CN103125503B - α-异灰叶素作为农用杀菌剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明首次从紫穗槐种子中分离得到了具有农用杀菌活性的α-异灰叶素，公开了α-异灰叶素对植物病原菌具有较强的抑制和杀灭作用，可作为农用杀菌剂的用途，不但拓展了豆科植物紫穗槐的利用范围，而且为植物源农药的开发提供了可靠的技术依据。
Description
技术领域
本发明属于农药应用领域，涉及豆科植物紫穗槐的综合利用，具体涉及一种从紫穗槐种子中分离纯化得到的活性物质α-异灰叶素作为农用杀菌剂的用途。
背景技术
紫穗槐(Amorpha fruticosa L.)为豆科紫穗槐属落叶丛生灌木。紫穗槐属植物全世界约25种，原产北美。我国南北均有紫穗槐的栽培，其适用性强，分布范围广，并具有很好的防风、固沙、保持水土功能，在我国北方特别是沙漠地区主要用于水土保持。另外，其枝条可以用于编织，叶子可作绿肥，根、茎、叶可作药用，果实中的挥发油可作为理想的天然香料。
紫穗槐的根、树干、树皮、叶及果实种子中均含有对某些昆虫有毒杀作用的化学成分，植物资源十分丰富。近些年来，人们对紫穗槐的研究不断深入。医学方面，姜泓等在《紫穗槐中黄酮类化学成分的体外抗癌活性研究》中药材，2008，31(5)，第736-738页报道了黄酮类物质对癌细胞A375-S2的作用；李坤等在《紫穗槐果实提取物的保肝作用研究》中医药学刊，2006，24(2)，第272-273页报道了紫穗槐果实提取物具有明显的保护肝脏作用。农用方面，CN1817140A中公开了一种植物源生长调节剂，以艾蒿或紫穗槐植物为原料，研制的一种低毒、高效新生物产品，以叶面喷洒的方式施药，应用于农、林、牧业领域；曹艳萍等在《紫穗槐叶中杀虫化学成分的分离和结构鉴定》化学研究与应用，2004，16(5)，719-720页中报道从紫穗槐叶的乙醇提取物中分离得到对金龟甲、菜青虫等有毒杀作用的混合物。WO 9815269A1报道了α-异灰叶素的医用杀菌活性，可用于治疗幽门螺杆菌引起的疾病；Dae Sik Jang等在《Potential cancer chemopreventive flavonoids from the stems of Tephrosistoxicaria》Journal of Natural Products，2003，66(9)，1166-1170页中报道了α-异灰叶素具有潜在的癌症化学预防作用。Seiferle等在《Insecticides derived from plants》Journal of Industrial andEngineering Chemistry，1948，40(4)，683-691页中报道了异灰叶素的农用杀虫活性。OrasaPancharoen等在《Rotenoids from the flowers of Millettia brandisiana》SongklanakarinJ.Sci.Technol.，2007，29(1)，151-156页中报道了α-异灰叶素的化学结构以及化学归属。但至今没有从紫穗槐种子中分离得到α-异灰叶素的报道，也未见α-异灰叶素具有农用杀菌活性的报道。
发明内容
本发明的目的在于从紫穗槐种子中分离得到可作为农用杀菌剂的活性物质，并确定其结构，为扩大紫穗槐的综合利用、开发新的植物源农药提供技术依据。
为了实现本发明的目的，本发明对紫穗槐种子(市售)进行乙酸乙酯提取、硅胶柱初次分离、硅胶柱二次分离、高速逆流色谱初次分离以及高速逆流色谱二次分离，首次从紫穗槐种子中分离得到具有农用杀菌活性物质的提取物、并证明了其结构为α-异灰叶素。具体分离提纯方法如下：
1.索氏提取
