JP2005500375A - 神経組織の修復を促進するための材料および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、損傷をうけた神経組織の修復を促進するための組成物および方法ならびに神経移植片の調製に関係する。本発明の組成物および方法は、疾患、外傷的事象または外科的手順により中断された神経の連続性を回復させるために用いられうる。
Description
【背景技術】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所助成金No. R01 NS37901により援助された研究プロジェクトによる政府援助でなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2001年8月13日に出願された仮特許出願第60/311,870号の恩典を主張するものであり、それは、すべての図、表、および図面を含め、完全に参照として本明細書に組み入れられている。
【０００３】
発明の背景
末梢神経損傷は、慢性能力障害の主な原因である。神経損傷の弱い統御力は、筋萎縮と関連し、切断された軸索が遠位の神経と連続性を回復することができない場合、有痛性神経腫へと導きうる。神経は、損傷後再生する潜在能力をもっているが、この能力は、厳密に言えば、切断された神経セグメント(およびその中のシュワン細胞基底層)と適切な接触をする、再生する神経線維(およびそれらの軸索の新芽)に依存している。裂け目または損傷部位を横断して切断された遠位の神経セグメントの基底層に入ることができない再生中の軸索は、衰退し、結果として、ニューロン死、筋萎縮および永久機能障害を生じるであろう(Fawcett JWら、[1990] Annu Rev Neurosci 13:43-60)。
【０００４】
簡単には、神経は、ニューロンの末梢突起(または軸索)を有する。ニューロンの細胞体は、脊髄(運動ニューロン)、脊柱に沿って位置している神経節(脊髄知覚神経節)、または身体の器官中いたるところに見出される神経節(自律神経および腸の神経節)に存在する。神経は、軸索、シュワン細胞および拡張性結合組織鞘からなる(Dagum AB [1998] J Hand Ther 11:111-117)。外部被覆、神経上膜は、外圧から束を保護し、神経周膜を囲むコラーゲン性結合組織で作られている。神経周膜は、個々の束を囲み、神経内膜の微細血管の内皮細胞と共に、血液-神経関門として機能する。神経内膜は、神経周膜の内側にあり、シュワン細胞および軸索を囲むコラーゲン性組織からなる。束群は、それぞれ、神経周膜および神経内膜により囲まれている2つまたはそれ以上の束からなる。神経の組織分布は、遠心的に一定であり、束の群は知覚性または運動性のいずれかである。ニューロンは、細胞体(cell body)および数フィート長でありうる軸索からなる。
【０００５】
軸索の分裂があるが、神経内膜鞘の連続性が無傷のままである神経損傷(例えば、挫滅損傷)においては、軸索は、それらの本来の基底層内に再生し、完全回復が予想されうる。対照的に、神経切断後では、軸索再生はひどく危うくなる可能性があり、外科的修復は、上記の神経要素の再アライメントに高く依存している(Dagum AB [1998] J Hand Ther 11:111-117)。神経上膜接合(神経縫合術)は、神経切断を扱う第一次的方法である。しかしながら、再生の程度は、大いに変わりやすく、せいぜい、部分的な機能回復が予想されうる(Terzis JKら、[1990] The Peripheral Nerve: Structure, function and reconstruction, Hampton Press, Norfolk)。神経切断の修復後の機能の完全回復は、顕微手術技法における技術の現状にもかかわらず、緻密な神経微細構造および正確な軸索から軸索への接合を達成することの不可能のために、達成されえない観念のままである。
【０００６】
神経移植は、神経切除を伴って保証されるが、いくつかの実際的な難題を示す。何年間にもわたって、様々な神経移植片代替物が探究されてきた。現在、開発中の代替物と考えられるのは、同種の神経移植片の適用である。ドナー移植片の利用可能性は、他の器官の交換戦略の困難性をこうむるが、神経移植片における生存可能な細胞要素の重要性は、ほとんど重要でない可能性がある。シュワン細胞は、再生過程に有意に寄与しているが、神経鞘構造は、軸索再生を促進するための必須の足場および接着性の手掛かりを含み、有意な再生が無細胞性(例えば、凍結死滅した)神経移植片において達成された(Ide Cら、[1983] Brain Res 288:61-75; Hall SM [1986] Neuropathol Appl Neurobiol 12:401-414; Gulati AK [1988] J Neurosurg 68:117-123; Nadim Wら、[1990] Neuropathol Appl Neurobiol 16:411-421)。内在する抗原提示細胞(例えば、シュワン細胞、線維芽細胞、内皮細胞など)を死滅させることは、移植片の免疫原性を大いに低下させる。無細胞性神経移植片の使用は、宿主-移植片の免疫拒絶の懸念を大いに減らすかまたは排除する(Evans PJら、[1994] Prog Neurobiol 43:187-233; Evans PJら、[1998] Muscle Nerve 21:1507-1522)。これらの特徴は、凍結死滅した(無細胞性)同種および異種の神経移植片の使用についてかなりの見込みを与える。他方、生存可能な細胞の非存在は、再生過程を促進するものと思われる神経変性およびその後の再構築を妨げる(Bedi KSら、[1992] Eur J Neurosci 4:193-200; Danielsen Nら、[1994] Brain Res 666:250-254)。
【０００７】
ラミニンは、うまく軸索再生するための接着性刺激を示す、基底層の主な成長促進成分である(Wang, GYら、[1992] Brain Res 570:116-125)。しかしながら、正常な(損傷のない)神経はラミニンに富んでいる一方、正常な神経は、軸索伸長に対して抑制性または無反応性のままである。(Langley JN [1904] J Physiol 31:365-391; Brown MCら、[1994] Eur J Neurosci 6:420-428)。これは、ラミニンの成長促進活性が正常な神経環境においては抑制されており、かつラミニン活性が神経変性および後に続く再生においてなんとかして回復されなければならないことを示唆している。
【０００８】
正常な末梢神経は、軸索伸長にとって乏しい基底である(Zuo Jら、[1998] J Neurobiol 34:41-54; Bedi KSら、[1992] Eur J Neurosci 4:193-200)。実験結果より、正常な神経基底層内のラミニンは、再生中の軸索新芽に接近できないことが示されている(Zuo Jら、[1998] J Neurosci 18:5203-5211; Ferguson TAおよびD. Muir [2000] Mol Cell Neurosci 16:157-167; Agius E.ら、[1998] J Neurosci 18:328-338)。神経への損傷において、切断されたセグメント(損傷に対して遠位の)は、拡張性再構築を起こす拡張性変性過程を受ける。損傷誘導性神経変性において、切断された軸索は死に、それらのミエリン鞘断片およびその結果生じる壊死組織片は食作用により除去される。この変性にもかかわらず、鞘構造および基底層は保存される。シュワン細胞は増殖し、軸索の再伸長のために神経を調える。再構築局面を含む全過程は、一般的に、神経変性と呼ばれている。神経損傷が結果として、遠位の神経セグメントへ正の改変を生じることは、今や、明らかであり、実験は、変性した神経が、正常な神経より大きい軸索成長促進潜在能力をもっていることを示している(Bedi KSら、[1992] Eur J Neurosci 4:193-200; Danielsen NJら、[1994] Brain Res 666:250-254; Agius Eら、[1998] J Neurosci 18:328-338)。それゆえに、変性過程は、抑制された状態から軸索伸長を促進する状態へと正常な神経を転換する機構を含むように思われる(Salonen VJら、[1987] J Neurocytol 16:713-720; Danielsen Nら、[1995] Brain Res 681:105-108)。
【０００９】
神経損傷に関連する機能喪失は、軸索分裂から生じる。軸索は、とても薄くかつ脆く、わずかな損傷(圧迫を含む)でさえも切断する応答(軸索切断)を引き起こしうる。軸索切断において、損傷に対して遠位の軸索は、死んで、退化する。神経への最も問題の少ない損傷は、挫滅損傷(軸索断裂症)であり、軸索切断があるが、神経鞘の連続性が無傷のままである。軸索断裂症の場合、典型的には、軸索は、基底層が連続的なままであるため、外科的介入なしに再生される。切断された末梢神経が成功裡に再生されるためには、近位の神経断端から発する軸索新芽が、まず、遠位の神経セグメントにおけるシュワン細胞基底層の位置を捜し当て、その後、接近しなければならない。この決め手となる必要条件が、挫滅損傷と比較して、神経切断後に達成される相対的に乏しい再生の一因となっているものと考えられる。神経切断(神経断裂)において、神経は部分的にまたは完全に切断される。切断損傷は、軸索および神経鞘の両方が切断されるものであり、神経の連続性および軸索再生に必要とされる誘導機構を崩壊させる。神経の神経要素の連続性を再確立するための外科的接合(神経縫合術)は、軸索の再伸長に必須である。加えて、神経切断後の軸索再伸長および修復は、近位と遠位の要素の誤アライメントにより、さらに複雑である。鋭利な道具によるきれいな切断の場合でさえも、神経構造全体が崩壊する。切断末端からの膨張および軸索原形質流出は、基底層足場の正確な接合および再アライメントを妨げるキノコ状化効果を引き起こす。顕微手術技術により成し遂げられる線維束のアライメントにおける向上にもかかわらず、軸索から軸索への接合は、理想論的な目標のままである。軸索の小さいサイズおよび結合組織の相対的優位のために、外科的接合後に近位断端から発する軸索新芽の多数は、たいてい、阻害性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)に富んでいる非許容性の基底に最初に遭遇する可能性が高い。これは、末梢神経切断修復に関連した有意な潜伏期および迷走性の再生を説明しうる。CSPGが結合してラミニンの成長促進活性を阻害すること、およびCSPGが損傷後、変性過程の間に分解されることを証拠が示している。従って、CSPGが不活化される過程により、なぜ再生が神経再生にとって必須であるかを説明できる。末梢神経が神経内膜ラミニンの成長促進活性を阻害するCSPGを豊富に含んでいることが、最近、見出された(Zuo Jら、[1998a] J Neurobiol 34:41-54)。神経突起阻害性CSPGが、シュワン細胞基底層を囲む神経内膜組織に豊富にあり、神経損傷後、速やかに上方制御される(Braunewell KHら、[1995a] Eur J Neurosci 7:805-814; Braunewell KHら、[1995b] Eur J Neurosci 7:792-804)。従って、いずれの神経微細構造の誤アライメント(損傷および修復後の)も、再生する軸索新芽が、遠位の神経における基底層への接近を厳しく制限しうる非許容性組織をうまく通り抜けるようにさせる。最近の研究により、ある特定のCSPG分解酵素が、変性する神経内にラミニンの成長促進性質を回復させうる機構を表すという結論が支持された(Zuo Jら、[1998b] J Neurosci 18:5203-5211; Ferguson TAら、[2000] Mol Cell Neurosci 16:157-167)。さらに、この過程は、神経損傷部位において、および再生を向上させるための神経移植片へのCSPG分解酵素の適用により達成されうる(Zuo Jら、[2002] Exp Neurol 176:221-228; Krekoski CAら、[2001] J Neurosci 21:6206-6213)。特に効果的であるそのようなCSPG分解酵素の一つには、コンドロイチナーゼABCであり、これはCSPGの二糖側鎖を分解する細菌酵素である(Zuo Jら、[1998a] J Neurobiol 34:41-54)。他には、CSPGの核タンパク質を分解する、マトリックスメタロプロテイナーゼのファミリーの特定のメンバー、MMP-2およびMMP-9を含む(Ferguson TAら、[2000] Mol Cell Neurosci 16:157-167)。
【００１０】
コンドロイチナーゼABC(グリコサミノグリカンリアーゼ)は、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸およびヒアルロナンを分解するが、神経組織の成長促進性質を増強させるその能力は、CSPG分解に起因した(Zuo Jら、[1998] Exp Neurol 154:654-662; FergusonTAら、[2000] Mol Cell Neurosci 16:157-167)。さらに、コンドロイチナーゼABC処理は、神経鞘組織化を崩壊させないか、またはラミニンをシュワン細胞基底層から転置させないことが示された(Krekoski CAら、[2001] J Neurosci 21:6206-6213)。
【００１１】
神経切断修復モデルにおいて、阻害性CSPGの分解は、軸索新芽を再生することへの主な障害を除去し、結果として、遠位の神経へのより丈夫でかつ一様な伸長を生じた(Krekoski CAら、[2001] J Neurosci 21:6206-6213)。
【００１２】
変性された神経は、軸索伸長を支える能力が増加することが示された(Giannini Cら、[1990] J Neuropathol Exp Neurol 49:550-563; Hasan Nら、[1996] J Anat 189:293-302)。あらかじめ変性された神経から調製された無細胞性移植片へも軸索再生が改善されることから、変性の効果は、神経基底層の改変による可能性が高い(Danielsen Nら、[1995] Brain Res 681:105-108)。変性過程の間中、シュワン細胞基底層は、構造的に無傷のままである。
【００１３】
動物モデルより、インビボであらかじめ変性された神経から作製された移植片は、新鮮に切断された移植片より、神経再生を支えるにおいてずっと有能であることが示された(Danielsen Nら、[1995] Brain Res 681:105-108)。しかしながら、ヒトにおいてあらかじめ変性された神経を作製するための手順は、実際的ではない(すなわち、神経損傷に続いて、組織変性を可能にするためのインビボでの生存の期間)。
【００１４】
インビボでの末梢神経変性は、結果として、ニューロン、シュワン細胞および侵入しているマクロファージによるタンパク質分解酵素の放出および活性化に依存する、いくつかの細胞外マトリックス分子の代謝回転の増加を生じる。損傷後のマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)活性の調節は、神経変性および再生の間の細胞外マトリックスの再構築にMMP-2およびMMP-9を関係させる(La Fleurら、[1996] J Exp Med 184:2311-2326; Kherifら、[1998] Neuropathol Appl Neurobiol 24:309-319; Fergusonら、[2000] Mol Cell Neurosci 16:157-167)。MMP-9は、末梢神経において、損傷後すぐに、かつ主に損傷の部位に、発現される。MMP-9発現は、血液神経関門の崩壊、顆粒球の蓄積およびマクロファージの侵入と相関している(Shubayevら、[2000] Brain Res 855:83-89; Siebertら、[2001] J Neuropathol Exp Neurol 60:85-93)。たいていの証拠は、造血細胞がMMP-9活性の上昇に有意に寄与していることを示唆している(Taskinenら、[1997] Acta Neuropathol (Berl) 93:252-259)。他方、MMP-2は、正常な末梢神経においてシュワン細胞により恒常的に発現されている(Yamadaら、[1995] Acta Neuropathol (Berl) 89:199-203)。損傷の数日後、MMP-2発現が上方制御され、潜在性酵素が、実質的にその活性型へ変換される(Fergusonら、[2000] Mol Cell Neurosci 16:157-167)。
【００１５】
インビトロでの変性は、結果として、神経外植片の神経突起促進活性における実質的増加を生じる。この増加は、正味のゼラチン分解活性において同時に起こる増加と同じように(インサイチュー酵素電気泳動法により実証される)、MMP阻害剤の添加により遮断される。神経突起促進活性における上昇は、培養された神経外植片において、かつMMP-2の上方制御および活性化と並行して、速やかに生じる。対照的に、インビボでの変性の最初の効果は、すでに低い正常な神経の神経突起促進活性を抑制するのみであり、その間は、インビボでのMMP-2発現または活性化に変化はない。しかしながら、切断された神経の神経突起促進活性は、十分な時間が過ぎるとインビボで増加し、これは、MMP-2発現および活性化の突発と同時に起きる(FergusonおよびMuir, 2000, Mol Cell Neurosci 16:157-167; ShubayevおよびMyers, 2000, Brain Res 855:83-89)。
【００１６】
インビトロでのアッセイは、インビボであらかじめ変性された神経セグメントが、神経の正常なセグメントより大きい神経突起促進活性をもつことを示している(Bediら、[1992] Eur J Neurosci 4:193-200; Agiusら、[1998] J Neurosci 18:328-338; Fergusonら、[2000] Mol Cell Neurosci 16:157-167)。しかしながら、あらかじめ変性された神経移植片を試験するインビボでの研究では、特に、細胞性(生きている)神経移植片を用いる場合、矛盾する結果を生じた(Gordonら、[1979] J Hand Surg [Am] 4:42-47; Danielsenら、[1994] Brain Res 666:250-254; Hasanら、[1996] J Anat 189(Pt 2):293-302)。それでもなお、事前変性は、無細胞性移植片への再生の増強として特に有利であるように思われる(Ochiら、[1994] Exp Neurol 128:216-225; Danielsenら、[1995] Brain Res 681:105-108)。これは、変性において、細胞および分子の機構が基底層の成長促進性質を増強するように作用し、その後、基底層が、細胞の要素が死滅した後、神経再生を刺激する能力を保持することを示している。インビトロでの事前変性は、結果として、無細胞性神経移植片の成長促進能力における実質的増加を生じ、それは、本発明の凍結切片培養法および移植モデルにおいて容易に実証された。無細胞性神経移植は、軸索再生の開始における実質的な潜伏期と関連している(Danielsenら、[1995] Brain Res 681:105-108)。
【００１７】
神経外植片培養および神経移植片保存についての研究の多くは、神経セグメントの低温貯蔵に集中してきた。培養中の神経移植片の限定的な変性を促進するための試みとは違い、低温貯蔵方法は、細胞およびタンパク質分解の活性を抑制する最小限で虚血性の条件下で神経を保存することを目指している。Leviら(Levi Aら、[1994] Glia 10:121-131)は、細胞生存度が、低温貯蔵の1週間後、有意に減少し、3週間後、神経外植片には少数の生存可能なシュワン細胞のみが残ったことを見出した。続いて、Lassnerら(Lassnerら、[1995] J Reconstr Microsurg 11:447-453)は、培地(低温貯蔵溶液(Cold Storage Solution)よりむしろ、DMEM)が、シュワン細胞の生存度を維持することおよび低温虚血性条件下で保存された神経移植片の再生潜在能力に正の効果を及ぼすことを報告した。神経移植片の成長促進潜在能力を最適化するためには有益ではないが、連続した低温貯蔵は、細胞生存度、免疫原性および同種の神経移植片の免疫拒絶の懸念をさらに減少させる(Evansら、[1998] Muscle Nerve 21:1507-1522)。このため、長期の低温貯蔵および凍結死滅した神経同種移植片は、結果として、新鮮な同種移植片より良好な再生を生じる(Evansら、[1999] Microsurgery 19:115-127)。
【００１８】
従って、当技術分野において、通常の神経修復の成果を向上させるための低危険性の補助的治療についての必要性が依然として残っている。
【発明の開示】
【００１９】
発明の簡単な概要
本発明は、神経組織の修復を促進するための組成物および方法に関する。好ましい態様において、本発明の組成物は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)分解酵素を含む。一つの態様において、本発明の組成物は、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるCSPG分解酵素を含む。さらなる態様において、本発明の組成物は、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、コンドロイチナーゼAC、ヒアルロニダーゼ、MMP-2、およびMMP-9、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるCSPG分解酵素を含む。
【００２０】
本発明はまた、ヒトまたは動物において、損傷をうけた神経組織の修復を促進するための方法に関する。本発明の方法は、神経修復、接合、移植、または損傷をうけた神経組織へ1つまたは複数のCSPG分解酵素を投与する段階を含む。本発明の方法は、再生中の軸索の神経-神経または神経-移植片の界面を横断する能力を向上させ、基底層スキャホールド内の軸索伸長を増強する。阻害性CSPGの分解は、より許容的な神経基底を創造し、神経のシュワン細胞基底層への軸索新芽のより十分な接近を可能にし、それにより、損傷をうけた神経組織または移植された神経移植片を成功裡に貫入する軸索の数を増加させる。軸索新芽の適切な経路設定はまた、機能の回復においてさらなる改善へと導くことを可能にしうる。
【００２１】
本発明はまた、CSPG分解酵素での処理により神経移植片を調製する方法に関する。好ましくは、神経移植片(同種または異種のいずれか)は、新鮮でありかつ変性されておらず、神経移植片を凍結させる前または後のいずれかにCSPG分解酵素で処理される。移植片の細胞が生きている間に処理される場合、移植片は、それ自体が移植されうるか、またはその後それを無細胞性にするために凍結死滅されうる。一つの態様において、神経組織は、処理後無細胞性にされる。好ましい態様において、神経組織は、凍結死滅により無細胞性にされる。
【００２２】
本発明はまた、ヒトまたは動物への神経移植片としてその後に移植するための新鮮な(または輸送のために簡単に保存された)神経組織を培養する方法に関する。好ましくは、神経組織は、ヒトまたは動物のドナーから新鮮に採取され、そして、組織がエキソビボで変性かつ再構築することを可能にし、内因性過程により組織内のシュワン細胞の増殖および基底層の活性化を促進する生理学的条件下で培養される。一つの態様において、神経組織/移植片は、培養後無細胞性にされる。好ましい態様において、神経組織/移植片は、凍結死滅により無細胞性にされる。
【００２３】
本発明はさらに、ヒトまたは動物への移植のための神経移植片を供給する方法に関係する。好ましくは、ドナー移植片の横断面の特徴は、移植部位での神経組織の横断面の特徴と類似している。
【００２４】
発明の詳細な開示
本発明は、神経組織の修復を促進するための組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、疾患、外傷性事象または外科的処置により中断された神経の連続性を回復させるために使用されうる。本発明の組成物および方法は、損傷をうけた神経組織または移植された神経移植片を成功裡に貫入する軸索の数を増加させることにより神経組織の修復を促進させ、結果として、より大きな機能的回復を生じる。
【００２５】
好ましい態様において、本発明の組成物は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)分解酵素を含む。一つの態様において、本発明の組成物は、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるCSPG分解酵素を含む。さらなる態様において、本発明の組成物は、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、コンドロイチナーゼAC、ヒアルロニダーゼ、MMP-2、およびMMP-9、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるCSPG分解酵素を含む。
【００２６】
CSPG分解酵素は、起源がヒト、動物、または細菌起源であり、天然に存在するかまたは組換え型でありうる。本明細書に用いられる場合、用語「CSPG分解酵素」とはまた、例えば、それらの実質的なCSPG分解活性の量を保持する、そのような酵素の生物活性のある断片および変異体も含むものとする。本発明の組成物は、適切な薬学的担体を含むことができる。本発明はさらに、1つまたは複数のCSPG分解酵素で処理された神経組織に関する。
【００２７】
1つまたは複数のCSPG分解酵素に加えて、本発明の組成物は、成長因子のような生物学的または薬理学的に活性のある分子をさらに含むことができる。そのような成長因子は、限定されるものではないが、神経成長因子(NGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF-1およびFGF-2)、上皮増殖因子(EGF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4およびニューロトロフィン-5(NT-3、NT-4およびNT-5)、インスリン様成長因子-Iおよびインスリン様成長因子-II(IGF-I、IGF-II)、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、グリア成長因子-2(GGF-2)、血管内皮成長因子(VEGF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)ならびにリンパ球浸潤因子/コリン作動性分化因子(LIF/CDF)を含む。そのような分子は、自然に、または組換えDNA技術により得ることができる。それらの生物学的または薬理学的活性を保持するそのような分子の断片または変異体もまた使用されうる。
【００２８】
本発明はまた、ヒトまたは動物において、損傷をうけた神経組織の修復を促進するための方法に関する。本発明の方法は、1つまたは複数のCSPG分解酵素を神経移植片または損傷をうけた神経組織に投与することを含む。本発明の方法は、再生中の軸索の神経-神経および神経-移植片の界面を横断する能力を向上させ、その基底層スキャホールド内の軸索伸長を増強する。阻害性CSPGの分解は、より許容的な神経基底を創造し、神経のシュワン細胞基底層への軸索新芽のより十分な接近を可能にし、それにより、損傷をうけた神経組織または移植された神経移植片に成功裡に貫入する軸索の数を増加させる。
【００２９】
損傷をうけた神経への CSPG 分解酵素の適用
一つの態様において、CSPG分解酵素は、損傷をうけた神経、神経損傷の部位または神経損傷修復の部位に適用される。好ましい態様において、CSPG分解酵素は、切断されたまたは切り取られた神経の接合(すなわち、末端から末端への神経接合)を含む、第一次神経修復の部位へ適用される。神経への損傷は、神経が部分的にもしくは完全に切断されているか、または小領域が損傷をうけて外科的に除去されている、神経切断(神経断裂)を表してもよく、神経上膜接合(神経縫合術)は、損傷をうけた神経を修復する第一の方法である。例えば、本発明の組成物および方法は、基底層、神経周膜または神経上膜のような損傷をうけた神経の神経鞘の少なくとも1つの連続性における崩壊を含む、神経損傷の修復を促進するために用いられうる。好ましくは、外科的修復は、神経要素を再配列することを試みる。
【００３０】
特定の態様において、神経への損傷は、軸索切断があるが、鞘の連続性が無傷のままであるかもしくはいくらか傷つけられている、神経挫滅損傷(軸索断裂症)またはより極度の損傷を表す。軸索断裂症の場合、軸索は、典型的には、外科的介入なしに再生する。
【００３１】
いくつかの場合において、神経のセグメントは、病気にかかっているか、回復不可能に損傷をうけているかまたは喪失しており、そして外科的に除去される。修復は、ギャップを橋渡しするための移植片または人工器官の移植を含みうる。インプラントは、天然の導管(例えば、神経または血管移植片)、天然の派生的導管(例えば、生体高分子チューブ)または合成導管(シリコーンチューブ)でありうる。これらは、切断神経末端に接続される。特定の態様において、CSPG分解酵素は、接続部位の片方または両方の末端に適用される。例えば、CSPG分解酵素は、間置の移植片上の宿主-移植片界面の1箇所または両方の箇所へ適用されうる。CSPG分解酵素は、損傷をうけた神経組織の外科的修復もしくはレシピエント内の移植片の移植の前、間、または後に適用されうる。
【００３２】
神経移植片への CSPG 分解酵素の適用
一つの態様において、CSPG分解酵素は、神経移植片に適用される。CSPG分解酵素が神経移植片に適用される場合、移植片全体が処理されうる。CSPG分解酵素は、神経移植片全体に、一括して適用されうる。この適用は、前処理または移植前のインキュベーションであり、適用される酵素を除去するための手順を含むか、または含まない場合がある。一括処理は、生きた(新鮮な)または前に凍結された神経移植片に適用されうる。一括処理は、宿主神経との接合部位でのCSPG分解酵素の追加の適用を排除せず、それと共に用いられうる。
【００３３】
本発明の方法に従って、CSPG分解酵素は、神経移植片もしくは損傷をうけた神経組織、または両方に適用されうる。CSPG分解酵素は、移植の前、間または後に、神経移植片へ適用されうる。CSPG分解酵素は、損傷をうけた神経の断端へ連結されうる末端のような移植片のいずれの部分にも適用されうる。CSPG分解酵素が損傷をうけた神経に適用される場合には、損傷部位においてまたは損傷部位に付近などの、損傷をうけた神経の修復を促進する損傷をうけた神経のいずれの領域へも適用されうる。CSPG分解酵素は、神経移植片への適用として、培地中に配置される。培地は、未知組成培地、既知組成培地、または例えば血清を追加した既知組成培地でありうる。本発明はまた、移植前の神経移植片の貯蔵のための貯蔵溶液を含む。貯蔵溶液は、上で示されているような培地、および少なくとも1つのCSPG分解酵素を含む。貯蔵溶液はまた、フィブリン糊のような組織接着剤を含みうる。貯蔵溶液はまた、上で列挙されている成長因子のような他の生物活性のある薬剤を含みうる。
