KR100974262B1

KR100974262B1 - 메틸파라하이드록시벤조에이트를 유효성분으로 함유하는제초제 조성물 및 삼지구엽초로부터메틸파라하이드록시벤조에이트의 분리방법

Info

Publication number: KR100974262B1
Application number: KR1020070115047A
Authority: KR
Inventors: 허수정; 임상현; 김경희; 김희연; 김성문; 임순성
Original assignee: 강원도; 강원대학교산학협력단
Priority date: 2007-11-12
Filing date: 2007-11-12
Publication date: 2010-08-06
Also published as: KR20090048934A

Abstract

본 발명은 삼지구엽초로부터 분리한 신규의 제초활성 물질인 메틸파라하이드록시벤조에이트(methyl-p-hydroxy benzoate)를 유효성분으로 함유하는 제초제 조성물, 상기 화합물을 제초활성 용도로 사용하는 방법 및 삼지구엽초로부터 상기 화합물을 분리하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의해 분리된 상기 화합물은 천연유래의 제초활성 물질로서, 현재까지 개발된 제초제의 구조와는 다른 독특한 구조를 가지고 있어 향후 새로운 작용점(mode of action)을 공격하는 새로운 제초제의 개발에 선도물질(lead compound)로 사용될 수 있다.

메틸파라하이드록시벤조에이트, 삼지구엽초, 제초제, 제초활성,

Description

메틸파라하이드록시벤조에이트를 유효성분으로 함유하는 제초제 조성물 및 삼지구엽초로부터 메틸파라하이드록시벤조에이트의 분리방법 {Herbicide composition comprising methyl-p-hydroxybenzoate as an efficient content and method for Purifying the same from Epimedium koreanum Nakai}

본 발명은 메틸파라하이드록시벤조에이트(methyl-p-hydroxybenzoate)를 유효성분으로 함유하는 제초제 조성물 및 삼지구엽초로부터 메틸파라하이드록시벤조에이트의 분리방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 삼지구엽초로부터 분리한 신규의 제초활성 물질인 메틸파라하이드록시벤조에이트(methyl-p-hydroxy benzoate)를 유효성분으로 함유하는 제초제 조성물, 상기 화합물을 제초활성 용도로 사용하는 방법 및 삼지구엽초로부터 상기 화합물을 분리하는 방법에 관한 것이다.

삼지구엽초(Epimedium koreanum Nakai)는 매자나무과(Berberidaceae)의 다년생 식물로 높이는 40~80cm이며, 근경은 옆으로 낡은 원줄기의 밑부분과 연결되며 그 끝에서 새순이 나와 곧추 자란다(박종희, 이정규. 2000.. 상용 약용식물도감. 신일상사. 서울. pp.204-206).

삼지구엽초의 소엽은 난형인데, 잎의 끝은 뾰족하고 밑은 심장저이다. 원줄기에서 1-2개의 잎이 호생하며 3개씩 2회 갈라지는 특성을 가지며(도 1), 꽃은 황백색이다(이창복. 2003. 원색대한식물도감. 향문사. 서울. pp.393).

삼지구엽초의 전초는 음양곽이라고 하며, 그 추출액은 개구리의 동공을 확대하고, 쥐의 수의운동을 증가시키며, 개의 정액분비를 촉진하는 등의 약리작용이 있으며, 전통 한방에서는 양을 강하게 하여 발정의 효능이 있는 것으로 알려져 있어서 강장약으로 음위 치료에 활용되고 있다(박종희, 이정규. 2000. 상용 약용식물도감. 신일상사. 서울. pp.204-206).