首先应用微型植物试样粉碎机对紫穗槐种子(自购)进行粉碎，将其粉碎至40-80目后，按照紫穗槐种子粉质量(Kg)和溶剂体积(L)1∶4-1∶6的比例，采用索氏提取设备，在回流温度下进行提取，直至从索氏提取器提取管中回流下的溶剂不带颜色为止，提取时间大约为4-6h。所用的溶剂分别为石油醚、乙酸乙酯、乙醇，分别将提取液进行浓缩得到紫穗槐种子的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物以及乙醇提取物。将三份提取物分别进行杀虫(杀螨)、杀菌和除草活性测定。杀虫活性测定选择小菜蛾、甜菜夜蛾以及桃蚜等作为供试昆虫，杀螨活性选择朱砂叶螨作为供试螨，杀菌活性以蔬菜灰霉病菌、稻瘟病菌、番茄晚疫病菌、小麦白粉病、黄瓜霜霉病、玉米锈病以及黄瓜炭疽病等作为供试病菌，除草活性选择稗草和独行菜作为试材。生测试验结果表明，紫穗槐种子的乙酸乙酯提取物有一定的农药活性。
2、硅胶柱层析初次分离
将上述具有一定农药活性的紫穗槐种子的乙酸乙酯提取物进行硅胶柱粗分。以100-140目硅胶为固定相，分别以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇为流动相进行洗脱，根据色带在柱子上的变化，初步分离得到5个洗脱份。将分离得到的洗脱份分别进行生物活性测定(方法同第一次)，第二次生测活性结果显示硅胶柱初次分离后的乙酸乙酯洗脱份农药活性最好，因此对其进行下一步的硅胶柱层析二次分离。
3、硅胶柱层析二次分离
对硅胶柱初次分离得到的乙酸乙酯洗脱份继续进行硅胶柱层析二次分离，洗脱剂选择石油醚、石油醚和乙酸乙酯(v∶v，下同)(10∶1)、石油醚和乙酸乙酯(5∶1)、石油醚和乙酸乙酯(1∶1)、石油醚和乙酸乙酯(1∶2)、石油醚和乙酸乙酯(1∶5)、石油醚和乙酸乙酯(1∶10)、乙酸乙酯、乙醇进行洗脱，并收集各份洗脱份。对各份洗脱份进行生测试验(方法同前)，结果表明石油醚和乙酸乙酯(1∶1)份具有较强的杀菌活性，因此对其进行下一步的高速逆流色谱初次分离。
4、高速逆流色谱(HSCCC)初次分离
对硅胶柱层析二次分离收集到的石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)份进行高速逆流色谱初次分离，溶剂体系为正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水＝1∶0.8∶1.3∶1进行分离，流速2ml/min，上样量300mg，正转速850r/min，反转速600r/min，温度30℃。根据仪器配置的紫外检测器(254nm波段)的吸收峰进行流份的收集，在正转洗脱过程中一共得到11份样品，反转洗脱过程中一共得到4份样品。得到的样品分别进行生测试验(方法同前)，结果表明其中正转第10份样品具有较强的杀菌活性。此份样品经过高效液相色谱检测，纯度50％左右，因此应进一步提纯。下一步分离继续选择高速逆流色谱进行。
5、高速逆流色谱(HSCCC)二次分离
对高速逆流色谱初次分离正转接收到的第10份样品进行高速逆流色谱再次分离，溶剂体系选择正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水＝(1∶2∶1∶1)进行分离，流速2ml/min，上样量300mg，正转速850r/min，反转速600r/min，温度30℃。根据仪器配置的紫外检测器(254nm波段)的吸收峰进行收集，在正转洗脱过程中一共得到3份样品，反转洗脱过程中一共得到1份样品。经过高效液相色谱进行检测，其中第2份样品纯度在95％以上，具有很好的杀菌活性。上述分离物经过核磁、质谱等检测证明此份样品成分为α-异灰叶素。
采用上述方法，从紫穗槐种子中提取分离得到的α-异灰叶素为黄色粉末，结构如式(I)所示：
(I)α-异灰叶素
ESI-MS(-)m/z 409[M-H]-，ESI-MS(+)m/z 411[M+H]+，相对分子质量为410。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ12.21(1H，s，11-OH)，6.87(1H，s，H-1)，6.56(1H，d，J＝9.9Hz，H-4′)，6.46(1H，s，H-4)，5.96(1H，s，H-10)，5.47(1H，d，J＝9.9Hz，H-5′)，4.87(1H，m，H-6a)，4.60(1H，dd，H-6)，4.18(1H，d，H-6)，3.79和3.82(each3H，s，2，3-OMe)，3.85(1H，d，H-12a)，1.37和1.43(each 3H，s，7′，8′-CH3)。