【００３４】
本明細書に用いられる場合、用語「移植片」は、ヒトまたは動物内の移植のために意図された任意の組織を指す。自己移植片、合成移植片、同種移植片および異種移植片のような移植片の様々な型は、本発明内に含まれる。移植片のサイズ(例えば、長さおよび直径)は、本発明にとって重要ではない。例えば、神経移植片の長さは、約1センチメートルから約10センチメートル、または約10センチメートルを超えうる。神経移植片の直径は、任意の損傷をうけた神経または必要とされる神経の部分の直径に適合しうる。神経移植片は、レシピエントの神経の長さに沿ってギャップを橋渡しするための、または遠位端を置換するため、すなわち、末端から末端への移植のための、構造的に完全な神経のセグメントでありうる。または、神経移植片は、一部分の神経セグメント、または偏心形(例えば、神経組織弁（nerve flap）)であり、いくらかの構造的崩壊があるが、物理学的連続性を保持している裂けた神経を再構築することを意図されうる。
【００３５】
選択的には、CSPG分解酵素は、生物学的糊のような組織接着剤と共に、損傷をうけた神経または神経移植片に適用されうる。好ましくは、生物学的糊は、フィビリン糊、フィブリンシーラント、または血小板ゲルのようなフィブリン含有接着剤である。生物学的糊は、外科的技術分野においてよく知られている(Suri Aら、[2002] Neurol. India 50:23-26; Alibai Eら、[1999] Irn J. Med. Sci. 24(3&4):92-97; Sames Mら、[1997] Physiol. Res. 46(4):303-306; Jackson Mら、[1996] Blood Coag. Fibrinolysis 7:737-746; Fasol Rら、[1994] J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 107:1432-1439)。本明細書に用いられる場合、用語「フィブリン糊」、「フィブリンシーラント」および「フィブリン組織接着剤」は、適用部位でフィブリン凝塊の形成を導く、フィブリノーゲンおよびトロンビンを含む製剤の群を指すのに交換可能に用いられる。組織接着剤は、CSPG分解酵素と同時にまたは連続的に適用されうる。組織接着剤は、CSPG分解酵素と同じ製剤内で、または別々の製剤において、損傷をうけた神経および/または神経移植片に適用されうる。好ましくは、接着剤は、残っている神経構造から軸索の伸長を引き寄せると考えられるラミニンのような物質を含まないか、または適用された酵素の活性と競合するか、もしくは活性を阻害すると考えられる、適用された酵素の基質もしくは阻害剤を含まないようにする。
【００３６】
本発明に用いられるCSPG分解酵素は、様々な手段により、かつ様々な製剤において、神経移植片または損傷をうけた神経組織に適用されうる。本明細書に用いられる場合、用語「適用される」、「投与される」、「接触させる」、および「処理される」は、交換可能に用いられる。例えば、CSPG分解酵素は、神経移植片または損傷をうけた神経組織に局所的に適用されうる(例えば、滴下様式)か、または注射により投与されうる。局所的適用または注射による局所投与は、より大きな制御のためには好ましい。さらに、CSPG分解酵素またはそのような酵素を含む組成物は、好ましくは、液状、流動可能な製剤として適用される。CSPG分解酵素はまた、多孔性物質上に吸着されうるか、または例えば、軟膏(ointment, salve)、ゲル、クリームまたは泡へ製剤化されうる。
【００３７】
本発明はまた、損傷をうけた神経組織の修復を促進するためのキットを含む。本発明のキットは、少なくとも1つのCSPG分解酵素を含む第一の区画および本明細書に記載されるような組織接着剤を含む第二の区画を含む。選択的に、キットは、CSPG分解酵素と組織接着剤を混合するための第三の区画を含みうる。キットは、損傷をうけた神経組織の修復のために、直接的に、または神経移植片により間接的に用いられうる。キットは、プラスチック、ガラスおよび/または紙製品のような、当技術分野において公知の様々な材料の包装を含みうる。
【００３８】
薬学的組成物
1つまたは複数のCSPG分解酵素は、患者、例えば、ヒトまたは動物への投与に適した薬学的組成物へ組み込まれうる。そのような組成物は、典型的には、少なくとも1つのCSPG分解酵素および薬学的に許容される担体を含む。本明細書に用いられる場合、用語「薬学的に許容される担体」とは、薬学的投与と適合性のある、あらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張性吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性のある物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野においてよく知られている。補足活性化合物もまた、組成物へ組み込まれうる。好ましくは、薬学的組成物は、少なくとも1つのCSPG分解酵素、およびフィブリン糊のような組織接着剤を含む。
【００３９】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化されうる。製剤は、当業者によく知られ、容易に入手可能な多数の情報源に記載されている。例えば、Remington's Pharmaceutical Science(Martin EW [1995] Easton Pennsylavania, Mack Publishing Company, 第19版)は、本発明に関連して用いられうる製剤を記載している。非経口投与に適した製剤は、例えば、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を意図したレシピエントの血液と等張性にする溶質を含みうる、水性滅菌注射溶液；ならびに沈殿防止剤および濃化剤を含みうる水性および非水性滅菌懸濁液を含む。製剤は、単位投与量または複数投与量の容器、例えば、封をしたアンプル、バイアル、およびガラスまたはプラスチック製の使い捨て注射器で提供されてよく、使用の前に滅菌液状担体、例えば注射用水の条件のみを必要とする、凍結乾燥(lyophilized)状態で保存されうる。即時注射溶液および懸濁液は、滅菌した粉末、顆粒、錠剤などから調製されうる。特に上で言及されている成分に加えて、本発明の製剤は、問題の製剤の型を考慮する、当技術分野において通常の他の薬剤を含むことができることは、理解されるべきである。薬学的組成物は、容器、パッケージまたはディスペンサー中に、投与に関する使用説明書と共に含まれうる。
【００４０】
CSPG分解酵素は、投与の様式に対して適切な担体、例えば、食塩水または水性緩衝液中に製剤化されうる。CSPG分解酵素はまた、徐放性製剤内にまたは付随して、含まれうる。そのような物質は、限定されるものではないが、リポソーム、リポスフィアまたは小胞のような生分解性マトリックスおよび粒子を含む。徐放性製剤は、生分解性重合体のマトリクスでありうる。CSPG分解酵素はまた、ゲルもしくはフィルムとして適用されるか、または合成の移植片もしくはインプラント内に含まれうる。
【００４１】
CSPG分解酵素は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む徐放性製剤のような、身体からの急速な排出に対してその酵素を保護する担体と共に調製されうる。好ましくは、担体は、生分解性および/または生体再吸収性（bioresorbable）である。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性、生体適合性の重合体が、徐放性製剤に利用されうる。
【００４２】
徐放性製剤は、球またはカプセルのような、本質的に微粒子(例えば、マイクロまたはナノサイズの尺度)でありうる。粒子は、外側の層または殻によりカプセル化されている、1つまたは複数のCSPG分解酵素を含むコアを有しうる。外殻は、カプセル化CSPG分解酵素により分解可能(殻が内側から分解されるように)でありうる。例えば、殻内のヒアルロナンがカプセル化CSPG分解酵素により(部分的にまたは完全に)分解される場合、CSPG分解酵素が放出されるように、殻は少なくとも部分的にヒアルロナンより構成されうる。または、(殻が外から分解されるように)外因的に適用されるか、もしくはインビボ環境内に存在するいずれかの別の分解剤により殻は分解されうる。
【００４３】
米国特許第5,320,837号は、ヒアルロニダーゼまたはコンドロイチナーゼのようなアミノ基を有する酵素を、無水マレイン酸および共重合化可能なポリアルキレングリコールエーテルの共重合体と反応させることにより得られる、徐放性調製物を記載している。反応産物は、水および/または有機溶媒に可溶性であり、加水分解において酵素をゆっくり放出することができる。
【００４４】
米国特許第4,933,185号は、酵素により特異的に分解されるイオン架橋した多糖のような重合体から形成されるコア、および速度制御する皮を有する、マイクロカプセル内にカプセル化された酵素(ヒアルロニダーゼなど)からなる生物活性物質の送達のための徐放系を記載している。皮の完全性はコアが分解される時に失われ、カプセルからの生物活性物質の急激な放出を引き起こす。その'185特許における徐放性系は、CSPG分解酵素を送達するために利用されうる。例えば、CSPG分解酵素は、生物活性物質もしくはコアの分解酵素、または両方としての役目を果たしうる。
【００４５】
徐放性製剤は、CSPG分解酵素の最初の曝露、続いて、一定の時間後に1回または複数回の遅延した曝露を提供しうる。または、徐放性製剤は、CSPG分解酵素の単一の遅延した放出を起こしうる。または、連続的放出性製剤は、CSPG分解酵素の連続的放出を可能にしうる。選択的に、CSPG分解酵素の連続的放出は、1回または複数回のパルス的放出と協同しうる。
【００４６】
インプラントのようなCSPG分解酵素の担体は、特定の適用に対して適切なサイズおよび形でありうる。このように、担体は、その担体が使用のために置かれる生きている身体の領域を十分に考えて設計された、望ましい容量および望ましい形でありうる。形の例には、円柱、半円柱または環を含むが、これらに限定されない。担体は、損傷をうけた神経または神経移植片に接触するパッド、ラップ、シート、棒または糸でありうる。好ましくは、担体は、生きている身体の周囲の組織に炎症を起こさせるか、さもなければ刺激する可能性がある、鋭利な縁または角をもたない。
【００４７】
担体から放出されるCSPG分解酵素の量および放出持続期間は、適切な範囲内に制御されうる。担体は、移植片もしくは損傷をうけた神経に、または移植片もしくは損傷をうけた神経に隣接した組織に固定されうる。担体は、例えば、24時間〜3ヶ月間のような期間にわたって、神経損傷部位においてCSPG分解酵素を連続的に放出しうる。
【００４８】
使用される特定の担体に依存して、CSPG分解酵素は、その製造中または後に、担体内に含まれるか、担体でコーティングされるか、またはさもなければ担体と付随することができる。例えば、CSPG分解酵素は、市販製品と付随しうる。
【００４９】
担体はまた、CSPG分解酵素と共に、細胞(例えば、シュワン細胞)または成長因子のような他の生物活性のある薬剤を送達するために機能しうる。担体により送達される細胞は、その患者由来、または同じ種もしくは異なる種の別の源由来でありうる。担体により送達される細胞は、生物活性のある薬剤を産生するように遺伝子改変されうる。
【００５０】
一つの態様において、担体は、神経移植片または損傷をうけた神経(例えば、損傷部位において)に密着して移植されうる、米国特許第4,602,624号、米国特許第5,487,756号および公開された米国特許出願第2002/0071828号に記載されるもののような外科用カフである。本発明のカフは、神経移植片または損傷をうけた神経組織に適用されうるスリーブを含む。スリーブは様々な形でありうる。例えば、スリーブは、損傷をうけた神経および/もしくは神経移植片を少なくとも一部分もしくは完全に取り囲むチューブ状の人工器官またはラップであってよく、神経連続性を回復させるために、カフ装着技術を用いて、直接的にまたは神経移植片を通して間接的にのいずれかで、損傷をうけた神経の末端を連結する意図された使用に適合性のあるいずれの装置も含みうる。カフがチューブ状の形である場合には、選択的に、カフは、神経移植片または損傷をうけた神経への適用のゆとりのための、第一および第二の縁を接触している縦方向のスリットを含みうる。例えば、縦方向のスリットの第一および第二の接触縁は、お互いに分離可能な接触状態であることができ、スリットの接触縁の分離を可能にし、チューブ状のスリーブの管腔を露出する。その後、損傷をうけた神経および/または神経移植片を、管腔へ挿入することができ、縦方向のスリットの接触縁が、損傷をうけた神経および/または神経移植片をいっしょに保持しながら互いに分離可能な接触状態に戻って、CSPG分解酵素への曝露に利用できるようにさせる。
【００５１】
選択的に、外科用カフは、通常の縫合技術または神経系に適用されうる生物学的糊のような組織接着剤、または他の手段を用いて神経に固定されうる。好ましくは、生物学的糊は、BIOCOLLE(BIOTRANSFUSION)、CRTS(Lille)、ISSUCOL(IMMUNO AG, Vienna Austria)などのようなフィブリンを含む糊である。カフは、剛性支持体、または、例えば自動巻き込みシートでありうる。自動巻き込みシートは、それぞれの組織に接触した場合、その損傷をうけた神経および/または神経移植片を自動的に取り囲むことができる。カフは、透過性、不透過性または半透過性でありうる。選択的に、カフは、米国特許第5,487,756号に記載されているもののような、神経移植片もしくは損傷をうけた神経を電気的に刺激するための手段、および/または神経移植片もしくは損傷をうけた神経内の神経電気的活性を記録するための手段を含みうる。好ましくは、CSPG分解酵素は、カフの内部表面から放出されるか、さもなければ作動する、すなわち、その表面が神経移植片または損傷をうけた神経に面している。
【００５２】
外科用カフは、貯蔵所のような送達系、または公開された米国特許出願第2002/0071828号に記載されているアデノウイルス構築物のような発現系により、CSPG分解酵素を神経移植片または損傷をうけた神経へ供給できる。コンドロイチンリアーゼ酵素についての発現系は、当技術分野において知られており、そのいくつかは、米国特許第6,054,569号；米国特許第6,093,563号；公開された米国特許出願第2001/0034043号；およびTralec, A.L. [2000] Appl. Environ. Microbiol. 66:29-35に記載されている。
【００５３】
外科用カフは、シリコーン、PAN/PVC、PVFD、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)繊維またはアクリル共重合体のような様々な合成素材から構成されうる。本発明の特定の態様において、特に架橋コラーゲン、骨粉、糖質基盤重合体、ポリグリコール酸/ポリ乳酸誘導体、ヒアルロン酸エステル、もしくは白亜基盤支持体のような生体適合物質からなるまたは基づくカフの使用が好ましい。好ましくは、コラーゲンまたはシリコーンが本発明の枠組み内に使用される。それは、例えば、ヒト、ウシまたはマウス起源のコラーゲンでありうる。より好ましくは、I型もしくはIII型もしくはIV型、有利にはIV/IVOX型コラーゲン、またはシリコーンの、二層からなるカフが使用される。特定の例として、シリコーンからなるSILASTICカフ(DOW-CORNING)によって言及される場合がある。さらに、カフは、有利には、円柱形または角のある切断面のチューブ型でありうる。カフの直径は、所望の適用に従って当業者により調整されうる。特に、末梢神経の再生を刺激するためには、比較的小さい直径、0.05 mmから15 mmまでが使用されうる。より好ましくは、カフの内径は、0.5 mmと10 mmの間である。脊髄再生適用については、より大きい内径をもつカフが選択されうる。特に、これらの適用について、使用されるカフは、直接的に関連する神経切断面に依存して、15 mm〜20 mmくらいの高さでありうる内径を有する。腕神経叢のレベルで裂離された根を橋渡しするためには、カフの直径は、有利には、根の直径に一致する。カフの長さは、一般的に、補償される物質の損失のサイズにより決定される。0.5 cmと5 cmとの間の長さをもつカフが使用されうる。好ましくは、カフの長さは、5 cmより大きい物質の損失はほとんど起こらないので、5 cm未満にとどまる。
【００５４】
CSPG分解酵素は、様々な濃度で神経移植片または損傷をうけた神経組織に適用されうるが、好ましくは、濃縮された形で適用される。理想的な濃度は、神経サイズおよび酵素によって変わると考えられる。例えば、コンドロイチナーゼは、約10ユニット/mLから約1000ユニット/mLまでの範囲の濃度で適用されうる。好ましくは、コンドロイチナーゼは、約100ユニット/mLから約500ユニット/mLまでの濃度範囲で神経移植片または損傷をうけた神経組織に適用される。MMPは、約0.1 μg/mLから約100 μg/mLまでの範囲の濃度で適用されうる。好ましくは、MMPは、約10 μg/mLから約50 μg/mLまでの範囲の濃度で適用される。
【００５５】
上記で示されているように、本発明の方法に従って、CSPG分解酵素は、成長因子のような生物活性分子と共に、神経移植片または損傷をうけた神経組織に投与されうる。CSPG分解酵素と共に投与されうる他の生物活性のある薬剤は、遺伝子改変細胞または非遺伝子改変細胞を含む。したがって、本発明の組成物は、そのような細胞を含みうる。細胞は、非幹細胞(成熟および/もしくは分化した細胞、またはそれらの前駆細胞もしくは始原細胞、または幹細胞でありうる。このように、投与される細胞は、柔軟に、全能性もしくは多能性の幹細胞(例えば、成体または胚性の)、前駆細胞もしくは始原細胞から、中枢もしくは末梢神経系のもの(例えば、シュワン細胞)のような高度に分化したまたは成熟した細胞までの範囲にわたりうる。
【００５６】
幹細胞は、例えば、胎児組織、成体組織、臍帯血、末梢血、骨髄および脳を含む様々な源から得られる。幹細胞および非幹細胞(例えば、分化した細胞または成熟した細胞、および前駆細胞または始原細胞)は、分化されかつ/または遺伝子改変されうる。幹細胞を同定するため、および分化した細胞型を特徴付けるために一般に使用される方法およびマーカーは、科学文献(例えば、2001年6月、国立衛生研究所により作成された報告書、Stem Cells: Scientific Progress and Future Research Directions, Appendix E1-E5)に記載されている。幹細胞を含むことが報告されている成体組織のリストは増加しており、骨髄、末梢血、脳、脊髄、歯髄、血管、骨格筋、皮膚および消化器系の上皮、角膜、網膜、肝臓、ならびに膵臓を含む。
【００５７】
本発明の方法に従って、組換え細胞のような遺伝子改変の宿主が神経移植片または損傷をうけた神経組織に投与されうる。宿主は、1つまたは複数のCSPG分解酵素を産生するように遺伝子改変されうる。好ましくは、CSPG分解酵素は、組換え細胞から分泌される。例えば、コンドロイチンリアーゼ酵素についての発現系は当技術分野において知られており、それらのいくつかは、米国特許第6,054,569号；米国特許第6,093,563号；公開された米国特許出願第2001/0034043号；およびTralec, A.L. [2000] Appl. Environ. Microbiol. 66:29-35に記載されている。選択的に、組換え宿主は、CSPG分解酵素に加えて、他の生物活性のある薬剤を組換えによって産生するように遺伝子改変される。
【００５８】
1つまたは複数のCSPG分解酵素をコードする核酸分子は、ベクターへ挿入され、遺伝子治療ベクターとして用いられうる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与、または定位注入により患者へ送達されうる。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含みうるか、または遺伝子送達媒体が埋め込まれているか、さもなければ結合されている、徐放性担体を含みうる。さらに、薬学的調製物は、CSPG分解酵素を組換えによって産生する治療的有効量の細胞を含みうる。
【００５９】
宿主細胞の遺伝子改変に用いられる様々な方法は、当技術分野においてよく知られており、例えば、Sambrookら、(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、1-3巻、Cold Spring Harbor Laboratory, New YorkおよびGloves, D.M. (1985) DNA Cloning、I巻: A Practical Approach, IRL Press, Oxfordに記載されている。したがってDNAをその源から抽出すること、制限酵素消化を行うこと、DNA断片を電気泳動すること、プラスミドと挿入DNAをつなぐ(tail)およびアニーリングすること、DNAをライゲーションすること、細胞、例えば原核細胞および真核細胞を形質転換すること、プラスミドDNAを調製すること、タンパク質を電気泳動すること、ならびにDNAをシーケンシングすることは、遺伝子工学分野における当業者の技術範囲内である。
【００６０】
免疫原性を低減させるために、本発明に用いられる神経移植片は、当業者に公知の様々な方法により無細胞性にさせられうる。例えば、神経組織は、材料および方法の項に記載されているように、凍結死滅により、または界面活性剤での化学的抽出により(Sondell Mら、[1998] Brain Res 795:44-54)により無細胞性にされうる。神経移植片は、1つもしくは複数のCSPG分解酵素の適用の前、間または後に、無細胞性にされうる。
【００６１】
インビトロの神経培養
本発明はまた、ヒトまたは動物への移植のための神経組織を培養する方法に関する。本発明の培養方法は、移植後、再生中の軸索の移植片と宿主神経組織間の界面を横断する能力を向上させる、インビトロで神経組織を「あらかじめ変性させる段階」を含む。理論に結び付けられてはいないが、本発明の培養方法は、生きている神経細胞が、CSPG分解酵素を発現し、かつ神経変性の再構築過程の間、インビボで自然に起こると考えられる、シュワン細胞の増殖を促進することを可能にする。
【００６２】
インビトロ培養の方法は、神経組織をインビトロで増殖するのを可能にし、かつその後移植片として移植された場合に、神経組織の神経突起促進活性を増加させる条件下で、神経組織を培養する段階を含む。神経突起促進活性の増加は、本明細書に記載されている凍結切片培養バイオアッセイ法のような、神経組織のインビトロ神経突起伸長アッセイ法により測定されるものでありうる。
【００６３】
または、神経組織のインビボ神経突起伸長アッセイ法もまた使用されうると思われる。神経突起伸長をアッセイするための方法は、当技術分野において公知であり、典型的には、マイクロプレートまたは顕微鏡スライドのような固体支持体上で神経突起伸長の程度を定性的にまたは定量的に測定する段階を含む。標準的な蛍光が使用されうる。
【００６４】
本発明の方法は、ヒトまたは動物から神経組織を単離すること、および約24時間から約96時間までの範囲の短時間、インビトロで神経組織を培養する段階を含みうる。インビトロでのより長いインキュベーションは、結果として、成長促進性質の悪化および損失を生じうる。好ましくは、神経組織は、約24時間から約72時間まで培養される。より好ましくは、神経組織は、約48時間、培養される。
【００６５】
神経組織は、約10℃〜約37℃の範囲内の温度で培養されうる。好ましくは、神経組織は、約30℃〜約37℃の範囲内で培養される。より好ましくは、神経組織は、約37℃で培養される。
【００６６】
神経組織は、既知組成培地または血清を追加した培地で培養されうる。既知組成培地は、例えば、N2培地またはダルベッコの改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM)でありうる。血清を追加した培地が使用される場合には、血清は、ヒト血清またはウシ胎児血清のような動物血清でありうる。好ましくは、神経組織は、既知組成培地で培養される。一つの態様において、神経組織は、培養後かつ宿主内への移植の前に、無細胞性にされる神経移植片である。好ましい態様において、神経移植片は、凍結死滅により無細胞性にされる。外因性酵素は本発明の培養方法を実行するために必要ではないが、1つまたは複数のCSPG分解酵素に神経組織を接触させる段階を方法はさらに含みうる。
【００６７】
本発明はさらに、ヒトまたは動物への移植のための神経移植片を提供する方法に関係する。好ましくは、神経移植片の横断面の特徴は、移植部位での宿主神経組織、例えば、宿主の近位および遠位の神経断端の横断面の特徴と類似している。一つの態様において、本発明の方法は、潜在的な宿主(すなわち、移植片レシピエント)内の神経断端横断面のデジタル画像データを生成する段階、画像データを解析して、レシピエント鋳型を作製するための神経要素の座標位置およびそれらの直径を定義する段階、ならびにレシピエント鋳型データを記憶装置に蓄積されうるドナー鋳型データと比較する段階を含む。ドナー鋳型データは、貯蔵された神経移植片の「バンク」からのデジタル画像データを意味する。その後、レシピエントの神経断端との最高度の構造要素のアライメントを有する貯蔵された神経移植片がレシピエント内の移植のために選択されうる。関連パラメーターは、神経上膜、繊維束群、束、ミエリン鞘、および軸索を含むが、これらに限定されない1つまたは複数の構造要素の直径、厚さ、ならびに/または空間的配置(すなわち、境界線)を含む。それゆえに、神経移植片と宿主神経間のアライメントは、最大化されうる。好ましくは、選択された移植片は、繊維束群および軸索の類似した横断面アライメントを有するものである。
【００６８】
米国特許第5,231,580号は、神経の特徴を測定するための様々な方法を記載している。デジタル画像データの生成は、デジタルカメラのような当技術分野において周知の方法および装置を用いて達成されうる。画像データの解析およびレシピエント鋳型データを蓄積されたドナー鋳型データと比較することは、例えば、画像スキャニング、解析、およびパターン認識の能力を持つアルゴリズムを通して達成されうる。神経移植片とレシピエント神経間の最も近い整合を選択するために、類似度の閾値が設定されうる。
【００６９】
本発明の方法および組成物は、中枢神経系(CNS)および末梢神経系(PNS)の両方の神経組織に適用可能である。例えば、本発明の神経移植片は、PNSにおける間置神経移植片として、または脳および脊髄ならびにそれらの任意の伸展部におけるブリッジとして使用されうる。
【００７０】
本発明に用いられるCSPG分解酵素は、天然にその酵素を産生する生物体、または(組換え酵素を産生する)遺伝子改変によりその酵素を産生する(もしくは過剰産生する)生物体を含む、様々な源から得られる。例えば、CSPG分解酵素は、天然でその酵素を産生するもの、またはその酵素を産生する(もしくは過剰産生する)ように遺伝子改変されたものを含む、細菌源から得られる。CSPG分解酵素はまた、天然でその酵素を産生する哺乳動物、またはその酵素を産生する(もしくは過剰産生する)ように遺伝子改変された哺乳動物を含む、哺乳類の源から得られる。または、CSPG分解酵素は、化学的に合成されうる。
【００７１】
本明細書に用いられる場合、「近位の」部分とは、ニューロン細胞体との連続性の中に残存している軸索の部分、またはこれらの軸索を含む神経の部分を意味するものとする。「遠位の」部分とは、ニューロン細胞体から接続を断たれた状態になっている軸索の部分、またはこれらの接続を断たれた軸索を含む神経の部分を意味するものとする。
【００７２】
末梢神経損傷の場合、その近位部分は、神経節または脊髄と接続されている部分である。末梢神経の遠位部分は、運動終板(神経筋接合部)または感覚器官と接続されている神経の最も末梢の部分を意味するものとする。脊髄損傷の場合、近位部分は、核またはより前方と接触している部分である。遠位部分は、終末シナプスへ伸長している部分を意味するものとする。
【００７３】
本明細書に用いられる場合、用語「治療すること」または「治療」とは、患者がうけている特定の神経損傷に付随した少なくとも1つの有害作用または症状の低減または緩和を指す。
【００７４】
本明細書に用いられる場合、用語「幹細胞」とは、複製または自己再生、および様々な細胞型の分化した細胞へと発生することができる未分化の細胞である。分割を起こした幹細胞の生成物は、源を発する細胞と同じ能力を有する少なくとも1個の追加の幹細胞である。例えば、適切な条件下で、造血幹細胞は、第二世代幹細胞およびニューロンを生成しうる。幹細胞は、胚性幹細胞(例えば、胚盤胞の内部細胞塊から生じる幹細胞)および成体幹細胞(ヒトを含むより成熟した動物中のいたるところに見出されうる)を含む。本明細書に用いられる場合、幹細胞は、胚性期を越えて成熟した動物(例えば、胎児、幼児、青年、少年、成人など)に見出される幹細胞を含むことが意図される。
【００７５】
本明細書に用いられる場合、用語「始原細胞(progenitor cell)」(「前駆細胞(precursor cell)」としても知られている)とは、未分化であるか、または細胞分割を起こし、2個の分化した細胞を生じる能力がある、分化した細胞の部分的特徴を有する。例えば、脊髄の始原/前駆細胞は、細胞分割を起こして、2個の分化した細胞(好中球および赤血球)を生じることができる。
【００７６】
本明細書に用いられる場合、用語「共投与」およびそれの語尾変化形は、2つもしくはそれ以上の薬剤の同時的(1つもしくは複数の調製物において)、または連続的な投与を指す。
【００７７】
本明細書に用いられる場合、用語「組み合わせ」とは、下位組み合わせを含む。例えば、CSPG分解酵素のコンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、コンドロイチナーゼAC、ヒアルロニダーゼ、MMP-2、およびMMP-9の組み合わせは、例えば、コンドロイチナーゼABCとMMP-2の下位組み合わせを含む。
【００７８】
本明細書に用いられる場合、用語「生物活性」または「生物活性のある」とは、特定の薬剤、分子、化合物などに付随した活性を指すものとする。例えば、CSPG分解コンドロイチナーゼにより示される生物活性は、CSPGの分解である。好ましくは、CSPG分解活性は、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、もしくはコンドロイチン-4-硫酸とコンドロイチン-6-硫酸の両方の切断または溶解を含む。それゆえ、特定のCSPG分解酵素の生物活性のある断片および変異体は、同様にCSPG分解活性を示す。同様に、線維芽細胞増殖因子-1のような成長因子の生物活性のある断片は、その成長因子に通常付随している生物活性を示す。
【００７９】
