KR100460437B1

KR100460437B1 - 제초활성을 갖는 곤달비 추출물

Info

Publication number: KR100460437B1
Application number: KR10-2003-0001649A
Authority: KR
Inventors: 김창진; 이향범; 임치환; 조종운
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2003-01-10
Filing date: 2003-01-10
Publication date: 2004-12-08
Also published as: KR20040064795A

Abstract

본 발명은 제초활성을 갖는 곤달비 추출물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 곤달비(Ligularia stenocephalaM.) 추출물과 곤달비로부터 분리 정제된 벤조퓨란계 유도체 및 클로로제닉산 유도체 화합물이 잡초 식물에 대하여 강한 제초활성이 있음을 확인함으로써 곤달비 유래 제초성 천연물을 이용한 생물농약으로서의 새로운 용도에 관한 것이다.

Description

제초활성을 갖는 곤달비 추출물{Herbicidal extracts and compounds from Ligularia stenocephala M.}

농업생태계에서 잡초종은 대단히 종류가 많고 그 피해는 막대하다. 잡초는 작물의 생장에 필수적인 수분, 영양분, 그리고 태양광선을 작물과 경쟁함으로써 작물의 질과 수량을 저하시켜 작물생산성을 떨어뜨리는 중요한 제한요인이 되고 있다. 1945년 2,4-D가 제초제로서 처음 개발 보급된 이래 농업의 생력화의 일환으로 제초제의 사용량 증가와 동일 제초제의 연용 등으로 인한 특정 잡초의 출현 및 환경오염 등이 문제가 되어 국내외적으로 환경에 안정하고, 효율이 높고, 비용이 적게 들어가며 또한 선택성이 있는 제초제 개발이 요구되고 있어 식물이 분비하는 천연화합물인 타감물질(allelochemicals)을 이용한 천연물 제초제 개발에 관한 연구가 이루어지고 있다. 이러한 화합물들은 식물 상호간의 인접한 환경으로부터 분비되는데, 다른 식물의 생장을 지연시키거나 억제하여 주어진 환경에서 경쟁력을 획득하도록 한다. 이러한 타감 활성 화합물들은 거의 모든 식물에 존재하여 뿌리로부터의 삼출, 용탈 또는 식물잔해의 분해과정 등에 의해 분비될 수 있다. 타감물질의 후보물질로는 독성가스, 유기산과 알데히드, 방향족산, 불포화 락톤, 쿠마린, 퀴논, 플라보노이드, 탄닌, 알칼로이드, 테르페노이드, 스테로이드 등을 들 수 있다. 타감물질의 종류는 1984년 라이스(Rice) 등에 의해 14개의 카테고리로 분류되었는데, 즉 페놀릭산(phenolic acid), 푸라보노이드(flavonoid), 퀴논(quinone), 테르페노이드(terpenoid), 스테로이드(steroid), 퓨린(purine), 지방산(fatty acid), 유기산(organic acid), 아세틸렌(acetylene), 불포화락톤(unsaturated lactone) 등이다. 이러한 타감물질은 식물에서의 여러 가지 2차 대사산물 중 한 가지 예로 이들 대부분의 생물학적 특성은 잘 알려져 있지 않다. 스와인(Swain)은 식물계에서 약 40만 가지의 2차 대사산물이 합성되고 있을 것으로 추정하고 있으며, 이러한 다양한 화학구조를 가진 여러 가지 화합물을 천연물 제초제 개발을 위한 선도물질로 이용될 수 있다. 지금까지의 제초활성물질에 관한 연구사례를 보면, 커피종자로부터 분리한 천연물인 1,3,7,-트리메틸크산틴은 선택성 천연제초제로 등록된바 있으며, 주글론(Juglone)류는 가래나무, 호두나무로부터 분리되었으며 7개 유도체가 제초제로 사용되고 있으며, 아르테미시닌(artemisinin)은 개똥쑥(Artemisia annua)으로부터 분리된 식물생장억제물질로서 상업화되었으며, 세스퀴테르페노이드 락톤(sesquiterpenoid lactone) 및 2,4-디하이드록시-7-메톡시-1,4-벤조크사진-3-온은 밀(Triticum aestivum)로부터 분리된 물질로 고도의 제초활성을 나타내며, 페놀릭산은 밀로부터 분리된 제초활성 및 타감 활성물질이며, DALA(D-aminolevulinic acid)는 포르피린(porphyrin) 전구체 레이저 제초제로서, 네오메란올(neomeranol)은 존슨그래스(johnsongrass)에 제초활성, 브롬계 세스퀴테르펜(brominated sesquiterpene)은 담배 잎으로부터 분리되는 식물생장조절물질 및 타감활성 물질로서, 검은 호두나무(black walnut)로부터 분리된 아잘레아(azalea)가 타감 활성을 나타내며, 식물유래 2-아미노-3-클로로-1,4-나프토퀴논 제초활성 물질은 현재 유기합성이 되고 있다. 트리콜로린 에이(Tricolorin A)는 메꽃과 식물인 이포모에 트리콜러(Ipomoea tricolor)로부터분리되는 식물생장저해 물질이며, 진달래과 식물인 로도덴드론 멕시뭄(Rhododendron maximum)으로부터 종자발아 및 뿌리신장 저해물질이 분리되었으며, 상추(Lactuca sativa)로부터 분리된 에센셜 오일(essential oils)의 식물독성(phytotoxicity)이 이용되고 있으며, 화본과 식물유래 벤조크사지노이드 아세탈 글리코사이드류(benzoxazinoid acetal glycosides)가 식물생장저해 물질로, 갯방풍(Glehnia littoralis)으로부터 팔칼린디올(falcalindiol) 타감 활성물질이 보고된 바 있다.

