ES2319857T3 - Atenuacion de la angiogenesis mediante el uso de enzimas que degradan sulfato de condroitina. - Google Patents
Atenuacion de la angiogenesis mediante el uso de enzimas que degradan sulfato de condroitina. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2319857T3 ES2319857T3 ES00978781T ES00978781T ES2319857T3 ES 2319857 T3 ES2319857 T3 ES 2319857T3 ES 00978781 T ES00978781 T ES 00978781T ES 00978781 T ES00978781 T ES 00978781T ES 2319857 T3 ES2319857 T3 ES 2319857T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- chondroitinase
- enzymes
- enzyme
- sulfate
- angiogenesis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/51—Lyases (4)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
El uso de una enzima que degrada sulfato de condroitina en la fabricación de un medicamento para reducir la angiogénesis.
Description
Atenuación de la angiogénesis mediante el uso de
enzimas que degradan sulfato de condroitina.
La invención presente proporciona formulaciones
que usan enzimas condroitinasa AC y B que degradan
glicosaminoglicanos para inhibir la angiogénesis, y poder tratar
así o prevenir varios tipos de cáncer.
Los proteoglicanos sobre la superficie de la
célula y en la matriz extracelular contienen cadenas de
glicosaminoglicanos variables, que incluyen sulfato de heparán y
sulfatos de condroitinasa A, B, o C. Mientras que algunos
proteoglicanos contienen solamente un tipo de glicosaminoglicanos,
otros contienen una mezcla de heparán y sulfatos de condroitina
(Jackson et. al., Physiol. Rev.
71:481-530,1991). Los proteoglicanos
extracelulares constituyen una base estructural para células y
tejidos, y en conjunto con los proteoglicanos celulares, tienen
funciones muy importantes en regular la adherencia, la migración, y
proliferación a la célula. La interrupción de la síntesis normal y
la función de proteoglicanos se piensa que juega un papel importante
en la metástasis en las células tumorales.
La metástasis de tumor es el proceso por el que
las células malignas de un tumor se extienden en todo el cuerpo y
se transforman en tumores secundarios múltiples (Lida et al.
Sem. Cancer Biol. 7: 155-162, 1996; Meyer y
Hart Eur. J Cancer. 34:214-221, 1998). Para
extenderse a otras partes del cuerpo, las células tumorales deben
escaparse del tumor principal u original, participar en el flujo de
sangre o el sistema linfático y desde allí invade el tejido de
otros órganos, donde se multiplican y constituyen nuevos tumores. El
escape desde el tumor principal y la invasión dentro de otros
órganos es un proceso multietapa complejo. Las metástasis
involucran los cambios en la adherencia y la movilidad de la célula
tumoral, la secreción de enzimas proteolíticas, quimicoatrayente, y
proteoglicanos. Además de estas actividades de la célula tumoral,
angiogénesis, o la formación de nuevos vasos sanguíneos, es también
un paso esencial en el proceso metastático (Folman Medicine Nature
1:27-31, 1995).
La participación de diferentes clases de
glicosaminoglicanos en la metástasis de la célula tumoral ha sido
investigada. Los sulfatos de heparán sobre la superficie de la
célula parecen inhibir la movilidad de la célula (Culp et
al. J. Biol. 79:788-801, 1978). Los
sulfatos de heparán en la matriz extracelular actúan para inhibir
el movimiento de la célula a través de la formación de una red
ajustada con otros componentes de matriz. Las células tumorales
pueden segregar una enzima que degrada glicosaminoglicano, la
heparanasa, que rompe los sulfatos de heparán y aumenta el escape
del tumor y promueve la metástasis (Culp, et al. J. Cell
Biol. 79:788-801, 1978; Nakajima et al.
Science 220:611-613, 198).
Por el contrario, los sulfatos de condroitina
nunca han sido vinculados a un aumento de la movilidad en células
de endotelio o tumorales (Culp et al. 1978). Cuando la
formación de proteoglicanos de sulfato de condroitina se inhibe al
tratar células con xilosidas, la movilidad, la migración y la
habilidad de invadir el material de matriz son inhibidas (Henke
et al., J. Clin. Invest.
97:2541-2552, 1996; Faassen et al., J.
Biol Cell. 116:521-531, 1992 and Trochan et
al. Int. J. Cáncer 66:664-668, 1996). La
remoción de sulfatos de condroitina de la superficie de célula con
condroitinasa ABC también reduce la movilidad de la célula (Faassen
et al., 1992); sin embargo los efectos de esta enzima sobre
la invasión o metástasis, o sobre la angiogénesis no son
conocidos.
Es un objetivo de la presente invención
suministrar métodos para la fabricación de un medicamento para
tratar o prevenir la angiogénesis.
Es un objetivo adicional de la presente
invención proporcionar formulaciones para tratar o prevenir la
angiogénesis.
Una enzima que degrada glicosaminoglicano
altamente purificada y específica, la condroitinasa AC, y en menor
grado, la condroitinasa B, puede ser usada en el tratamiento de los
cánceres metastáticos. La eliminación enzimática del sulfato de
condroitina A y C, y en una extensión menor, del sulfato de
condroitina B, de las células tumorales superficiales, A) disminuye
su habilidad de proliferar cuando se estimulan por factores de
crecimiento oncogénicos, B) reduce la habilidad de células tumorales
de invadir vasos sanguíneos y previene así la formación de tumores
metastáticos o secundarios, y C) reduce la angiogénesis inhibiendo
la proliferación de célula de endotelio y la formación de vaso
capilar. Reducir la formación de nuevos vasos sanguíneos en el
tumor por su parte reduce el potencial de crecimiento del tumor, y
reduce también la habilidad de las células tumorales de invadir la
corriente sanguínea. Estos efectos anti-metastáticos
de las condroitinasas son opuestos a los efectos
pro-metastáticos de las heparanasas segregadas por
los tumores.
Las figuras 1A y 1B son gráficos del lanzamiento
de glicosaminoglicanos sulfatados de células humanas de melanoma de
SK-MEL, siguiendo el tratamiento con condroitinasa
AC procedente de Flavobacterium heparinum. La Figura 1A es
el lanzamiento de ^{35}S-glicosaminoglicanos
después del tratamiento con la concentración indicada (control.,
0,1; 1 y 2 IU/ml) de la enzima por una hora. La figura 1B es el
lanzamiento de ^{35}S-glicosaminoglicanos después
del tratamiento con 1,0 IU/ml de enzima por el tiempo indicado,
cero, 5, 15, 30 y 60 minutos. Los datos son cpm/pocillo de
^{35}S-glicosaminoglicanos liberado por el
tratamiento con la enzima o por el medio (control), la media \pm
sem de los experimentos representativos realizada por
cuadruplicado.
La Figura 2 es un gráfico de los efectos
dosis-dependiente (0, 1,0; y 10 IU/ml) de
condroitinasa AC procedente de Flavobacterium heparinum
sobre la invasión de melanoma SK - MEL y células de fibrosarcoma
HT-1080 en Matrigel^{TM}. Los datos son
expresados como el número de células que migraron a través de los
filtros y Matrigel^{TM} y son el número de células contado en
diez campos microscópicos 400 X. Cada barra representa la media
\pm sem de tres experimentos realizados por duplicado.
