상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 족도리로부터 분리한 신규 제초활성물질인 하기 구조식의 화합물(이하 엘레미신[elemicin]이라 칭한다), 족도리로부터 하기 구조식의 엘레미신을 분리하는 방법 및 족도리로부터 분리한 하기 구조식의 엘레미신을 포함하는 제초제를 포함한다.
본 발명의 족도리로부터 엘레미신의 분리방법은 하기의 (a)단계 내지 (f)단 계에 의해 족도리로부터 엘레미신을 분리할 수 있다.
(a)족도리(Asarum sieboldii Miquel var. soulensis Nakai)를 메탄올로 추출하고 건조하는 단계;
(b)메탄올 추출 건조물을 헥산으로 용해하여 헥산 분획물을 얻는 단계;
(c)헥산 분획물로부터 헥산-에틸아세테이트-메탄올 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 제초활성의 HB 분획물를 얻는 단계;
(d)단계 (c)의 HB 분획물로부터 헥산-에틸아세테이트-메탄올 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 제초활성의 HBB 분획물을 얻는 단계;
(e)단계 (d)의 HBB분획물로부터 헥산-에틸아세테이트 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 제초활성의 HBBA 분획물을 얻는 단계;
(f)단계 (e)의 HBBA 분획물로부터 메탄올-아세토니트릴 용액을 이용하여 흡착 컬럼 크로마토그라피에서 용출, 분획하여 HBBAA를 분리하는 단계를 포함하여 족도리로부터 엘레미신을 분리할 수 있다.
본 발명에서 족도리는 뿌리, 잎, 줄기 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용하여 상기 (a)단계 내지 (f)단계에 의해 족도리로부터 엘레미신을 분리할 수 있다.
상기 (a)단계에서 족도리를 메탄올로 추출시 족도리는 1mm 이하 보다 바람직하게는 0.1∼1mm로 분쇄한 것을 사용할 수 있다. 분쇄한 족도리를 족도리 중량 대비 1.5∼5배 중량의 메탄올에 넣고 50∼200rpm으로 10∼30시간 동안 1∼5회 반복 추출하여 족도리 메탄올 추출물을 얻을 수 있다. 이후 족도리 메탄올 추출물은 여과하고 건조하는 한편, 건조시료를 (b)단계 내지 (f)단계를 이용하여 족도리로부터 엘레미신을 분리한다.
이하, 족도리로부터 엘레미신을 분리하는 방법을 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 엘레미신 화합물은 족도리(Asarum sieboldii Miq.)로부터 분리된 것이다. 족도리를 수세한 후 표면에 물기가 없어질 때까지 건조한 다음 1mm 이하 보다 바람직하게는 0.1∼1mm로 분쇄한다. 분쇄한 족도리 건조시료를 메탄올로 추출하고, 그 추출물을 얻을 때 사용한 메탄올과 극성을 달리하는 유기용매인 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 각각 순차 분획한 다음, 각각의 분획물을 유채(Brassica napus L.)를 대상으로 seed bioassay를 통하여 제초활성을 검정한 결과, 헥산 분획물의 GR50값(대조구와 비교하여 유채의 생장을 50% 억제하는 농도)이 가장 우수하여 디클로로메탄 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 물 분획물에 비해 높은 제초활성을 나타내었다.
고활성의 헥산 분획물을 헥산:에틸아세테이트:메탄올(5:1:0.1, v/v/v) 용액을 이용하여 컬럼크로마토그라피에서 높은 제초활성의 HB 분획물을 얻고, HB 분획물을 헥산:에틸아세테이트:메탄올(9:1:0.5, v/v/v) 용액을 이용하여 컬럼크로마토그라피에서 높은 제초활성의 HBB 분획물을 얻은 후, HBB 분획물을 헥산:에틸아세테이트(5:5, v/v) 용액으로 흡착(Silica gel 60, 0.040 - 0.063 mm, Merck) 컬럼 크로마토그라피에서 용출, 분획하여 높은 제초활성의 HBBA 분획물을 얻는다. 그런 다음, HBBA 분획물을 메탄올:아세토니트릴 용액(9:1, v/v)을 이용하여 흡착(ODS-A, 150 ㎛, YMC) 컬럼 크로마토그라피에서 용출, 분획하고, 제초활성을 검정한 결과 가장 제초활성이 높았던 HBBAA 분획물을 얻었다.
