KR20070032867A

KR20070032867A - 족도리로부터 분리한 신규 제초활성물질 엘레미신 및 그의분리방법

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Publication number: KR20070032867A
Application number: KR1020050087415A
Authority: KR
Inventors: 김미성; 이유선; 김희연; 최해진; 허수정; 권순배; 임상현; 김경희; 김성문
Original assignee: 강원도; 강원대학교산학협력단
Priority date: 2005-09-20
Filing date: 2005-09-20
Publication date: 2007-03-23
Also published as: KR100750349B1

Abstract

본 발명은 족도리로부터 분리한 신규 제초활성물질인 하기 구조식의 화합물(이하 엘레미신[elemicin]이라 칭한다), 족도리로부터 하기 구조식의 엘레미신을 분리하는 방법 및 족도리로부터 분리한 하기 구조식의 엘레미신을 포함하는 제초제에 관한 것이다.

엘레미신, 족도리, 제초활성물질, elemicin, Asarum sieboldii Miq.

Description

족도리로부터 분리한 신규 제초활성물질 엘레미신 및 그의 분리방법{Elemicin Purified from Asarum sieboldii Miq. and Preparation Method thereof}

도 1은 본 발명에 따른 족도리 헥산 추출물에 함유되어 있는 제초활성물질 HBBAA의 구조를 구명하기 위하여 EI-MS 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2는 본 발명에 따른 족도리 헥산 추출물에 함유되어 있는 제초활성물질 HBBAA의 구조를 구명하기 위하여 ¹H-NMR 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3은 본 발명에 따른 족도리 헥산 추출물에 함유되어 있는 제초활성물질 HBBAA의 구조를 구명하기 위하여 ¹³C-NMR 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 족도리(Asarum sieboldii Miq.)로부터 분리한 신규한 제초활성물질인 엘레미신(elemicin)과 그의 분리방법에 관한 것이다.

신규 제초제 개발을 위한 방법으로는 (1)무작위 유기합성 화합물의 제초활성 스크리닝 방법(random screening), (2)이미 개발된 제초제 구조의 모방 방법(me-too approach), (3)작용점 연구를 통한 생합리적 방법(biorational screening), (4)천연물 유래 제초활성물질의 탐색을 통한 개발 방법(natural product screening)을 들 수 있다(Duke, S. O., J. G. Romagni, and F. E. Dayan. 2000. Natural products as sources for new mechanisms of herbicidal action. Crop Protect. 19:583-589).

상기의 신규 제초제 개발을 위한 방법 중에서 (1)의 방법과 (2)의 방법은 현재까지 개발된 거의 모든 제초제의 개발을 주도하는 방법으로 활용되었지만, 시간과 경비가 많이 소요된다는 단점 때문에 향후의 제초제 개발을 주도하는 방법으로는 적절하지 못하다고 판단된다. (3)의 방법은 현재의 과학기술동향을 고려할 때 그 응용 시기가 적절하다고 판단되지만 제초제의 작용점(target site)인 식물체내의 효소 작용점에 대한 지식부족으로 인하여 농약개발업체에서는 크게 활용하고 있지 못하고 있는 형편이다. (4)의 방법은 자연계에 존재하는 동물, 식물, 미생물로부터 새로운 제초 활성성분을 탐색하고 이를 이용하여 제초제를 개발하는 것으로, 고속검색시스템(high throughput screening system)을 구축할 경우 시간과 경비를 획기적으로 절약할 수 있는 장점이 있다.