本明細書に用いられる場合の用語「遺伝子改変」とは、結果として永久的または一時的な遺伝子型の変化を生じる、当技術分野において公知の任意の手段による外因性核酸の意図的な導入による、本発明の細胞の遺伝子型の安定的または一過性の変化を指す。核酸は、合成、または天然由来であってよく、遺伝子、遺伝子の一部、または他の有用なポリヌクレオチドを含みうる。用語「遺伝子改変」は、天然のウイルス活性、自然の遺伝子組換え、またはその種の他のものにより生じるもののような自然発生の変化を含まないものとする。
【００８０】
様々なベクターが、本発明に従って遺伝子改変を行うために使用されうる。ベクターは、ワクチン、複製または増幅ベクターでありうる。本発明のこの局面のいくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチド配列の発現を引き起こすことができる制御エレメントと機能可能に結合される。そのようなベクターは、特に、染色体ベクター、エピソームベクターおよびウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、バキュロウイルス、SV40のようなパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス由来のベクター、ならびにプラスミドとバクテリオファージの遺伝的エレメント由来のもの(例えば、コスミドおよびファージミド)のような前記のベクター源の組み合わせに由来するベクターを含む。
【００８１】
上で示されているように、遺伝子改変を行うために使用されるベクターはまた、与えられた宿主細胞において本発明のヌクレオチド配列によりコードされる、CSPG分解酵素またはそれの生物活性のある断片もしくは変異体のような、ポリペプチドの発現および/または分泌を提供するために必要なエレメントを含みうる。ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのシグナル、翻訳終結のためのシグナル、および転写制御のための適切な領域からなる群より選択される1つまたは複数のエレメントを含みうる。ある特定の態様において、ベクターは、宿主細胞において安定的に維持されることができ、選択的に、翻訳されたタンパク質の分泌を方向づけるシグナル配列を含みうる。他の態様では、形質転換された宿主細胞において安定的ではないベクターを提供する。ベクターは、宿主ゲノムへと統合されうるか、または自己複製ベクターでありうる。
【００８２】
特定の態様において、ベクターは、タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結されたプロモーター、1つまたは複数の複製起点、および、選択的に、1つまたは複数の選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)を含む。本発明のポリペプチドの発現のための非限定の例示的なベクターは、pBr型ベクター、pET型プラスミドベクター(PROMEGA)、pBADプラスミドベクター(INVITROGEN)または下の例に提供されているものを含む。さらに、本発明によるベクターは、本発明のヌクレオチド配列のクローニングまたは発現のために、宿主細胞を形質転換するのに有用である。
【００８３】
発現を制御するために使用されうるプロモーターは、以下のものを含むが、これらに限定されない；CMVプロモーター、SV40初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon [1981] Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamotoら、[1980] Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、[1981] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の制御配列(Brinsterら、[1982] Nature 296:39-42)；原核生物ベクターは、β-ラクタマーゼプロモーター(Villa-Kamaroffら、[1978] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731)、またはtacプロモーター(DeBoerら、[1983] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25)のようなプロモーターを含む；Scientific American, 1980, 242:74-94の「Useful Proteins from Recombinant Bacteria」も参照；植物発現ベクターは、ノパリン合成酵素プロモーター領域(Herrera-Estrellaら、[1983] Nature 303:209-213)またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Gardnerら、[1981] Nucl. Acids Res. 9:2871)、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrellaら、[1984] Nature 310:115-120)を含む；Gal 4プロモーター、ADC(アルコール脱水素酵素)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、および/またはアルカリホスファターゼプロモーターのような酵母または真菌由来のプロモーターエレメント。
【００８４】
本発明はまた、「相同的な」または「改変された」ヌクレオチド配列の使用について提供する。改変された核酸配列は、当業者に周知の技術による突然変異誘発により得られ、かつ通常の配列に関して改変を示す、任意のヌクレオチド配列を意味するように理解されると考えられる。例えば、結果として、本発明によるポリペプチドの発現レベルの改変を生じる、ポリペプチドの発現のための制御配列および/またはプロモーター配列における変異が、「改変されたヌクレオチド配列」を規定する。同様に、本発明のポリヌクレオチドへの核酸の置換、欠失、または付加が、「相同的な」または「改変された」ヌクレオチド配列を規定する。様々な態様において、「相同的な」または「改変された」核酸配列は、実質的に、本来の(天然に存在する)CSPG分解酵素と同じ生物学的または血清学的活性を有する。「相同的」または「改変された」ヌクレオチド配列はまた、本発明のポリヌクレオチドのスプライス変種または下で定義されているような「改変されたポリペプチド」をコードする任意のヌクレオチド配列を意味するように理解されると考えられる。
【００８５】
本発明の目的のためには、相同的なヌクレオチド配列は、少なくとも(または少なくとも約)20.00 %から99.99 %(両数値を含む)の間のヌクレオチド配列の塩基についての同一性率を有するヌクレオチド配列を含む。前記パーセント同一性の範囲は、書かれた記述を含めて提供するものと解釈され、かつ20.00 %と99.99 %との間の、0.01 %の間隔でのいずれの端数の割合も支持するものとする。これらの割合は、純粋に統計学上のものであり、2つの核酸配列間の相違は、ランダムに、かつ全配列長に渡って分配されうる。
【００８６】
様々な態様において、本発明において使用されるヌクレオチド配列の塩基についての同一性率を示す相同的な配列は、CSPG分解酵素をコードするポリヌクレオチド配列と20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99パーセント同一性を有しうる。
【００８７】
タンパク質および核酸の配列相同性の両方とも、当技術分野において公知の様々な配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれかを用いて評価されうる。そのようなアルゴリズムおよびプログラムは、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTAおよびCLUSTALW(PearsonおよびLipman [1988] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-24448; Altschulら、[1990] J. Mol. Biol. 215(3):403-410; Thompsonら、[1994] Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680; Higginsら、[1996] Methods Enzymol. 266:383-402; Altschulら、[1990] J. Mol. Biol. 215(3):403-410; Altschulら、[1993] Nature Genetics 3:266-272)を含むが、これらに決して限定されるものではない。
【００８８】
本発明の方法に従って患者に投与される細胞または組織は、例えばヒト、または非ヒト霊長類、齧歯類およびブタを含む、他の哺乳動物由来でありうる。源の種の特定の例は、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、類人猿(ape)、チンパンジー、オラウータン、サル(monkey))；イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ベトナムのだるまブタ（pot-bellied pig）、ウサギ、およびフェレットのような家畜動物(ペット)；ウシ、水牛、野牛、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジおよびヤギのような家畜農場動物；クマ、ライオン、トラ、パンサー、ゾウ、カバ、サイ、キリン、レイヨウ、ナマケモノ、ガゼル、シマウマ、ウイルドビースト、プレーリードッグ、コアラ、カンガルー、フクロネズミ、アライグマ、パンダ、ジャイアントパンダ、ハイエナ、アザラシ、アシカ、ゾウアザラシ、ネズミイルカ、マイルカおよびクジラのような典型的には動物園で見られる外来の動物を含むが、これらに限定されない。
【００８９】
同様に、開示された治療の方法から恩恵を得る哺乳動物種は、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、類人猿、チンパンジー、オラウータン、サル)；イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ベトナムのだるまブタ、ウサギおよびフェレットのような家畜動物(例えば、ペット)；ウシ、水牛、野牛、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジおよびヤギのような家畜農場動物；クマ、ライオン、トラ、パンサー、ゾウ、カバ、サイ、キリン、レイヨウ、ナマケモノ、ガゼル、シマウマ、ウイルドビースト、プレーリードッグ、コアラ、カンガルー、フクロネズミ、アライグマ、パンダ、ハイエナ、アザラシ、アシカ、ゾウアザラシ、カワウソ、ネズミイルカ、マイルカおよびクジラのような典型的には動物園で見られる外国産の動物を含む。
【００９０】
米国特許出願第＿＿＿号、(UF-336XC1)「Materials and Methods for Nerve Repair」；米国特許出願第＿＿＿号、(UF-336XC2)「Materials and Methods for Nerve Grafting」および米国特許出願第＿＿＿号、(UF-336XC3)「Materials and Methods for Nerve Grafting」が同時出願されているが、本明細書に参照または引用されるすべての特許、特許出願、仮特許出願および刊行物は、あらゆる図、表、図面、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を含め、それらが本明細書の明確な教示と矛盾しない限り、完全に参照として組み入れられている。
【００９１】
材料および方法
神経切断および神経挫滅実験のための外科的手順
すべての外科的手順は、所内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)認可のプロトコールに従って行われた。若年成体SPRAGUE DAWLEYラット(HARLAN Indianapolis, IN)をキシラジン(15 mg/kg、筋肉内)、続いてケタミン-HCl(110 mg/kg、腹腔内)で深く麻酔をかけた。6匹の動物は、左右相称の神経挫滅損傷をうけた。坐骨神経を露出させ、その後、内閉鎖筋の腱に対して4 mm遠位の部位にDUMONT 5番鉗子での30秒間の常時圧力で挫滅させた。挫滅部位は、神経上膜縫合糸で印をつけられた。実験の別の組において、8匹のラットが、鋸歯型鋏を用いる左右相称の坐骨神経切断損傷をうけた。近位および遠位の断端は、9-0 ETHILON縫糸を用いる神経上膜の神経縫合術によりかぶせられた。その後、フィブリン糊(フィブリノーゲンおよびトロンビン)が結合を安定化させるために適用された。両方の損傷モデルにおいて、右の坐骨神経は、コンドロイチナーゼABC(2 μl中1 U)(高純度、プロテアーゼを含まない；SIGMA CHEMICAL CO., St. Louis, MS)を損傷に対して2-mm遠位に注射された。左の坐骨神経(右側と同じ損傷をもつ)は、溶媒のみ(0.1 %ウシ血清アルブミンを含むPBS)を注射された。筋肉切り口は縫合され、皮膚は金属クリップで閉じられた。麻酔から回復後、動物は、標準的住居へ戻された。手術後2日目(挫滅損傷について)および4日目(切断損傷について)、神経を麻酔下で取り出し、下記のように固定した。神経切断および修復をうけた8匹の動物のうちの1匹は、回復期の間に、一方の神経における連続性の喪失が生じたため、除外された。
【００９２】
コンドロイチナーゼで処理された無細胞性神経移植片の調製
成体(180 g〜200 g)雌SPRAGUE DAWLEYラット(HARLAN, Indianapolis, IN)が、神経ドナーおよびレシピエント宿主として用いられた。ドナーのラットはハロタンで麻酔され、断頭された。坐骨神経を臀部筋肉開裂切開により露出し、下にある筋膜から離して単離した。吻側から総腓骨神経および脛骨神経への分岐点まで、15-mm 神経セグメントを切除した。セグメントを冷たい滅菌リンガー溶液ですすぎ、薄いプラスチック支持体へ末端をピンで留めることにより安定化させ、そして低温貯蔵のバイアルへ移した。バイアルを2分間液体窒素中に沈め、その後、2分間37℃水浴へ移した。この凍結/解凍サイクルを繰り返し、無細胞性神経移植片を生じ、その後、液体窒素中に保存された。移植の1日前に、神経移植片を室温まで温め、2ユニット/ml コンドロイチナーゼABC(SIGMA, St. Louis, MO)を含む100 μl リン酸緩衝食塩水pH 7.4(PBS)中、またはPBS(溶媒)のみの中で、37℃、16時間、インキュベートした。移植片を使用の前に、リンガー溶液で2回すすぎ、氷上に置いておいた。コンドロイチナーゼABC調製物は、高度に精製されており、本質的にプロテアーゼ活性を含まないと製造会社により述べられていた。
【００９３】
コンドロイチナーゼ実験のための間置神経移植
12匹のラットが、左右相称の無細胞性神経移植片、一方はコンドロイチナーゼ処理された移植片および一方は溶媒処理された移植片を受けた。宿主ラットにキシラジン(15 mg/kg、筋肉内)およびケタミン(110 mg/kg、腹腔内)を用いて深く麻酔をかけた。坐骨神経は露出され、神経と下にある組織の間に置かれたプラスチック挿入物により支持された。座骨の切れ込みと分岐点の間の中間点の神経領域が、最初に、フィブリン糊で塗布された。鋸歯型鋏を用いて、宿主神経の2.5-mmのセグメントが切除され、新鮮に切り取られた10-mmの無細胞性神経移植片に交換された。移植片は、各末端において、1本の9-0 ETHILON縫糸を用いる神経上膜神経縫合術により宿主神経断端に接合された。その後、フィブリン糊が接合を安定化させるために適用され、最初のフィブリン塗布と共同して、神経要素の突出(神経内膜キノコ状化)もまた低減させた(Menovsky Tら、[1999] Neurosurgery 44:224-226)。筋肉は4-0縫糸で、皮膚は創傷用クリップで閉じられた。麻酔からの回復後、動物は、標準的住居へ戻された。
【００９４】
9匹のラットは移植後8日目に、4匹は4日目に終結させた。動物を深く麻酔し、断頭した。移植片ならびに近位および遠位の宿主神経の3 mmを取り出し、4 % パラホルムアルデヒドを含む0.1 M リン酸緩衝液(pH 7.4)に一晩、4℃で浸漬した。検体をPBSで平衡化させ、30 % ショ糖/リン酸緩衝液に2日間、4℃で浸漬した。解剖顕微鏡および目印として神経上膜の縫糸を用いて、各検体をa)近位の神経-移植片界面、b)主な移植片、およびc)遠位の神経-移植片界面を表す3つのセグメントへ細分した。検体を包埋し、凍結切片にした。接合の連続性を調べるために、縦方向の切片は神経-移植片界面を通って取られた。
【００９５】
主な移植片は、顕微鏡により軸索伸長の程度を評価するために、記録された寸法で横断面についての連続切片を作製した。再生中の軸索は、0.56 mmの間隔での移植片の切片において、GAP-43免疫蛍光法(下記参照)により標識された。エピ蛍光顕微鏡写真は、SPOTデジタルカメラシステム(SPOT Digital Camera System)(DIAGNOSTIC INSTRUMENTS, INC., Sterling Heights, MI)およびAXIOVERT 10顕微鏡(CARL ZEISS, Thornwood, NY)を用いて得られた。GAP-43陽性軸索プロファイルは、IMAGE-PRO PLUSソフトウェア(MEDIA CYBERNETICS, Silver Springs, MD)を用いてスコア化された。
【００９６】
事前変性実験のための神経外植片培養
成体(180 g〜200 g)雌SPRAGUE DAWLEYラット(HARLAN, Indianapolis, IN)が神経ドナーおよび移植片レシピエントとして用いられた。このプロジェクトは、所内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)により検討されて認可された。ドナーのラットは、イソフルオラン(isofluorane)で深く麻酔され、断頭された。坐骨神経を臀部筋肉開裂切開により露出し、下にある筋膜から離して単離した。吻側から総腓骨神経および脛骨神経への分岐点まで、15-mm 神経セグメントを切除した。セグメントを滅菌リンガー溶液ですすぎ、薄いプラスチック支持体へ末端をピンで留めることにより安定化させた。神経外植片を、N2補足物を含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM/N2)または2 %もしくは10 %ウシ胎児血清(FBS)を補ったDMEM/N2(ATLANTA BIOLOGICALS, Atlanta, GA)において、1日、2日、4日、および7日間、培養した。明記されるように、いくつかの外植片は、MMP阻害剤、GM6001(50 μM)の存在下で培養された(Grobelnyら、[1992] Biochem., 31:7152-7154)。培養された神経をDMEM中で入念に洗浄し、その後、封管へ移した。その管を液体窒素中に2分間浸漬し、その後、37℃水浴で5分間解凍した。この凍結-解凍サイクルは2回繰り返され、凍結死滅した(無細胞性)神経セグメントを生じた。新鮮に切除された神経(培養されていない対照)を同じ手順を用いて凍結死滅させた。その後、無細胞性神経セグメントは、a)凍結切片培養アッセイ法に使用するための凍結切片作製のために包埋されたか、またはb)生化学的分析のためおよび間置神経移植片としての使用のために液体窒素中に保存された(2週間までの間)。組織学的検査のために調製される神経外植片は、アルデヒドで固定され、凍結死滅は省かれた。
【００９７】
インビボでの神経変性は、骨盤の近くの坐骨神経の単一の切断により果たされた。近位の断端は、軸索伸長を防止するために、はずして結紮された。脚の筋肉および皮膚を閉じて、切断された神経をインサイチューで2日間または7日間、変性するようにさせた。
【００９８】
免疫細胞化学
軸索再生は、GAP-43免疫蛍光法およびデジタル画像解析により評価された。スライドに載せられた組織切片をPBSで洗浄し、その後、0.5 %トリトンX-100を含むPBSで10分間、処理した。切片をブロッキング緩衝液(10 %血清を含むPBS + 0.1 %トリトンX-100)で処理し、その後、一次抗体(ブロッキング緩衝液に希釈した)と一晩、4℃でインキュベートした。結合した抗体を、ブタ抗ウサギ免疫グロブリン(DAKO CORPORATION, Carpinteria, CA)またはヤギ抗マウス免疫グロブリン(Sigma)FITC結合二次抗体で暗闇で1時間、室温で標識した。抗マウス二次抗体は、使用前にラット血清であらかじめ吸着された。切片を洗浄し、4 %パラホルムアルデヒドを含むPBSで後固定し、すすぎ、蛍光封入媒体中においてカバーガラスをかけた。アフィニティー精製されたウサギ抗GAP-43ペプチド抗体は、公知の方法(Ferguson TAら、[2000] Mol Cell Neurosci, 16:157-167)を用いて作製され、2 μg/mlで使用された。ポリクローナル抗体1918(CHEMICON INTERNATIONAL, Temecula, CA)(1:1000)は、コンドロイチナーゼABCでの消化により露出されたCSPGコアタンパク質の結合領域に付着したままである不飽和二糖単位にのみ結合する(Bertolotto Aら、[1986] J Neurol Sci 73:233-244)。ポリクローナル抗EHSラミニン抗体(Sigma)(1:1000)は、基底層を標識するために使用された。ポリクローナル抗S-100抗血清(Dako)(1:500)は、シュワン細胞を標識するために使用された。暗視野画像は、PHOTOSHOP(ADOBE SYSTEMS INC., San Jose, CA)において反転され、印刷のために最適化された。
【００９９】
凍結切片培養バイオアッセイ法
凍結切片培養法は、ニューロンが新鮮/凍結神経切片上で直接的に培養される神経突起伸長アッセイ法であり、以前に記載されているように行われた(Ferguson TAら、[2000] Mol Cell Neurosci, 16:157-167)。簡単には、コンドロイチナーゼ処理および溶媒処理された神経セグメントを20 μmの薄片に切り、滅菌したアミノプロピルトリエトキシシラン(APTS)コーティングカバーガラス上に載せて、使用されるまで-20℃で保存した。示された所において、切片は、コンドロイチナーゼABC(0.1ユニット/ml)または溶媒(50 mM NaClを含む、50 mM トリス-HCl、pH 8.0)で2時間、37℃で処理された。8日のニワトリ胚由来の精製された後根神経節(DRG)ニューロンを、10 ng/ml 神経成長因子を含む既知組成N2培地(Bottenstein JEら、[1980] Exp Cell Res 125:183-190)における神経切片に直接的に播種した。凍結切片培養アッセイを、24時間のインキュベーション後、100 %メタノールでの固定化により終結させた。DRGニューロンによる神経突起伸長は、GAP-43免疫蛍光標識により評価された。エピ蛍光顕微鏡写真は、組織切片について記載されるように得られた。神経突起の長さは、IMAGE-PRO PLUSソフトウェア(MEDIA CYBERNETICS, Silver Springs, MD)を用いて直接的に測定された。各実験における各条件について、一つの細胞体(〜15 μm)より長い神経突起をもつ少なくとも250個のニューロンがスコア化された。
【０１００】
神経事前変性実験のためのゲル酵素電気泳動法
神経セグメントを氷冷抽出緩衝液(1 %トリトンX-100、200 mM NaCl、および10 mM CaCl2を含む、50 mM トリス-HCl、pH 7.6)中に置き、プローブ超音波処理(15秒)によりホモジナイズした。試料を30分間、4℃で撹拌し、可溶性画分を遠心分離(12,000 g、20分)により収集した。可溶性画分の全タンパク質含有量は、BRADFORD REAGENT(BIO-RAD LABORATORIES, Hercules, CA)を用いて測定された。抽出緩衝液に溶解したウシ血清アルブミンがタンパク質標準として使用された。抽出物を加熱せずに非還元Laemmli試料緩衝液中で可溶化し、1.5 mg/ml ブタのゼラチンを含む10 %SDS-ポリアクリルアミドゲル上において4℃で電気泳動した。ゲルを水中で簡単にすすぎ、その後、2.5 %トリトンX-100中で3回、45分より長く洗浄した。トリトンを3回の5分間水洗浄で除去し、酵素電気泳動ゲルをインキュベーション緩衝液(50 mM トリス-HCl、pH 8.0、5 mM CaCl2、0.02 %アジ化ナトリウム)中で21時間展開させた。ゲルを固定し、0.05 %クーマシーブリリアントブルーで染色した。ゼラチン溶解性活性をもつタンパク質バンドは、ゼラチンゲルの青色バックグラウンド内に透明溶解帯として現れた。ゼラチン溶解バンドの共移動は、着色分子量標準(BIO-RAD)に加えて、組換えヒトMMP-2およびMMP-9の潜在型ならびに活性型と比較された。デジタル顕微鏡写真を得て、ゼラチン溶解バンドの濃度測定をIMAGE-PRO PLUSソフトウェアを用いて行った。
【０１０１】
神経事前変性実験のためのインサイチュー酵素電気泳動法
固定されていない正常神経および培養された神経の凍結切片(10 μm)をスライドに載せ、分子内で消光されている、フルオレセイン標識ゼラチン基質(MOLECULAR PROBES INC., Eugene, OR)の20 μg/mlを含む反応緩衝液(50 mM トリス-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2、0.2 mM アジ化ナトリウム、pH 7.6)で表面を塗った(Ohら、1999)。対照条件において、MMP阻害剤EDTA(30 mM)が反応緩衝液に含まれた。24時間、37℃でのインキュベーション後、切片を水ですすぎ、4 %パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液で固定した。切片を水ですすぎ、Citifluorを用いて封入した。組織切片においてゼラチン溶解活性により生じた蛍光-ゼラチンペプチドが観察され、エピ蛍光顕微鏡により撮影された。
【０１０２】
事前変性実験のための間置神経移植
6匹のラットに、左右相称の無細胞性神経移植片、一方は正常(培養されていない)移植片および一方はインビトロであらかじめ変性された(2 %血清中で2日間、培養された)移植片を与えた。宿主ラットをキシラジン(15 mg/kg、筋肉内)およびケタミン(110 mg/kg、腹腔内)を用いて深く麻酔をかけた。坐骨神経は露出され、神経と下にある組織の間に置かれたプラスチック挿入物により支持された。坐骨の切れ込みと分岐点の間の中間点の神経領域を、最初にフィブリン糊で塗布した。鋸歯型鋏を用いて、宿主神経の2.5mmのセグメントを切除した。移植片を解凍し、解剖用メスの刃で10 mmに新鮮に切り取った。移植片は、各末端において、1本の9-0 ETHILON縫糸を用いる神経上膜神経縫合術により宿主神経断端に接合された。その後、フィブリン糊が接合を安定化させるために適用され、宿主神経に適用された最初のフィブリン塗布と共同して、神経要素の突出(神経内膜キノコ状化)を低減させた(MenovskyおよびBartels, [1999] Neurosurgery 44:224-225、考察pp.225-226)。筋肉は4-0縫糸で、皮膚は創傷用クリップで閉じられた。麻酔からの回復後、動物は、標準的住居へ戻された。移植後8日目、宿主ラットを深く麻酔し、断頭した。移植片ならびに近位および遠位の宿主神経3 mmを取り出し、4 % パラホルムアルデヒドを含む0.1 M リン酸緩衝液、pH 7.4に一晩、4℃で浸漬した。検体をPBSで平衡化し、リン酸緩衝液中の30 % ショ糖に2日間、4℃で浸漬した。検体を包埋し、記録された寸法の横断面について凍結切片を作製した。移植片内の再生中の軸索は、GAP-43免疫蛍光法により標識された(下記参照)。エピ蛍光顕微鏡写真が得られ、GAP-43陽性軸索プロファイルは、IMAGE-PRO PLUSソフトウェアを用いてスコア化した。
【０１０３】
神経事前変性実験のための免疫蛍光標識
固定された組織切片をPBS中の0.5 %トリトンX-100で10分間、処理した。非特異的抗体結合は、0.1 %トリトンX-100および10 %正常血清を含むPBS(ブロッキング緩衝液)での前処理によりブロックされた。一次抗体をブロッキング緩衝液に希釈し、一晩、4℃で適用した。結合された一次抗体を、フルオレセインもしくはローダミンを結合したブタ抗ウサギ免疫グロブリン(DAKO, Carpinteria, CA)またはヤギ抗マウス免疫グロブリン(Sigma)で暗闇で1時間、室温で標識した。抗マウス二次抗体は、使用前にラット血清であらかじめ吸着された。神経突起の長さ(凍結切片培養法)および軸索再生(移植)は、ポリクローナル抗GAP-43 IgG(2 μg/ml)(FergusonおよびMuir, 2000, Mol Cell Neurosci, 16:157-167)(NB300-143; NOVUS BIOLOGICAL, Littleton, CO)での免疫標識法により評価された。他の一次抗体は以下のものを含んだ：ポリクローナル抗MMP-2 IgG(4 μg/ml)(MMP2/475; Muir, 1995)；ポリクローナル抗MMP-9 IgG(4 μg/ml)(AB19047; CHEMICON, Temecula, CA)；ポリクローナル抗S-100抗血清(1:500)(DAKO)および；ポリクローナルOX42抗血清(1:500)(SEROTEK, Raleigh, NC)；ならびにモノクローナル抗神経フィラメントIgG(4 μg/ml)(NAP4; Harrisら、1993)。いくつかの例において、エピ蛍光顕微鏡写真は、PHOTOSHOP(ADOBE SYSTEMS, San Jose, CA)において印刷のために反転およびコントラスト増強された。
【０１０４】
以下は、本発明を実施するための手順を説明する実施例である。これらの実施例は、限定なものとして解釈されるべきではない。別に記載されない限り、すべての割合は、重量単位であり、すべての溶媒混合物の割合は容量単位である。
【０１０５】
実施例 1 - 無細胞性神経セグメントのコンドロイチナーゼでの処理による CSPG の分解
この実験の目的は、コンドロイチナーゼ処理が無細胞性神経の無傷セグメントの全体にわたってCSPGを効果的に分解するかどうかを決定することであった。ラット坐骨神経のセグメント(長さ1.5 cm)は、繰り返される凍結-解凍サイクルにより無細胞性にされ、その後、一括して、16時間、コンドロイチナーゼABC溶液中に浸された。コンドロイチナーゼ前処理された神経内のCSPG分解は、ネオエピトープ抗体Ab1918での免疫標識法により調べられた。この抗体は、コンドロイチナーゼABCによるコンドロイチン硫酸鎖の溶解後にコアタンパク質上に創造されるエピトープに結合する(Bertolottoら、[1986] J. Neurol Sci, 73:233-244)。図1Aに示されるように、Ab1918免疫染色は、前処理された神経セグメント全体を通じて強かった。さらに、図1Bに示されるように、Ab1918免疫染色の強度は、コンドロイチナーゼでの切片の追加的後処理により増加しなかった。コンドロイチナーゼに曝されなかった無細胞性神経において、Ab1918免疫反応性はなかった(示していない)。これらの発見は、一括コンドロイチナーゼ処理が、すべての神経区画に効果的に浸透し、CSPG側鎖を徹底的に分解したことを示している。