족도리 헥산분획물로부터 단리된 제초활성분획물 HBBAA의 구조를 밝히기 위해 1H-NMR, 13C-NMR, EI-MS 분석을 행한 결과, 족도리에서 분리한 제초활성물질 HBBAA는 분자량 208, 화학식 C12H16O3, 하기 구조식을 가지는 물질로 규명하였으며, 하기 구조식을 지니는 물질의 이름을 엘레미신(elemicin;1,2,3-trimethoxy-5-allylbenzene)으로 명명하였다.
본 발명은 상기 구조식의 엘레미신을 활성성분으로 함유하는 제초제를 포함한다. 이때 제초제는 상기 구조식의 엘레미신 이외에 기타 제초제에 통상적으로 사용하는 분산제, 부형제, 희석제 등의 성분을 포함하여 분말, 과립, 스프레이 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 이하 상기 제초제에 통상적으로 사용하는 성분들은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 당업자가 적의 선택하여 사용할 수 있으므로 이하 자세한 내용은 생략하기로 한다.
이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 보다 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들은 본 발명의 실시예로서 이들에 의해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아 니다.
<실시예 1>
족도리의 뿌리부위를 수세하고 음건한 후 분쇄기를 이용하여 0.6±0.1mm로 분쇄하였다. 분쇄한 족도리 건조시료 1kg을 취하여 메탄올 2리터(L)가 담겨 있는 5-L 삼각플라스크에 넣고 100rpm의 진탕기에서 24시간씩 2회 반복 추출하였다.
상기에서 얻은 메탄올 추출물을 여과지가 깔려있는 부흐너 깔때기(Buchner funnel)에 통과시켜 잔재물을 제거한 후 회전감압농축기(EYELA NE-1101)를 이용하여 메탄올을 완전히 제거하는 완전 농축을 실시한 다음, 이를 플라스크에 넣은 후 플라스크에 물을 50ml 첨가하였다. 플라스크(Flask) 내의 건조물은 물을 이용하여 잘 용해시킨 다음 동결건조기(ILSHIN Lab Co. Ltd.)를 이용하여 -50℃에서 3일간 건조시켰다. 동결건조된 시료를 4℃의 냉장고에 보관하면서 제초활성검정에 사용하였다.
상기에서 얻은 족도리 메탄올 추출 건조물에 대한 제초활성 검정법은 seed bioassay 법을 사용하였다. 메탄올 추출 건조물을 물로 희석하여 10,000 ㎍ g-1이 되게 스톡용액(stock solution)을 제조한 후, 이 스톡용액으로부터 농도를 달리하는 처리액을 제조하였다. 처리액을 모래 1g 위에 5립의 유채(Brassica napus L.)종자가 치상되어 있는 24-well tissue culture test plate에 처리하였고, 테스트 플레이트(test plate)를 온도 25℃, 습도 70%, 광도 250μmol m-2 s-1 조건의 식물생 장상에 놓고 7일 동안 생장시켰다. 처리 7일 후 유채 유식물의 생체중을 측정하여 각 시료에 대한 GR50 값(식물의 생장을 50% 저해할 수 있는 약량)을 계산하여 제초력을 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복 실시되었다.
족도리의 제초활성을 검정하고자 메탄올 추출물을 얻고, 그 추출물을 유채를 대상으로 seed bioassay를 수행한 결과 GR50 값은 242 ㎍ g-1이었다.
<실시예 2>
상시 실시예 1의 족도리로부터 메탄올을 이용하여 추출한 메탄올 추출 건조물 10g 당 각각 100ml의 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 단계적으로 용매의 극성을 높여가면서 각 용매의 가용획분별로 분획한 다음, 각각의 분획층을 회전감압농축기로 각각의 용매를 완전히 제거하는 완전농축을 실시하고 -50℃에서 3일간 동결건조시켰다. 동결건조된 각각의 분획물은 물을 사용하여 농도를 달리하는 처리액을 제조하였고, 각각의 분획물에 대한 제초력 검정을 상기 실시예 1에서 언급한 방법을 이용하여 실시하였다.
족도리의 메탄올 추출물을 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 , 부탄올, 물로 분획하고, 각각의 분획물을 회전증발농축기로 완전농축하고 동결건조시킨 다음 유채를 대상식물로 제초력을 검정한 결과, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물의 GR50 값은 각각 66 ㎍ g-1(회수율 20.7%), 42 ㎍ g-1(회수 율 1.3%), >400 ㎍ g-1(회수율 1.3%), >400 ㎍ g-1(회수율 26.9%), >400 ㎍ g-1(회수율 58.0%)이었다(표 1 참조). 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 용매로 하는 분획물 중에서 헥산 분획물의 제초활성이 가장 우수하였다.