현재까지 자연계에 존재하는 천연물 중 코넥시스틴(cornexistin)(Nakajima, M., K. Ito, Y. Takamatsu, S. Sato, Y. Furukawa, T. Honma, J. Kodotani, M. Kozasa, and T. Haneishi. 1989. Cornexistin: A new fungal metabolite with herbicidal activity. J. Antibiotics 42:1065-1072), 소골리온(sorgoleone)(Rimando, A. M., F. E. Dayan, F. E. Czarnota, M. A. Weston, and S. O. Duke. 1998. A new photosystem II electron transfer inhibitor from Sorghum bicolor (L.) J. Nat. Prod. 61:927-930), 아테미시닌(artemisinin)(Tallez, M. R., C. Canel, A M. Rimando, and S. O. Duke. 1999. Differential accumulation of isoprenoids in glanded and glandless Artemisia annua L. Phytochem. 52:1035-1040), 시네올(cineole)(Romagni, J. G., S. O. Duke, and F. E. Dayan. 2000. Allelopathic effects of volatile cineoles on two weedy plant species. J. Chemical Ecol. 26:303-313), 렙토스퍼몬(leptospermone)(Mitchell G., D. W. Bartlett, T. E. M. Fraser, T. R. Hawkes, D. C. Holt, J. K. Townson, and R. A. Wichert. 2001. Mesotrione: a new selective herbicide for use in maize. Pest. Manag. Sci. 57:120-128), 포스피노트리신(phosphinothricin)(Lydon, J. and S. O. Duke. 1999. Inhibitors of glutamine biosynthesis. In Singh, B. K. (ed.). Plant Amino Acids：Biochemistry and Biotechnology. Marcel Dekker, New York, pp.445-464)이 새로운 제초제 개발을 위한 모화합물로 제안된 바 있으며, 실제 몇몇 천연화합물은 제품으로 개발되었다.

국내에서도 고활성의 천연제초활성물질을 신규 제초제 개발을 위한 모화합물 로 활용하고자 국내의 자생식물로부터 제초활성식물을 탐색하고, 이로부터 제초활성물질을 분리하려는 연구가 진행되고 있다. 국내 자생식물 185과 1,065속 4,596종(이철희. 2002. 생물산업발전을 위한 자생식물의 활용방안. pp.27-67. In 기능성 자생식물을 이용한 고부가가치 상품화 방안. 농촌진흥청 고령지시험장)을 이용하여 새로운 제초제 개발에 응용할 수 있는 제초활성물질을 탐색하고자 일련의 연구가 수행되었고, 다양한 제초활성식물에 대한 보고가 이루어졌다(김희연, 최해진, 임상현, 허수정, 한상섭, 김도순, 황기환, 김성문. 2003. 제초활성물질 함유 국내 자생식물의 탐색(I). 한국농약과학회지 7(4):248-257; 김미성, 이유선, 김희연, 최해진, 임상현, 허수정, 권순배, 박동식, 한상섭, 김성문. 2004. 제초활성물질 함유 국내 자생식물의 탐색(II). 한국농약과학회지 8(3):220-230; 김성문, 김미성, 이유선, 김희연, 최해진, 허수정, 권순배, 김경희, 한상섭, 임상현. 2005. 제초활성물질 함유 국내 자생식물의 탐색(III). 농약과학회지 9(2):173-180; 이유선, 김미성, 임상현, 허수정, 권순배, 박동식, 한상섭, 김성문. 2004. 국내 자생 제초활성식물의 탐색. 한국잡초학회지 24(2):103-113).

김 등(2004)이 보고한 고활성의 제초활성식물 중 족도리(Asarum sieboldii Miq.)는 국내의 전역에서 발견되는 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae)의 다년생식물로서, 근경은 마디가 많고 육질은 매운 맛이 나는 특징이 있다(이창복. 2003. 원색대한식물도감. 향문사. pp.245). 너비 5∼10cm의 표면이 녹색인 심장형 혹은 신장형의 족도리 잎은 원줄기 끝에서 2개가 마주나와 대생한 것처럼 보이며 표면은 녹색을 띤다.

족도리의 뿌리는 한방에서 세신(細辛)이라 하여 담기강화, 풍습양(風濕痒)제거, 치통 및 요통치료의 목적으로 소청룡탕과 마황부자세신탕 등의 다양한 처방제제로 활용되고 있다(박종희, 이정규. 2000. 상용 약용식물도감. 신일상사. pp.368-370).

