ES2294014T3 - Promotores de la regeneracion de nervios que contienen un inhibidor de semaforina como ingrediente activo. - Google Patents
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Abstract
Utilización de un compuesto representado por la fórmula [8] o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita, en la que R4 representa un átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo o un grupo alcoxicarbonilo y R5 representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo aciloxi y R6 y R7 están representados por (1) o (2) a continuación: (1) R6 representa un grupo metilo y R7 representa un grupo mostrado por las fórmulas [2], [9] o [10], en la que R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo o un grupo alquiloxicarbonilo y R2 representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo aciloxi y R3 representa un átomo de hidrógeno, un grupo metoximetilo o la fórmula [3], en las que R1 y R2 tienen los mismos significados que en la fórmula [2], en la que R1 y R2 tienen los mismos significados que en la fórmula [2], (2) R6 representa un grupo mostrado por la fórmula [5] u [11] y R7 representa un grupo acetilo; en las que R1 y R2 tienen los mismos significados que en la fórmula [2].
Description
Promotores de la regeneración de nervios que
contienen un inhibidor de semaforina como ingrediente activo.
La presente invención se refiere a promotores de
la regeneración de nervios centrales o periféricos que contienen un
inhibidor de semaforina como ingrediente activo, a preventivos y
remedios para enfermedades neurodegenerativas o similares que
contienen promotores de regeneración de nervios, a inhibidores de
semaforina no peptídicos y no nucleotídicos, a los compuestos con
actividad inhibidora de semaforina y a un procedimiento
microbiológico para producir dichos compuestos o similares.
Las células nerviosas son tejidos específicos,
que no presentan potencial mitótico en un adulto. Por consiguiente,
una vez se lesionan, el daño perdurará durante un periodo de tiempo
prolongado. Se dice que no existe potencial de regeneración
especialmente en el sistema nervioso central (SNC) tal como en el
cerebro y la médula espinal. La falta de potencial de regeneración
en los nervios centrales puede considerarse una de las razones por
las que no se han creado terapias para lesiones traumáticas tales
como la lesión de la médula espinal ni para enfermedades
neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer y la
enfermedad de Parkinson. Por otra parte, los nervios periféricos
poseen potencial de regeneración. Sus axones pueden regenerarse y
sus funciones pueden recuperarse incluso después de agravarse. En
este caso, sin embargo, la recuperación requiere un espacio de
tiempo prolongado comprendido entre varios meses e incluso más de un
año, y por lo tanto los pacientes han de padecer dolores
considerables. Además, el periodo de recuperación es tan largo que
algunas células nerviosas pueden morir durante este periodo, lo que
con frecuencia conduce al fallo de la recuperación de las
funciones. Y sin embargo, incluso los nervios periféricos que
presentan regeneración potencial son completamente incapaces de
crecer más en el SNC tal como en el cerebro y en la médula espinal.
Esto conduce a la base para la hipótesis de que existen algunas
sustancias en el sistema nervioso central que inhiben el crecimiento
de los nervios. Si se suprimen las sustancias inhibidoras para la
regeneración de los nervios en el sistema nervioso central
utilizando anticuerpos o similares, se observará la regeneración de
los nervios en el sistema nervioso central así como la recuperación
de sus funciones, si bien parcialmente. Como una de dichas
sustancias inhibidoras para la regeneración de los nervios
centrales, se ha descubierto recientemente Nogo (Nature 403,
434, 2000, Nature 403, 439, 2000). Sin embargo, solamente
una pequeña parte de los axones se regeneran al inhibir Nogo y de
este modo se supone que existen algunas otras sustancias inhibidoras
de la regeneración. Las siguientes son sustancias ejemplificadas
como experimentales que inhiben la regeneración de los nervios: MAG
(glucoproteína asociada a la mielina); tenascina; gangliósidos;
efrina; netrina; slit; semaforinas y similares. La única razón para
que estas sustancias estén ejemplificadas como sustancias
experimentales es que inhiben el crecimiento de las neuritas in
vitro. Hasta ahora no se ha aclarado si realmente actúan para
inhibir la regeneración in vivo de los nervios.
Haciendo referencia a la semaforina, su gen se
aisló en primer lugar como un factor implicado en la formación del
sistema nervioso en langostas en desarrollo. Desde entonces, se ha
publicado que las semaforinas constituyen una gran familia de genes
que se distribuyen en nemátodos, peces, mamíferos o incluso en
determinados tipos de virus, y actualmente los genes de semaforina
se clasifican en ocho subfamilias o clases de genes basándose en
sus estructuras (Cell 97, 551, 1999). La semaforina es una
proteína endógena identificada como un factor que colapsa el cono
del crecimiento nervioso y suprime el crecimiento del axón, y hasta
ahora, se han descrito aproximadamente 20 especies moleculares
(Cell 97, 551, 1999). Sin embargo, la mayoría de las
funciones de muchas familias de semaforina no se han descubierto
con detalle. El grupo génico más estudiado es el de una subfamilia
denominada tipo clase III, de la que todos los productos de la
traducción son proteínas secretoras. Aunque es sabido que las
proteínas codificadas por estos genes poseen crecimiento intensivo
de las neuritas que suprime la actividad y el cono de crecimiento
colapsa la actividad in vitro, se publicó que provocan
crecimiento de neuritas en determinadas condiciones. Entre éstas, la
semaforina 3A (Sema3A) es la más estudiada y es conocida por
provocar el desplome del cono de crecimiento de las células
nerviosas cultivadas a una concentración tan baja como 10 pM en un
corto periodo de tiempo (Cell 75, 217, 1993, Cell 75,
1389, 1993). Con el fin de analizar las funciones in vivo de
las semaforinas, se han estudiado (Neuron 19, 995, 1997)
ratones modificados genéticamente por neuropilina-1,
que es uno de los componentes del receptor Sema3A. Dichos ratones
modificados genéticamente presentan letalidad embriónica así como
anomalía motriz en algunos sistemas nerviosos tales como el nervio
trigémino y anomalía de angiogénesis. Aunque se aprecia similar
anomalía motriz en sistemas nerviosos en ratones modificados
genéticamente por Sema3A, algunos ratones aislados es sabido que
crecen hasta adultos sin graves problemas. Por consiguiente, las
funciones in vivo de Sema3A permanecen en gran medida
desconocidas.
Además, con respecto a las semaforinas son
también conocidas las siguientes: nucleótidos complementarios y
antagonistas tales como anticuerpos o similares para semaforina W,
semaforina Y y semaforina Z se preparan para promotores de
regeneración de nervios centrales (documentos WO 98/5628, WO
98/11216 y WO 98/20928); y es conocido un procedimiento de
provocación del crecimiento de neuritas poniendo en contacto una
célula nerviosa con un anticuerpo que se une específicamente a
colapsina humana (patente US nº 5.416.197). Sin embargo, se
desconocen todavía las acciones in vivo de estos anticuerpos
o similares. Además, cualquiera de los compuestos de bajo peso
molecular aparte de péptidos o nucleótidos tales como un anticuerpo
o un nucleótido complementario o similares, que inhiben
específicamente a semaforina han sido completamente
desconocidos.
El objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar inhibidores de semaforina, promotores de regeneración
de nervios periféricos o centrales que contienen dichos inhibidores
de semaforina como ingrediente activo, preventivos y remedios para
las enfermedades neuropáticas y las enfermedades neurodegenerativas
que contienen los promotores de regeneración de nervios.
Se cree que las semaforinas presentan varias
acciones, y algunos investigadores propusieron que las semaforinas
estaban implicadas no solamente en el desarrollo de nervios sino
también en la regeneración de nervios, aunque existían pocas
pruebas. Además, un animal que carece del gen no sirve siempre como
herramienta para evaluar la función del gen porque la pérdida de la
función génica provoca con frecuencia una acción compensadora por
otros genes, como se observa en el animal modificado genéticamente
con MAG. Aunque se ha descubierto hace años como resultado de
numerosos estudios que MAG es una de las sustancias inhibidoras para
la regeneración de nervios, los ratones modificados genéticamente
por MAG no presentaban estimulación de la regeneración de nervios.
Los presentes inventores, por consiguiente, comenzaron el estudio
sobre semaforina para examinar si la inhibición de semaforina
ocasiona la regeneración de nervios in vivo sin utilizar
animales modificados genéticamente con semaforina.
En primer lugar, se identificó una sustancia que
inhibe completamente la actividad de semaforina in vivo, y
de este modo se administró el inhibidor de semaforina a un modelo
animal de regeneración de nervios para aclarar la actividad que
provoca la regeneración de nervios de dicho inhibidor de semaforina.
Como resultado de este estudio los presentes inventores han
descubierto que una sustancia, que no solamente inhibe la actividad
del desplome del cono de crecimiento de semaforina completamente
sino que también inhibe persistentemente la actividad de semaforina
en un gel de colágeno y provoca el crecimiento de neuritas en
presencia de semaforina, y presenta la actividad que estimula la
regeneración de nervios in vivo. Los presentes inventores han
descubierto además que la regeneración de nervios fue activada no
solamente en el sistema nervioso periférico sino en el SNC
utilizando el inhibidor de semaforina. El estudio no sólo aclaró la
acción in vivo de la semaforina sino que también hizo
posible proporcionar un promotor de regeneración de nervios que
contiene un inhibidor de semaforina, que ha permanecido
completamente desconocido, como ingrediente activo, y un producto
farmacéutico que contiene el promotor de regeneración de nervios. El
estudio ha aclarado también que un compuesto con una estructura
específica en la molécula descubierta en el cultivo de
Penicillium sp. SPF-3059, que fue
identificado por los presentes inventores, presenta actividad
inhibidora de semaforina. La presente invención se llevó a cabo
basándose en estos descubrimientos.
La presente invención se refiere a la
utilización de un compuesto representado por la fórmula [8] o una
sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un
medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para
estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo
necesita,
en la que R^{4} representa un
átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo o un grupo alcoxicarbonilo y
R^{5} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un
grupo aciloxi y R^{6} y R^{7} están representadas por (1) o (2)
a
continuación:
(1) R^{6} representa un grupo metilo y R^{7}
representa un grupo mostrado por las fórmulas [2], [9] o [10],
en la que R^{1} representa un
átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo o un grupo alquiloxicarbonilo
y R^{2} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un
grupo aciloxi y R^{3} representa un átomo de hidrógeno, un grupo
metoximetilo o la fórmula
[3],
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en las que R^{1} y R^{2} tienen
los mismos significados que en la fórmula
[2],
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en la que R^{1} y R^{2} tienen
los mismos significados que en la fórmula
[2],
(2) R^{6} representa un grupo mostrado por la
fórmula [5] u [11] y R^{7} representa un grupo acetilo;
\vskip1.000000\baselineskip
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en las que R^{1} y R^{2} tienen
los mismos significados que la fórmula
[2].
Se conocen compuestos similares a los descritos
anteriormente. Por ejemplo, el documento
EP-A-0537622 se refiere al
compuesto xantofulvina, que se dice que presenta propiedades
antimicóticas.
El documento
WO-A-92/16517 y Wrigley et
al., Pure & Applied Chemistry,
66(10/11), 2383-2386 (1994) se
refieren ambos a derivados de xantona que son agentes de unión de
CD4 e inhibidores de las enzimas proteína cinasa C (PKC) y
colagenasa. Se dice que los compuestos son útiles en el tratamiento
de la enfermedad autoinmunitaria, la enfermedad injerto contra el
hospedador, rechazo de órganos, artritis reumatoide, lupus
eritematoso generalizado, diabetes mellitus, esclerosis múltiple,
cirrosis biliar primaria, enfermedades alérgicas, enfermedades
inflamatorias y VIH.
Aoki et al., Tetrahedron Letters,
32(36), 4737-4740 (1991) se refiere al
inhibidor de fosfolipasa C, Vinaxantona que es producido por
Penicillium vinaceum.
Sin embargo, ninguno de los documentos
anteriores sugieren que los compuestos que describen podrían ser
útiles como inhibidores de semaforina o podrían utilizarse para
estimular la regeneración nerviosa.
Por otra parte, Yoshio Goshima et al.,
Jpn. J. Pharmacol., 82, 273-279 (2000)
da a conocer que las semaforinas tales como sema 3A son reconocidas
como moléculas repulsivas potentes que inhiben o repelen el
crecimiento de neuritas y esta inhibición de la actividad repulsiva
puede aumentar la regeneración de las neuronas del SNC, pero no
menciona ningún compuesto que podría utilizarse con esta
finalidad.
La invención se refiere también a la utilización
de un compuesto representado por la fórmula [12] o de una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un
medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para
estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita
(reivindicación 2).
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en la que R^{1}, R^{2}, R^{4}
y R^{5} tiene los mismos significados que en las fórmulas [2] y
[8].
Para los objetivos de esta utilización, se
prefiere que en la fórmula [12]:
por lo menos uno entre R^{2} y R^{5}
represente un grupo hidroxilo (reivindicación 3);
R^{2} representa un grupo hidroxilo
(reivindicación 4);
tanto R^{2} como R^{5} representan grupos
hidroxilo (reivindicación 5);
R^{4} representa un grupo carboxilo
(reivindicación 6);
R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo
y R^{2} un grupo hidroxilo (reivindicación 7).
Además, la invención se refiere a un compuesto
representado por la fórmula [12]
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en la que por lo menos uno de entre
R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} está representado por un átomo
de hidrógeno, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable
(reivindicación
8).
Además, se prefiere que en la fórmula [12]:
por lo menos uno entre R^{2} y R^{5}
represente un grupo hidroxilo (reivindicación 9);
R^{2} representa un grupo hidroxilo
(reivindicación 10);
tanto R^{2} como R^{5} representan grupos
hidroxilo (reivindicación 11);
R^{4} representa un grupo carboxilo
(reivindicación 12);
R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo
y R^{2} un grupo hidroxilo (reivindicación 13).
La invención se refiere además a la utilización
de un compuesto representado por la fórmula [13] o de una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo,
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en la que R^{1}, R^{2}, R^{4}
y R^{5} tienen los mismos significados que en las fórmulas [2] y
[8], para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la
actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios
en un paciente que lo necesita (reivindicación
14).
Para los objetivos de esta utilización, en el
compuesto de fórmula [13], se prefiere que:
por lo menos uno entre R^{2} y R^{5}
represente un grupo hidroxilo (reivindicación 15);
R^{2} representa un grupo hidroxilo
(reivindicación 16);
tanto R^{2} como R^{5} representan grupos
hidroxilo (reivindicación 17);
R^{4} representa un grupo carboxilo
(reivindicación 18);
R^{2} y R^{5} representan un grupo
hidroxilo, R^{1} representa un grupo carboxilo y R^{4} un grupo
átomo de hidrógeno (reivindicación 19);
R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo
y R^{5} representa un grupo hidroxilo (reivindicación 20).
La invención se refiere además a un compuesto
representado por la fórmula [13]
\vskip1.000000\baselineskip
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en la que por lo menos uno de entre
R^{1}, R^{2} y R^{5} representa un átomo de hidrógeno o una
sal del mismo farmacéuticamente aceptable (reivindicación
21).
En el compuesto de fórmula [13] se prefiere
que:
por lo menos uno entre R^{2} y R^{5}
represente un grupo hidroxilo (reivindicación 22);
R^{2} representa un grupo hidroxilo
(reivindicación 23);
tanto R^{2} como R^{5} representan grupos
hidroxilo (reivindicación 24);
R^{4} representa un grupo carboxilo
(reivindicación 25);
R^{2} representa un grupo hidroxilo y R^{4}
representa un grupo carboxilo (reivindicación 26);
R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo
y R^{5} un grupo hidroxilo (reivindicación 27).
\newpage
La invención proporciona asimismo un compuesto
representado por la fórmula [14] o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo,
en la que R^{1}, R^{2},
R^{3}, R^{4} y R^{5} tiene los mismos significados que en las
fórmulas [2] y [8] (reivindicación
28).
En el compuesto de fórmula [14] se prefiere
que:
por lo menos uno entre R^{2} y R^{5}
represente un grupo hidroxilo (reivindicación 29);
R^{2} representa un grupo hidroxilo
(reivindicación 30);
R^{2} y R^{5} representan grupos hidroxilo
(reivindicación 31);
R^{2} representa un grupo carboxilo
(reivindicación 32);
R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo
y R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo (reivindicación
33);
R^{1} representa un grupo carboxilo y R^{2}
y R^{5} representan un grupo hidroxilo y R^{3} representa un
grupo metoximetilo (reivindicación 34);
R^{1} representa un grupo carboxilo o un grupo
metoximetilo,
R^{4} representa un grupo carboxilo, R^{3}
representa un átomo de hidrógeno y R^{5} representa un grupo
hidroxilo (reivindicación 35);
R^{1} representa un grupo carboxilo o un grupo
metoximetilo,
R^{4} representa un grupo carboxilo, R^{2} y
R^{3} representan un átomo de hidrógeno y R^{5} representa un
grupo hidroxilo (reivindicación 36);
R^{3} está representado por la fórmula [3]
(reivindicación 37);
La invención se refiere además a un compuesto de
fórmula [14] tal como el descrito anteriormente o a una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un
medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para
estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita
(reivindicación 38).
En un aspecto adicional, la invención
proporciona un compuesto representado por la fórmula [15] o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo:
en la que R^{4} y R^{5} tiene
los mismos significados que en la fórmula [8] (reivindicación
39).
En el compuesto de fórmula [15]:
R^{5} representa un grupo hidroxilo
(reivindicación 40);
R^{4} representa un grupo carboxilo
(reivindicación 41).
La invención se refiere además a la utilización
de un compuesto de fórmula [15] tal como el definido anteriormente
o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la
preparación de un medicamento destinado a inhibir la actividad de
semaforina para estimular la regeneración de nervios en un paciente
que lo necesita (reivindicación 42).
La invención se refiere en otro aspecto a un
compuesto representado por la fórmula [16] o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo:
en la que R^{1}, R^{2}, R^{4}
y R^{5} tiene los mismos significados que en la fórmulas [2] y [8]
(reivindicación
43).