<표 1> 족도리 메탄올 추출 건조물에 대한 용매 분획층의 제초활성
용매분획층 |
GR50(㎍g-1) |
헥산 |
66 |
디클로로메탄 |
42 |
에틸아세테이트 |
>400 |
부탄올 |
>400 |
물 |
>400 |
<실시예 3>
상기 실시예 2에서 족도리 메탄올 추출 건조물에 대한 용매 분획물 중 가장 높은 제초활성과 회수율을 나타내었던 헥산 분획물(36.17g)을 헥산-에틸아세테이트-메탄올 용액(5:1:0.1, v/v/v)으로 흡착(Silica gel 60, 0.040∼0.063 mm, Merck) 컬럼 크로마토그라피에서 10ml씩 용출분획하여 HA 분획물(Rf 0.74∼1.00), HB 분획물(Rf 0.53∼0.67), HC 분획물(Rf 0.33∼0.50), HD 분획물(Rf 0.24∼0.30)을 얻었다.
각각의 분획물을 회전감압농축기로 완전농축한 다음, 실시예 1의 방법을 이용하여 HA 분획물, HB 분획물, HC 분획물, HD 분획물의 제초력 검정을 실시한바, 이들 분획물의 GR50 값은 각각 599 ㎍ g-1(회수율 4.6%), 250 ㎍ g-1(회수율 47.2%), 162 ㎍ g-1(회수율 3.4%), 190 ㎍ g-1(회수율 23.2%)이었다(표 2 참조). 제초력 및 회수율을 고려한바 HB 분획물의 제초력이 가장 우수하였다.
<표 2> 족도리 헥산 분획층으로부터 분획된 HA, HB, HC, HD 분획물의 제초활성
분획물 |
GR50(㎍g-1) |
HA |
599 |
HB |
250 |
HC |
162 |
HD |
190 |
<실시예 4>
상기 실시예 3에서 제초활성과 회수율이 높았던 HB 분획물(17.06 g)을 헥산-에틸아세테이트-메탄올 용액(9:1:0.5, v/v/v)으로 흡착 컬럼 크로마토그라피(Silica gel 60, 0.040 - 0.063 mm, Merck)에서 10ml씩 용출분획하여 HBA 분획물(Rf 0.64∼0.72)과 HBB 분획물(Rf 0.52∼0.60)을 얻은 다음, 이들 분획물을 회전감압농축기로 용매를 완전히 제거하는 완전농축을 실시하고 실시예 1의 방법을 이용하여 HBA 분획물과 HBB 분획물의 제초력 검정을 실시한바, HBA와 HBB 분획물의 GR50 값은 각각 412 ㎍ g-1(회수율 12.3%)와 138 ㎍ g-1(회수율 13.9%)이었다(표 3 참조).
<표 3> 족도리 HB로부터 분획된 HBA, HBB 분획물의 제초활성
분획물 |
GR50(㎍g-1) |
HBA |
412 |
HBB |
138 |
<실시예 5>
실시예 4의 HBA 분획물과 HBB 분획물 중에서 제초활성이 높았던 HBB 분획물(2.38g)을 헥산-에틸아세테이트 용액(5:5, v/v)으로 흡착 컬럼 크로마토그라피(Silica gel 60, 0.040∼0.063 mm, Merck)에서 10ml씩 용출분획하여 HBBA 분획물(Rf 0.83∼1.00), HBBB 분획물(Rf 0.55∼0.64), HBBC 분획물(Rf 0.24∼0.36), HBBD 분획물(Rf 0.00∼0.12)을 얻었다. 각각의 분획물을 회전감압농축기로 용매를 완전히 제거하는 완전농축을 실시하고 농축된 HBBA 분획물, HBBB 분획물, HBBC 분획물, HBBD 분획물에 대해 실시예 1의 방법을 이용하여 제초력 검정을 실시한바, 각 분획물의 GR50 값은 각각 239 ㎍ g-1(회수율, 78.0%), 857 ㎍ g-1(4.0%), 451 ㎍ g-1(1.3%)이었던 반면, HBBD 분획물의 GR50 값은 1,000 이상이었다(표 4 참조).