삼지구엽초에 함유되어 있는 생리활성 천연물질에 대해서는 많은 연구가 이루어졌으며, 현재까지 anhydroicaritin-3-O-α-rhamnoside, epimedin I, epimedoside, epimedoside C, glucosides, icariin, icariside A1, icaritin-3-O-α-rhamnoside, ikarisoside A-F, maltol, n-alkanes, phytosterols, phytosteryl, quercetin, salidroside(이태성. 2005. 삼지구엽초(Epimedium koreanum Nakai)의 추출성분. 강원대학교 석사학위논문), β-sitosterol, β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside(강삼식, 김주선, 강윤정, 한혜경. 음양곽의 성분에 관한 연구 (II). 생약학회지 21(1):56-59), caohuoside-B, epimedokoreanoside-I(Li, W. K., P. G. Xiao, G. Z. Tu, L. B. Ma, and R. Y. Zhang. 1995. Flavonol glycosides from Epimedium koreanum. Phytochemistry 38(1):263-265), epimedokoreanin A(Li, W. K., P. G. Xiao, and R. Y. Zhang. 1995. A difuranoflavone from Epimedium koreanum. Phytochemistry 38(3):807-808), baohuoside I(Li, W. K., J. Q. Pan, M. J. Lu, R. Y. Zhang and P. G. Xiao. 1995. A 9,10-dihydrophenanthrene derivative from Epimedium koreanum. Phytochemistry 39(1):231-233) 등이 존재하는 것으로 보고된 바 있다.

그리고, 삼지구엽초을 이용한 다양한 산업용품 개발을 위한 제조방법에 대한 연구가 활발하게 진행되어 왔는데, 주로 건강음료나 의학품 분야에 집중되어 있는 실정이다.

즉, 건강음료에 관한 것으로, 삼지구엽초를 함유한 건강음료의 제조방법(한국등록특허 제10-0463098호), 음양곽을 이용한 민속주의 제조방법(한국 특허출원 제2001-0068828호), 삼지구엽초 막걸리의 제조방법(한국등록특허 제10-0484789호) 등이 개시되어 있다.

또한 의약품에 관한 것으로는 전립선 비대증 및 전립선염 치료용 음양곽 추출물을 포함하는 약학적 조성물(한국특허출원 제2005-0084420호), 삼지구엽초 식물로부터의 추출물 제조방법(한국공개특허 제84-001510호) 등이 개시되어 있다.

현재까지 삼지구엽초의 제초활성에 대해서는, 삼지구엽초로부터 살초활성물질의 분리방법에 관한 한국공개특허 제2007-0065943호가 개시되어 있으나, 상기 방법에 의하면 에틸아세테이트 층으로부터 분리한 GR₅₀값이 각각 241, 399, 253 μg g^- ¹으로 제초활성이 매우 높은 EADBA, EADBB 및 EADBC 분획물이 개시되어 있으나, 현재까지 EADBA, EADBB 및 EADBC 분획물의 정체에 대해서는 전혀 밝혀진 바가 없는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 삼지구엽초로부터 분리한 천연물 유래의 제초활성 화합물을 유효성분으로 함유하는 제초제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 삼지구엽초로부터 분리한 천연물 유래의 상기의 화합물을 제초활성 용도로 사용하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 삼지구엽초로부터 상기의 화합물을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 하기 화학식으로 표시되는 메틸파라하이드록시벤조에이트(methyl-p-hydroxybenzoate) 화합물을 유효성분으로 함유하는 제초제 조성물을 제공한다.

<화학식>

본 발명은 상기의 화합물을 제초활성 용도로 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 삼지구엽초로부터 상기의 화합물의 분리방법을 제공한다.

본 발명에 의해 분리된 화합물인 메틸파라하이드록시벤조에이트(methyl-p-hydroxybenzoate)는 제초활성이 매우 높은 삼지구엽초 디클로로메탄 추출물로부터 단리되고, 구조가 결정된 제초활성 물질로서, 새로운 제초제로 이용될 수 있으며, 현재까지 개발된 제초제의 구조와는 다른 독특한 구조를 가지고 있어 향후 새로운 작용점(mode of action)을 공격하는 새로운 제초제의 개발에 선도물질(lead compound)로 사용될 수 있다.