En el compuesto de fórmula [16] se prefiere
que:
por lo menos uno de entre R^{4} y R^{5}
represente un átomo de hidrógeno (reivindicación 44);
R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo
(reivindicación 45);
R^{4} representa un grupo carboxilo
(reivindicación 46).
En otro aspecto, la invención se refiere a la
utilización de un compuesto de fórmula [16] o a una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un
medicamento destinado a inhibir la actividad de semaforina para
estimular la regeneración de nervios en un paciente que lo necesita
(reivindicación 47).
La invención se refiere también a la utilización
mencionada anteriormente en la que el medicamento está destinado a
tratar o prevenir enfermedades neuropáticas y/o enfermedades
neurodegenerativas (reivindicación 48).
Las enfermedades neuropáticas y/o las
enfermedades neurodegenerativas pueden estar acompañadas de una
lesión de los nervios raquídeos y/o una lesión de los nervios
periféricos (reivindicación 49).
Las enfermedades neuropáticas y/o las
enfermedades neurodegenerativas pueden ser, por ejemplo, anomalía
olfativa, neuropatía traumática, neuropatía de infarto cerebral,
parálisis de los nervios faciales, neuropatía diabética, glaucoma,
retinitis pigmentaria, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de
Parkinson, enfermedades neurodegenerativas, esclerosis lateral
hipoplástica muscular, enfermedad de Lou Gehrig, corea de
Huntington, infarto cerebral o enfermedades neurodegenerativas
traumáticas (reivindicación 50).
En otro aspecto, la invención se refiere a un
procedimiento para producir el compuesto de fórmula [12], [13],
[14], [15] o [16], en el que el procedimiento comprende cultivar un
hongo productor de un compuesto de fórmula [12], [13], [14], [15] o
[16] que pertenece al género Penicillium y recoger dicho
compuesto del cultivo (reivindicaciones 51 a 57).
El hongo que pertenece al género
Penicillium es preferentemente Penicillium sp.
SPF-3059 (reivindicación 58).
La Fig. 1 presenta la acción inhibidora
dependiente de la concentración de los inhibidores de semaforina de
la presente invención, SPF-3059-1,
M162 y A721, sobre la actividad de desplome del cono de crecimiento
de Sema3A.
La Fig. 2 presenta la acción inhibidora
dependiente de la concentración de los inhibidores de semaforina de
la presente invención, SPF-3059-1,
SPF-3059-2 y
SPF-3059-5, sobre la actividad de
desplome del cono de crecimiento de Sema3A.
La Fig. 3 presenta la acción inhibidora
dependiente de la concentración de los inhibidores de semaforina
SPF-3059-1 de la presente invención
sobre la actividad de desplome del cono de crecimiento de
Sema6C.
La Fig. 4 son fotografías que presentan la
acción inhibidora de los inhibidores de semaforina de la presente
invención, SPF-3059-1, M162 y A721,
sobre la actividad inhibidora de crecimiento de neuritas de Sema3A
en el procedimiento de cultivo conjunto de
colágeno-gel.
La Fig. 5 presenta la acción promotora de la
regeneración de nervios in vivo del inhibidor
SPF-3059-1 de semaforina de la
presente invención en la incisión del nervio olfativo.
La Fig. 6 presenta la acción promotora de la
regeneración de nervios in vivo de los inhibidores M162 y
A721 de semaforina de la presente invención en la incisión del
nervio olfativo.
La Fig. 7 presenta la acción promotora de la
regeneración de nervios del inhibidor
SPF-3059-1 de semaforina de la
presente invención en la herida del nervio ciático.
La Fig. 8 presenta el resultado de examinar la
influencia del inhibidor SPF-3059-1
de semaforina de la presente invención sobre la proliferación de
células COS7.
La Fig. 9 presenta el resultado de examinar la
influencia del inhibidor SPF-3059-1
de semaforina de la presente invención sobre la unión al receptor
de semaforina 3A (Neurofilina-1).
La Fig. 10 presenta el resultado de examinar que
la molécula diana del inhibidor
SPF-3059-1 de semaforina de la
presente invención es semaforina 3A.
La Fig. 11 son fotografías que presentan los
resultados de examinar la acción de activación de la regeneración
de nervios in vivo del inhibidor
SPF-3059-1 de semaforina de la
presente invención en la incisión del nervio raquídeo (trayectoria
corteza cerebral-médula espinal).
La Fig. 12 son fotografías que presentan los
resultados de examinar la acción de activación de la regeneración
de nervios in vivo de PBS como referencia en la incisión del
nervio raquídeo (trayectoria corteza cerebral-médula
espinal).
No existe ninguna limitación específica para un
promotor de regeneración de nervios de la presente invención de
manera que el promotor contenga un inhibidor para un factor
repelente del crecimiento de nervios tal como semaforina o
similares como ingrediente activo. En la presente memoria,
semaforina es una denominación genérica para las proteínas que
tienen dominios de semaforina con estructuras similares constituidas
por aproximadamente 500 restos de aminoácido (Neuron 14,
941-948, 1995), y hasta la fecha se han descrito
aproximadamente 20 variantes o más. En la presente invención, sin
embargo, las semaforinas no se limitarán a las conocidas
públicamente. Pueden ejemplificarse como tales semaforinas las
siguientes: semaforinas de mamíferos tales de la especie humana,
etc.; preferentemente semaforinas de la clase 3, 4, 5 ó 6 definidas
en la bibliografía (Cell 97, 551, 1999); más preferentemente
las semaforinas de la clase 3 ó 6; y todavía más preferentemente la
semaforina 3A (Cell 75, 217, 1993, Cell 75, 1389,
1993) en las semaforinas de clase 3 y la semaforina 6C (documento
WO 98/11216, Moll. Cell. Neurosci. 13, 9-23
(1999)) en las semaforinas de clase 6. En cuanto a la información
de la secuencia con respecto a los genes que codifican estas
semaforinas está descrita en la base de datos del GenBank, en las
bibliografías mencionadas anteriormente o similares, el ADNc que
codifica la semaforina puede clonarse según dicha información de la
secuencia y utilizando, por ejemplo, un banco de ADNc procedente
del cerebro o similar con una parte apropiada de ADN como sonda para
la hibridación o como cebador para PCR. Los expertos en la materia
pueden realizar fácilmente esta clonación según los protocolos
básicos tales como Molecular Cloning 2ª ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989), etc. Además, las proteínas pueden
producirse según varios libros de texto y bibliografías tales como
la Molecular Cloning mencionada anteriormente o similares
expresando un gen que codifica la semaforina así obtenida. Además,
la semaforina de la presente invención no estará limitada solamente
a una proteína natural o recombinante sino que también incluye: una
proteína en la que se expresa el dominio extracelular de una
semaforina unida a la membrana y se disuelve; una proteína de
fusión con otra proteína tal como un anticuerpo, fosfatasa alcalina
o similar; una proteína a la que se añade una etiqueta tal como la
etiqueta His, Flag o similar; o un mutante en el que se eliminan,
sustituyen o añaden parte de los aminoácidos.
Por ejemplo, la semaforina 6C (Sema6C) es una
proteína unida a la membrana y el dominio extracelular de Sema6C se
utiliza normalmente tal como para medir la actividad de una
sustancia del asunto utilizando acciones de activación o supresión
de actividades de Sema6C. Se conocen dos isoformas en el dominio
extracelular de Sema6C (documento WO 98/11216 y Moll. Cell.
Neurosci. 13, 9-23 (1999)), cada una de las
cuales presenta la actividad de desplome del cono de crecimiento.
Una proteína de fusión en la que el dominio extracelular de dicho
Sema6C y una proteína marcadora y/o una etiqueta peptídica se unen
puede utilizarse con ventaja para dichos casos de medición de la
actividad de una sustancia en cuestión con tal que la actividad de
Sema6C no se deteriore. Ejemplos de proteínas marcadoras son las
proteínas marcadoras convencionalmente bien conocidas tales como la
fosfatasa alcalina (Cell 63, 185-194 (1990)),
la zona Fc de un anticuerpo (número de registro M87789 de Genbank),
HRP y similares, y las etiquetas peptídicas están ejemplificadas por
la etiqueta Mic, la etiqueta His, la etiqueta Flag
convencionalmente bien conocidas y similares.
En la presente invención, un inhibidor de
semaforina significa una sustancia que inhibe una actividad de
cualquiera de las semaforinas mencionadas anteriormente tales como,
por ejemplo, la actividad de migración de una célula, la actividad
de provocación de la muerte celular, cambios morfológicos de una
célula tal como el redondeo de la célula o el desplome del cono de
crecimiento, la actividad de supresión o activación del crecimiento
de neuritas, la actividad de supresión o activación del crecimiento
de dendritas de las células nerviosas, la actividad de dirección
del axón del nervio o similares. Cualquier sustancia que inhiba las
siguientes actividades de semaforina pueden adoptarse como dicho
inhibidor de semaforina sin limitación específica. Preferentemente,
se ejemplifica un compuesto que presenta acción promotora sobre la
regeneración de los nervios centrales y/o periféricos, más
preferentemente un compuesto que presenta acción supresora sobre la
actividad de desplome del cono de crecimiento y/o la actividad
inhibidora del crecimiento de nervios en un gel de colágeno, y
todavía más preferentemente un compuesto que presenta actividad
supresora tanto en la actividad de desplome del cono de crecimiento
de semaforina como en la actividad inhibidora del crecimiento de
nervios en un gel de colágeno.
La acción promotora descrita anteriormente sobre
la regeneración de nervios centrales y/o periféricos se refiere a
una acción que favorece la regeneración de nervios en el sistema
(tejido) nervioso central que comprende tejidos tales como el del
cerebro, médula espinal y similar, y/o en el sistema (tejido)
nervioso periférico que están en los órganos o en la superficie del
cuerpo o en el cuerpo que consisten en partes marginales y/o
periféricas y no dicho sistema (tejido) nervioso central. En la
presente memoria, la acción promotora de la regeneración de los
nervios centrales incluye la acción promotora no solamente de la
regeneración de nervios en las que un axón surge de un cuerpo de
célula nerviosa en la zona central, tal como un nervio de la retina
o un nervio de la corteza cerebral, y se proyecta sobre otra célula
nerviosa que está también en el central, sino también sobre la
regeneración de nervios en la que un axón de nervio se regenera en
el sistema (tejido) nervioso central, circunstancia aun cuando un
nervio, tal como una fibra aferente del nervio olfativo o un nervio
sensitivo del ganglio del pedículo dorsal, surge de un cuerpo de
célula nerviosa en el sistema periférico. Además, la acción
promotora de la regeneración de nervios periféricos incluye la
acción promotora no solamente de la regeneración de nervios de un
nervio que surge de un cuerpo de célula nerviosa periférica y se
prolonga en un tejido periférico, sino también en la regeneración
de nervios en la que la circunstancia para la regeneración es el
sistema (tejido) nervioso periférico, aun cuando un nervio emerja de
un cuerpo de célula nerviosa central (cerebro, médula espinal o
similares). Éste último puede estar ejemplificado por la acción
promotora de la regeneración de nervios para dicho nervio motriz de
la médula espinal, un nervio preganglionar en el sistema nervioso
autonómico como los nervios simpático y parasimpático, y similares.
La acción promotora en la regeneración de un nervio tal como un
nervio ciático, que tiene ambos nervios mencionados anteriormente,
se incluye también en la ejemplificación. Un compuesto con acción
promotora sobre la regeneración de nervios centrales y periféricos
se prefiere particularmente para un inhibidor de semaforina de la
presente invención. El sistema (tejido) nervioso central descrito
anteriormente se refiere a un tejido que comprende el cerebro, bulbo
raquídeo, médula espinal, ojos y similares, y más particularmente
se refiere a una zona en la que el transporte de las sustancias
poliméricas está restringido por estructuras tales como la barrera
sangre-cerebro y la barrera
sangre-retina. El sistema (tejido) nervioso
periférico se refiere a la zona de las demás partes del cuerpo. Las
fibras nerviosas son en general capaces de regenerarse en los
tejidos nerviosos periféricos, pero son incapaces de regenerarse en
los tejidos nerviosos centrales.
La actividad del desplome del cono de
crecimiento de la semaforina descrita anteriormente significa una
actividad para hacer desaparecer los conos de crecimiento. Esta
actividad se observa después de realizar las etapas siguientes:
cultivo de células nerviosas (generalmente explantes tisulares de
ganglios) durante un periodo de tiempo dado in vitro hasta
que pueden observarse las neuritas extendidas así como los conos de
crecimiento al borde de dichas neuritas; y a continuación añadir a
éstas una concentración dada (p. ej. aproximadamente 3 unidades/ml;
1 unidad/ml se define como una concentración de semaforina en la que
el 50% de los conos de crecimiento están colapsados) de semaforina
y cultivar durante otro periodo de tiempo dado (p. ej. una hora).
Con el fin de obtener las neuritas extendidas y los conos de
crecimiento al borde de dichas neuritas listas para la observación,
las células nerviosas se cultivan generalmente durante 10 a 20 horas
in vitro, cuya duración puede alterarse según una variante
de nervios y las condiciones de cultivo. Cuando el desplome del
cono de crecimiento producido por la semaforina es suprimido, por
ejemplo, mediante la adición de un compuesto a este sistema
experimental a una concentración apropiada aproximadamente una hora
antes de la adición de semaforina, entonces dicho compuesto se
considera como inhibidor de semaforina especialmente como un
compuesto con una acción supresora sobre la actividad de desplome
del cono de crecimiento de la semaforina. Aunque no existe ninguna
limitación específica para un compuesto con dicha acción supresora
sobre la actividad de desplome del cono de crecimiento, pueden
ejemplificarse compuestos que presentan dicha acción supresora a una
concentración de 100 \mug/ml o inferior, preferentemente 30
\mug/ml o inferior, más preferentemente 10 \mug/ml o inferior y
todavía más preferentemente 3 \mug/ml o inferior. Además, un
compuesto que no afecta sustancialmente a la proliferación de las
células tales como las células nerviosas, las células que expresan a
semaforina o similares se prefiere como inhibidor de semaforina
para confirmar el efecto de los inhibidores de semaforina de la
presente invención y en vista de la seguridad cuando se utiliza como
producto farmacéutico.
La actividad inhibidora del crecimiento de
nervios de la semaforina en un gel de colágeno como se describió
anteriormente significa, por ejemplo, la actividad inhibidora del
crecimiento de neuritas observada en un gel de colágeno que
contiene, por ejemplo, tanto las células productoras de semaforina
como las células nerviosas (normalmente ganglios). Y la acción
supresora de dicha actividad inhibidora del crecimiento de neuritas
es una actividad para inhibir de manera persistente la actividad de
semaforina en un gel de colágeno y, por ejemplo, es una actividad
mediante la cual las neuritas pueden crecer del lado de las células
que producen semaforina tanto como 1/2 o más del crecimiento
observado en el lado opuesto en presencia de la sustancia en
cuestión bajo la condición experimental en la que las neuritas
pueden solamente crecer hasta 1/3 o menos para las células
productoras de semaforina en comparación con el crecimiento
observado en el lado opuesto de las células que producen semaforina
cuando se observa después de cultivar células que producen
semaforina y células nerviosas adyacentes en un gel de colágeno,
normalmente durante la noche o incluso más tiempo. Además, no existe
limitación específica para un compuesto con acción supresora sobre
la actividad inhibidora de crecimiento de neuritas de semaforina en
dicho gel de colágeno. Sin embargo, se ejemplifican las que
presentan la siguiente acción supresora a una concentración de 100
\mug/ml o inferior, preferentemente 30 \mug/ml o inferior, más
preferentemente 10 \mug/ml o inferior y todavía más
preferentemente 3 \mug/ml o inferior.
La semaforina utilizada para medir los dos tipos
de actividades de semaforina mencionadas anteriormente no está
limitada a una semaforina natural y pueden utilizarse también las
semaforinas siguientes descritas anteriormente: semaforina en la
que solamente se expresa y se disuelve el dominio extracelular de
una semaforina de unión a la membrana; una proteína de fusión con
otra proteína tal como un anticuerpo, fosfatasa alcalina o similar;
semaforina a la que se añade una etiqueta tal como la etiqueta His o
una Flag; o semaforina en la que están alterados algunos
aminoácidos. Además, los ganglios del pedículo dorsal procedentes de
embriones de pollitos de 7 a 8 días se utilizan convenientemente
como células nerviosas para el cultivo. Sin embargo, los ganglios
del pedículo dorsal de otros animales aparte de pollitos, o
cualquier otra célula nerviosa tal como los ganglios del simpático,
los ganglios de la retina, los ganglios cervicales superiores o
similares aparte de los ganglios del pedículo dorsal pueden
utilizarse también de manera que las células nerviosas sean capaces
de extender sus neuritas en el cultivo in vitro. No existe
ninguna limitación específica a la condición del cultivo con tal
que pueda observarse crecimiento de neuritas y puedan medirse las
actividades de la semaforina.
El mecanismo de acción de los inhibidores de
semaforina de la presente invención puede considerarse de la manera
siguiente. La inhibición del crecimiento de neuritas o del desplome
del cono de crecimiento causado por la semaforina es desencadenada
por la unión de la semaforina a su receptor en la superficie de la
célula nerviosa (cono de crecimiento). La señal se transmite del
receptor al que se une la semaforina hasta la serie de
realizaciones de señalización intracelular y la despolimerización de
las fibras de actina se consigue finalmente, lo que da lugar a la
supresión del crecimiento de neuritas y al desplome del cono de
crecimiento. La inhibición de la actividad de semaforina se
consigue inhibiendo o bloqueando cualquiera de las etapas en el
transcurso de estas reacciones. Como receptor mencionado
anteriormente para la semaforina, puede adoptarse un receptor para
cualquiera de las semaforinas siguientes, y puede también adoptarse
un mutante o un componente de una parte de dicho receptor con la
condición de que la semaforina pueda unirse a éste. Son ejemplos la
Neuropilina-1, la plexina y similares. Los
inhibidores de semaforina de la presente invención no estarán
limitados por sus mecanismos de actuación y un inhibidor que inhibe
cualquiera de las etapas en el mecanismo de actuación descrito
anteriormente se incluye en la categoría de la presente invención.
