离纯化，结构解析等技术，对大灰藓的次生代谢产物进行了分离纯化，获得了一种新的二萜衍生物：

Description

二萜类衍生物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及农业医药领域，具体涉及二萜类衍生物及其制备方法以及该衍生物的农业用途。
背景技术
应用传统的随机合成筛选模式成功开发新除草剂的几率已越来越小,合成化学除草剂的环境毒性及药害问题也日益严重。天然除草活性化合物具有易生物降解、毒性低、开发费用少、化学结构新奇、作用方式独特、靶标选择性高等合成除草剂无法比拟的优势,其研究日益受到人们的重视。在新型除草剂的开发过程中，一方面具有良好活性的天然产物可以直接应用；另一方面，以天然活性成分为先导化合物，通过有机合成、结构改造等方法寻找和开发新的高效低毒的化合物，是被实践证明最行之有效的途径之一。
研究学者对生化他感(Allelopathy)现象的观察已有很长的历史,但在1900年之后才开始真正进行科学的实验和研究。Allelopathy通常指一种植物对其它植物的萌发,生长发育的毒害作用。他感物质是植物体在生命活动中和残体分解产生的初级或次级代谢产物。植物之间通过生化物质(即他感物质)相互促进和相互抑制的两方面效应。目前世界上已发现上百种具除草活性的天然化合物,有些已被开发为除草剂推广应用。人工合成的植物毒素和天然植物毒素作用的分子靶位很少有重叠,这样,就可能通过植物源的次级化合物来发现具有新的作用靶位,而且对环境友好的除草剂。
发明内容
本发明运用现代分离分析方法对大灰藓(Hypnum plumaeforme Wilson)的次生代谢产物进行了系统研究，获得一种结构新颖的他感活性单体化合物。
本发明所提供的二萜类衍生物，其结构式如式Ⅰ所示，(3aR,5aR,8R,10aR,10bR,10cR)-8-((S)-1,2-dihydroxyethyl)-5a,7,8,9,10,10a,10b,10c-octahydro-3a,8,10b-trimethyl-1H-phenanthro[10,1-bc]furan-3,4(2H,3aH)-dione。
Figure BDA0002739538360000011
本发明还提供了上述二萜类衍生物制备方法，包括如下步骤：
1)将大灰藓植物Hypnum plumaeforme Wilso使用甲醇、乙醇、水中的一种或几种(优选无水乙醇)，0-40℃(优选室温)提取，将提取物浓缩成浸膏后溶于水，使用乙酸乙酯进行萃取，取乙酸乙酯相，浓缩得到粗提物；
2)将粗提物溶于甲醇，采用中低压反相硅胶色谱柱(优选反相硅胶(120埃，30–50目))，先采用50％(体积百分比)甲醇-水溶液洗涤色谱柱(优选洗涤5个柱体积，洗脱杂质)，再使用60％(体积百分比)甲醇-水溶液洗脱1-5个柱体积(优选5个柱体积)，收集第3个洗脱组分；
3)将步骤(2)收集的组分采用反相高效液相色谱柱分离纯化，流动相：甲醇–水溶液，甲醇：水体积比为65:35，0.1％甲酸，流速为2.0mL/min，检测波长为220nm，得到权利要求1所述的二萜类衍生物(保留时间为110min的组分)。
优选，反相高效液相色谱柱为Hedera C18 A-5μm，4.6mm I.D×250mm。
本发明的另一目的是提供本发明二萜类衍生物的化合物用途。
本发明通过实验证实，本发明的二萜类衍生物具有良好的抗菌活性，可以用于制备抗菌剂或抗菌药物。
本发明通过实验证实，本发明的二萜类衍生物对于其他植物具有化感作用，可以用于制备植物生长抑制剂，特别是除草剂，具有广泛的用途。
附图说明
图1为本发明实施例1反相高效液相色谱图。
具体实施方式
实施例1结构式为式Ⅰ化合物的制备
本发明采用实验室培养条件下常规条件下提取，纯化等步骤，来制备本发明化合物。其中所采用的植物为大灰藓(Hypnum plumaeforme Wilson)。
具体化合物的制备过程如下：
1)提取
采集大灰藓植物(2.4kg)，阴干后粉碎，用无水乙醇于室温下提取(5L×3)，将提取物浓缩成浸膏后溶于水中成混悬液，使用乙酸乙酯进行萃取，取乙酸乙酯相，减压浓缩至干，得到粗提物约71.8g。
2)中低压反相硅胶色谱柱纯化
将步骤1)制得的粗提物溶于适量甲醇，上样至装有120g反相硅胶(120埃，30–50目)的色谱柱，先采用50％(体积百分比)甲醇-水溶液洗涤色谱柱(优选洗涤5个柱体积，洗脱杂质)，再使用60％(体积百分比)甲醇-水溶液洗脱1-5个柱体积，收集第3个洗脱组分。
3)反相高效液相色谱纯化
将步骤2)的组分用反相高效液相色谱分析、纯化。色谱条件为：色谱柱Hedera C18A-5μm，4.6mm I.D×250mm(江苏汉邦科技)，洗脱系统为甲醇-水等度洗脱：甲醇-水(65：35，V/V，甲酸：0.1％)，流速为2.0mL/min。检测波长为220nm，柱温25℃，进样量20μL。收集保留时间为110min的组分，得到结构式为式I二萜衍生物。
式I化合物：(3aR，5aR，8R，10aR，10bR，10cR)-8-((S)-1，2-dihydroxyethyl)-5a，7，8，9，10，10a，10b，10c-octahydro-3a，8，10b-trimethyl-1H-phenanthro[10，1-bc]furan-3，4(2H，3aH)-dione，无色针晶：
[[α]D 20-131.4(c0.05，CD3OD)；UV(MeOH)λmax：(logε)214(0.95)nm；IR(KBr)νmax：3445，2977，2920，1736，1636，1132，1067cm-1；1H and 13C NMR data，see Table 1；HRESIMSm/z 349.2008[M+H]+(calcd for C20H29O5，349.2010)。
其1H-NMR及13C-NMR数据如表1所示。
表1.式I化合物的核磁数据(CD3OD)
Table 1.1H and13C NMR data for compounds 1 in CD3OD-d4 [a]
Figure BDA0002739538360000031
[a]1H and 13C were measured at 500 and 125 MHz，respectively
以上结果表明，所得化合物结构正确。
实施例2本发明式I化合物的化感活性
1)实验材料
测试所用植物种子：Samolus parviflorus Raf.,(小白菜种子)，Lactuca sativaL.var.angustana Irish(莴苣种子)，购于农业科学研究所。
测试样品：式Ⅰ化合物，纯度在98％以上；化合物以DMSO溶解后稀释，使其浓度为1mg/mL。
2)实验方法
配置1/2MS培养液：称取MS培养基2.47g，溶解于1L水中，同时加入8g琼脂粉；121℃下灭菌25分钟，将灭菌完成的1/2MS培养基倒入平面培养皿中(每个平板20ml)，在其中分别加入0.08ml以及0.32ml配置好的化合物1溶液，使其终浓度分别为4/16μg/mL.同时，在其中加入10粒小白菜种子Samolus parviflorus Raf.,以及莴苣种子Lactuca sativaL.var.angustana Irish，20±1℃条件下培养7天(18小时日光，6小时避光)，观察种子发芽情况。其中，0.32ml二甲基亚砜溶液为空白对照。
植物生长抑制率计算：抑制率(％)＝(1-SL/CL)×100％。
其中SL为加药后种子根茎长度，CL为空白对照种子根茎长度。
3)实验结果，结果如表2所示。
表2.式Ⅰ化合物对植物种子的生长抑制率
Figure BDA0002739538360000041
结果表明，本发明的式Ⅰ化合物对于小白菜以及莴苣种子的正常生长发育具有较好的抑制作用，可以作为除草剂的活性成分。
实施例3本发明式Ⅰ化合物的抗菌活性
1)实验材料
仪器与试剂：CO2培养箱；酶标仪(Bio-TEK ELx800)；LB培养基(上海生物工程有限公司)。测试所用致病细菌株：Enterobacter cloacae(阴沟肠杆菌)，Escherichia coli(大肠杆菌)，Klebsiella aerogenes(克雷伯氏菌)，Pseudomonas aeroginosa(绿脓杆菌)，Salmonella typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌)，Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)，购于中国医学科学院微生物研究所。
测试样品：本发明式Ⅰ化合物，纯度在90％以上；同时，选取硫酸链霉素为阳性对照药物，各化合物均以DMSO溶解后稀释。
2)实验方法
配置LB培养液，121℃下灭菌25分钟备用，将配置稀释好的菌液加入96孔板中，每孔加入180μl，将本发明式Ⅰ化合物配置为一定浓度的DMSO溶液，以倍数关系逐级稀释加入含有菌液的微孔中，使其最终浓度依次为64,32,16,8,4,2,1,0.5,0.25，0.125，0.0625μg/ml，于37℃培养箱中培养24小时，用酶标仪于600nm处读取吸光度，其中采用硫酸链霉素为阳性对照，180μl空白培养基与20μl的DMSO混合溶液为空白对照。实验重复3次。计算各受试样品对人类致病菌的最小抑制浓度(MIC值)。
3)实验结果，结果如表2所示。结果表明本发明所述式Ⅰ化合物对Enterobactercloacae(阴沟肠杆菌)，Pseudomonas aeroginosa(绿脓杆菌)，Salmonella typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌)，Staphylococcus aureus(金黄色葡萄球菌)具有较好的抗菌作用。
表3.式Ⅰ化合物的抗菌活性测试(MIC，μg/ml)
Figure BDA0002739538360000051