본 발명의 제 1측면은 하기 화학식으로 표시되는 메틸파라하이드록시벤조에이트(methyl-p-hydroxybenzoate) 화합물을 유효성분으로 함유하는 제초제 조성물에 관한 것이다.

<화학식>

본 발명에 의한 상기 제초제 조성물은 상기 화합물이 삼지구엽초로부터 분리되는 것을 특징으로 하는데, 상기 화합물의 함량은 특별히 제한되는 것은 아니고, 필요에 따라 적의 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 제초제 조성물은 상기 화합물을 제초활성의 유효성분으로 함유하고, 또한 당해 분야에 공지되어 있는 안료(pigment), 증점제(thickener), 하제(diarrhoeareagent), 계면활성제(surfactant) 또는 이들의 혼합물 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의한 제초제 조성물의 유효성분인 상기 화합물의 방제 대상식물로는 유채(Brassica napus L.) 등과 같은 십자화과가 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 제 2측면은 하기 화학식으로 표시되는 메틸파라하이드록시벤조에이트(methyl-p-hydroxybenzoate) 화합물을 제초활성 용도로 사용하는 방법에 관한 것이다.

<화학식>

본 발명에 의한 상기 방법에서, 상기 화합물은 삼지구엽초로부터 분리되는 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 상기 방법은 매우 다양하게 변형될 수 있고, 토양의 성질, 적용 방법, 농작물, 방제될 잡초, 주된 기후 조건, 및 적용 방법, 적용 시간 및 대상 작물에 의해 지배되는 다른 요인들에 따라 좌우될 수 있다.

본 발명의 제 3측면은, (a) 삼지구엽초의 건조시료를 메탄올로 추출하는 단계; (b) 상기 메탄올 추출물로부터 디클로로메탄 분획물을 얻는 단계; (c) 상기 디클로로메탄 분획물로부터 헥산-에틸아세테이트용액을 이용하여 진공액체 크로마토그래피(vacuum liquid chromatography)에서 GR₅₀값이 <500 μg g^-1인 제초활성을 갖는 고활성의 분획물(DA)을 얻는 단계; 및 (d) 상기 DA 분획물로부터 진공액체 크로마토그래피에서 GR₅₀값이 132 μg g^-1인 제초활성을 갖는 분획물(DAB)을 얻는 단계; 를 포함하는 삼지구엽초로부터 하기 화학식으로 표시되는 메틸파라하이드록시벤조에이트(methyl-p-hydroxybenzoate) 화합물의 분리방법에 관한 것이다.

<화학식>

본 발명에 의한 상기 분리방법은 상기 (d) 단계에서 얻은 DAB 분획물을 재결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이하, 삼지구엽초로부터 상기 화학식으로 표시되는 메틸 파라하이드록시벤조에이트 화합물을 분리하는 과정을 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 메틸 파라하이드록시벤조에이트 화합물은 삼지구엽초(Epimedium koreanum Nakai) 전초로부터 분리된 것으로서, 삼지구엽초 건조시료를 메탄올로 추출하고, 그 추출물을 유채(Brassica napus L.)를 대상으로 seed bioassay를 수행한 결과 GR₅₀값(식물의 생장을 50% 저해하는 약량)은 381 μg g^-1이었다.

메탄올 추출물을 에틸아세테이트, 부탄올, 디클로로메탄, 헥산, 물로 재분획하고, 상기 분획물에 대한 살초력을 검정한 결과, 디클로로메탄 추출물의 GR₅₀값은 214 μg g^-1이었다.

고활성의 디클로로메탄 추출물을 헥산-에틸아세테이트 용액으로 진공용액 크로마토그래피(vacuum liquid chromatography)를 이용하여 분획하고, 각 분획물의 살초활성을 검정한 다음, GR₅₀값이 <500 μg g^-1인 고활성 분획물(' 이하, “DA"'라 칭한다)을 얻었다.

상기에서 얻은 고활성의 DA 분획물을 헥산-에틸아세테이트 용액으로 진공용액 크로마토그래피를 이용하여 분획하고 각 분획물의 살초활성을 검정한 다음, GR₅₀값이 132 μg g^-1인 고활성 분획물(이하, “DAB”라 칭한다)을 단리하였다.