Es decir, se incluye un compuesto también en la categoría de la
presente invención, cuando el compuesto inhibe la actividad de
semaforina inhibiendo las reacciones que conciernen a la serie de
reacciones de señalización intracelular que tienen lugar desde la
fijación del receptor de semaforina mencionado anteriormente hasta
la despolimerización de las fibras de actina. Además, un
procedimiento de medición de la actividad inhibidora de la fijación
al receptor de semaforina puede ser cualquier procedimiento si es
seleccionado de manera apropiada por los expertos en la materia, que
está ejemplificado por un procedimiento de medición de la actividad
inhibidora de fijación al receptor de la semaforina, en la que la
semaforina fusionada con otra proteína tal como un anticuerpo,
fosfatasa alcalina o similar o la semaforina a la que se añade
etiqueta His, Flag o similares, tal como se describió anteriormente,
se une a un receptor de dicha semaforina o a una célula que expresa
un componente del receptor en presencia de una sustancia en
cuestión.
Por ejemplo, la actividad inhibidora de
SPF-3059-1 para la unión de Sema3A a
la Neuropilina-1 se examinó realmente utilizando la
Sema3A fusionada a fosfatasa alcalina (= Sema3A-AP)
y las células COS7 que expresan a Neuropilina-1.
SPF-3059-1 es un compuesto
descubierto por los presentes inventores, que inhibe tanto el
desplome como la inhibición del crecimiento de neuritas provocado
por la semaforina 3A (Sema3A). El presente estudio puso de
manifiesto que SPF-3059-1 inhibe la
unión de Sema3A-AP a Neuropilina-1
en función de la concentración. Además, con el fin de aclarar el
mecanismo de dicha inhibición, es decir, para aclarar si
SPF-3059-1 interactúa con Sema3A o
con su receptor, se realizó la comparación midiendo la actividad de
desplome entre (1) la actividad de desplome que se observó cuando
una muestra, a la que se mezclaron
SPF-3059-1 y Sema3A con antelación a
la concentración que alcanza suficiente actividad inhibidora (0,25
\mug/ml de SPF-3059-1) se añadió a
la solución de cultivo de los ganglios del pedículo dorsal y (2) la
actividad de desplome que se observó al añadir Sema3A a la solución
de cultivo mencionada anteriormente tras la adición de
SPF-3059-1. La concentración final
de SPF-3059-1 (0,05 \mug/ml) en la
solución de cultivo fue la misma para (1) y (2). La inhibición de la
actividad de desplome no se observó en (2) a esta concentración de
SPF-3059-1. Sin embargo en (1), se
observó inhibición de la actividad de desplome. Este resultado
indica que Sema3A ha perdido su actividad de desplome porque
SPF-3059-1 interactuó con ella. A
partir de las consideraciones anteriores, se cree que
SPF-3059-1 actúa mediante un
mecanismo en el que la unión de Sema3A al receptor está inhibida por
la acción directa de SPF-3059-1
sobre Sema3A. Cuando se considera este descubrimiento, se prefiere
un compuesto que inhibe la unión de semaforina a su receptor
interactuando directamente con la semaforina y que inhibe la función
y la actividad de la semaforina para un inhibidor de semaforina de
la presente invención. Un inhibidor de semaforina, particularmente
un compuesto que inhibe la función de semaforina interactuando con
éste, puede ser identificado por los procedimientos de medición
mencionados anteriormente de la actividad de desplome o la actividad
inhibidora de unión al receptor o similares.
Un compuesto preferido para el inhibidor de
semaforina de la presente invención es un compuesto en el que el
inhibidor de semaforina no afectará de manera sustancial la
proliferación celular, es decir, un compuesto que no presenta la
acción supresora sobre la proliferación celular a una concentración
que está comprendida entre 50 y 3.000 veces o superior a la
concentración a la que puede observarse actividad inhibidora de
semaforina. Además, aunque no existe ninguna limitación específica
del peso molecular de los inhibidores de semaforina de la presente
invención, es deseable un compuesto con un bajo peso molecular a la
vista de la capacidad de difusión, permeabilidad de la membrana,
distribución del tejido, permeabilidad de la barrera
sangre-cerebro específicamente o similares, y los
ejemplos adecuados incluyen un compuesto de bajo peso molecular con
un peso molecular de 10.000 o inferior, preferentemente un peso
molecular de 5.000 o inferior, más preferentemente un peso
molecular de 1.000 o inferior y particularmente un compuesto con un
peso molecular de 600 o inferior. Todavía además, como inhibidores
de semaforina de la presente invención, pueden proporcionarse a
título de ejemplo dichos compuestos no peptídicos y no
nucleotídicos. Dichos compuestos no peptídicos y no nucleotídicos
están ejemplificados por un compuesto M162 sintetizado alifático, un
compuesto A721 derivado de actinomicetos, y todavía más
preferentemente, los compuestos obtenidos a partir del cultivo de
Penicillium sp. SPF-3059 que se describe más
adelante.
Un ejemplo de los compuestos mencionados
anteriormente obtenidos a partir del cultivo de Penicillium
sp. SPF-3059 es un compuesto con actividad
inhibidora de semaforina representado por la fórmula general [8]
mencionada anteriormente y más preferentemente un compuesto
representado por una de las fórmulas generales [12] a [16]
mencionadas anteriormente. En las fórmulas generales [2], [9], [10],
[11], [12], [13], [14] y [16] en estos compuestos, R^{1}
representa un átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo o un grupo
alcoxicarbonilo, preferentemente un átomo de hidrógeno o un grupo
carboxilo, y un grupo metoxicarbonilo, un grupo etoxicarbonilo, un
grupo propoxicarbonilo y similares están ejemplificados como el
grupo alcoxicarbonilo mencionado anteriormente, entre los que
resulta preferido un metoxicarbonilo. Específicamente, R^{1} en
las fórmulas generales [9], [10], [11], [12], [13] y [16]
representan preferentemente un átomo de hidrógeno o un grupo
carboxilo y R^{1} en las fórmulas generales [2] y [14]
representan preferentemente un átomo de hidrógeno, un grupo
carboxilo o un grupo metoxicarbonilo en el que resulta más
preferido un átomo de hidrógeno o un grupo carboxilo. Asimismo,
R^{2} en las fórmulas generales [2], [9], [10], [11], [12], [13],
[14] y [16] representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o
un grupo aciloxi, preferentemente un átomo de hidrógeno o un grupo
hidroxilo. Como grupo aciloxi mencionado anteriormente, un grupo
acetoxi, un grupo propioniloxi, un grupo pivaloiloxi y similares
está ejemplificado como grupo aciloxi mencionado anteriormente.
R^{3} en las fórmulas generales [2] y [14] representa un átomo de
hidrógeno, un grupo metoximetilo o un grupo mostrado por la fórmula
[3]. R^{4} en las fórmulas generales [8], [12], [13], [14], [15]
y [16] representa un átomo de hidrógeno, un grupo carbonilo o un
grupo alcoxicarbonilo, preferentemente un átomo de hidrógeno o un
grupo carboxilo. Los ejemplos del grupo alcoxicarbonilo mencionados
anteriormente son un grupo metoxicarbonilo, un grupo etoxicarbonilo,
un grupo propoxicarbonilo y similares, entre los que se prefiere un
grupo metoxicarbonilo. Asimismo, R^{5} en las fórmulas generales
[8], [12], [13], [14], [15] y [16] representa un átomo de hidrógeno,
un grupo hidroxilo o un grupo aciloxi, preferentemente un átomo de
hidrógeno o un grupo hidroxilo. Y un grupo acetoxi, un grupo
propioniloxi, un grupo pivaloiloxi y similares están ejemplificados
como grupo aciloxi mencionado anteriormente. Como R^{6} y R^{7}
en la fórmula general [8], (1) cuando R^{6} representa un grupo
metilo, R^{7} representa un grupo mostrado por las fórmulas [2],
[9] o [10] y (2) cuando R^{6} representa un grupo mostrado por la
fórmula [5] o [11], R^{7} representa un grupo acetilo.
Un compuesto que presenta un grupo representado
por la fórmula general [8] mencionada anteriormente y
particularmente un compuesto representado por las fórmulas
generales [12] a [16] mencionadas anteriormente puede obtenerse a
partir del cultivo de Penicillium sp.
SPF-3059 con la actividad inhibidora de semaforina
como índice. Además, dicho compuesto puede obtenerse también a
partir del compuesto con actividad inhibidora de semaforina
obtenido de este modo o similar por procedimientos de conversión y
síntesis con actividad inhibidora de semaforina como índice. Los
compuestos que constituyen inhibidores de semaforina de la presente
invención están ejemplificados por los mostrados por las fórmulas
[17] a [37] que se describen a continuación en los ejemplos en la
presente descripción, y están ejemplificados más específicamente
por: los compuestos representados por la fórmula general [12] que
está presentada por las fórmulas [17], [20], [23], [24] y [32]; los
compuestos representados por la fórmula general [13] presentados
por las fórmulas [18], [19], [21], [25], [26], [27] y [28]; los
compuestos representados por la fórmula general [14] mostrados por
las fórmulas [22], [30], [31], [34], [36] y [37]; los compuestos
representados por la fórmula general [15] mostrados por las fórmulas
[29] y [35]; y los compuestos representados por la fórmula general
[16] mostrados por la fórmula [33]. Estos compuestos ejemplificados
específicamente anteriormente son nuevos compuestos excepto los
siguientes: el compuesto SPF-3059-1
mostrado por la fórmula [17] (solicitud de patente japonesa abierta
al público nº 1993-239050); el compuesto
SPF-3059-2 presentado por la
fórmula [18] (Pure & Appl. Chem. 66,
2383-2386, 1994); y el compuesto
SPF-3059-5 mostrado por la fórmula
[19] (Pure & Appl. Chem. 66, 2383-2386,
1994, y la traducción japonesa publicada de la publicación
internacional PCT nº 1994-506202).
Además, en los compuestos que constituyen los
inhibidores de semaforina de la presente invención, las sales o
derivados de los compuestos, preferentemente las sales
farmacéuticamente aceptables desde un punto de vista farmacéutico o
veterinario o los derivados que también están incluidos en la
categoría de la presente invención. Ejemplos de sales son: las
sales inorgánicas básicas tales como la sal de sodio, la sal de
potasio, la sal de calcio, la sal de magnesio, la sal de aluminio,
la sal de amonio o similares; sales orgánicas básicas tales como la
sal de trietilamonio, sal de trietanolamonio, sal de piridinio, sal
de diisopropilamonio o similares; las sales de aminoácidos básicos
tales como la sal de arginina, la sal de lisina o similares. Están
ejemplificados los derivados en los que el grupo carboxilo o el
grupo hidroxilo de un compuesto se convierte en un grupo éster en
los que los ejemplos incluyen un derivado en el que el grupo
hidroxilo está acilado por un grupo acilo con 2 a 5 carbonos tal
como un grupo acetilo, un grupo propionilo o similares, y un
derivado en el que el grupo carboxilo se convierte en ésteres con 2
a 5 carbonos tal como éster metílico, éster etílico o similares.
Ejemplos de un compuesto de la presente
invención, preferentemente un compuesto que presenta actividad
inhibidora de semaforina y particularmente un compuesto obtenido a
partir del cultivo de Penicillium sp.
SPF-3059 y que presenta actividad inhibidora de
semaforina incluyen un compuesto en el que por lo menos uno de entre
R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} en la fórmula general [12]
mencionada anteriormente (en la que R^{1}, R^{2}, R^{4} y
R^{5} son como se describió anteriormente) está representado por
un átomo de hidrógeno, preferentemente un compuesto en el que por
lo menos uno de R^{2} y R^{5} representa un grupo hidroxilo,
por ejemplo, un compuesto en el que R^{2} representa un grupo
hidroxilo, por ejemplo, un compuesto en el que R^{2} y R^{5}
representan un grupo hidroxilo y un átomo de hidrógeno,
respectivamente, etc.), un compuesto en el que R^{2} y R^{5}
representan un grupo hidroxilo, el compuesto mencionado
anteriormente en el que R^{4} representa un grupo carboxilo y el
compuesto mencionado anteriormente en el que R^{1} y R^{4}
representan un grupo carboxilo y R^{2} representa un grupo
hidroxilo y similares. Está ejemplificado específicamente por el
compuesto SPF-3059-3 presentado por
la fórmula [20], el compuesto
SPF-3059-7 presentado por [23], el
compuesto SPF-3059-9 presentado por
[24] y el compuesto SPF-3059-30
presentado por [32]. Los compuestos de la presente invención
incluyen también sales o derivados farmacéuticamente aceptables del
compuesto representado por la fórmula general [12] mencionada
anteriormente.
Ejemplos de un compuesto de la presente
invención, preferentemente un compuesto que presenta actividad
inhibidora de semaforina y particularmente un compuesto obtenido a
partir del cultivo de Penicillium sp.
SPF-3059 y que presenta actividad inhibidora de
semaforina incluyen un compuesto en el que por lo menos uno de entre
R^{1}, R^{2} y R^{5} en la fórmula general [13] mencionada
anteriormente (en la que R^{1}, R^{2}, R^{4} y R^{5} son
como se describió anteriormente) está representado por un átomo de
hidrógeno, preferentemente un compuesto en el que por lo menos uno
de R^{2} y R^{5} representa un grupo hidroxilo, por ejemplo, un
compuesto en el que R^{2} representa un grupo hidroxilo (un
compuesto en el que R^{2} y R^{5} representan un grupo
hidroxilo y un átomo de hidrógeno, respectivamente, etc.), un
compuesto en el que R^{2} y R^{5} representan un grupo
hidroxilo, el compuesto mencionado anteriormente en el que R^{4}
representa un grupo carboxilo y el compuesto mencionado
anteriormente en el que R^{1} y R^{4} representan un grupo
carboxilo y R^{5} representa un grupo hidroxilo y similares. Está
ejemplificado más específicamente por el compuesto
SPF-3059-4 presentado por la fórmula
[21], el compuesto SPF-3059-12
presentado por la fórmula [25], el compuesto
SPF-3059-24 presentado por [26], el
compuesto SPF-3059-25 presentado por
[27] y el compuesto SPF-3059-26
presentado por [28]. Los compuestos de la presente invención
incluyen también sales o derivados farmacéuticamente aceptables del
compuesto representado por la fórmula general [13] mencionada
anteriormente.
Ejemplos de un compuesto de la presente
invención, preferentemente un compuesto que presenta actividad
inhibidora de semaforina y particularmente un compuesto obtenido a
partir del cultivo de Penicillium sp.
SPF-3059 y que presenta actividad inhibidora de
semaforina incluyen un compuesto representado por la fórmula general
[14] (en la que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} son
como se describieron inicialmente), preferentemente un compuesto en
el que por lo menos uno de R^{2} y R^{5} está representado por
un grupo hidroxilo, por ejemplo, un compuesto en el que R^{2}
representa un grupo hidroxilo (un compuesto en el que R^{2} y
R^{5} representan un grupo hidroxilo y un átomo de hidrógeno,
respectivamente, etc.), un compuesto en el que R^{2} y R^{5}
representan un grupo hidroxilo, el compuesto mencionado
anteriormente en el que R^{4} representa un grupo carboxilo, un
compuesto en el que R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo
y R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo, un compuesto en
el que R1 representa un grupo carboxilo, R^{2} y R^{5}
representan un grupo hidroxilo y R^{3} representa el grupo
metoximetilo, un compuesto en el que R^{1} representa ya sea un
grupo carboxilo o un grupo metoxicarbonilo, R^{4} representa un
grupo carboxilo, R^{3} representa un átomo de hidrógeno y R^{5}
representa un grupo hidroxilo, especialmente un compuesto en el que
R^{1} representa ya sea un grupo carboxilo o un grupo
metoxicarbonilo, R^{4} representa un grupo carboxilo, y R^{2} y
R^{3} representan un átomo de hidrógeno y R^{5} representa un
grupo hidroxilo, un compuesto en el que R^{3} representa un grupo
mostrado por la fórmula [3] mencionada anteriormente y así
sucesivamente. Está ejemplificado más específicamente por el
compuesto SPF-3059-6 presentado por
la fórmula [22], el compuesto
SPF-3059-28 presentado por [30], el
compuesto SPF-3059-29 presentado por
[31], el compuesto SPF-3059-35
presentado por [34], el compuesto
SPF-3059-37 presentado por [36] y el
compuesto SPF-3059-39 presentado por
[37]. Los compuestos de la presente invención incluyen también
sales o derivados farmacéuticamente aceptables del compuesto
representado por la fórmula general [14] mencionada
anteriormente.
Los ejemplos de un compuesto de la presente
invención, preferentemente un compuesto que presenta actividad
inhibidora de semaforina y particularmente un compuesto obtenido a
partir del cultivo de Penicillium sp.
SPF-3059 y que presenta actividad inhibidora de
semaforina comprenden un compuesto representado por la fórmula
general [15] mencionada anteriormente (en la que R^{4} y R^{5}
son como se describió anteriormente) preferentemente un compuesto
en el que R^{5} representa un grupo hidroxilo, el compuesto
mencionado anteriormente en el que R^{4} representa un grupo
carboxilo y similares. Está ejemplificado más específicamente por el
compuesto SPF-3059-27 presentado
por la fórmula [29] y el compuesto
SPF-3059-36 presentado por [35]. Los
compuestos de la presente invención comprenden asimismo sales o
derivados del compuesto representado por la fórmula general [15]
mencionada
anteriormente.
anteriormente.
Ejemplos de un compuesto de la presente
invención, preferentemente un compuesto que presenta actividad
inhibidora de semaforina y particularmente un compuesto obtenido a
partir del cultivo de Penicillium sp.
