CN103957924A

CN103957924A - 促红细胞生成素衍生肽及其用途

Info

Publication number: CN103957924A
Application number: CN201280058270.7A
Authority: CN
Inventors: 金厚廷
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-09-27
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2014-07-30
Also published as: US20140378378A1; JP2014528952A; EP2762149A2; WO2013048116A2; EP2762149A4; WO2013048116A3; KR101148191B1

Abstract

本发明提供对防止细胞损伤有效的具有序列表第1序列的氨基酸序列的肽，以及包含所述肽作为有效成分的用于防止细胞损伤的药物组合物。根据本发明的肽与以往的天然人类促红细胞生成素相比，不仅在各种细胞的保护活性方面具有显著优异的生理活性，而且与天然人类促红细胞生成素相比具有明显简单的结构，因此具有容易通过组织-血液屏障，生产费用少的经济上的优点。因此，包含根据本发明的肽作为活性成分的药物组合物对预防或治疗脑卒中、神经类机械性损伤或缺血性损伤、心肌梗塞、糖尿病、心力衰竭、末梢血管障碍、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经症、青光眼、痴呆、帕金森氏病、葛雷克氏症等神经退行性疾病，急性及慢性肾功能障碍等有效。

Description

促红细胞生成素衍生肽及其用途

技术领域

本发明涉及促红细胞生成素衍生肽及包含该肽的药物组合物。

背景技术

在生存期间，人体暴露于内部或外部的不间断的刺激和有害要素中，个体通过各种机制来应对该有害要素，从而保护自己的身体。这种有害要素有机械化学性危险要素、缺氧症、感染等多种多样的要素，为了在这些有害要素中保护身体，在个体、甚至小至细胞单位中发现了防御有害要素的各种机制。通过这种机制分泌的多种多样的细胞因子(cell factor)，不仅防御初期的外部有害要素，而且防御由完成防御机制、结束寿命的细胞生产的二次内部有害物质引起的化学、免疫学损伤，从而起到防止细胞坏死或细胞凋亡(necrosis orapoptosis)、防止初期损伤部位的扩散、以及诱导新细胞的出现、直至新的健康组织的再生的作用。

促红细胞生成素(EPO)作为由熟知的165个氨基酸构成的34kDa的造血细胞因子(hematopoietic cytokine)，应对身体内的缺氧症(hypoxia)，由肾脏生成，通过刺激骨髓内的红细胞前体细胞(precursor of red blood cell)来诱发红细胞的增加。因此，重组人类促红细胞生成素(rhEPO)可以作为治疗由慢性肾功能衰竭引起的贫血、由手术引起的贫血、由癌或抗癌治疗引起的贫血等的贫血的药剂来使用(非专利文献1)。最近，除治疗贫血之外，EPO在神经类机械性损伤或缺血性损伤中表现出令人注目的细胞、组织保护能力(非专利文献2)，在急性心肌梗塞动物模型中也表现出降低50％左右的组织损伤的效果，这被认为是通过抑制抗细胞凋亡(antiapoptosis)而产生(非专利文献3、4)。

在这种EPO的贫血治疗效果及细胞组织保护能力的反面，已经发现施用EPO时，可能发生由红细胞的增加引起的血液循环障碍及血小板活性度的增加等(非专利文献5、6)，从而出现由这种副作用引起的EPO的组织保护能力丧失的问题。因此，正在进行关于不引起红细胞增加或不刺激血小板的活性度并保持组织保护能力的去唾液酸促红细胞生成素(asialoEPO)、氨甲酰化促红细胞生成素(carbamylated EPO)等利用促红细胞生成素的衍生物(derivatives)或促红细胞生成素的部分结构的肽(peptide)的研究(非专利文献7～9)。

如上述说明，已知促红细胞生成素执行红细胞增加引起的贫血治疗，神经类细胞、组织保护能力，心肌组织损伤保护能力等非常重要的功能。如此，已知虽然EPO是活性非常高的蛋白质，但生产费用非常高；从末梢血管内施用EPO时，因部分目标器官中存在的组织-血管屏障(tissue-blood barrier)等而无法将其输送至目标器官，从而在药物传递方面有困难(非专利文献10～12)。因此，需要生产费用低并顺利输送至生物体组织的有效的人类EPO替代物质。

[现有技术文献]

非专利文献

1.Jelkmann,W.促红细胞生成素的生物学(Biology of erythropoietin)(1994)Clin.Invest.72,S3-S10；

2.Brines,M.L.et al.促红细胞生成素穿过血脑屏障来保护实验性脑损伤(Erythropoietin cresses the blood brain barrier to protect against experimentalbrain injury)(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97,10526-10531；

3.Moon C.et al.大鼠中促红细胞生成素降低心肌梗塞以及冠状动脉结扎后左心室功能减退(Erythropoietin reduces myocardial infarction and leftventricular functional decline after coronary artery ligation in rats)(2003)Proc NatlAcad Sci U S A.2003September30；100(20):11612-11617；

4.Siren et al.在脑缺血和代谢应激后促红细胞生成素阻碍神经元细胞凋亡(Erythropoietin prevents neuronal apoptosis after cerebral ischemia andmetabolic stress)(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98,4044-4049；

5.Wiessner,C.et al.在过度表达促红细胞生成素的聚球蛋白小鼠中增大的脑梗塞体积(Increased cerebral infarct volumes in polyglobulic miceoverexpressing erythropoietin)(2001)J.Cereb.Blood Flow Metab.21,857-864.pmid:11435798；

6.Wolf,R.F.,在狗中施用促红细胞生成素来提高血小板的产量和反应(Erythropoietin administration increases production and reactivity of platelets indogs)(1997)Thromb.Haemostasis78,1505-1509.pmid:9423803；

7.Imai,N.et al.,去唾液酸促红细胞生成素的物理化学和生物特性(在人类促红细胞生成素的体外生物活性表达中唾液酸的抑制作用)(Physicochemical and biological characterization of asialoerythropoietin.(Suppressive effects of sialic acid in the expression of biological activity ofhuman erythropoietin in vitro))(1990)Eur.J.Biochem.194,457-462；

8.Leist M et al.,非红细胞生成的具有组织保护性的促红细胞生成素衍生物(Derivatives of erythropoietin that are tissue protective but not erythropoietic).Science(New York,NY2004；305:239-42；

9.Brines M,et al.,衍生自促红细胞生成素的三级结构的非红细胞生成的组织保护性肽(Nonerythropoietic,tissue-protective peptides derived from thetertiary structure of erythropoietin).Proc Natl Acad Sci USA.2008；105:10925-30；

10.Marti et al.,在人类酒中检测促红细胞生成素：内源性促红细胞生成素在大脑中的生成(Detection of erythropoietin in human liquor:intrinsicerythropoietin production in the brain),1997,Kidney Int.51:416-8；

11.Juul et al.,持续性CNS损伤的新生儿脑髓液中的促红细胞生成素(Erythropoietin in the cerebrospinal fluid of neonates who sustained CNS injury),1999,Pediatr,Res.46:543-547；

12.Buemi et al.静脉重组促红细胞生成素不会导致脑髓液中促红细胞生成素浓度的提高(Intravenous recombinant erythropoietin does not lead to increasein cerebrospinal fluid reythropoietin concentration),2000,Nephrol.Dial.Transplant.15:422-433。