<표 4> 족도리 HBB 분획층으로부터 분획된 분획물들의 제초활성
분획물 |
GR50(㎍g-1) |
HBBA |
239 |
HBBB |
857 |
HBBC |
451 |
HBBD |
>1,000 |
<실시예 6>
실시예 5에서 제초활성이 가장 높았던 HBBA 분획물(1.86g)을 메탄올-아세토니트릴 용액(9:1)으로 흡착(ODS-A 150mm, YMC) 컬럼크로마토그래피에서 용출분획 하여 HBBAA 분획물(Rf 0.68∼0.80), HBBAB 분획물(Rf 0.34∼0.39), HBBAC 분획물(Rf 0.00∼0.33)을 얻었다. 각각의 분획물을 회전감압농축기로 용매를 제거하는 완전농축을 실시하고 농축된 HBBAA 분획물, HBBAB 분획물, HBBAC 분획물에 대해 실시예 1의 방법을 이용하여 제초력 검정을 실시하였다. 각 분획물에 대한 제초활성 검정결과 HBBAA 분획물의 GR50 값이 113 ㎍ g-1으로 가장 낮았다(표 5 참조).
<표 5> 족도리 HBBA 분획층으로부터 분획된 분획물들의 제초활성
분획물 |
GR50(㎍g-1) |
HBBAA |
113 |
HBBAB |
422 |
HBBAC |
> 1,000 |
<실시예 7>
실시예 6에서 HBBAA 분획물, HBBAB 분획물, HBBAC 분획물 중에서 제초활성이 가장 높았던 HBBAA 분획물에 대해 가스 크로마토그라피-매스 스텍트로메트리(Gas chromatography-mass spectrometry)(GC-MS, 8000 Top Series, CE Instruments)를 이용하여 순수한 화합물임을 확인하였다(분석조건은 컬럼, DB-5MS (30m ×0.25mm ×0.25mm); injector 온도, 200℃; oven 온도, 100℃-15℃/min 상승-250℃(2min) 이었고 MS 분석조건은 : Ion source, EI, 70 eV; ion source 온도, 250℃ 이었다.).
한편 실시예 6에서 얻은 HBBAA 분획물(1.50g)를 normal phase 실리카겔(Silica gel 60 F254, Merck)과 reversed phase 실리카겔 (Silica gel RP-18 F254, Merck) 박막 크로마토그래피를 이용하여 정제한 후, HBBAA 분획물의 화학구조를 결정하기 위하여 기기분석을 실시하였다.
정제분리된 HBBAA 분획물은 EI-MS를 이용하여 분석한 결과 molecular ion(M+)이 m/z 208 (100), 193 (53), 177 (18), 165 (30), 161 (7), 150 (8), 133 (18), 118 (13), 105 (15), 91 (32), 77 (29), 65 (24), 58 (6)에서 나타났다(도 1 참조).
1H-NMR, 13C-NMR 분석은 Varian Gemini 200 (400 MHz) NMR을 사용하여 분석하였고, 용매는 CDCl3를 사용하였으며, 내부표준물질로는 테트라메틸실란(tetramethylsilane, TMS)를 사용하였다.
HBBAA를 CDCl3를 사용하여 1H-NMR(400 MHz)을 실시한 결과, δ(ppm) 3.34 (2H, brd, H-1'), 3.83 (3H, s, 2-OCH3), 3.85 (6H, s, 1 and 3-OCH3), 5.08 (1H, brd, Ha-3'), 5.10 (1H, brd, Hb-3'), 5.95 (1H, m, H-2'), 6.41 (2H, m, H-4, H-6)에서 수소신호를 확인하였다(도 2 참조).
CDCl3를 사용하여 HBBAA를 13C-NMR(400 MHz)을 실시하였고 그 결과 δ(ppm) 40.9 (C-1'), 56.3 (C-3-OCH3 and 1-OCH3), 61.1 (2-OCH3), 105.7 (C-4 and 6), 116.3 (C-3'), 136.1 (C-5), 136.6 (C-2), 137.5 (C-2'), 153.2 (C-1 and 3)에서 탄소신호를 확인 할 수 있었다(도 3 참조).
이상의 EI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR의 분석에서 족도리로부터 제초활성물질로 단리된 활성물질 HBBAA 분획물은 분자량이 208이고, 화학구조식이 C12H16O3인 엘레미신(elemicin)으로 알려져 있는 1,2,3-trimethoxy-5-allylbenzene으로 결정하였다.