한편, 벤조퓨란계 물질과 관련하여 1939년 캄통(Kamthong)과 로버츤(Robertson)[J. Chem. Soc. 925]이 국화과 식물인 등골나물류의 일종인 유파토리움 퍼푸레움(Eupatorium purpureum)의 뿌리로부터 유파린(euparin)을 처음 분리하였으며 그 후로, 다른 유파토리움(Eupatorium) 종(E. cannabinum, E. japonica) 및 엔셀리아 칼리포니아(Encelia californica), 그리고 아브로타넬라 니비게나(Abrotanella nivigena)로부터 분리·동정된 이래 여러 벤조퓨란계 물질이 합성되었다. 최근 합테마리암(Habtemariam)은 유파토리움 퍼푸레움으로부터 분리된 유파린을 포함한 벤조퓨란계 화합물이 항염증효과를 나타내는 것으로 보고하였다(Phytother. Res. 15: 687-690, 2001). 벤조퓨란계 화합물로서 유파린(R=OH), 트레메톤(tremetone)(R=H, R'=H), 하이드록시트레메톤(R=OH, R'=H), 디하이드로트레메톤(R=H) 및 톡솔(R=H, R'=OH)이 유파토리움 우티케폴리움(Eupatorium urticaefolium) 및 아플로파푸스 헤테로필루스(Aplopappus heterophyllus)로부터 분리되었으며 5,6-디메톡시-2-이소프로페닐 벤조퓨란은 뮤래(Murae) 등[Tetrahedron 24: 2177-2181 (1968)]에 의해 곤달비로부터 분리되었다. 유파린과 디하이드로트레메톤은 라마챈드란(Ramachandran) 등[J. Org. Chem. 44(9): 1429-1433, 1963]에 의해 합성된바 있으며, 특히 리굴라리아 베이치아나(L. veitchiana) 등 곤달비 속 식물로부터 다수의 천연물이 기지 및 신규로 보고되었다[Chem. Ber. 110: 2640-2648, 1977; Phytochemistry 18: 877-878, 1979; Planta Med. 58: 365-367, 1992; Planta Med. 60: 91-92, 1994]. 5,6-디메톡시-2-이소프로페닐벤조퓨란은 트레메톤(tremetone) 유도체인 벤조퓨란계 화합물로 1968년 일본의 뮤래 등에 의해 곤달비(L. stenocephala)의 뿌리로부터 유파린과 함께 처음 분리되었고, 1977년 독일의 볼만(Bohlmann)에 의해서 곤달비(L. stenocephala) 및 리굴라리아 베이치아나(L. veitchiana), 리굴라리아 프르젤??스키(L. przelwalskii), 그리고 리굴라리아 시브리카(L. sibrica) 등에서도 분리되었다. 리구호조날(liguhodgsonal)은 1977년 볼만 등에 의해 리굴라리아(Ligularia) 속인 리굴라리아 홋소니(L. hodgsoni), 리굴라리아 브라키필라(L. brachyphylla), 리굴라리아 덴타타(L. dentata), 그리고 리굴라리아 클리비룸(L. clivirum) 등에서 처음 밝혀진 후, 세네시오(Senecio) 속에서 리구호조날 유도체가 분리되었으며, 지아(Jia) 등에 의해 리굴라리아 베이치아나(L. veitchiana)에서도 분리, 동정된 바 있다. 볼만은 1979년 리굴라리아속 식물인 리굴라리아 인테르메디아(L. intermedia)및 리굴라리아 쉬미드티(L. schmidtii)로부터 2-하이드록시플라타이필리드(hydroxyplatyphyllid) 물질을 포함한 4종의 물질을 분리한바있다[Phytochemistry 18: 877-878, 1979]. 한편, 활성물질로 분리, 정제된 클로로제닉산 유도체인 3,4-디카페오닐 퀴닌산과 3,5-디카페오닐 퀴닌산 화합물의 전구물질에 해당되는 퀴닌산 및 카페인산은 트립신 억제제의 저해, 혈청 트리글리세라이드 및 총 콜레스테롤 생성의 저해, 리피드 퍼옥사이드(lipid peroxide) 억제활성, 그리고 GOT 및 GPT 등의 저해 활성뿐만 아니라 항산화 등의 활성이 보고된 바 있다. 최근에는 HIV 인테그레이스(integrase)에 대한 저해활성을 나타내는 것으로 보고된 바 있다[Molecular Pharmacology 50: 846-855, 1996; Chem. Pharm. Bull. 48: 1796-1798, 2000]. 구조결정 결과 밝혀진 3,4-디카페오닐 퀴닌산 또는 3,5-디카페오닐 퀴닌산의 화학구조는 곤달비에서는 처음 밝혀진 제초성 화합물이었다.