发明内容

技术课题

由此，本发明人为了制备不仅具有与天然人类EPO相同的效果的同时比天然EPO的生产费用低，而且容易透过身体内存在的组织-血管屏障(tissue-blood barrier)的肽，制备及筛选了多种人类EPO衍生肽。其结果是，从多种肽候选物质中选出了不仅与天然EPO相比生理活性显著优异，而且容易透过组织-血管屏障、生产费用低的经济型肽，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的是提供不仅与EPO相比具有优异的生理活性，而且容易透过组织-血管屏障，能够经济性生产的肽。

本发明的另一目的是提供用于防止包含上述肽的细胞损伤药物组合物。

解决课题方法

为了实现上述目的，本发明的一方面提供对防止细胞损伤有效的肽，其具有序列表第1序列的氨基酸序列。

本发明的另一方面提供用于防止细胞损伤的药物组合物，其包含对防止细胞损伤有效的上述肽作为有效成分。

以下，更详细说明本发明。

在本发明中使用的全部技术用语，如果没有另行定义，则其使用的含义与本发明的相关领域中普通技术人员通常理解的含义相同。此外，在本说明书中虽然记载了优选的方法或试样，但与其类似或同等的方法或试样也包括在本发明的范畴内。本发明中以参考文献记载的全部刊物的内容整体以参考并入本发明。

本发明人通过制备及筛选多种人类EPO衍生肽，找到了与天然人类EPO相比具有显著优异生理活性的肽，由于该肽与天然人类EPO相比具有明显简单的结构，因此容易通过组织-血管屏障(tissue-blood barrier)，生产费用低，具有经济性。

因此，本发明的一方面提供由下述通式I表示的具有序列表第1序列的氨基酸序列的对防止细胞损伤有效的肽。

[通式I]

Ile Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Leu Met

表示根据本发明的肽的上述通式I是为便于表示本发明的肽结构而记载，本领域的技术人员应该理解，其变形也属于本发明。例如，对于本领域的技术人员来说显而易见的是，从上述通式I中EPO衍生序列的变形体也属于本发明的范围。

根据本发明的一个实施方式，本发明的肽的N-末端或C-末端可以进一步结合选自由乙酰基、芴甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基、聚乙二醇(PEG)及氨基酸组成的组的保护基。

根据本发明的另一实施方式，本发明的肽的N-末端或C-末端改性为羟基(-OH)或氨基(-NH₂)，更优选的是改性为羟基。

上述说明的氨基酸的改性能够起到大大改善本发明的肽的稳定性的作用。本发明中的用语“稳定性”是指体内(in vivo)稳定性及存储稳定性(例如，常温存储稳定性)。上述保护基能够起到从生物体内蛋白质切割酶的攻击保护本发明的肽的作用。

本发明中用语“肽”是指氨基酸通过肽键相互结合而形成的线形分子。本发明的肽可以根据本技术领域公知的合成方法，例如固相合成技术(solid-phasesynthesis technique)来制备(Merrifield,J.Amer.Chem.soc.85:2149-54(1963)；Stewart et al.,固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis),2nd,ed.,Pierce Chem.Co.:Rockford,111(1984))。

上述肽衍生自人类EPO，发现其本身与天然人类EPO相比具有显著优异的神经细胞保护效果、心肌细胞保护效果、视网膜细胞保护效果、及胰腺β细胞保护效果(实验例1-4)。

因此，在另一方面中本发明提供包含上述根据本发明的肽的用于预防或治疗细胞、组织或器官损伤的药物组合物。

此外，根据本发明的一个实施方式，提供包含药用有效量的上述根据本发明的肽及可药用的载体的用于预防或治疗细胞、组织或器官损伤的药物组合物。

在本发明中，“损伤”是指在神经学或精神学症状、眼疾病、心血管疾病、血压疾病、呼吸系统疾病、肾脏、尿道及生殖器疾病、骨疾病、皮肤疾病、胃肠疾病、以及内分泌及代谢障碍中，根据本发明的肽具有预防或治疗学效果的任意人类疾病。特别是，这样的状态及疾病包含对兴奋组织，如中枢神经类、末梢神经类、心脏细胞或视网膜组织的可兴奋组织(excitable tissue)，如大脑/脊髓、心脏或视网膜/眼有不良影响的缺氧症状态。

能够将氧用于神经组织的可能性的减少导致应激、损伤及最终的神经细胞死亡，可以用本发明的肽来治疗。一般而言，被称为缺氧症及/或缺血的状态包括脑卒中、血管堵塞、出生前或后的氧缺乏、窒息、气道阻塞、哮喘、溺死之前、一氧化碳中毒、烟雾吸入、包含手术及辐射治疗的外伤、窒息、癫痫、低血糖(症)、慢性肺循环障碍疾病、肺气肿、成人呼吸窘迫综合症、低血压休克、败血性休克、超过敏反应休克、胰岛素休克、镰状红细胞病、心率失常、氮麻醉、以及心脏-肺移植引起的神经学缺陷，但不局限于此。因此，根据本发明的肽能够用于治疗或预防在多种状态及环境中由缺氧状态引起的兴奋组织(excitable tissue)的缺乏。作为这种疾病或状态的例子有缺血症(心脏动脉疾病、心肌梗塞症、心绞痛、由先天性心脏疾病引起的瓣膜性心肌病、变异型心绞痛、心脏破裂、脉管炎、心率失常、心肌炎、钝器外伤、穿透外伤、如可卡因的毒素)、高血压、减压病、纤维肌肉增生症、动脉瘤、哮喘、慢性支气管炎、肺气肿、aviation occlusion、肺栓塞症、肺血栓症、特发性肺纤维症、囊性纤维症、肺炎、肉样瘤症、1型及2型糖尿病，骨减少症、骨髓炎、无血管坏死、外伤、佩吉特氏病、脱发症、白斑正、糖尿病性溃疡、烧伤、末梢血管疾病、红斑狼疮、肖格伦综合症、风湿性关节炎、肾小球肾炎、脉管炎、视觉神经炎、视网膜脱落，颞动脉炎、视网膜缺血、黄斑变性、视网膜脱落、色素性视网膜炎、动脉硬化、视网膜病变、高血压性视网膜病变、视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、糖尿病性视网膜病变、窒息、缺血、子痫症、缺血性脑卒中、出血性脑卒中、脑外伤、脊椎外伤、癫痫、痉挛、慢性发作障碍、慢性疲劳综合症、急性及慢性低渗透压及高渗透压综合症、AIDS、痴呆、电死、窒息、多发性硬化症、阿尔茨海默氏病、大脑性麻痹、脑功能老化、记忆丧失、ALS、癫痫发作、亚急性硬化性脑炎、脑炎、脑膜炎、硬脑膜下血肿、尼古丁中毒、药物滥用及戒断、强迫性精神障碍、情绪障碍、焦虑障碍、忧郁症、自闭症、注意力缺乏、多动障碍、认知功能障碍、椎管狭窄症、横断脊髓炎、格林-巴利综合症、外伤、神经肌肉压迫、肿瘤性压迫、中暑、结节性硬化症、威尔逊氏病、大脑及进行性核上麻痹、关岛病、路易体痴呆、亨廷顿氏病、肌肉紧张退行性萎缩、弗里德赖希共济失调及其他共济失调、图雷特综合症、克雅氏病(CJD)、耳鸣、美尼尔氏综合症、听力损失、外伤性损伤、糖尿病性肾病、过敏性紫癜、重症肌无力症、皮肌炎、多肌炎、肌肉疾病、中暑、横纹肌溶解症、线粒体病、坏死性肌膜炎、由药物引起的继发性阳痿、病毒/细菌/寄生虫性感染、肝硬化、脂肪肝、肝中的浸润/代谢疾病、缺血性大肠疾病、炎症性大肠疾病、坏死性胃肠炎、器官移植中的供体与受体的治疗、不孕症(血管性、自身免疫性、子宫异常、着床障碍)、内分泌腺功能亢进、或内分泌腺功能减退，但不局限于此。