SPF-3059 y que presenta actividad inhibidora de
semaforina incluyen un compuesto representado por la fórmula general
[16] mencionada anteriormente (en la que R^{1}, R^{2}, R^{4}
y R^{5} son como se describió anteriormente), preferentemente un
compuesto en el que por lo menos uno de R^{2} y R^{5} representa
un grupo hidroxilo, especialmente un compuesto en el que R^{2} y
R^{5} representan un grupo hidroxilo, el compuesto mencionado
anteriormente en el que R^{4} representa un grupo carboxilo y
similares. Está ejemplificado más específicamente por el compuesto
SPF-3059-34 presentado por la
fórmula [33]. Los compuestos de la presente invención incluyen
también sales o derivados del compuesto representado por la fórmula
general [16] mencionada anteriormente.
Un compuesto que presenta un grupo representado
por las fórmulas generales [2] o [5] mencionadas en la molécula y
que presenta actividad inhibidora de semaforina, preferentemente un
compuesto representado por la fórmula general [8] mencionada
anteriormente, más preferentemente un compuesto representado por las
fórmulas generales [12] a [16] mencionadas anteriormente, más
específicamente los compuestos que constituyen los inhibidores de
semaforina de la presente invención mostrados por las fórmulas [17]
a [37] mencionadas anteriormente, etc., todos estos compuestos
pueden obtenerse eficazmente cultivando la cepa micótica
SPF-3059 que pertenece al género
Penicillium.La cepa fue aislada por los presentes inventores
de una muestra de suelo recogida en la prefectura de Osaka, Japón.
La cepa SPF-3059 posee las siguientes
características taxonómicas.
En agar-agar con extracto de
malta, crecieron lentamente colonias que alcanzan un diámetro de 2,8
a 2,9 cm en 21 días a 25 grados C. Las colonias eran de color
blanco amarillo y de aspecto floculento. El color del lado opuesto
era amarillo oscuro. No se observó ni producción de pigmento soluble
ni formación de esporas. En agar Czapek, las colonias crecieron
lentamente alcanzando un diámetro de 3,1 a 3,2 cementación en 21
días a 25ºC. Las colonias eran blancas a grises y de aspecto
floculento. El color del lado opuesto era amarillo crema. No se
observó ni producción de pigmento soluble ni formación de esporas.
En agar-agar con dextrosa de patata, crecieron
lentamente colonias que alcanzaron un diámetro de 3,2 a 3,3 cm en 21
días a 25 grados C. Las colonias eran de color amarillo crema y de
aspecto floculento. El color del lado opuesto era amarillo oscuro a
marrón. No se observó ni producción de pigmento soluble ni formación
de esporas. En agar-agar de Czapec, crecieron
lentamente colonias que alcanzan un diámetro de 3,1 a 3,2 cm en 21
días a 25ºC. Las colonias eran blancas a grises y de aspecto
floculento. El color del lado opuesto era amarillo crema. No se
observó ni producción de pigmento soluble ni formación de esporas.
En agar-agar con harina de avena (medio Actino nº 3
"DAIGO", Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), crecieron lentamente
colonias que alcanzan un diámetro de 2,0 a 2,1 cm en 21 días a 25
grados C. Las colonias eran blancas a amarillas o verde grisáceas y
de aspecto floculento. El color del lado opuesto era amarillo a
gris. No se produjo pigmento soluble pero se observó la formación
de esporas. Los conidióforos eran de pared lisa con una longitud
entre 5 y 20 \mum, y generaron 3 a 6 proyecciones en forma de
frasco en un solo verticilo al final de los tallos. En la parte
superior de las proyecciones en forma de frasco, que tenían una
longitud de 3 a 4 \mum, se formaron conidios en forma de cadena,
con 2 a 10 conidios por cadena. Los conidios son esféricos con un
diámetro entre 2,2 y 2,4 \mum con la superficie estriada (en
general, 10 líneas longitudinales en la superficie). No se observó
teleomorfo.
Se examinó el crecimiento en cultivo en
agitación utilizando caldo de cultivo Sabouraud. La observación se
realizó después del cultivo durante 3 días a 27 grados C. El
resultado fue el siguiente:
| pH | Crecimiento |
| 3,1 | - |
| 4,5 | + |
| 5,5 | ++ |
| 7,1 | +++ |
| 8,0 | ++ |
| 9,0 | \pm |
| 10,0 | - |
Se examinó el crecimiento utilizando
agar-agar con harina de avena. La observación se
realizó después de la incubación durante 5 días a 38 grados C. El
resultado fue que la cepa creció con la temperatura.
Basándose en las características taxonómicas
anteriores, se identificó la cepa como una cepa del género
Penicillium y se utilizó Penicillium sp.
SPF-3059. Dicha cepa se depositó el 13 de julio de
2001 en el organismo depositario de patentes internacionales, el
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,
Japón (1-1 Higashi 1-chome,
Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japón) con el número de
registro FERM BP-7663 como número de depósito
internacional bajo el Tratado de Budapest bajo el reconocimiento
internacional del depósito de microorganismos para el objeto del
procedimiento de la patente.
Según la presente invención, el cultivo para la
producción de dichos inhibidores de semaforina por la cepa
SPF-3059 puede realizarse en un medio nutritivo. El
medio nutritivo puede ser líquido o sólido. Se prefiere el cultivo
en agitación o el cultivo sumergido con aireación. La composición
del medio puede estar comprendida en un amplio intervalo. Ninguna
limitación específica se asigna a la composición del medio para su
utilización. Esencialmente, lo que se requiere es una fuente de
carbono, y una fuente de nitrógeno. Pueden añadirse también
elementos inorgánicos en trazas. Ejemplos de fuentes de carbono
adecuadas son la glucosa, sacarosa, glicerina, almidón, dextrina,
molasas o similares. Ejemplos de fuentes de nitrógeno adecuadas son
peptona, caseína o su hidrolizado, extracto de carne, extracto de
levadura, harina de soja, harina de semilla de algodón, jarabe de
maíz a remojo, aminoácidos tales como histidina, sales amónicas,
sales de nitrato o similares. Ejemplos de fuentes de elementos
inorgánicos adecuados son las sales de fosfato tales como el fosfato
sódico y el fosfato potásico, sulfato de magnesio, cloruro sódico,
cloruro potásico, carbonato cálcico o similares. Pueden añadirse
también elementos inorgánicos al medio para ajustar la presión
osmótica, ajustar el pH, complementar los elementos en trazas o
similares. Además, pueden añadirse varios aditivos tales como
vitaminas, ácidos nucleicos o similares al medio para estimular el
crecimiento de la cepa productora. También es posible añadir un
agente antiespumante tal como aceite de silicona, derivado de
polipropilenglicol, aceite de soja o similares durante el periodo
de cultivo. Un intervalo de temperatura preferido para el cultivo
está comprendido preferentemente entre 20 y 35 grados C, más
preferentemente entre 25 y 30 grados C y el pH preferido del medio
es, por ejemplo, el que está comprendido en aproximadamente la
neutralidad y el periodo de cultivo es, por ejemplo, un periodo de
5 a 10 días.
Para la recuperación de los inhibidores de
semaforina de la presente invención, mostrados por las fórmulas
[17] a [37] mencionadas anteriormente, a partir del caldo de cultivo
de fermentación después del cultivo, pueden adoptarse cualquier
procedimiento convencional adoptado para el aislamiento y la
purificación de los metabolitos secundarios producidos por los
microorganismos. Estos procedimientos incluyen la extracción con
disolvente, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía
de adsorción, la cromatografía de reparto, la cromatografía de
filtración en gel, la cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC), la cromatografía en capa fina y similares. Estos
procedimientos de aislamiento y purificación pueden adoptarse ya sea
solos o en combinación. Para obtener los compuestos objeto del
sobrenadante del cultivo, pueden adoptarse estos procedimientos de
aislamiento y purificación. Además, cuando los compuestos objeto
están dentro del micelio del hongo cultivado, el micelio puede
recogerse mediante dicha filtración o centrifugación y puede
extraerse directamente utilizando un disolvente orgánico soluble en
agua tal como acetona, metanol o similares. A continuación puede
obtenerse un compuesto de interés a partir del extracto por
procedimientos similares descritos anteriormente. Dicho compuesto
de interés puede convertirse también en una sal añadiendo una
cantidad apropiada de base en disolventes tales como agua, metanol,
etanol, acetona, acetato de etilo, cloroformo, éter o similares.
Además, un grupo hidroxilo puede acilarse, un grupo carboxilo puede
esterificarse en dicho compuesto de interés por los procedimientos
convencionales. Por ejemplo, un grupo hidroxilo puede acilarse
mediante la adición de un agente de acilación tal como el anhídrido
acético, cloruro de acetilo o similares en un disolvente orgánico
apropiado y en presencia de bases. Alternativamente, un grupo
carboxilo puede esterificarse utilizando haluro de alquilo tal como
yoduro de metilo, bromuro de etilo o similares en un disolvente
orgánico apropiado y en presencia de bases. Para dichos disolventes
orgánicos pueden ponerse como ejemplos acetona, acetato de etilo,
cloroformo, éter, DMF, piridina o similares. Para bases pueden
ponerse como ejemplos, trietilamina, piridina, carbonato potásico o
similares.
Además, M162 o A721, que están descritos en los
Ejemplos, se proporcionan asimismo a título de ejemplo como otros
inhibidores de semaforina de la presente invención. M162 es un
compuesto alifático con una absorción ultravioleta débil, en tanto
que A721 es un producto natural aislado procedente del caldo de
cultivo cultivado de una cepa de actinomiceto que presenta un peso
molecular de 437 y un espectro de absorción \lambda max
UV-visible máximo (en metanol) a 397 nm.
Considerando éstos, M162 y A721 son compuestos de bajo peso
molecular cuyas estructuras químicas son totalmente diferentes de
las de los compuestos mostrados por las fórmulas [17] a [37]
mencionadas anteriormente y similares.
No existe ninguna limitación específica como
preventivos o remedios de la presente invención para enfermedades
neuropáticas y/o enfermedades neurodegenerativas incluyendo la
lesión de los nervios raquídeos y/o la lesión de los nervios
periféricos con tal de que contengan los promotores de regeneración
de nervios descritos anteriormente que poseen un inhibidor para un
factor repelente del crecimiento de nervios, particularmente los
inhibidores de semaforina mencionados anteriormente como
ingrediente activo. A dichos preventivos y remedios, pueden añadirse
varias composiciones para dosificación tales como portadores,
aglutinantes, estabilizantes, excipientes, diluyentes, tampones de
pH, agentes disgregadores, disolventes, coadyuvantes de disolución,
agentes isotónicos ordinarios farmacéuticamente aceptables o
similares. Además, estos preventivos y remedios pueden administrarse
ya sea por vía oral o parenteral. En otras palabras, pueden
administrarse en un medio de administración habitual, por ejemplo,
pueden administrarse por vía oral en formas de agente tales como
polvo, gránulos, cápsulas, jarabe, líquido en suspensión o
similares, o pueden administrarse por vía parenteral inyectando en
formas de agente tal como en solución, emulsión, suspensión o
similares. Alternativamente, puede administrarse por vía nasal en
forma de agentes de nebulización.
Aunque la dosis y la frecuencia o la
administración difieren dependiendo del método de administración y
de la edad, peso, condiciones médicas o similares de un paciente,
se prefiere administrar por vía local en el punto de la enfermedad.
Ya que se tarda de varios días a varios meses para regenerar los
nervios, los preventivos o los remedios se administran
preferentemente una o más de dos veces durante este periodo para
suprimir las actividades de semaforina. Cuando se administran dos
veces o más, resulta preferido administrar los preventivos o los
remedios de forma repetida durante días consecutivos o a intervalos
apropiados. La dosis puede definirse como varios centenares de
\mug a 2 g por administración en forma de inhibidor de semaforina,
preferentemente varias docenas de mg o menos. Con el fin de reducir
la frecuencia de administración, pueden utilizarse agentes de
liberación lenta, una bomba osmótica o similares. En algunos de
estos procedimientos de administración, se prefiere adoptar una vía
y procedimiento de administración en los que la concentración
alcanzaría la suficiente concentración para inhibir la actividad de
semaforina en el punto de actuación.
Las enfermedades neuropáticas y/o las
enfermedades neurodegenerativas mencionadas anteriormente incluyendo
la lesión de los nervios raquídeos y/o la lesión de los nervios
periféricos significa la lesión o enfermedades degenerativas de los
nervios periféricos o centrales enumerados por: anomalía olfativa
debida al envejecimiento o similares, lesión de los nervios
distintos de los olfativos producida por traumatismo tal como la
lesión de la médula espinal o similares; lesión de nervios debida a
infarto cerebral o similares; parálisis de los nervios faciales,
neuropatía diabética, glaucoma, retinitis pigmentaria, enfermedades
neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la
enfermedad de Parkinson y ALS; esclerosis lateral hipoplástica
muscular, enfermedad de Lou Gehrig, corea de Huntington, infarto
cerebral o enfermedades neurodegenerativas traumáticas; y demás.
Las enfermedades acompañadas de angiogénesis en las que VEGF165 está
implicada son también objetivos, ya que VEGF165 también utiliza
neuropilina como receptor suyo.
Además, la aplicación de los promotores de la
regeneración de nervios de la presente invención no se limitará a
los productos farmacéuticos tales como preventivos o remedios para
enfermedades neuropáticas y/o enfermedades neurodegenerativas, sino
que se aplican también competentemente a fármacos veterinarios, o
además a reactivos experimentales industrialmente importantes como
los inhibidores de señalización de semaforina. Debido a que
contienen inhibidores de semaforina como ingrediente activo, los
promotores de regeneración de nervios de la presente invención
estimulan la regeneración del nervio olfativo que es un nervio
periférico, y estimulan la regeneración de nervios en la zona
central, que es el bulbo olfativo, corteza cerebral, hipocampo,
cuerpo estriado, tálamo, diencéfalo, mesoencéfalo, cerebelo,
protuberancia, bulbo raquídeo, médula espinal, retina y
similares.
La presente invención se explica a continuación
con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos. El alcance
técnico de la invención, sin embargo, no se limitará a estos
ejemplos.
Ejemplo
1
Un medio de 75 ml que contiene 2% de glucosa, 5%
de sacarosa, 2% de semillas de algodón en polvo, 0,1% de nitrato
sódico, 0,1% de L-histidina, 0,05% de fosfato
dipotásico, 0,07% de cloruro potásico y 0,0014% de sulfato
magnésico heptahidratado, con su pH ajustado a 7,0, se pipeteó a un
matraz Sakaguchi de 500 ml de volumen y se esterilizó en un
autoclave. Una aguja de inoculación de Penicillium sp.
SPF-3059 (FERM BP-7663) en cultivo
inclinado se inoculó en este medio y se cultivó con agitación a 130
rpm durante 5 días a 27 grados C como precultivo. Se pipetearon 300
ml de un medio con la misma composición que el medio mencionado
anteriormente en cada uno de los 10 matraces Sakaguchi de 2 litros
de volumen y se esterilizó en un autoclave. Posteriormente, la
solución de precultivo mencionada anteriormente se añadió a estos
matraces en 6 ml a cada uno, que se cultivaron a continuación en
agitación a 110 rpm durante 7 días a 27 grados C.
Tras el cultivo, el caldo de fermentación se
centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4 grados C para
separar el sobrenadante y el micelio. Las fracciones de sobrenadante
se extrajeron con 3 litros de acetato de etilo-ácido fórmico
(99:1). La fracción del micelio se extrajo con 3 litros de acetona,
se filtró a continuación y se concentró. Una vez concentrada en
solución acuosa, se extrajo con 1 litro de acetato de etilo-ácido
fórmico (99:1). Ambos extractos se mezclaron a continuación y se
concentraron a presión reducida para obtener 10,4 g de extracto en
bruto. Este extracto se disolvió a continuación en 100 ml de metanol
y se aplicó a una cromatografía en columna con Sephadex (marca
registrada) LH-20 (Amersham Biosciences K.K.) y se
eluyó con metanol. Se recogieron las fracciones activas y se
evaporó el disolvente a presión reducida para obtener 2,6 g del
material en bruto. Este material en bruto se disolvió a
continuación en 100 ml de metanol para una cromatografía en columna
utilizando TSKgel TOYOPEARL HW-40F (Tosoh
Corporation) y se eluyó con metanol. Se recogieron las fracciones
activas y se evaporó el disolvente a presión reducida para obtener
1,6 g de sustancia en bruto. Esta sustancia en bruto se disolvió a
continuación en alícuotas de 50 mg en 1 ml de sulfóxido de dimetilo
(DMSO) para una HPLC en fase inversa. Las condiciones de la HPLC en
fase inversa fueron, columna: Wakopak®
Wakosil-II5C18RS (conexión 20\times50 mm y
20\times250 mm, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), disolución
A: solución acuosa al 1% de ácido fórmico, solución B: metanol,
gradiente: gradiente lineal durante 90 min. desde 35% hasta 65%
para la proporción de la solución B, caudal: 5 ml/min., detección:
absorbancia a 260 nm. Las fracciones eluidas a 59, 74 y 81 minutos
se recogieron y se evaporó el disolvente a presión reducida, y de
este modo se obtuvieron los compuestos,
SPF-3059-5 (34,2 mg),
SPF-3059-1 (64,1 mg) y
SPF-3059-2 (12,0 mg)
respectivamente. Las propiedades fisicoquímicas de estos compuestos
obtenidos de este modo son las siguientes.