그러나, 곤달비 식물체를 직접 이용하거나 곤달비에서 분리한 천연물을 잡초방제제로 이용하고자하는 연구는 아직까지 시도된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 식물체로부터 유래되는 천연물을 이용하여 국내외 주요 잡초종을 생물학적인 방법으로 방제하는 방법을 연구 개발하던 중, 잡초 식물에 대하여 높은 제초효과를 나타내는 곤달비를 선발하였으며 본 식물체 추출물, 분리된 물질이in vitro및in vivo에서 제초활성이 있음을 확인하고 천연물 농약으로서의 이용가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 잡초종에 대하여 제초활성을 갖는 곤달비 추출물, 이로부터 분리된 벤조퓨란계 유도체 및 클로로제닉산 유도체 화합물을 이용한 제초제를 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1은 제초활성 식물체인 곤달비의 모양을 보여주는 사진이다.

도 2는 곤달비 식물체로부터 제초활성 벤조퓨란(benzofuran)계 유도체 화합물을 분리하기 위한 과정을 나타낸 그림이다.

도 3은 곤달비 식물체로부터 제초활성 클로로제닉산(chlorogenic acid) 유도체 화합물을 분리하기 위한 과정을 나타낸 그림이다.

도 4는 곤달비로부터 분리된 5,6-디메톡시-2-이소프로페닐벤조퓨란(화학식 1)의 H¹-NMR를 나타낸 것이다.

도 5는 곤달비로부터 분리된 5,6-디메톡시-2-아세틸벤조퓨란(유파타론, 화학식 2)의 H¹-NMR를 나타낸 것이다.

도 6은 곤달비로부터 분리된 5-아세틸-2-이소프로페닐벤조퓨란(유파린, 화학식 3)의 H¹-NMR를 나타낸 것이다.