在上述根据本发明的药物组合物中，由于作为活性成分的根据本发明的肽具有心肌细胞保护效果、神经细胞保护效果、视网膜细胞保护效果、及胰腺β细胞保护效果，因此通过防止细胞损伤，对预防或治疗细胞、组织及器官损伤有效。此外，由于这种效果，其能够用于预防或治疗包含脑卒中、神经类机械性损伤或缺血性损伤、心肌梗塞、视网膜损伤及糖尿病在内的可以引起细胞、组织或器官的损伤的上述列举的多种疾病，优选用于保护或者修复与下列有关的功能性损伤：脑卒中障碍、多发性硬化症、癫痫、低血压、心脏麻痹、缺血症、心肌梗塞、炎症、与年龄有关的认知能力的损失、辐射损伤、大脑麻痹、神经退行性疾病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、利氏(Leigh)病、AIDS性痴呆、记忆障碍、肌萎缩性侧索硬化症、酒精中毒、情绪障碍、焦虑障碍、注意力缺乏障碍、自闭症、克雅氏病、大脑或脊髓外伤或缺血症、心脑搭桥、慢性心力衰竭、由老化引起的视力减退、糖尿病、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾衰竭、青光眼、视网膜缺血或视网膜外伤。

本发明中，用语“药用有效量”是指上述肽在生物体内实现效果的充分的量。

上述药物组合物可以以本技术领域公知的通常的药物剂型进行制剂化。上述药物组合物可以是口服或非口服、优选非口服施用，非口服施用时，可以以静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、局部施用、经皮施用等方式施用。因此，上述药物组合物可以包含口服施用制剂、注射剂、栓剂、经皮施用制剂及经鼻施用制剂，还可以以不局限于此的任意的剂型进行制剂化后施用。

以上述各剂型进行制剂化时，可以添加在制备各剂型时所需的可药用的载体或添加剂来制备。作为代表，以注射剂进行制剂化时，可以根据本技术领域公知的通常的注射剂制备方法来制备。根据一个实施方式，根据上述本发明的注射剂通常可以将药物溶于蒸馏水中而作为注射剂。根据本发明的注射剂可以是分散于灭菌介质的形态以便能够在给患者施用时直接使用，还可以是在施用时添加注射用蒸馏水分散成合适的浓度后进行施用的形态。

以口服用剂型进行制剂化时，作为上述载体，可以从稀释剂、润滑剂、结合剂、崩解剂、甜味剂、稳定剂及防腐剂中选择1种以上使用，作为添加剂，可以从香料、维生素类及抗氧化剂中选择1种以上使用。上述载体和添加剂只要是可药用的则都可以使用，具体地，作为稀释剂，优选为乳糖、玉米淀粉、大豆油、微晶纤维素或甘露醇；作为润滑剂，优选为硬脂酸镁或滑石；作为结合剂，优选为聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素。此外，作为崩解剂，优选为羧甲基纤维素钙、羧甲基淀粉钠、波拉克林钾或交聚维酮；作为甜味剂，优选为白糖、果糖、山梨醇或天冬甜素(aspartame)；作为稳定剂，优选为羧甲基纤维素钠、β-环糊精、白蜡或黄原胶；作为防腐剂，优选为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸钾。

上述根据本发明的药物组合物的施用量可以根据如制剂化方法、施用方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、施用时间、施用途径、排泄速度、反应敏感度的要素而多样地确定，以成人标准男性为基准，可以将本发明的肽以0.001～100μg/天的范围来施用。

发明效果

如上述说明，根据本发明的肽与以往的天然人类EPO相比，不仅在各种细胞的保护活性方面具有显著优异的生理活性，而且与天然人类EPO相比具有明显简单的结构，因此具有容易通过组织-血管屏障(tissue-blood barrier)、生产费用低的经济性的优点。因此，包含根据本发明的肽作为活性成分的药物组合物对预防或治疗与脑卒中、神经类的机械性损伤或缺血性损伤、心肌梗塞、视网膜损伤、糖尿病等细胞损伤有关的各种疾病有效。

附图说明

图1是表示以各种浓度的EPO及MKX-2处理心肌细胞后，培养72小时，然后通过MTT检测法比较细胞生存率的结果的图表。

EPO图表中下面没有*标记是因为与基准点0.1nM比较时没有统计上的意义，1000nM中的3个位置的*标记中上部**是指与MKX0.1nM相比，MKX1000nM具有统计上的意义，中间是指在MKX1000nM与EPO1000nM之间在细胞保护效果方面存在差异，下部**是指与EPO0.1nM相比，EPO1000nM具有统计上的意义。

图2是表示以各种浓度的EPO及MKX-2对脑神经细胞进行处理后，培养72小时，然后通过MTT检测法比较的细胞生存率的结果的图表。

图3是表示以各种浓度的EPO及MKX-2对视网膜神经细胞进行处理后，培养72小时，然后通过MTT检测法比较细胞生存率的结果的图表。

图4a是表示以各浓度的MKX-2对β细胞HIT-T15进行预处理后，用H₂O₂处理2小时，然后通过MTT检测法比较细胞生存率的结果的图表。

图4b是表示以各浓度的MKX-2对β细胞HIT-T15进行预处理后，用H₂O₂处理4小时，然后通过MTT检测法比较细胞生存率的结果的图表。

图5a是表示以各浓度的MKX-2对β细胞INS-1进行预处理后，用H₂O₂处理2小时，然后通过MTT检测法比较细胞生存率的结果的图表。

图5b是表示以各浓度的MKX-2对β细胞INS-1进行预处理后，用H₂O₂处理4小时，然后通过MTT检测法比较细胞生存率的结果的图表。

图6是对诱发脑梗塞的Sprague-Dawley白鼠模型施用试验药物后，分离大脑并将沿冠状面的切片进行TTC染色后拍摄的照片。

图7是示出对诱发脑梗塞的Spague-Dawley白鼠模型施用试验药物后，分离大脑并将沿冠状面的切片进行TTC染色后测量的脑梗塞面积的结果的图表。

图8是示出对来自Wistar鼠的培养的心肌细胞进行TUNEL检测的结果，计数用DAPI染色的细胞和显示TUNEL阳性(TUNEL positive)的细胞的个数并计算其比例的结果的图表。

具体实施方式

以下，依据下述实施例更具体说明本发明。然而，这些实施例只是用于帮助理解本发明，在任何情况下本发明的范围也不会受到这些实施例的限制。

实施例

1.Ile Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Leu Met的合成

根据以往公知的固相合成技术(solid-phase synthesis technique)合成了序列表1的Ile Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu LeuMet肽。