【０１０６】
正常な神経において、CSPGおよびラミニンは、主として、シュワン細胞基底層を含む神経鞘および基底膜に共存している(Zuoら、[1998a] J. Neurobiol. 34:41-54)。それらの分布は、繰り返される凍結-解凍後、変化せず、図1Aおよび図1Cに示されるように、一括コンドロイチナーゼ処理がECM構造を変化させたという、光学顕微鏡レベルでの徴候はなかった。コンドロイチナーゼ処理された無細胞性神経セグメントの完全性は、神経再生移植片としてのそれらのその後の使用にとって、重要な考慮すべきことであった。従って、神経移植後の前処理された神経セグメントの構造的完全性もまた調べた。図1Dに示されるように、Ab1918免疫反応性の強度および分布は、インビボで8日後では変化せず、シュワン細胞基底層の基本構造が無傷のままであったことを示している。ひとまとめにして考えると、これらの結果は、無細胞性神経移植片の一括コンドロイチナーゼ処理が、基底層スキャホールドを傷つけることまたはそれのラミニン含有量を移行させることなく、効果的にCSPGを分解したことを実証している。
【０１０７】
実施例 2 - コンドロイチナーゼでの無細胞性神経セグメントの処理による阻害性 CSPG の不活化
コンドロイチナーゼ処理された無細胞性神経における阻害性CSPGの不活化は、凍結切片培養バイオアッセイ法により測定された。胚性ニワトリDRGニューロンを、調製された神経セグメントの切片上に播種し、神経突起促進活性は、神経突起伸長をスコア化することにより評価された。結果は図2に示されている。溶媒のみで一括前処理された無細胞性神経の切片における平均神経突起長は、49 μmであった。コンドロイチナーゼで一括前処理された無細胞性神経における神経突起伸長は平均して96 μmであり、対照条件と比較して95 %の増加を示した。一括コンドロイチナーゼ処理が完全であったかどうかを決定するために、切片作製後にコンドロイチナーゼで処理された(後処理)神経組織において凍結切片培養アッセイ法を行った。予想された通り、溶媒のみで一括処理された無細胞性神経の神経突起促進活性は、コンドロイチナーゼでの後処理により有意に(86 %)増加した。対照的に、コンドロイチナーゼ後処理は、一括コンドロイチナーゼ処理神経移植片由来の切片にわずかな追加効果を生ずるのみであった。
【０１０８】
これらの結果は、少量のコンドロイチナーゼABCに無細胞性神経移植片のセグメントを浸すことにより、阻害性CSPGが効果的に分解かつ不活化されたことを示している。さらに、一括コンドロイチナーゼ処理は、基底層スキャホールドのラミニン関連性神経突起促進潜在能力を妨害することなく、神経移植片を効果的に脱阻害した。後者の点は、正常神経および変性した神経の凍結切片培養アッセイ法と同様に(FergusonおよびMuir, 2000, Mol Cell Neurosci, 16:157-167)、コンドロイチナーゼ処理された無細胞性神経移植片の切片における神経突起伸長が、シュワン細胞基底層と厳密に関連して生じたという観察により強化された。
【０１０９】
実施例 3 - 神経再生は無細胞性神経移植片のコンドロイチナーゼ処理により増強される
以下の実験は、コンドロイチナーゼ処理が無細胞性神経同種移植片を通しての神経再生を向上させるという仮説を試験した。実施例2に記載されるように、無細胞性坐骨神経セグメントを溶媒またはコンドロイチナーゼABCで一括処理した。10-mmの間置神経移植片を、フィブリン糊で補強される神経上膜神経縫合術により宿主神経へ連結した。9匹の宿主ラットのそれぞれは、左右相称の移植片、一方は溶媒処理された移植片および一方はコンドロイチナーゼ処理された移植片を受けた。再生は、最初、8日後に調べた。まず、図3に示されるように、近位および遠位の神経-移植片の接合を外科的接合のアライメントを評価するために縦方向の切片において調べた。すべての移植片が連続状態にあり、従って、次の分析に含められた。再生のスコア化は、伸長している軸索を強く染色するGAP-43免疫標識法に基づいた。凍結死滅した移植片内の軸索およびシュワン細胞残遺物は、GAP-43に対して免疫陰性であり、宿主シュワン細胞は、非常にかすかに染色されるのみであった(デジタルスコア化に用いられる限界値未満の強度で)。軸索伸長は、移植片内の指定された空間的間隔において、横断切片におけるGAP-43免疫陽性プロファイルに得点をつけることにより評価された。図4に示されるように、すべての移植片において、いくらかの軸索の内への伸長が観察された。しかしながら、コンドロイチナーゼ処理された移植片への伸長は、対照移植片においてより、際立って多くかつ広く分布された。定量的結果は、図5に示されている。
【０１１０】
コンドロイチナーゼ処理された移植片に侵入する軸索(GAP-43免疫陽性プロファイル)の平均数は、平均して、対照移植片より3倍以上多かった。対照移植片に侵入する軸索はいつも制限されており、たいてい中央にクラスターを形成していたが、コンドロイチナーゼ処理された移植片への初期の伸長は、より広く分散され、特に近位端において豊富であった。これらの発見は、無細胞性神経移植片への軸索貫入の成功が、コンドロイチナーゼでの移植片の前処理により著しく向上したことを示している。しかしながら、移植片の遠位端において、両条件で、類似した数の軸索が一貫して観察された。これは、軸索は、8日の期間中を通じてコンドロイチナーゼ処理された移植片に貫入し続けたが、一方で、対照移植片への軸索貫入が初期に生じ、その後、時間的に制限されたことを示唆した。
【０１１１】
無細胞性移植片への軸索伸長の潜伏期がコンドロイチナーゼ処理により低減されるかどうかを決定するために、移植片の最も近位の面を横断切片において同様に調べてスコア化することのほかは、同じ分析を4日目の移植片について行った。左右相称の移植片を受けた3匹の動物のみが調べられたが、結果は、8日目の移植片について観察されたものと一致していた。しかも、図6に示されるように、移植片の最も近位の面(宿主-移植片の界面から0.3 mm)において、軸索貫入がコンドロイチナーゼ処理された移植片で、平均して5倍多かった。これらの結果から、コンドロイチナーゼ処理が潜伏期を減少させ、かつ無細胞性神経移植片への軸索再生の接近を有意に向上させることが、結論されうる。
【０１１２】
実施例 4 - コンドロイチナーゼ処理された移植片の基底層管内の軸索再生
神経再生の成功は、ラミニンの豊富な基底層管内の軸索の伸長に依存しているため、軸索伸長の基底層との関連が無細胞性移植片のコンドロイチナーゼ処理により変化するかどうかを決定した。8日目の移植片の横断切片をGAP-43およびラミニンについて二重標識した。ラミニン標識は強く、基底層は、対照およびコンドロイチナーゼ処理の移植片中、同様に無傷であるように思われた。繰り返される凍結-解凍、酵素処理、外科的操作、およびインビボでの8日間にもかかわらず、細胞外マトリックススキャホールドは、構造的に無傷であるように思われた。多数のGAP-43標識軸索(または神経突起)は、個々の基底層内で明らかであり、これらの大部分は管の管腔表面と密接に結合しているのが観察された。対照および処理の移植片において、あいまいに付着した、同じくらいの少数の神経突起が観察された。全般的に、基底層内で伸長する軸索の性質は、無細胞性神経移植片のコンドロイチナーゼ処理により変化しなかった。
【０１１３】
実施例 5 - コンドロイチナーゼ処理された移植片への軸索伸長およびシュワン細胞移動
8日目の移植片の連続切片を、軸索伸長に関するシュワン細胞の移動を調べるために、S-100およびGAP-43について免疫標識した。移植片は、S-100染色の2つの別個のパターンを含んだ；強い染色は生きている宿主由来シュワン細胞に関連し、弱い染色は凍結死滅したシュワン細胞残遺物に関連した。別に示さない限り、後に続く記載は、強く染色された(生きている)シュワン細胞プロファイルを指す。図7に示されるように、移植片の近位領域において、シュワン細胞および軸索の分布は、大概は一致した。軸索のクラスターが、少しの明らかなシュワン細胞関連もなく、時々見出された。散らばったシュワン細胞もまた、伸長している軸索を含有しない領域に見られた。シュワン細胞移動は、8日目の移植片中にはっきり見られた。しかしながら、図7に示されるように、移植片中のより遠位の点において、軸索がしばしばシュワン細胞を伴わないで見出された。これは、図8に示されるように、遠位の接合を含む縦方向の切片において確認された。図8Bに示されるように、S-100標識シュワン細胞は、遠位宿主断端において豊富であったが、移植片の遠位面(凍結死滅したシュワン細胞残遺物のみを含んだ)にはたとえ侵入したものがあるとしても少なかった。図7、図8Aおよび図8Bに提示されている実施例は、コンドロイチナーゼ処理された移植片から得られ、同一の結果が対照移植片において観察された。これらの発見は、コンドロイチナーゼ処理された移植片における軸索伸長の増大が、主として、基底層の神経突起促進活性の増強に起因することを示唆した。
【０１１４】
軸索伸長の経路は、近位および遠位の接合をすぐ近くに囲んでいる組織の縦方向切片においてのみ調べられた。移植片への侵入について、軸索伸長は、遠位へ方向づけられ、移植片内に逸脱した伸長または神経腫形成の徴候はなかった。これは、誘導機構(または遠位断端に関連した化学誘引物質の性質)がコンドロイチナーゼ処理された移植片において傷つけられなかったことを示唆した。さらに、図8Aに示されるように、軸索が移植片の遠位範囲に到達した数少ない例に基づいて、軸索は移植片を出て、宿主神経断端へと伸長を続けた。
【０１１５】
実施例 6 - コンドロイチナーゼでの無細胞性ヒト神経セグメントの処理による阻害性 CSPG の分解および不活化
ラット神経を用いて行われた上記実施例に記載される実験の多くは、ヒト神経を用いて繰り返された。ヒト神経を用いる実施例6および実施例7においても、別に示されている所を除いて、ラット神経を用いる実施例1および実施例2に記載される手順に従った。ヒト腓腹および脛骨の神経は、外科的脚切断から新鮮に得られた。切断は、神経の介入がない疾患(例えば、骨癌)にとって必要であり、神経は、組織学的検査を基礎として正常であると判断された。
【０１１６】
ヒト神経は、まず、CSPGおよびラミニンのそれらの含有量がラット神経において観察されたものと類似しているかどうかを決定するために調べられた。免疫細胞化学より、神経再生を支えている基底層は、CSPGおよびラミニンの両方を含み、他の種においてと同じ様式で共存していることが示された。CSPGネオエピトープおよびラミニンについて染色されたヒト神経は、それぞれ、図9Aおよび図9Bに示されている。さらになお、凍結切片培養バイオアッセイ法を用いて、ヒト神経の成長促進性質がコンドロイチナーゼでの処理により増加したことが見出された。定量的結果は、図10に示されている。
【０１１７】
実施例 7 - コンドロイチナーゼ処理されたヒト神経移植片内の軸索再生
以下の実験において、コンドロイチナーゼ処理が、ラット異種移植モデルにおいて、無細胞性ヒト神経移植片を通じた神経再生を向上させるという仮説を試験した。ヒト神経から取られたサブユニット(個々の束)を一括して溶媒またはコンドロイチナーゼABCで処理した。10-mmの間置神経移植片を、フィブリン糊で補強される神経上膜神経縫合術によりラット宿主坐骨神経に連結した。2匹の宿主ラットのそれぞれは、左右相称の移植片、一方は溶媒処理された移植片および一方はコンドロイチナーゼ処理された移植片を受けた。再生は、最初、8日後に調べられた。軸索伸長は、移植片内の指定された空間的間隔において、横断切片におけるGAP-43免疫陽性プロファイルをスコア化することにより評価された。
【０１１８】
コンドロイチナーゼ処理された移植片への伸長は、対照の移植片より、際立って多くかつ広く分布された。定量的結果は、図11に示されている。コンドロイチナーゼ処理された移植片に侵入した軸索の平均の数(GAP-43免疫陽性のプロファイル)は、平均して、対照の移植片より、3倍以上多かった。この発見は、無細胞性ヒト神経移植片への軸索の貫入の成功が、CSPG分解酵素での移植片の前処理により著しく向上したことを示している。この異種移植モデルはまた、無細胞性ヒト神経がラット宿主により拒絶されなかった(8日以内)ことを実証し、無細胞性神経の低免疫原性を確信させる。
【０１１９】
実施例 8 - コンドロイチナーゼ注射後の神経における CSPG の分解
動物は、左右相称の神経挫滅かまたは左右相称の神経切断のいずれか、および直接的縫合修復を受けた。同時に、一方の神経は、コンドロイチナーゼABCを注射され、反対側の神経は、溶媒単独を受けた。コンドロイチナーゼ処理が損傷をうけた神経において効果的にCSPGを分解したかどうかを最初に調べた。損傷の部位地点および周囲の神経の組織切片をCSPGネオエピトープ抗体を用いて免疫標識した。これらの抗体は、コンドロイチナーゼABCによるコンドロイチン硫酸鎖の溶解後CSPGコアタンパク質上に創造される新しいエピトープに結合する。図12Aおよび図12Bに示されるように、損傷およびコンドロイチナーゼ適用後4日目に切断された神経において、CSPGネオエピトープ免疫染色は、接合地点および数mm周辺の遠位神経の横断面領域全体にわたって強かった。強い免疫染色はまた、近位神経への数mmにも観察された。図12Cに示されるように、同様の結果が挫滅損傷をうけた神経において得られた。図12Dに示されるように、接合および注射の部位近くの組織のCSPGネオエピトープ標識は、免疫染色手順の一部としてコンドロイチナーゼでの二次処理を組織切片に適用した場合、せいぜいわずかにより強かっただけであった。これらの結果は、コンドロイチナーゼABCでのインビボでの処理が、神経損傷および修復の部位を含む、注射部位を囲む細胞外マトリックスにおいて、完全ではないにしても、実質的にCSPGを分解したことを示している。
【０１２０】
実施例 9 - コンドロイチナーゼ処理は神経挫滅損傷 ( 軸索断裂症 ) 後の軸索再生を変化させなかった
コンドロイチナーゼ処理は神経挫滅損傷の部位を通じた軸索伸長を向上させるという仮説を試験した。神経鞘の連続性を維持しつつ、座骨神経を重度に挫滅させることにより、左右相称の軸索断裂症が達せられた。損傷の時点において、一方の神経はコンドロイチナーゼABCを注射され、反対側の神経は溶媒単独を受けた。神経挫滅後の軸索の急速な再伸長のため、損傷部位を渡る軸索伸長は、損傷後2日目に調べられた。再生中の軸索は、GAP-43免疫蛍光により標識され、デジタル画像解析によりスコア化された。対照の神経において予想された通り、図13Aに示されるように、挫滅部位に対してすぐ遠位の軸索再生は、強くかつ神経横断面中に広く行き渡った。同様に、類似した再生応答および伸長パターンは、コンドロイチナーゼ処理された移植片にも観察された。両方の条件において、免疫染色は非常に濃く、多数の神経突起が各基底層管内に見られた。GAP-43免疫反応性の定量的評価は、神経挫滅損傷後の軸索再生がコンドロイチナーゼ適用により有意には影響を受けなかったことを示した(図13B)。同様に、軸索再生の潜伏期または速度は、コンドロイチナーゼ処理された神経において変化した徴候はなかった。
【０１２１】
実施例 10 - 神経切断 ( 神経断裂 ) 修復後の軸索の再生はコンドロイチナーゼ処理により増強される
コンドロイチナーゼ処理は神経接合部位を通じた軸索伸長を向上させるという仮説を試験した。座骨神経の鋏での切断により左右相称の神経断裂が達せられ、その後、神経上膜の縫合術およびフィブリン糊により修復された。一方の神経はコンドロイチナーゼABCを注射され、反対側の神経は溶媒単独を受けた。神経切断後の再生の潜伏期のため、接合を横切っての軸索伸長は、損傷後4日目に調べられた。対照神経において、軸索の侵入は、主に所々に生じ、遠位の神経の不連続の小区分に限定された；さもなければ、図14Aに示されるように、少数の軸索のみが、残っている神経の横断面中に散らばっているのが見出された。遠位部へとより遠くへ伸展する軸索の数(4日後)は、急速に減少し、接合部から3 mm以内でゼロに近づいた。対照的に、コンドロイチナーゼ処理された移植片への軸索の侵入は、より強く、神経横断面全体中を広く行き渡った。7/7の動物において、遠位の神経に侵入した軸索の数は、対照神経より、コンドロイチナーゼ処理された移植片において多かった。図14Bに示されるように、平均して、接合に対してすぐ近くの遠位の軸索のスコアは、コンドロイチナーゼ処理された神経において2倍大きく、3/7の動物は、3.5倍を超えて増加した。対照神経と比較したコンドロイチナーゼ処理神経における軸索数の比率は、2:1(ちょうど接合を越える地点)から、遠位の断端の中へとより遠くなる地点において、4:1を超えて累進的に増加した。このように、遠位の神経に侵入する軸索の数を増加させることに加えて、コンドロイチナーゼ処理はまた、軸索侵入の潜伏期を減少させ、かつ/または遠位の神経セグメント内の伸長速度を増加させた。遠位の神経のあらゆる部分における軸索伸長は、厳密に直線であり、神経の縦軸に整列していることは明らかであった。さらに、再生中の軸索(GAP-43)および基底層(ラミニン)についての二重免疫標識は、遠位の神経の基底層内に再伸長しうる軸索の強い性質がコンドロイチナーゼ処理により変化しないことを示した。
【０１２２】
これらの発見は、挫滅損傷後の軸索再伸長がコンドロイチナーゼ処理および対照の神経において類似していたことを示している。対照的に、コンドロイチナーゼを注射された神経において、切断された神経の接合を通しての軸索再伸長は加速され、遠位のセグメント中への軸索の侵入は数倍に増加した。このように、神経連続性が崩壊している場合の切断損傷において、コンドロイチナーゼ適用は、遠位の神経セグメントの基底層に接近する軸索の能力を有意に増加させ、かつ著しく再生を高めた。
【０１２３】
本発明に従って、単一のコンドロイチナーゼの注射が、接合された末梢神経の界面を横切っての軸索の再生を著しく向上させる。阻害性CSPGの分解が、より許容的な神経基底を創造し、軸索新芽の、遠位神経のシュワン細胞基底層の位置を捜し当てて接近するために、より大きな自由度を許容する。この過程に軸索が直面する困難性は、挫滅損傷と比較して切断損傷後の再生に関連する増加した潜伏期により証明される。特に、そのデータは、コンドロイチナーゼ処理の重要な効果が末梢神経切断モデルにおいて再生の潜伏期を減少させることであることを示唆している。さらに、軸索新芽が、接合を横断することができない場合には退化すると考えられることは公知である(Fu, S. Y.およびT. Gordon, 1997, Mol Neurobiol 14:67-116)。
【０１２４】
実施例 11 - 培養された神経セグメントの神経突起促進活性
新鮮に切除された(細胞性)ラット坐骨神経セグメントを0 %、2 %および10 %ウシ胎児血清を含む培地において、7日間までの間、培養した。対照(培養されていない)および培養された神経を凍結切片にし、それらの神経突起促進活性を凍結切片培養アッセイ法により評価した。結果は、図15Aに示されている。対照神経の切片上に成長した胚性ニワトリDRGニューロンは、118 μmの平均神経突起長であった。1日〜4日間培養された神経外植片の切片上の神経突起伸長は、有意に大きかった。既知組成培地(0 %血清)において培養された神経について、神経突起促進活性は、インビトロでの2日目に最大値に達し、対照神経と比較して43 %増加を示した。2 %血清を含む培地において1日または2日間培養された神経外植片について、神経突起促進活性における70 %を超える増加があった。そのうえ、10 %血清において培養された神経外植片は、インビトロでの2日目に、類似した最大値に達した。神経外植片の神経突起促進活性は、より長い培養期間後には衰え、7日目に、対照条件のレベル以下に落ちた。これらのデータは、神経外植片の神経突起促進活性が、培地への血清の添加の有りおよび無しで、インビトロで短期間培養された場合、著しく増加したことを示している。神経外植片は、培養容器へ付着するのを防止され、細胞増殖は観察されなかった。しかしながら、すべての条件における細胞生存力は、切り刻まれて押しつぶされた神経外植片から培養表面へ強い細胞移動が観察された別の実験において確認された。
【０１２５】
実施例 12 - インビトロおよびインビボでの事前変性の比較
凍結切片培養アッセイ法を用いて、インビトロであらかじめ変性されたラット坐骨神経の神経突起促進活性を、インビボであらかじめ変性されたものと比較した。上記のように(図15Aおよび図15Bを参照)、2 %血清中で2日間培養された神経外植片上のDRGニューロンの神経突起伸長は、対照神経(あらかじめ変性されていない)より70 %大きかった。また、より長い期間(4日間および7日間)の神経外植片培養は、結果として、累進的に少ない神経突起促進活性を生じた。7日間培養された神経は、対照条件より37 %少ない活性であった。比較すると、インビボであらかじめ変性された神経の神経突起促進活性は、インビトロであらかじめ変性されたものより非常に低かった。インビボで2日間あらかじめ変性された神経における神経突起伸長は、35.8 μmであり、対照条件(126.5 μm)より72 %少ない活性であった(t検定、p＜0.001)。しかしながら、この抑制は、十分時間が過ぎると逆転し、7日間のインビボでの事前変性は、結果として、対照条件より12 %大きい神経突起伸長を生じた(p = 0.06)。これらのデータは、インビトロでの事前変性が、インビボでの事前変性により達成されるものより大きい程度まで、神経セグメントの神経突起促進活性を増加させたことを示している。
【０１２６】
実施例 13 - インビトロ変性は MMP 依存性である
神経セグメントを、MMP阻害剤、GM6001の添加の有りおよび無しの2 %血清含有培地において、2日間培養した。培養された神経の神経突起促進活性は、凍結切片培養アッセイ法により評価された。結果は、図15Bに示されている。図15Aに示されているものと類似して、培養された神経(2日、2 %血清)上に伸長したDRGニューロンの平均神経突起長は、210 μmであり、(培養されていない)対照神経のそれに対して68 %増加を示した。しかしながら、この増加は、GM6001の存在下で培養された神経について、たった14 %までに低下した。各条件における神経セグメントの解離培養(押しつぶし標本)は、細胞生存力の損失がないことを示す豊富な細胞増殖を示した。さらに、単離されたシュワン細胞培養物のGM6001での処理が、このハイドロメート基盤の（hydromate-based）ジペプチドの非常に低い毒性を確証した。これらの結果により、MMP活性が、培養された神経外植片の神経突起促進活性を増加させる変性過程に強く結び付けられる。
【０１２７】
実施例 14 - 培養された神経セグメントにおける MMP 発現：酵素電気泳動ゲル分析
MMP-2およびMMP-9は、ゼラチン(開裂されたコラーゲン)を分解する能力がある主要な細胞外プロテイナーゼであり、それらの主な基質は、基底層のコラーゲンIV型である。MMP-2は、インビボでシュワン細胞により恒常的に発現され、ラットにおいて神経損傷後、上方制御される。他方、MMP-9は、正常な神経において検知されず、侵入している顆粒球およびマクロファージに関連して損傷後に存在する。本発明におけるインビトロでの神経変性の試験は、造血細胞による最小限の寄与により、常在の神経細胞によるMMP発現の役割を決定する唯一の機会を提供する。培養された神経外植片におけるMMPレベルは、まず、ゼラチン基質重層ゲル電気泳動法(酵素電気泳動法)により調べられた。ゼラチン酵素電気泳動法は、MMP-2およびMMP-9の検出において非常に感度が高く、潜在性型および活性型の両方を明らかにするという追加の利点をもつ。神経セグメントを2 %血清の存在下において1日、2日、4日、および7日間、培養した。抽出された神経の代表的な酵素電気泳動分析が図16に示されている。正常な(培養されていない対照)神経は、ヒト組換えMMP-2のプロ型と共移動するMr = 72 kDに優勢なゼラチン溶解バンドを示した。微量の活性MMP-2が観察された(Mr = 66 kD)が、MMP-9(Mr = 92 kDおよび84 kD)は検出されなかった。培養された神経において、活性MMP-2における急速な増加および全MMP-2含有量における実質的増加があった。MMP-9は、1日間または2日間培養された神経において検知されず、4日目および7日目の試料において活性MMP-9の痕跡量であった。同様の結果は、既知組成培地において培養された神経外植片について得られ、血清が神経試料において観察されたゼラチン溶解活性に寄与していなかったことが確認された。これらの発見は、MMP-2が、インビトロでの神経変性において、急速に活性化されかつ上方制御されることを示している。ゼラチン酵素電気泳動法は、MMP-2よりMMP-9を検出することにおいて数倍感度が高いことは注目に値し、(Ladwigら、[2002] Wound Repair Regen 10:26-37)、神経試料におけるMMP-9含有量は無視してよいことを意味している。
【０１２８】
実施例 15 - 培養された神経セグメントにおける MMP 活性：インサイチュー酵素電気泳動法
MMPの活性は、遺伝子転写、酵素前駆体活性化、およびメタロプロテイナーゼの組織阻害剤の作用により制御される。インサイチュー酵素電気泳動法による神経セグメントにおける正味のゼラチン溶解活性を調べた。組織切片を、組織内のゼラチン溶解活性により蛍光性ペプチドへ変換される、消光したフルオレセイン-ゼラチンで重層した。構成性のゼラチン溶解活性は、神経内膜基底層に沿って整列したシュワン細胞に大部分関連した正常な神経において検出された(図17Aおよび図17Bに示されるように)。図17Cおよび図17Dに示されるように、培養された神経において、神経内膜内に拡散したゼラチン溶解活性における広く行き渡った増加があり、シュワン細胞はより強く標識された。GM6001の存在下で培養された神経におけるゼラチン溶解活性もまた調べた。上で記載されているように、GM6001は、培養された神経に観察される神経突起促進の増加を妨害した。図17Eおよび図17Fに示されるように、GM6001処理された神経外植片におけるゼラチン溶解活性は、ほとんど検知されなかった。これらの発見を合わせると、ゼラチン溶解活性は神経外植片培養により著しく増加したこと、およびGM6001はインビトロ変性の間、新たなMMP活性を効果的に妨害したことを示している。
【０１２９】
実施例 16 - 培養された神経セグメントにおける MMP 局在化：免疫蛍光標識法
2日間培養された神経外植片におけるMMP-2およびMMP-9の分布を免疫蛍光顕微鏡により調べた。図18Aに示されるように、培養神経のMMP-2免疫標識は、シュワン細胞およびその周囲の基底層内で強かった。S-100でのシュワン細胞染色は、最も強いMMP-2免疫標識が、移動しているシュワン細胞と関連していることを示した(図18B；および下記参照)。また、MMP-2免疫発現は、インサイチュー酵素電気泳動法により得られたゼラチン溶解活性のパターンに非常に類似していた。他方、MMP-9免疫標識は、まれな細胞プロファイルを除いては、神経束内に事実上存在しなかった。図18Cに示されるように、いくらかのMMP-9の細胞免疫発現が周囲の神経上膜に見られた。図18Dに示されるように、OX42標識は、培養された神経の神経上膜全体およびまれに神経束内に散らばったマクロファージを同定するために用いられた。MMP-9およびOX42標識の区画別分布により、マクロファージがMMP-9の主要な供給源であることが示唆された。さらに、シュワン細胞、およびおそらくはいくつかの神経周膜の線維芽細胞が、MMP-2を発現しており、MMP-2免疫反応性はまた、周囲の細胞外マトリックスに拡散しているのが観察された。
【０１３０】
実施例 17 - 培養された神経セグメントにおける細胞分布および軸索変性
神経損傷後、シュワン細胞は活性化状態になり、それらのミエリンを解離し、広く移動する。図18Bに示されるように、培養された神経外植片のS-100免疫標識により、多くのシュワン細胞が、損傷応答の典型であるが、それらの細長い形態および軸索との密接な連合を喪失したことが示された。循環系から接続を断たれた場合に予想されるように、神経外植片におけるマクロファージの数が、インビボでの神経変性において観察されるものより、非常に低かった。さらになお、図18Dに示されるように、ごく少数のマクロファージだけが神経束内に見出され、ほとんどすべてのOX42標識細胞は、神経上膜に限られた。神経切除の時点で神経上膜区画に存在していたマクロファージが、培養の間に内部の神経区画へ侵入しなかったことは、明らかであった。従って、インビトロでの神経外植片は、シュワン細胞の寄与が、侵入しているマクロファージのそれとは独立して評価されうる神経変性のモデルを表している。
【０１３１】
軸索の分解を、培養された神経外植片において、神経フィラメントの免疫標識法により調べた。結果は、図19A〜図19Dに示されている。図19Aに示される、正常な神経において観察される連続的な神経フィラメント染色とは違って、2日間培養された神経セグメントにおける神経フィラメントのプロファイルは、図19Bに示されるように、断片化され、不揃いだった。インビボでの軸索の変性と類似して、培養された神経は、細胞骨格崩壊および軸索の変性を示す、環状および凝縮神経フィラメントの両方のプロファイルを含んだ。図19Dに示されるように、軸索の変性は、特に、残留するミエリン鞘内に空隙または高濃度の球粒を示したトルイジンブルーで染色されたやや薄い(semi-thin)切片において明らかであった。2日間培養された神経において観察される変性の変化は、インビボで見られるウォラーの変性(Wallerian degeneration)(StollおよびMuller, 1999, Brain Pathol 9:313-325により概説されている)の第一相を暗示した。図19Dに示されるように、ウォラーの変性の第二相の主要な特徴もまた、ミエリン鞘における形態的変化、およびシュワン細胞によるミエリン突出、加えてシュワン細胞増殖を含め、培養された神経において観察された。しかしながら、結果としてさらなるミエリン変性(崩壊および凝縮)ならびに貧食性除去を生じる変性過程は、2日目の神経外植片培養物において起こらなかった。図19Cに示されるように、実質的な変性の変化にも関わらず、基底層スキャホールドは、構造的に無傷のままであり、再構築が、シュワン細胞による高レベルのラミニン発現により示された。
【０１３２】
実施例 18 - 無細胞性間置移植片として培養された神経
本実験は、インビトロでの事前変性が無細胞性神経同種移植片を通しての神経再生を向上させるという仮説を試験する。宿主ラットは、1つの対照(あらかじめ変性されていない)および1つのインビトロであらかじめ変性されている(2日間、2 %血清中で培養される)、左右相称の無細胞性神経移植片を受けた。軸索再生は、8日後、横断切片におけるGAP-43免疫陽性プロファイルをスコア化することにより評価された。図20Aおよび図20Bに示されるように、軸索伸長はすべての移植片において観察され、中央に分布されて、近位の宿主神経と移植片の良好なアライメントおよび接合を示した。6/6の動物において、近位の神経-移植片の接合を横断し、移植片に侵入する軸索の数は、インビトロであらかじめ変性された移植片において、その反対側の対照移植片よりも多かった。図20Bに示されるように、平均して、インビトロであらかじめ変性された移植片内の軸索のスコアは、2倍大きかった。両方の移植片条件において、軸索伸長は、基底層管内に生じ、宿主由来シュワン細胞を伴った。これらの発見は、無細胞性神経移植片への軸索再生がインビトロでの事前変性により増強されることを示している。
