JP4749667B2 - 神経組織の修復を促進するための材料および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2001年8月13日に出願された仮特許出願第60/311,870号の恩典を主張するものであり、それは、すべての図、表、および図面を含め、完全に参照として本明細書に組み入れられている。
末梢神経損傷は、慢性能力障害の主な原因である。神経損傷の弱い統御力は、筋萎縮と関連し、切断された軸索が遠位の神経と連続性を回復することができない場合、有痛性神経腫へと導きうる。神経は、損傷後再生する潜在能力をもっているが、この能力は、厳密に言えば、切断された神経セグメント(およびその中のシュワン細胞基底層)と適切な接触をする、再生する神経線維(およびそれらの軸索の新芽)に依存している。裂け目または損傷部位を横断して切断された遠位の神経セグメントの基底層に入ることができない再生中の軸索は、衰退し、結果として、ニューロン死、筋萎縮および永久機能障害を生じるであろう(Fawcett JWら、[1990] Annu Rev Neurosci 13:43-60)。
本発明は、神経組織の修復を促進するための組成物および方法に関する。好ましい態様において、本発明の組成物は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)分解酵素を含む。一つの態様において、本発明の組成物は、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるCSPG分解酵素を含む。さらなる態様において、本発明の組成物は、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、コンドロイチナーゼAC、ヒアルロニダーゼ、MMP-2、およびMMP-9、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるCSPG分解酵素を含む。
本発明は、神経組織の修復を促進するための組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、疾患、外傷性事象または外科的処置により中断された神経の連続性を回復させるために使用されうる。本発明の組成物および方法は、損傷をうけた神経組織または移植された神経移植片を成功裡に貫入する軸索の数を増加させることにより神経組織の修復を促進させ、結果として、より大きな機能的回復を生じる。
一つの態様において、CSPG分解酵素は、損傷をうけた神経、神経損傷の部位または神経損傷修復の部位に適用される。好ましい態様において、CSPG分解酵素は、切断されたまたは切り取られた神経の接合(すなわち、末端から末端への神経接合)を含む、第一次神経修復の部位へ適用される。神経への損傷は、神経が部分的にもしくは完全に切断されているか、または小領域が損傷をうけて外科的に除去されている、神経切断(神経断裂)を表してもよく、神経上膜接合(神経縫合術)は、損傷をうけた神経を修復する第一の方法である。例えば、本発明の組成物および方法は、基底層、神経周膜または神経上膜のような損傷をうけた神経の神経鞘の少なくとも1つの連続性における崩壊を含む、神経損傷の修復を促進するために用いられうる。好ましくは、外科的修復は、神経要素を再配列することを試みる。
一つの態様において、CSPG分解酵素は、神経移植片に適用される。CSPG分解酵素が神経移植片に適用される場合、移植片全体が処理されうる。CSPG分解酵素は、神経移植片全体に、一括して適用されうる。この適用は、前処理または移植前のインキュベーションであり、適用される酵素を除去するための手順を含むか、または含まない場合がある。一括処理は、生きた(新鮮な)または前に凍結された神経移植片に適用されうる。一括処理は、宿主神経との接合部位でのCSPG分解酵素の追加の適用を排除せず、それと共に用いられうる。
1つまたは複数のCSPG分解酵素は、患者、例えば、ヒトまたは動物への投与に適した薬学的組成物へ組み込まれうる。そのような組成物は、典型的には、少なくとも1つのCSPG分解酵素および薬学的に許容される担体を含む。本明細書に用いられる場合、用語「薬学的に許容される担体」とは、薬学的投与と適合性のある、あらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張性吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性のある物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野においてよく知られている。補足活性化合物もまた、組成物へ組み込まれうる。好ましくは、薬学的組成物は、少なくとも1つのCSPG分解酵素、およびフィブリン糊のような組織接着剤を含む。
本発明はまた、ヒトまたは動物への移植のための神経組織を培養する方法に関する。本発明の培養方法は、移植後、再生中の軸索の移植片と宿主神経組織間の界面を横断する能力を向上させる、インビトロで神経組織を「あらかじめ変性させる段階」を含む。理論に結び付けられてはいないが、本発明の培養方法は、生きている神経細胞が、CSPG分解酵素を発現し、かつ神経変性の再構築過程の間、インビボで自然に起こると考えられる、シュワン細胞の増殖を促進することを可能にする。
神経切断および神経挫滅実験のための外科的手順