La Figura 3 es un gráfico de los efectos
dosis-dependiente de condroitinasa AC procedente de
Flavobacterium heparinum (ChAC) (0, 0,1; 1,0; 5,0; y 10
IU/ml) sobre proliferación de célula de melanoma en respuesta a 10%
del suero. Los datos son el número medio de células/pocillo, 48
horas después del tratamiento de células SK - MEL con cualquier
ChAC o medio solo (control). Cada barra representa la media \pm
sem de cuatro experimentos realizados por triplicado.
La Figura 4 es un gráfico de los efectos
dosis-dependiente de condroitinasa AC procedente de
Flavobacterium heparinum sobre la proliferación de células de
endotelio en respuesta a 20 ng/ml del factor de crecimiento
endotelial vascular. Los datos son la media \pm sem de cinco
experimentos realizados por cuadruplicado.
La Figura 5 es un gráfico de los efectos
dosis-dependiente de condroitinasa AC procedente de
Flavobacterium heparinum sobre angiogénesis dentro de
Matrigel^{TM}. Los datos son el número de estructuras de tipo
vaso capilar (CLS) presente por campo 100X. Cada barra representa la
media \pm sem de cinco experimentos realizados por duplicado.
La Figura 6 es un gráfico de la comparación de
los efectos de condroitinasa AC procedente de Flavobacterium
heparinum, y condroitinasa B, y la combinación de condroitinasa
AC y B sobre la proliferación de célula tumoral, la invasión de
célula tumoral, la proliferación endotelial y la angiogénesis. Los
efectos de 1,0 IU/ml o 5,0 IU/ml (proliferación endotelial) de
condroitinasa AC y condroitinasa B, sobre estas actividades
celulares fueron determinados como se describe en la Figuras de 2 a
5. Los datos son expresados como los % de inhibición, determinados
comparando las respuestas de células sin tratar y tratadas de
condroitinasa. Cada barra representa la media \pm sem de cinco
experimentos para cada actividad.
La Figura 7 es un gráfico de los efectos de
condroitinasa AC procedente de Flavobacterium heparinum (0,1
a 10 IU/ml) y condroitinasa B (1,0 IU/ml) sobre la melanoma y
apoptósis de células endoteliales. Los datos son expresados como el
% control, determinado por comparación de la actividad de células
tratadas con condroitinasa con el de controles sin tratar (100%). El
inductor de apoptósis, genisteína (40 mg/ml), fue usado como un
control positivo. Cada barra representa la media \pm sem de cinco
experimentos realizados por duplicado.
La Figura 8 es un gráfico de los efectos de
condroitinasa AC procedente de Flavobacterium heparinum sobre
el crecimiento de tumor in vivo en ratones. A los ratones se
les implantó subcutáneamente células de un carcinoma de pulmón de
Lewis de ratón en el día 0. Los animales fueron inyectados,
directamente en el tumor, en los días 7, 8, 9, 11, y 13 con unas 55
IU de la condroitinasa AC o con un volumen similar de salino. Los
animales fueron sacrificados y el tamaño del tumor fue medido en los
días indicados. Los datos son mostrados como el tamaño de tumor en
mm^{2}, y son la media \pm sem de 10 ratones por grupo. Los
asteriscos indican una diferencia estadística entre grupos; *indica
p=0, 035, y **indica p <0,005.
Los eventos en las metástasis de, crecimiento
de, y angiogénesis dentro de tumores cancerosos pueden ser inhibidos
por el uso de una o más enzimas que degradan glicosaminoglicanos
altamente purificadas procedentes de varios orígenes, pero con
preferencia de Flavobacterium heparinum. Los
glicosaminoglicanos, incluyendo sulfatos de condroitina A, B o C, y
sulfato de heparán, son los componentes polisacáridos sulfatados de
proteoglicanos ubicados en las superficies de célula, donde actúan
como co-receptores en las interacciones entre
proteínas de factor determinante de célula y componentes de matriz
extracelular como el ácido hialurónico y los colágenos; y en el
espacio de extracelular donde se forma la estructura de la matriz
extracelular y sirven como soporte de la estructura organizativa de
los tejidos y órganos.
Los sulfatos de condroitina se ha descubierto
que están relacionados con una molécula de adherencia de la célula,
CD44, que es importante en la invasión de la célula tumoral. Las
actividades biológicas de CD44 han sido vinculadas con los sulfatos
de condroitina sobre esta proteína (Faassen, et. al. J.
Science Cell 105:501-511, 1993). Los anticuerpos
para CD44 inhiben la formación de tumores metastáticos in
vivo (Zawadzki et. al. Int. J. Cáncer
75:919-924, 1998), e inhiben la migración de las
células endoteliales y la formación de estructuras de tipo vaso
capilar in vitro (Henke et. al. 1996 y Trochan et.
al. 1996).
La combinación de los datos de estudios sobre
los efectos inhibidores de los sulfatos de condroitina y estudios
sobre los efectos de anticuerpos anti-CD44, resulta
en la conclusión de que los sulfatos de condroitina tienen un papel
esencial tanto en las células tumorales como en el crecimiento de
células endoteliales y la formación de vasos (angiogénesis). Este
papel de los sulfatos de condroitina en la angiogénesis es relevante
por su papel en el crecimiento sostenido de los tumores y la
metástasis de tumor, ya que la formación de nuevos vasos sanguíneos
es esencial para proporcionar nutrientes a un tumor en crecimiento y
proveer una vía por la que las células tumorales invasoras se
desplazan a órganos distantes y forman tumores secundarios.
La condroitinasa AC y la condroitinasa B
descritas en los ejemplos son enzimas que degradan
glicosaminoglicanos procedentes de Flavobacterium heparinum.
Estas enzimas retiran y degradan glicosaminoglicanos de
proteoglicanos, y ajustan las interacciones implicadas en la
invasión y proliferación de células tumorales, así como los procesos
implicados en la formación y proliferación del vaso capilar
endotelial. La condroitinasa AC y la condroitinasa B regulan el
crecimiento y metástasis de células tumorales al: i) romper los
proteoglicanos de sulfato de condroitina de la superficie celular;
ii) reducir la capacidad invasora de células tumorales degradando
sulfatos GAGs de condroitina vinculados a CD44; iii) disminuir la
proliferación de células endoteliales y la formación de vasos
capilares y reducir con ello el suministro de nutrientes al tumor y
reducir el acceso de la célula tumoral al flujo sanguineo; e iv)
inhibir directamente la proliferación de factor dependiente del
crecimiento de tumores.
Los glicosaminoglicanos son polisacáridos no
ramificados que constan de residuos alternantes de hexosamina y
hexurónicos que llevan grupos de sulfato en posiciones diferentes.
Esta clase de moléculas puede ser dividida en tres familias de
acuerdo con la composición del nodo central de disacáridos. Éstas
son: sulfato de heparina/heparán [HexA - GlcNAc (SO_{4})];
sulfato de condroitina [HexA - GalNAc]; y sulfato de keratán [Gal-
GlcNAc].