Aspecto: polvo amarillo
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M+H)^{+}:
- Valor medido: 579,0772
- Valor calculado: 579,0776
Fórmula molecular: C_{28}H_{18}O_{14}
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 241(31.600), 315(23.400), 365(16.500)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.400, 1.701, 1.615, 1.570, 1.457, 1.273
^{1}H-RMN (500 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,28, 2,67, 2,69, 4,6-4,7, 5,02, 6,40, 6,91, 7,91, 8,52, 9,33, 11,1-11,6, 12,8
^{13}C-RMN (125 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 16,5, 17,0, 32,4, 56,2, 65,7, 68,0, 102,3, 104,2, 108,8, 110,1, 118,2, 118,5, 120,6, 122,2, 125,8, 127,7, 132,4, 134,9, 137,6, 139,1, 140,7, 140,8, 150,1, 150,2, 152,2, 153,8, 154,5, 156,3, 167,5, 167,6, 172,7, 172,8, 186,3, 199,1, 202,7, 202,9
Considerada en conjunto, la estructura de
SPF-3059-1 se determinó como la
fórmula [17] siguiente (tautómera):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Aspecto: polvo de color crema
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M+H)^{+}:
- Valor medido: 533,0710
- Valor calculado: 533,0721
Fórmula molecular: C_{27}H_{16}O_{12}
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 209(40.600), 236(42.600), 283(28.500), 323(25.400)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.266, 1.678, 1.654, 1.623, 1.562, 1.471, 1.296
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,53 (6H,s), 6,93 (1H, s), 6,95 (1H, s), 7,47 (1H, s), 8,15 (1H, s), 8,54 (1H, s), 9,38 (1H, brs), 9,89 (1H, brs), 10,78 (1H, brs), 11,37 (1H, brs), 12,68 (1H, brs)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 29,1, 32,1, 102,3, 103,1, 108,7, 112,15, 113,5, 119,6, 119,8, 120,9, 126,2, 132,4, 133,6, 136,1, 141,7, 144,5, 150,71, 150,74, 152,49, 152,54, 152,7, 154,4, 167,4, 172,9, 173,4, 199,2, 201,2
Considerada en conjunto, la estructura de
SPF-3059-2 se determinó como la
fórmula [18] siguiente:
Aspecto: polvo de color crema
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M+H)^{+}:
- Valor medido: 577,0615
- Valor calculado: 577,0619
Fórmula molecular: C_{28}H_{16}O_{14}
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 229(35.800), 284(22.600), 322(21.000)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.260, 1.684, 1.626, 1.567, 1.467, 1.288
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,53 (3H,s), 2,55 (3H, s), 6,93 (1H, s), 6,96 (1H, s), 8,17 (1H, s), 8,53 (1H, s), 9,5-13,0 (6H)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 29,1, 32,1, 102,26, 102,32, 109,9, 112,4, 119,6, 119,8, 120,3, 120,9, 126,3, 132,5, 133,4, 136,2, 141,2, 141,7, 150,4, 150,8, 152,1, 152,68, 152,73, 154,5, 167,4, 167,5, 172,5, 172,9, 199,1, 201,1
A partir de estos resultados, se determinó la
estructura de SPF-3059-5 como la
fórmula [19] siguiente:
Ejemplo
2
Una placa de 96 pocillos (Sumitomo Bakelite Co.,
ltd.) recubierta previamente con polilisina se recubrió además con
laminina (20 \mu/ml de laminina, durante 1 hora a temperatura
ambiente). A cada pocillo se le añadieron 100 \mul de medio
(medio F12 que contiene 10% de suero bovino fetal, 20 ng/ml de NGF,
100 unidades/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina)
cuyos medios se inocularon a continuación con ganglios nerviosos
del pedículo dorsal extirpados de embriones de pollo E7 (embriones
de 7 días) y se cultivaron durante 16 a 20 horas en CO_{2} al 5%
y a 37 grados C. Posteriormente, se añadieron los compuestos del
asunto a los medios a varias concentraciones y se añadieron 2
unidades/ml de semaforina 3A (Sema3A) de ratón después de cultivar
durante 1 hora. Los cultivos se incubaron más durante 1 hora más. Se
añadió rápidamente glutaraldehído a éstos después de dicha 1 hora
hasta una concentración final del 1%. Los cultivos de dejaron a
continuación durante 15 minutos a temperatura ambiente de modo que
se fijaron las secciones de tejido y se observaron al microscopio
los ritmos de desplome de los conos de crecimiento. Un pocillo sin
adición de Sema3A efectuó el control. Los resultados se representan
en las Figs. 1 y 2.
Las Figs. 1 y 2 demuestran que el ritmo de
desplome de los conos de crecimiento disminuyen a medida que aumenta
la concentración del compuesto. Por el contrario, los compuestos
solos no afectaron los ritmos en absoluto. Los resultados pusieron
de manifiesto que estos compuestos
(SPF-3059-1,
SPF-3059-2,
SPF-3059-5, M162 y A721) inhiben
las actividades de desplome del cono de crecimiento de Sema3A en
función de la concentración. Los ejes longitudinal y lateral en las
figuras representan el ritmo de desplome de los conos de crecimiento
y la concentración de los compuestos, respectivamente. \bullet
\sqbullet \blacktriangle presentan los resultados cuando se
añadió Sema3A después de la adición de los compuestos y o \Box
\Delta demuestran éstos cuando no se añadió Sema3A. Además, se
determinaron los IC_{50} (\mug/ml) de los inhibidores por el
procedimiento que comprende: calcular el ritmo del desplome del
cono de crecimiento (A) % de las referencias negativas (no se
añadieron compuestos ni Sema3a); posteriormente se calcula el ritmo
de desplome del cono de crecimiento (B) % de las referencias
positivas (no se añadieron compuestos pero se añadió Sema3a); y se
seleccionó la concentración de cada compuesto a partir del gráfico
en el que el ritmo de desplome del cono de crecimiento cumple
(A+B)/2 (%), que era igual a la concentración de IC_{50}. Los
resultados son los siguientes.
| Compuesto | IC_{50} (\mug/ml) |
| SPF-3059-1 | <0,1 |
| SPF-3059-2 | <0,1 |
| SPF-3059-5 | <0,1 |
| M162 | 2,0 |
| A721 | 5,0 |
Estos resultados demuestran que
SPF-3059-1,
SPF-3059-2 y
SPF-3059-5 inhiben potencialmente la
semaforina.
Ejemplo
3
El experimento se realizó de la misma manera que
en el Ejemplo 2 con la excepción de que se utilizó la semaforina
6C-AP de rata (Sema6C-AP: proteína
de fusión de dominio extracelular de Sema6C y fosfatasa alcalina
procedente de placenta humana) en lugar de semaforina 3A (Sema3A)
de ratón y se utilizaron los ganglios del pedículo dorsal extraídos
de embriones de pollitos de 8 días en lugar de los extraídos de
embriones de pollitos de 7 días. Se midió el ritmo de desplome del
cono de crecimiento cuando se añadió Sema6C-AP una
hora después de la adición del compuesto
SPF-3059-1 a varias concentraciones.
Los resultados se presentan en la Fig. 3. Los ejes longitudinal y
lateral en la figura representan el ritmo de desplome de los conos
de crecimiento y la concentración de
SPF-3059-1, respectivamente.
\bullet presenta los resultados cuando se añadió
Sema6C-AP después de la adición de
SPF-3059-1 y presenta el resultado
cuando no se añadió Sema6C-AP. La Fig. 3 demuestra
que el ritmo de desplome de los conos de crecimiento disminuye a
medida que aumenta la concentración de
SPF-3059-1. Por el contrario,
SPF-3059-1 solo no afectó el ritmo
en absoluto. Estos resultados ponen de manifiesto que
SPF-3059-1 inhibe las actividades de
desplome del cono de crecimiento de Sema6C-AP en
función de la concentración.
Ejemplo
4
Si los presentes compuestos
(SPF-3059-1, M162, A721) presentan
acción inhibidora persistente para Sema3A se analizaba por el
método de cultivo conjunto colágeno gel (Neuroprotocols 4,
116, 1994) utilizando grupos de células COS7 que expresan a Sema3A
y ganglios del pedículo dorsal de embriones de pollitos de 7 y 8
días. Se generaron grupos de células COS7 que expresan a Sema3A de
la forma siguiente. Se introdujo 1 \mug de
Sema3A-plásmido de expresión en células COS7
(100.000 células/35 mm de placa de cultivo), que se cultivaron
durante la noche, con el reactivo de transfección FuGENE6 (Roche).
2,5 horas después del comienzo de la transfección, se recogieron
las células COS7 por tripsinización y centrifugación, y se volvieron
a poner en suspensión en un medio de 200 \mul. Se colocaron 20
\mul de la suspensión celular sobre la tapa de la placa de cultivo
(interior) y se volvió a colocar la tapa, y a continuación se
cultivó la suspensión durante 20 horas (cultivo en gota suspendida)
(Cell 78, 425, 1994). Cuando se terminó el cultivo, se
recogieron las células COS7 agregadas (grupo) y se recortaron hasta
un diámetro de 0,5 mm. El grupo de células COS7 que expresa a Sema3A
y los ganglios del pedículo dorsal mencionados anteriormente se
colocaron en paralelo a una distancia entre 0,5 y 1 mm en un gel de
colágeno al 0,2% que se cultivó a continuación en un medio que
contenía los compuestos mencionados anteriormente a varias
concentraciones durante 2 días a 37 grados C en CO_{2} al 5%. Se
le añadió rápidamente glutaraldehído hasta una concentración final
del 1%. Se dejaron a continuación los cultivos durante 1 hora a
temperatura ambiente de modo que se fijaron los tejidos, y se
observó al microscopio el crecimiento de neuritas. En la Fig. 4 se
encuentran los resultados.
Se formaron gradientes de concentración en los
geles de colágeno mencionados anteriormente debido a que se segregó
Sema3A del grupo de células COS7 que se introdujo con los plásmidos
que expresan a Sema3A (el más próximo al grupo de células COS7
presentó una concentración mayor). Cuando se utilizó un medio que no
contiene un compuesto del asunto, las neuritas no pudieron crecer
hacia el grupo de células COS7 con la concentración elevada de
Sema3A y crecieron solamente en la dirección opuesta. Sin embargo,
cuando se añadió al medio el compuesto
SPF-3059-1 o M162, se observó
crecimiento de neuritas en dirección hacia el grupo de células COS7
que expresa Sema3A. Dicho crecimiento de neuritas hacia el grupo de
células COS7 que expresa a Sema3A fue más destacable a medida que
la concentración del compuesto era mayor, lo que sugiere la
dependencia de la concentración. Este resultado demostró la
capacidad de SPF-3059-1 y de M162 de
inhibir persistentemente las actividades de Sema3A. Sin embargo,
solamente cuando se añadió A721, no se observó el crecimiento de
neuritas hacia el grupo de células COS7 que expresan a Sema3A, que
se observó con la adición de
SPF-3059-1 y M162. Esto demostró
que A721 no presentaba la acción inhibidora persistente sobre
Sema3A.
Ejemplo
5
De manera similar a la del Ejemplo 4, se analizó
la supresión de la actividad inhibidora del crecimiento de neuritas
en los compuestos, SPF-3059-1,
SPF-3059-2 y
SPF-3059-5. Cuando las neuritas
crecieron en forma circular concéntrica completa precisamente como
para los grupos de referencia en los que se utilizaron células COS7
que no expresan a Sema3A, se puntuó +++ (efecto inhibidor potente
para Sema3A). Cuando el crecimiento se observó casi en forma
circular concéntrica acompañado de una pequeña supresión del
crecimiento en dirección de las células que expresan a Sema3A, se
puntuó ++. Cuando el crecimiento en dirección de las células COS que
expresan a Sema3A apenas se suprime para presentar una forma de
media luna, se puntuó +. Cuando no se observó en absoluto
crecimiento en dirección de las células COS que expresan a Sema3A,
efecto no inhibidor para Sema3A), se puntuó -. Los resultados
determinados se presentan a continuación.
| Compuesto | Concentración de los presentes compuestos | ||
| (\mug/ml) | |||
| 0,5 | 1,0 | 2,0 | |
| SPF-3059-1 | + | ++ | +++ |
| SPF-3059-2 | + | ++ | +++ |
| SPF-3059-5 | + | ++ | ++ |
| PBS (referencia) | - | - | - |
Estos resultados pusieron de manifiesto que los
compuestos, SPF-3059-1,
SPF-3059-2 y
SPF-3059-5 inhibieron
persistentemente la acción de Sema3A segregada de las células COS7
que expresan Sema3A durante el cultivo de 48 horas.
Ejemplo
6
Se adquirieron ratas Wister macho (de 6,5
semanas) en CHARLES RIVER JAPAN, INC. y se criaron con alimentación
libre y toma de agua en un criadero dedicado. Se preparó una muestra
de solución diluyendo SPF-3059-1
hasta 1 mg/ml con PBS y se rellenó en una bomba de presión osmótica
(alzet 2004, ALZA Co., US). Se utilizó una bomba llena con PBS como
referencia. La solución de la muestra y una similar se prepararon el
día antes de la operación y la bomba de presión osmótica se puso en
un baño en PBS y se colocó durante la noche a temperatura ambiente.
Justo antes de la operación, se conectó una cánula en L a un extremo
de un tubo de silicio relleno con la solución de la muestra y de la
similar, y el otro extremo del tubo se conectó a la bomba. Se
anestesió una rata con pentobarbital (50 mg/kg, inyectado por vía
intrapeniana) y su cabeza se fijó al aparato estereotáxico. Se
practicó una incisión en el cuero cabelludo a lo largo de la línea
media y el cráneo por encima del bulbo olfativo se abrió para
exponer el bulbo olfativo (parte anterior). Con el fin de axotomizar
el nervio olfativo, se insertó una cuchilla (se cortó una cuchilla
en 1,5 mm de profundidad) entre el bulbo olfativo y la lámina
cribosa. El nervio olfativo que se proyecta sobre el bulbo olfativo
superior se axotomiza mediante esta manipulación. La cánula en L se
fijó a la apertura craneal por encima del bulbo olfativo con
adhesivo instantáneo quirúrgico y cemento dental de modo que el
borde de la cánula está dispuesto en la proximidad de la incisión.
La salida de la muestra se colocó a 6 \mul (6 \mug)/día. La
bomba se insertó por vía subcutánea en el cuello dorsal y la
incisión se suturó. A continuación el animal volvió en sí.
Dos y tres semanas después de la operación, la
rata anestesiada con pentobarbital se extendió sobre su lomo y se
inyectó con 100 \mul de WGA-HRP/PBS al 1% (TOYOBO)
en la cavidad nasal utilizando una microjeringuilla. 24 horas
después de la inyección de HRP, la rata se continuó anestesiando con
pentobarbital (50 mg/kg, inyectado por vía intrapeniana) y se le
practicó una incisión torácica. Posteriormente, se perfundió PBS en
el ventrículo izquierdo y a continuación se perfundió PBS que
contenía 200 \mul de paraformaldehído al 4%. Se extrajo el bulbo
olfativo y se colocó en PBS que contenía sacarosa al 30%, se colocó
en un baño durante la noche a 4 grados C y a continuación se
congeló con nieve carbónica. El bulbo olfativo se impregnó en un
compuesto de OTC en nieve carbónica y a continuación se prepararon
secciones de 30 \mum con un criostato. Se tomaron alícuotas de
las secciones en solución salina tamponada con Tris (TBS) (una de
cada tres piezas). Se lavaron las secciones en PBS en la que se
añadió a continuación TBS 0,1 M que contenía DAB al 0,48%, NiCl al
0,096% y H_{2}O al 0,036% y la reacción tuvo lugar durante 15
min. Una vez que se hubo lavado en TBS, se montaron las secciones
en un portaobjetos de vidrio y se sellaron después de secarse. Las
secciones se observaron al microscopio y se observó la reacción de
HRP del glomérulo en la parte externa del bulbo olfativo.
Se evaluó cuantitativamente la regeneración de
los nervios olfativos observando en qué sección horizontal del
bulbo olfativo del vértice emergía el glomérulo positivo a HRP. En
la Figura 5 y en la Tabla 1 se presentan los resultados. Todas las
ratas excepto la que murió por asfixia la 2ª semana a la inyección
de HRP se utilizaron para la evaluación. Cuando se inyectó
SPF-3059-1, se observaron secciones
positivas a HRP en las piezas más superficiales que las referencias
inyectadas con PBS tanto en la 2ª semana como en la 3ª. Se
interpretaron las diferencias significativas en el grupo inyectado
con SPF-3059-1 frente al grupo
inyectado con PBS, se observaron los positivos a HRP en las
secciones más superficiales que el grupo inyectado con PBS la 3ª
semana. Estos resultados demuestran que
SPF-3059-1 ha puesto de manifiesto
la acción promotora de la regeneración de nervios en modelos de
rata adulta para la axotomía del nervio olfativo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se realizó el mismo experimento que en el
Ejemplo 6 con M162 y A721. En la Fig. 6 se presentan los resultados.
Estos resultados demuestran que M162 presenta la acción promotora
de la regeneración de nervios in vivo pero A721 no.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se adquirieron ratas Wister macho de 7 semanas
(CHARLES RIVER JAPAN, INC.) y se criaron en ciclos de luz y
oscuridad durante 12 horas. Las ratas tenían libre acceso a pienso
sólido (CLEA Japan, Inc., CE2) y agua, y se utilizaron en el
experimento tras aproximadamente una semana de cría preliminar. Bajo
anestesia de pentobarbital, se expuso el nervio ciático de los
muslos de la rata, se pinzó durante 30 s. con fórceps de 5 mm de
profundidad, y se comprimió de este modo. El punto de compresión se
marcó con hilo de nilón 10-0. Se disolvió
SPF-3059-1 en PBS a razón de 8,3
\mug/ml y se administró localmente al punto de la lesión durante
14 días consecutivos a un caudal de 1 \mug/día utilizando una
bomba de presión osmótica (2ML2, 5 \mul/h, alzet). Se administró
PBS a las referencias. El 14º día de administración, se extrajeron
los nervios ciáticos y se recortaron en las áreas distales del
punto de compresión (posiciones de calificación) por 2 mm, 6 mm y 10
mm. Los nervios ciáticos incisos se fijaron en glutaraldehído al
2,5%/tampón fosfato 0,1 M durante un día y una noche. Cuando
estaban fijados, se deshidrataron los nervios en alcohol y se
impregnaron en resina epoxi. Se realizaron secciones transversales
de los nervios ciáticos y se secaron con azul de toluidina, y se
tomaron fotografías en un microscopio óptico para determinar los
recuentos de las fibras con mielina. Una vez medidas las áreas de
los nervios ciáticos, se calculó la densidad de la fibra con
mielina dividiendo cada área por el recuento de fibras con mielina.