【０１３３】
変性は、除神経した末梢神経および引き出した神経移植片の成長促進性質を増加させる。本実験は、神経外植片培養モデルを用いて、この変性過程におけるMMPの役割を研究した。また、インビボでの神経事前変性は、ヒト同種移植片の調製として適していないため、インビトロで事前変性された神経移植片の特性を調べた。本実験の結果は、以下の結論を支持する。まず、造血性マクロファージが存在しないにも関わらず、ウォラーの変性の初期段階が、末梢神経外植片の短期間培養において起こる。神経セグメントの神経突起促進活性は、インビトロでの変性により著しく増加し、かつインビボであらかじめ変性された神経よりも大きい程度まで増加する。インビトロでの変性から結果として生じた神経突起促進活性の増加は、シュワン細胞によって高められたMMP-2の発現および活性に起因する。最後に、インビトロでの事前変性は、無細胞性間置神経移植片の中への軸索再生を増強する。
【０１３４】
インビトロでの末梢神経変性の本実験は、MMP-9が、神経上膜鞘に制限された少数の細胞集団に大部分関連して痕跡量で存在することを見出している。MMP-9についての免疫標識は、培養された神経の神経内膜の区画において本質的に存在しない。対照的に、MMP-2、特にその活性型は、培養された神経の神経内膜内で急速に増加する。免疫位置測定およびインサイチュー酵素電気泳動データをひとまとめにして考えると、実験データより、MMP-2がシュワン細胞により発現され、活性酵素がインビトロでの神経変性の間に周囲の神経内膜へ放出されると結論づけられる。
【０１３５】
神経外植片の本観察と合わせると、実験データより、MMP-2が、除神経した神経(およびあらかじめ変性された神経移植片)の成長促進性質の増強のための、主要ではないにしても十分な変性機構を表すことが示される。
【０１３６】
本発明に従って、細胞生存力および増殖を支持する条件を用いる神経外植片の培養は、細胞介在性変性を可能にし、神経移植片の再生潜在能力を有意に増強させる。神経外植片は、凍結死滅されて、間置神経移植片として後の使用のために凍結保存されうる。凍結死滅した神経移植片は、事実上、移植片免疫拒絶の懸念を排除する。この理由で、無細胞性神経移植片は、免疫抑制せずに同種移植片を移植することにおいて、細胞性神経移植片を行うより、臨床的適用としての大きな可能性をもっている。
【０１３７】
本明細書に記載される実施例および態様は例示目的のためのみであり、かつそれらの観点からの様々な改変または変更は、当業者に示唆されると考えられ、本出願の趣旨および範囲内に含まれうることは、理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】コンドロイチナーゼ処理された無細胞性神経移植片のCSPGネオエピトープ免疫蛍光を示す。無細胞性(凍結死滅した)ラット坐骨神経セグメントは、インビトロで16時間、コンドロイチナーゼABCで一括して処理された。図1Aは、Ab1918でのネオエピトープ(コンドロイチナーゼ依存性)標識を示し、コンドロイチナーゼでの一括処理がすべての神経区画に効果的に浸透してCSPG側鎖を分解したことを実証している。図1Bにおいて、Ab1918免疫標識の強度は、図1Aに示される神経の切片をコンドロイチナーゼで追加的に処理することにより増加せず、最初の一括処理が完全であったことを示している。図1Cにおいて、コンドロイチナーゼ処理された無細胞性神経セグメントにおけるシュワン細胞基底層の構造的完全性は、ラミニン免疫蛍光により示された。図1Dは、インビボで8日後のコンドロイチナーゼ処理された無細胞性間置神経移植片のAb1918免疫標識を示す。
【図２】コンドロイチナーゼで処理された無細胞性神経セグメントの凍結切片培養バイオアッセイ法による阻害性CSPGの不活化を示す。無細胞性神経セグメントは、コンドロイチナーゼ(「Ch'ase」)または溶媒単独で一括して処理された。神経は、薄片に切られ、その後、コンドロイチナーゼまたは溶媒単独での後処理として追加的に処理された。分離されたニワトリ胚性DRGニューロンが24時間、神経切片上に増殖され、神経突起長は、材料および方法に記載されているように、スコア化された。測定は、各条件において少なくとも250個のニューロンにスコア化することにより行われた。結果は、平均(-SEM)として表され、一括の溶媒およびコンドロイチナーゼの条件を比較する統計上の有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定された。*P＜0.001。
【図３】間置無細胞性神経移植片の連続性およびGAP-43免疫染色の評価を示す。各神経移植片の連続性は、縦方向の切片において近位および遠位の神経-移植片接合を調べることにより確認された。近位の接合において、GAP-43標識により、移植片の近位局面に侵入する多数の再生中の軸索が明らかにされた。GAP-43は、無細胞性移植片内のいずれの残留要素も標識しなかった。
【図４】8日後の無細胞性間置神経移植片中への軸索再生を示す。それぞれ、溶媒処理およびコンドロイチナーゼ処理の移植片を受けた、2匹の動物からの代表的な連続切片。近位の移植片(1.2 mm、先端)および後に続く0.56 mm間隔から取られた連続切片は、GAP-43で免疫標識された。左右相称の移植片を受けた各動物において(n = 9)、軸索伸長は、溶媒処理された対照よりコンドロイチナーゼで処理された無細胞性移植片中に向かって多かった。画像は、神経上膜で切り取られ、図5においてデジタル画像解析によりスコア化された範囲を近似した。
【図５】コンドロイチナーゼ処理された無細胞性神経移植片中への再生中の軸索のより多い到達を示す。8日目の間置神経移植片の連続切片(図4に示す)は、デジタル画像解析によりGAP-43標識軸索プロファイルについてスコア化された。データは、移植片への指定された距離において(近位から遠位まで)評価された9個の溶媒処理移植片および9個のコンドロイチナーゼ処理移植片の平均(-SEM)を表す。
【図６】4日後の無細胞性間置神経移植片の最初のセグメント中への軸索再生を示す。4日目の無細胞性移植片の神経-移植片界面とすぐ近くの近位領域が調べられた。GAP-43標識軸索プロファイルは、移植片中へ0.3 mmにおいて比較された。データは、3個の溶媒処理移植片および3個のコンドロイチナーゼ処理移植片の平均(-SEM)を表す。
【図７】移植片内における軸索再生とシュワン細胞移動の関係を示す。8日目の移植片の連続切片は、GAP-43(軸索)およびS-100(シュワン細胞)について免疫標識された。コンドロイチナーゼ処理された移植片の近位の領域において、シュワン細胞が、再生中の軸索と密接に関係しているのが最も頻繁に見出された。軸索のクラスターが、共移動しているシュワン細胞なしで時々観察された(矢印)。移植片中のより遠位の地点において、軸索は、しばしばシュワン細胞を伴わずに見出された。移植片のより遠位の領域において、ほんの少数の点在するシュワン細胞のみが、S-100について強く免疫標識され、凍結死滅したシュワン細胞残遺物に関連した弱いS-100染色を大部分含んだ。
【図８】遠位の移植片接合における軸索伸長およびシュワン細胞増殖を示す。8日目のコンドロイチナーゼ処理された移植片および遠位の神経断端の連続の縦方向切片が、図8Aに示されるようにGAP-43について(軸索)、および図8Bに示されるようにS-100について(シュワン細胞)、免疫標識された。図8Aにおいて、軸索(小さい矢印)は、遠位の接合に接近、横断し、宿主の遠位断端内に拡散的に伸長する。図8Bにおいて、S-100標識されたシュワン細胞は、遠位の宿主断端において豊富であるが、あるとしてもほんの少数のみが、移植片の遠位局面(凍結死滅したシュワン細胞残遺物に関連した弱いS-100免疫染色を含む)に侵入する。
【図９】図9Aおよび図9Bは、それぞれ、CSPGネオエピトープおよびラミニンについて染色されたヒト神経を示す。ヒト神経の全体構造はラット神経より複雑であるが、これらの結果は、軸索再生を支えている基底層が大概は類似しており、成長を制御する分子成分(CSPGおよびラミニン)が豊富であることを示している。図9Aはまた、ネオエピトープ標識により、CSPG側鎖がコンドロイチナーゼで処理されたヒト神経セグメントにおいて効果的に分解されたことを実証している。
【図１０】ヒト神経セグメントを用いる凍結切片培養アッセイ法による阻害性CSPGの不活化を示す。ヒト神経は、コンドロイチナーゼで処理され、その後、神経突起促進活性についてアッセイされた。分離されたニワトリDRGニューロンが24時間、切片上で増殖され、神経突起長がスコア化された。結果は、平均(-SEM)として表されている。溶媒処理およびコンドロイチナーゼ処理の条件を比較する統計上の有意性(P＜0.001)は、スチューデントのt検定を用いて見出された。
【図１１】ヒトからラットへの異種移植モデルにおいて、コンドロイチナーゼ処理された無細胞性神経移植片中へのより多い軸索の伸長を示す。(ラットの坐骨神経と類似した直径の)ヒト神経束が、ラットの坐骨神経に作られたギャップへ移植された。8日目の間置神経異種移植片の連続切片が、デジタル画像解析によりGAP-43標識軸索プロファイルについてスコア化された。データは、移植片への指定された距離において(近位から遠位まで)評価された2個の溶媒処理移植片および2個のコンドロイチナーゼ処理移植片の平均(-SEM)を表す。
【図１２】コンドロイチナーゼABCの単一の注射による、損傷をうけた坐骨神経におけるCSPGの分解を示す。2つの損傷モデル、左右相称の神経切断および修復(図12A、図12Bおよび図12D)ならびに左右相称の神経挫滅(図12C)が調べられた。損傷の時点において、右の坐骨神経は、神経損傷の部位に対して2 mm遠位の部位にコンドロイチナーゼABC(2 μl中1 U)を注射された。神経切断および修復後4日後、CSPG-ネオエピトープ免疫染色は、接合部位における神経内膜および神経鞘の全体(図12A)(神経上膜における縫い目に注目されたい)、ならびに接合に対して数mm遠位(図12B)および近位(示していない)両方の神経の横断面領域全体に強かった。図12Cに示されるように、コンドロイチナーゼ注射後2日目に調べられた挫滅損傷の神経において、同様の結果が得られた。図12Dに示されるように、インビボでのコンドロイチナーゼの注射によるCSPG分解の程度は、組織を切片にした後にコンドロイチナーゼでの2度目を処理された神経のCSPG-ネオエピトープ免疫標識により調べられた。2度目の適用後、連続切片に観察された染色強度は、顕著な違いはなく(図12Bと図12Dを比較)、単一のコンドロイチナーゼのインビボでの注射が、周囲の細胞外マトリックスにおいてCSPGを効果的に分解したことを示している。
【図１３】コンドロイチナーゼABCでの処理が神経挫滅損傷後の軸索再生を変化させなかったことを示す。成体ラットは、左右相称の坐骨神経挫滅を受け、一方の神経はコンドロイチナーゼABCを注射され、反対側の神経は溶媒単独を受けた。損傷後2日目に神経は取り出され、再生中の軸索は、GAP-43免疫細胞化学により標識された。2匹の代表する動物(それぞれ、溶媒およびコンドロイチナーゼの注射を受けている)において、神経挫滅に対してすぐ近くの遠位の再生された軸索プロファイルが図13Aに示されている。図13Bに示されるように、遠位神経の連続切片において、GAP-43免疫標識された軸索がスコア化された。溶媒処理された対照神経と比較して、コンドロイチナーゼ処理された(Ch'ase)神経において軸索再生に有意な違いはなかった。データは、遠位神経への0.56mm間隔で評価された6個のコンドロイチナーゼ処理移植片および6個の溶媒処理の神経の平均(±SEM)を表す。
【図１４】コンドロイチナーゼABCでの処理が、神経切断および神経縫合術での修復後の軸索再生を著しく増強させたことを示す。成体ラットは、左右相称の神経切断および末端から末端への修復を受けた。1つの神経はコンドロイチナーゼABCを注射され、反対側の神経は溶媒単独を受けた。神経は損傷後4日目に取り出され、再生中の軸索は、GAP-43免疫細胞化学により標識された。2匹の代表する動物(それぞれ、溶媒およびコンドロイチナーゼの注射を受けている)において、神経接合に対してすぐ近くの遠位の再生された軸索プロファイルが図14Aに示されている。図14Bに示されるように、遠位神経の連続切片において、GAP-43免疫標識された軸索がスコア化された。溶媒処理された対照と比較してコンドロイチナーゼ処理された(Ch'ase)神経において、軸索再生は有意に大きかった。データは、遠位神経への0.56mm間隔で評価された7個のコンドロイチナーゼ処理および7個の溶媒処理の神経の平均(±SEM)を表す。
【図１５】神経外植片培養の凍結切片培養アッセイ法を示す。図15Aに示されるように、新鮮に切除されたラット坐骨神経外植片は、0 %、2 %、または10 %ウシ胎児血清を含むDMEM/N2において、1日、2日、4日および7日間、培養された。図15Bに示されるように、神経外植片は、GM6001(MMP阻害剤)の添加無しおよび有りの2 %血清を含むDMEM/N2(培養標準(Culture Standard))において2日間、培養された。その後、神経は凍結切片にされ、胚性DRGニューロンが、NGFを含むDMEM/N2における組織切片上に播種された。24時間後、DRGニューロンは、GAP-43について免疫染色され、神経突起伸長は、デジタル顕微鏡写真および画像解析により測定された。対照条件は、正常な神経(培養の0日目)であった。データは、各条件において、2つまたはそれ以上の別々の実験で試験された少なくとも4つの別々の神経移植片培養物からの、スコア化された＞250個のニューロンの平均神経突起長(±SEM)を表す。
【図１６】神経外植片培養物の酵素電気泳動の分析を示す。神経外植片は、2 %血清を含むDMEM/N2において、0日(対照、C)、1日、2日、4日、および7日間、培養された。その後、神経は抽出され、ゼラチン重層電気泳動法により分析された。酵素電気泳動法により、染色されたゲル内に透明なバンドとして現れるプロ型および活性型の両方のゼラチナーゼが明らかにされる。対照神経は、大部分はプロMMP-2を含み、痕跡量の活性MMP-2を含んだ。2日間またはそれより長く培養された神経外植片内で、MMP-2含有量における累進的な増加および活性型への急速な変換があった。MMP-9は、4日目および7日目において痕跡量が検出されたが、対照および初期の外植片においては無視してよいものだった。分子量は、組換え型ヒトプロMMP-9(92 kD)、活性MMP-9(84 kD)、プロMMP-2(72 kD)および活性MMP-2(66 kD)の位置を指す。
【図１７】インサイチュー酵素電気泳動法による神経セグメントにおける正味のゼラチン溶解活性の局在化を示す。対照神経(図17Aおよび図17B)ならびに培養された神経外植片(2日、2 %血清)(図17Cおよび図17D)の組織切片は、組織内のゼラチン溶解活性により蛍光性ペプチドへ変換される、消光したフルオレセイン標識ゼラチンで表面を重層された。恒常的ゼラチン溶解活性が、正常な神経において検出され(図17A)、より高倍率において(図17B)、シュワン細胞と関連していた。図17Cおよび図17Dに示されるように、ゼラチン溶解活性は、培養された神経において、より強くかつ神経内膜中に拡散していた。図17Eおよび図17Fに示されるように、GM6001の存在下で培養された神経におけるゼラチン溶解活性は、著しく減少した。
【図１８】培養された神経外植片におけるMMP-2およびMMP-9の免疫発現を示す。図18Aに示されるように、培養された神経(2日、2 %血清)のMMP-2免疫標識は、シュワン細胞および周囲の基底層(挿入写真)内で強かった。図18Bにおいて、S-100免疫標識は、神経内のシュワン細胞の増殖した集団の再配置を示した。図18Cに示されるように、MMP-9免疫標識は、まれな細胞のプロファイルを除いて、事実上、神経束内に存在しなかった。周囲の神経上膜におけるいくつかの細胞がMMP-9について標識された。図18Dにおいて、OX42標識は、培養された神経の神経上膜全体に散らばったマクロファージ、およびまれに神経束内に散らばったマクロファージを示した。
【図１９】培養された神経外植片におけるウォラーの変性を示す。2日間培養された神経セグメントにおいて観察される変性の変化は、インビボで見られるウォラーの変性の第一相を暗示した。図19Aにおいて、神経フィラメント免疫標識は、図19Bに示されるような培養された神経外植片(2日、2 %血清)において見出される環状および断片化された軸索と比較して、正常な神経において軸索の緻密かつ連続的な形態を示した(図19Aおよび図19Bの挿入写真、縦方向切片)。図19Cに示されるように、ラミニンについての免疫標識は、基底層が構造的に無傷であり、ラミニン発現がシュワン細胞において上方制御されたこと(挿入写真)を示した。図19Dに示されるように、軸索の変性およびシュワン細胞によるミエリンの放出は、特に、トルイジンブルーで染色されたやや薄い切片において明らかであった。図19Dの挿入写真に示されるように、結果としてさらなるミエリン変性(崩壊および凝縮)および貪食性除去を生じる変性過程は、2日間培養された神経セグメントにおいて観察されなかった。
【図２０】インビトロであらかじめ変性された無細胞性神経移植片内の軸索再生を示す。正常および培養された(2日、2 %血清)神経移植片は、凍結死滅され、長さ10 mmにトリミングされ、切断された坐骨神経の修復のための間置移植片として使用された。宿主ラットは、一方は正常(培養されていない)および一方はあらかじめ変性されている(培養された)、左右相称の移植片を受けた。軸索再生は、8日後に、横断切片におけるGAP-43免疫陽性プロファイルをスコア化することにより評価された。図20Aにおいて、2匹の動物からの対照およびあらかじめ変性された移植片の代表的な切片が示されている。切片は、移植片内へ1.5 mmのところで軸索再生を示す。免疫蛍光画像のピクセル値は反転された。図20Bに示されるように、定量的分析は、移植片内の測定された距離において行われた。データは、各条件における6つの神経の平均(±SEM)を表す。
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所助成金No. R01 NS37901により援助された研究プロジェクトによる政府援助でなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2001年8月13日に出願された仮特許出願第60/311,870号の恩典を主張するものであり、それは、すべての図、表、および図面を含め、完全に参照として本明細書に組み入れられている。
【０００３】
発明の背景
末梢神経損傷は、慢性能力障害の主な原因である。神経損傷の弱い統御力は、筋萎縮と関連し、切断された軸索が遠位の神経と連続性を回復することができない場合、有痛性神経腫へと導きうる。神経は、損傷後再生する潜在能力をもっているが、この能力は、厳密に言えば、切断された神経セグメント(およびその中のシュワン細胞基底層)と適切な接触をする、再生する神経線維(およびそれらの軸索の新芽)に依存している。裂け目または損傷部位を横断して切断された遠位の神経セグメントの基底層に入ることができない再生中の軸索は、衰退し、結果として、ニューロン死、筋萎縮および永久機能障害を生じるであろう(Fawcett JWら、[1990] Annu Rev Neurosci 13:43-60)。
【０００４】
簡単には、神経は、ニューロンの末梢突起(または軸索)を有する。ニューロンの細胞体は、脊髄(運動ニューロン)、脊柱に沿って位置している神経節(脊髄知覚神経節)、または身体の器官中いたるところに見出される神経節(自律神経および腸の神経節)に存在する。神経は、軸索、シュワン細胞および拡張性結合組織鞘からなる(Dagum AB [1998] J Hand Ther 11:111-117)。外部被覆、神経上膜は、外圧から束を保護し、神経周膜を囲むコラーゲン性結合組織で作られている。神経周膜は、個々の束を囲み、神経内膜の微細血管の内皮細胞と共に、血液-神経関門として機能する。神経内膜は、神経周膜の内側にあり、シュワン細胞および軸索を囲むコラーゲン性組織からなる。束群は、それぞれ、神経周膜および神経内膜により囲まれている2つまたはそれ以上の束からなる。神経の組織分布は、遠心的に一定であり、束の群は知覚性または運動性のいずれかである。ニューロンは、細胞体(cell body)および数フィート長でありうる軸索からなる。
【０００５】
軸索の分裂があるが、神経内膜鞘の連続性が無傷のままである神経損傷(例えば、挫滅損傷)においては、軸索は、それらの本来の基底層内に再生し、完全回復が予想されうる。対照的に、神経切断後では、軸索再生はひどく危うくなる可能性があり、外科的修復は、上記の神経要素の再アライメントに高く依存している(Dagum AB [1998] J Hand Ther 11:111-117)。神経上膜接合(神経縫合術)は、神経切断を扱う第一次的方法である。しかしながら、再生の程度は、大いに変わりやすく、せいぜい、部分的な機能回復が予想されうる(Terzis JKら、[1990] The Peripheral Nerve: Structure, function and reconstruction, Hampton Press, Norfolk)。神経切断の修復後の機能の完全回復は、顕微手術技法における技術の現状にもかかわらず、緻密な神経微細構造および正確な軸索から軸索への接合を達成することの不可能のために、達成されえない観念のままである。
【０００６】
神経移植は、神経切除を伴って保証されるが、いくつかの実際的な難題を示す。何年間にもわたって、様々な神経移植片代替物が探究されてきた。現在、開発中の代替物と考えられるのは、同種の神経移植片の適用である。ドナー移植片の利用可能性は、他の器官の交換戦略の困難性をこうむるが、神経移植片における生存可能な細胞要素の重要性は、ほとんど重要でない可能性がある。シュワン細胞は、再生過程に有意に寄与しているが、神経鞘構造は、軸索再生を促進するための必須の足場および接着性の手掛かりを含み、有意な再生が無細胞性(例えば、凍結死滅した)神経移植片において達成された(Ide Cら、[1983] Brain Res 288:61-75; Hall SM [1986] Neuropathol Appl Neurobiol 12:401-414; Gulati AK [1988] J Neurosurg 68:117-123; Nadim Wら、[1990] Neuropathol Appl Neurobiol 16:411-421)。内在する抗原提示細胞(例えば、シュワン細胞、線維芽細胞、内皮細胞など)を死滅させることは、移植片の免疫原性を大いに低下させる。無細胞性神経移植片の使用は、宿主-移植片の免疫拒絶の懸念を大いに減らすかまたは排除する(Evans PJら、[1994] Prog Neurobiol 43:187-233; Evans PJら、[1998] Muscle Nerve 21:1507-1522)。これらの特徴は、凍結死滅した(無細胞性)同種および異種の神経移植片の使用についてかなりの見込みを与える。他方、生存可能な細胞の非存在は、再生過程を促進するものと思われる神経変性およびその後の再構築を妨げる(Bedi KSら、[1992] Eur J Neurosci 4:193-200; Danielsen Nら、[1994] Brain Res 666:250-254)。
【０００７】
ラミニンは、うまく軸索再生するための接着性刺激を示す、基底層の主な成長促進成分である(Wang, GYら、[1992] Brain Res 570:116-125)。しかしながら、正常な(損傷のない)神経はラミニンに富んでいる一方、正常な神経は、軸索伸長に対して抑制性または無反応性のままである。(Langley JN [1904] J Physiol 31:365-391; Brown MCら、[1994] Eur J Neurosci 6:420-428)。これは、ラミニンの成長促進活性が正常な神経環境においては抑制されており、かつラミニン活性が神経変性および後に続く再生においてなんとかして回復されなければならないことを示唆している。
【０００８】
正常な末梢神経は、軸索伸長にとって乏しい基底である(Zuo Jら、[1998] J Neurobiol 34:41-54; Bedi KSら、[1992] Eur J Neurosci 4:193-200)。実験結果より、正常な神経基底層内のラミニンは、再生中の軸索新芽に接近できないことが示されている(Zuo Jら、[1998] J Neurosci 18:5203-5211; Ferguson TAおよびD. Muir [2000] Mol Cell Neurosci 16:157-167; Agius E.ら、[1998] J Neurosci 18:328-338)。神経への損傷において、切断されたセグメント(損傷に対して遠位の)は、拡張性再構築を起こす拡張性変性過程を受ける。損傷誘導性神経変性において、切断された軸索は死に、それらのミエリン鞘断片およびその結果生じる壊死組織片は食作用により除去される。この変性にもかかわらず、鞘構造および基底層は保存される。シュワン細胞は増殖し、軸索の再伸長のために神経を調える。再構築局面を含む全過程は、一般的に、神経変性と呼ばれている。神経損傷が結果として、遠位の神経セグメントへ正の改変を生じることは、今や、明らかであり、実験は、変性した神経が、正常な神経より大きい軸索成長促進潜在能力をもっていることを示している(Bedi KSら、[1992] Eur J Neurosci 4:193-200; Danielsen NJら、[1994] Brain Res 666:250-254; Agius Eら、[1998] J Neurosci 18:328-338)。それゆえに、変性過程は、抑制された状態から軸索伸長を促進する状態へと正常な神経を転換する機構を含むように思われる(Salonen VJら、[1987] J Neurocytol 16:713-720; Danielsen Nら、[1995] Brain Res 681:105-108)。
【０００９】
神経損傷に関連する機能喪失は、軸索分裂から生じる。軸索は、とても薄くかつ脆く、わずかな損傷(圧迫を含む)でさえも切断する応答(軸索切断)を引き起こしうる。軸索切断において、損傷に対して遠位の軸索は、死んで、退化する。神経への最も問題の少ない損傷は、挫滅損傷(軸索断裂症)であり、軸索切断があるが、神経鞘の連続性が無傷のままである。軸索断裂症の場合、典型的には、軸索は、基底層が連続的なままであるため、外科的介入なしに再生される。切断された末梢神経が成功裡に再生されるためには、近位の神経断端から発する軸索新芽が、まず、遠位の神経セグメントにおけるシュワン細胞基底層の位置を捜し当て、その後、接近しなければならない。この決め手となる必要条件が、挫滅損傷と比較して、神経切断後に達成される相対的に乏しい再生の一因となっているものと考えられる。神経切断(神経断裂)において、神経は部分的にまたは完全に切断される。切断損傷は、軸索および神経鞘の両方が切断されるものであり、神経の連続性および軸索再生に必要とされる誘導機構を崩壊させる。神経の神経要素の連続性を再確立するための外科的接合(神経縫合術)は、軸索の再伸長に必須である。加えて、神経切断後の軸索再伸長および修復は、近位と遠位の要素の誤アライメントにより、さらに複雑である。鋭利な道具によるきれいな切断の場合でさえも、神経構造全体が崩壊する。切断末端からの膨張および軸索原形質流出は、基底層足場の正確な接合および再アライメントを妨げるキノコ状化効果を引き起こす。顕微手術技術により成し遂げられる線維束のアライメントにおける向上にもかかわらず、軸索から軸索への接合は、理想論的な目標のままである。軸索の小さいサイズおよび結合組織の相対的優位のために、外科的接合後に近位断端から発する軸索新芽の多数は、たいてい、阻害性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)に富んでいる非許容性の基底に最初に遭遇する可能性が高い。これは、末梢神経切断修復に関連した有意な潜伏期および迷走性の再生を説明しうる。CSPGが結合してラミニンの成長促進活性を阻害すること、およびCSPGが損傷後、変性過程の間に分解されることを証拠が示している。従って、CSPGが不活化される過程により、なぜ再生が神経再生にとって必須であるかを説明できる。末梢神経が神経内膜ラミニンの成長促進活性を阻害するCSPGを豊富に含んでいることが、最近、見出された(Zuo Jら、[1998a] J Neurobiol 34:41-54)。神経突起阻害性CSPGが、シュワン細胞基底層を囲む神経内膜組織に豊富にあり、神経損傷後、速やかに上方制御される(Braunewell KHら、[1995a] Eur J Neurosci 7:805-814; Braunewell KHら、[1995b] Eur J Neurosci 7:792-804)。従って、いずれの神経微細構造の誤アライメント(損傷および修復後の)も、再生する軸索新芽が、遠位の神経における基底層への接近を厳しく制限しうる非許容性組織をうまく通り抜けるようにさせる。最近の研究により、ある特定のCSPG分解酵素が、変性する神経内にラミニンの成長促進性質を回復させうる機構を表すという結論が支持された(Zuo Jら、[1998b] J Neurosci 18:5203-5211; Ferguson TAら、[2000] Mol Cell Neurosci 16:157-167)。さらに、この過程は、神経損傷部位において、および再生を向上させるための神経移植片へのCSPG分解酵素の適用により達成されうる(Zuo Jら、[2002] Exp Neurol 176:221-228; Krekoski CAら、[2001] J Neurosci 21:6206-6213)。特に効果的であるそのようなCSPG分解酵素の一つには、コンドロイチナーゼABCであり、これはCSPGの二糖側鎖を分解する細菌酵素である(Zuo Jら、[1998a] J Neurobiol 34:41-54)。他には、CSPGの核タンパク質を分解する、マトリックスメタロプロテイナーゼのファミリーの特定のメンバー、MMP-2およびMMP-9を含む(Ferguson TAら、[2000] Mol Cell Neurosci 16:157-167)。
【００１０】
コンドロイチナーゼABC(グリコサミノグリカンリアーゼ)は、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸およびヒアルロナンを分解するが、神経組織の成長促進性質を増強させるその能力は、CSPG分解に起因した(Zuo Jら、[1998] Exp Neurol 154:654-662; FergusonTAら、[2000] Mol Cell Neurosci 16:157-167)。さらに、コンドロイチナーゼABC処理は、神経鞘組織化を崩壊させないか、またはラミニンをシュワン細胞基底層から転置させないことが示された(Krekoski CAら、[2001] J Neurosci 21:6206-6213)。