족도리에 함유되어 있는 다양한 생리활성물질에 대한 탐색연구가 이루어져 몇몇 2차대사산물의 존재가 규명되었는데, 족도리에는 신미물질인 N-isobutyl-2,4,8,10-dodecatetraneamide 이외에도 체온강하와 알레르기 치료효과가 있는 methyleugenol(김형민, 유영현. 알레르기 치료제로서의 메틸유게놀. 대한민국특허 10-2000-0057019), asarylketone, 항균과 항암작용을 하며 고혈압에 효과가 있는 cineol(조병옥, 진미림, 정형진, 김선영, 김봉철. 생약 복합물을 포함하는 위장관 운동장애 질환의 예방 및 치료용 조성물. 대한민국특허 10-2003-0023173) 살충작용이 있는 safrole(김금숙, 백남인, 성재덕, 곽용호. 1999. 세신(Asarum sieboldii)으로부터 propiophenone의 분리. 한국농화학회지 42(4):369∼370), 항균과 항암효과가 있는 limonene(민선호, 김창규, 이능안, 양승각. 항균성 치약. 대한민국특허 10-1989-0000070), 강심작용을 하는 higenamine(김성진. 세신추출물을 함유하는 뇌세포 보호 및 기억력 증진용 조성물. 대한민국특허 10-2001-0050670)과 eucarvone과 같은 정유성분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

그러나 현재까지 본 발명에서와 같은 제초활성물질로서 엘레미신에 대한보고는 없다.

본 발명의 목적은 족도리로부터 신규 제초활성물질을 분리하고, 그 화학구조를 규명하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 족도리로부터 신규 제초활성물질을 분리하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명은 의해 족도리로부터 신규 제초활성물질을 규명한 후 이러한 신규 제초활성물질을 함유하는 제초제를 제공할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 족도리로부터 분리한 신규 제초활성물질인 하기 구조식의 화합물(이하 엘레미신[elemicin]이라 칭한다), 족도리로부터 하기 구조식의 엘레미신을 분리하는 방법 및 족도리로부터 분리한 하기 구조식의 엘레미신을 포함하는 제초제를 포함한다.

본 발명의 족도리로부터 엘레미신의 분리방법은 하기의 (a)단계 내지 (f)단 계에 의해 족도리로부터 엘레미신을 분리할 수 있다.

(a)족도리(Asarum sieboldii Miquel var. soulensis Nakai)를 메탄올로 추출하고 건조하는 단계;

(b)메탄올 추출 건조물을 헥산으로 용해하여 헥산 분획물을 얻는 단계;

(c)헥산 분획물로부터 헥산-에틸아세테이트-메탄올 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 제초활성의 HB 분획물를 얻는 단계;

(d)단계 (c)의 HB 분획물로부터 헥산-에틸아세테이트-메탄올 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 제초활성의 HBB 분획물을 얻는 단계;

(e)단계 (d)의 HBB분획물로부터 헥산-에틸아세테이트 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 제초활성의 HBBA 분획물을 얻는 단계;

(f)단계 (e)의 HBBA 분획물로부터 메탄올-아세토니트릴 용액을 이용하여 흡착 컬럼 크로마토그라피에서 용출, 분획하여 HBBAA를 분리하는 단계를 포함하여 족도리로부터 엘레미신을 분리할 수 있다.

본 발명에서 족도리는 뿌리, 잎, 줄기 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용하여 상기 (a)단계 내지 (f)단계에 의해 족도리로부터 엘레미신을 분리할 수 있다.

상기 (a)단계에서 족도리를 메탄올로 추출시 족도리는 1mm 이하 보다 바람직하게는 0.1∼1mm로 분쇄한 것을 사용할 수 있다. 분쇄한 족도리를 족도리 중량 대비 1.5∼5배 중량의 메탄올에 넣고 50∼200rpm으로 10∼30시간 동안 1∼5회 반복 추출하여 족도리 메탄올 추출물을 얻을 수 있다. 이후 족도리 메탄올 추출물은 여과하고 건조하는 한편, 건조시료를 (b)단계 내지 (f)단계를 이용하여 족도리로부터 엘레미신을 분리한다.

이하, 족도리로부터 엘레미신을 분리하는 방법을 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 엘레미신 화합물은 족도리(Asarum sieboldii Miq.)로부터 분리된 것이다. 족도리를 수세한 후 표면에 물기가 없어질 때까지 건조한 다음 1mm 이하 보다 바람직하게는 0.1∼1mm로 분쇄한다. 분쇄한 족도리 건조시료를 메탄올로 추출하고, 그 추출물을 얻을 때 사용한 메탄올과 극성을 달리하는 유기용매인 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 각각 순차 분획한 다음, 각각의 분획물을 유채(Brassica napus L.)를 대상으로 seed bioassay를 통하여 제초활성을 검정한 결과, 헥산 분획물의 GR₅₀값(대조구와 비교하여 유채의 생장을 50％ 억제하는 농도)이 가장 우수하여 디클로로메탄 분획물_,에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 물 분획물에 비해 높은 제초활성을 나타내었다.