Las enzimas que degradan glicosaminoglicanos
representativas incluyen heparinasa 1 de Flavobacterium
heparinum, heparinasa 2 de Flavobacterium heparinum,
heparinasa 3 de Flavobacterium heparinum, condroitinasa AC
de Flavobacterium heparinum, y condroitinasa B de
Flavobacterium heparinum, heparinasa de cepas
Bacteroides, heparinasa de Flavobacterium Hp206,
heparinasa de la especie Citofagia, enzimas que degradan
sulfato de condroitina de especies Bacteroides, enzimas que
degradan sulfato de condroitina de especies de Proteus
vulgaris, enzimas que degradan sulfato de condroitina de
especies de Microcossus, enzimas que degradan sulfato de
condroitina de especies de Vibrio, enzimas que degradan
sulfato de condroitina de especies de Arthrobacter
aurescens, las enzimas expresadas de secuencias recombinantes de
nucleótidos en bacterias y combinaciones de éstas. Otras enzimas
que degradan glicosaminoglicanos están presentes en las células de
mamíferos e incluyen heparanasas, arilsulfatasa B,
N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa,
y sulfatasa de iduronato.
La familia de sulfato de condroitina incluye
siete subtipos designados de sulfato de condroitina no sulfatado,
sulfato de condroitina sobresulfatado y sulfatos de condroitina
A-E que varían en el número y posición de su grupo
funcional de sulfato. Adicionalmente, el sulfato de condroitina B,
también denominado sulfato de dermatán, difiere en que el ácido
idurónico es el residuo predominante en la posición del ácido de
hexurónico alternativo.
Los sulfatos de condroitina A, B y C son las
formas predominantes encontradas en mamíferos y podrían estar
implicados en la modulación de varias actividades biológicas que
incluyen la diferenciación celular, adhesión, vía enzimática e
interacción de hormonas. La presencia de proteoglicanos de sulfato
de condroitina es elevada en las etapas posteriores del crecimiento
de la célula en respuesta a daños en tejido y vasos, según fue
reportado por Yeo, et al., Am. J. Pathol.
138:1437-1450, 1991, Richardson y Hatton, Exp. Mol.
Pathol. 58:77-95, 1993 y Forrester, et al.,
J. Am. Coll. Cardiol. 17:758-769, 1991. Los sulfatos
de condroitina también han sido relacionados con los eventos
involucrados en la evolución de la enfermedad vascular y consumo de
lipoproteína como se describe en Tabas, et al., J. Biol.
Chem., 268 (27):20419-20432, 1993.
Las condroitinasas han sido separadas de algunas
especies bacteriales: Flavobacterium heparinum, Aeromonas sp.,
Proteus vulgaris, Aurebacterium sp. Bacillus thetaiotamicron
(Linhardt et. al., 1986; Linn et. al., J. Bacteriol.
156:859-866, 1983; Michelacci et. al.,
Biochim. Biophys. Acta. 923:291-201, 1987; y Sato
et al., Agric. Biol. Chem. 50:1057-1059,
1986). La PCT/US95/08560 "Condroitina Lyase enzymes" de Ibex
Technologies R y D, Inc., et al. describe métodos para la
purificación de condroitinasas producidas naturalmente,
especialmente la separación de condroitinasa AC de la condroitinasa
B, así como la expresión y purificación de condroitinasas
recombinantes. Las enzimas de mamíferos que degradan sulfatos de
condroitina incluyen arilsulfatasa B,
N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa,
y sulfatasa de iduronato.
Los compuestos farmacéuticos se preparan usando
la enzima que degrada glicosaminoglicanos como agente activo para
inhibir el crecimiento de tumores o la angiogénesis sobre la base de
la aplicación específica. La aplicación es tópica, localizada o
sistémica. Cualquiera de estas formulaciones podría incluir también
conservantes, antioxidantes, antibióticos, inmunosupresores y otros
agentes biológica o farmacéuticamente eficaces que no ejerzan un
efecto perjudicial sobre la enzima que degrada glicosaminoglicanos o
las células. Para el tratamiento de los tumores, la composición
podría incluir un agente citotóxico que mata selectivamente las
células tumorales que se reproducen más rápido, muchos de los
cuales son conocidos y están clínicamente en uso.
Para la aplicación tópica, la enzima que degrada
glicosaminoglicano es combinada con un portador con el propósito de
que una dosis efectiva sea repartida, según la actividad deseada, en
el sitio de la aplicación. La composición tópica puede aplicarse a
la piel para el tratamiento de las enfermedades como la psoriasis.
El portador puede ser en forma de un ungüento, crema, gel, engrudo,
espuma, aerosol, supositorio, tampón o barra con gel. Un compuesto
tópico para el tratamiento de los trastornos de ojo consta de una
cantidad efectiva de enzima que degrada glicosaminoglicanos en un
excipiente aceptable oftalmológicamente como un buffer salino,
aceite mineral, aceites vegetales como aceite de maíz o arachis,
jalea de petróleo, Miglyol 182, soluciones de alcohol, liposomas o
productos tipo liposomas.
Los compuestos para administración local o
sistémica, por ejemplo, dentro de un tumor generalmente incluirán a
un diluente inerte. Las soluciones o suspensiones usadas para
aplicación parenteral, intradérmica, subcutánea o tópica pueden
incluir los siguientes componentes: un diluente estéril como el agua
para inyección, solución salina, aceites fijos, glicoles de
polietileno, glicerina, glicoles de propileno u otros disolventes
sintéticos; agentes antibacterianos como alcohol bencilo o
metilparabenos; antioxidantes como ácido ascórbico o bisulfito de
sodio; agentes quelantes como ácido de etilendiaminotetraacético;
tampones como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el
ajuste de tonicidad como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación
parental puede meterse en ampollas, jeringas desechables o viales
de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.
Para las aplicaciones tópicas internas
dirijidas, por ejemplo para el tratamiento de tumores sólidos,
sitios de resección o hemorroides, la composición puede ser en
forma de pastillas o cápsulas, que pueden contener cualquiera de
los siguientes ingredientes o compuestos de una naturaleza similar:
un atador como la celulosa microcristalina, goma de tragacanto o
gelatina; un excipiente como almidón o lactosa, un agente
desintegrante como el ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz;
un lubricante como estereato de magnesio o Sterotes; o un aditivo
como dióxido de silicio coloidal. Cuando la unidad de dosis es una
cápsula, puede contener un portador líquido como un aceite graso,
además del material del tipo anterior. Además, las formas de unidad
de dosis pueden contener otros materiales diversos que modifican la
forma física de la unidad de dosis, por ejemplo, capas de azúcar,
laca u otros agentes entéricos.
La enzima que degrada glicosaminoglicanos
también puede ser administrada en combinación con un implante
polimérico biocompatible que libera la enzima que degrada
glicosaminoglicanos durante un período controlado de tiempo en un
sitio seleccionado. Ejemplos de materiales poliméricos
biodegradables preferidos incluyen polianhidridos, poliortoésteres,
poliglicoliácido, poliésteres como el ácido poliláctico, el ácido
poliglicólico, el acetato de vinilpolietileno, copolímeros y
mezclas de éstos. Ejemplos de materiales poliméricos no
biodegradables preferidos incluyen copolímeros de acetato de
viniletileno.
La enzima que degrada glicosaminoglicano puede
ser administrada individual o conjuntamente con otros tratamientos.
Por ejemplo, las enzimas pueden ser administradas con antibióticos,
citoquinas, y antiinflammatorios como cortisona y otras clases de
inhibidores angiogénicos. Las otras combinaciones serán evidentes
para expertos. En algunas realizaciones, las enzimas son
administradas con una barrera, como metilcelulosa u otro material
polimérico, ya sea tópicamente en el momento de la cirugía o
incorporadas en la barrera, que es insertada en el momento de la
cirugía.