단리된 DAB 분획물의 화학구조를 밝히기 위하여, EI-MS, ¹H-NMR, ¹³C-NMR 분석을 수행한 결과, 분자량 152이고, 화학구조식이 C₈H₈O₃인 메틸 파라하이드록시벤조에이트로 판명되었다.

이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 (삼지구엽초 메탄올 추출물의 조제)

실험에 사용한 삼지구엽초 시료는 2005년 7월 강원도 철원군 김화읍 청양6리 강원도 농업기술원 북부시험장에서 채집하였다.

삼지구엽초의 잎과 줄기 부위를 음건한 후 분쇄기를 이용하여 0.6mm로 분쇄하였다. 분쇄한 건조시료 200g을 취하여 메탄올 2L가 담겨 있는 5L 삼각플라스크에 넣고 120rpm의 진탕기에서 24시간씩 2회 반복 추출하였다.

상기에서 얻은 메탄올 추출물을 여과지가 깔려 있는 부흐너 깔때기(Buchner funnel)에 통과시켜 잔재물을 제거한 후, 회전 감압농축기(EYELA NE-1101)를 이용하여 메탄올을 농축시켜 완전히 제거한 다음, 이를 플라스크에 넣고 증류수 50mL를 첨가하였다.

증류수로 플라스크 내의 건조물을 잘 용해시킨 다음, 동결건조기(ILSHIN LAB CO.)를 이용하여 -50^oC에서 3일간 건조시켰다. 동결건조된 시료를 4^oC의 냉장고에 보관하면서 살초활성검정 및 구조분석에 사용하였다.

살초활성 검정은 상기에서 얻는 삼지구엽초 메탄올 추출 건조물이 유채(Brassica napus L.) 식물의 발아와 생장에 미치는 영향을 알아 볼 수 있는 시드 바이오어세이(seed bioassay) 법을 이용하였다.

메탄올 추출 건조물을 증류수로 희석하여 10,000 μg g^-1이 되게 스톡용액(stock solution)을 제조한 후, 이 스톡용액으로부터 농도를 달리하는 처리액을 제조하였다.

처리액을 모래 1g 위에 5립의 유채 종자가 치상되어 있는 24-웰 조직배양 검정 플레이트(24-well tissue culture test plate)에 처리하였고, 검정 플레이트를 온도 25^oC, 습도 70%, 광도 250 μmol m^-2 s^-1 조건의 식물생장상에 놓고 7일간 생장시켰다.

처리 7일 후 유채 유식물의 생체중을 측정하여 각 시료에 대한 GR₅₀값(식물 생장을 50% 저해할 수 있는 약량)을 계산하여 살초력을 측정하였는데, 모든 실험은 3반복 실시되었다.

삼지구엽초의 살초활성을 검정하고자 메탄올 추출물을 얻고, 그 추출물을 유채를 대상으로 시드 바이오어세이를 수행한 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, GR₅₀값은 381 μg g^-1이었다.

실시예 2 (삼지구엽초 메탄올 추출물로부터 용매 분획층의 분리)

실시예 1의 삼지구엽초로부터 얻은 메탄올 추출 건조물 10g이 들어 있는 세퍼러터리 훠넬(separatory funnel)에 각각 100ml의 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 증류수를 첨가하고 단계적으로 용매의 극성을 높여가면서 가용획 분별로 분획하였다.

각각의 분획층을 회전 감압농축기로 용매를 완전히 제거하는 농축을 실시하고, -50^oC에서 3일간 동결건조시켰다. 동결건조된 각각의 분획물로부터 물을 사용하여 농도를 달리하는 처리액을 제조하였고, 각각의 분획물에 대한 살초력 검정을 위하여 상기 실시예 1에서 언급한 시드 바이오어세이를 실시하였다.