고활성의 헥산 분획물을 헥산:에틸아세테이트:메탄올(5:1:0.1, v/v/v) 용액을 이용하여 컬럼크로마토그라피에서 높은 제초활성의 HB 분획물을 얻고, HB 분획물을 헥산:에틸아세테이트:메탄올(9:1:0.5, v/v/v) 용액을 이용하여 컬럼크로마토그라피에서 높은 제초활성의 HBB 분획물을 얻은 후, HBB 분획물을 헥산:에틸아세테이트(5:5, v/v) 용액으로 흡착(Silica gel 60, 0.040 - 0.063 mm, Merck) 컬럼 크로마토그라피에서 용출, 분획하여 높은 제초활성의 HBBA 분획물을 얻는다. 그런 다음, HBBA 분획물을 메탄올:아세토니트릴 용액(9:1, v/v)을 이용하여 흡착(ODS-A, 150 ㎛, YMC) 컬럼 크로마토그라피에서 용출, 분획하고, 제초활성을 검정한 결과 가장 제초활성이 높았던 HBBAA 분획물을 얻었다.

족도리 헥산분획물로부터 단리된 제초활성분획물 HBBAA의 구조를 밝히기 위해 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, EI-MS 분석을 행한 결과, 족도리에서 분리한 제초활성물질 HBBAA는 분자량 208, 화학식 C₁₂H₁₆O₃, 하기 구조식을 가지는 물질로 규명하였으며, 하기 구조식을 지니는 물질의 이름을 엘레미신(elemicin;1,2,3-trimethoxy-5-allylbenzene)으로 명명하였다.

본 발명은 상기 구조식의 엘레미신을 활성성분으로 함유하는 제초제를 포함한다. 이때 제초제는 상기 구조식의 엘레미신 이외에 기타 제초제에 통상적으로 사용하는 분산제, 부형제, 희석제 등의 성분을 포함하여 분말, 과립, 스프레이 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 이하 상기 제초제에 통상적으로 사용하는 성분들은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 당업자가 적의 선택하여 사용할 수 있으므로 이하 자세한 내용은 생략하기로 한다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 보다 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들은 본 발명의 실시예로서 이들에 의해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아 니다.

<실시예 1>

족도리의 뿌리부위를 수세하고 음건한 후 분쇄기를 이용하여 0.6±0.1mm로 분쇄하였다. 분쇄한 족도리 건조시료 1kg을 취하여 메탄올 2리터(L)가 담겨 있는 5-L 삼각플라스크에 넣고 100rpm의 진탕기에서 24시간씩 2회 반복 추출하였다.

상기에서 얻은 메탄올 추출물을 여과지가 깔려있는 부흐너 깔때기(Buchner funnel)에 통과시켜 잔재물을 제거한 후 회전감압농축기(EYELA NE-1101)를 이용하여 메탄올을 완전히 제거하는 완전 농축을 실시한 다음, 이를 플라스크에 넣은 후 플라스크에 물을 50ml 첨가하였다. 플라스크(Flask) 내의 건조물은 물을 이용하여 잘 용해시킨 다음 동결건조기(ILSHIN Lab Co. Ltd.)를 이용하여 -50℃에서 3일간 건조시켰다. 동결건조된 시료를 4℃의 냉장고에 보관하면서 제초활성검정에 사용하였다.

상기에서 얻은 족도리 메탄올 추출 건조물에 대한 제초활성 검정법은 seed bioassay 법을 사용하였다. 메탄올 추출 건조물을 물로 희석하여 10,000 ㎍ g^-1이 되게 스톡용액(stock solution)을 제조한 후, 이 스톡용액으로부터 농도를 달리하는 처리액을 제조하였다. 처리액을 모래 1g 위에 5립의 유채(Brassica napus L.)종자가 치상되어 있는 24-well tissue culture test plate에 처리하였고, 테스트 플레이트(test plate)를 온도 25℃, 습도 70％, 광도 250μmol m^-2 s^-1 조건의 식물생 장상에 놓고 7일 동안 생장시켰다. 처리 7일 후 유채 유식물의 생체중을 측정하여 각 시료에 대한 GR₅₀ 값(식물의 생장을 50％ 저해할 수 있는 약량)을 계산하여 제초력을 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복 실시되었다.