【００１１】
神経切断修復モデルにおいて、阻害性CSPGの分解は、軸索新芽を再生することへの主な障害を除去し、結果として、遠位の神経へのより丈夫でかつ一様な伸長を生じた(Krekoski CAら、[2001] J Neurosci 21:6206-6213)。
【００１２】
変性された神経は、軸索伸長を支える能力が増加することが示された(Giannini Cら、[1990] J Neuropathol Exp Neurol 49:550-563; Hasan Nら、[1996] J Anat 189:293-302)。あらかじめ変性された神経から調製された無細胞性移植片へも軸索再生が改善されることから、変性の効果は、神経基底層の改変による可能性が高い(Danielsen Nら、[1995] Brain Res 681:105-108)。変性過程の間中、シュワン細胞基底層は、構造的に無傷のままである。
【００１３】
動物モデルより、インビボであらかじめ変性された神経から作製された移植片は、新鮮に切断された移植片より、神経再生を支えるにおいてずっと有能であることが示された(Danielsen Nら、[1995] Brain Res 681:105-108)。しかしながら、ヒトにおいてあらかじめ変性された神経を作製するための手順は、実際的ではない(すなわち、神経損傷に続いて、組織変性を可能にするためのインビボでの生存の期間)。
【００１４】
インビボでの末梢神経変性は、結果として、ニューロン、シュワン細胞および侵入しているマクロファージによるタンパク質分解酵素の放出および活性化に依存する、いくつかの細胞外マトリックス分子の代謝回転の増加を生じる。損傷後のマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)活性の調節は、神経変性および再生の間の細胞外マトリックスの再構築にMMP-2およびMMP-9を関係させる(La Fleurら、[1996] J Exp Med 184:2311-2326; Kherifら、[1998] Neuropathol Appl Neurobiol 24:309-319; Fergusonら、[2000] Mol Cell Neurosci 16:157-167)。MMP-9は、末梢神経において、損傷後すぐに、かつ主に損傷の部位に、発現される。MMP-9発現は、血液神経関門の崩壊、顆粒球の蓄積およびマクロファージの侵入と相関している(Shubayevら、[2000] Brain Res 855:83-89; Siebertら、[2001] J Neuropathol Exp Neurol 60:85-93)。たいていの証拠は、造血細胞がMMP-9活性の上昇に有意に寄与していることを示唆している(Taskinenら、[1997] Acta Neuropathol (Berl) 93:252-259)。他方、MMP-2は、正常な末梢神経においてシュワン細胞により恒常的に発現されている(Yamadaら、[1995] Acta Neuropathol (Berl) 89:199-203)。損傷の数日後、MMP-2発現が上方制御され、潜在性酵素が、実質的にその活性型へ変換される(Fergusonら、[2000] Mol Cell Neurosci 16:157-167)。
【００１５】
インビトロでの変性は、結果として、神経外植片の神経突起促進活性における実質的増加を生じる。この増加は、正味のゼラチン分解活性において同時に起こる増加と同じように(インサイチュー酵素電気泳動法により実証される)、MMP阻害剤の添加により遮断される。神経突起促進活性における上昇は、培養された神経外植片において、かつMMP-2の上方制御および活性化と並行して、速やかに生じる。対照的に、インビボでの変性の最初の効果は、すでに低い正常な神経の神経突起促進活性を抑制するのみであり、その間は、インビボでのMMP-2発現または活性化に変化はない。しかしながら、切断された神経の神経突起促進活性は、十分な時間が過ぎるとインビボで増加し、これは、MMP-2発現および活性化の突発と同時に起きる(FergusonおよびMuir, 2000, Mol Cell Neurosci 16:157-167; ShubayevおよびMyers, 2000, Brain Res 855:83-89)。
【００１６】
インビトロでのアッセイは、インビボであらかじめ変性された神経セグメントが、神経の正常なセグメントより大きい神経突起促進活性をもつことを示している(Bediら、[1992] Eur J Neurosci 4:193-200; Agiusら、[1998] J Neurosci 18:328-338; Fergusonら、[2000] Mol Cell Neurosci 16:157-167)。しかしながら、あらかじめ変性された神経移植片を試験するインビボでの研究では、特に、細胞性(生きている)神経移植片を用いる場合、矛盾する結果を生じた(Gordonら、[1979] J Hand Surg [Am] 4:42-47; Danielsenら、[1994] Brain Res 666:250-254; Hasanら、[1996] J Anat 189(Pt 2):293-302)。それでもなお、事前変性は、無細胞性移植片への再生の増強として特に有利であるように思われる(Ochiら、[1994] Exp Neurol 128:216-225; Danielsenら、[1995] Brain Res 681:105-108)。これは、変性において、細胞および分子の機構が基底層の成長促進性質を増強するように作用し、その後、基底層が、細胞の要素が死滅した後、神経再生を刺激する能力を保持することを示している。インビトロでの事前変性は、結果として、無細胞性神経移植片の成長促進能力における実質的増加を生じ、それは、本発明の凍結切片培養法および移植モデルにおいて容易に実証された。無細胞性神経移植は、軸索再生の開始における実質的な潜伏期と関連している(Danielsenら、[1995] Brain Res 681:105-108)。
【００１７】
神経外植片培養および神経移植片保存についての研究の多くは、神経セグメントの低温貯蔵に集中してきた。培養中の神経移植片の限定的な変性を促進するための試みとは違い、低温貯蔵方法は、細胞およびタンパク質分解の活性を抑制する最小限で虚血性の条件下で神経を保存することを目指している。Leviら(Levi Aら、[1994] Glia 10:121-131)は、細胞生存度が、低温貯蔵の1週間後、有意に減少し、3週間後、神経外植片には少数の生存可能なシュワン細胞のみが残ったことを見出した。続いて、Lassnerら(Lassnerら、[1995] J Reconstr Microsurg 11:447-453)は、培地(低温貯蔵溶液(Cold Storage Solution)よりむしろ、DMEM)が、シュワン細胞の生存度を維持することおよび低温虚血性条件下で保存された神経移植片の再生潜在能力に正の効果を及ぼすことを報告した。神経移植片の成長促進潜在能力を最適化するためには有益ではないが、連続した低温貯蔵は、細胞生存度、免疫原性および同種の神経移植片の免疫拒絶の懸念をさらに減少させる(Evansら、[1998] Muscle Nerve 21:1507-1522)。このため、長期の低温貯蔵および凍結死滅した神経同種移植片は、結果として、新鮮な同種移植片より良好な再生を生じる(Evansら、[1999] Microsurgery 19:115-127)。
【００１８】
従って、当技術分野において、通常の神経修復の成果を向上させるための低危険性の補助的治療についての必要性が依然として残っている。
【発明の開示】
【００１９】
発明の簡単な概要
本発明は、神経組織の修復を促進するための組成物および方法に関する。好ましい態様において、本発明の組成物は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)分解酵素を含む。一つの態様において、本発明の組成物は、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるCSPG分解酵素を含む。さらなる態様において、本発明の組成物は、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、コンドロイチナーゼAC、ヒアルロニダーゼ、MMP-2、およびMMP-9、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるCSPG分解酵素を含む。
【００２０】
本発明はまた、ヒトまたは動物において、損傷をうけた神経組織の修復を促進するための方法に関する。本発明の方法は、神経修復、接合、移植、または損傷をうけた神経組織へ1つまたは複数のCSPG分解酵素を投与する段階を含む。本発明の方法は、再生中の軸索の神経-神経または神経-移植片の界面を横断する能力を向上させ、基底層スキャホールド内の軸索伸長を増強する。阻害性CSPGの分解は、より許容的な神経基底を創造し、神経のシュワン細胞基底層への軸索新芽のより十分な接近を可能にし、それにより、損傷をうけた神経組織または移植された神経移植片を成功裡に貫入する軸索の数を増加させる。軸索新芽の適切な経路設定はまた、機能の回復においてさらなる改善へと導くことを可能にしうる。
【００２１】
本発明はまた、CSPG分解酵素での処理により神経移植片を調製する方法に関する。好ましくは、神経移植片(同種または異種のいずれか)は、新鮮でありかつ変性されておらず、神経移植片を凍結させる前または後のいずれかにCSPG分解酵素で処理される。移植片の細胞が生きている間に処理される場合、移植片は、それ自体が移植されうるか、またはその後それを無細胞性にするために凍結死滅されうる。一つの態様において、神経組織は、処理後無細胞性にされる。好ましい態様において、神経組織は、凍結死滅により無細胞性にされる。
【００２２】
本発明はまた、ヒトまたは動物への神経移植片としてその後に移植するための新鮮な(または輸送のために簡単に保存された)神経組織を培養する方法に関する。好ましくは、神経組織は、ヒトまたは動物のドナーから新鮮に採取され、そして、組織がエキソビボで変性かつ再構築することを可能にし、内因性過程により組織内のシュワン細胞の増殖および基底層の活性化を促進する生理学的条件下で培養される。一つの態様において、神経組織/移植片は、培養後無細胞性にされる。好ましい態様において、神経組織/移植片は、凍結死滅により無細胞性にされる。
【００２３】
本発明はさらに、ヒトまたは動物への移植のための神経移植片を供給する方法に関係する。好ましくは、ドナー移植片の横断面の特徴は、移植部位での神経組織の横断面の特徴と類似している。
【００２４】
発明の詳細な開示
本発明は、神経組織の修復を促進するための組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、疾患、外傷性事象または外科的処置により中断された神経の連続性を回復させるために使用されうる。本発明の組成物および方法は、損傷をうけた神経組織または移植された神経移植片を成功裡に貫入する軸索の数を増加させることにより神経組織の修復を促進させ、結果として、より大きな機能的回復を生じる。
【００２５】
好ましい態様において、本発明の組成物は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)分解酵素を含む。一つの態様において、本発明の組成物は、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるCSPG分解酵素を含む。さらなる態様において、本発明の組成物は、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、コンドロイチナーゼAC、ヒアルロニダーゼ、MMP-2、およびMMP-9、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるCSPG分解酵素を含む。
【００２６】
CSPG分解酵素は、起源がヒト、動物、または細菌起源であり、天然に存在するかまたは組換え型でありうる。本明細書に用いられる場合、用語「CSPG分解酵素」とはまた、例えば、それらの実質的なCSPG分解活性の量を保持する、そのような酵素の生物活性のある断片および変異体も含むものとする。本発明の組成物は、適切な薬学的担体を含むことができる。本発明はさらに、1つまたは複数のCSPG分解酵素で処理された神経組織に関する。
【００２７】
1つまたは複数のCSPG分解酵素に加えて、本発明の組成物は、成長因子のような生物学的または薬理学的に活性のある分子をさらに含むことができる。そのような成長因子は、限定されるものではないが、神経成長因子(NGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF-1およびFGF-2)、上皮増殖因子(EGF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4およびニューロトロフィン-5(NT-3、NT-4およびNT-5)、インスリン様成長因子-Iおよびインスリン様成長因子-II(IGF-I、IGF-II)、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、グリア成長因子-2(GGF-2)、血管内皮成長因子(VEGF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)ならびにリンパ球浸潤因子/コリン作動性分化因子(LIF/CDF)を含む。そのような分子は、自然に、または組換えDNA技術により得ることができる。それらの生物学的または薬理学的活性を保持するそのような分子の断片または変異体もまた使用されうる。
【００２８】
本発明はまた、ヒトまたは動物において、損傷をうけた神経組織の修復を促進するための方法に関する。本発明の方法は、1つまたは複数のCSPG分解酵素を神経移植片または損傷をうけた神経組織に投与することを含む。本発明の方法は、再生中の軸索の神経-神経および神経-移植片の界面を横断する能力を向上させ、その基底層スキャホールド内の軸索伸長を増強する。阻害性CSPGの分解は、より許容的な神経基底を創造し、神経のシュワン細胞基底層への軸索新芽のより十分な接近を可能にし、それにより、損傷をうけた神経組織または移植された神経移植片に成功裡に貫入する軸索の数を増加させる。
【００２９】
損傷をうけた神経への CSPG 分解酵素の適用
一つの態様において、CSPG分解酵素は、損傷をうけた神経、神経損傷の部位または神経損傷修復の部位に適用される。好ましい態様において、CSPG分解酵素は、切断されたまたは切り取られた神経の接合(すなわち、末端から末端への神経接合)を含む、第一次神経修復の部位へ適用される。神経への損傷は、神経が部分的にもしくは完全に切断されているか、または小領域が損傷をうけて外科的に除去されている、神経切断(神経断裂)を表してもよく、神経上膜接合(神経縫合術)は、損傷をうけた神経を修復する第一の方法である。例えば、本発明の組成物および方法は、基底層、神経周膜または神経上膜のような損傷をうけた神経の神経鞘の少なくとも1つの連続性における崩壊を含む、神経損傷の修復を促進するために用いられうる。好ましくは、外科的修復は、神経要素を再配列することを試みる。
【００３０】
特定の態様において、神経への損傷は、軸索切断があるが、鞘の連続性が無傷のままであるかもしくはいくらか傷つけられている、神経挫滅損傷(軸索断裂症)またはより極度の損傷を表す。軸索断裂症の場合、軸索は、典型的には、外科的介入なしに再生する。
【００３１】
いくつかの場合において、神経のセグメントは、病気にかかっているか、回復不可能に損傷をうけているかまたは喪失しており、そして外科的に除去される。修復は、ギャップを橋渡しするための移植片または人工器官の移植を含みうる。インプラントは、天然の導管(例えば、神経または血管移植片)、天然の派生的導管(例えば、生体高分子チューブ)または合成導管(シリコーンチューブ)でありうる。これらは、切断神経末端に接続される。特定の態様において、CSPG分解酵素は、接続部位の片方または両方の末端に適用される。例えば、CSPG分解酵素は、間置の移植片上の宿主-移植片界面の1箇所または両方の箇所へ適用されうる。CSPG分解酵素は、損傷をうけた神経組織の外科的修復もしくはレシピエント内の移植片の移植の前、間、または後に適用されうる。
【００３２】
神経移植片への CSPG 分解酵素の適用
一つの態様において、CSPG分解酵素は、神経移植片に適用される。CSPG分解酵素が神経移植片に適用される場合、移植片全体が処理されうる。CSPG分解酵素は、神経移植片全体に、一括して適用されうる。この適用は、前処理または移植前のインキュベーションであり、適用される酵素を除去するための手順を含むか、または含まない場合がある。一括処理は、生きた(新鮮な)または前に凍結された神経移植片に適用されうる。一括処理は、宿主神経との接合部位でのCSPG分解酵素の追加の適用を排除せず、それと共に用いられうる。
【００３３】
本発明の方法に従って、CSPG分解酵素は、神経移植片もしくは損傷をうけた神経組織、または両方に適用されうる。CSPG分解酵素は、移植の前、間または後に、神経移植片へ適用されうる。CSPG分解酵素は、損傷をうけた神経の断端へ連結されうる末端のような移植片のいずれの部分にも適用されうる。CSPG分解酵素が損傷をうけた神経に適用される場合には、損傷部位においてまたは損傷部位に付近などの、損傷をうけた神経の修復を促進する損傷をうけた神経のいずれの領域へも適用されうる。CSPG分解酵素は、神経移植片への適用として、培地中に配置される。培地は、未知組成培地、既知組成培地、または例えば血清を追加した既知組成培地でありうる。本発明はまた、移植前の神経移植片の貯蔵のための貯蔵溶液を含む。貯蔵溶液は、上で示されているような培地、および少なくとも1つのCSPG分解酵素を含む。貯蔵溶液はまた、フィブリン糊のような組織接着剤を含みうる。貯蔵溶液はまた、上で列挙されている成長因子のような他の生物活性のある薬剤を含みうる。
【００３４】
本明細書に用いられる場合、用語「移植片」は、ヒトまたは動物内の移植のために意図された任意の組織を指す。自己移植片、合成移植片、同種移植片および異種移植片のような移植片の様々な型は、本発明内に含まれる。移植片のサイズ(例えば、長さおよび直径)は、本発明にとって重要ではない。例えば、神経移植片の長さは、約1センチメートルから約10センチメートル、または約10センチメートルを超えうる。神経移植片の直径は、任意の損傷をうけた神経または必要とされる神経の部分の直径に適合しうる。神経移植片は、レシピエントの神経の長さに沿ってギャップを橋渡しするための、または遠位端を置換するため、すなわち、末端から末端への移植のための、構造的に完全な神経のセグメントでありうる。または、神経移植片は、一部分の神経セグメント、または偏心形(例えば、神経組織弁（nerve flap）)であり、いくらかの構造的崩壊があるが、物理学的連続性を保持している裂けた神経を再構築することを意図されうる。
【００３５】
選択的には、CSPG分解酵素は、生物学的糊のような組織接着剤と共に、損傷をうけた神経または神経移植片に適用されうる。好ましくは、生物学的糊は、フィビリン糊、フィブリンシーラント、または血小板ゲルのようなフィブリン含有接着剤である。生物学的糊は、外科的技術分野においてよく知られている(Suri Aら、[2002] Neurol. India 50:23-26; Alibai Eら、[1999] Irn J. Med. Sci. 24(3&4):92-97; Sames Mら、[1997] Physiol. Res. 46(4):303-306; Jackson Mら、[1996] Blood Coag. Fibrinolysis 7:737-746; Fasol Rら、[1994] J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 107:1432-1439)。本明細書に用いられる場合、用語「フィブリン糊」、「フィブリンシーラント」および「フィブリン組織接着剤」は、適用部位でフィブリン凝塊の形成を導く、フィブリノーゲンおよびトロンビンを含む製剤の群を指すのに交換可能に用いられる。組織接着剤は、CSPG分解酵素と同時にまたは連続的に適用されうる。組織接着剤は、CSPG分解酵素と同じ製剤内で、または別々の製剤において、損傷をうけた神経および/または神経移植片に適用されうる。好ましくは、接着剤は、残っている神経構造から軸索の伸長を引き寄せると考えられるラミニンのような物質を含まないか、または適用された酵素の活性と競合するか、もしくは活性を阻害すると考えられる、適用された酵素の基質もしくは阻害剤を含まないようにする。
【００３６】
本発明に用いられるCSPG分解酵素は、様々な手段により、かつ様々な製剤において、神経移植片または損傷をうけた神経組織に適用されうる。本明細書に用いられる場合、用語「適用される」、「投与される」、「接触させる」、および「処理される」は、交換可能に用いられる。例えば、CSPG分解酵素は、神経移植片または損傷をうけた神経組織に局所的に適用されうる(例えば、滴下様式)か、または注射により投与されうる。局所的適用または注射による局所投与は、より大きな制御のためには好ましい。さらに、CSPG分解酵素またはそのような酵素を含む組成物は、好ましくは、液状、流動可能な製剤として適用される。CSPG分解酵素はまた、多孔性物質上に吸着されうるか、または例えば、軟膏(ointment, salve)、ゲル、クリームまたは泡へ製剤化されうる。
【００３７】
本発明はまた、損傷をうけた神経組織の修復を促進するためのキットを含む。本発明のキットは、少なくとも1つのCSPG分解酵素を含む第一の区画および本明細書に記載されるような組織接着剤を含む第二の区画を含む。選択的に、キットは、CSPG分解酵素と組織接着剤を混合するための第三の区画を含みうる。キットは、損傷をうけた神経組織の修復のために、直接的に、または神経移植片により間接的に用いられうる。キットは、プラスチック、ガラスおよび/または紙製品のような、当技術分野において公知の様々な材料の包装を含みうる。
【００３８】
薬学的組成物
1つまたは複数のCSPG分解酵素は、患者、例えば、ヒトまたは動物への投与に適した薬学的組成物へ組み込まれうる。そのような組成物は、典型的には、少なくとも1つのCSPG分解酵素および薬学的に許容される担体を含む。本明細書に用いられる場合、用語「薬学的に許容される担体」とは、薬学的投与と適合性のある、あらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張性吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性のある物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野においてよく知られている。補足活性化合物もまた、組成物へ組み込まれうる。好ましくは、薬学的組成物は、少なくとも1つのCSPG分解酵素、およびフィブリン糊のような組織接着剤を含む。
【００３９】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化されうる。製剤は、当業者によく知られ、容易に入手可能な多数の情報源に記載されている。例えば、Remington's Pharmaceutical Science(Martin EW [1995] Easton Pennsylavania, Mack Publishing Company, 第19版)は、本発明に関連して用いられうる製剤を記載している。非経口投与に適した製剤は、例えば、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を意図したレシピエントの血液と等張性にする溶質を含みうる、水性滅菌注射溶液；ならびに沈殿防止剤および濃化剤を含みうる水性および非水性滅菌懸濁液を含む。製剤は、単位投与量または複数投与量の容器、例えば、封をしたアンプル、バイアル、およびガラスまたはプラスチック製の使い捨て注射器で提供されてよく、使用の前に滅菌液状担体、例えば注射用水の条件のみを必要とする、凍結乾燥(lyophilized)状態で保存されうる。即時注射溶液および懸濁液は、滅菌した粉末、顆粒、錠剤などから調製されうる。特に上で言及されている成分に加えて、本発明の製剤は、問題の製剤の型を考慮する、当技術分野において通常の他の薬剤を含むことができることは、理解されるべきである。薬学的組成物は、容器、パッケージまたはディスペンサー中に、投与に関する使用説明書と共に含まれうる。
【００４０】
CSPG分解酵素は、投与の様式に対して適切な担体、例えば、食塩水または水性緩衝液中に製剤化されうる。CSPG分解酵素はまた、徐放性製剤内にまたは付随して、含まれうる。そのような物質は、限定されるものではないが、リポソーム、リポスフィアまたは小胞のような生分解性マトリックスおよび粒子を含む。徐放性製剤は、生分解性重合体のマトリクスでありうる。CSPG分解酵素はまた、ゲルもしくはフィルムとして適用されるか、または合成の移植片もしくはインプラント内に含まれうる。
【００４１】
CSPG分解酵素は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む徐放性製剤のような、身体からの急速な排出に対してその酵素を保護する担体と共に調製されうる。好ましくは、担体は、生分解性および/または生体再吸収性（bioresorbable）である。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性、生体適合性の重合体が、徐放性製剤に利用されうる。
【００４２】
徐放性製剤は、球またはカプセルのような、本質的に微粒子(例えば、マイクロまたはナノサイズの尺度)でありうる。粒子は、外側の層または殻によりカプセル化されている、1つまたは複数のCSPG分解酵素を含むコアを有しうる。外殻は、カプセル化CSPG分解酵素により分解可能(殻が内側から分解されるように)でありうる。例えば、殻内のヒアルロナンがカプセル化CSPG分解酵素により(部分的にまたは完全に)分解される場合、CSPG分解酵素が放出されるように、殻は少なくとも部分的にヒアルロナンより構成されうる。または、(殻が外から分解されるように)外因的に適用されるか、もしくはインビボ環境内に存在するいずれかの別の分解剤により殻は分解されうる。
【００４３】
米国特許第5,320,837号は、ヒアルロニダーゼまたはコンドロイチナーゼのようなアミノ基を有する酵素を、無水マレイン酸および共重合化可能なポリアルキレングリコールエーテルの共重合体と反応させることにより得られる、徐放性調製物を記載している。反応産物は、水および/または有機溶媒に可溶性であり、加水分解において酵素をゆっくり放出することができる。
【００４４】
米国特許第4,933,185号は、酵素により特異的に分解されるイオン架橋した多糖のような重合体から形成されるコア、および速度制御する皮を有する、マイクロカプセル内にカプセル化された酵素(ヒアルロニダーゼなど)からなる生物活性物質の送達のための徐放系を記載している。皮の完全性はコアが分解される時に失われ、カプセルからの生物活性物質の急激な放出を引き起こす。その'185特許における徐放性系は、CSPG分解酵素を送達するために利用されうる。例えば、CSPG分解酵素は、生物活性物質もしくはコアの分解酵素、または両方としての役目を果たしうる。
【００４５】
徐放性製剤は、CSPG分解酵素の最初の曝露、続いて、一定の時間後に1回または複数回の遅延した曝露を提供しうる。または、徐放性製剤は、CSPG分解酵素の単一の遅延した放出を起こしうる。または、連続的放出性製剤は、CSPG分解酵素の連続的放出を可能にしうる。選択的に、CSPG分解酵素の連続的放出は、1回または複数回のパルス的放出と協同しうる。
【００４６】
インプラントのようなCSPG分解酵素の担体は、特定の適用に対して適切なサイズおよび形でありうる。このように、担体は、その担体が使用のために置かれる生きている身体の領域を十分に考えて設計された、望ましい容量および望ましい形でありうる。形の例には、円柱、半円柱または環を含むが、これらに限定されない。担体は、損傷をうけた神経または神経移植片に接触するパッド、ラップ、シート、棒または糸でありうる。好ましくは、担体は、生きている身体の周囲の組織に炎症を起こさせるか、さもなければ刺激する可能性がある、鋭利な縁または角をもたない。
【００４７】
担体から放出されるCSPG分解酵素の量および放出持続期間は、適切な範囲内に制御されうる。担体は、移植片もしくは損傷をうけた神経に、または移植片もしくは損傷をうけた神経に隣接した組織に固定されうる。担体は、例えば、24時間〜3ヶ月間のような期間にわたって、神経損傷部位においてCSPG分解酵素を連続的に放出しうる。
【００４８】
使用される特定の担体に依存して、CSPG分解酵素は、その製造中または後に、担体内に含まれるか、担体でコーティングされるか、またはさもなければ担体と付随することができる。例えば、CSPG分解酵素は、市販製品と付随しうる。
【００４９】
担体はまた、CSPG分解酵素と共に、細胞(例えば、シュワン細胞)または成長因子のような他の生物活性のある薬剤を送達するために機能しうる。担体により送達される細胞は、その患者由来、または同じ種もしくは異なる種の別の源由来でありうる。担体により送達される細胞は、生物活性のある薬剤を産生するように遺伝子改変されうる。
【００５０】
一つの態様において、担体は、神経移植片または損傷をうけた神経(例えば、損傷部位において)に密着して移植されうる、米国特許第4,602,624号、米国特許第5,487,756号および公開された米国特許出願第2002/0071828号に記載されるもののような外科用カフである。本発明のカフは、神経移植片または損傷をうけた神経組織に適用されうるスリーブを含む。スリーブは様々な形でありうる。例えば、スリーブは、損傷をうけた神経および/もしくは神経移植片を少なくとも一部分もしくは完全に取り囲むチューブ状の人工器官またはラップであってよく、神経連続性を回復させるために、カフ装着技術を用いて、直接的にまたは神経移植片を通して間接的にのいずれかで、損傷をうけた神経の末端を連結する意図された使用に適合性のあるいずれの装置も含みうる。カフがチューブ状の形である場合には、選択的に、カフは、神経移植片または損傷をうけた神経への適用のゆとりのための、第一および第二の縁を接触している縦方向のスリットを含みうる。例えば、縦方向のスリットの第一および第二の接触縁は、お互いに分離可能な接触状態であることができ、スリットの接触縁の分離を可能にし、チューブ状のスリーブの管腔を露出する。その後、損傷をうけた神経および/または神経移植片を、管腔へ挿入することができ、縦方向のスリットの接触縁が、損傷をうけた神経および/または神経移植片をいっしょに保持しながら互いに分離可能な接触状態に戻って、CSPG分解酵素への曝露に利用できるようにさせる。
【００５１】