Una variedad de trastornos a tratar. En la
realización principal, las enzimas condroitinasa AC y la
condroitinasa B, que degradan glicosaminoglicanos, son usadas para
inhibir la formación, crecimiento y metástasis de tumores,
especialmente tumores sólidos. Ejemplos de tumores incluyen
carcinomas, adenocarcinomas, limpohomas, sarcomas y otros tumores
sólidos, como se describe en la Patente US 5,945,403 de Folkman
et al., tumores sólidos; tumores de la sangre, como
leucemias; metástasis de tumor; tumores benignos, por ejemplo
hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, trachomas, y
granulomas biogénicos. Pueden ser tratados otros trastornos que
involucran angiogénesis, incluyendo la artritis reumatoidea;
psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo,
retinopatía diabética, retinopatía de prematuros, degeneración
macular, rechazo de injerto córneo, glaucoma neovascular,
fibroplasia retrolental, rubeosis; síndrome de
Osler-Webber; angiogénesis de miocardio;
neovascularización de placa; tel-angiectasia
articulaciones hemofiliacas; angiofibroma; enfermedad del estímulo
excesivo o anormal de células endoteliales, incluyendo adhesiones
intestinales, la enfermedad de Crohn, la aterosclerosis,
escleroderma, y las cicatrices hipertróficas, por ejemplo:
queloides y enfermedades que tienen angiogénesis como una
consecuencia patológica como la enfermedad por arañazo de gato
(Rochele minalia quintosa) y las úlceras (Helicobacter
pylori). Los inhibidores angiogénicos pueden ser usados para
prevenir e inhibir adhesión especialmente
intra-peritoneal o pélvica tales como las
resultantes después de una operación abierta o laproscópica, y
contracciones de quemado. Otras dolencias que pueden ser tratadas
beneficiosamente usando los inhibidores de angiogénesis incluyen la
prevención de dejar una cicatriz tras un transplante, la cirrosis
hepática, fibrosis pulmonar posterior al síndrome de dolor
respiratorio agudo u otra fibrosis pulmonar del recién nacido, la
implantación de prótesis temporales, y adhesiones después de la
cirugía entre el cerebro y el duramadre. La endometriosis, poliposis
hipertrofía cardíaca, así como la obesidad, también pueden ser
tratadas por inhibición de angiogénesis. Estos trastornos pueden
conllevar aumentos en tamaño o crecimiento de otras clases de tejido
normal, como fibroides uterinos hipertrofia prostática y
amiloidosis.
La angiogénesis, la proliferación y la migración
de células endoteliales que resultan en la formación de nuevos
vasos sanguíneos, es un evento esencial en una gran variedad de
procesos normales y patológicos. Por ejemplo, la angiogénesis tiene
un papel crítico en la embriogénesis, la curación de heridas, la
psoriasis, la retinopatía diabética y la formación de tumor, como
se describe en Folkman, J. Angiogénesis and its inhibitors. In: V.
T. DeVita, S. Hellman y S. A. Rosenberg (eds.). Important Advances
in Ontology, pp. 42-62, (J. B. Lippincott Co.,
Filadelfia, 1985); Brem, H., et al., Brain tumor angiogenesis
In: P. L. Kornblith y M. D. Walker (eds.), Advances in
Neuro-Oncology, pp. 89-101. (Future
Publishing Co., 1988 de Mount Kisco, NY 1988); Folkman, J. Tumor
angiogenesis: therapeutic implications. N. Engl. J. Med, 285;
1182-1186 (1971); y Folkman, J. Successful
treatment of an angiogenic disease. N. Engl. J. Med,
320:1211-1212 (1989).
La identificación de varios agentes que inhiben
la angiogénesis del tumor ha suministrado un marco conceptual para
el conocimiento de la angiogénesis en general. La inhibición de
angiogénesis por ciertos esteroides y derivados de heparina,
reportada por Folkman, J., et al., Science 221:719 (1983); y
Murray, J. B., et al., J. Biol. Chem,
261:4154-4159 (1986); lleva a estudios que aclaran
el papel crucial de remodelación de la matriz extracelular en la
angiogénesis. Estos agentes previenen la angiogénesis alterando
específicamente la deposición e inter-vinculación
de colágeno, como es reportado por Ingber, D., and Folkman, J. Lab.
Invest. 59:44-51 (1989).
Otros estudios sobre la inhibición de
angiogénesis han acentuado la importancia de remodelado mediado de
enzimas de la matriz extracelular en el crecimiento y la
proliferación de vasos capilares (Folkman, J., et al.,
Science 221:719-725 (1983); Ingber, D., et
al. Laboratorio. Invest. 59:44-51 (1989);
Folkman, J., et al., Science 243: 1490-1493
(1989); Krum, R, et al., Science
230:1375-1378 (1985); Ingber, D., et al.,
Endocrinol. 119: 1768-1775 (1986); e Ingber, D.,
et al., J. Cell. Biol. 109:317-330
(1989)).
La composición puede administrarse
sistemáticamente usando cualquiera de varias rutas que incluyen
subcutánea, intravenosa, intracraneal, oral, o mediante un
depósito. La composición puede administrarse por medio de una bomba
de infusión, por ejemplo, del tipo usado para entregar insulina o
quimioterapia a órganos específicos o a tumores, o por
inyección.
La condroitinasa AC y condroitinasa B pueden ser
inyectadas usando una jeringa o catéter directamente en un tumor o
en el sitio de un tumor primario antes o después de extirpación; o
sistemáticamente tras la extirpación del tumor primario.
Las formulaciones de enzima son administradas
tópicamente o a nivel local a conveniencia. Para administración
local prolongada, las enzimas pueden ser administradas en un
implante de liberación controlada inyectado en el sitio de un
tumor. Para el tratamiento tópico de una enfermedad de piel, la
formulación de enzima puede ser administrada a la piel en un
ungüento o gel.
Una dosis efectiva puede ser determinada por la
cantidad de unidades de actividad de enzima (IU) por tumor. Un
rango de dosis efectiva esperado incluye de 0,1 a 250 IU/tumor para
los tamaños de tumores esperados en rangos de 20 mm^{3} a 15
cm^{3}.
La presente invención será comprendida con mayor
claridad por referencia a los siguientes ejemplos no
restrictivos.
La condroitinasa B (sin número de EC) y la
condroitinasa AC (EC 4.2.2.5) son enzimas originarias de
Flavobacterium heparinum y también pueden ser expresadas de
modo recombinante en esta misma bacteria (Gu et. al.,
Biochem. J. 312:569-577 (1995)).
La actividad específica y la especificidad del
sustrato fueron determinada para cada enzima usando un ensayo
espectrofotométrico cinético, llevado a cabo realizado como se
describe en Gu et al. (1995). En estos ensayos, las
concentraciones de enzima fueron de 0,25 IU/ml y las concentraciones
de sustrato de 0,5 mg ml (sulfato de condroitinasa B y sulfato de
condroitinasa AC) ó 0,75 mg/ml (sulfato de heparán). Las actividades
específicas de las enzimas fueron: 97 IU/mg para condroitinasa B y
221 IU/miligramos para condroitinasa AC.
La especificidad de sustrato de condroitinasa B
y AC ultrapurificada fue determinada evaluando la habilidad de las
enzimas para degradar sulfato de condroitina B, sulfato de
condroitina A, sulfato de condroitina C, y sulfato de heparán. Como
se muestra en la Tabla 1, ambas enzimas estaban activas frente al
glicosaminoglicano sulfatado correspondiente, con 0,2% o menos de
actividad contra cualquiera de los otros glicosaminoglicanos. Estos
resultados confirman la especificidad de sustrato de la
condroitinasa B y la condroitinasa AC purificada usadas en esta
aplicación.