すべての外科的手順は、所内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)認可のプロトコールに従って行われた。若年成体SPRAGUE DAWLEYラット(HARLAN Indianapolis, IN)をキシラジン(15 mg/kg、筋肉内)、続いてケタミン-HCl(110 mg/kg、腹腔内)で深く麻酔をかけた。6匹の動物は、左右相称の神経挫滅損傷をうけた。坐骨神経を露出させ、その後、内閉鎖筋の腱に対して4 mm遠位の部位にDUMONT 5番鉗子での30秒間の常時圧力で挫滅させた。挫滅部位は、神経上膜縫合糸で印をつけられた。実験の別の組において、8匹のラットが、鋸歯型鋏を用いる左右相称の坐骨神経切断損傷をうけた。近位および遠位の断端は、9-0 ETHILON縫糸を用いる神経上膜の神経縫合術によりかぶせられた。その後、フィブリン糊(フィブリノーゲンおよびトロンビン)が結合を安定化させるために適用された。両方の損傷モデルにおいて、右の坐骨神経は、コンドロイチナーゼABC(2 μl中1 U)(高純度、プロテアーゼを含まない;SIGMA CHEMICAL CO., St. Louis, MS)を損傷に対して2-mm遠位に注射された。左の坐骨神経(右側と同じ損傷をもつ)は、溶媒のみ(0.1 %ウシ血清アルブミンを含むPBS)を注射された。筋肉切り口は縫合され、皮膚は金属クリップで閉じられた。麻酔から回復後、動物は、標準的住居へ戻された。手術後2日目(挫滅損傷について)および4日目(切断損傷について)、神経を麻酔下で取り出し、下記のように固定した。神経切断および修復をうけた8匹の動物のうちの1匹は、回復期の間に、一方の神経における連続性の喪失が生じたため、除外された。
成体(180 g〜200 g)雌SPRAGUE DAWLEYラット(HARLAN, Indianapolis, IN)が、神経ドナーおよびレシピエント宿主として用いられた。ドナーのラットはハロタンで麻酔され、断頭された。坐骨神経を臀部筋肉開裂切開により露出し、下にある筋膜から離して単離した。吻側から総腓骨神経および脛骨神経への分岐点まで、15-mm 神経セグメントを切除した。セグメントを冷たい滅菌リンガー溶液ですすぎ、薄いプラスチック支持体へ末端をピンで留めることにより安定化させ、そして低温貯蔵のバイアルへ移した。バイアルを2分間液体窒素中に沈め、その後、2分間37℃水浴へ移した。この凍結/解凍サイクルを繰り返し、無細胞性神経移植片を生じ、その後、液体窒素中に保存された。移植の1日前に、神経移植片を室温まで温め、2ユニット/ml コンドロイチナーゼABC(SIGMA, St. Louis, MO)を含む100 μl リン酸緩衝食塩水pH 7.4(PBS)中、またはPBS(溶媒)のみの中で、37℃、16時間、インキュベートした。移植片を使用の前に、リンガー溶液で2回すすぎ、氷上に置いておいた。コンドロイチナーゼABC調製物は、高度に精製されており、本質的にプロテアーゼ活性を含まないと製造会社により述べられていた。
12匹のラットが、左右相称の無細胞性神経移植片、一方はコンドロイチナーゼ処理された移植片および一方は溶媒処理された移植片を受けた。宿主ラットにキシラジン(15 mg/kg、筋肉内)およびケタミン(110 mg/kg、腹腔内)を用いて深く麻酔をかけた。坐骨神経は露出され、神経と下にある組織の間に置かれたプラスチック挿入物により支持された。座骨の切れ込みと分岐点の間の中間点の神経領域が、最初に、フィブリン糊で塗布された。鋸歯型鋏を用いて、宿主神経の2.5-mmのセグメントが切除され、新鮮に切り取られた10-mmの無細胞性神経移植片に交換された。移植片は、各末端において、1本の9-0 ETHILON縫糸を用いる神経上膜神経縫合術により宿主神経断端に接合された。その後、フィブリン糊が接合を安定化させるために適用され、最初のフィブリン塗布と共同して、神経要素の突出(神経内膜キノコ状化)もまた低減させた(Menovsky Tら、[1999] Neurosurgery 44:224-226)。筋肉は4-0縫糸で、皮膚は創傷用クリップで閉じられた。麻酔からの回復後、動物は、標準的住居へ戻された。
成体(180 g〜200 g)雌SPRAGUE DAWLEYラット(HARLAN, Indianapolis, IN)が神経ドナーおよび移植片レシピエントとして用いられた。このプロジェクトは、所内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)により検討されて認可された。ドナーのラットは、イソフルオラン(isofluorane)で深く麻酔され、断頭された。坐骨神経を臀部筋肉開裂切開により露出し、下にある筋膜から離して単離した。吻側から総腓骨神経および脛骨神経への分岐点まで、15-mm 神経セグメントを切除した。セグメントを滅菌リンガー溶液ですすぎ、薄いプラスチック支持体へ末端をピンで留めることにより安定化させた。神経外植片を、N2補足物を含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM/N2)または2 %もしくは10 %ウシ胎児血清(FBS)を補ったDMEM/N2(ATLANTA BIOLOGICALS, Atlanta, GA)において、1日、2日、4日、および7日間、培養した。明記されるように、いくつかの外植片は、MMP阻害剤、GM6001(50 μM)の存在下で培養された(Grobelnyら、[1992] Biochem., 31:7152-7154)。培養された神経をDMEM中で入念に洗浄し、その後、封管へ移した。その管を液体窒素中に2分間浸漬し、その後、37℃水浴で5分間解凍した。この凍結-解凍サイクルは2回繰り返され、凍結死滅した(無細胞性)神経セグメントを生じた。新鮮に切除された神経(培養されていない対照)を同じ手順を用いて凍結死滅させた。その後、無細胞性神経セグメントは、a)凍結切片培養アッセイ法に使用するための凍結切片作製のために包埋されたか、またはb)生化学的分析のためおよび間置神経移植片としての使用のために液体窒素中に保存された(2週間までの間)。組織学的検査のために調製される神経外植片は、アルデヒドで固定され、凍結死滅は省かれた。