将上述合成的肽命名为MKX-2。

实验例

实验方法及材料

1.心肌细胞实验方法及材料

A.心肌细胞的分离及培养

准备出生后8周龄的威斯特(Wister)鼠后，对成体鼠注射氯胺酮和戊巴比妥使其死亡后，快速分离心脏。利用大动脉向逆方向、心脏方向灌注预先加热至34～37度的无钙重碳酸盐缓冲(Ca free Krebs-Henseleit buffer)溶液(KHB)5分钟。然后，将KHB溶液更换成含有0.15％II级胶原酶(Cooper Biomedical，Malvern，PA)的汉克平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution(HBSS：GIBCO，格兰德艾兰(Grand Island)，NY))灌注30～40分钟左右。然后，用细胞培养液(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)反复清洗2次。分离心室(ventricle)和心房(atria)，将心室组织彻底剁碎后，在充满预先加热至34～37度的含有II级胶原酶的培养基(DMEM)的振动器中(shaker)充分搅拌5分钟左右。通过过滤器过滤掉未溶解的结缔组织，用培养介质(DMEM)溶液将含有胶原酶的溶液反复清洗2次。以10g的速度轻轻地进行2分钟的离心分离后，将上清液分离并去除后，用含有1％牛胎儿血清(FBS；西格玛化学(SigmaChemical)，圣路易斯，MO)的培养介质(DMEM)溶液将细胞成分清洗3次。然后，将获得的细胞在培养介质(DMEM)、10％的FBS、10mM的HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid，HEPES)，GIBCO Laboratories，格兰德艾兰，NY)、2mM的L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素(100IU/mL，GIBCO)中稳定60分钟。

然后，将细胞以20×10³细胞/cm²的密度分注至6孔培养板中，向培养液中添加3天溴脱氧尿苷(BrdU，10uM，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))以防止成纤维细胞和前体细胞的增殖(Lokuta等人，1994；Miragoli等人，2006)。为了之后的实验，在95％的O²、5％的CO²、37度的培养器中培养了细胞。

B.MTT检测

将细胞以2×10⁴细胞(cells)/孔(well)的密度、每孔200ul接种(seeding)到96孔培养板中。此时，将细胞融合度(cell confluence)设定为约70～80％。24小时后当细胞实现稳定化后，利用26或28规格(gauze)的针(needle)去除孔内已有的介质。向各个孔中放入200ul没有血清和营养物质的FBS并将其分成EPO治疗组和MKX-2治疗组后，将EPO及MKX-2治疗组根据0、0.1、1、10、100、100nM的用量分成实验组，在低氧培养(hypoxic condition)条件下分别对各用量的实验组进行72小时的药物治疗后，以MTT检测法比较了细胞生存率。EPO使用了艾泊伦(Eporon)注射液(东亚制药，韩国)。对于根据各浓度的所有实验组，各进行了7个孔的实验。

经过既定处理时间后，以1mg/ml的浓度、每孔100ul放入溶解于PBS(磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline))后用0.22um的膜滤器灭菌过滤的MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴，Sigma，M2128)。此时，将MTT试剂包裹于箔纸中阻断光线进行使用。在培养器中将放入MTT试剂的孔培养板反应2小时。培养结束后，去除介质。去除介质时，小心不让细胞随介质一同带出。

向各孔放入了200ul的DMSO。包裹于箔纸中用振动器轻轻振动约10分钟的同时对其进行搅拌以便甲臜(formazan)晶体能够充分溶解。用多功能移液管(160ul)对其进行2、3次左右的吹打(pipetting)来粉碎甲臜。用ELISA读取器(reader)在570nm处测量O.D.值并进行了定量分析。

2.神经细胞实验方法及材料

A.神经细胞分离及培养

(1)培养板涂布

向将要培养细胞的培养板中放入多聚-L-赖氨酸(sigma P4707)，放入培养器中保管1小时。利用移液管将多聚-L-赖氨酸吸取后，用灭菌蒸馏水清洗3次。将涂布的培养板在无尘无菌操作台上充分干燥2小时以上，然后包裹于保鲜膜中进行冷藏保管。

(2)介质制备

1)胎儿清洗介质或HBSS(每只200ml)

将HBSS(GIBCO，14170-112,180ml)及20ml的10％青霉素/链霉素(GIBCO，15140-122)混合并准备。

2)胰蛋白酶溶液

将0.125％的胰蛋白酶-EDTA(3ml)、HBSS(12ml)、1.5mg的0.1mg/mlDNase I(sigma，脱氧核糖核酸酶I(deoxyribonuclease I)，D5025)混合后，通过注射器进行了过滤。

3)基本介质(basal media，共1L)

将1袋DMEM(hg，GIBCO，12100-046)、10ml的1％P/S(青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)，GIBCO，15140-122)、3.7g的NaHCO₃(碳酸氢钠(sodium bicarbonate)，sigma，S5761)与0.8L的蒸馏水混合后，通过注射器进行了过滤。

4)培养介质(共1L)

将900mL的基本介质(basal media)、100mL的10％FBS、500ul的胰岛素(sigma，I9278-5ml，10mg/ml)、100ul的70mM对氨基苯甲酸(PABA：N-乙酰转移酶抑制剂，A9878)混合后，通过注射器进行了过滤。

5)清洗介质(每只20ml)

将DMEM(hg，GIBCO，12100-046)、20ml的1％P/S、2mg的0.1mg/mlDNase I混合后，通过注射器进行了过滤。

(3)神经细胞分离及培养

将妊娠16天的大鼠的颈椎脱臼、牺牲实验动物后，将实验动物的腹部以U字形切开，将孕有胎儿(fetus)的子宫拿出。然后，从子宫中将胎儿取出，将其放入胎儿清洗介质中，进行3次清洗。只将胎儿的头部切下并放入清洗介质、再次清洗3次后，将头盖骨打开分离大脑。利用刀将大脑的皮质部分切开获得组织后，将组织彻底剁碎并收集至预先准备好的胎儿清洗介质中。在进行400g、4分钟的离心分离后，向去除上清液而获得的团块(pellet)中放入0.025％的胰蛋白酶和10ml的DNase I并破坏团块。此时，在培养器中保管了15分钟。

然后，再次添加15ml的培养介质后，进行400g、4分钟的离心分离并将上清液去除后，用每次6ml的清洗介质(添加DNase I)清洗获得的团块2次后，再次进行400g、4分钟的离心分离。在离心分离后，再次去除上清液后，向获得的团块中放入10ml的培养介质并与10ul的台盼蓝混合后，用血细胞计(hemocytometer)进行了细胞计数(cell counting)。将细胞以每孔500ul接种(seeding)至准备好的24孔培养板中并培养48小时。然后，为了稳定化而去除培养液后，向各孔中放入新的培养介质和5uM的Ara-c(阿糖胞苷(cytosinearabinoside)，sigma，C1768)后培养14小时，24小时后再次去除培养液后，再次放入新的培养介质，并且为了准备的实验，将其在95％的O₂、5％的CO₂、37度的培养器中进行培养。