도 7은 곤달비로부터 분리된 5,6,7,8-테트라하이드로-3-하이드록시-7-(1-메틸에테닐)-1-나프타렌카르복살데하이드(리구호조날, 화학식 4)의 H¹-NMR를 나타낸 것이다.

도 8은 곤달비로부터 분리된 하이드록시트레메톤(화학식 5)의 H¹-NMR를 나타낸 것이다.

도 9는 곤달비로부터 분리된 톡솔(화학식 6)의 H¹-NMR를 나타낸 것이다.

도 10은 곤달비로부터 분리된 하이드록시플라티필리드(화학식 7)의 H¹-NMR를 나타낸 것이다.

도 11은 곤달비로부터 분리된 3,5-디카페오일퀴닌산(화학식 8)의 H¹-NMR를 나타낸 것이다.

도 12는 곤달비로부터 분리된 3,4-디카페오일퀴닌산(화학식 9)의 H¹-NMR를 나타낸 것이다.

본 발명은 잡초종에 대하여 제초활성을 갖는 곤달비 추출물, 이로부터 분리된 벤조퓨란계 유도체 및 클로로제닉산 유도체 화합물을 이용한 제초제를 그 특징으로 한다.

또한, 곤달비로부터 제초활성을 갖는 벤조퓨란계 유도체 및 클로로제닉산 유도체 화합물을 분리하는 방법을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 곤달비(Ligularia stenocephalaM.) 추출물 및 곤달비로부터 분리 정제된 다음 화학식 1(5,6-디메톡시-2-이소프로페닐벤조퓨란), 화학식 2(5,6-디메톡시-2-아세틸벤조퓨란), 화학식 3(5-아세틸-2-이소프로페닐벤조퓨란, 유파린), 화학식 4(5,6,7,8-테트라히이드로-3-하이드록시-7-(1-메틸에테닐)-1-나프타렌카르복살데하이드, 리구호조날), 화학식 5(하이드록시트레메톤), 화학식 6(톡솔) 및 화학식 7(하이드록시플라티필리드)의 벤조퓨란계 유도체 화합물 및 다음 화학식 8(3,5-디카페오일퀴닌산), 화학식 9(3,4-디카페오일퀴닌산)의 클로로제닉산 유도체 화합물이 잡초 식물에 대하여 강한 제초활성이 있음을 확인함으로써 곤달비 유래 제초성 천연물을 이용한 생물농약으로서의 새로운 용도에 관한 것이다.

본 발명자들은 잡초 방제를 위한 새로운 천연물을 탐색하고자 각종 식물재료를 수집하고, 수집한 식물체를 건조시킨 후 식물체를 부위별로 나누어 추출한 추출물을 대상으로 바랭이, 피 종자발아저해 활성을 검정함으로써 활성이 우수한 곤달비를 최종 선발하였다.

곤달비는 다년초 식물로서 깊은 산 습지에 분포하는 것으로 알려져 있으며 연한 순을 묵나물로 하고 뿌리는 부인병에 사용되고 있는 약용식물로도 잘 알려져 있어 독성문제가 없는 것이 특징이다.

본 발명의 곤달비 추출물은 곤달비 잎, 줄기, 뿌리부위를 물 또는 유기용매로 추출하여 수득한 조추출물이 효과적이다. 용매는 메탄올, 핵산, 클로로포름, 아세톤, 에틸아세테이트, 포름산 등이다.

우선 제초활성검정을 위하여 용매추출물별로 논피를 대상으로in vitro상에서 제초활성을 확인하였으며, 피 이외에 개밀, 바랭이, 미국개기장, 까마중, 자귀풀, 어저귀, 도꼬마리, 메꽃 및 수수 등에 대한in vivo제초활성도 확인하였다.

본 발명의 곤달비 추출물을 포함하는 제초성 활성물을 추출하기 위하여 수행한 실험과정은 다음과 같다.