Claims (8)

1.一种二萜类衍生物，其特征在于具有如下结构：
Figure FDA0002739538350000011
2.如权利要求1所述的二萜类衍生物的制备方法，包括如下步骤：
1)将大灰藓植物Hypnum plumaeforme Wilso使用甲醇、乙醇、水中的一种或几种，0-40℃提取，将提取物浓缩成浸膏后混悬于水，使用乙酸乙酯进行萃取，取乙酸乙酯相，浓缩得到粗提物；
2)将粗提物溶于甲醇，采用中低压反相硅胶色谱柱，先采用50％甲醇-水溶液洗涤色谱柱，再使用60％甲醇-水溶液洗脱1-5个柱体积，收集第3个洗脱组分；
3)将步骤(2)收集的组分采用反相高效液相色谱柱分离纯化，流动相：甲醇–水溶液，甲醇：水体积比为65:35，0.1％甲酸，流速为2.0mL/min，检测波长为220nm，得到权利要求1所述的二萜类衍生物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤1)使用乙醇提取。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)反相高效液相色谱柱为Hedera C18 A-5μm，4.6mm I.D×250mm。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)收集保留时间为110min的组分。
6.如权利要求1所述二萜类衍生物在制备植物生长抑制剂中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述植物生长抑制剂为除草剂。
8.如权利要求1所述二萜类衍生物在制备抗菌剂或抗菌药物中的应用。
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