B.MTT检测

将细胞以2×10⁴细胞/孔的密度、每孔200ul接种(seeding)至96孔培养板。此时，将细胞融合度设定为约70～80％。24小时后当细胞实现稳定化时，利用26或28规格的针去除孔内已有的介质。放入200ul没有血清和营养物质的FBS并将其分成EPO治疗组和MKX-2治疗组后，对EPO治疗组再次进行血清去除(血清饥饿(serum starvation))后，将其分成EPO非治疗组、1IU/ml治疗组、10IU/ml治疗组3个组，再次将各治疗组分成用作为神经毒性物质的0.1％的2-巯基乙醇处理18小时的组和非处理组并进行了比较。

同样地，对MKX-2治疗组也进行血清去除后，将其分成MKX-2非治疗组、1.2ng/ml治疗组、12ng/ml治疗组3个组，再次将各个组分成由作为神经毒性物质的0.1％的2-巯基乙醇处理18小时的组和非处理组并进行了比较。此外，将在正常培养条件下培养的组设定为阴性对照组，进行了它们之间的比较。在各个实验条件下都进行了6个孔的实验，在统计分析中使用了平均及标准偏差。EPO和MKX-2治疗组在药物治疗环境中分别培养了72小时。对EPO使用了艾泊伦(Eporon)注射液(东亚制药，韩国)。经过既定处理时间后，以1mg/ml的浓度、每孔100ul放入溶解于PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)后用0.22um的膜滤器灭菌过滤的MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴，Sigma，M2128)。此时，将MTT试剂包裹于箔纸中阻断光线进行使用。在培养器中将放入MTT试剂的孔培养板反应2小时。培养结束后，去除介质。去除介质时，小心不让细胞随介质一同带出。然后，向各孔(well)放入了200ul的DMSO。包裹于箔纸中用振动器轻轻振动约10分钟的同时对其进行搅拌以便甲臜晶体能够充分溶解。用多功能移液管(160ul)对其进行2、3次左右的吹打来粉碎甲臜。用ELISA读取器(reader)在570nm处测量O.D.值并进行了定量分析。

3.视网膜神经细胞实验方法及材料

A.视网膜神经细胞分离和培养

(1)培养板涂布

向将要培养细胞的培养板中放入多聚-D-赖氨酸(sigma P7280)，放入培养器中保管2小时。利用移液管将多聚-L-赖氨酸吸取后，用灭菌蒸馏水清洗3次。将涂布的培养板在无尘无菌操作台上充分干燥2小时以上后，包裹于保鲜膜中进行冷藏保管。

(2)介质制备

1)溶液1

将如下组成的介质(5.4mM KCl、116mM NaCl、0.096mM NaH₂PO₄2H₂O、19.5mM D-葡萄糖、0.15mM MgSO₄、23.8mM NaHCO₃、3g/L牛血清白蛋白、10mg/L酚红)和10％的青霉素/链霉素(GIBCO，15140-122)混合并准备。

2)胰蛋白酶溶液

将0.125％的胰蛋白酶-EDTA(3ml)、溶液1(12ml)、1.5mg0.1mg/ml的DNase I(sigma，脱氧核糖核酸酶I(deoxyribonuclease I)，D₅0₂₅)混合后，通过注射器进行了过滤。

3)溶液1的停止液(stop solution)

向溶液1中加入DNAse(10000U/7.5ml牛胰脂酶II型)、大豆胰蛋白酶抑制剂(1-S型、5mg/7.5ml)、0.19mM的MgSO₄而制备。

4)最少必需介质(共1L)

将900mL的基本介质(basal media)、100mL10％的FBS、91mg/L的硫酸庆大霉素、2.3mg/L的两性霉素B、5mM葡萄糖混合后，通过注射器进行了过滤。

(3)视网膜细胞分离及培养

摘除出生后3天的大鼠的眼球，将视网膜取出并放入溶液1中。将视网膜组织在37度的胰蛋白酶中处理10分钟后，进行180g、5分钟的离心分离。离心分离后，将扔掉上清液后收集的组织放入停止液(stop solution)中。用移液管将团聚的组织分散后，再次进行180g、5分钟的离心分离。将分离的细胞以1×10⁶细胞/mL与10％的FBS-MEM进行混合。将细胞以每孔100ul接种到准备的96孔培养板中并培养24小时。

然后，为了稳定化而去除培养液后，分别放入新的培养介质和5uM的Ara-c(阿糖胞苷，sigma，C1768)后培养48小时，48小时后再次去除培养液后，放入新的培养介质，并且为了准备的实验，将其在95％的O₂、5％的CO₂、37度的培养器中进行培养。再次，48小时后去除培养液后，为了准备的实验，将其在95％的O₂、5％的CO₂、37度的培养器中进行培养。

B.MTT检测

将细胞以2×10⁴细胞/孔的密度、每孔200ul接种至96孔培养板。此时，将细胞融合度设定为约70～80％。24小时后当细胞实现稳定化时，利用26或28规格的针去除孔内已有的介质。放入200ul没有血清和营养物质的FBS并将其分成EPO治疗组和MKX-2治疗组后，将EPO治疗组和MKX-2治疗组根据0、0.1、1、10、100、1000nM的用量分成实验组，各用量实验组在药物治疗环境中培养72小时，通过含有荧光物质的MTT检测，利用荧光分析仪对生存的视网膜神经进行了定量分析。对EPO使用了艾泊伦(Eporon)注射液(东亚制药，韩国)。在根据各浓度的细胞组中，对两组各进行了7个孔的实验。经过既定处理时间后，以1mg/ml的浓度、每孔100ul放入溶解于PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)后用0.22um的膜滤器灭菌过滤的MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴，Sigma，M2128)。此时，将MTT试剂包裹于箔纸中阻断光线进行使用。在培养器中将放入MTT试剂的孔培养板反应2小时。

培养结束后，去除介质。去除介质时，小心不让细胞随介质一同带出。然后，向各孔放入了200ul的DMSO。然后，包裹于箔纸中用振动器轻轻振动约10分钟的同时对其进行搅拌以便甲臜晶体能够充分溶解。用多功能移液管(160ul)对其进行2、3次左右的吹打来粉碎甲臜。

然后，用ELISA读取器(reader)在570nm处测量O.D.值并进行了定量分析。

4.胰腺β细胞实验方法及材料

A.胰岛细胞培养

使用了作为源自仓鼠的胰岛素分泌细胞株的HIT-T15细胞(75～77次传代)和作为源自大鼠的胰岛素分泌细胞株的INS-1细胞(18～20次传代)。在用于HIT-T15细胞培养的介质中使用了向RPMI-1640中添加10％的FBS以及100units/ml的青霉素、100g/ml的链霉素的介质。在用于INS-1细胞培养的介质中使用了向RPMI-1640中混合10％的FBS以及1mM的丙酮酸盐、10mM的HEPES、50mM的2-巯基乙醇、100units/ml的青霉素、100g/ml的链霉素的介质。在保持95％的湿度的37℃、5％的CO₂环境中培养了两种β细胞株。当细胞融合度(confluence)到达约70～80％时，用PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)清洗并用0.05％的胰蛋白酶-EDTA进行处理，进行了继代培养。