먼저, 제초활성물질을 추출하기 위하여 곤달비 잎, 가지, 뿌리부위를 80% 메탄올로 96시간 침지 후 추출물을 감압 여과하였다. 감압여과물을 클로로포름으로 분획한 후 클로로포름층 분획물이 강한 제초활성물질이 함유되어 있음을 확인하고 이를 실리카겔 컬럼크로마토그래피(실리카겔, ODS)와 고압액상크로마토그래피(HPLC)를 통해 벤조퓨란계 7종의 활성물질을 분리, 정제하였다. 또한, 메탄올 추출물은 감압증류하고 다시 물과 클로로포름으로 분획 후 물층으로부터 다시 에틸아세테이트로 더욱 추출한 조성물이 제초활성을 갖는다. 이를 박층크로마토그래피, 컬럼크로마토그래피와 고압액상크로마토그래피(HPLC)를 통해 클로로제닉산 유도체 2종의 활성물질을 분리, 정제하였다.

본 발명에서 사용한 곤달비 뿌리, 가지, 잎 부위 모두가 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 사람에게 무해함이 입증된 바, 본 발명의 유도체들이 인체에 대한 독성을 유발하지 않는다. 또한, 본 발명의 벤조퓨란계 및 클로로제닉산 유도체 구조를 기반으로 화학구조를 변형하여 더 활성효과를 가지는 신규화합물을 개발하는 모핵 화합물로 이용할 수 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 곤달비로부터 벤조퓨란계 화합물 분리

수집한 곤달비 시료 4 kg을 80% 메탄올로 4일간 침지한 후 감압증류하였다. 제초활성 검정결과 클로로포름층(35.8 g)이 강한 제초활성이 있음을 확인하고 이를 실리카겔(1 kg) 컬럼(4 i.d. ×45 ㎝)에서 3회에 걸쳐 분리하였다. 1차 실리카겔 컬럼크로마토그래피(n-hexane,n-hexane/EtOAc = 5/1 ∼ 1/5(v/v), MeOH)를 실시하여 조분획층을 얻었으며, 이중 가장 활성이 높고 양도 많은 분획(6.08 g)[F2]을 2차 실리카겔 컬럼크로마토그래피(n-hexane/EtOAc = 10/0, 9/1 ∼ 1/1(v/v), EtOAc 그리고, MeOH)를 실시하여 이들 중에서 활성이 높은 분획(1.561 g)[F2-4, F2-5]으로부터 백색침전물(4 ℃, 아세톤, 50 mg)을 여과하여 얻고 prep-HPLC(silica,n-hexane: EtOAc=1:1(v/v))를 실시하고 화합물 유파린(화학식 3, 35.9 mg)을 분리하였다. 또한, 여액(1.511 g)을 다시 3차 실리카겔 컬럼크로마토그래피(n-hexane/EtOAc = 15/1(v/v), MeOH)를 실시하여 총 8개의 조분획층을 얻었으며 이중에서 활성이 높은 분획(385 mg)[F2-4-4]을 Prep-HPLC(silica,n-hexane/EtOAc = 4/1(v/v))을 이용하여 5,6-디메톡시-2-이소프로페닐벤조퓨란(화학식 1), 5,6-디메톡시-2-아세틸벤조퓨란(화학식 2), 하이드록시트레메톤(화학식 5), 톡솔(화학식 6) 및 하이드록시플라티필리드(화학식 7)를 각각 분리하였다. 또한, 활성이 높은 또 다른 분획(5.28 g)[F3, F4]을 2차 실리카겔 컬럼크로마토그래피(chloroform/acetone/formic acid = 9/1/0.1 (v/v), MeOH, 각 100 ㎖)를 실시하여 11개의 조분획층을 얻었으며, 이중에서 활성이 높은 분획(1.615 g)[F3-5]을 세파덱스 LH-20 컬럼크로마토그래피(chloroform/MeOH = 1/1 (v/v))를 실시하여 총 6개의 조분획층을 얻었고, 활성이 높은 분획[F3-5-5]을 다시 Sep-pak 실리카 카트리지(n-hexane, chloroform, EtOAc, MeOH)로 분리하였다. 이 중에서 활성이 높은 클로로포름층(192 mg)을 prep-HPLC(ODS, 55% acetonitrile)를 이용하여 리구호조날(화학식 4, 1.8 mg)을 분리하였다[도 2].