족도리의 제초활성을 검정하고자 메탄올 추출물을 얻고, 그 추출물을 유채를 대상으로 seed bioassay를 수행한 결과 GR₅₀값은 242 ㎍ g^-1이었다.

<실시예 2>

상시 실시예 1의 족도리로부터 메탄올을 이용하여 추출한 메탄올 추출 건조물 10g 당 각각 100ml의 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 단계적으로 용매의 극성을 높여가면서 각 용매의 가용획분별로 분획한 다음, 각각의 분획층을 회전감압농축기로 각각의 용매를 완전히 제거하는 완전농축을 실시하고 -50℃에서 3일간 동결건조시켰다. 동결건조된 각각의 분획물은 물을 사용하여 농도를 달리하는 처리액을 제조하였고, 각각의 분획물에 대한 제초력 검정을 상기 실시예 1에서 언급한 방법을 이용하여 실시하였다.

족도리의 메탄올 추출물을 헥산, 디클로로메탄_,에틸아세테이트 , 부탄올, 물로 분획하고, 각각의 분획물을 회전증발농축기로 완전농축하고 동결건조시킨 다음 유채를 대상식물로 제초력을 검정한 결과, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물의 GR₅₀값은 각각 66 ㎍ g^-1(회수율 20.7％), 42 ㎍ g^-1(회수 율 1.3％), >400 ㎍ g^-1(회수율 1.3％), >400 ㎍ g^-1(회수율 26.9％), >400 ㎍ g^-1(회수율 58.0％)이었다(표 1 참조). 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 용매로 하는 분획물 중에서 헥산 분획물의 제초활성이 가장 우수하였다.

<표 1> 족도리 메탄올 추출 건조물에 대한 용매 분획층의 제초활성

용매분획층	GR₅₀(㎍g^-1)
헥산	66
디클로로메탄	42
에틸아세테이트	>400
부탄올	>400
물	>400

<실시예 3>

상기 실시예 2에서 족도리 메탄올 추출 건조물에 대한 용매 분획물 중 가장 높은 제초활성과 회수율을 나타내었던 헥산 분획물(36.17g)을 헥산-에틸아세테이트-메탄올 용액(5:1:0.1, v/v/v)으로 흡착(Silica gel 60, 0.040∼0.063 mm, Merck) 컬럼 크로마토그라피에서 10ml씩 용출분획하여 HA 분획물(Rf 0.74∼1.00), HB 분획물(Rf 0.53∼0.67), HC 분획물(Rf 0.33∼0.50), HD 분획물(Rf 0.24∼0.30)을 얻었다.

각각의 분획물을 회전감압농축기로 완전농축한 다음, 실시예 1의 방법을 이용하여 HA 분획물, HB 분획물, HC 분획물, HD 분획물의 제초력 검정을 실시한바, 이들 분획물의 GR₅₀값은 각각 599 ㎍ g^-1(회수율 4.6％), 250 ㎍ g^-1(회수율 47.2％), 162 ㎍ g^-1(회수율 3.4％), 190 ㎍ g^-1(회수율 23.2％)이었다(표 2 참조). 제초력 및 회수율을 고려한바 HB 분획물의 제초력이 가장 우수하였다.

