KR100559080B1 - 잔디 생장 촉진물질 및 잔디 생장 촉진물질의 검정 유전자 - Google Patents

잔디 생장 촉진물질 및 잔디 생장 촉진물질의 검정 유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 잔디의 생장촉진 관련 유전자, 잔디의 생장을 촉진시키는 물질 및 잔디의 생장을 촉진시키는 물질을 검정하는 방법에 관한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 미생물 유래의 엘리시터 BA-1, EB-1를 이용하여 잔디 생장을 촉진시키는 방법을 제공하며, 잔디의 생장촉진 관련 유전자로서 cyc2 유전자, PR 유전자를 제공하며, 상기 유전자를 잔디의 생장을 촉진시키는 물질의 검정유전자(reference gene)로 이용하는 방법을 제공한다.
잔디, 엘리시터, cyc2 유전자, pr 유전자

Description

잔디 생장 촉진물질 및 잔디 생장 촉진물질의 검정 유전자{Bentgrass growth promoting substance and the reference gene thereof}
도 1은 각각의 엘리시터 처리 후 잔디의 생장 촉진효과를 비교한 사진이다.
도 2는 각각의 엘리시터 처리 후 잔디종자의 발아촉진율을 비교한 그래프이다.
도 3은 벼 유전자의 프라이머를 이용하여 잔디에서 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 벼 cyc2 유전자의 프라이머에 의한 PCR 산물의 염기서열(cyc2)과 잔디에서 상기 프라이머를 이용하여 얻은 PCR 산물(cyc2-1)의 염기서열을 비교하여 나타낸 것이다.
도 4b는 벼 PR 유전자의 프라이머에 의한 PCR 산물의 염기서열(PR)과 잔디에서 상기 프라이머를 이용하여 얻은 PCR 산물(PR2)의 염기서열을 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 잔디에 엘리시터를 처리한 후 시간에 따른 cyc2 유전자의 발현량을 나타낸 것이다.
본 발명은 잔디의 생장촉진 관련 유전자, 잔디의 생장을 촉진시키는 물질및 잔디의 생장을 촉진시키는 물질을 검정하는 방법에 관한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 미생물 유래의 엘리시터 BA-1, EB-1를 이용하여 잔디 생장을 촉진시키는 방법을 제공하며, 잔디의 생장촉진 관련 유전자로서 cyc2 유전자, PR 유전자를 제공하며, 상기 유전자를 잔디의 생장을 촉진시키는 물질의 검정유전자(reference gene)로 이용하는 방법을 제공한다.
식물이 미생물과 접촉하였을 때 미생물 유래의 엘리시터(elicitor)에 대해 이 미생물에 저항성을 보인 식물은 피토알렉신(phytoalexin)이라는 저분자의 항균성 화합물을 합성하고 축적한다. 상기 피토알렉신은 페닐프로파노이드 경로(phenylpropanoid pathway)의 유도체로서 식물 병에 대한 식물의 유도저항기전에 있어서 매우 중요한 물질이다. 이와 같이 식물-미생물 상호작용 과정 중에 미생물이 분비하는 엘리시터(elicitor)는 식물의 저항성 기작을 유도하는 시그널(signal) 물질로써 오래 전부터 연구되어 왔으며 이 엘리시터를 이용하여 생물 농약으로 개발하고자 하는 시도가 있어왔다.
한편, 비병원성 토양 미생물인 바실러스 아밀로리쿠에스파시엔스 (Bacillus amyloliquesfaciens)로부터 분리한 물질 중 하나인 BA-1과 미생물인 벌크홀데리아 속(Burkholderia sp.)으로부터 자체 분리한 물질 중 하나인 EB-1 이라는 엘리시터(elicitor)를 담배에 처리하였을 때 ICR(Induced System Resistance)이 유도되며, 이를 감자에 처리하였을 때는 ISR과 함께 PGPR(plant growth promoting rhizobacteria)로 작용하여 식물의 생장촉진 및 항 바이러스성 반응을 유도한다는 보고가 있었다. 그러나 잔디와 같은 외떡잎 식물에서 엘리시터에 의한 생장 촉진 효과는 보고된 바 없다.