삼지구엽초의 메탄올 추출물을 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 증류수로 분획하고, 각각의 분획물을 회전 감압농축기로 농축하고 동결건조시킨 다음, 유채에 대해서 제초력을 검정한 결과를 하기 표 1에 나타내었는데, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 증류수 분획물의 GR₅₀값은 각각 >5,000 μg g^-1(회수율 10.5%), 231 μg g^-1(회수율 4.8%), 969 μg g^-1(회수율 13.0%), 1,311 μg g^-1(회수율 17.3%), 1,458 μg g^-1(회수율 53.8)이었다.

<표 1> 삼지구엽초 메탄올 추출물로부터 분리한 용매 분획층의 살초활성

용매분획층	살초력 (GR₅₀, μg g^-1)
헥산 (Hexane)	>5,000
디클로로메탄 (Dichloromethane)	231
에틸아세테이트 (Ethylacetate)	969
부탄올 (Butanol)	1,311
물 (Water)	1,458

실시예 3 (디클로로메탄 분획물(DA)의 분리)

상기 실시예 2에서 삼지구엽초 메탄올 추출 건조물을 용매를 이용하여 분획한 분획물 중 높은 살초력을 나타내었던 디클로로메탄 분획물과 실리카겔을 1대 2의 비율로 코팅하여 건조마쇄한 다음, 유리 컬럼(직경 5 cm, 길이 100 cm)에 500g을 충진하였다.

컬럼에 하기 표 2와 같은 용매 비율로 순차적으로 1L씩 용출시켜 11개의 분획물(DA, DB, DC, DE, DF, DG, DH, DI, DJ, DK)을 얻었다.

<표 2> 디클로로메탄 분획물 분리 용매 비율

용매 비율	용출	분획물
헥산-에틸아세테이트 용액(85:15)	1L	DA
헥산-에틸아세테이트 용액(80:20)	1L
헥산-에틸아세테이트 용액(70:30)	1L
헥산-에틸아세테이트 용액(60:40)	1L
헥산-에틸아세테이트 용액(50:50)	1L	DB
헥산-에틸아세테이트 용액(40:60)	1L	DC
헥산-에틸아세테이트 용액(30:70)	1L	DD
헥산-에틸아세테이트 용액(20:80)	1L	DD
헥산-에틸아세테이트 용액(10:90)	1L	DE
에틸아세테이트 용액(100%)	1L	DE
에틸아세테이트 용액-메탄올(90:10)	1L	DF
에틸아세테이트 용액-메탄올(80:20)	1L	DG
에틸아세테이트 용액-메탄올(70:30)	1L	DG
에틸아세테이트 용액-메탄올(60:40)	1L	DH
에틸아세테이트 용액-메탄올(50:50)	1L	DH
에틸아세테이트 용액-메탄올(40:60)	1L	DI
에틸아세테이트 용액-메탄올(30:70)	1L	DI
에틸아세테이트 용액-메탄올(20:80)	1L	DJ
에틸아세테이트 용액-메탄올(10:90)	1L	DJ
메탄올(100%)	1L	DK
아세톤(100%)	1L	DK

각각의 분획물을 회전 감압농축기로 완전 농축한 다음, 실시예 1에서 와 같은 시드 바이오어세이 방법을 이용하여 11개의 제초활성을 검정하여 GR₅₀값을 얻은 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

하기 표 3을 참조하면, 분획물 DA, DB, DC, DE, DF, DG, DH, DI, DJ, DK의 GR₅₀값은 각각 <500 μg g^-1(회수율 9.5%), 971 μg g^-1(회수율 3.5%), 445 μg g^-1(회수율 5.67%), 725 μg g^-1(회수율 8.0%), 1,033 μg g^-1(회수율 7.56%), 768 μg g^-1(회수율 3.78%), 575 μg g^-1(회수율 17.0%), 543 μg g^-1(회수율 3.83%), >5,000 μg g^-1(회수율 4.0%), 3,187 μg g^-1(회수율 3.0%), 4,700 μg g^-1(회수율 3.5%)으로 서, DA의 살초력이 11개 분획물 중에서 가장 높음을 알 수 있다.