B.MTT检测

将β细胞株以1×10⁵细胞/孔的密度分注至24孔(well)培养板中，进行24小时培养使细胞融合度到达约70～80％。24小时后，去除已有介质，将其更换为含有0.5％FBS的RPMI-1640介质，然后进行6小时培养，使其处于增殖和分化停止状态。在用H₂O₂处理的1小时前，将MKX-2溶解于DMSO，以0、0.12、1.2、12、60、120ng/ml的浓度进行了预处理。对对照组用0.001％的DMSO进行处理来比较。在MKX-2处理1小时后，进行2小时或4小时的H₂O₂处理并进行反应。向各孔(well)中添加溶解于PBS缓冲液的MTT(5mg/ml)溶液并反应2～3小时，然后，以不使形成于孔底部的甲臜分散的方式去除上清液，添加250ul的DMSO使其溶解，使用ELISA读取器(reader)(MolecularDevices Exax，森尼韦尔，CA)在540nm(ref.650nm)处测量了吸光度。定量分析吸光度值并求得了相对细胞生长抑制率。

5.脑梗塞动物实验方法及材料

A.实验动物及脑梗塞实验模型

在本实验中，将Spague-Dawley(SD)白鼠用于实验，实验动物的重量为280g至330g，全部购自Koatech Inc.(首尔，韩国)。使用的白鼠的数量全部为39只，13只用作对照组，在剩余的26只中，13只用于MKX-2治疗组，13只用于促红细胞生成素(EPO)组。

为了诱发脑梗塞，使用了将左侧中脑动脉暂时闭塞后再灌注的方法，并且利用了对小泉(Koizumi)方法进行变形而创造的动脉内线栓法(intraluminalfilament technique)。用异氟烷(isoflurane)(3％用于诱导和2％用于手术)与70％的一氧化二氮(nitrous oxide)及30％的氧(oxygen)的混合气体麻醉了SD白鼠。手术时，在脖子中央的稍偏左侧进行切开，以不使周围的迷走神经受到损伤的方式小心剥离了左侧总颈动脉。

用黑丝3.0(black silk3.0)拉起左侧总颈动脉，剥离同侧外颈动脉和内颈动脉，先结扎左侧外颈动脉后，拉起内颈动脉。通过外颈动脉上开的孔推入用硅树脂(Xantopren；Bayer Dental，大阪，日本))预先涂布的20mm长的4-0尼龙线(Ethilon；Ethicon Norderstedt，德国))来闭塞左侧中脑动脉的起始部。插入后，将外颈动脉与剩余尼龙线一同结扎以防止出血或尼龙线挤出。手术过程中没有出血并在15分钟内完成。经过2小时后，去除尼龙线，以便实现通过左侧总颈动脉的完整的再灌注。

就在中脑动脉闭塞/再灌注后，立即在再灌注后通过左侧外颈动脉对既定的动物实验组中的各实验动物注射0.9％的生理盐水或3.6μg/kg的MKX-2或3000iu/kg的促红细胞生成素(艾泊伦，东亚制药(株))。在左侧中脑动脉闭塞/再灌注手术和药物注射结束后，经过24小时后牺牲了白鼠。在手术前后，使白鼠能够自由接近饲料和水。

B.脑梗塞的体积测量

为了确定脑梗塞部位，利用了2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色。

首先，对白鼠肌肉注射舒泰(zoletile)和隆朋(rompun)使其安乐死，从头盖骨开始小心分离大脑并浸泡于冷却1分钟的0.9％的生理盐水中。然后，利用啮齿动物大脑切片模具(rodent brain matrix)(RBM-4000C，ASI Instruments，Warrin，MI，USA))从距离额极(frontal pole)1mm的位置开始以2mm的间距沿冠状面进行切片。

在室温下，将切片在包含2％的2,3,5-TTC(Sigma，St.Louis，MO，USA)的磷酸盐缓冲液(PB)中保管1小时，然后，用10％的磷酸盐缓冲福尔马林(phosphate-buffered formalin)固定。将对各实验组的固定的冠状面切片拍摄的照片表示在图6中。

用带有LeicaQwin程序的图像分析仪(image analyzer with LeicaQwinprogram)(Leica Microsystem Image Solution Ltd.，剑桥，英国)测量了脑梗塞面积，由切片的梗塞体积(＝切片的梗塞面积×厚度)的和计算了体积(mm³)，从而求得各实验组的平均和标准偏差。

6.心肌细胞细胞凋亡实验

A.心肌细胞的分离及培养

准备出生后8周龄的威斯特(Wister)鼠后，对成体鼠注射氯胺酮和戊巴比妥使其死亡后，快速分离心脏。利用大动脉向逆方向、心脏方向灌注5分钟预先加热至34～37℃的无钙重碳酸盐缓冲溶液(KHB)。然后，将KHB溶液更换成含有0.15％II级胶原酶(Cooper Biomedical，Malvern，PA))的汉克平衡盐溶液(HBSS：GIBCO，格兰德艾兰，NY)灌注30～40分钟左右。然后，用细胞培养液(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)反复清洗2次。分离心室(ventricle)和心房(atria)，只将心室组织分离并彻底剁碎后，在充满预先加热至34～37度的含有II级胶原酶的培养介质(DMEM)的振动器中充分搅拌5分钟左右。通过过滤器过滤掉不能溶解的结缔组织，用培养介质(DMEM)溶液将含有胶原酶的溶液反复清洗2次。以10g的速度轻轻地进行2分钟的离心分离后，将上清液分离并去除后，用含有1％牛胎儿血清(FBS；Sigma Chemical，St.Louis，MO)的培养介质(DMEM)溶液将细胞成分清洗3次。然后，将获得的细胞在培养介质(DMEM)、10％的FBS、10mM的HEPES(N-2-羟乙基哌嗪乙烷磺酸-N′-2-乙烷磺酸(N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid，HEPES)，GIBCO Laboratories，格兰德艾兰，NY)、2mM的L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素(100IU/mL，GIBCO)中稳定60分钟。将细胞以20×10³细胞/cm²的密度分注至6孔培养板中，向培养液中添加3天溴脱氧尿苷(Bromodeoxyuridine(BrdU，10uM，西格玛奥德里奇))以防止成纤维细胞(fibroblast)和前体细胞(progenitor)的增殖(Lokuta等人，1994；Miragoli等人，2006)。

为了之后的实验，在95％的O₂、5％的CO₂、37℃的培养器中培养了细胞。

B.TUNEL检测

为了进行MKX-2处理，将培养细胞分成对照组和实验组，在处理前，为两组都更换了不含FBS的培养液。对照组、实验组的处理时间都分为0、12、24小时，将MKX-2的浓度分为0.1和0.01ng/μl进行处理。对于对照组和实验组，为了诱导细胞凋亡(apoptosis)，在用MKX-2处理30分钟前，均放入了0.03％的H₂O₂。

在6孔培养板中放入盖玻片(cover glass)，将培养于盖玻片上的细胞用PBS(磷酸盐缓冲溶液)清洗，然后，用100％的乙醇在室温下固定5秒后，再次用PBS清洗。加入新制备的渗透液(permeabilization solution，0.1％的曲通X-100(Triton X-100)+0.01％的柠檬酸钠(sodium citrate))并在37℃的培养器中处理了10分钟。然后，用PBS清洗5分钟2次，将放置于原位细胞死亡检测试剂盒(in situ cell death detection kit)中的标记(label)溶液和酶溶液的混合液以30μl滴入各盖玻片，然后用石蜡膜(parafilm)轻轻盖上。在37℃的培养器中反应1小时，用PBS清洗5分钟2次后，在室温用DAPI(sigma)处理10分钟。用PBS清洗后，利用荧光显微镜，一边观察一边选定任意选择的10处，然后计数用DAPI(sigma)染色的细胞和显示TUNEL阳性的细胞的个数并计算了它们的比例。