본 발명에서는 잔디에 상기 엘리시터(elicitor)를 처리하였을 때 PGPR에 의한 생장촉진 효과를 나타내는 것을 확인하였고, 또한 상기 엘리시터에 의해 발현되는 잔디의 생장촉진 관련 유전자를 규명함으로써 상기 유전자를 잔디의 생장을 촉진시키는 물질의 검정유전자(reference gene)로 이용할 수 있게 하였다.
본 발명의 기술적 과제는 잔디(Bentgrass)에 엘리시터(BA-1, EB-1) 처리 후 잔디의 생장촉진 효과를 검정하고, 벼의 유전자로부터 제조한 프라이머를 이용하여 잔디의 생장촉진 관련 유전자를 선별한 후 그 염기서열을 규명하고, 상기 유전자를 잔디의 생장을 촉진시키는 물질의 검정유전자(reference gene)로 이용함으로써 달성하였다.
본 발명은 잔디의 생장촉진 관련 유전자, 잔디의 생장을 촉진시키는 물질 및 잔디의 생장을 촉진시키는 물질을 검정하는 방법에 관한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 미생물 유래의 엘리시터 BA-1, EB-1를 이용하여 잔디 생장을 촉진시키는 방법을 제공하며, 잔디의 생장촉진 관련 유전자로서 cyc2 유전자, PR 유전자를 제공하며, 상기 유전자를 잔디의 생장을 촉진시키는 물질의 검정유전자(reference gene)로 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 잔디(Bentgrass)에 엘리시터(BA-1, EB-1) 처리 후 생장촉진 효과를 검정하는 단계; 벼의 유전자로부터 제조한 프라이머를 이용하여 잔디의 생장촉진 관련 유전자를 선별하고 그 염기서열을 분석하는 단계; 및 잔디의 cyc2 유전자에 엘리시터 처리 후 시간에 따른 cyc2 유전자 발현 양상을 분석하는 단계로 이루어진다.
본 발명에서는 PGPR(plant growth promoting rhizobacteria)을 유도하는 미생물 유래의 엘리시터 BA-1, EB-1를 잔디에 처리했을 때, 각각의 엘리시터에 의하여 다른 패턴으로 잔디의 생장이 촉진되는 것을 확인하였다.
또한 본 발명에서는 벼의 유전자로부터 제조한 프라이머를 이용하여, 잔디의 생장촉진 관련 유전자로서 cyc2 유전자, PR 유전자의 존재를 확인하고 그 염기서열을 규명함으로써, 상기 유전자를 잔디의 생장을 촉진시키는 물질의 검정유전자(reference gene)로 이용할 수 있게 하였다.
또한 본 발명에서는 엘리시터의 종류 및 엘리시터 처리 후 경과시간에 따라 잔디 cyc2 유전자의 발현 양상이 달라지는 것을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하나, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 엘리시터 처리 후 잔디의 생장촉진 효과
화본과 식물인 잔디에 있어서 엘리시터(elicitor)의 생장 및 발아 촉진효과 여부를 밝히기 위한 실험을 실시하였다. 조직 배양용 플레이트(plate)를 무균 상태로 MS 배지에 BA-1, EB-1과 같은 엘리시터(elicitor)를 각각 0.005ppm, 0.01ppm, 0.05ppm씩 처리하여 굳힌 뒤 벤트글래스(bentgrass)를 치상하였다.
그 결과 처리된 엘리시터 및 농도에 따라 잔디가 자라는 양상의 차이를 보였다(도 1 참조). BA-1은 무처리에 비하여 5-10%의 길이 생장을 보였으며, EB-1도 0.01ppm까지 길이 생장 촉진을 보였으나 0.05ppm에서는 다소 줄어드는 양상을 보였다. 또한 처리된 엘리시터 및 농도에 따른 잔디 종자의 발아 촉진 효과는 도 2와 같다.
따라서 실험 결과, 엘리시터가 잔디의 생장 및 종자 발아에 영향을 미치는 것을 확인하였다.