選択的に、外科用カフは、通常の縫合技術または神経系に適用されうる生物学的糊のような組織接着剤、または他の手段を用いて神経に固定されうる。好ましくは、生物学的糊は、BIOCOLLE(BIOTRANSFUSION)、CRTS(Lille)、ISSUCOL(IMMUNO AG, Vienna Austria)などのようなフィブリンを含む糊である。カフは、剛性支持体、または、例えば自動巻き込みシートでありうる。自動巻き込みシートは、それぞれの組織に接触した場合、その損傷をうけた神経および/または神経移植片を自動的に取り囲むことができる。カフは、透過性、不透過性または半透過性でありうる。選択的に、カフは、米国特許第5,487,756号に記載されているもののような、神経移植片もしくは損傷をうけた神経を電気的に刺激するための手段、および/または神経移植片もしくは損傷をうけた神経内の神経電気的活性を記録するための手段を含みうる。好ましくは、CSPG分解酵素は、カフの内部表面から放出されるか、さもなければ作動する、すなわち、その表面が神経移植片または損傷をうけた神経に面している。
【００５２】
外科用カフは、貯蔵所のような送達系、または公開された米国特許出願第2002/0071828号に記載されているアデノウイルス構築物のような発現系により、CSPG分解酵素を神経移植片または損傷をうけた神経へ供給できる。コンドロイチンリアーゼ酵素についての発現系は、当技術分野において知られており、そのいくつかは、米国特許第6,054,569号；米国特許第6,093,563号；公開された米国特許出願第2001/0034043号；およびTralec, A.L. [2000] Appl. Environ. Microbiol. 66:29-35に記載されている。
【００５３】
外科用カフは、シリコーン、PAN/PVC、PVFD、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)繊維またはアクリル共重合体のような様々な合成素材から構成されうる。本発明の特定の態様において、特に架橋コラーゲン、骨粉、糖質基盤重合体、ポリグリコール酸/ポリ乳酸誘導体、ヒアルロン酸エステル、もしくは白亜基盤支持体のような生体適合物質からなるまたは基づくカフの使用が好ましい。好ましくは、コラーゲンまたはシリコーンが本発明の枠組み内に使用される。それは、例えば、ヒト、ウシまたはマウス起源のコラーゲンでありうる。より好ましくは、I型もしくはIII型もしくはIV型、有利にはIV/IVOX型コラーゲン、またはシリコーンの、二層からなるカフが使用される。特定の例として、シリコーンからなるSILASTICカフ(DOW-CORNING)によって言及される場合がある。さらに、カフは、有利には、円柱形または角のある切断面のチューブ型でありうる。カフの直径は、所望の適用に従って当業者により調整されうる。特に、末梢神経の再生を刺激するためには、比較的小さい直径、0.05 mmから15 mmまでが使用されうる。より好ましくは、カフの内径は、0.5 mmと10 mmの間である。脊髄再生適用については、より大きい内径をもつカフが選択されうる。特に、これらの適用について、使用されるカフは、直接的に関連する神経切断面に依存して、15 mm〜20 mmくらいの高さでありうる内径を有する。腕神経叢のレベルで裂離された根を橋渡しするためには、カフの直径は、有利には、根の直径に一致する。カフの長さは、一般的に、補償される物質の損失のサイズにより決定される。0.5 cmと5 cmとの間の長さをもつカフが使用されうる。好ましくは、カフの長さは、5 cmより大きい物質の損失はほとんど起こらないので、5 cm未満にとどまる。
【００５４】
CSPG分解酵素は、様々な濃度で神経移植片または損傷をうけた神経組織に適用されうるが、好ましくは、濃縮された形で適用される。理想的な濃度は、神経サイズおよび酵素によって変わると考えられる。例えば、コンドロイチナーゼは、約10ユニット/mLから約1000ユニット/mLまでの範囲の濃度で適用されうる。好ましくは、コンドロイチナーゼは、約100ユニット/mLから約500ユニット/mLまでの濃度範囲で神経移植片または損傷をうけた神経組織に適用される。MMPは、約0.1 μg/mLから約100 μg/mLまでの範囲の濃度で適用されうる。好ましくは、MMPは、約10 μg/mLから約50 μg/mLまでの範囲の濃度で適用される。
【００５５】
上記で示されているように、本発明の方法に従って、CSPG分解酵素は、成長因子のような生物活性分子と共に、神経移植片または損傷をうけた神経組織に投与されうる。CSPG分解酵素と共に投与されうる他の生物活性のある薬剤は、遺伝子改変細胞または非遺伝子改変細胞を含む。したがって、本発明の組成物は、そのような細胞を含みうる。細胞は、非幹細胞(成熟および/もしくは分化した細胞、またはそれらの前駆細胞もしくは始原細胞、または幹細胞でありうる。このように、投与される細胞は、柔軟に、全能性もしくは多能性の幹細胞(例えば、成体または胚性の)、前駆細胞もしくは始原細胞から、中枢もしくは末梢神経系のもの(例えば、シュワン細胞)のような高度に分化したまたは成熟した細胞までの範囲にわたりうる。
【００５６】
幹細胞は、例えば、胎児組織、成体組織、臍帯血、末梢血、骨髄および脳を含む様々な源から得られる。幹細胞および非幹細胞(例えば、分化した細胞または成熟した細胞、および前駆細胞または始原細胞)は、分化されかつ/または遺伝子改変されうる。幹細胞を同定するため、および分化した細胞型を特徴付けるために一般に使用される方法およびマーカーは、科学文献(例えば、2001年6月、国立衛生研究所により作成された報告書、Stem Cells: Scientific Progress and Future Research Directions, Appendix E1-E5)に記載されている。幹細胞を含むことが報告されている成体組織のリストは増加しており、骨髄、末梢血、脳、脊髄、歯髄、血管、骨格筋、皮膚および消化器系の上皮、角膜、網膜、肝臓、ならびに膵臓を含む。
【００５７】
本発明の方法に従って、組換え細胞のような遺伝子改変の宿主が神経移植片または損傷をうけた神経組織に投与されうる。宿主は、1つまたは複数のCSPG分解酵素を産生するように遺伝子改変されうる。好ましくは、CSPG分解酵素は、組換え細胞から分泌される。例えば、コンドロイチンリアーゼ酵素についての発現系は当技術分野において知られており、それらのいくつかは、米国特許第6,054,569号；米国特許第6,093,563号；公開された米国特許出願第2001/0034043号；およびTralec, A.L. [2000] Appl. Environ. Microbiol. 66:29-35に記載されている。選択的に、組換え宿主は、CSPG分解酵素に加えて、他の生物活性のある薬剤を組換えによって産生するように遺伝子改変される。
【００５８】
1つまたは複数のCSPG分解酵素をコードする核酸分子は、ベクターへ挿入され、遺伝子治療ベクターとして用いられうる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与、または定位注入により患者へ送達されうる。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含みうるか、または遺伝子送達媒体が埋め込まれているか、さもなければ結合されている、徐放性担体を含みうる。さらに、薬学的調製物は、CSPG分解酵素を組換えによって産生する治療的有効量の細胞を含みうる。
【００５９】
宿主細胞の遺伝子改変に用いられる様々な方法は、当技術分野においてよく知られており、例えば、Sambrookら、(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、1-3巻、Cold Spring Harbor Laboratory, New YorkおよびGloves, D.M. (1985) DNA Cloning、I巻: A Practical Approach, IRL Press, Oxfordに記載されている。したがってDNAをその源から抽出すること、制限酵素消化を行うこと、DNA断片を電気泳動すること、プラスミドと挿入DNAをつなぐ(tail)およびアニーリングすること、DNAをライゲーションすること、細胞、例えば原核細胞および真核細胞を形質転換すること、プラスミドDNAを調製すること、タンパク質を電気泳動すること、ならびにDNAをシーケンシングすることは、遺伝子工学分野における当業者の技術範囲内である。
【００６０】
免疫原性を低減させるために、本発明に用いられる神経移植片は、当業者に公知の様々な方法により無細胞性にさせられうる。例えば、神経組織は、材料および方法の項に記載されているように、凍結死滅により、または界面活性剤での化学的抽出により(Sondell Mら、[1998] Brain Res 795:44-54)により無細胞性にされうる。神経移植片は、1つもしくは複数のCSPG分解酵素の適用の前、間または後に、無細胞性にされうる。
【００６１】
インビトロの神経培養
本発明はまた、ヒトまたは動物への移植のための神経組織を培養する方法に関する。本発明の培養方法は、移植後、再生中の軸索の移植片と宿主神経組織間の界面を横断する能力を向上させる、インビトロで神経組織を「あらかじめ変性させる段階」を含む。理論に結び付けられてはいないが、本発明の培養方法は、生きている神経細胞が、CSPG分解酵素を発現し、かつ神経変性の再構築過程の間、インビボで自然に起こると考えられる、シュワン細胞の増殖を促進することを可能にする。
【００６２】
インビトロ培養の方法は、神経組織をインビトロで増殖するのを可能にし、かつその後移植片として移植された場合に、神経組織の神経突起促進活性を増加させる条件下で、神経組織を培養する段階を含む。神経突起促進活性の増加は、本明細書に記載されている凍結切片培養バイオアッセイ法のような、神経組織のインビトロ神経突起伸長アッセイ法により測定されるものでありうる。
【００６３】
または、神経組織のインビボ神経突起伸長アッセイ法もまた使用されうると思われる。神経突起伸長をアッセイするための方法は、当技術分野において公知であり、典型的には、マイクロプレートまたは顕微鏡スライドのような固体支持体上で神経突起伸長の程度を定性的にまたは定量的に測定する段階を含む。標準的な蛍光が使用されうる。
【００６４】
本発明の方法は、ヒトまたは動物から神経組織を単離すること、および約24時間から約96時間までの範囲の短時間、インビトロで神経組織を培養する段階を含みうる。インビトロでのより長いインキュベーションは、結果として、成長促進性質の悪化および損失を生じうる。好ましくは、神経組織は、約24時間から約72時間まで培養される。より好ましくは、神経組織は、約48時間、培養される。
【００６５】
神経組織は、約10℃〜約37℃の範囲内の温度で培養されうる。好ましくは、神経組織は、約30℃〜約37℃の範囲内で培養される。より好ましくは、神経組織は、約37℃で培養される。
【００６６】
神経組織は、既知組成培地または血清を追加した培地で培養されうる。既知組成培地は、例えば、N2培地またはダルベッコの改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM)でありうる。血清を追加した培地が使用される場合には、血清は、ヒト血清またはウシ胎児血清のような動物血清でありうる。好ましくは、神経組織は、既知組成培地で培養される。一つの態様において、神経組織は、培養後かつ宿主内への移植の前に、無細胞性にされる神経移植片である。好ましい態様において、神経移植片は、凍結死滅により無細胞性にされる。外因性酵素は本発明の培養方法を実行するために必要ではないが、1つまたは複数のCSPG分解酵素に神経組織を接触させる段階を方法はさらに含みうる。
【００６７】
本発明はさらに、ヒトまたは動物への移植のための神経移植片を提供する方法に関係する。好ましくは、神経移植片の横断面の特徴は、移植部位での宿主神経組織、例えば、宿主の近位および遠位の神経断端の横断面の特徴と類似している。一つの態様において、本発明の方法は、潜在的な宿主(すなわち、移植片レシピエント)内の神経断端横断面のデジタル画像データを生成する段階、画像データを解析して、レシピエント鋳型を作製するための神経要素の座標位置およびそれらの直径を定義する段階、ならびにレシピエント鋳型データを記憶装置に蓄積されうるドナー鋳型データと比較する段階を含む。ドナー鋳型データは、貯蔵された神経移植片の「バンク」からのデジタル画像データを意味する。その後、レシピエントの神経断端との最高度の構造要素のアライメントを有する貯蔵された神経移植片がレシピエント内の移植のために選択されうる。関連パラメーターは、神経上膜、繊維束群、束、ミエリン鞘、および軸索を含むが、これらに限定されない1つまたは複数の構造要素の直径、厚さ、ならびに/または空間的配置(すなわち、境界線)を含む。それゆえに、神経移植片と宿主神経間のアライメントは、最大化されうる。好ましくは、選択された移植片は、繊維束群および軸索の類似した横断面アライメントを有するものである。
【００６８】
米国特許第5,231,580号は、神経の特徴を測定するための様々な方法を記載している。デジタル画像データの生成は、デジタルカメラのような当技術分野において周知の方法および装置を用いて達成されうる。画像データの解析およびレシピエント鋳型データを蓄積されたドナー鋳型データと比較することは、例えば、画像スキャニング、解析、およびパターン認識の能力を持つアルゴリズムを通して達成されうる。神経移植片とレシピエント神経間の最も近い整合を選択するために、類似度の閾値が設定されうる。
【００６９】
本発明の方法および組成物は、中枢神経系(CNS)および末梢神経系(PNS)の両方の神経組織に適用可能である。例えば、本発明の神経移植片は、PNSにおける間置神経移植片として、または脳および脊髄ならびにそれらの任意の伸展部におけるブリッジとして使用されうる。
【００７０】
本発明に用いられるCSPG分解酵素は、天然にその酵素を産生する生物体、または(組換え酵素を産生する)遺伝子改変によりその酵素を産生する(もしくは過剰産生する)生物体を含む、様々な源から得られる。例えば、CSPG分解酵素は、天然でその酵素を産生するもの、またはその酵素を産生する(もしくは過剰産生する)ように遺伝子改変されたものを含む、細菌源から得られる。CSPG分解酵素はまた、天然でその酵素を産生する哺乳動物、またはその酵素を産生する(もしくは過剰産生する)ように遺伝子改変された哺乳動物を含む、哺乳類の源から得られる。または、CSPG分解酵素は、化学的に合成されうる。
【００７１】
本明細書に用いられる場合、「近位の」部分とは、ニューロン細胞体との連続性の中に残存している軸索の部分、またはこれらの軸索を含む神経の部分を意味するものとする。「遠位の」部分とは、ニューロン細胞体から接続を断たれた状態になっている軸索の部分、またはこれらの接続を断たれた軸索を含む神経の部分を意味するものとする。
【００７２】
末梢神経損傷の場合、その近位部分は、神経節または脊髄と接続されている部分である。末梢神経の遠位部分は、運動終板(神経筋接合部)または感覚器官と接続されている神経の最も末梢の部分を意味するものとする。脊髄損傷の場合、近位部分は、核またはより前方と接触している部分である。遠位部分は、終末シナプスへ伸長している部分を意味するものとする。
【００７３】
本明細書に用いられる場合、用語「治療すること」または「治療」とは、患者がうけている特定の神経損傷に付随した少なくとも1つの有害作用または症状の低減または緩和を指す。
【００７４】
本明細書に用いられる場合、用語「幹細胞」とは、複製または自己再生、および様々な細胞型の分化した細胞へと発生することができる未分化の細胞である。分割を起こした幹細胞の生成物は、源を発する細胞と同じ能力を有する少なくとも1個の追加の幹細胞である。例えば、適切な条件下で、造血幹細胞は、第二世代幹細胞およびニューロンを生成しうる。幹細胞は、胚性幹細胞(例えば、胚盤胞の内部細胞塊から生じる幹細胞)および成体幹細胞(ヒトを含むより成熟した動物中のいたるところに見出されうる)を含む。本明細書に用いられる場合、幹細胞は、胚性期を越えて成熟した動物(例えば、胎児、幼児、青年、少年、成人など)に見出される幹細胞を含むことが意図される。
【００７５】
本明細書に用いられる場合、用語「始原細胞(progenitor cell)」(「前駆細胞(precursor cell)」としても知られている)とは、未分化であるか、または細胞分割を起こし、2個の分化した細胞を生じる能力がある、分化した細胞の部分的特徴を有する。例えば、脊髄の始原/前駆細胞は、細胞分割を起こして、2個の分化した細胞(好中球および赤血球)を生じることができる。
【００７６】
本明細書に用いられる場合、用語「共投与」およびそれの語尾変化形は、2つもしくはそれ以上の薬剤の同時的(1つもしくは複数の調製物において)、または連続的な投与を指す。
【００７７】
本明細書に用いられる場合、用語「組み合わせ」とは、下位組み合わせを含む。例えば、CSPG分解酵素のコンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、コンドロイチナーゼAC、ヒアルロニダーゼ、MMP-2、およびMMP-9の組み合わせは、例えば、コンドロイチナーゼABCとMMP-2の下位組み合わせを含む。
【００７８】
本明細書に用いられる場合、用語「生物活性」または「生物活性のある」とは、特定の薬剤、分子、化合物などに付随した活性を指すものとする。例えば、CSPG分解コンドロイチナーゼにより示される生物活性は、CSPGの分解である。好ましくは、CSPG分解活性は、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、もしくはコンドロイチン-4-硫酸とコンドロイチン-6-硫酸の両方の切断または溶解を含む。それゆえ、特定のCSPG分解酵素の生物活性のある断片および変異体は、同様にCSPG分解活性を示す。同様に、線維芽細胞増殖因子-1のような成長因子の生物活性のある断片は、その成長因子に通常付随している生物活性を示す。
【００７９】
本明細書に用いられる場合の用語「遺伝子改変」とは、結果として永久的または一時的な遺伝子型の変化を生じる、当技術分野において公知の任意の手段による外因性核酸の意図的な導入による、本発明の細胞の遺伝子型の安定的または一過性の変化を指す。核酸は、合成、または天然由来であってよく、遺伝子、遺伝子の一部、または他の有用なポリヌクレオチドを含みうる。用語「遺伝子改変」は、天然のウイルス活性、自然の遺伝子組換え、またはその種の他のものにより生じるもののような自然発生の変化を含まないものとする。
【００８０】
様々なベクターが、本発明に従って遺伝子改変を行うために使用されうる。ベクターは、ワクチン、複製または増幅ベクターでありうる。本発明のこの局面のいくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチド配列の発現を引き起こすことができる制御エレメントと機能可能に結合される。そのようなベクターは、特に、染色体ベクター、エピソームベクターおよびウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、バキュロウイルス、SV40のようなパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス由来のベクター、ならびにプラスミドとバクテリオファージの遺伝的エレメント由来のもの(例えば、コスミドおよびファージミド)のような前記のベクター源の組み合わせに由来するベクターを含む。
【００８１】
上で示されているように、遺伝子改変を行うために使用されるベクターはまた、与えられた宿主細胞において本発明のヌクレオチド配列によりコードされる、CSPG分解酵素またはそれの生物活性のある断片もしくは変異体のような、ポリペプチドの発現および/または分泌を提供するために必要なエレメントを含みうる。ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのシグナル、翻訳終結のためのシグナル、および転写制御のための適切な領域からなる群より選択される1つまたは複数のエレメントを含みうる。ある特定の態様において、ベクターは、宿主細胞において安定的に維持されることができ、選択的に、翻訳されたタンパク質の分泌を方向づけるシグナル配列を含みうる。他の態様では、形質転換された宿主細胞において安定的ではないベクターを提供する。ベクターは、宿主ゲノムへと統合されうるか、または自己複製ベクターでありうる。
【００８２】
特定の態様において、ベクターは、タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結されたプロモーター、1つまたは複数の複製起点、および、選択的に、1つまたは複数の選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)を含む。本発明のポリペプチドの発現のための非限定の例示的なベクターは、pBr型ベクター、pET型プラスミドベクター(PROMEGA)、pBADプラスミドベクター(INVITROGEN)または下の例に提供されているものを含む。さらに、本発明によるベクターは、本発明のヌクレオチド配列のクローニングまたは発現のために、宿主細胞を形質転換するのに有用である。
【００８３】
発現を制御するために使用されうるプロモーターは、以下のものを含むが、これらに限定されない；CMVプロモーター、SV40初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon [1981] Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamotoら、[1980] Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら、[1981] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の制御配列(Brinsterら、[1982] Nature 296:39-42)；原核生物ベクターは、β-ラクタマーゼプロモーター(Villa-Kamaroffら、[1978] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731)、またはtacプロモーター(DeBoerら、[1983] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25)のようなプロモーターを含む；Scientific American, 1980, 242:74-94の「Useful Proteins from Recombinant Bacteria」も参照；植物発現ベクターは、ノパリン合成酵素プロモーター領域(Herrera-Estrellaら、[1983] Nature 303:209-213)またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Gardnerら、[1981] Nucl. Acids Res. 9:2871)、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrellaら、[1984] Nature 310:115-120)を含む；Gal 4プロモーター、ADC(アルコール脱水素酵素)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、および/またはアルカリホスファターゼプロモーターのような酵母または真菌由来のプロモーターエレメント。
【００８４】
本発明はまた、「相同的な」または「改変された」ヌクレオチド配列の使用について提供する。改変された核酸配列は、当業者に周知の技術による突然変異誘発により得られ、かつ通常の配列に関して改変を示す、任意のヌクレオチド配列を意味するように理解されると考えられる。例えば、結果として、本発明によるポリペプチドの発現レベルの改変を生じる、ポリペプチドの発現のための制御配列および/またはプロモーター配列における変異が、「改変されたヌクレオチド配列」を規定する。同様に、本発明のポリヌクレオチドへの核酸の置換、欠失、または付加が、「相同的な」または「改変された」ヌクレオチド配列を規定する。様々な態様において、「相同的な」または「改変された」核酸配列は、実質的に、本来の(天然に存在する)CSPG分解酵素と同じ生物学的または血清学的活性を有する。「相同的」または「改変された」ヌクレオチド配列はまた、本発明のポリヌクレオチドのスプライス変種または下で定義されているような「改変されたポリペプチド」をコードする任意のヌクレオチド配列を意味するように理解されると考えられる。
【００８５】
本発明の目的のためには、相同的なヌクレオチド配列は、少なくとも(または少なくとも約)20.00 %から99.99 %(両数値を含む)の間のヌクレオチド配列の塩基についての同一性率を有するヌクレオチド配列を含む。前記パーセント同一性の範囲は、書かれた記述を含めて提供するものと解釈され、かつ20.00 %と99.99 %との間の、0.01 %の間隔でのいずれの端数の割合も支持するものとする。これらの割合は、純粋に統計学上のものであり、2つの核酸配列間の相違は、ランダムに、かつ全配列長に渡って分配されうる。
【００８６】
様々な態様において、本発明において使用されるヌクレオチド配列の塩基についての同一性率を示す相同的な配列は、CSPG分解酵素をコードするポリヌクレオチド配列と20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99パーセント同一性を有しうる。
【００８７】
タンパク質および核酸の配列相同性の両方とも、当技術分野において公知の様々な配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれかを用いて評価されうる。そのようなアルゴリズムおよびプログラムは、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTAおよびCLUSTALW(PearsonおよびLipman [1988] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-24448; Altschulら、[1990] J. Mol. Biol. 215(3):403-410; Thompsonら、[1994] Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680; Higginsら、[1996] Methods Enzymol. 266:383-402; Altschulら、[1990] J. Mol. Biol. 215(3):403-410; Altschulら、[1993] Nature Genetics 3:266-272)を含むが、これらに決して限定されるものではない。
【００８８】
本発明の方法に従って患者に投与される細胞または組織は、例えばヒト、または非ヒト霊長類、齧歯類およびブタを含む、他の哺乳動物由来でありうる。源の種の特定の例は、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、類人猿(ape)、チンパンジー、オラウータン、サル(monkey))；イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ベトナムのだるまブタ（pot-bellied pig）、ウサギ、およびフェレットのような家畜動物(ペット)；ウシ、水牛、野牛、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジおよびヤギのような家畜農場動物；クマ、ライオン、トラ、パンサー、ゾウ、カバ、サイ、キリン、レイヨウ、ナマケモノ、ガゼル、シマウマ、ウイルドビースト、プレーリードッグ、コアラ、カンガルー、フクロネズミ、アライグマ、パンダ、ジャイアントパンダ、ハイエナ、アザラシ、アシカ、ゾウアザラシ、ネズミイルカ、マイルカおよびクジラのような典型的には動物園で見られる外来の動物を含むが、これらに限定されない。
【００８９】
同様に、開示された治療の方法から恩恵を得る哺乳動物種は、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、類人猿、チンパンジー、オラウータン、サル)；イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ベトナムのだるまブタ、ウサギおよびフェレットのような家畜動物(例えば、ペット)；ウシ、水牛、野牛、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジおよびヤギのような家畜農場動物；クマ、ライオン、トラ、パンサー、ゾウ、カバ、サイ、キリン、レイヨウ、ナマケモノ、ガゼル、シマウマ、ウイルドビースト、プレーリードッグ、コアラ、カンガルー、フクロネズミ、アライグマ、パンダ、ハイエナ、アザラシ、アシカ、ゾウアザラシ、カワウソ、ネズミイルカ、マイルカおよびクジラのような典型的には動物園で見られる外国産の動物を含む。
【００９０】
米国特許出願第＿＿＿号、(UF-336XC1)「Materials and Methods for Nerve Repair」；米国特許出願第＿＿＿号、(UF-336XC2)「Materials and Methods for Nerve Grafting」および米国特許出願第＿＿＿号、(UF-336XC3)「Materials and Methods for Nerve Grafting」が同時出願されているが、本明細書に参照または引用されるすべての特許、特許出願、仮特許出願および刊行物は、あらゆる図、表、図面、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を含め、それらが本明細書の明確な教示と矛盾しない限り、完全に参照として組み入れられている。
【００９１】
材料および方法
神経切断および神経挫滅実験のための外科的手順
すべての外科的手順は、所内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)認可のプロトコールに従って行われた。若年成体SPRAGUE DAWLEYラット(HARLAN Indianapolis, IN)をキシラジン(15 mg/kg、筋肉内)、続いてケタミン-HCl(110 mg/kg、腹腔内)で深く麻酔をかけた。6匹の動物は、左右相称の神経挫滅損傷をうけた。坐骨神経を露出させ、その後、内閉鎖筋の腱に対して4 mm遠位の部位にDUMONT 5番鉗子での30秒間の常時圧力で挫滅させた。挫滅部位は、神経上膜縫合糸で印をつけられた。実験の別の組において、8匹のラットが、鋸歯型鋏を用いる左右相称の坐骨神経切断損傷をうけた。近位および遠位の断端は、9-0 ETHILON縫糸を用いる神経上膜の神経縫合術によりかぶせられた。その後、フィブリン糊(フィブリノーゲンおよびトロンビン)が結合を安定化させるために適用された。両方の損傷モデルにおいて、右の坐骨神経は、コンドロイチナーゼABC(2 μl中1 U)(高純度、プロテアーゼを含まない；SIGMA CHEMICAL CO., St. Louis, MS)を損傷に対して2-mm遠位に注射された。左の坐骨神経(右側と同じ損傷をもつ)は、溶媒のみ(0.1 %ウシ血清アルブミンを含むPBS)を注射された。筋肉切り口は縫合され、皮膚は金属クリップで閉じられた。麻酔から回復後、動物は、標準的住居へ戻された。手術後2日目(挫滅損傷について)および4日目(切断損傷について)、神経を麻酔下で取り出し、下記のように固定した。神経切断および修復をうけた8匹の動物のうちの1匹は、回復期の間に、一方の神経における連続性の喪失が生じたため、除外された。