Los resultados se presentan en la Fig. 7. La densidad de la fibra
con mielina aumentó más en el grupo inyectado con
SPF-3059-1 en comparación con el
grupo inyectado con PBS en las áreas distales de 2 mm y 6 mm del
punto de compresión. Este resultado demuestra que
SPF-3059-1 presenta efecto promotor
para la regeneración de los nervios ciáticos que fueron
comprimidos.
comprimidos.
Ejemplo
9
Se sembraron células COS7 en una placa de 96
pocillos (100 \mul de medio/pocillo) a razón de 10.000 células
por pocillo. Al mismo tiempo, se añadió
SPF-3059-1 de varias concentraciones
y se cultivaron las células durante dos días en presencia de
CO_{2} al 5% a 37 grados C. A continuación se añadieron a cada
pocillo 10 \mul de solución MTT a razón de 5 mg/ml y se cultivó
durante otra hora. Posteriormente, se eliminó el sobrenadante del
cultivo y el formazán (derivado de MTT producido en células viable)
acumulado en las células se disolvió mediante la adición de 50
\mul de DMSO y a continuación se midió la absorbancia a 570 nm
para determinar la proliferación de las células COS7. En la Fig. 8
se presentan los resultados. Como se muestra en la Fig. 8, el nivel
de proliferación celular en el cultivo realizado en presencia de
SPF-3059-1 fue similar al nivel
observado en ausencia de SPF-3059-1.
Este resultado demuestra que
SPF-3059-1 no presenta actividad
inesperada para la proliferación celular. Los ejes longitudinal y
lateral en la figura presentan la proliferación celular y la
concentración de SPF-3059-1,
respectivamente. Además, la desviación estándar (n=4) se añadió a
cada columna.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
El mismo efecto sobre la proliferación celular
que en el Ejemplo 9 se examinó para los compuestos,
SPF-3059-1,
SPF-3059-2 y
SPF-3059-5. Los pocillos con estos
compuestos sirvieron como muestras, los pocillos con PBS sirvieron
como referencia y los pocillos en los que se realizó el experimento
sin añadir las células sirvieron como blanco. Se determinó
IC_{50} (\mug/ml), índice inhibidor para la proliferación
celular, que se calcula mediante la ecuación presentada a
continuación.
Índice
inhibidor para la proliferación celular (%) = (1 - (absorbancia de
un pocillo de muestra - absorbancia del pocillo del
blanco)/(absorbancia del pocillo de referencia - absorbancia
del pocillo del blanco)) \times
100
Los resultados de la determinación del índice
inhibidor para la proliferación celular de los compuestos
mencionados anteriormente son los siguientes, demostrando que no se
observó ninguna citotoxicidad entre 1.000 y 3.000 veces o incluso a
concentraciones superiores en las que pueden observarse actividades
inhibidoras de semaforina.
| Compuesto | IC_{50} (\mug/ml) |
| SPF-3059-1 | > 300 |
| SPF-3059-2 | > 100 |
| SPF-3059-5 | > 300 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Si SPF-3059-1
inhibe la unión de Sema3A y Neuropilina-1, que es un
componente constituyente del complejo receptor Sema3A, se examinaba
en el experimento de unión al receptor. La
Neuropilina-1 y la plexina A1 son conocidas
actualmente como componentes constituyentes de los receptores de
Sema3A. Sin embargo, principalmente Neuropilina-1
es conocida porque contribuye a la unión de Sema3A. Sema3A
condensada con fosfatasa alcalina (procedente del hombre:
resistencia al calor) (Sema3A-AP) se utilizó como
ligando en el experimento de unión al receptor y la cantidad unida
al receptor se detectó con la actividad de fosfatasa alcalina como
índice. Se utilizó Sema3A procedente de ratón. Se generó un gen
recombinante en el que se condensó la fosfatasa alcalina desde el
aminoácido 758º hasta el lado del terminal C en dicha Sema3A. Este
gen recombinante se introdujo a continuación en la célula COS7
donde se expresó y segregó y se preparó
Sema3A-AP.
Se llevó a cabo el experimento de unión al
receptor como se describe a continuación. Se introdujo el plásmido
que expresa Neuropilina-1
(pUCSR\alpha-Neuropilina-1) en
células COS7 y se cultivó durante 24 horas. Estas células expresan
Neuropilina-1 sobre la superficie celular. Se
lavaron las células una vez en solución de tampón HBH (solución
salina equilibrada de Hank que contiene HEPES 20 mM, pH 7,2 y 0,5
mg/ml de albúmina de suero bovino) y se añadieron a continuación
solución de tampón HBH que contenía Sema3A-AP y
SPF-3059-1 de varias
concentraciones (0 a 10 \mug/ml) al mismo tiempo. Una vez que se
ha dejado durante una hora a temperatura ambiente en agitación, se
unió Sema3A-AP a Neuropilina-1 que
expresa las células, tras lo cual se eliminó el sobrenadante.
Posteriormente, se lavaron seis veces las células en solución de
tampón HBH para eliminar el exceso de Sema3A-AP. A
continuación se disolvió Sema3A-AP unido a las
células con Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, solución al 1%
de Triton X-100 (extracto celular). Se eliminaron
los materiales insolubles en el extracto celular por centrifugación
y a continuación fosfatasa alcalina endógena de la célula se
inactivó después de una hora de tratamiento a 65 grados C. Se
determinó la actividad de fosfatasa alcalina procedente de
Sema3A-AP en el extracto celular (= cantidad de
unión de Sema3A-AP). Se mezcló una alícuota del
extracto celular con tampón SEAP (dietanolamina 1 M, MgCl_{2} 0,5
mM, L-homoarginina 10 mM) y un sustrato fluorescente
(fosfato de p-nitrofenil 10 mM), y se mantuvo
caliente a 37 grados C. Se midió a continuación la solución su
absorbancia a 405 nm (p-nitrofenol: generada a
partir de fosfato p-nitrofenilo con fosfatasa
alcalina). Los resultados se presentan en la Fig. 9. Los resultados
demuestran que la unión de Sema3A-AP disminuye en
función de la concentración con la concentración creciente de
SPF-3059-1. Esto demuestra
claramente que SPF-3059-1 inhibe la
actividad de Sema3A porque el compuesto inhibe la unión de Sema3A a
su
receptor.
receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Se mezcló Sema3A con
SPF-3059-1, cuya concentración es lo
bastante alta para mostrar la actividad inhibidora (0,25 \mug/ml)
(= muestra de premezcla). A continuación se añadió la muestra de
premezcla a la solución de cultivo de los ganglios del pedículo
dorsal para examinar si se inhibía la actividad de desplome del cono
de crecimiento de Sema3A. La cantidad de muestra de premezcla fue
un cuarto de la solución de cultivo. Esto significa que la
concentración de SPF-3059-1 se
diluirá desde 0,25 \mug/ml hasta 0,05 \mug/ml (1/5 veces)
cuando la muestra de premezcla se añada a la solución de cultivo de
los ganglios del pedículo dorsal. Esta es la concentración a la que
la actividad inhibidora no se observará cuando
SPF-3059-1 y Sema3A se añaden
independientemente. En la Fig. 10 se presentan los resultados. La
Fig. 10 demuestra que la actividad de Sema3A se inhibió cuando la
muestra de premezcla se añadió a la solución de cultivo y a los
ganglios del pedículo dorsal a pesar del hecho de que la
concentración final de SPF-3059-1
era 0,05 \mug/ml (concentración de actividad no inhibidora). Esto
significa que la actividad de Sema3A se perderá en el momento en que
Sema3A y SPF-3059-1 se ponen en
contacto. A partir de este resultado, la molécula diana de
SPF-3059-1 se cree que es
Sema3A.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Se adquirieron ratas Wister macho (de 10
semanas) en Charles River Japan, Inc. y se criaron con alimentación
y toma de agua libres en un criadero dedicado. Se utilizaron en el
experimento tras aproximadamente una semana de cría previa. Se
preparó SPF-3059-1 a 0,1 mg/ml con
PBS. Se utilizó PBS como referencia. El agente se llenó en una
bomba de presión osmótica (Alzet, modelo 2004, dosis para cuatro
semanas, caudal 0,25 \mul/h). Una cánula rellena con la
disolución de la muestra se conectó a la bomba y se preincubó en
solución salina durante la noche a temperatura ambiente.
Se inyectó pentobarbital (50 mg/kg) a una rata
por vía intrapeniana. Se realizaron incisiones en la piel y en los
músculos en la zona de la médula espinal torácica dorsal de la rata
anestesiada y se expusieron las vértebras T8 a T12. Se practicó una
laminectomía en la vértebra torácica T11 al microscopio. Se punzaron
un par de tijeras oftalmológicas unidas al manipulador y se
insertaron a través de la línea media a una profundidad de 1,5 mm
de la superficie de la duramadre, y se practicó una incisión en la
trayectoria de la corteza cerebral a la médula espinal y se separó.
La abertura de las vértebras se llenó con un gel esponjoso. Se
practicó una canulación desde la vértebra T9 que se perforó con un
taladro quirúrgico para exponer la duramadre. La parte de la
duramadre, a la que la cánula tenía que insertarse, se perforó con
una aguja de inyección y el tubo de silicio conectado a la bomba se
insertó en ésta. Esto aseguró que el borde de la cánula alcanzaba el
área lesionada de la médula espinal T11. A continuación se llenó
con gel esponjoso la abertura de la vértebra en la que se infiltró
una gota de adhesivo instantáneo quirúrgico. Se fijó la cánula al
músculo adyacente con sutura para impedir el deslizamiento. Después
de suturar el músculo operado, se practicaron puntos de sutura a la
piel incisa junto con grapas de sutura. La muestra fue administrada
durante cuatro semanas consecutivas al caudal de muestra de 0,6
\mug/día.
Dos semanas después de la operación, se
anestesió a la rata con pentobarbital (50 mg/kg, inyectado por vía
intrapeniana) cuya cabeza se fijó al aparato estereotáxico. Se hizo
una incisión en el cuero cabelludo a lo largo de la línea media y
se perforó el cráneo con un taladro para exponer el cerebro. Se
inyectaron 0,1 \mul de DBA al 10% (amina biotinilada con
dextrano) en cada uno de los puntos en el área motriz de la corteza
cerebral con una microjeringuilla, después de lo cual se suturó la
incisión y se recuperó el animal. La DBA se transportará desde el
núcleo del nervio hasta la médula espinal a través de los nervios.
Después de dos semanas de cría, la rata se anestesió otra vez con
pentobarbital y se realizó una incisión en la parte torácica y a
continuación se perfundió PBS desde el ventrículo izquierdo.
Posteriormente, se perfundió PBS que contiene 200 ml de
paraformaldehído al 4%. La médula espinal (incluyendo la parte
lesionada) se extrajo y se fijó durante la noche en la solución,
que se colocó a continuación en PBS que contiene sacarosa al 30% y
se colocó en un baño a 4 grados C. La médula espinal se impregnó en
el compuesto OTC y se congeló en nieve carbónica. Se prepararon
secciones de 30 \mum en un criostato y se pusieron alícuotas en
solución de tampón Tris (TBS). Se lavaron las secciones en TBS y se
colocaron en baños en solución de reacción ABC durante dos horas.
Una vez lavadas las secciones, se observaron con sustrato DBA y se
efectuaron las preparaciones. Las fibras nerviosas regeneradas en el
área lesionada se observaron al microscopio. La Fig. 11 presenta el
resultado de la inyección de
SPF-3050-1 de la presente invención
y la Fig. 12 presenta el resultado de la inyección de PBS como
referencia. La Fig. 11A, B y C y la Fig. 12A, B y C presentan
secciones en serie en la proximal de la zona traumatizada,
respectivamente. La Fig. 11D y la Fig. 12D son grandes
macrofotografías de la Fig. 11B y la Fig. 12B, respectivamente.
Cuando se administró SPF-3059-1, se
observó la retención de DBA (cabeza de flecha negra) en la parte del
rostro hasta el punto de la lesión presentado en la Fig. 11D. Se
observaron muchas fibras positivas a DBA que se extienden desde el
área de retención hasta la caudal a lo largo del área lesionada
(cabeza de flecha blanca) y fibras nerviosas regeneradas que se
extienden eludiendo el punto de incisión se observaron
frecuentemente. Por el contrario, cuando se administró PBS, se
observó retención de DBA (cabeza de flecha negra) en la parte del
rostro hasta el punto de la lesión como se muestra en la Fig. 12D.
Se observaron unas pocas fibras positivas a DBA hasta el lado de la
cola a lo largo del área lesionada (cabeza de flecha blanca) y
solamente se observaron unas pocas fibras nerviosas. Estos
resultados pusieron de manifiesto que
SPF-3059-1 presenta la acción de
activación de regeneración de nervios en ratas adultas del modelo de
lesión de médula espinal.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
Un medio de 10 ml que contiene 2% de glucosa, 5%
de sacarosa, 2% de semillas de algodón en polvo, 0,1% de nitrato
sódico, 0,1% de L-histidina, 0,05% de fosfato
dipotásico, 0,07% de cloruro potásico y 0,0014% de sulfato
magnésico heptahidratado, con su pH ajustado a 7,0, se pipeteó a un
matraz Erlenmeyer de 50 ml de volumen y se esterilizó en un
autoclave. Una aguja de inoculación de Penicillium sp.
SPF-3059 (FERM BP-7663) en cultivo
inclinado se inoculó en este medio y se cultivó con agitación a 180
rpm a 27ºC durante 4 días como precultivo. Se pipetearon 125 ml de
un medio con la misma composición que el medio mencionado
anteriormente en cada uno de los cinco matraces Erlenmeyer de 500
ml de volumen y se esterilizó en un autoclave. Posteriormente, la
solución de precultivo mencionada anteriormente se añadió a los
cinco matraces en 4 ml a cada uno y se cultivaron con agitación a
180 rpm durante 4 días a 27 grados C. 30 litros de medio que
contienen 1,43% de glucosa, 3,57% de sacarosa, 1,43% de semillas de
algodón en polvo, 0,07% de nitrato sódico, 0,07% de
L-histidina, 0,036% de fosfato dipotásico, 0,05% de
cloruro potásico, 0,001% de sulfato magnésico heptahidratado y 0,01%
de Adekanol LG-295S (agente de antimoldeo de Asahi
Denka Co., Ltd.), con su pH ajustado a 7,0, en un fermentador de
vaso de 50 litros de volumen se esterilizó al vapor de alta presión
(121 grados C, 20 min.). A continuación se añadieron 500 ml del
caldo del cultivo mencionado anteriormente al fermentador y se
cultivaron a 27 grados C, durante 9 días con una agitación de 400
rpm y una aireación de 15 litros/min.
Cuando acabó el cultivo, el caldo cultivado se
centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos para separar el
sobrenadante y el micelio. La fracción sobrenadante se extrajo dos
veces con 20 litros de acetato de etilo-ácido fórmico (99:1). La
fracción del micelio del hongo se extrajo con 30 litros de acetona,
y a continuación se filtró y se concentró. Una vez concentrada en
solución acuosa, se extrajo con 10 litros de acetato de etilo-ácido
fórmico (99:1). Ambos extractos se mezclaron y se concentraron a
presión reducida para obtener 224 g de extracto en bruto. 100 g de
este extracto en bruto se disolvieron en 500 ml de metanol y se
aplicó a una cromatografía en columna con Sephadex (marca
registrada) LH-20 (Amersham Biosciences K.K.) y se
eluyó con metanol. Se recogieron las fracciones activas y se
evaporó el disolvente a presión reducida para obtener 48,8 g de la
sustancia aceitosa. Esta sustancia se disolvió a continuación en
400 ml de metanol y se aplicó a una cromatografía en columna
utilizando TSKgel TOYOPEARL HW-40F (Tosoh
Corporation) y se eluyó con metanol. Se recogieron las fracciones
activas y se evaporó el disolvente a presión reducida para obtener
21,8 g de sustancia en bruto. Esta sustancia en bruto se disolvió a
continuación en alícuotas de 200 mg en 2 ml de DMSO y se aplicó a
una HPLC en fase inversa. Las condiciones de la HPLC de preparación
en fase inversa fueron, columna: Wakopak®
Wakosil-II5C18HGprep (conexión 5 d.i. x 10 cm y 5
d.i. x 25 cm, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), disolución A:
solución acuosa al 1% de ácido fórmico, solución B: metanol,
gradiente: gradiente lineal durante dos horas desde 45% hasta 75%
para la proporción de la solución B, caudal: 25 ml/min. y detección:
absorbancia a 260 nm. El eluido se fraccionó durante un
minuto.
minuto.
Las fracciones eluidas como las descritas
anteriormente se analizaron por HPLC analítica. Las condiciones de
la HPLC analítica fueron, columna: Wakopak®
Wakosil-II5C18RS (4,6\times150 mm, Wako Pure
Chemical Industries, Ltd.), disolución A: solución acuosa al 1% de
ácido fórmico, solución B: metanol, gradiente: gradiente lineal
durante 71,1 min. desde 20% hasta 67% para la proporción de la
solución B, caudal: 1,3 ml/min., y detección: absorbancia a 260 nm.
Las fracciones que contenían el compuesto objetivo se recogieron con
el tiempo de retención en esta HPLC analítica como índice y se
evaporó el disolvente a presión reducida. El material resultante se
aplicó de nuevo a la HPLC de preparación y se purificó de manera
similar a la del caso anterior, y se continuó aplicando a una
cromatografía en columna utilizando TSKgel TOYOPEARL
HW-40F (Tosoh Corporation) y se purificaron de
manera similar a como se hizo anteriormente. Las fracciones que
contienen el compuesto objetivo se recogieron y se evaporó el
disolvente a presión reducida. De este modo, se obtuvieron los
compuestos purificados descritos a
continuación.
continuación.