軸索再生は、GAP-43免疫蛍光法およびデジタル画像解析により評価された。スライドに載せられた組織切片をPBSで洗浄し、その後、0.5 %トリトンX-100を含むPBSで10分間、処理した。切片をブロッキング緩衝液(10 %血清を含むPBS + 0.1 %トリトンX-100)で処理し、その後、一次抗体(ブロッキング緩衝液に希釈した)と一晩、4℃でインキュベートした。結合した抗体を、ブタ抗ウサギ免疫グロブリン(DAKO CORPORATION, Carpinteria, CA)またはヤギ抗マウス免疫グロブリン(Sigma)FITC結合二次抗体で暗闇で1時間、室温で標識した。抗マウス二次抗体は、使用前にラット血清であらかじめ吸着された。切片を洗浄し、4 %パラホルムアルデヒドを含むPBSで後固定し、すすぎ、蛍光封入媒体中においてカバーガラスをかけた。アフィニティー精製されたウサギ抗GAP-43ペプチド抗体は、公知の方法(Ferguson TAら、[2000] Mol Cell Neurosci, 16:157-167)を用いて作製され、2 μg/mlで使用された。ポリクローナル抗体1918(CHEMICON INTERNATIONAL, Temecula, CA)(1:1000)は、コンドロイチナーゼABCでの消化により露出されたCSPGコアタンパク質の結合領域に付着したままである不飽和二糖単位にのみ結合する(Bertolotto Aら、[1986] J Neurol Sci 73:233-244)。ポリクローナル抗EHSラミニン抗体(Sigma)(1:1000)は、基底層を標識するために使用された。ポリクローナル抗S-100抗血清(Dako)(1:500)は、シュワン細胞を標識するために使用された。暗視野画像は、PHOTOSHOP(ADOBE SYSTEMS INC., San Jose, CA)において反転され、印刷のために最適化された。
凍結切片培養法は、ニューロンが新鮮/凍結神経切片上で直接的に培養される神経突起伸長アッセイ法であり、以前に記載されているように行われた(Ferguson TAら、[2000] Mol Cell Neurosci, 16:157-167)。簡単には、コンドロイチナーゼ処理および溶媒処理された神経セグメントを20 μmの薄片に切り、滅菌したアミノプロピルトリエトキシシラン(APTS)コーティングカバーガラス上に載せて、使用されるまで-20℃で保存した。示された所において、切片は、コンドロイチナーゼABC(0.1ユニット/ml)または溶媒(50 mM NaClを含む、50 mM トリス-HCl、pH 8.0)で2時間、37℃で処理された。8日のニワトリ胚由来の精製された後根神経節(DRG)ニューロンを、10 ng/ml 神経成長因子を含む既知組成N2培地(Bottenstein JEら、[1980] Exp Cell Res 125:183-190)における神経切片に直接的に播種した。凍結切片培養アッセイを、24時間のインキュベーション後、100 %メタノールでの固定化により終結させた。DRGニューロンによる神経突起伸長は、GAP-43免疫蛍光標識により評価された。エピ蛍光顕微鏡写真は、組織切片について記載されるように得られた。神経突起の長さは、IMAGE-PRO PLUSソフトウェア(MEDIA CYBERNETICS, Silver Springs, MD)を用いて直接的に測定された。各実験における各条件について、一つの細胞体(〜15 μm)より長い神経突起をもつ少なくとも250個のニューロンがスコア化された。
神経セグメントを氷冷抽出緩衝液(1 %トリトンX-100、200 mM NaCl、および10 mM CaCl2を含む、50 mM トリス-HCl、pH 7.6)中に置き、プローブ超音波処理(15秒)によりホモジナイズした。試料を30分間、4℃で撹拌し、可溶性画分を遠心分離(12,000 g、20分)により収集した。可溶性画分の全タンパク質含有量は、BRADFORD REAGENT(BIO-RAD LABORATORIES, Hercules, CA)を用いて測定された。抽出緩衝液に溶解したウシ血清アルブミンがタンパク質標準として使用された。抽出物を加熱せずに非還元Laemmli試料緩衝液中で可溶化し、1.5 mg/ml ブタのゼラチンを含む10 %SDS-ポリアクリルアミドゲル上において4℃で電気泳動した。ゲルを水中で簡単にすすぎ、その後、2.5 %トリトンX-100中で3回、45分より長く洗浄した。トリトンを3回の5分間水洗浄で除去し、酵素電気泳動ゲルをインキュベーション緩衝液(50 mM トリス-HCl、pH 8.0、5 mM CaCl2、0.02 %アジ化ナトリウム)中で21時間展開させた。ゲルを固定し、0.05 %クーマシーブリリアントブルーで染色した。ゼラチン溶解性活性をもつタンパク質バンドは、ゼラチンゲルの青色バックグラウンド内に透明溶解帯として現れた。ゼラチン溶解バンドの共移動は、着色分子量標準(BIO-RAD)に加えて、組換えヒトMMP-2およびMMP-9の潜在型ならびに活性型と比較された。デジタル顕微鏡写真を得て、ゼラチン溶解バンドの濃度測定をIMAGE-PRO PLUSソフトウェアを用いて行った。
固定されていない正常神経および培養された神経の凍結切片(10 μm)をスライドに載せ、分子内で消光されている、フルオレセイン標識ゼラチン基質(MOLECULAR PROBES INC., Eugene, OR)の20 μg/mlを含む反応緩衝液(50 mM トリス-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2、0.2 mM アジ化ナトリウム、pH 7.6)で表面を塗った(Ohら、1999)。対照条件において、MMP阻害剤EDTA(30 mM)が反応緩衝液に含まれた。24時間、37℃でのインキュベーション後、切片を水ですすぎ、4 %パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液で固定した。切片を水ですすぎ、Citifluorを用いて封入した。組織切片においてゼラチン溶解活性により生じた蛍光-ゼラチンペプチドが観察され、エピ蛍光顕微鏡により撮影された。