실시예 2: 벤조퓨란계 화합물 구조분석

곤달비의 각 부위별로 제초활성 검정을 통하여 분리된 화합물의 구조는 질량분석기(EI-MS), 적외선(IR) 및 자외선(UV) 분광기, 핵자기공명분석기(¹H-¹H COSY,¹H-¹³C COSY, HMBC, HMQC) 등의 기기분석 및 문헌 조사를 통하여 동정하였다. 화합물들에 대한 EI-MS 측정결과 분자이온 피크 분석 및 적외선 스펙트럼 분석 결과 벤조퓨란계의 유파린(C₁₃H₁₂O₃, 분자량 216), 5,6-디메톡시-2-이소프로페닐벤조퓨란(C₁₃H₁₄O₃, 분자량 218), 5,6-디메톡시-2-아세틸벤조퓨란(C₁₂H₁₂O₄, 분자량 220), 하이드록시트레메톤(C₁₃H₁₄O₃, 분자량 218), 톡솔(C₁₃H₁₄O₃, 분자량 218), 리구호조날(C₁₄H₁₆O2, 분자량 216), 하이드록시플라타필리드[R=OH: C₁₄H₁₄O₃(분자량 230); R=Ac₂O: C₁₆H₁₆O₄(분자량 272)]로 밝혀졌다. 특히, 하이드록시플라티필리드는 2-C의 하이드록시기가 Ac₂O로 치환이 되어 분자구조가 C₁₆H₁₆O₄(분자량 272)로 바뀌는 것을 통해 OH기가 있음을 확인하였다.

실시예 3: 곤달비로부터 클로로제닉산 유도체 분리

곤달비의 잎(20 kg)을 음건, 마쇄하여 분말(4 kg)을 얻었다. 80% MeOH 72 ??에 약 96시간씩 2회 침지한 후, 감압 여과하였다. 여액은 감압 농축하여 여기에 물을 적당량 추가하고 동량의 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물 순으로 극성에 따른 용매 분획을 2회에 걸쳐 실시하였다. 이중 에틸아세테이트층(45.2 g)의 활성이 가장 높게 나타났으며 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(톨루엔/에틸아세테이트/메탄올/포름산 = 5/3.5/0.5/1, v/v)를 실시하여 7개의 조분획층(F1-F7)을 얻었다. 활성검정을 통해 다시 6번 분획층을 단계적 HPLC 컬럼 크로마토그래피(아세톤/물 = 1/9 -> 6/4, v/v)를 실시하여 6개의 조분획층(L1-6)을 얻었다. 이중에서 활성이 높은 L3,4 층을 prep-HPLC(ODS, 53%메탄올, 0.1% 포름산)를 통해 3,5-디카페오일퀴닌산(화학식 8), 3,4-디카페오일퀴닌산(화학식 9)을 분리하였다[도 3].

실시예 4: 클로로제닉산 유도체의 구조분석

클로로제닉산 유도체 2종에 대한 화합물의 구조는 질량분석기(EI- 및 FAB-MS), 적외선(IR) 및 자외선(UV) 분광기, 핵자기공명분석기(¹H-¹H COSY,¹H-¹³C COSY, HMBC) 등의 기기분석 및 문헌 조사를 통하여 동정하였다. FAB-MS(Jeol JMS-BX 303) 측정결과 m/z 539(M+Na)⁺, m/z 517(M+1)⁺피크가 관찰되어 분자량이 516임을확인하였다. 또한, IR 스펙트럼으로부터 3200 cm^-1부근에서 하이드록시기와 1700 cm^-1부근에서 알파, 베타-불포화 카보닐기가 확인되었다.¹H-NMR과¹³C-NMR 스펙트럼을 해석한 결과, 두 물질의 분자식이 동일한 C₂₅H₂₄O₁₂인 3,5-디카페오일퀴닌산 및 3,4-디카페오일퀴닌산으로 동정되었다. 즉, 3,4-디카페오일퀴닌산은 3,5-디카페오일퀴닌산이 C-5에 결합된 카페인산 부위가 C-4위치에 결합된 것 이외에는 동일한 구조로 판명되었다.