\newpage
| Compuesto | Cantidad obtenida (mg) | Tiempo de retención en la |
| HPLC analítica (min.) | ||
| SPF-3059-12 | 6,2 | 34,4 |
| SPF-3059-24 | 28,0 | 34,5 |
| SPF-3059-4 | 10,2 | 36,0 |
| SPF-3059-25 | 4,0 | 39,3 |
| SPF-3059-34 | 2,9 | 40,8 |
| SPF-3059-6 | 34,9 | 45,6 |
| SPF-3059-27 | 17,4 | 46,1 |
| SPF-3059-26 | 6,2 | 46,5 |
| SPF-3059-28 | 11,8 | 46,6 |
| SPF-3059-7 | 13,0 | 47,0 |
| SPF-3059-39 | 2,8 | 49,95 |
| SPF-3059-37 | 4,0 | 50,0 |
| SPF-3059-3 | 118,2 | 50,1 |
| SPF-3059-35 | 11,0 | 51,5 |
| SPF-3059-9 | 100,9 | 52,7 |
| SPF-3059-29 | 45,6 | 54,0 |
| SPF-3059-36 | 3,7 | 57,8 |
| SPF-3059-30 | 23,5 | 63,0 |
Las propiedades fisicoquímicas de los compuestos
obtenidos de este modo son las siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Aspecto: polvo amarillo
Peso molecular: 534
Fórmula molecular: C_{27}H_{18}O_{12}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo): 535 (M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo): 533
(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 535,0905
- Valor calculado: 535,0877 (C_{27}H_{19}O_{12})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 242(30.800), 317(22.700), 367(14.000)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.356, 1.700, 1.652, 1.610, 1.515, 1.475, 1.283
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,28, 2,29, 2,68, 2,69, 4,62, 4,62, 4,64, 4,72, 5,03, 6,38, 6,40, 6,90, 6,91, 7,44, 7,98, 8,54, 8,90-11,10, 12,70
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 16,5, 17,0, 32,3, 32,4, 56,2, 65,8, 68,0, 103,0, 104,2, 108,7, 108,8, 109,4, 113,5, 118,2, 118,6, 122,2, 125,7, 127,5, 129,8, 132,0, 132,6, 137,9, 134,8, 137,6, 138,8, 144,3, 150,5, 150,6, 152,0, 152,6, 154,2, 154,5, 155,5, 156,3, 167,6, 167,7, 173,4, 183,5, 186,2, 199,2, 202,8, 203,0
\newpage
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-3 como la
fórmula [20] siguiente (tautómera):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Aspecto: polvo de color crema
Peso molecular: 560
Fórmula molecular: C_{28}H_{16}O_{13}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
561(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
559(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 561,0667
- Valor calculado: 561,0670 (C_{28}H_{17}O_{13})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 221(35.600), 250(38.100), 276sh(25.800), 323(24.300)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.412, 1.665, 1.619, 1.563, 1.465, 1.427, 1.263
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,53 (3H,s), 2,56 (3H,s), 6,84 (1H, d, 2,1), 6,95 (1H, s), 6,96 (1H, d, 2,1), 8,17 (1H, s), 8,52 (1H, s), 10,10-11,40 (3H, brs), 12,71 (1H, brs), 13,26 (1H, brs)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 29,2, 32,1, 102,3, 103,2, 110,1, 112,4, 112,8, 119,6, 120,3, 120,8, 126,3, 133,1, 133,4, 136,7, 137,5, 141,7, 150,8, 152,3, 152,7, 152,8, 157,2, 163,9, 167,4, 169,3, 172,2, 172,9, 199,3, 201,0
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
\newpage
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-4 como la
fórmula [21] siguiente:
Aspecto: polvo de color crema
Peso molecular: 592
Fórmula molecular: C_{29}H_{20}O_{14}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
593(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
591(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 593,0949
- Valor calculado: 593,0932 (C_{29}H_{21}O_{14})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 210sh(45.900), 223(47.700), 317(25.800), 358sh(14.700)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.418, 1.701, 1.617, 1.565, 1.465, 1301
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,22 (3H,s), 2,72 (3H,s), 3,11 (3H, s), 3,98 (2H, brs), 6,78 (1H, s), 6,88 (1H, s), 8,21 (1H, s), 9,00-13,00 (6H, brs)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 16,8, 32,4, 57,8, 64,4, 102,1, 102,3, 109,3, 111,9, 118,4, 118,6, 119,1, 119,6, 127,6, 128,2, 131,6, 139,0, 141,6, 142,1, 150,7(2C), 151,9, 152,9, 155,5, 162,0, 167,8, 167,9, 172,4, 174,6, 202,6
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-6 como la
fórmula [22] siguiente:
Aspecto: polvo amarillo
Peso molecular: 562
Fórmula molecular: C_{28}H_{18}O_{13}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
563(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
561(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 563,0843
- Valor calculado: 593,0826 (C_{28}H_{19}O_{13})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 242(31.600), 312(24.500), 385(10.200)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.424, 1.701, 1.603, 1.504, 1.448, 1420, 1270
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,28, 2,29, 2,68, 2,69, 4,62, 4,67, 4,71, 5,04, 6,38, 6,41, 6,81, 6,92, 6,93, 7,95, 8,52, 9,33, 11,22, 11,35, 12,93
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 16,6, 17,0, 32,3, 32,4, 56,2, 65,7, 67,9, 102,3, 102,8, 103,1, 104,3, 108,7, 109,3, 110,1, 112,5, 112,6, 118,5, 118,7, 121,6, 122,1, 125,9, 127,6, 130,1, 131,9, 132,4, 135,3, 137,4, 137,6, 138,9, 139,7, 151,9, 152,3, 154,5, 155,5, 156,2, 157,1, 163,6, 167,6, 169,3, 172,7, 172,8, 183,7, 186,2, 199,1, 202,5, 202,7
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-7 como la
fórmula [23] siguiente (tautómera):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Aspecto: polvo amarillo
Peso molecular: 534
Fórmula molecular: C_{27}H_{18}O_{12}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
535(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
533(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 535,0876
- Valor calculado: 535,0877 (C_{27}H_{19}O_{12})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 207(47.600), 243(41.800), 314(34.400), 369(23.000)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.444, 1.702, 1.614, 1.474, 1.289
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,29, 2,31, 2,67, 2,70, 4,60, 4,65, 4,69, 5,97, 6,32, 6,35, 6,89, 6,90, 7,03, 7,17, 7,94, 8,50, 12,50, 9,20-10,80
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 16,6, 17,1, 32,3, 32,4, 56,2, 65,9, 68,2, 102,3, 103,0, 103,2, 103,9, 109,9, 110,0, 110,4, 110,5, 111,9, 112,2, 118,2, 118,6, 120,5, 125,7, 127,7, 130,0, 131,9, 132,4, 134,8, 138,2, 139,1, 140,9, 141,1, 141,5, 150,2, 150,3, 151,7, 152,2, 154,1, 154,6, 154,9, 1588,8, 156,6 167,5, 172,6, 172,7, 183,5, 187,2, 199,3, 202,7, 202,9
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-9 como la
fórmula [24] siguiente (tautómera):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Aspecto: polvo de color crema
Peso molecular: 560
Fórmula molecular: C_{28}H_{16}O_{13}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
561(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
559(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 561,0680
- Valor calculado: 561,0670 (C_{28}H_{17}O_{13})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 232(37.400), 250sh(34.800), 285(28.000), 308sh(23.200), 360sh(9.000)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.080, 1.698, 1.608, 1. 468, 1.291
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,54 (3H,s), 2,55 (3H,s), 6,82 (1H, d, 2,1), 6,87 (1H, s), 6,95 (1H, d, 2,1), 8,22 (1H, s), 8,55 (1H, s), 9,50-13,50 (5H, brs)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 29,1, 32,2, 102,1, 103,0, 109,4, 112,1, 113,5, 119,8, 120,0, 121,7, 126,6, 132,0, 133,3, 135,9, 136,7, 141,7, 150,6, 152,1, 153,0, 155,4, 157,6, 162,4, 167,4, 167,6, 172,2, 172,9, 199,1, 201,1
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-12 como la
fórmula [25] siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Aspecto: polvo de color crema
Peso molecular: 532
Fórmula molecular: C_{27}H_{16}O_{12}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
533(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
531(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 531,0621
- Valor calculado: 531,0564 (C_{27}H_{17}O_{12})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 212(36.900), 229sh(34.500), 283(26.300), 323(21.700)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.447, 1.697, 1.629, 1.578, 1.470, 1.290
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,52 (3H,s), 2,54 (3H,s), 6,92 (1H, s), 6,93 (1H, s), 7,28 (1H, s), 8,13 (1H, s), 8,54 (1H, s), 9,50-13,00 (5H, brs)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 29,1, 32,3, 102,3, 102,9, 107,9, 110,0, 115,8, 119,8, 120,4, 120,7, 126,5, 133,0, 133,3, 136,0, 141,2, 145,0, 150,4, 151,1, 152,2, 152,9, 153,0, 154,3, 167,5, 172,6, 173,6, 199,1, 201,1
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-24 como la
fórmula [26] siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Aspecto: polvo de color crema
Fórmula molecular: C_{27}H_{16}O_{11}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
517(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
515(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 517,0778
- Valor calculado: 517,0771 (C_{27}H_{17}O_{11})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 215(35.000), 253(35.100), 276sh(25.200), 323(23.400)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.417, 1.691, 1.625, 1.471, 1.293
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,54 (6H,s), 6,82 (1H, brs), 6,92 (2H, brs), 7,27 (1H, s), 8,14 (1H, s), 8,53 (1H, s), 9,0-14,00 (4H, brs)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 29,2, 32,3, 102,9, 103,0, 107,8, 109,9, 113,0, 115,7, 120,4, 120,6, 126,4, 133,3, 133,4, 136,4(2C), 145,0, 151,2, 152,3, 152,98, 153,01, 157,3, 164,2, 169,4, 172,6, 173,6, 199,2, 201,0
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-25 como la
fórmula [27] siguiente:
Aspecto: polvo de color crema
Peso molecular: 488
Fórmula molecular: C_{26}H_{16}O_{10}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
489(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
487(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 489,0823
- Valor calculado: 489,0822 (C_{26}H_{17}O_{10})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 212(31.500), 235(30.900), 284(23.900), 324(19.500)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.454, 1.694, 1.625, 1517, 1.471, 1.293
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,53 (3H,s), 2,54 (3H,s), 6,91 (1H, s), 6,92 (1H, s), 7,27 (1H, s), 7,47 (1H, s), 8,11 (1H, s), 8,57 (1H, s)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 29,1, 32,2, 102,9, 103,0, 107,9, 108,5, 113,3, 115,7, 119,8, 120,7, 126,3, 132,7, 133,5, 135,8, 144,6, 145,0, 150,8, 151,1, 152,5, 152,9(2C), 154,7, 173,3, 173,6, 199,1, 201,2
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-26 como la
fórmula [28] siguiente:
Aspecto: polvo amarillo
Peso molecular: 642
Fórmula molecular: C_{33}H_{22}O_{14}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
643(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
641(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 643,1088
- Valor calculado: 643,1089 (C_{33}H_{23}O_{14})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 213(46.100), 246(46.600), 287(31.700), 354(19.900)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.400, 1.694, 1.640, 1604, 1.468, 1.290
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,41 (3H,s), 2,45 (3H,s), 2,67 (3H,s), 6,34 (1H, s), 6,63 (1H,s), 6,90 (1H, s), 7,48 (1H, d, 2,1), 7,97 (1H, d, 2,1), 8,49 (1H, s), 11,9 (1H, brs), 12,5 (1H, brs)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 27,4, 30,2, 32,7, 102,3, 102,8, 109,8, 111,8, 117,4, 119,6, 119,7, 120,3, 126,7, 127,5, 128,4, 133,0, 133,4, 135,1, 135,8, 138,6, 139,9, 141,3, 150,5, 151,7, 154,6, 155,8, 157,5, 158,3, 167,5, 172,5, 196,3, 200,0, 201,6, 205,3
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-27 como la
fórmula [29] siguiente:
Aspecto: polvo de color crema
Peso molecular: 532
Fórmula molecular: C_{27}H_{16}O_{12}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
533(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
531(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 533,0735
- Valor calculado: 533,0721 (C_{27}H_{17}O_{12})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 217(35.300), 236(34.100), 309(26.100)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.502, 3.096, 1.690, 1.598, 1.503, 1.434, 1.303
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,39 (3H,s), 2,71 (3H,s), 6,52 (1H, s), 6,85 (1H,d, 2,1), 6,92 (1H, d, 2,1), 6,98 (1H, d, 2,1), 8,25 (1H, s), 9,5-13,5 (5H, brs)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 17,3, 32,4, 102,3, 103,3, 110,0, 112,1, 112,3, 113,4, 118,8, 120,6, 127,6, 128,9, 132,1, 136,1, 138,8, 140,9, 150,2, 152,0, 154,1, 157,8, 162,2, 162,6, 167,5, 169,2, 172,5, 175,3, 202,7
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-28 como la
fórmula [30] siguiente:
Aspecto: polvo de color crema
Peso molecular: 548
Fórmula molecular: C_{28}H_{20}O_{12}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
549(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
547(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 549,1027
- Valor calculado: 549,1034 (C_{28}H_{21}O_{12})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 226(48.900), 316(26.200), 352sh(17.400)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.388, 1.687, 1.662, 1.626, 1.469, 1.296
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,23 (3H,s), 2,72 (3H,s), 3,11 (3H, s), 3,98 (2H, brs), 6,89 (1H,s), 6,93 (1H, s), 7,44 (1H, s), 8,27 (1H, s), 9,00-13,00 (5H, brs)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 16,8, 32,4, 57,8, 64,4, 102,3, 103,1, 108,6, 112,0, 113,5, 118,46, 118,48, 119,1, 127,7, 128,1, 131,8, 138,9, 141,8, 144,3, 150,6, 150,7, 151,9, 152,6, 154,2, 162,1, 167,8, 173,5, 174,6, 202,7
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-29 como la
fórmula [31] siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Aspecto: polvo de color crema
Peso molecular: 490
Fórmula molecular: C_{26}H_{18}O_{10}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
491(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
489(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 491,0966
- Valor calculado: 491,0979 (C_{26}H_{19}O_{10})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 206(36.000), 240(32.700), 315(26.500), 372(17.900)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.396, 1.704, 1.618, 1.518, 1.479, 1.294
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,28, 2,30, 2,67, 2,69, 4,62, 4,66, 4,70, 4,96, 6,32, 6,36, 6,90, 6,91, 7,03, 7,17, 7,43, 7,98, 8,54, 9,20-10,80
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 16,5, 17,0, 32,3, 32,4, 56,2, 65,9, 68,3, 103,0, 103,2, 103,8, 108,6, 110,4, 111,8, 113,4, 118,6, 125,6, 127,5, 129,5, 132,1, 132,6, 134,4, 137,9, 138,8, 141,2, 141,5, 144,3, 150,6, 152,0, 152,5, 154,3, 154,6, 154,9, 155,8, 156,6, 172,6, 173,4, 183,5, 187,2, 199,3, 202,7, 202,9
\global\parskip0.940000\baselineskip
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-30 como la
fórmula [32] siguiente:
Aspecto: polvo amarillo
Peso molecular: 550
Fórmula molecular: C_{27}H_{18}O_{13}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
551(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
549(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 551,0846
- Valor calculado: 551,0826 (C_{27}H_{19}O_{13})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 211(35.600), 240(31.100), 283(24.100), 349(14.500)
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,18 (3H,s), 2,66 (3H,s), 4,39 (1H, d, 11,9), 4,64 (1H, d, 11,9), 6,37 (1H,s), 6,84 (1H, s), 7,09 (1H, s), 8,47 (1H, brs)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 16,8, 32,4, 72,5, 80,0, 102,1, 103,0, 109,5, 110,6, 111,1, 117,7, 120,0, 126,5, 131,8, 133,6, 138,6, 141,4, 141,5, 150,5, 151,7, 154,9, 155,0, 156,2, 167,7, 172,6, 188,5, 202,8, 204,0
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-34 como la
fórmula [33] siguiente:
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Aspecto: polvo de color crema
Peso molecular: 546
Fórmula molecular: C_{28}H_{18}O_{12}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
547(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
545(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 547,0911
- Valor calculado: 547,0877 (C_{28}H_{19}O_{12})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 216(38.600), 237(37.300), 307(30.100), 356sh(8.800)
Espectro de absorción v_{máx} infrarrojo (KBr)
cm^{-1}:
- 3.460, 3.076, 1.734, 1.699, 1.629, 1.466, 1.302
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,39 (3H,s), 2,71 (3H,s), 3,82 (3H, s), 6,49 (1H,s), 6,86 (1H, d, 2,1), 6,92 (1H, s), 7,01 (1H, d, 2,1), 8,25 (1H, s), 9,5-13,5(4H, brs)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 17,3, 32,4, 52,5, 102,3, 103,6, 110,0, 112,1, 112,8, 113,5, 118,8, 120,6, 127,7, 129,0, 132,1, 134,3, 138,8, 140,9, 150,3, 152,1, 154,1, 157,7, 162,2, 162,8, 167,5, 168,6, 172,6, 175,1, 202,7
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-35 como la
fórmula [34] siguiente:
Aspecto: polvo de color crema
Peso molecular: 598
Fórmula molecular: C_{32}H_{22}O_{12}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
599(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
597(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 599,1198
- Valor calculado: 599,1190 (C_{32}H_{23}O_{12})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 213(46.300), 246(48.700), 287(33.200), 360(20.000)
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,41 (3H,s), 2,45 (3H,s), 2,66 (3H, s), 6,34 (1H,s), 6,63 (1H, s), 6,90 (1H, s), 7,46 (1H, d, 2,0), 7,46 (1H, s), 7,95 (1H, d, 2,0), 8,52 (1H, s)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 27,3, 30,2, 32,7, 102,8, 103,1, 108,6, 111,7, 113,4, 117,3, 119,6(2C), 126,7, 127,5, 128,5, 133,2, 133,4, 135,1, 135,6, 138,6, 139,7, 144,6, 150,8, 152,1, 154,6, 155,9, 157,5, 158,4, 173,3, 196,3, 200,0, 201,6, 205,2
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-36 como la
fórmula [35] siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Aspecto: polvo amarillo
Peso molecular: 806
Fórmula molecular: C_{41}H_{26}O_{18}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
807(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
805(M-H)^{-}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
de alta resolución (HRFAB-MS) m/z
(M-H)^{+}:
- Valor medido: 807,1197
- Valor calculado: 807,1198 (C_{41}H_{27}O_{18})
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 219(68.900), 323(30.700), 349(30.600)
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,08 (3H,s), 2,20 (3H,s), 2,53 (3H, s), 3,42 (1H,d, 15,6), 3,56 (1H,d, 15,6), 4,64 (1H,d, 13,4), 4,71 (1H,d, 13,4), 6,27 (1H, s), 6,83 (1H, s), 6,84 (1H, s), 6,88 (1H, s), 8,15 (1H, s), 9,0-13,0 (8H, brs)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 16,6, 17,7, 20,0, 32,0, 62,3, 102,1, 102,25, 103,8, 106,0, 108,4, 108,7, 109,9, 111,55, 118,56, 119,2, 119,6, 120,4, 121,7, 127,9, 129,13, 131,1, 139,5, 140,6, 141,00, 141,7, 150,1, 150,23, 150,46, 150,51, 151,6, 152,3, 154,09, 154,17, 158,7, 161,1, 167,7, 168,0, 172,5, 173,2, 175,1, 202,2
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-37 como la
fórmula [36] siguiente:
Aspecto: polvo amarillo
Peso molecular: 548
Fórmula molecular: C_{27}H_{16}O_{13}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (positivo):
549(M+H)^{+}
Espectro de masas con bombardeo atómico rápido
(FAB-MS) m/z (negativo):
547(M-H)^{-}
Espectro \lambda_{máx} de absorción
UV-VISIBLE (en metanol) nm (\varepsilon):
- 223(40.000), 319(23.900), 348(20.100)
^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 2,37 (3H,s), 2,71 (3H, s), 6,47 (3H, s), 6,91 (1H, s), 6,98 (1H, s), 8,22 (1H, s), 9,0-13,0 (6H, brs)
^{13}C-RMN
(DMSO-d_{6}) \delta ppm:
- 17,3, 32,4, 102,3, 102,7, 109,9, 111,49, 112,4, 118,64, 118,8, 120,5, 127,5, 129,12, 132,1, 138,8, 140,96, 142,5, 150,29, 151,1, 152,0, 152,6, 154,24, 162,1, 167,5, 167,9, 172,6, 175,5, 202,7
Solubilidad:
- Insoluble: agua, hexano
- Soluble: metanol, DMSO
Considerada en conjunto, se determinó la
estructura de SPF-3059-39 como la
fórmula [37] siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
De manera similar a la del Ejemplo 2, se
midieron las acciones inhibidoras de los nuevos compuestos de la
presente invención para la actividad de desplome de Sema 3A. Los
IC_{50} fueron los siguientes y todos ellos inhibieron
fuertemente a Sema 3A.