13C NMR(75MHz，CDCl3)：110.2(C-1)，104.4(C-1a)，143.9(C-2)，149.7(C-3)，101.0(C-4)，147.3(C-4a)，66.0(C-6)，71.9(C-6a)，155.9(C-7a)，101.7(C-8)，162.8(C-9)，97.8(C-10)，164.5(C-11)，101.1(C-11a)，194.2(C-12)，43.5(C-12a)，115.4(C-4′)，126.4(C-5′)，78.3(C-6′)，28.3和28.6(CH3-7′，8′)，56.3和55.8(2，3-OMe)。
H谱数据和C谱数据与《Rotenoids from the flowers of Millettia Brandisiana》Songklanakarin J.Sci.Technol.，2007，29(1)，151-156页中报道的数据一致。
经生物活性检测证明，本发明首次从紫穗槐种子中提取得到的α-异灰叶素对植物病原菌具有较强的杀菌活性，适宜作为一种高效、低毒、环保的农用杀菌剂的活性组分。因此，本发明首次发现了α-异灰叶素作为农用杀菌剂的用途，拓展了豆科植物紫穗槐的综合利用，不但实现了本发明的目的，而且为植物源农药的开发提供了可靠的技术依据。
具体实施方式
以下实施例用于进一步详细说明本发明。将按照上述方法从紫穗槐种子中提取的α-异灰叶素进行农用杀菌活性测试。
实施例1α-异灰叶素杀菌活性的测定
用从紫穗槐种子中提取得到的α-异灰叶素对植物的真菌病害进行了活体保护活性试验。防治黄瓜霜霉病保护效果试验方法如下：
选择生长一致的盆栽黄瓜幼苗，剪去生长点保留两片真叶，作为试验材料。将提取物α-异灰叶素按照设计浓度进行叶面喷雾处理，另设喷清水的空白对照，3次重复。处理后第二天接种黄瓜霜霉病孢子囊悬浮液，然后放置于人工气候室(温度：昼25℃、夜20℃，相对湿度：95-100％)保湿培养，24小时后放置于温室(25±2℃)并正常管理，5天后调查防治效果。病害分级参照中华人民共和国国家标准《农药田间药效试验准则》，以病情指数计算防治效果。
试验结果表明α-异灰叶素具有较强的杀菌活性，如异灰叶素浓度为250mg/L时，对黄瓜霜霉病的防效达到了70％。
Claims (4)
1.α-异灰叶素作为农用杀菌剂的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的α-异灰叶素是从紫穗槐种子中分离得到的。
3.根据权利要求2所述的用途，所述的α-异灰叶素采用以下方法从紫穗槐种子中分离提纯得到：1）索氏提取，所用的溶剂为乙酸乙酯，2）硅胶柱层析初次分离，收集乙酸乙酯洗脱组分，3）硅胶柱层析二次分离，收集石油醚与乙酸乙酯为1:1的洗脱组分，4）高速逆流色谱初次分离，溶剂体系为正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水=1:0.8:1.3:1，5）高速逆流色谱二次分离，溶剂体系选择正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水=1:2:1:1；其特征在于：紫外检测器在波长为254nm波段的吸收峰进行收集，对高速逆流色谱初次分离正转接收到的第10份样品进行高速逆流色谱再次分离，在正转洗脱过程中得到的第2份样品为α-异灰叶素。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：采用所述的分离提纯方法从紫穗槐种子中分离得到的α-异灰叶素的化学结构如下：
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