<표 2> 족도리 헥산 분획층으로부터 분획된 HA, HB, HC, HD 분획물의 제초활성

분획물	GR₅₀(㎍g^-1)
HA	599
HB	250
HC	162
HD	190

<실시예 4>

상기 실시예 3에서 제초활성과 회수율이 높았던 HB 분획물(17.06 g)을 헥산-에틸아세테이트-메탄올 용액(9:1:0.5, v/v/v)으로 흡착 컬럼 크로마토그라피(Silica gel 60, 0.040 - 0.063 mm, Merck)에서 10ml씩 용출분획하여 HBA 분획물(Rf 0.64∼0.72)과 HBB 분획물(Rf 0.52∼0.60)을 얻은 다음, 이들 분획물을 회전감압농축기로 용매를 완전히 제거하는 완전농축을 실시하고 실시예 1의 방법을 이용하여 HBA 분획물과 HBB 분획물의 제초력 검정을 실시한바, HBA와 HBB 분획물의 GR₅₀값은 각각 412 ㎍ g^-1(회수율 12.3％)와 138 ㎍ g^-1(회수율 13.9％)이었다(표 3 참조).

<표 3> 족도리 HB로부터 분획된 HBA, HBB 분획물의 제초활성

분획물	GR₅₀(㎍g^-1)
HBA	412
HBB	138

<실시예 5>

실시예 4의 HBA 분획물과 HBB 분획물 중에서 제초활성이 높았던 HBB 분획물(2.38g)을 헥산-에틸아세테이트 용액(5:5, v/v)으로 흡착 컬럼 크로마토그라피(Silica gel 60, 0.040∼0.063 mm, Merck)에서 10ml씩 용출분획하여 HBBA 분획물(Rf 0.83∼1.00), HBBB 분획물(Rf 0.55∼0.64), HBBC 분획물(Rf 0.24∼0.36), HBBD 분획물(Rf 0.00∼0.12)을 얻었다. 각각의 분획물을 회전감압농축기로 용매를 완전히 제거하는 완전농축을 실시하고 농축된 HBBA 분획물, HBBB 분획물, HBBC 분획물, HBBD 분획물에 대해 실시예 1의 방법을 이용하여 제초력 검정을 실시한바, 각 분획물의 GR₅₀값은 각각 239 ㎍ g^-1(회수율, 78.0％), 857 ㎍ g^-1(4.0％), 451 ㎍ g^-1(1.3％)이었던 반면, HBBD 분획물의 GR₅₀값은 1,000 이상이었다(표 4 참조).

<표 4> 족도리 HBB 분획층으로부터 분획된 분획물들의 제초활성

분획물	GR₅₀(㎍g^-1)
HBBA	239
HBBB	857
HBBC	451
HBBD	>1,000

<실시예 6>

실시예 5에서 제초활성이 가장 높았던 HBBA 분획물(1.86g)을 메탄올-아세토니트릴 용액(9:1)으로 흡착(ODS-A 150mm, YMC) 컬럼크로마토그래피에서 용출분획 하여 HBBAA 분획물(Rf 0.68∼0.80), HBBAB 분획물(Rf 0.34∼0.39), HBBAC 분획물(Rf 0.00∼0.33)을 얻었다. 각각의 분획물을 회전감압농축기로 용매를 제거하는 완전농축을 실시하고 농축된 HBBAA 분획물, HBBAB 분획물, HBBAC 분획물에 대해 실시예 1의 방법을 이용하여 제초력 검정을 실시하였다. 각 분획물에 대한 제초활성 검정결과 HBBAA 분획물의 GR₅₀ 값이 113 ㎍ g^-1으로 가장 낮았다(표 5 참조).

<표 5> 족도리 HBBA 분획층으로부터 분획된 분획물들의 제초활성

분획물	GR₅₀(㎍g^-1)
HBBAA	113
HBBAB	422
HBBAC	> 1,000

<실시예 7>

실시예 6에서 HBBAA 분획물, HBBAB 분획물, HBBAC 분획물 중에서 제초활성이 가장 높았던 HBBAA 분획물에 대해 가스 크로마토그라피-매스 스텍트로메트리(Gas chromatography-mass spectrometry)(GC-MS, 8000 Top Series, CE Instruments)를 이용하여 순수한 화합물임을 확인하였다(분석조건은 컬럼, DB-5MS (30m ×0.25mm ×0.25mm); injector 온도, 200℃; oven 온도, 100℃-15℃/min 상승-250℃(2min) 이었고 MS 분석조건은 : Ion source, EI, 70 eV; ion source 온도, 250℃ 이었다.).