| Compuesto | IC_{50} (\mug/ml) |
| SPF-3059-3 | 0,2 |
| SPF-3059-4 | 2,0 |
| SPF-3059-6 | 0,1 |
| SPF-3059-7 | 1,0 |
| SPF-3059-9 | 0,1 |
| SPF-3059-12 | 2,0 |
| SPF-3059-24 | 0,1 |
| SPF-3059-25 | 4,0 |
| SPF-3059-26 | 0,2 |
| SPF-3059-27 | 0,5 |
| SPF-3059-28 | 2,0 |
| SPF-3059-29 | 0,1 |
| SPF-3059-30 | 0,2 |
| SPF-3059-34 | 0,1 |
| SPF-3059-35 | 2,0 |
| SPF-3059-36 | 4,0 |
| SPF-3059-37 | < 0,1 |
| SPF-3059-39 | 0,1 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
De manera similar a la del Ejemplo 5, se
midieron las acciones inhibidoras de los nuevos compuestos de la
presente invención para la acción inhibidora del crecimiento de
neuritas de Sema3A. Los resultados de la medición se presentan a
continuación.
| Compuesto | Concentración del compuesto (\mug/ml) | ||
| 2 | 6 | 20 | |
| SPF-3059-2 | +++ | NT | NT |
| SPF-3059-3 | +++ | NT | NT |
| SPF-3059-5 | ++ | NT | NT |
| SPF-3059-4 | - | + | ++ |
(Continuación)
| Compuesto | Concentración del compuesto (\mug/ml) | ||
| 2 | 6 | 20 | |
| SPF-3059-6 | ++ | ++ | +++ |
| SPF-3059-7 | + | + | ++ |
| SPF-3059-12 | + | + | ++ |
| PBS (referencia) | - | - | - |
| (NT = no analizado) |
Este resultado demuestra que la acción
inhibidora del crecimiento de neuritas presentada por Sema3A puede
ser inhibida persistentemente por los nuevos compuestos de la
presente invención.
Ejemplo
17
Se determinaron los efectos de los compuestos
para la proliferación celular utilizando células COS7, de manera
similar a la del Ejemplo 10. Los resultados de la determinación de
la inhibición de la proliferación celular de los nuevos compuestos
de la presente invención fueron los siguientes. Se puso de
manifiesto que la falta de citotoxicidad se observó a una
concentración tan alta como 50 a 1.000 veces la concentración en la
que pueden observarse actividades de semaforina.
| Presente compuesto | IC_{50} (\mug/ml) |
| SPF-3059-3 | > 100 |
| SPF-3059-4 | > 100 |
| SPF-3059-6 | > 100 |
| SPF-3059-7 | > 100 |
| SPF-3059-9 | > 100 |
| SPF-3059-12 | > 100 |
| SPF-3059-24 | > 100 |
| SPF-3059-29 | > 100 |
| SPF-3059-30 | > 100 |
Ejemplo
18
Un compuesto de la presente invención se
disuelve en metanol para preparar una solución 1 mM. La disolución
en metanol de hidróxido sódico 1 mM se añade a 1 ml de la disolución
anterior por 2 ml cuando un compuesto de la presente invención
tiene dos grupos carboxilo y en 1 ml cuando tiene un grupo
carboxilo, y se mezcla a fondo. El disolvente de la disolución se
evapora a presión reducida y los residuos se secan, y de este modo
se obtiene 1 \mumol de la sal sódica de un compuesto de la
presente invención.
Los inhibidores de semaforina como ingredientes
activos para los promotores de regeneración de nervios de la
presente invención presentan la acción promotora de regeneración de
nervios periféricos o centrales incluso a baja concentración y
presentan acción supresora de la actividad de desplome del cono de
crecimiento de semaforina y/o sobre la actividad inhibidora del
crecimiento de neuritas de semaforina en un gel de colágeno.
Especialmente, un compuesto inhibidor de semaforina de bajo peso
molecular con un peso molecular de 1.000 o inferior se utiliza con
ventaja como preventivo o como remedio para varias enfermedades
neuropáticas y neurodegenerativas debido a su difusividad molecular
significativa, permeabilidad de la membrana, distribución en
órganos, permeabilidad de la barrera sangre-cerebro
en particular, o similares.
Claims (58)
1. Utilización de un compuesto representado por
la fórmula [8] o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo
para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la
actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios
en un paciente que lo necesita,
en la que R^{4} representa un
átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo o un grupo alcoxicarbonilo y
R^{5} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un
grupo aciloxi y R^{6} y R^{7} están representados por (1) o (2)
a
continuación:
(1) R^{6} representa un grupo metilo y R^{7}
representa un grupo mostrado por las fórmulas [2], [9] o [10],
en la que R^{1} representa un
átomo de hidrógeno, un grupo carboxilo o un grupo alquiloxicarbonilo
y R^{2} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un
grupo aciloxi y R^{3} representa un átomo de hidrógeno, un grupo
metoximetilo o la fórmula
[3],
\vskip1.000000\baselineskip
en las que R^{1} y R^{2} tienen
los mismos significados que en la fórmula
[2],
en la que R^{1} y R^{2} tienen
los mismos significados que en la fórmula
[2],
(2) R^{6} representa un grupo mostrado por la
fórmula [5] u [11] y R^{7} representa un grupo acetilo;
en las que R^{1} y R^{2} tienen
los mismos significados que en la fórmula
[2].
2. Utilización del compuesto representado por la
fórmula [12] o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo
para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la
actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios
en un paciente que lo necesita.
en la que R^{1}, R^{2}, R^{4}
y R^{5} tiene los mismos significados que en las fórmulas [2] y
[8].
3. Utilización del compuesto según la
reivindicación 2, en la que por lo menos uno de entre R^{2} y
R^{5} representa un grupo hidroxilo en la fórmula [12].
4. Utilización del compuesto según la
reivindicación 3, en la que R^{2} representa un grupo hidroxilo en
la fórmula [12].
5. Utilización del compuesto según la
reivindicación 3, en el que R^{2} y R^{5} representan un grupo
hidroxilo en la fórmula [12].
6. Utilización del compuesto según cualquiera de
las reivindicaciones 2 a 5, en la que R^{4} representan un grupo
carboxilo en la fórmula [12].
7. Utilización del compuesto según la
reivindicación 2, en la que R^{1} y R^{4} representan un grupo
carboxilo y R^{2} representa un grupo hidroxilo en la fórmula
[12].
8. Compuesto representado por la fórmula
[12]
en la que R^{1}, R^{2}, R^{4}
y R^{5} tienen los mismos significados que en las fórmulas [2] y
[8] pero por lo menos uno de entre R^{1}, R^{2}, R^{4} y
R^{5} está representado por un átomo de hidrógeno, o una sal del
mismo farmacéuticamente
aceptable.
9. Compuesto según la reivindicación 8, en el
que por lo menos uno de entre R^{2} y R^{5} representa un grupo
hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
10. Compuesto según la reivindicación 9, en el
que R^{2} representa un grupo hidroxilo o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
11. Compuesto según la reivindicación 9, en el
que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
12. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, en el que R^{4} representa un grupo
carboxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
13. Compuesto según la reivindicación 8, en el
que R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{2}
representa un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable
del mismo.
14. Utilización de un compuesto representado por
la fórmula [13] o de una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo,
en la que R^{1}, R^{2}, R^{4}
y R^{5} tienen los mismos significados que en las fórmulas [2] y
[8], para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la
actividad de semaforina para estimular la regeneración de nervios
en un paciente que lo
necesita.
15. Utilización del compuesto según la
reivindicación 14, en la que por lo menos uno de entre R^{2} y
R^{5} representa un grupo hidroxilo en la fórmula [13].
16. Utilización del compuesto según la
reivindicación 15, en la que R^{2} representa un grupo hidroxilo
en la fórmula [13].
17. Utilización del compuesto según la
reivindicación 15, en la que por lo menos uno de entre R^{2} y
R^{5} representa un grupo hidroxilo en la fórmula [13].
18. Utilización del compuesto según cualquiera
de las reivindicaciones 14 a 17, en la que R^{4} representa un
grupo carboxilo en la fórmula [13].
19. Utilización del compuesto según la
reivindicación 14, en la que R^{2} y R^{5} representan un grupo
hidroxilo, R^{1} representa un grupo carboxilo y R^{4}
representa un átomo de hidrógeno en la fórmula [13].
20. Utilización del compuesto según la
reivindicación 14, en la que R^{1} y R^{4} representan un grupo
carboxilo y R^{5} representa un grupo hidroxilo en la fórmula
[13].
21. Compuesto representado por la fórmula
[13]:
en la que R^{1}, R^{2}, R^{4}
y R^{5} tienen los mismos significados que en las fórmulas [2] y
[8], pero en la que por lo menos uno de entre R^{1}, R^{2} y
R^{5} representa un átomo de hidrógeno; o una sal
farmacéuticamente aceptable del
mismo.
22. Compuesto según la reivindicación 21, en el
que por lo menos uno de entre R^{2} y R^{5} representan un
grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
23. Compuesto según la reivindicación 22, en el
que R^{2} representa un grupo hidroxilo o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
\newpage
24. Compuesto según la reivindicación 22, en el
que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
25. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 24, en el que R^{4} representa un grupo
carboxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
26. Compuesto según la reivindicación 21, en el
que R^{2} representa un grupo hidroxilo y R^{4} representa un
grupo carboxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
27. Compuesto según la reivindicación 21, en el
que R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{5}
representa un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable
del mismo.
28. Compuesto representado por la fórmula [14] o
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en la que R^{1}, R^{2},
R^{3}, R^{4} y R^{5} tienen los mismos significados que en las
fórmulas [2] y
[8].
29. Compuesto según la reivindicación 28, en el
que por lo menos uno de entre R^{2} y R^{5} representa un grupo
hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
30. Compuesto según la reivindicación 29, en el
que R^{2} representa un grupo hidroxilo o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
31. Compuesto según la reivindicación 29, en el
que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
32. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 31, en el que R^{4} representa un grupo
carboxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
33. Compuesto según la reivindicación 28, en el
que R^{1} y R^{4} representan un grupo carboxilo y R^{2} y
R^{5} representan un grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo.
34. Compuesto según la reivindicación 28, en el
que R^{1} representa un grupo carboxilo, R^{2} y R^{5}
representan un grupo hidroxilo y R^{3} representa un grupo
metoximetilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
35. Compuesto según la reivindicación 28, en el
que R^{1} representa un grupo carboxilo o un grupo
metoxicarbonilo, R^{4} representa un grupo carboxilo, R^{3}
representa un átomo de hidrógeno y R^{5} representa un grupo
hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
36. Compuesto según la reivindicación 35, en el
que R^{1} representa un grupo carboxilo o un grupo
metoxicarbonilo, R^{4} representa un grupo carboxilo, R^{2} y
R^{3} representan un átomo de hidrógeno y R^{5} representa un
grupo hidroxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
37. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 33, en el que R^{3} está representado por un
grupo de fórmula [3] o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
38. Utilización del compuesto según cualquiera
de las reivindicaciones 28 a 37 o de una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento destinado
a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración
de nervios en un paciente que lo necesita.
39. Compuesto representado por la fórmula [15] o
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en la que R^{4} y R^{5} tienen
los mismos significados que en la fórmula
[8].
40. Compuesto según la reivindicación 39, en el
que R^{5} representa un grupo hidroxilo o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
41. Compuesto según la reivindicación 39 ó 40,
en el que R^{4} representa un grupo carboxilo o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
42. Utilización de un compuesto según cualquiera
de las reivindicaciones 39 a 41 o de una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento destinado
a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración
de nervios en un paciente que lo necesita.
43. Compuesto representado por la fórmula [16] o
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en la que R^{1}, R^{2}, R^{4}
y R^{5} tienen los mismos significados que en la fórmulas [2] y
[8].
44. Compuesto según la reivindicación 43, en el
que por lo menos uno de entre R^{2} y R^{5} representa un átomo
de hidrógeno o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
45. Compuesto según la reivindicación 43, en el
que R^{2} y R^{5} representan un grupo hidroxilo o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
46. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 43 a 45, en el que R^{4} representa un grupo
carboxilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
47. Utilización de un compuesto según cualquiera
de las reivindicaciones 43 a 46 o de una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento destinado
a inhibir la actividad de semaforina para estimular la regeneración
de nervios.
48. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, 14 a 20, 38, 42 ó 47, en la que el
medicamento está destinado a tratar o prevenir enfermedades
neuropáticas y/o enfermedades neurodegenerativas.
49. Utilización según la reivindicación 48, en
la que las enfermedades neuropáticas y/o enfermedades
neurodegenerativas están acompañadas de una lesión de los nervios
raquídeos y/o una lesión de los nervios periféricos.
50. Utilización según la reivindicación 48, en
la que las enfermedades neuropáticas y/o enfermedades
neurodegenerativas son la anomalía olfativa, la neuropatía
traumática, la neuropatía de infarto cerebral, la parálisis de los
nervios faciales, la neuropatía diabética, el glaucoma, la retinitis
pigmentaria, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de
Parkinson, las enfermedades neurodegenerativas, la esclerosis
lateral hipoplástica muscular, la enfermedad de Lou Gehrig, la
corea de Huntington, el infarto cerebral o las enfermedades
neurodegenerativas traumáticas.
51. Procedimiento para producir el compuesto
según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en el que el
procedimiento comprende cultivar un hongo productor del compuesto
según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 que pertenece al
género Penicillium y recoger dicho compuesto del cultivo.
52. Procedimiento para producir el compuesto
según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, en el que el
procedimiento comprende cultivar un hongo productor del compuesto
según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27 que pertenece al
género Penicillium y recoger dicho compuesto del cultivo.
53. Procedimiento para producir el compuesto
según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 37, en el que el
procedimiento comprende cultivar un hongo productor del compuesto
según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 37 que pertenece al
género Penicillium y recoger dicho compuesto del cultivo.
54. Procedimiento para producir el compuesto
según cualquiera de las reivindicaciones 39 a 41, en el que el
procedimiento comprende cultivar un hongo productor del compuesto
según cualquiera de las reivindicaciones 39 a 41 que pertenece al
género Penicillium y recoger dicho compuesto del cultivo.
55. Procedimiento para producir el compuesto
según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 46, en el que el
procedimiento comprende cultivar un hongo productor del compuesto
según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 46 que pertenece al
género Penicillium y recoger dicho compuesto del cultivo.
56. Procedimiento para producir un compuesto de
fórmula [12]
en el que R^{1}, R^{2}, R^{4}
y R^{5} tienen los mismos significados que en las fórmulas [2] y
[8], o una sal farmacéuticamente aceptable de los
mismos;
en el que el procedimiento comprende cultivar el
hongo productor de compuesto Penicillium sp.
SPF-3059 y recoger dicho compuesto del cultivo.
57. Procedimiento para producir un compuesto de
fórmula [13]
en la que R^{1}, R^{2}, R^{4}
y R^{5} tienen los mismos significados que en las fórmulas [2] y
[8], o una sal farmacéuticamente aceptable de los
mismos;
en el que el procedimiento comprende cultivar el
hongo productor de compuesto Penicillium sp.
SPF-3059 y recoger dicho compuesto del cultivo.
58. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 51 a 55, en el que el hongo productor que pertenece
al género Penicillium es el sp. Penicillium
SPF-3059.
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