6匹のラットに、左右相称の無細胞性神経移植片、一方は正常(培養されていない)移植片および一方はインビトロであらかじめ変性された(2 %血清中で2日間、培養された)移植片を与えた。宿主ラットをキシラジン(15 mg/kg、筋肉内)およびケタミン(110 mg/kg、腹腔内)を用いて深く麻酔をかけた。坐骨神経は露出され、神経と下にある組織の間に置かれたプラスチック挿入物により支持された。坐骨の切れ込みと分岐点の間の中間点の神経領域を、最初にフィブリン糊で塗布した。鋸歯型鋏を用いて、宿主神経の2.5mmのセグメントを切除した。移植片を解凍し、解剖用メスの刃で10 mmに新鮮に切り取った。移植片は、各末端において、1本の9-0 ETHILON縫糸を用いる神経上膜神経縫合術により宿主神経断端に接合された。その後、フィブリン糊が接合を安定化させるために適用され、宿主神経に適用された最初のフィブリン塗布と共同して、神経要素の突出(神経内膜キノコ状化)を低減させた(MenovskyおよびBartels, [1999] Neurosurgery 44:224-225、考察pp.225-226)。筋肉は4-0縫糸で、皮膚は創傷用クリップで閉じられた。麻酔からの回復後、動物は、標準的住居へ戻された。移植後8日目、宿主ラットを深く麻酔し、断頭した。移植片ならびに近位および遠位の宿主神経3 mmを取り出し、4 % パラホルムアルデヒドを含む0.1 M リン酸緩衝液、pH 7.4に一晩、4℃で浸漬した。検体をPBSで平衡化し、リン酸緩衝液中の30 % ショ糖に2日間、4℃で浸漬した。検体を包埋し、記録された寸法の横断面について凍結切片を作製した。移植片内の再生中の軸索は、GAP-43免疫蛍光法により標識された(下記参照)。エピ蛍光顕微鏡写真が得られ、GAP-43陽性軸索プロファイルは、IMAGE-PRO PLUSソフトウェアを用いてスコア化した。
固定された組織切片をPBS中の0.5 %トリトンX-100で10分間、処理した。非特異的抗体結合は、0.1 %トリトンX-100および10 %正常血清を含むPBS(ブロッキング緩衝液)での前処理によりブロックされた。一次抗体をブロッキング緩衝液に希釈し、一晩、4℃で適用した。結合された一次抗体を、フルオレセインもしくはローダミンを結合したブタ抗ウサギ免疫グロブリン(DAKO, Carpinteria, CA)またはヤギ抗マウス免疫グロブリン(Sigma)で暗闇で1時間、室温で標識した。抗マウス二次抗体は、使用前にラット血清であらかじめ吸着された。神経突起の長さ(凍結切片培養法)および軸索再生(移植)は、ポリクローナル抗GAP-43 IgG(2 μg/ml)(FergusonおよびMuir, 2000, Mol Cell Neurosci, 16:157-167)(NB300-143; NOVUS BIOLOGICAL, Littleton, CO)での免疫標識法により評価された。他の一次抗体は以下のものを含んだ:ポリクローナル抗MMP-2 IgG(4 μg/ml)(MMP2/475; Muir, 1995);ポリクローナル抗MMP-9 IgG(4 μg/ml)(AB19047; CHEMICON, Temecula, CA);ポリクローナル抗S-100抗血清(1:500)(DAKO)および;ポリクローナルOX42抗血清(1:500)(SEROTEK, Raleigh, NC);ならびにモノクローナル抗神経フィラメントIgG(4 μg/ml)(NAP4; Harrisら、1993)。いくつかの例において、エピ蛍光顕微鏡写真は、PHOTOSHOP(ADOBE SYSTEMS, San Jose, CA)において印刷のために反転およびコントラスト増強された。
この実験の目的は、コンドロイチナーゼ処理が無細胞性神経の無傷セグメントの全体にわたってCSPGを効果的に分解するかどうかを決定することであった。ラット坐骨神経のセグメント(長さ1.5 cm)は、繰り返される凍結-解凍サイクルにより無細胞性にされ、その後、一括して、16時間、コンドロイチナーゼABC溶液中に浸された。コンドロイチナーゼ前処理された神経内のCSPG分解は、ネオエピトープ抗体Ab1918での免疫標識法により調べられた。この抗体は、コンドロイチナーゼABCによるコンドロイチン硫酸鎖の溶解後にコアタンパク質上に創造されるエピトープに結合する(Bertolottoら、[1986] J. Neurol Sci, 73:233-244)。図1Aに示されるように、Ab1918免疫染色は、前処理された神経セグメント全体を通じて強かった。さらに、図1Bに示されるように、Ab1918免疫染色の強度は、コンドロイチナーゼでの切片の追加的後処理により増加しなかった。コンドロイチナーゼに曝されなかった無細胞性神経において、Ab1918免疫反応性はなかった(示していない)。これらの発見は、一括コンドロイチナーゼ処理が、すべての神経区画に効果的に浸透し、CSPG側鎖を徹底的に分解したことを示している。
コンドロイチナーゼ処理された無細胞性神経における阻害性CSPGの不活化は、凍結切片培養バイオアッセイ法により測定された。胚性ニワトリDRGニューロンを、調製された神経セグメントの切片上に播種し、神経突起促進活性は、神経突起伸長をスコア化することにより評価された。結果は図2に示されている。溶媒のみで一括前処理された無細胞性神経の切片における平均神経突起長は、49 μmであった。コンドロイチナーゼで一括前処理された無細胞性神経における神経突起伸長は平均して96 μmであり、対照条件と比較して95 %の増加を示した。一括コンドロイチナーゼ処理が完全であったかどうかを決定するために、切片作製後にコンドロイチナーゼで処理された(後処理)神経組織において凍結切片培養アッセイ法を行った。予想された通り、溶媒のみで一括処理された無細胞性神経の神経突起促進活性は、コンドロイチナーゼでの後処理により有意に(86 %)増加した。対照的に、コンドロイチナーゼ後処理は、一括コンドロイチナーゼ処理神経移植片由来の切片にわずかな追加効果を生ずるのみであった。