실시예 2 : 잔디( Bentgrass )의 생장촉진 유전자 분석
벼는 잔디와 같은 단자엽 식물로서, 외떡잎 식물 중 가장 많은 유전자 염기서열 분석이 이루어져 있으므로, 벼의 유전자를 이용하여 제작한 프라이머(primer)를 잔디에 적용하는 방법으로 잔디의 생장촉진 유전자를 규명하는 실험을 수행하였다.
벼에서 기능이 밝혀진 관련 유전자의 프라이머(primer)를 디자인하고 RT-PCR을 수행하였다. 프라이머는 ISR(Induced System Resistance) 관련 유전자 분리를 위하여 페닐프로파노이드 경로(phenylpropanoid pathway)에 관여하는 유전자와 PGPR(Plant Growth Promoting Rhizobacteria) 작용에 근거하여 세포주기(cell cycle)에 관여하는 유전자를 위주로 제작하였다(표 1 참조).
유전자 명칭(Full name) 포워드 프라이머/백워드 프라이머
pr 발병관련 단백질 군 (pathogesis-related protein class) 5'-TATTTGATCTTTGCGAGTGTGTATG-3'/5'-TAGCTTCCGAGCTCATTATCTTTTA-3'
5'-AGCTCGGATCATCTCTGCAT-3'/5'-TGAAGTTGAACTGCCTGACG-3'
pr-1 발병관련 단백질 군 I (pathogesis-related protein class I) 5'-CCTTATATTATGGGACAGAGGGACT-3'/5'-GTCATCAAGAGGGTAATATTCAACG-3'
5'-GATTTTTAGTTTTTGCTTGCAATGT-3'/5'-TGTCCCATAATATAAGGGATTTTGA-3'
pr-3 발병관련 단백질 군 IV (pathogesis-related protein class IV) 5'-TCCAGATTTAACTCTCTCCATTTTG-3'/5'-GCTTTTATAGGGCGAGAGAACTACT-3'
5'-ATGGAACTACACCAATATACGGCTA-3'/5'-CAAAATGGAGAGAGTTAAATCTGGA-3'
osvp1 벼 VP1 단백질 (Oryza sativa VP1 protein) 5'-ATTATGCATATGATTTTTGCTGGTT-3'/5'-AAGTTTGCTATTCACCTGTGTTTTC-3'
cyc2 싸이클린 2 (Cyclin 2) 5'-CTGCATACAAAATACTCTGAAGAAC-3'/5'-TAAATGTGCTGTACTTTCTATGAACT-3'
5'-ATGGAGAACATGAGATCTGAGAACT-3'/5'-TTACAGTGCCACGCTCTTGAGCAAG-3'
17S 17S 리보솜 RNA (17S ribosomal RNA) 5'-GCCATCGCTCTGGATACATT-3'/5'-ATGCACCACCACCCATAGAA-3'
먼저, 상기에서 제작한 프라이머가 잔디(Bentgrass)에서도 발현하는지를 알아보기 위해 잔디(Bentgrass)에 엘리시터(elicitor)를 10ppm의 농도로 처리한 후 총 RNA(total RNA)를 분리하여 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과 cyc2와 PR, 17S 유전자만이 발현이 되었다(도 3 참조). 프라이머를 다시 제작하는 등의 추가 실험을 여러 차례 실시하였으나 그 외의 유전자에서는 발현을 확인할 수 없었다.
cyc2라는 세포주기(cell cycle)에 관여하는 유전자가 잔디에서도 발현된다는 상기 결과를 토대로, 세포주기에 관여하는 다른 유전자들(cyc B2, cyc1, cdk, cycA1, pcna, cycD, cyc H1)을 추가하여 PCR을 수행하였으나 발현 결과는 얻지 못하였다.
상기 프라이머(primer) 중 잔디에서 발현됨을 확인할 수 있었던 cyc2와 pr의 PCR 산물(product)을 용리(elution)를 통해 정제(purification)한 후 그 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 도 4와 같다.
벼에서 제작한 프라이머 내의 산물의 서열(product sequence)과 잔디로부터 증폭된 산물의 염기서열 분석을 의뢰하여, 두 서열(sequence)을 비교해본 결과 CYC2 유전자는 97% 이상의 일치를 나타내었고, PR 유전자는 60%의 염기서열 일치를 나타내었다(도 4 참조).