실시예 5: in vitro 제초활성검정

in vitro제초활성 검정은 바랭이 및 논피의 종자발아 저해검정법을 통하여 실시하였다. 종자발아 저해검정법은 바랭이 및 논피 종자를 습실 처리된 플레이트 상에 깔고 그 위에 추출물 등의 시료를 처리한 후 종자발아 및 유묘신장 정도를 조사하는 방법과, 3 ∼ 4 일간 미리 종자발아를 유도시킨 유묘체에 직접 처리하는 방법이다. 즉, 여과지 3장을 살균수에 묻혀 플레이트에 놓은 후 바랭이, 논피의 발아되지 않은 종자와 발아된 유묘에 화학식 1 내지 9의 화합물을 원액에서 수배까지 희석하여 일정농도로 처리하고 광조건 하의 습실 배양기에서 치상하는 방법이다.

구 분	종자발아 제초활성(%)	활성농도
구 분	논피	활성농도	바랭이
벤조퓨란계 유도체	화합물 1	70	100	10^-3M
	화합물 2	<70	90	10^-3M
	화합물 3	30	<90	10^-3M
	화합물 4	30	<90	10^-3M
	화합물 5	<70	90	10^-3M
	화합물 6	<70	90	10^-3M
	화합물 7	<70	90	10^-3M
클로로제닉산 유도체	화합물 8	>95	100	10^-3M
클로로제닉산 유도체	화합물 9	>95	100	10^-3M

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 벤조퓨란계 유도체 및 클로로제닉산 유도체의 논피에 대한 활성농도는 대체로 10^-3M농도에서 30 ∼ 100%의 제초활성을 보였으며, 클로로제닉산 유도체가 논피에 대하여 더 높은 종자발아 저해활성이 95% 이상으로 높은 것으로 나타났다. 또한, 곤달비로부터 분리된 상기 화합물들의 바랭이에 대한 제초활성은 매우 우수한 것으로 확인되었다.

실시예 6: in vivo 제초활성검정

잡초에 대한in vivo저해활성을 검정하기 위하여 대상잡초(돌피, 개밀, 바랭이, 미국개기장, 까마중, 자귀풀, 어저귀, 도꼬마리, 메꽃, 바랭이, 돌피, 명아주 및 토끼풀)의 잎에 곤달비 추출물을 직접 폿트에 처리하여 검정하였다.In vivo제초활성 검정을 위해서는 사질토양과 적당량의 비료를 혼합시킨 다음, 시험용 폿트(150, 350 cm²)에 담고 파종구를 만들어 식물체를 심거나 종자를 파종한 후 곱게 친 흙으로 복토한 후 온실에서 자란 것을 공시하였으며 처리할 추출물[0.2%의Tween 20 용액 미량 첨가 또는 님오일(neem oil) 등 첨가] 용액을 만들어 손분무기(hand sprayer)로 경엽 처리하였다.

처리한 후 온실에서 2주일간 생육시키면서 처리 4일 및 14일 후에 나타나는 제초활성 효과를 형태학적, 생리학적 관찰근거에 의해 달관 조사하였다. 처리는 발아 전(pre-emergence)과 발아 후(post-emergence)로 나누어 제초활성을 조사하였다. 조사 결과는 무방제의 경우를 0, 완전방제의 경우를 100%으로 하여 각각의 제초활성 정도를 평가하는데 70% 이상의 등급을 가지면 실제적으로 그 식물에 대하여 제초효과가 있는 것으로 간주하며 80% 이상의 제초효과를 보인 경우는 방제가능으로 간주하였으며, 그 결과는 다음 표 2에 나타내었다.

자엽	잡초종	분획물 및 혼합물	농도
자엽	잡초종	물층	농도	에틸 아세테이트층	부탄올층	클로로포름층	클로로포름층 추출물 + 님오일
단자엽	Echinochloa crus-galli(피)	0	30	0	70	90	40 kg/ha
	Agropyron smithii(개밀)	0	0	0	0	20	"
	Digitaria sanguinalis(바랭이)	0	60(BC)	0	100	100	"
	Panicum dichotomiflorum(미국개기장)	0	0	0	60(BC)	80	"
쌍자엽	Solanum nigrum(까마중)	0	0	0	100	100	"
	Aeschynomene indica(자귀풀)	0	20	0	40(IC)	60	"
	Abutilon avicennae(어저귀)	0	0	0	20	40	"
	Xanthium strumarium(도꼬마리)	0	0	0	0	20	"
	Calystegia japonica(메꽃)	0	0	0	0	20	"
주) 제초효과는 처리 14일 후 평가되었으며, 0: 비효과, 10-30: 미세효과, 40-60: 중 도 효과, 70-90: 강한 효과, 100: 완전한 제초효과를 나타냄