以下の実験は、コンドロイチナーゼ処理が無細胞性神経同種移植片を通しての神経再生を向上させるという仮説を試験した。実施例2に記載されるように、無細胞性坐骨神経セグメントを溶媒またはコンドロイチナーゼABCで一括処理した。10-mmの間置神経移植片を、フィブリン糊で補強される神経上膜神経縫合術により宿主神経へ連結した。9匹の宿主ラットのそれぞれは、左右相称の移植片、一方は溶媒処理された移植片および一方はコンドロイチナーゼ処理された移植片を受けた。再生は、最初、8日後に調べた。まず、図3に示されるように、近位および遠位の神経-移植片の接合を外科的接合のアライメントを評価するために縦方向の切片において調べた。すべての移植片が連続状態にあり、従って、次の分析に含められた。再生のスコア化は、伸長している軸索を強く染色するGAP-43免疫標識法に基づいた。凍結死滅した移植片内の軸索およびシュワン細胞残遺物は、GAP-43に対して免疫陰性であり、宿主シュワン細胞は、非常にかすかに染色されるのみであった(デジタルスコア化に用いられる限界値未満の強度で)。軸索伸長は、移植片内の指定された空間的間隔において、横断切片におけるGAP-43免疫陽性プロファイルに得点をつけることにより評価された。図4に示されるように、すべての移植片において、いくらかの軸索の内への伸長が観察された。しかしながら、コンドロイチナーゼ処理された移植片への伸長は、対照移植片においてより、際立って多くかつ広く分布された。定量的結果は、図5に示されている。
神経再生の成功は、ラミニンの豊富な基底層管内の軸索の伸長に依存しているため、軸索伸長の基底層との関連が無細胞性移植片のコンドロイチナーゼ処理により変化するかどうかを決定した。8日目の移植片の横断切片をGAP-43およびラミニンについて二重標識した。ラミニン標識は強く、基底層は、対照およびコンドロイチナーゼ処理の移植片中、同様に無傷であるように思われた。繰り返される凍結-解凍、酵素処理、外科的操作、およびインビボでの8日間にもかかわらず、細胞外マトリックススキャホールドは、構造的に無傷であるように思われた。多数のGAP-43標識軸索(または神経突起)は、個々の基底層内で明らかであり、これらの大部分は管の管腔表面と密接に結合しているのが観察された。対照および処理の移植片において、あいまいに付着した、同じくらいの少数の神経突起が観察された。全般的に、基底層内で伸長する軸索の性質は、無細胞性神経移植片のコンドロイチナーゼ処理により変化しなかった。
8日目の移植片の連続切片を、軸索伸長に関するシュワン細胞の移動を調べるために、S-100およびGAP-43について免疫標識した。移植片は、S-100染色の2つの別個のパターンを含んだ;強い染色は生きている宿主由来シュワン細胞に関連し、弱い染色は凍結死滅したシュワン細胞残遺物に関連した。別に示さない限り、後に続く記載は、強く染色された(生きている)シュワン細胞プロファイルを指す。図7に示されるように、移植片の近位領域において、シュワン細胞および軸索の分布は、大概は一致した。軸索のクラスターが、少しの明らかなシュワン細胞関連もなく、時々見出された。散らばったシュワン細胞もまた、伸長している軸索を含有しない領域に見られた。シュワン細胞移動は、8日目の移植片中にはっきり見られた。しかしながら、図7に示されるように、移植片中のより遠位の点において、軸索がしばしばシュワン細胞を伴わないで見出された。これは、図8に示されるように、遠位の接合を含む縦方向の切片において確認された。図8Bに示されるように、S-100標識シュワン細胞は、遠位宿主断端において豊富であったが、移植片の遠位面(凍結死滅したシュワン細胞残遺物のみを含んだ)にはたとえ侵入したものがあるとしても少なかった。図7、図8Aおよび図8Bに提示されている実施例は、コンドロイチナーゼ処理された移植片から得られ、同一の結果が対照移植片において観察された。これらの発見は、コンドロイチナーゼ処理された移植片における軸索伸長の増大が、主として、基底層の神経突起促進活性の増強に起因することを示唆した。
ラット神経を用いて行われた上記実施例に記載される実験の多くは、ヒト神経を用いて繰り返された。ヒト神経を用いる実施例6および実施例7においても、別に示されている所を除いて、ラット神経を用いる実施例1および実施例2に記載される手順に従った。ヒト腓腹および脛骨の神経は、外科的脚切断から新鮮に得られた。切断は、神経の介入がない疾患(例えば、骨癌)にとって必要であり、神経は、組織学的検査を基礎として正常であると判断された。
以下の実験において、コンドロイチナーゼ処理が、ラット異種移植モデルにおいて、無細胞性ヒト神経移植片を通じた神経再生を向上させるという仮説を試験した。ヒト神経から取られたサブユニット(個々の束)を一括して溶媒またはコンドロイチナーゼABCで処理した。10-mmの間置神経移植片を、フィブリン糊で補強される神経上膜神経縫合術によりラット宿主坐骨神経に連結した。2匹の宿主ラットのそれぞれは、左右相称の移植片、一方は溶媒処理された移植片および一方はコンドロイチナーゼ処理された移植片を受けた。再生は、最初、8日後に調べられた。軸索伸長は、移植片内の指定された空間的間隔において、横断切片におけるGAP-43免疫陽性プロファイルをスコア化することにより評価された。
動物は、左右相称の神経挫滅かまたは左右相称の神経切断のいずれか、および直接的縫合修復を受けた。同時に、一方の神経は、コンドロイチナーゼABCを注射され、反対側の神経は、溶媒単独を受けた。コンドロイチナーゼ処理が損傷をうけた神経において効果的にCSPGを分解したかどうかを最初に調べた。損傷の部位地点および周囲の神経の組織切片をCSPGネオエピトープ抗体を用いて免疫標識した。これらの抗体は、コンドロイチナーゼABCによるコンドロイチン硫酸鎖の溶解後CSPGコアタンパク質上に創造される新しいエピトープに結合する。図12Aおよび図12Bに示されるように、損傷およびコンドロイチナーゼ適用後4日目に切断された神経において、CSPGネオエピトープ免疫染色は、接合地点および数mm周辺の遠位神経の横断面領域全体にわたって強かった。強い免疫染色はまた、近位神経への数mmにも観察された。図12Cに示されるように、同様の結果が挫滅損傷をうけた神経において得られた。図12Dに示されるように、接合および注射の部位近くの組織のCSPGネオエピトープ標識は、免疫染色手順の一部としてコンドロイチナーゼでの二次処理を組織切片に適用した場合、せいぜいわずかにより強かっただけであった。これらの結果は、コンドロイチナーゼABCでのインビボでの処理が、神経損傷および修復の部位を含む、注射部位を囲む細胞外マトリックスにおいて、完全ではないにしても、実質的にCSPGを分解したことを示している。