Las actividades de enzima son mostradas como
IU/ml con cada sustrato, y como actividad relativa frente a cada
sustrato. La actividad relativa fue determinada después de atribuir
100% al sustrato preferido (CSB para condroitinasa B, CSA para la
condroitinasa AC. CSB = sulfato de condroitina B; CSA = sulfato de
condroitina A; CSC = sulfato de condroitina C; HS = sulfato de
heparán). Las concentraciones de sustrato fueron 500 \mug/ml (CSB,
CSA, CSC) ó
750 \mug/ml (HS).
750 \mug/ml (HS).
La efectividad de la condroitinasa AC en
eliminar glicosaminoglicanos sulfatados de las células fue revisada
usando células con glicosaminoglicanos marcado por incubación con
Na^{35}SO_{4} (Dupont, NEN). Células de melanoma humano
(SK-MEL) se ubicaron a una densidad de 6 x 10^{4}
células/pocillo en placas de 24 pocillos, en MEM con 10% de suero y
25 mCi/ml de Na_{2}^{35}SO_{4}, e incubación continuada
durante 2,5 días. El medio fue retirado y las células enjuagadas 2X
con MEM luego tratadas con condroitinasa AC como se indica. El
medio fue eliminado y determinada la radiactividad. La liberación de
glicosaminoglicanos sulfatados de las células por la enzima fue
expresada como cpm/pocillo.
Las células fueron expuestas a 0,1, 1,0 o 2,0
IU/ml de condroitinasa AC, en 37ºC durante 1 hora. Como se muestra
en la Figura 1A, la liberación máxima de GAGs sulfatado por
condroitinasa AC se consiguió con 1,0 IU/ml de enzima. Experimentos
adicionales fueron hechos en los que células SK se trataron con 1,0
IU/ml de condroitinasa AC de 5 a 60 minutos. La Figura 1B ilustra
que la liberación de glicosaminoglicanos sulfatados de células SK
estaba también en función de la extensión de tiempo que fueron
expuestos a la condroitinasa AC.
Otros experimentos fueron hechos para
identificar los glicosaminoglicanos radiomarcados liberados en el
medio después del tratamiento de células con condroitinasa AC. Las
células se trataron con 1,0 IU/ml de condroitinasa AC durante 1
hora a 37ºC, después con glicosaminoglicanos en el medio se
precipitaron con Cetavalon (Aldrich Chemicals, St. Louis, MO) y
analizados con electroforesis de gel agarosa (Volpi, Carbohydrate
Res. 247:263-278, 1993). Los
^{35}S-glicosaminoglicanos liberados en el medio
se identificaron como fragmentos de disacáridos de sulfato de
condroitina en función de la distancia migrada en los geles de
agarosa. Como los medidos en los pocillos, las distancias de
migración dentro de los geles para los estándares de
glicosaminoglicano fueron: 25 mm para sulfato de heparán, 31 mm
para sulfato de dermatan, 37 mm para sulfato de condroitina, y 10 mm
para fragmentos de sulfato de condroitina preparados por digestión
con la condroitinasa AC. Los
^{35}S-glicosaminoglicanos liberados de las
células migraron 10 mm en los geles.
Los efectos de la condroitinasa AC sobre la
invasión de célula tumoral se evaluaron en un ensayo in
vitro. Dos líneas de célula humanas se usaron:
SK-MEL-2, una melanoma y un
HT-1080, un fibrosarcoma, ambos obtenidos del ATCC
en Manassas, VA. Cada línea de célula creció a una densidad de
aproximadamente 4 x 10^{5} célula/pocillo, en MEM con suero al
10%. Las células se enjuagaron con PBS, luego tratadas con la
concentración indicada de condroitinasa AC en suero libre de medio
durante una hora en 37ºC. Seguido del tratamiento de enzima, las
células se enjuagaron con suero libre de medio, eliminadas en
lavados por tripsinización y resuspendidas en medio que contiene
suero al 1% y la concentración indicada de condroitinasa AC.
El ensayo de invasión se realizó en un injerto
de cultivo de célula de filtro de policarbonato de poro de 8 mm
(Falcon, Franklin Lakes, NJ). Los filtros de injerto fueron
precubiertos con 25 \mug de Matrigel (Collaborative Biochemicals,
Cambridge, MA.) en suero libre de medio. Los filtros cubiertos
fueron secados toda la noche y equilibrados con suero libre de
medio durante 1 horas antes del uso. Cincuenta mil células tumorales
en el medio con BSA al 1% se ubicaron en la cima de los filtros, y
medio de fibroblasto condicionado (preparado como el descrito por
Jin-inchi et al., Cancer Res.
50:6731-6737, 1990) se ubicó por debajo del filtro
como un químicoatrayente. El ensayo de invasión se incubó durante
16 horas a 37ºC, después de que las células permanecieron sobre la
cima de los filtros fueron eliminadas. Los filtros se tiñieron luego
usando el set de teñido Diff-Quik^{TM} (Baxter,
Miami, FL). La invasión fue evaluada como el número de células que
migraron a través del material de matriz (Matrigel^{TM}), a la
parte oculta de los filtros. Para cada filtro, 10 campos fueron
contados a 400X. Todas las muestras se realizaron por duplicado.
Los controles consistieron en células tratadas con el medio a
solas.
La invasión de las células de melanoma (SK -
MEL) se inhibió por 32% y 38% seguida del tratamiento de células
con 1,0 y 10,0 IU/ml de condroitinasa AC, como se muestra en la
Figura 2. La invasión de células de fibrosarcoma
(HT-1080) también se inhibió por condroitinasa AC.
La condroitinasa AC en concentraciones de 1,0 y 10 IU/ml inhibió la
invasión de célula de fibrosarcoma por 27% y 40%, respectivamente,
como muestra la Figura 2.
Células de melanoma humanos (SK - Mel) se
obtuvieron del ATCC, Manassas, VA. Las células se cultivaron en MEM
que contenía antibióticos al 1% y suero al 10%. El ensayo de
proliferación se realizó como se describe en Denholm y Phan, Am J
Pathol. 134 (2):355-63 (1989). Brevemente, las
células se ubicaron en MEM con suero al 10%; 24 horas después el
medio fue reemplazado con suero libre de medios, e incubación
continuada por 24 horas adicionales. Las células se trataron luego
con cualquier suero libre de MEM solamente, o MEM que contenga de
0,1 a 10 IU/ml de condroitinasa AC durante 1 hora a 37ºC. Luego del
tratamiento de enzima, las células se enjuagaron con MEM 1X, luego
dicho MEM con suero al 10% e incubado durante 48 horas. Los
controles para cada experimento fueron: (negativo) células sin
tratar incubadas en suero libre de medio, y (positivo) células sin
tratar incubadas en MEM con suero al 10%. El número de células por
pocillo fue cuantificado usando el método de ensayo CyQuant^{TM}
de pruebas moleculares, Eugene, OR. La fluorescencia/pocillo fue
determinada usando un CytoFluor^{TM} Series 4000 lector de placa
fluorescente (PerSeptive Biosystems) y los números de célula
calculados de una curva de estándar. l. Los experimentos se
realizaron para determinar si el tratamiento de células de melanoma
SK-MEL con la condroitinasa AC tendría un efecto
sobre la proliferación de estas células. La proliferación de célula
de melanoma en respuesta a suero 10% fue inhibida en 45% con 10 IU/m
de condroitinasa AC l, como muestra la Figura 3.