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 특히 클로로포름 추출물이 40 kg/ha 농도에서 바랭이, 까마중 등 주요 문제 잡초종에 대해 100%의 높은 제초활성을 나타내었으며 피에 대해서도 70%의 제초활성을 나타내어 유기용매 추출물 및 곤달비 유래 화합물의 합성물이 천연물농약으로 사용될 수 있음을 보여주었다. 또한, 님오일(neem oil)을 클로로포름 추출물에 1% 첨가하여 혼합 처리할 경우 제초활성이 크게 증가하는 것을 확인하여 님오일과 같은 오일을 혼합 처리하는 것이 더욱 효과적임을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 바랭이, 까마중, 피 등 잡초종에 높은 제초활성을 나타내는 곤달비 식물체를 직접 이용하거나 이로부터 유래하는 분리된 제초활성 물질을 이용하여 친환경형 천연물농약으로서 유용한 효과가 있다.

Claims

곤달비(Ligularia stenocephalaM.) 추출물과 농학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 제초제.
제 1 항에 있어서, 상기 곤달비 추출물의 유효성분으로는 다음 화학식 1 내지 9로 표시되는 화합물 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제초제.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]
도 2에 나타낸 바와 같이, 곤달비(Ligularia stenocephalaM.)를 메탄올 수용액으로 침지 후 감압여과하고, 이를 물과 클로로포름으로 분획하여 얻은 클로로포름 분획물로부터 다음 화학식 1 내지 7로 표시되는 화합물을 각각 분리하는 것을 특징으로 하는 곤달비로부터 벤조퓨란계 유도체 화합물의 분리방법.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]
제 3 항에 있어서, 상기 클로로포름 분획물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피하여 얻은 조분획물(F2)을 다시 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하여 조분획물(F2-4, F2-5)을 얻고, 이 조분획물을 여과하여 얻은 백색침전물로부터 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 얻는 것을 특징으로 하는 곤달비로부터 벤조퓨란계 유도체 화합물의 분리방법.
제 4 항에 있어서, 상기 백색침전물 여과하여 남은 여액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 얻은 조분획물(F2-4-4)로부터 상기 화학식 1, 2, 5, 6 및 7로 표시되는 화합물을 각각 얻는 것을 특징으로 하는 곤달비로부터 벤조퓨란계 유도체 화합물의 분리방법.
제 3 항에 있어서, 상기 클로로포름 분획을 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하여 얻은 조분획물(F3, F4)을 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하여 얻은 조분획물(F3-5)를 세파덱스 크로마토그래피를 실시하여 얻은 조분획물(F3-5-5)로부터 상기 화학식 4로 표시되는 화합물을 얻는 것을 특징으로 하는 곤달비로부터 벤조퓨란계 유도체 화합물의 분리방법.
도 3에 나타낸 바와 같이, 곤달비(Ligularia stenocephalaM.)를 메탄올 수용액으로 침지 후 감압여과하고, 이를 물과 클로로포름으로 분획하여 얻은 물 분획물로부터 다음 화학식 8 및 9로 표시되는 화합물을 각각 분리하는 것을 특징으로 하는 곤달비로부터 클로로제닉산 유도체 화합물의 분리방법.

[화학식 8]

[화학식 9]
제 7 항에 있어서, 상기 물 분획물을 물과 에틸아세테이트로 분획하고, 에틸아세테이트 분획물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하여 얻은 조분획물(F6)로부터 상기 화학식 8 및 9로 표시되는 화합물을 각각 얻는 것을 특징으로 하는 곤달비로부터 클로로제닉산 유도체 화합물을 분리하는 방법.