이는 잔디에서 처음 분리한 세포주기(cell cycle) 관련 유전자이며, 이를 NCBI GenBank에 등재하였다.
상기와 같이 규명된 잔디의 생장촉진 관련 유전자인 CYC2, 17S, PR 유전자는, 잔디의 생장을 촉진시키는 물질의 검정유전자(reference gene)로 이용될 수 있다.
실시예 3 : 잔디에 엘리시터 처리 후 시간에 따른 CYC2 유전자의 발현 양상
잔디(Bentgrass)에 엘리시터(elicitor)를 0.1ppm 처리한 후 각각 6, 12, 24, 48시간 후에 채취(harvesting)하여 총 RNA(total RNA)를 분리하고, 양적 (Quantitative) RT-PCR을 수행하였다. 양적(Quantitative) RT-PCR은 보통의 RT-PCR 에 비해 하우스 키핑 유전자(house keeping gene)를 이용해 RNA의 농도를 같은 조건으로 맞춰주므로 시간에 따른 특정 유전자의 발현양상을 좀더 정확하게 비교할 수 있다. 여기서 사용한 cyc2 유전자는 세포주기 조절(Cell Cycle Regulation)에 관여하는 유전자로서, 분류상 B-타입에 해당하는 미토틱 사이클린(mitotic cyclins)으로 복합 다세포 생물(complex multicellular organism)의 세포분열(cell division)과 발생 프로그램(developmental program) 중 G2에서 M 상(phase)으로 넘어가는 단계에 역할을 하는 유전자로 알려져 있다.
양적(Quantitative) RT-PCR 결과 각각의 엘리시터(Elicitor)를 처리한 후 시간에 따라 cyc2 유전자가 발현 양상의 차이를 보이는 것을 알 수 있었다(도 5 참조).
각각의 엘리시터 처리결과 12시간대에서 모두 많은 발현량을 보이는 것을 확인하였다. 또한 각각의 엘리시터에 대해 발현 양상이 다르게 관찰되었는데, BA-2과 EB-1은 12시간 처리 이후 감소하는 양상을, BA-1은 지속적으로 증가하는 양상을 보여, 각각의 엘리시터에 대해 식물의 반응이 다름을 알 수 있었다.
상기 설명한 바와 같이, 본 발명은 미생물 유래의 엘리시터 BA-1, EB-1를 이용하여 잔디 생장을 촉진시키는 방법을 제공하며, 잔디의 생장촉진 관련 유전자로서 cyc2 유전자, PR 유전자를 제공하며, 상기 유전자를 잔디의 생장을 촉진시키는 물질의 검정유전자(reference gene)로 이용하는 방법을 제공하므로, 이는 잔디 육종 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
<110> Samsung Everland Co. <120> Bentgrass growth promoting substance and the reference gene thereof <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 92 <212> DNA <213> Bentgrass cyc2 gene <400> 1 agcttgatgg agtgctccag atgatggttg agctccccaa aaagcaggac atgggaagct 60 tactggagtt catagaaagt acagcacatt ta 92 <210> 2 <211> 228 <212> DNA <213> Bentgrass pr gene <400> 2 agctcggatc atctctgcat tcgcaagaag acctggtttt cttcgcaatt caagatattg 60 tcaaccgtgc cttcgatatc agtttgttgg agtaccatga tagaaaaaac ttccccttcc 120 tcatggtgag gtatgccctt gcccccaaga tcgtaccttg aagagacgtg ggagttctcc 180 agggagtgtg cattgtatgc gtccgcagcg taaggcagtt caacttca 228

Claims (4)

  1. 서열번호 1로 표시되는 잔디(Bentgrass) cyc2 유전자.
  2. 삭제
  3. 제1항의 잔디 유전자에 잔디생장촉진 후보물질을 처리한 후 RT-PCR에 의해 상기 유전자를 증폭시키고 그 발현 양상을 측정하는 것에 의하여 잔디의 생장을 촉진시키는 물질을 검정하는 방법.
  4. 삭제
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