コンドロイチナーゼ処理は神経挫滅損傷の部位を通じた軸索伸長を向上させるという仮説を試験した。神経鞘の連続性を維持しつつ、座骨神経を重度に挫滅させることにより、左右相称の軸索断裂症が達せられた。損傷の時点において、一方の神経はコンドロイチナーゼABCを注射され、反対側の神経は溶媒単独を受けた。神経挫滅後の軸索の急速な再伸長のため、損傷部位を渡る軸索伸長は、損傷後2日目に調べられた。再生中の軸索は、GAP-43免疫蛍光により標識され、デジタル画像解析によりスコア化された。対照の神経において予想された通り、図13Aに示されるように、挫滅部位に対してすぐ遠位の軸索再生は、強くかつ神経横断面中に広く行き渡った。同様に、類似した再生応答および伸長パターンは、コンドロイチナーゼ処理された移植片にも観察された。両方の条件において、免疫染色は非常に濃く、多数の神経突起が各基底層管内に見られた。GAP-43免疫反応性の定量的評価は、神経挫滅損傷後の軸索再生がコンドロイチナーゼ適用により有意には影響を受けなかったことを示した(図13B)。同様に、軸索再生の潜伏期または速度は、コンドロイチナーゼ処理された神経において変化した徴候はなかった。
コンドロイチナーゼ処理は神経接合部位を通じた軸索伸長を向上させるという仮説を試験した。座骨神経の鋏での切断により左右相称の神経断裂が達せられ、その後、神経上膜の縫合術およびフィブリン糊により修復された。一方の神経はコンドロイチナーゼABCを注射され、反対側の神経は溶媒単独を受けた。神経切断後の再生の潜伏期のため、接合を横切っての軸索伸長は、損傷後4日目に調べられた。対照神経において、軸索の侵入は、主に所々に生じ、遠位の神経の不連続の小区分に限定された;さもなければ、図14Aに示されるように、少数の軸索のみが、残っている神経の横断面中に散らばっているのが見出された。遠位部へとより遠くへ伸展する軸索の数(4日後)は、急速に減少し、接合部から3 mm以内でゼロに近づいた。対照的に、コンドロイチナーゼ処理された移植片への軸索の侵入は、より強く、神経横断面全体中を広く行き渡った。7/7の動物において、遠位の神経に侵入した軸索の数は、対照神経より、コンドロイチナーゼ処理された移植片において多かった。図14Bに示されるように、平均して、接合に対してすぐ近くの遠位の軸索のスコアは、コンドロイチナーゼ処理された神経において2倍大きく、3/7の動物は、3.5倍を超えて増加した。対照神経と比較したコンドロイチナーゼ処理神経における軸索数の比率は、2:1(ちょうど接合を越える地点)から、遠位の断端の中へとより遠くなる地点において、4:1を超えて累進的に増加した。このように、遠位の神経に侵入する軸索の数を増加させることに加えて、コンドロイチナーゼ処理はまた、軸索侵入の潜伏期を減少させ、かつ/または遠位の神経セグメント内の伸長速度を増加させた。遠位の神経のあらゆる部分における軸索伸長は、厳密に直線であり、神経の縦軸に整列していることは明らかであった。さらに、再生中の軸索(GAP-43)および基底層(ラミニン)についての二重免疫標識は、遠位の神経の基底層内に再伸長しうる軸索の強い性質がコンドロイチナーゼ処理により変化しないことを示した。
新鮮に切除された(細胞性)ラット坐骨神経セグメントを0 %、2 %および10 %ウシ胎児血清を含む培地において、7日間までの間、培養した。対照(培養されていない)および培養された神経を凍結切片にし、それらの神経突起促進活性を凍結切片培養アッセイ法により評価した。結果は、図15Aに示されている。対照神経の切片上に成長した胚性ニワトリDRGニューロンは、118 μmの平均神経突起長であった。1日〜4日間培養された神経外植片の切片上の神経突起伸長は、有意に大きかった。既知組成培地(0 %血清)において培養された神経について、神経突起促進活性は、インビトロでの2日目に最大値に達し、対照神経と比較して43 %増加を示した。2 %血清を含む培地において1日または2日間培養された神経外植片について、神経突起促進活性における70 %を超える増加があった。そのうえ、10 %血清において培養された神経外植片は、インビトロでの2日目に、類似した最大値に達した。神経外植片の神経突起促進活性は、より長い培養期間後には衰え、7日目に、対照条件のレベル以下に落ちた。これらのデータは、神経外植片の神経突起促進活性が、培地への血清の添加の有りおよび無しで、インビトロで短期間培養された場合、著しく増加したことを示している。神経外植片は、培養容器へ付着するのを防止され、細胞増殖は観察されなかった。しかしながら、すべての条件における細胞生存力は、切り刻まれて押しつぶされた神経外植片から培養表面へ強い細胞移動が観察された別の実験において確認された。
凍結切片培養アッセイ法を用いて、インビトロであらかじめ変性されたラット坐骨神経の神経突起促進活性を、インビボであらかじめ変性されたものと比較した。上記のように(図15Aおよび図15Bを参照)、2 %血清中で2日間培養された神経外植片上のDRGニューロンの神経突起伸長は、対照神経(あらかじめ変性されていない)より70 %大きかった。また、より長い期間(4日間および7日間)の神経外植片培養は、結果として、累進的に少ない神経突起促進活性を生じた。7日間培養された神経は、対照条件より37 %少ない活性であった。比較すると、インビボであらかじめ変性された神経の神経突起促進活性は、インビトロであらかじめ変性されたものより非常に低かった。インビボで2日間あらかじめ変性された神経における神経突起伸長は、35.8 μmであり、対照条件(126.5 μm)より72 %少ない活性であった(t検定、p < 0.001)。しかしながら、この抑制は、十分時間が過ぎると逆転し、7日間のインビボでの事前変性は、結果として、対照条件より12 %大きい神経突起伸長を生じた(p = 0.06)。これらのデータは、インビトロでの事前変性が、インビボでの事前変性により達成されるものより大きい程度まで、神経セグメントの神経突起促進活性を増加させたことを示している。