한편 실시예 6에서 얻은 HBBAA 분획물(1.50g)를 normal phase 실리카겔(Silica gel 60 F₂₅₄, Merck)과 reversed phase 실리카겔 (Silica gel RP-18 F₂₅₄, Merck) 박막 크로마토그래피를 이용하여 정제한 후, HBBAA 분획물의 화학구조를 결정하기 위하여 기기분석을 실시하였다.

정제분리된 HBBAA 분획물은 EI-MS를 이용하여 분석한 결과 molecular ion(M+)이 m/z 208 (100), 193 (53), 177 (18), 165 (30), 161 (7), 150 (8), 133 (18), 118 (13), 105 (15), 91 (32), 77 (29), 65 (24), 58 (6)에서 나타났다(도 1 참조).

¹H-NMR, ¹³C-NMR 분석은 Varian Gemini 200 (400 MHz) NMR을 사용하여 분석하였고, 용매는 CDCl₃를 사용하였으며, 내부표준물질로는 테트라메틸실란(tetramethylsilane, TMS)를 사용하였다.

HBBAA를 CDCl₃를 사용하여 ¹H-NMR(400 MHz)을 실시한 결과, δ(ppm) 3.34 (2H, brd, H-1'), 3.83 (3H, s, 2-OCH₃), 3.85 (6H, s, 1 and 3-OCH₃), 5.08 (1H, brd, Ha-3'), 5.10 (1H, brd, Hb-3'), 5.95 (1H, m, H-2'), 6.41 (2H, m, H-4, H-6)에서 수소신호를 확인하였다(도 2 참조).

CDCl₃를 사용하여 HBBAA를 ¹³C-NMR(400 MHz)을 실시하였고 그 결과 δ(ppm) 40.9 (C-1'), 56.3 (C-3-OCH₃ and 1-OCH₃), 61.1 (2-OCH₃), 105.7 (C-4 and 6), 116.3 (C-3'), 136.1 (C-5), 136.6 (C-2), 137.5 (C-2'), 153.2 (C-1 and 3)에서 탄소신호를 확인 할 수 있었다(도 3 참조).

이상의 EI-MS, ¹H-NMR, ¹³C-NMR의 분석에서 족도리로부터 제초활성물질로 단리된 활성물질 HBBAA 분획물은 분자량이 208이고, 화학구조식이 C₁₂H₁₆O₃인 엘레미신(elemicin)으로 알려져 있는 1,2,3-trimethoxy-5-allylbenzene으로 결정하였다.

본 발명을 통하여 국내에 서식하고 있는 자생식물 중 하나인 족도리(Asarum sieboldii Miq.)로부터 분리되고, 그 화학구조가 밝혀진 제초활성물질인 엘레미신은, 현재까지 개발된 제초제의 구조와는 전혀 다른 구조를 가지고 있어서, 향후 새로운 제초제의 개발을 위한 선도물질(lead compound)로 활용할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

족도리로부터 분리한 하기 구조식의 엘레미신.
(a)족도리(Asarum sieboldii Miquel var. soulensis Nakai)를 메탄올로 추출하고 건조하는 단계;

(b)메탄올 추출 건조물을 헥산으로 용해하여 헥산 분획물을 얻는 단계;

(c)헥산 분획물로부터 헥산-에틸아세테이트-메탄올 용액(5:1:0.1, v/v/v)을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 제초활성의 HB 분획물를 얻는 단계;

(d)단계 (c)의 HB 분획물로부터 헥산-에틸아세테이트-메탄올 용액(9:1:0.5, v/v/v)을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 제초활성의 HBB 분획물을 얻는 단계;

(e)단계 (d)의 HBB분획물로부터 헥산-에틸아세테이트 용액(5:5, v/v)을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 제초활성의 HBBA 분획물을 얻는 단계;

(f)단계 (e)의 HBBA 분획물로부터 메탄올-아세토니트릴 용액(9:1, v/v)을 이용하여 흡착 컬럼 크로마토그라피에서 용출, 분획하여 HBBAA를 분리하는 단계를 포함하는 족도리부터 제초 활성물질인 엘레미신의 분리방법.
제2항에 있어서, 족도리는 뿌리, 잎, 줄기 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용하는 족도리부터 제초 활성물질인 엘레미신의 분리방법.
청구항 제1항의 엘레미신을 활성성분으로 함유하는 제초제.