El ensayo de la proliferación de célula
endotelial se realizó esencialmente como los descritos en el Ejemplo
4 para células tumorales, excepto que las células endoteliales
fueron ubicadas a 1,5 x 10^{4}/ml en MEM con 10% de suero. Al
tercer día las células se trataron con 0,1 a 10 IU/ml de
condroitinasa AC durante 1 horas enjuagadas luego con suero libre
de medio y medio fresco que contenía 20 ng/ml de VEGF. El número de
células/pocillo se cuantificó 48 horas más tarde usando el ensayo
CyQuant^{TM} como se describe en el Ejemplo 4.
El tratamiento con condroitinasa Ac inhibió la
proliferación de célula endotelial (Figura 4) en modo
dosis-dependiente. La proliferación de célula
endotelial se inhibió de 11 a 55% tras el tratamiento con 1,0 a 10
IU/ml de condroitinasa AC, respectivamente.
Los efectos de la condroitinasa AC sobre
angiogénesis se evaluaron en un sistema in vitro. Células
endotelial humanas (ATCC, Manassas, VA) se cultivaron en MEM con
suero al 10%. Las células se lavaron con PBS y luego se trataron
con la concentración indicada de condroitinasa AC durante 1 hora a
37ºC. Siguiendo el tratamiento de enzima, las células se lavaron,
se removieron de las placas con tripsina, y se resuspendieron en
medio libre de suero a una concentración de células de 4
x10^{5}/ml. Esta suspensión de célula endotelial fue mezclada en
una proporción de 1:1 con 2 mg/ml de colágeno tipo I (rat tail,
Collaborative Biochemical Products), o en una proporción de 2:1 con
19 mg/ml con el Matrigel^{TM} reducido con factor de crecimiento.
Diez ml de esta suspensión de célula fue añadida al centro de cada
pocillo de una placa de cultivo de 48 pocillos, e incubada por 30
minutos a 37ºC. Tras la formación, un medio con 2 mg/ml de BSA y 20
ng/ml de VEGF (Peprotech, Rocky Hill, NJ) se añadió, con la
concentración indicada de condroitinasa AC. La angiogénesis fue
evaluada como la formación de estructuras de tipo vaso capilar
(CLS) después de la incubación por 3 días (colágeno) o 6 días
(Matrigel). Para visualizar y cuantificar el CLS, células
endoteliales fueron marcadas con 1 mM de calceína AM Molecular
Probes Inc, Portland, OR) por 30 minutos. Los CLS se cuantificaron
contando el número de CLS en 3, campos de 100X.
La condroitinasa AC inhibió angiogénesis en una
manera dosis-dependiente. La angiogénesis se inhibió
en 46 y 72% tras el tratamiento con 1,0 y 10 IU/ml de condroitinasa
AC, respectivamente (Figura 5).
Los efectos de la condroitinasa AC, la
condroitinasa B y la combinación de condroitinasa AC y B, y
actividades de célula tumoral y endotelial fueron comparados.
Melanoma o células endoteliales se trataron con medio solamente
(controles), 1,0 IU/ml ó 5,0 IU/ml de una o ambas de las enzimas
condroitinasa durante una hora en 37ºC. Las actividades celulares
ensayadas son la proliferación de células tumorales, la invasión de
célula tumoral, la proliferación de endotelial y la angiogénesis,
que se ensayaron como se describió en los ejemplos anteriores.
Cada enzima tuvo efectos inhibitorios
significativos en todas las actividades ensayadas, comparado con los
controles sin tratar que se muestran en la Figura 6. Para cada
actividad ensayada, la condroitinasa AC fue más efectiva que la
condroitinasa B. Sin embargo, esta diferencia es importante solo con
respecto a la proliferación de células tumorales. Además, las
células tratadas con condroitinasa AC sola fueron tan efectivas para
inhibir las actividades celulares como la combinación de la
condroitinasa AC y la condroitinasa B, como indica la Figura 6.
Los efectos de la condroitinasa AC sobre célula
tumoral y apoptosis de célula endotelial de tumor fueron ensayados.
Esto se hizo para determinar si la inducción de apoptosis por la
condroitinasa AC podría ser el mecanismo por el que la
condroitinasa AC inhibe las actividades celulares múltiples en el
Ejemplo 7.
Melanoma o células endoteliales se trataron con
medio solo (controles negativos), 0,10 IU/ml o 10,0 IS/ml de
condroitinasa AC, o 1,0 IU/ml de condroitinasa B, 48 horas a 37ºC.
Como control positivo, las células se incubaron en paralelo, con 40
\mug/ml de genisteína, un conocido inductor de apoptosis. Al final
del periodo de incubación, las células fueron destruidas y
ensayadas por actividad de 3-caspase, como un
marcador de apoptosis. Los ensayos de 3 caspasa fueron hechos
usando un kit de ensayo de BioSource International.
Comparado con los controles sin tratar (100%) la
apoptosis se incrementó tanto en melanoma como en células
endoteliales (Figura 7). La apoptosis (la actividad de
3-caspasa), se incrementó sobre los controles por
64% en células endoteliales, y 150% en células de melanoma, luego
del tratamiento con la condroitinasa AC. En comparación, la
condroitinasa B no incrementó la actividad de
3-caspasa significativamente en células de melanoma,
pero si incrementó la actividad en células endotelial 60% más que
en los controles. La genisteína incrementó la actividad de caspasa
de células endoteliales a 89% más que en los controles, y de células
de melanoma por 169% sobre controles.
Los efectos de la condroitinasa AC sobre el
crecimiento de tumor fueron evaluados en ratones. Ratones (cepa
C57BL) pesaban de 20 a 25 g. Células tumorales eran
H-59, una sub-línea de células de
carcinoma de pulmón de ratón Lewis, como se describe por Brodt,
Cancer Res. 46:2442-2448, 1986. Los tumores fueron
producidos en ratones, por la inyección subcutánea de 2 x 10^{5}
células en el día cero. Los ratones se palpitaron diariamente para
la aparición de tumores en el sitio de la inyección. En cuanto los
tumores eran palpables, los ratones fueron divididos en dos grupos
de 10 ratones. Las inyecciones intratumorales de salina estéril
(controles) ó 55 IU de condroitinasa AC (tratada) en salina fueron
hechas sobre los días 7, 8, 9, 11 y 13. Los tumores fueron medidos
diariamente usando calibrador. De conformidad con el protocolo de
animal y las reglas que gobiernan el uso de animales en
investigación, los ratones tuvieron que ser sacrificados en cuanto
el tamaño de tumor llegó a 150 mm^{2}. Por esta razón, los
ratones en el grupo de control fueron todos rescindidos sobre el día
18.