结果

1.肽MKX-2在心肌细胞中的细胞保护效果

将根据上述心肌细胞的分离及培养获得的心肌细胞以2×10⁴细胞/孔的密度、每孔200ul接种至96孔培养板中，24小时后当细胞实现稳定化时，利用26或28规格的针去除孔内已有的介质。

放入200ul没有血清和营养物质的FBS，分成EPO治疗组和MKX-2治疗组后，将EPO及MKX-2治疗组根据0、0.1、1、10、100、1000nM的用量分成实验组，对各实验组进行72小时的药物治疗后，用MTT检测法比较了细胞生存率。该结果表示在图1中。

72小时后，当以0nM为基准将细胞生存率基准定为100％时，在以0.1nM治疗时，没有看到与初期大的差异，然而在1nM的浓度时，两个治疗组都显示了减少趋势，且两组间没有差异。之后，在10nM浓度时，MKX-2组与EPO治疗组相比在细胞生存率方面显示优势(102.67+3.22％vs.94.52+4.36％，p＝0.002)，100nM(112.28+2.17％vs.102.64+2.69％，p<0.001)、1000nM(115.05+0.90％vs.106.97+1.99％，p＝0.001)治疗组也显示相对优势。

2.肽MKX-2在神经细胞中的细胞保护效果

将根据上述神经细胞的分离及培养获得的神经细胞以2×10⁴细胞/孔的密度、每孔200ul接种至96孔培养板中，24小时后当细胞实现稳定化时，利用26或28规格的针去除孔内已有的介质。

放入200ul没有血清和营养物质的FBS，分成EPO治疗组和MKX-2治疗组后，再次去除EPO治疗组中的血清，然后，将其分成EPO非治疗组、1IU/ml治疗组、10IU/ml治疗组，然后再次将各治疗组分成用作为神经毒性物质的0.1％的2-巯基乙醇处理18小时的组和非处理组并进行了比较。同样，也将MKX-2治疗组中的血清去除后，将其分成MKX-2非治疗组、1.2ng/ml治疗组、12ng/ml治疗组，然后再次将各治疗组分成用作为神经毒性物质的0.1％的2-巯基乙醇处理18小时的组和非处理组并进行了比较。此外，将在正常培养条件下培养的组设定为阴性对照组，进行了它们间的比较。各组在药物治疗环境中培养了72小时，通过含有荧光物质的钙黄绿素-AM检测，利用荧光分析仪对生存的神经细胞进行了定量分析。EPO1IU/ml为10ng/ml，将EPO10ng/ml和MKX-21.2ng/ml调制为相同浓度0.54nM进行了分析。该结果表示在图2中。

图2是表示以各浓度的EPO及MKX-2处理心肌细胞后，培养72小时，然后通过MTT检测法比较细胞生存率的结果的图表。

72小时后，当将正常培养的组的细胞生存率定为100％时，与没有处理EPO的组相比，处理EPO的组显示约2倍高的显著的细胞生存率的增加，并显示出随EPO浓度的增加，细胞生存率也增加的样态(非治疗组：EPO(1IU/ml)：EPO(10IU/ml)＝18.60％：41.64％：48.57％)。MKX-2处理组也显示出相似的结果(非治疗组：MKX-2(1.2ng/ml)：MKX-2(12ng/ml)＝18.60％：46.05％：52.85％)，对两组间的差异没有统计上的意义。

暴露于2-巯基乙醇中的神经细胞显示比没有暴露的嗅神经细胞高出约50％的细胞死亡率。

暴露于2-巯基乙醇中后，用1IU/ml的EPO处理时，与非治疗组相比，对细胞生存率没有有意义的增加(5.89％：6.98％，p＝0.19)，用10IU/ml处理时，显示统计上有意义的水平的神经细胞保护效果(5.89％：11.70％，p＝0.02)。

在用1.2ng/ml的MKX-2处理的组中，与非治疗组相比，显示细胞生存率有意义的增加(5.89％：25.72％，p＝0.005)，在12ng/ml的治疗组中也显示神经细胞的保护效果(5.89％：24.12％，p＝0.007)，在与EPO治疗组的比较中，各个浓度与EPO相比都显示优异的细胞生存率(p<0.001，p＝0.002)。

3.肽MKX-2在视网膜神经细胞中的细胞保护效果

将根据上述视网膜神经细胞的分离及培养获得的神经细胞以2×10⁴细胞/孔的密度、每孔200ul接种至96孔培养板中，24小时后当细胞实现稳定化时，利用26或28规格的针去除孔内已有的介质。

放入200ul没有血清和营养物质的FBS，分成EPO治疗组和MKX-2治疗组后，将EPO及MKX-2治疗组根据0、0.1、1、10、100、1000nM的用量分成实验组，各用量实验组在药物治疗环境中培养72小时，通过MTT检测，利用荧光分析仪对生存的视网膜神经细胞进行了定量分析。该结果表示在图3中。

72小时后，当以0nM为基准将细胞生存率的基准定为100％时，在以0.1nM、1nM治疗时，虽然两组细胞生存率与基准0nM相比都增加，但两组都没有统计上的意义。之后，在10nM浓度时，虽然两组细胞生存率与0nM相比都有意义增加，但MKX-2治疗组和EPO治疗组之间没有统计上的意义(128.03％vs.118.62％，p＝0.065)。在100nM治疗组中，两组都显示保护能力，且MKX-2治疗组与EPO治疗组相比在细胞生存率方面显示优势(144.41％vs.127.6％，p＝0.002)，在1000nM组中也是，MKX-2组显示相对优势(149.80％vs.124.77％，p＝0.001)。

4.肽MKX-2在胰腺β细胞中的细胞保护效果

按照上述内容，培养作为胰岛β细胞株的HIT-T15和INS-1细胞，以1×10⁵细胞/孔分注至24孔培养板的各孔中并稳定化后，实验当天将已有的介质小心去除后，将残留的少量的介质也清洗出去。之后，用包含0.5％FBS的RPMI-1640介质培养6小时来停止增殖和分化。分成MKX-2治疗组和只放入相同用量的在溶解MKX-2时使用的DMSO的对照组后，以0、0.12、1.2、12、60、120ng/ml的用量处理MKX-2治疗组，为了产生应激(under stress)，用H₂O₂(100M)处理2小时或4小时后，以MTT检测法比较了细胞生存率。该结果表示在图4及图5中。

图4是表示以各浓度的MKX-2对β细胞HIT-T15进行预处理后，用H₂O₂处理2小时(图4a)或4小时(图4b)，然后通过MTT检测法比较细胞生存率的结果的图表。