神経セグメントを、MMP阻害剤、GM6001の添加の有りおよび無しの2 %血清含有培地において、2日間培養した。培養された神経の神経突起促進活性は、凍結切片培養アッセイ法により評価された。結果は、図15Bに示されている。図15Aに示されているものと類似して、培養された神経(2日、2 %血清)上に伸長したDRGニューロンの平均神経突起長は、210 μmであり、(培養されていない)対照神経のそれに対して68 %増加を示した。しかしながら、この増加は、GM6001の存在下で培養された神経について、たった14 %までに低下した。各条件における神経セグメントの解離培養(押しつぶし標本)は、細胞生存力の損失がないことを示す豊富な細胞増殖を示した。さらに、単離されたシュワン細胞培養物のGM6001での処理が、このハイドロメート基盤の(hydromate-based)ジペプチドの非常に低い毒性を確証した。これらの結果により、MMP活性が、培養された神経外植片の神経突起促進活性を増加させる変性過程に強く結び付けられる。
MMP-2およびMMP-9は、ゼラチン(開裂されたコラーゲン)を分解する能力がある主要な細胞外プロテイナーゼであり、それらの主な基質は、基底層のコラーゲンIV型である。MMP-2は、インビボでシュワン細胞により恒常的に発現され、ラットにおいて神経損傷後、上方制御される。他方、MMP-9は、正常な神経において検知されず、侵入している顆粒球およびマクロファージに関連して損傷後に存在する。本発明におけるインビトロでの神経変性の試験は、造血細胞による最小限の寄与により、常在の神経細胞によるMMP発現の役割を決定する唯一の機会を提供する。培養された神経外植片におけるMMPレベルは、まず、ゼラチン基質重層ゲル電気泳動法(酵素電気泳動法)により調べられた。ゼラチン酵素電気泳動法は、MMP-2およびMMP-9の検出において非常に感度が高く、潜在性型および活性型の両方を明らかにするという追加の利点をもつ。神経セグメントを2 %血清の存在下において1日、2日、4日、および7日間、培養した。抽出された神経の代表的な酵素電気泳動分析が図16に示されている。正常な(培養されていない対照)神経は、ヒト組換えMMP-2のプロ型と共移動するMr = 72 kDに優勢なゼラチン溶解バンドを示した。微量の活性MMP-2が観察された(Mr = 66 kD)が、MMP-9(Mr = 92 kDおよび84 kD)は検出されなかった。培養された神経において、活性MMP-2における急速な増加および全MMP-2含有量における実質的増加があった。MMP-9は、1日間または2日間培養された神経において検知されず、4日目および7日目の試料において活性MMP-9の痕跡量であった。同様の結果は、既知組成培地において培養された神経外植片について得られ、血清が神経試料において観察されたゼラチン溶解活性に寄与していなかったことが確認された。これらの発見は、MMP-2が、インビトロでの神経変性において、急速に活性化されかつ上方制御されることを示している。ゼラチン酵素電気泳動法は、MMP-2よりMMP-9を検出することにおいて数倍感度が高いことは注目に値し、(Ladwigら、[2002] Wound Repair Regen 10:26-37)、神経試料におけるMMP-9含有量は無視してよいことを意味している。
MMPの活性は、遺伝子転写、酵素前駆体活性化、およびメタロプロテイナーゼの組織阻害剤の作用により制御される。インサイチュー酵素電気泳動法による神経セグメントにおける正味のゼラチン溶解活性を調べた。組織切片を、組織内のゼラチン溶解活性により蛍光性ペプチドへ変換される、消光したフルオレセイン-ゼラチンで重層した。構成性のゼラチン溶解活性は、神経内膜基底層に沿って整列したシュワン細胞に大部分関連した正常な神経において検出された(図17Aおよび図17Bに示されるように)。図17Cおよび図17Dに示されるように、培養された神経において、神経内膜内に拡散したゼラチン溶解活性における広く行き渡った増加があり、シュワン細胞はより強く標識された。GM6001の存在下で培養された神経におけるゼラチン溶解活性もまた調べた。上で記載されているように、GM6001は、培養された神経に観察される神経突起促進の増加を妨害した。図17Eおよび図17Fに示されるように、GM6001処理された神経外植片におけるゼラチン溶解活性は、ほとんど検知されなかった。これらの発見を合わせると、ゼラチン溶解活性は神経外植片培養により著しく増加したこと、およびGM6001はインビトロ変性の間、新たなMMP活性を効果的に妨害したことを示している。
2日間培養された神経外植片におけるMMP-2およびMMP-9の分布を免疫蛍光顕微鏡により調べた。図18Aに示されるように、培養神経のMMP-2免疫標識は、シュワン細胞およびその周囲の基底層内で強かった。S-100でのシュワン細胞染色は、最も強いMMP-2免疫標識が、移動しているシュワン細胞と関連していることを示した(図18B;および下記参照)。また、MMP-2免疫発現は、インサイチュー酵素電気泳動法により得られたゼラチン溶解活性のパターンに非常に類似していた。他方、MMP-9免疫標識は、まれな細胞プロファイルを除いては、神経束内に事実上存在しなかった。図18Cに示されるように、いくらかのMMP-9の細胞免疫発現が周囲の神経上膜に見られた。図18Dに示されるように、OX42標識は、培養された神経の神経上膜全体およびまれに神経束内に散らばったマクロファージを同定するために用いられた。MMP-9およびOX42標識の区画別分布により、マクロファージがMMP-9の主要な供給源であることが示唆された。さらに、シュワン細胞、およびおそらくはいくつかの神経周膜の線維芽細胞が、MMP-2を発現しており、MMP-2免疫反応性はまた、周囲の細胞外マトリックスに拡散しているのが観察された。