El aumento de tumor en ratones tratados con la
condroitinasa AC era significativamente reducido, comparado con
controles tratados con salina (Figure 8). La comparación de la media
del tamaño de tumor en los dos grupos, mostraba que los tumores en
ratones tratados con condroitinasa AC son más pequeños que los
controles siempre. Además, no hubo más el crecimiento de los
tumores en animales tratados con la condroitinasa AC entre los días
18 y 24, tiempo en el que el experimento fue terminado.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
- \bullet US 9508560 W
- \bullet US 5945403 A, Folkman
\bulletJACKSON. Physiol. Rev.,
1991, vol. 71, 481-530
\bulletLIDA et al. Sem. Cancer
Biol., 1996, vol. 7, 155-162
\bulletMEYER; HART. Eur. J.
Cancer, 1998, vol. 34,214-221
\bulletFOLKMAN. Nature
Medicine, 1995, vol. 1, 27-31
\bulletCULP et al. J. Cell
Biol., 1978, vol. 79, 788-801
\bulletNAKAJIMA et al. Science,
vol. 220, 611-613
\bulletHENKE et al. J. Clin.
Invest., 1996, vol. 97,2541-2552
\bulletFAASSEN et al. J. Cell
Biol., 1992, vol. 116, 521-531
\bulletTROCHAN et al. Int. J.
Cancer, 1996, vol. 66,664-668
\bulletFAASSEN. J. Cell
Science, 1993, vol. 105, 501-511
\bulletZAWADZKI. Int. J.
Cancer, 1998, vol. 75, 919-924
\bulletYEO et al. Am. J.
Pathol., 1991, vol. 138, 1437-1450
\bulletRICHARDSON; HATTON.
Exp. Mol. Pathol., 1993, vol. 58,
77-95
\bulletFORRESTER et al. J. Am.
Coll. Cardiol., 1991, vol. 17,
758-769
\bulletTABAS et al. J. Biol.
Chem., 1993, vol. 268
(27),20419-20432
\bulletLINN. J. Bacteriol.,
1983, vol. 156, 859-866
\bulletMICHELACCI. Biochim.
Biophys. Acta, 1987, vol. 923,
291-201
\bulletSATO et al. Agric. Biol.
Chem., 1986, vol. 50,1057-1059
\bullet Angiogenesis and its inhibitors.
FOLKMAN, J. ImportantAdvances in Ontology. J. B.
Lippincott Co, 1985,
42-62
42-62
\bullet Brain tumor angiogenesis. BREM,
H. et al. Advancesin Neuro-Oncology. Future
Publishing Co, 1988, 89-101
\bulletFOLKMAN, J. Tumor angiogenesis:
therapeutic implications. N. Engl. J. Med, 1971, vol.
285, 1182-1186
\bulletFOLKMAN, J. Successful
treatment of an angiogenicdisease. Engl. J. Med,
1989, vol. 320, 1211-1212
\bulletFOLKMAN, J. et al.
Science, 1983, vol. 221, 719
\bulletMURRAY, J. B. et al. J.
Biol. Chem., 1986, vol. 261,4154-4159
\bulletINGBER, D.; FOLKMAN. J.
Lab. Invest., 1989, vol. 59, 44-51
\bulletFOLKMAN, J. et al.
Science, 1983, vol. 221, 719-725
\bulletINGBER, D. et al. Lab.
Invest., 1989, vol. 59, 44-51
\bulletFOLKMAN, J. et al.
Science, 1989, vol. 243,1490-1493
\bulletKRUM, R et al. Science,
1985, vol. 230, 1375-1378
\bulletINGBER, D. et al.
Endocrinol., 1986, vol. 119,1768-1775
\bulletINGBER, D. et al. J. Cell.
Biol., 1989, vol. 109,317-330
\bulletGU. Biochem. J.,
1995, vol. 312, 569-577
\bulletVOLPI. Carbohydrate
Res., 1993, vol. 247, 263-278
\bulletJIN-INCHI et
al. Cancer Res., 1990, vol.
50,6731-6737
\bulletDENHOLM; PHAN. Am J
Pathol., 1989, vol. 134 (2),355-63
\bulletBRODT. Cancer Res.,
1986, vol. 46, 2442-2448
Claims (16)
1. El uso de una enzima que degrada sulfato de
condroitina en la fabricación de un medicamento para reducir la
angiogénesis.
2. El uso de la reivindicación 1 en donde la
enzima se selecciona de un grupo que consta de enzima que degrada
glicosaminoglicano bacteriano y es seleccionada del grupo que consta
de condroitinasa AC de Flavobacterium heparinum,
condroitinasa B de Flavobacterium heparinum, sulfato de
enzima que degrada sulfato de condroitina de Bacteroides
species, enzimas que degradan sulfato de condroitina de
Proteus vulgaris, enzimas que degradan sulfato de condroitina
de Microcossus, enzimas que degradan sulfato de condroitina
de Vibrio species, enzimas que degradan sulfato de
condroitina de Arthrobacter aurescens, arilsulfatasa B,
N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa
y sulfatasa de iduronato de células de mamíferos, todas estas
enzimas expresadas de las secuencias nucleótidas recombinantes en
bacterias y combinaciones de las mismas.
3. El uso de la reivindicación 1 para reducir la
angiogénesis en un individuo con cáncer.
4. El uso de la reivindicación 3 en donde el
cáncer es un tumor sólido y la enzima es la condroitinasa AC.
5. El uso de la reivindicación 1 para disminuir
la angiogénesis en un individuo con artritis reumatoide; psoriasis;
enfermedades angiogénicas oculares, rubeosis; síndrome de
Osler-Webber; angiogénesis de miocardio;
neovascularización de placa; telangiectasia; articulaciones
hemofílicas; angiofibroma; enfermedad del estímulo excesivo o
anormal de células endoteliales, enfermedad de Crohn,
aterosclerosis, escleroderma, y cicatrices hipertróficas,
enfermedades que tienen angiogénesis como consecuencia patológica,
adhesiones, cicatrices seguidas a un trasplante, cirrosis hepática,
fibrosis pulmonar seguida del síndrome de distensión respiratoria
aguda u otras fibrosis pulmonares del recién nacido, endometriosis,
poliposis, obesidad, fibroides uterinos, hipertrofia prostática o
amiloidosis.
6. Uso de acuerdo a la reivindicación 1 para la
prevención o el tratamiento de cicatrices seguidas a un trasplante,
cirrosis hepática, fibrosis pulmonar seguida del síndrome de
distensión respiratoria aguda u otras fibrosis pulmonares del
recién nacido, implantación de prótesis temporales y adhesiones
después de la cirugía entre el cerebro y la duramadre; o cicatrices
hipertróficas; o adhesiones.
7. El uso de la reivindicación 1 en donde la
enzima es administrada sistemáticamente.
8. El uso de la reivindicación 1 en donde la
enzima es administrada tópicamente o a nivel local o adyacente a un
sitio en necesidad del tratamiento.
9. El uso de la reivindicación 1 en donde el
medicamento comprende una formulación de una sola dosis aceptable
farmacéuticamente que comprende una cantidad efectiva de enzima que
degrada sulfato de condroitina para inhibir la angiogénesis, en
donde la dosis es diferente de la cantidad efectiva para la curación
de heridas, y un diluente inyectable estéril aceptable
farmacéuticamente.
10. El uso de la reivindicación 9 en donde la
enzima se selecciona entre el grupo que consta de enzimas que
degradan glicosaminoglicano bacteriano y es seleccionado del grupo
que consta de condroitinasa AC de Flavobacterium heparinum,
condroitinasa B de Flavobacterium heparinum, enzimas que
degradan sulfato de condroitina de Bacteroides species,
enzimas que degradan sulfato de condroitina de Proteus
vulgaris, enzimas que degradan sulfato de condroitina de
Microcossus, enzimas que degradan sulfato de condroitina de
Vibrio species, sulfato de condroitina degradante de enzimas
de Arthrobacter aurescens, estas enzimas expresadas de
secuencias nucleótidas recombinantes en bacterias y combinaciones de
éstas.