图5是表示以各浓度的MKX-2对β细胞INS-1进行预处理后，用H₂O₂处理2小时(图5a)或4小时(图5b)，然后通过MTT检测法比较细胞生存率的结果的图表。

在用H₂O₂处理2小时或4小时后，当以0ng/ml为基准将细胞生存率的基准定为100％时，以0.12和1.2ng/ml治疗时，与初期没有用MKX-2处理的情况相比，两种β细胞都没有看到统计上的差异，当与没有用MKX-2处理的情况相比时，HIT-T15细胞在12、60和120ng/ml浓度时，细胞生存率统计上有意义地增加(用H₂O₂处理2小时时：78.5％+0.92(12ng/ml)，92.3％+5.24(60ng/ml),104.1％+2.87(120ng/ml)vs.71％+1.44(未处理)；用H₂O₂处理4小时时：59.57％+2.09(12ng/ml)，67.19％+1.05(60ng/ml)，84.73％+4.82(120ng/ml)vs.52.46％+1.20(未处理))，INS-1细胞在60和120ng/ml浓度时，细胞生存率统计上有意义地增加(用H₂O₂处理2小时时：86.4％+4.79(60ng/ml)，95.0％+4.53(120ng/ml)vs.77.6％+1.02(未处理)；用H₂O₂处理4小时时：64.39％+1.65(60ng/ml)，83.60％+5.76(120ng/ml)vs.58.26％+2.56(未处理))。

5.肽MKX-2在脑梗塞动物实验中的组织保护效果

根据利用上述脑梗塞动物模型的实验方法，将各实验组以阴性对照组、MKX-2治疗组、促红细胞生成素治疗组(阳性对照组)分别进行了比较。

在阴性对照组中，将左侧中脑动脉(middle cerebral artery)闭塞后，经过2小时后，去除诱导闭塞的尼龙线并诱导产生完整的再灌注，然后立即施用0.9％的生理盐水。在MKX-2治疗组中进行相同的过程后，施用3.6μg/kg的MKX-2来替代0.9％的生理盐水，在促红细胞生成素治疗组中，施用了3000IU/kg的促红细胞生成素(艾泊伦，东亚制药(株))。各组共同经过24小时后，以上述方法将实验动物牺牲后，摘除大脑并以上述方法测量了脑梗塞的量。该结果表示在图7中。

图7是示出对诱发脑梗塞的Spague-Dawley白鼠模型施用实验药物后，分离大脑并将沿冠状面的切片进行TTC染色后测量的脑梗塞面积的结果的图表。

24小时后，施用0.9％生理盐水的阴性对照组的脑梗塞量是318.70+29.64mm³，促红细胞生成素治疗组的脑梗塞量是246.27+37.52mm³，MKX-2治疗组的脑梗塞量是159.24+27.78mm³，可以确认到与阴性对照组相比，促红细胞生成素治疗组的脑梗塞量有意义地减少(318.70+29.64mm³vs.246.27+37.52mm³，p＝0.05)，并可以确认到与阴性对照组相比，MKX-2治疗组的脑梗塞量也有意义地减少(318.70+29.64mm³vs.159.24+27.78mm³，p<0.001)。在促红细胞生成素治疗组和MKX-2治疗组的比较中，可以确认到与促红细胞生成素治疗组相比，MKX-2治疗组的脑梗塞量有意义地更加减少并显示相对优势(246.27+37.52mm³vs.159.24+27.78mm³，p＝0.05)。

6.肽MKX-2在心肌细胞细胞凋亡实验中的组织保护效果

根据利用上述心肌细胞凋亡实验的实验方法，将各实验组分为对照组、MKX-20小时治疗组、MKX-212小时治疗组、MKX-224小时治疗组，将各MKX-2治疗组分为0.01ng/uL、0.1ng/uL两种治疗组后进行了实验。就对照组而言，在基准时间、12小时后及24小时后，计数了用DAPI染色的细胞和显示TUNEL阳性的细胞的个数并计算了其比例。以相同的方法，以0.01ng/uL、0.1ng/uL浓度处理MKX-2治疗组并在0小时、12小时、24小时治疗后，计数了用DAPI染色的细胞和显示TUNEL阳性的细胞的个数并计算其比例。该结果表示在图8中。

图8是示出对从Wistar鼠中获得的培养的心肌细胞进行TUNEL检测的结果，计数用DAPI染色的细胞和显示TUNEL阳性的细胞的个数并计算其比例的结果的图表。

在0小时、12小时、24小时后，对照组的TUNEL阳性细胞数/DAPI染色细胞数分别为3.74+0.67％、65.52+5.09％、68.13+2.27％，与0小时相比，在12小时(3.74+0.67％比65.52+5.09％，p<0.001)和24小时(3.74+0.67％比68.13+2.27％，p<0.001)时，统计上有意义地增加，MKX-20.01ng/uL治疗组在0小时、12小时、24小时后，TUNEL阳性细胞数/DAPI染色细胞数分别为10.12+2.03％、35.82+3.95％、44.16+3.34％，与0小时相比，在12小时(10.12+2.03％比35.82+3.95％，p<0.05)和24小时(10.12+2.03％比44.16+3.34％，p<0.05)时，统计上有意义地增加，MKX-20.1ng/uL治疗组在0小时、12小时、24小时后，TUNEL阳性细胞数/DAPI染色细胞数分别为5.38+2.36％、44.35+3.91％、47.97+2.85％，与0小时相比，在12小时(5.38+2.36％比44.35+3.91％，p<0.05)和24小时(5.38+2.36％比47.97+2.85％，p<0.05)时，也显示统计上相似的结果。

在基准时间时的对照组、MKX-20.01ng/uL治疗组、MKX-20.1ng/uL治疗组之间的TUNEL阳性细胞数/DAPI染色细胞数的差异没有统计上的意义，在12小时治疗时间时，与对照组相比，MKX-20.01ng/uL治疗组(65.52+5.09％比35.82+3.95％，p<0.05)、MKX-20.1ng/uL治疗组(65.52+5.09％比44.35+3.91％，p<0.05)显示统计上的有意义的差异，在24小时的治疗时间时，与对照组相比，MKX-20.01ng/uL治疗组(68.13+2.27％比44.16+3.34％，p<0.05)、MKX-20.1ng/uL治疗组(68.13+2.27％比47.97+2.85％，p<0.05)也显示统计上的有意义的差异。在12小时治疗时间和24小时治疗时间时的MKX-20.01ng/uL治疗组和MKX-20.1ng/uL治疗组之间，两组间没有统计上有意义的差异。

以上结果暗示MKX-2的细胞保护功能通过抗细胞凋亡(antiapoptosis)的机制来实现。

Claims

1.一种对预防或治疗细胞、组织或器官损伤有效的肽，其具有序列表第1序列的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽衍生自促红细胞生成素(EPO)。

3.一种用于预防或治疗细胞、组织或器官损伤的药物组合物，其包含权利要求1或2所述的肽作为有效成分。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述细胞、组织或器官是脊髓、大脑、心脏、视网膜、皮肤、肌肉、肺、肝、肾脏、小肠、肾上腺、血管、膀胱、尿道、胃、肠道、神经、睾丸、卵巢或子宫的细胞、组织或器官。

5.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述损伤由脑卒中、神经类的机械性损伤或缺血性损伤、心肌梗塞、多发性硬化症、癫痫、低血压、心脏麻痹、缺血症、心肌梗塞、炎症、与年龄有关的认知能力的损失、辐射损伤、大脑麻痹、神经退行性疾病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、利氏病、AIDS性痴呆、记忆障碍、肌萎缩性侧索硬化症、酒精中毒、情绪障碍、焦虑障碍、注意力缺乏障碍、自闭症、克雅氏病、大脑或脊髓外伤或缺血症、心脑搭桥、慢性心力衰竭、由老化引起的视力减退、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾衰竭、青光眼、视网膜缺血或视网膜外伤引起。