<표 3> 삼지구엽초 디클로로메탄 분획층으로부터 분획된 DA~DK 분획물의 살초활성

용매분획층	살초력 (GR₅₀, μg g^-1)
DA	<500
DB	971
DC	445
DD	725
DE	1,033
DF	768
DG	575
DH	543
DI	>5,000
DJ	3,187
DK	4,700

실시예 4 (DA 분획물로부터 DAB 분획물의 분리)

상기 실시예 3에서 살초활성이 높았던 DA 분획물을 VLC(vacuum liquid chromatography)를 이용하여 분리하였다. 먼저 실리카겔 200g을 감압상태의 유리컬럼(직경 5 cm, 길이 15 cm)에 충진하고, 그 위에 DA 분획물 코팅시료(실리카겔 : DA분획물 = 1 : 2, w/w)를 놓았다.

시료 첨가 후, 하기 표 4에서와 같은 비율로 헥산-에틸아세테이트 혼합용액 1L씩을 제조하여 순차적으로 용출시킨 다음, 5개(DAA, DAB, DAC, DAD, DAE)의 분획물을 얻었다.

<표 4> DA 분획물 분리 용매 비율

용매 비율	용출	분획물
헥산-에틸아세테이트 용액(98:2)	1L	DAA
헥산-에틸아세테이트 용액(95:5)	1L	DAB
헥산-에틸아세테이트 용액(92:8)	1L	DAC
헥산-에틸아세테이트 용액(89:11)	1L	DAD
헥산-에틸아세테이트 용액(86:14)	1L	DAE

각각의 분획물을 회전 감압농축기로 완전 농축한 다음, 실시예 1에서 와 같은 시드 바이오어세이 방법을 이용하여 제초력 검정을 실시하여 GR₅₀값을 얻은 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

표 5를 참조하면, 분획물 DA, DB, DC, DE, DF, DG, DH, DI, DJ, DK의 GR₅₀값은 각각 403 μg g^-1(회수율 10.11%), 132 μg g^-1(회수율 14.61%), 355 μg g^-1(회수율 13.48%), 620 μg g^-1(회수율 19.10%), 938 μg g^- ¹(회수율 42.70%)으로서, DAB 분획물의 GR₅₀값이 가장 낮음을 알 수 있다.

<표 5> 삼지구엽초 DA 분획물로부터 분획된 DAA, DAB, DAC, DAD, DAE 분획물의 살초활성

용매분획층	살초력 (GR₅₀, μg g^-1)
DAA	403
DAB	132
DAC	355
DAD	620
DAE	938

실시예 5 (DAB 분획물의 재결정)

상기 실시예 4에서 제초활성이 높았던 DAB 분획물을 완전 농축한 후, 3mL의 에틸아세테이트로 녹인 다음, 5mL의 헥산을 첨가하여 결정화 단계에 도달하였을 때 밀봉하여 -20^oC의 냉장고에서 14일간 재결정하였다.

실시예 6 (재결정 분획물의 구조분석)

상기 실시예 5에서 재결정된 화합물을 질량분광분석계(Micromass, M363 series, U.K.)를 이용하여 MS 분석조건(Ion source, EI, 70 eV; ion source 온도, 250℃)에서 분석한 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, 분자 이온(molecular ion)(M+)이 m/z 152에 나타났으며, 특징적인 분획 이온(fragment ion)이 121, 93, 65에서 나타났다(도 4).

¹H-NMR, ¹³C-NMR 분석은 Bruker DPX 400 MHz (9.4T) 핵자기공명장치(FT-NMR Spectrometer)를 사용하여 분석하였고, 용매는 CDCl₃를 사용하였으며, 내부 표준물질로는 테트라메틸실란(tetramethylsilane, TMS)를 사용하였다.