11. El uso de la reivindicación 9 en donde la
cantidad de enzimas que degradan sulfato de condroitina es efectiva
para prevenir o tratar las cicatrices seguidas al transplante, la
cirrosis hepática, fibrosis pulmonar que sigue al síndrome de
distensión respiratoria aguda y otras fibrosis pulmonares del recién
nacido, la implantación de prótesis temporales, y adhesiones
después de cirugía entre el cerebro y la duramadre; o cicatrices
hipertróficas; o adhesiones.
12. El uso de las reivindicaciones de la 1 o de
la reivindicación 9 en donde la enzima es una enzima de
mamífero.
13. El uso de las reivindicaciones de la 1 o de
la reivindicación 9 en donde la enzima es una condroitinasa.
14. El uso de las reivindicaciones de la 1 o de
la reivindicación 9 en donde la enzima degrada de sulfato de
condroitina A y/o sulfato de condroitina C y/o sulfato de
dermatán.
15. El uso o formulación de la reivindicación 13
ó 14 en donde la condroitinasa es la condroitinasa AC.
16. El uso de la reivindicación 1 o la
formulación de la reivindicación 9 en donde la enzima está en una
formulación de liberación controlada y sostenida.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16595799P | 1999-11-17 | 1999-11-17 | |
| US165957P | 1999-11-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2319857T3 true ES2319857T3 (es) | 2009-05-14 |
Family
ID=22601193
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00978781T Expired - Lifetime ES2319857T3 (es) | 1999-11-17 | 2000-11-17 | Atenuacion de la angiogenesis mediante el uso de enzimas que degradan sulfato de condroitina. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1231935B1 (es) |
| AT (1) | ATE413886T1 (es) |
| AU (1) | AU783222B2 (es) |
| CA (1) | CA2414185A1 (es) |
| DE (1) | DE60040800D1 (es) |
| ES (1) | ES2319857T3 (es) |
| WO (1) | WO2001035977A2 (es) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001039795A2 (en) * | 1999-12-02 | 2001-06-07 | Ibex Technologies, Inc. | Attenuation of fibroblast proliferation |
| CA2455827C (en) | 2001-08-13 | 2015-06-09 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Materials and methods for nerve grafting comprising degrading chondroitin sulfate proteoglycan |
| AU2003243396A1 (en) | 2002-06-03 | 2003-12-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Rationally designed polysaccharide lyases derived from chondroitinase b |
| US7507570B2 (en) | 2004-03-10 | 2009-03-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Recombinant chondroitinase ABC I and uses thereof |
| WO2007049361A1 (ja) * | 2005-10-27 | 2007-05-03 | Stelic Corp. | 肝線維化抑制剤 |
| US20090202517A1 (en) * | 2006-08-17 | 2009-08-13 | Hiroyuki Yoneyama | Agents for improving inflammatory bowel disease |
| US20090202514A1 (en) * | 2006-08-25 | 2009-08-13 | Hiroyuki Yoneyama | Agents for improving chronic obstructive pulmonary diseases |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2176934A1 (en) * | 1993-11-17 | 1995-05-26 | Ramnath Sasisekharan | Method for inhibiting angiogenesis using heparinase |
| US5997863A (en) * | 1994-07-08 | 1999-12-07 | Ibex Technologies R And D, Inc. | Attenuation of wound healing processes |
| WO1996008559A1 (en) * | 1994-09-16 | 1996-03-21 | Cardiac Crc Nominees Pty. Ltd. | Glycosaminoglycan-degrading enzyme inhibition and resultant disease therapies |
-
2000
- 2000-11-17 EP EP00978781A patent/EP1231935B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-17 DE DE60040800T patent/DE60040800D1/de not_active Expired - Fee Related
- 2000-11-17 WO PCT/US2000/031663 patent/WO2001035977A2/en active IP Right Grant
- 2000-11-17 ES ES00978781T patent/ES2319857T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-17 AU AU16206/01A patent/AU783222B2/en not_active Ceased
- 2000-11-17 AT AT00978781T patent/ATE413886T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-11-17 CA CA002414185A patent/CA2414185A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2414185A1 (en) | 2001-05-25 |
| ATE413886T1 (de) | 2008-11-15 |
| WO2001035977A9 (en) | 2002-07-25 |
| EP1231935B1 (en) | 2008-11-12 |
| WO2001035977A3 (en) | 2002-01-17 |
| AU783222B2 (en) | 2005-10-06 |
| AU1620601A (en) | 2001-05-30 |
| DE60040800D1 (de) | 2008-12-24 |
| WO2001035977A2 (en) | 2001-05-25 |
| EP1231935A2 (en) | 2002-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vlodavsky et al. | Extracellular matrix‐resident basic fibroblast growth factor: implication for the control of angiogenesis | |
| Sarrazin et al. | Heparan sulfate proteoglycans | |
| Kirsch et al. | Angiostatin suppresses malignant glioma growth in vivo | |
| Folkman et al. | Duodenal ulcer. Discovery of a new mechanism and development of angiogenic therapy that accelerates healing. | |
| EP0769961B1 (en) | Use of bacterial enzymes e.g. heparinases, chondroitinases for modulating wound healing processes | |
| US7056711B2 (en) | Attenuation of fibroblast proliferation | |
| WO1995013830A1 (en) | Method for inhibiting angiogenesis using heparinase | |
| ES2319857T3 (es) | Atenuacion de la angiogenesis mediante el uso de enzimas que degradan sulfato de condroitina. | |
| CA2364463A1 (en) | Introducing a biological material into a patient | |
| Cirone et al. | Antiangiogenic cancer therapy with microencapsulated cells | |
| Avery et al. | Systemic amiloride inhibits experimentally induced neovascularization | |
| US20050260187A1 (en) | Therapeutic and cosmetic uses of heparanases | |
| US6979563B1 (en) | Attenuation of tumor growth, metastasis and angiogenesis | |
| JP3980088B2 (ja) | 傷治癒を改善するプラスミノーゲン活性化因子からなる製剤の使用 | |
| US6492330B1 (en) | Antiangiogenic drugs | |
| Kakkar | Low-molecular-weight heparin and survival in patients with malignant disease | |
| EP1317271A2 (en) | Therapeutic and cosmetic uses of heparanases | |
| JP4778629B2 (ja) | コラーゲン分解促進剤 | |
| CA2394613A1 (en) | Method for localized administration of fibrinolytic metalloproteinases | |
| EP1537871A1 (en) | Enoxaparin for the treatment of cancer | |
| WO2012136768A1 (en) | Use of mutants of human hyaluronidase ph-20 with increased chondroitinase activity for axonal regrowth | |
| EP1839671A2 (en) | Attenuation of fibroblast proliferation | |
| JP4833430B2 (ja) | 窒素酸化物産生抑制剤 | |
| VLODAVSKY et al. | Heparan sulfate degradation in tumor cell invasion and neovascularization | |
| Evander et al. | Hormonal and cholinergic effects on amylase and lysosomal enzyme activities in pancreatic tissue and ascites of rats with acute experimental pancreatitis |