神経損傷後、シュワン細胞は活性化状態になり、それらのミエリンを解離し、広く移動する。図18Bに示されるように、培養された神経外植片のS-100免疫標識により、多くのシュワン細胞が、損傷応答の典型であるが、それらの細長い形態および軸索との密接な連合を喪失したことが示された。循環系から接続を断たれた場合に予想されるように、神経外植片におけるマクロファージの数が、インビボでの神経変性において観察されるものより、非常に低かった。さらになお、図18Dに示されるように、ごく少数のマクロファージだけが神経束内に見出され、ほとんどすべてのOX42標識細胞は、神経上膜に限られた。神経切除の時点で神経上膜区画に存在していたマクロファージが、培養の間に内部の神経区画へ侵入しなかったことは、明らかであった。従って、インビトロでの神経外植片は、シュワン細胞の寄与が、侵入しているマクロファージのそれとは独立して評価されうる神経変性のモデルを表している。
本実験は、インビトロでの事前変性が無細胞性神経同種移植片を通しての神経再生を向上させるという仮説を試験する。宿主ラットは、1つの対照(あらかじめ変性されていない)および1つのインビトロであらかじめ変性されている(2日間、2 %血清中で培養される)、左右相称の無細胞性神経移植片を受けた。軸索再生は、8日後、横断切片におけるGAP-43免疫陽性プロファイルをスコア化することにより評価された。図20Aおよび図20Bに示されるように、軸索伸長はすべての移植片において観察され、中央に分布されて、近位の宿主神経と移植片の良好なアライメントおよび接合を示した。6/6の動物において、近位の神経-移植片の接合を横断し、移植片に侵入する軸索の数は、インビトロであらかじめ変性された移植片において、その反対側の対照移植片よりも多かった。図20Bに示されるように、平均して、インビトロであらかじめ変性された移植片内の軸索のスコアは、2倍大きかった。両方の移植片条件において、軸索伸長は、基底層管内に生じ、宿主由来シュワン細胞を伴った。これらの発見は、無細胞性神経移植片への軸索再生がインビトロでの事前変性により増強されることを示している。
Claims (23)
- 以下の段階を含む、移植のための神経移植片を調製する方法:
神経移植片中のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを分解することを含む、インビトロで神経移植片を事前変性させる段階;及び、
該神経移植片中の細胞を死滅させる段階。 - 事前変性段階が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を神経移植片に適用することを含む、請求項1に記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、神経移植片中でコンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン‐6‐硫酸、もしくはコンドロイチン‐4‐硫酸とコンドロイチン‐6‐硫酸の両方の溶解を引き起こす、請求項2に記載の方法。
- 事前変性段階が、神経移植片を培養することを含む、請求項1に記載の方法。
- 培養が、24時間から96時間までの範囲内の時間で行われる、請求項4に記載の方法。
- 培養が、10℃から37℃までの範囲内の温度で行われる、請求項4に記載の方法。
- 移植後の、接合部位における、損傷を受けた神経から神経移植片への軸索の侵入を、事前変性を受けない神経移植片と比べて促進するよう神経移植片を調整する、請求項1に記載の方法。
- 移植後の、神経移植片と宿主の神経組織との間の界面の軸索の横断を、事前変性を受けない神経移植片と比べて促進する、請求項1に記載の方法。
- 神経移植片が移植後の軸索の侵入を支持する能力を有し、無傷の基底層管を含む、請求項1に記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、それらの生物活性のある断片若しくは変異体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼである、請求項10に記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、コンドロイチナーゼAC、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2、マトリックスメタロプロテイナーゼ-9、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
- 神経移植片中の細胞の死滅が、凍結死滅および化学処理の少なくとも一つを含む、請求項1に記載の方法。
- 神経移植片が末梢神経の組織を含む、請求項1に記載の方法。
- 神経移植片が中枢神経系の組織を含む、請求項1に記載の方法。
- 神経移植片が哺乳動物の組織を含む、請求項1に記載の方法。
- 神経移植片が自家移植片である、請求項1に記載の方法。
- 神経移植片が同種移植片である、請求項1に記載の方法。
- 神経移植片を保存のために凍結させる段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 事前変性段階が、神経移植片を培養すること、及び、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を神経移植片に適用することを含む、請求項1に記載の方法。
- 細胞を死滅させる段階に続き、少なくとも一つの細胞を神経移植片に加える段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 神経移植片に、該神経移植片への電気的刺激の提供及び神経電気的活性の記録の少なくとも一方を促進する材料を適用する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 請求項1乃至22のいずれか一項に記載の方法により調製される、神経移植片。
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