¹H-NMR(400 MHz)을 실시한 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, δ(ppm) 3.9 (3H, t, -CH₃), 5.65 (1H, s, OH), 6.85 (2H, d, H-1, H-4), 7.95 (2H, d, H-2, H-3)에서 수소신호를 확인하였다. ¹³C-NMR(400 MHz)을 실시한 결과는 도 6에서 보는 바와 같이, δ(ppm) 52, 115, 122, 132, 160, 167에서 탄소신호를 확인 할 수 있었다.

이상의 EI-MS, ¹H-NMR, ¹³C-NMR의 분석으로 삼지구엽초로부터 제초활성물질로 단리된 활성물질 분획물은 분자량이 152이고, 화학구조식이 C₈H₈O₃인 일명 파라옥시안식향산메틸(methylparaben)로 잘 알려져 있는 메틸파라하이드록시벤조에이트(methyl-ρ-hydroxybenzoate)으로 결정하였다.

실시예 7 (제조체 조성물의 제조)

상기 실시예 5 및 실시예 6에서 구조확인된 메틸파라하이드록시벤조에이트 화합물 20 중량%, 계면활성제 30중량%, 액체 담체 50 중량%를 함유하는 제초제 조성물을 제조하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의해 삼지구엽초로부터 분리된 제초활성 물질은 화학합성법에 의해 제조된 제초활성 물질과는 달리, 천연물 유래의 제초활성 물질이기 때문에, 친환경 농업이라는 측면에서 각광을 받을 수 있을 것으로 기대되므로, 향후 국내외의 농약관련 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명을 통하여 제초활성이 매우 높은 삼지구엽초 디클로로메탄 추출물로부터 단리되고 구조가 결정된 제초활성물질인 메틸파라하이드록시벤조에이트(methyl-p-hydroxybenzoate)는 새로운 제초제로 이용될 수 있으며, 현재까지 개발된 제초제의 구조와는 다른 독특한 구조를 가지고 있어 향후 새로운 작용점(mode of action)을 공격하는 새로운 제초제의 개발에 선도물질(lead compound)로 사용될 수 있을 것이라 기대된다.

도 1은 삼지구엽초 전초 사진.

도 2는 24-well tissue culture test plate을 이용한 삼지구엽초 메탄올 추출물의 제초활성 검정 결과.

도 3는 삼지구엽초로부터 제초활성물질 DAB의 분리과정을 간략하게 나타낸 그림.

도 4는 삼지구엽초 디클로로메탄 추출물에 함유되어 있는 제초활성물질 DAB의 구조를 구명하기 위하여 EI-MS 분석을 수행한 결과.

도 5는 삼지구엽초 디클로로메탄 추출물에 함유되어 있는 제초활성물질 DAB의 구조를 구명하기 위하여 ¹H-NMR 분석을 수행한 결과.

도 6은 삼지구엽초 디클로로메탄 추출물에 함유되어 있는 제초활성물질 DAB의 구조를 구명하기 위하여 ¹³C-NMR 분석을 수행한 결과.

Claims

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(a) 삼지구엽초의 건조시료를 메탄올로 추출하는 단계;

(b) 상기 메탄올 추출물로부터 디클로로메탄 분획물을 얻는 단계;

(c) 상기 디클로로메탄 분획물로부터 헥산-에틸아세테이트용액을 이용하여 진공액체 크로마토그래피(vacuum liquid chromatography)에서 유채의 GR₅₀값 (식물의 생장을 50% 저해하는 약량)이 <500 μg g^-1인 제초활성을 갖는 고활성의 분획물(DA)을 얻는 단계; 및

(d) 상기 DA 분획물로부터 진공액체 크로마토그래피에서 유채의 GR₅₀값이 132 μg g^-1인 제초활성을 갖는 분획물(DAB)을 얻는 단계; 를 포함하는 삼지구엽초로부터 하기 화학식으로 표시되는 메틸파라하이드록시벤조에이트(methyl-p-hydroxybenzoate) 화합물의 분리방법.

<화학식>
제 5항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 얻은 DAB 분획물을 재결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.