【００９２】
コンドロイチナーゼで処理された無細胞性神経移植片の調製
成体(180 g〜200 g)雌SPRAGUE DAWLEYラット(HARLAN, Indianapolis, IN)が、神経ドナーおよびレシピエント宿主として用いられた。ドナーのラットはハロタンで麻酔され、断頭された。坐骨神経を臀部筋肉開裂切開により露出し、下にある筋膜から離して単離した。吻側から総腓骨神経および脛骨神経への分岐点まで、15-mm 神経セグメントを切除した。セグメントを冷たい滅菌リンガー溶液ですすぎ、薄いプラスチック支持体へ末端をピンで留めることにより安定化させ、そして低温貯蔵のバイアルへ移した。バイアルを2分間液体窒素中に沈め、その後、2分間37℃水浴へ移した。この凍結/解凍サイクルを繰り返し、無細胞性神経移植片を生じ、その後、液体窒素中に保存された。移植の1日前に、神経移植片を室温まで温め、2ユニット/ml コンドロイチナーゼABC(SIGMA, St. Louis, MO)を含む100 μl リン酸緩衝食塩水pH 7.4(PBS)中、またはPBS(溶媒)のみの中で、37℃、16時間、インキュベートした。移植片を使用の前に、リンガー溶液で2回すすぎ、氷上に置いておいた。コンドロイチナーゼABC調製物は、高度に精製されており、本質的にプロテアーゼ活性を含まないと製造会社により述べられていた。
【００９３】
コンドロイチナーゼ実験のための間置神経移植
12匹のラットが、左右相称の無細胞性神経移植片、一方はコンドロイチナーゼ処理された移植片および一方は溶媒処理された移植片を受けた。宿主ラットにキシラジン(15 mg/kg、筋肉内)およびケタミン(110 mg/kg、腹腔内)を用いて深く麻酔をかけた。坐骨神経は露出され、神経と下にある組織の間に置かれたプラスチック挿入物により支持された。座骨の切れ込みと分岐点の間の中間点の神経領域が、最初に、フィブリン糊で塗布された。鋸歯型鋏を用いて、宿主神経の2.5-mmのセグメントが切除され、新鮮に切り取られた10-mmの無細胞性神経移植片に交換された。移植片は、各末端において、1本の9-0 ETHILON縫糸を用いる神経上膜神経縫合術により宿主神経断端に接合された。その後、フィブリン糊が接合を安定化させるために適用され、最初のフィブリン塗布と共同して、神経要素の突出(神経内膜キノコ状化)もまた低減させた(Menovsky Tら、[1999] Neurosurgery 44:224-226)。筋肉は4-0縫糸で、皮膚は創傷用クリップで閉じられた。麻酔からの回復後、動物は、標準的住居へ戻された。
【００９４】
9匹のラットは移植後8日目に、4匹は4日目に終結させた。動物を深く麻酔し、断頭した。移植片ならびに近位および遠位の宿主神経の3 mmを取り出し、4 % パラホルムアルデヒドを含む0.1 M リン酸緩衝液(pH 7.4)に一晩、4℃で浸漬した。検体をPBSで平衡化させ、30 % ショ糖/リン酸緩衝液に2日間、4℃で浸漬した。解剖顕微鏡および目印として神経上膜の縫糸を用いて、各検体をa)近位の神経-移植片界面、b)主な移植片、およびc)遠位の神経-移植片界面を表す3つのセグメントへ細分した。検体を包埋し、凍結切片にした。接合の連続性を調べるために、縦方向の切片は神経-移植片界面を通って取られた。
【００９５】
主な移植片は、顕微鏡により軸索伸長の程度を評価するために、記録された寸法で横断面についての連続切片を作製した。再生中の軸索は、0.56 mmの間隔での移植片の切片において、GAP-43免疫蛍光法(下記参照)により標識された。エピ蛍光顕微鏡写真は、SPOTデジタルカメラシステム(SPOT Digital Camera System)(DIAGNOSTIC INSTRUMENTS, INC., Sterling Heights, MI)およびAXIOVERT 10顕微鏡(CARL ZEISS, Thornwood, NY)を用いて得られた。GAP-43陽性軸索プロファイルは、IMAGE-PRO PLUSソフトウェア(MEDIA CYBERNETICS, Silver Springs, MD)を用いてスコア化された。
【００９６】
事前変性実験のための神経外植片培養
成体(180 g〜200 g)雌SPRAGUE DAWLEYラット(HARLAN, Indianapolis, IN)が神経ドナーおよび移植片レシピエントとして用いられた。このプロジェクトは、所内動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)により検討されて認可された。ドナーのラットは、イソフルオラン(isofluorane)で深く麻酔され、断頭された。坐骨神経を臀部筋肉開裂切開により露出し、下にある筋膜から離して単離した。吻側から総腓骨神経および脛骨神経への分岐点まで、15-mm 神経セグメントを切除した。セグメントを滅菌リンガー溶液ですすぎ、薄いプラスチック支持体へ末端をピンで留めることにより安定化させた。神経外植片を、N2補足物を含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM/N2)または2 %もしくは10 %ウシ胎児血清(FBS)を補ったDMEM/N2(ATLANTA BIOLOGICALS, Atlanta, GA)において、1日、2日、4日、および7日間、培養した。明記されるように、いくつかの外植片は、MMP阻害剤、GM6001(50 μM)の存在下で培養された(Grobelnyら、[1992] Biochem., 31:7152-7154)。培養された神経をDMEM中で入念に洗浄し、その後、封管へ移した。その管を液体窒素中に2分間浸漬し、その後、37℃水浴で5分間解凍した。この凍結-解凍サイクルは2回繰り返され、凍結死滅した(無細胞性)神経セグメントを生じた。新鮮に切除された神経(培養されていない対照)を同じ手順を用いて凍結死滅させた。その後、無細胞性神経セグメントは、a)凍結切片培養アッセイ法に使用するための凍結切片作製のために包埋されたか、またはb)生化学的分析のためおよび間置神経移植片としての使用のために液体窒素中に保存された(2週間までの間)。組織学的検査のために調製される神経外植片は、アルデヒドで固定され、凍結死滅は省かれた。
【００９７】
インビボでの神経変性は、骨盤の近くの坐骨神経の単一の切断により果たされた。近位の断端は、軸索伸長を防止するために、はずして結紮された。脚の筋肉および皮膚を閉じて、切断された神経をインサイチューで2日間または7日間、変性するようにさせた。
【００９８】
免疫細胞化学
軸索再生は、GAP-43免疫蛍光法およびデジタル画像解析により評価された。スライドに載せられた組織切片をPBSで洗浄し、その後、0.5 %トリトンX-100を含むPBSで10分間、処理した。切片をブロッキング緩衝液(10 %血清を含むPBS + 0.1 %トリトンX-100)で処理し、その後、一次抗体(ブロッキング緩衝液に希釈した)と一晩、4℃でインキュベートした。結合した抗体を、ブタ抗ウサギ免疫グロブリン(DAKO CORPORATION, Carpinteria, CA)またはヤギ抗マウス免疫グロブリン(Sigma)FITC結合二次抗体で暗闇で1時間、室温で標識した。抗マウス二次抗体は、使用前にラット血清であらかじめ吸着された。切片を洗浄し、4 %パラホルムアルデヒドを含むPBSで後固定し、すすぎ、蛍光封入媒体中においてカバーガラスをかけた。アフィニティー精製されたウサギ抗GAP-43ペプチド抗体は、公知の方法(Ferguson TAら、[2000] Mol Cell Neurosci, 16:157-167)を用いて作製され、2 μg/mlで使用された。ポリクローナル抗体1918(CHEMICON INTERNATIONAL, Temecula, CA)(1:1000)は、コンドロイチナーゼABCでの消化により露出されたCSPGコアタンパク質の結合領域に付着したままである不飽和二糖単位にのみ結合する(Bertolotto Aら、[1986] J Neurol Sci 73:233-244)。ポリクローナル抗EHSラミニン抗体(Sigma)(1:1000)は、基底層を標識するために使用された。ポリクローナル抗S-100抗血清(Dako)(1:500)は、シュワン細胞を標識するために使用された。暗視野画像は、PHOTOSHOP(ADOBE SYSTEMS INC., San Jose, CA)において反転され、印刷のために最適化された。
【００９９】
凍結切片培養バイオアッセイ法
凍結切片培養法は、ニューロンが新鮮/凍結神経切片上で直接的に培養される神経突起伸長アッセイ法であり、以前に記載されているように行われた(Ferguson TAら、[2000] Mol Cell Neurosci, 16:157-167)。簡単には、コンドロイチナーゼ処理および溶媒処理された神経セグメントを20 μmの薄片に切り、滅菌したアミノプロピルトリエトキシシラン(APTS)コーティングカバーガラス上に載せて、使用されるまで-20℃で保存した。示された所において、切片は、コンドロイチナーゼABC(0.1ユニット/ml)または溶媒(50 mM NaClを含む、50 mM トリス-HCl、pH 8.0)で2時間、37℃で処理された。8日のニワトリ胚由来の精製された後根神経節(DRG)ニューロンを、10 ng/ml 神経成長因子を含む既知組成N2培地(Bottenstein JEら、[1980] Exp Cell Res 125:183-190)における神経切片に直接的に播種した。凍結切片培養アッセイを、24時間のインキュベーション後、100 %メタノールでの固定化により終結させた。DRGニューロンによる神経突起伸長は、GAP-43免疫蛍光標識により評価された。エピ蛍光顕微鏡写真は、組織切片について記載されるように得られた。神経突起の長さは、IMAGE-PRO PLUSソフトウェア(MEDIA CYBERNETICS, Silver Springs, MD)を用いて直接的に測定された。各実験における各条件について、一つの細胞体(〜15 μm)より長い神経突起をもつ少なくとも250個のニューロンがスコア化された。
【０１００】
神経事前変性実験のためのゲル酵素電気泳動法
神経セグメントを氷冷抽出緩衝液(1 %トリトンX-100、200 mM NaCl、および10 mM CaCl2を含む、50 mM トリス-HCl、pH 7.6)中に置き、プローブ超音波処理(15秒)によりホモジナイズした。試料を30分間、4℃で撹拌し、可溶性画分を遠心分離(12,000 g、20分)により収集した。可溶性画分の全タンパク質含有量は、BRADFORD REAGENT(BIO-RAD LABORATORIES, Hercules, CA)を用いて測定された。抽出緩衝液に溶解したウシ血清アルブミンがタンパク質標準として使用された。抽出物を加熱せずに非還元Laemmli試料緩衝液中で可溶化し、1.5 mg/ml ブタのゼラチンを含む10 %SDS-ポリアクリルアミドゲル上において4℃で電気泳動した。ゲルを水中で簡単にすすぎ、その後、2.5 %トリトンX-100中で3回、45分より長く洗浄した。トリトンを3回の5分間水洗浄で除去し、酵素電気泳動ゲルをインキュベーション緩衝液(50 mM トリス-HCl、pH 8.0、5 mM CaCl2、0.02 %アジ化ナトリウム)中で21時間展開させた。ゲルを固定し、0.05 %クーマシーブリリアントブルーで染色した。ゼラチン溶解性活性をもつタンパク質バンドは、ゼラチンゲルの青色バックグラウンド内に透明溶解帯として現れた。ゼラチン溶解バンドの共移動は、着色分子量標準(BIO-RAD)に加えて、組換えヒトMMP-2およびMMP-9の潜在型ならびに活性型と比較された。デジタル顕微鏡写真を得て、ゼラチン溶解バンドの濃度測定をIMAGE-PRO PLUSソフトウェアを用いて行った。
【０１０１】
神経事前変性実験のためのインサイチュー酵素電気泳動法
固定されていない正常神経および培養された神経の凍結切片(10 μm)をスライドに載せ、分子内で消光されている、フルオレセイン標識ゼラチン基質(MOLECULAR PROBES INC., Eugene, OR)の20 μg/mlを含む反応緩衝液(50 mM トリス-HCl、150 mM NaCl、5 mM CaCl2、0.2 mM アジ化ナトリウム、pH 7.6)で表面を塗った(Ohら、1999)。対照条件において、MMP阻害剤EDTA(30 mM)が反応緩衝液に含まれた。24時間、37℃でのインキュベーション後、切片を水ですすぎ、4 %パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液で固定した。切片を水ですすぎ、Citifluorを用いて封入した。組織切片においてゼラチン溶解活性により生じた蛍光-ゼラチンペプチドが観察され、エピ蛍光顕微鏡により撮影された。
【０１０２】
事前変性実験のための間置神経移植
6匹のラットに、左右相称の無細胞性神経移植片、一方は正常(培養されていない)移植片および一方はインビトロであらかじめ変性された(2 %血清中で2日間、培養された)移植片を与えた。宿主ラットをキシラジン(15 mg/kg、筋肉内)およびケタミン(110 mg/kg、腹腔内)を用いて深く麻酔をかけた。坐骨神経は露出され、神経と下にある組織の間に置かれたプラスチック挿入物により支持された。坐骨の切れ込みと分岐点の間の中間点の神経領域を、最初にフィブリン糊で塗布した。鋸歯型鋏を用いて、宿主神経の2.5mmのセグメントを切除した。移植片を解凍し、解剖用メスの刃で10 mmに新鮮に切り取った。移植片は、各末端において、1本の9-0 ETHILON縫糸を用いる神経上膜神経縫合術により宿主神経断端に接合された。その後、フィブリン糊が接合を安定化させるために適用され、宿主神経に適用された最初のフィブリン塗布と共同して、神経要素の突出(神経内膜キノコ状化)を低減させた(MenovskyおよびBartels, [1999] Neurosurgery 44:224-225、考察pp.225-226)。筋肉は4-0縫糸で、皮膚は創傷用クリップで閉じられた。麻酔からの回復後、動物は、標準的住居へ戻された。移植後8日目、宿主ラットを深く麻酔し、断頭した。移植片ならびに近位および遠位の宿主神経3 mmを取り出し、4 % パラホルムアルデヒドを含む0.1 M リン酸緩衝液、pH 7.4に一晩、4℃で浸漬した。検体をPBSで平衡化し、リン酸緩衝液中の30 % ショ糖に2日間、4℃で浸漬した。検体を包埋し、記録された寸法の横断面について凍結切片を作製した。移植片内の再生中の軸索は、GAP-43免疫蛍光法により標識された(下記参照)。エピ蛍光顕微鏡写真が得られ、GAP-43陽性軸索プロファイルは、IMAGE-PRO PLUSソフトウェアを用いてスコア化した。
【０１０３】
神経事前変性実験のための免疫蛍光標識
固定された組織切片をPBS中の0.5 %トリトンX-100で10分間、処理した。非特異的抗体結合は、0.1 %トリトンX-100および10 %正常血清を含むPBS(ブロッキング緩衝液)での前処理によりブロックされた。一次抗体をブロッキング緩衝液に希釈し、一晩、4℃で適用した。結合された一次抗体を、フルオレセインもしくはローダミンを結合したブタ抗ウサギ免疫グロブリン(DAKO, Carpinteria, CA)またはヤギ抗マウス免疫グロブリン(Sigma)で暗闇で1時間、室温で標識した。抗マウス二次抗体は、使用前にラット血清であらかじめ吸着された。神経突起の長さ(凍結切片培養法)および軸索再生(移植)は、ポリクローナル抗GAP-43 IgG(2 μg/ml)(FergusonおよびMuir, 2000, Mol Cell Neurosci, 16:157-167)(NB300-143; NOVUS BIOLOGICAL, Littleton, CO)での免疫標識法により評価された。他の一次抗体は以下のものを含んだ：ポリクローナル抗MMP-2 IgG(4 μg/ml)(MMP2/475; Muir, 1995)；ポリクローナル抗MMP-9 IgG(4 μg/ml)(AB19047; CHEMICON, Temecula, CA)；ポリクローナル抗S-100抗血清(1:500)(DAKO)および；ポリクローナルOX42抗血清(1:500)(SEROTEK, Raleigh, NC)；ならびにモノクローナル抗神経フィラメントIgG(4 μg/ml)(NAP4; Harrisら、1993)。いくつかの例において、エピ蛍光顕微鏡写真は、PHOTOSHOP(ADOBE SYSTEMS, San Jose, CA)において印刷のために反転およびコントラスト増強された。
【０１０４】
以下は、本発明を実施するための手順を説明する実施例である。これらの実施例は、限定なものとして解釈されるべきではない。別に記載されない限り、すべての割合は、重量単位であり、すべての溶媒混合物の割合は容量単位である。
【０１０５】
実施例 1 - 無細胞性神経セグメントのコンドロイチナーゼでの処理による CSPG の分解
この実験の目的は、コンドロイチナーゼ処理が無細胞性神経の無傷セグメントの全体にわたってCSPGを効果的に分解するかどうかを決定することであった。ラット坐骨神経のセグメント(長さ1.5 cm)は、繰り返される凍結-解凍サイクルにより無細胞性にされ、その後、一括して、16時間、コンドロイチナーゼABC溶液中に浸された。コンドロイチナーゼ前処理された神経内のCSPG分解は、ネオエピトープ抗体Ab1918での免疫標識法により調べられた。この抗体は、コンドロイチナーゼABCによるコンドロイチン硫酸鎖の溶解後にコアタンパク質上に創造されるエピトープに結合する(Bertolottoら、[1986] J. Neurol Sci, 73:233-244)。図1Aに示されるように、Ab1918免疫染色は、前処理された神経セグメント全体を通じて強かった。さらに、図1Bに示されるように、Ab1918免疫染色の強度は、コンドロイチナーゼでの切片の追加的後処理により増加しなかった。コンドロイチナーゼに曝されなかった無細胞性神経において、Ab1918免疫反応性はなかった(示していない)。これらの発見は、一括コンドロイチナーゼ処理が、すべての神経区画に効果的に浸透し、CSPG側鎖を徹底的に分解したことを示している。
【０１０６】
正常な神経において、CSPGおよびラミニンは、主として、シュワン細胞基底層を含む神経鞘および基底膜に共存している(Zuoら、[1998a] J. Neurobiol. 34:41-54)。それらの分布は、繰り返される凍結-解凍後、変化せず、図1Aおよび図1Cに示されるように、一括コンドロイチナーゼ処理がECM構造を変化させたという、光学顕微鏡レベルでの徴候はなかった。コンドロイチナーゼ処理された無細胞性神経セグメントの完全性は、神経再生移植片としてのそれらのその後の使用にとって、重要な考慮すべきことであった。従って、神経移植後の前処理された神経セグメントの構造的完全性もまた調べた。図1Dに示されるように、Ab1918免疫反応性の強度および分布は、インビボで8日後では変化せず、シュワン細胞基底層の基本構造が無傷のままであったことを示している。ひとまとめにして考えると、これらの結果は、無細胞性神経移植片の一括コンドロイチナーゼ処理が、基底層スキャホールドを傷つけることまたはそれのラミニン含有量を移行させることなく、効果的にCSPGを分解したことを実証している。
【０１０７】
実施例 2 - コンドロイチナーゼでの無細胞性神経セグメントの処理による阻害性 CSPG の不活化
コンドロイチナーゼ処理された無細胞性神経における阻害性CSPGの不活化は、凍結切片培養バイオアッセイ法により測定された。胚性ニワトリDRGニューロンを、調製された神経セグメントの切片上に播種し、神経突起促進活性は、神経突起伸長をスコア化することにより評価された。結果は図2に示されている。溶媒のみで一括前処理された無細胞性神経の切片における平均神経突起長は、49 μmであった。コンドロイチナーゼで一括前処理された無細胞性神経における神経突起伸長は平均して96 μmであり、対照条件と比較して95 %の増加を示した。一括コンドロイチナーゼ処理が完全であったかどうかを決定するために、切片作製後にコンドロイチナーゼで処理された(後処理)神経組織において凍結切片培養アッセイ法を行った。予想された通り、溶媒のみで一括処理された無細胞性神経の神経突起促進活性は、コンドロイチナーゼでの後処理により有意に(86 %)増加した。対照的に、コンドロイチナーゼ後処理は、一括コンドロイチナーゼ処理神経移植片由来の切片にわずかな追加効果を生ずるのみであった。
【０１０８】
これらの結果は、少量のコンドロイチナーゼABCに無細胞性神経移植片のセグメントを浸すことにより、阻害性CSPGが効果的に分解かつ不活化されたことを示している。さらに、一括コンドロイチナーゼ処理は、基底層スキャホールドのラミニン関連性神経突起促進潜在能力を妨害することなく、神経移植片を効果的に脱阻害した。後者の点は、正常神経および変性した神経の凍結切片培養アッセイ法と同様に(FergusonおよびMuir, 2000, Mol Cell Neurosci, 16:157-167)、コンドロイチナーゼ処理された無細胞性神経移植片の切片における神経突起伸長が、シュワン細胞基底層と厳密に関連して生じたという観察により強化された。
【０１０９】
実施例 3 - 神経再生は無細胞性神経移植片のコンドロイチナーゼ処理により増強される
以下の実験は、コンドロイチナーゼ処理が無細胞性神経同種移植片を通しての神経再生を向上させるという仮説を試験した。実施例2に記載されるように、無細胞性坐骨神経セグメントを溶媒またはコンドロイチナーゼABCで一括処理した。10-mmの間置神経移植片を、フィブリン糊で補強される神経上膜神経縫合術により宿主神経へ連結した。9匹の宿主ラットのそれぞれは、左右相称の移植片、一方は溶媒処理された移植片および一方はコンドロイチナーゼ処理された移植片を受けた。再生は、最初、8日後に調べた。まず、図3に示されるように、近位および遠位の神経-移植片の接合を外科的接合のアライメントを評価するために縦方向の切片において調べた。すべての移植片が連続状態にあり、従って、次の分析に含められた。再生のスコア化は、伸長している軸索を強く染色するGAP-43免疫標識法に基づいた。凍結死滅した移植片内の軸索およびシュワン細胞残遺物は、GAP-43に対して免疫陰性であり、宿主シュワン細胞は、非常にかすかに染色されるのみであった(デジタルスコア化に用いられる限界値未満の強度で)。軸索伸長は、移植片内の指定された空間的間隔において、横断切片におけるGAP-43免疫陽性プロファイルに得点をつけることにより評価された。図4に示されるように、すべての移植片において、いくらかの軸索の内への伸長が観察された。しかしながら、コンドロイチナーゼ処理された移植片への伸長は、対照移植片においてより、際立って多くかつ広く分布された。定量的結果は、図5に示されている。
【０１１０】
コンドロイチナーゼ処理された移植片に侵入する軸索(GAP-43免疫陽性プロファイル)の平均数は、平均して、対照移植片より3倍以上多かった。対照移植片に侵入する軸索はいつも制限されており、たいてい中央にクラスターを形成していたが、コンドロイチナーゼ処理された移植片への初期の伸長は、より広く分散され、特に近位端において豊富であった。これらの発見は、無細胞性神経移植片への軸索貫入の成功が、コンドロイチナーゼでの移植片の前処理により著しく向上したことを示している。しかしながら、移植片の遠位端において、両条件で、類似した数の軸索が一貫して観察された。これは、軸索は、8日の期間中を通じてコンドロイチナーゼ処理された移植片に貫入し続けたが、一方で、対照移植片への軸索貫入が初期に生じ、その後、時間的に制限されたことを示唆した。
【０１１１】
無細胞性移植片への軸索伸長の潜伏期がコンドロイチナーゼ処理により低減されるかどうかを決定するために、移植片の最も近位の面を横断切片において同様に調べてスコア化することのほかは、同じ分析を4日目の移植片について行った。左右相称の移植片を受けた3匹の動物のみが調べられたが、結果は、8日目の移植片について観察されたものと一致していた。しかも、図6に示されるように、移植片の最も近位の面(宿主-移植片の界面から0.3 mm)において、軸索貫入がコンドロイチナーゼ処理された移植片で、平均して5倍多かった。これらの結果から、コンドロイチナーゼ処理が潜伏期を減少させ、かつ無細胞性神経移植片への軸索再生の接近を有意に向上させることが、結論されうる。
【０１１２】
実施例 4 - コンドロイチナーゼ処理された移植片の基底層管内の軸索再生
神経再生の成功は、ラミニンの豊富な基底層管内の軸索の伸長に依存しているため、軸索伸長の基底層との関連が無細胞性移植片のコンドロイチナーゼ処理により変化するかどうかを決定した。8日目の移植片の横断切片をGAP-43およびラミニンについて二重標識した。ラミニン標識は強く、基底層は、対照およびコンドロイチナーゼ処理の移植片中、同様に無傷であるように思われた。繰り返される凍結-解凍、酵素処理、外科的操作、およびインビボでの8日間にもかかわらず、細胞外マトリックススキャホールドは、構造的に無傷であるように思われた。多数のGAP-43標識軸索(または神経突起)は、個々の基底層内で明らかであり、これらの大部分は管の管腔表面と密接に結合しているのが観察された。対照および処理の移植片において、あいまいに付着した、同じくらいの少数の神経突起が観察された。全般的に、基底層内で伸長する軸索の性質は、無細胞性神経移植片のコンドロイチナーゼ処理により変化しなかった。
【０１１３】
実施例 5 - コンドロイチナーゼ処理された移植片への軸索伸長およびシュワン細胞移動
8日目の移植片の連続切片を、軸索伸長に関するシュワン細胞の移動を調べるために、S-100およびGAP-43について免疫標識した。移植片は、S-100染色の2つの別個のパターンを含んだ；強い染色は生きている宿主由来シュワン細胞に関連し、弱い染色は凍結死滅したシュワン細胞残遺物に関連した。別に示さない限り、後に続く記載は、強く染色された(生きている)シュワン細胞プロファイルを指す。図7に示されるように、移植片の近位領域において、シュワン細胞および軸索の分布は、大概は一致した。軸索のクラスターが、少しの明らかなシュワン細胞関連もなく、時々見出された。散らばったシュワン細胞もまた、伸長している軸索を含有しない領域に見られた。シュワン細胞移動は、8日目の移植片中にはっきり見られた。しかしながら、図7に示されるように、移植片中のより遠位の点において、軸索がしばしばシュワン細胞を伴わないで見出された。これは、図8に示されるように、遠位の接合を含む縦方向の切片において確認された。図8Bに示されるように、S-100標識シュワン細胞は、遠位宿主断端において豊富であったが、移植片の遠位面(凍結死滅したシュワン細胞残遺物のみを含んだ)にはたとえ侵入したものがあるとしても少なかった。図7、図8Aおよび図8Bに提示されている実施例は、コンドロイチナーゼ処理された移植片から得られ、同一の結果が対照移植片において観察された。これらの発見は、コンドロイチナーゼ処理された移植片における軸索伸長の増大が、主として、基底層の神経突起促進活性の増強に起因することを示唆した。
【０１１４】
軸索伸長の経路は、近位および遠位の接合をすぐ近くに囲んでいる組織の縦方向切片においてのみ調べられた。移植片への侵入について、軸索伸長は、遠位へ方向づけられ、移植片内に逸脱した伸長または神経腫形成の徴候はなかった。これは、誘導機構(または遠位断端に関連した化学誘引物質の性質)がコンドロイチナーゼ処理された移植片において傷つけられなかったことを示唆した。さらに、図8Aに示されるように、軸索が移植片の遠位範囲に到達した数少ない例に基づいて、軸索は移植片を出て、宿主神経断端へと伸長を続けた。
【０１１５】
実施例 6 - コンドロイチナーゼでの無細胞性ヒト神経セグメントの処理による阻害性 CSPG の分解および不活化
ラット神経を用いて行われた上記実施例に記載される実験の多くは、ヒト神経を用いて繰り返された。ヒト神経を用いる実施例6および実施例7においても、別に示されている所を除いて、ラット神経を用いる実施例1および実施例2に記載される手順に従った。ヒト腓腹および脛骨の神経は、外科的脚切断から新鮮に得られた。切断は、神経の介入がない疾患(例えば、骨癌)にとって必要であり、神経は、組織学的検査を基礎として正常であると判断された。
【０１１６】
ヒト神経は、まず、CSPGおよびラミニンのそれらの含有量がラット神経において観察されたものと類似しているかどうかを決定するために調べられた。免疫細胞化学より、神経再生を支えている基底層は、CSPGおよびラミニンの両方を含み、他の種においてと同じ様式で共存していることが示された。CSPGネオエピトープおよびラミニンについて染色されたヒト神経は、それぞれ、図9Aおよび図9Bに示されている。さらになお、凍結切片培養バイオアッセイ法を用いて、ヒト神経の成長促進性質がコンドロイチナーゼでの処理により増加したことが見出された。定量的結果は、図10に示されている。
【０１１７】
実施例 7 - コンドロイチナーゼ処理されたヒト神経移植片内の軸索再生
以下の実験において、コンドロイチナーゼ処理が、ラット異種移植モデルにおいて、無細胞性ヒト神経移植片を通じた神経再生を向上させるという仮説を試験した。ヒト神経から取られたサブユニット(個々の束)を一括して溶媒またはコンドロイチナーゼABCで処理した。10-mmの間置神経移植片を、フィブリン糊で補強される神経上膜神経縫合術によりラット宿主坐骨神経に連結した。2匹の宿主ラットのそれぞれは、左右相称の移植片、一方は溶媒処理された移植片および一方はコンドロイチナーゼ処理された移植片を受けた。再生は、最初、8日後に調べられた。軸索伸長は、移植片内の指定された空間的間隔において、横断切片におけるGAP-43免疫陽性プロファイルをスコア化することにより評価された。
【０１１８】
コンドロイチナーゼ処理された移植片への伸長は、対照の移植片より、際立って多くかつ広く分布された。定量的結果は、図11に示されている。コンドロイチナーゼ処理された移植片に侵入した軸索の平均の数(GAP-43免疫陽性のプロファイル)は、平均して、対照の移植片より、3倍以上多かった。この発見は、無細胞性ヒト神経移植片への軸索の貫入の成功が、CSPG分解酵素での移植片の前処理により著しく向上したことを示している。この異種移植モデルはまた、無細胞性ヒト神経がラット宿主により拒絶されなかった(8日以内)ことを実証し、無細胞性神経の低免疫原性を確信させる。
【０１１９】
実施例 8 - コンドロイチナーゼ注射後の神経における CSPG の分解
動物は、左右相称の神経挫滅かまたは左右相称の神経切断のいずれか、および直接的縫合修復を受けた。同時に、一方の神経は、コンドロイチナーゼABCを注射され、反対側の神経は、溶媒単独を受けた。コンドロイチナーゼ処理が損傷をうけた神経において効果的にCSPGを分解したかどうかを最初に調べた。損傷の部位地点および周囲の神経の組織切片をCSPGネオエピトープ抗体を用いて免疫標識した。これらの抗体は、コンドロイチナーゼABCによるコンドロイチン硫酸鎖の溶解後CSPGコアタンパク質上に創造される新しいエピトープに結合する。図12Aおよび図12Bに示されるように、損傷およびコンドロイチナーゼ適用後4日目に切断された神経において、CSPGネオエピトープ免疫染色は、接合地点および数mm周辺の遠位神経の横断面領域全体にわたって強かった。強い免疫染色はまた、近位神経への数mmにも観察された。図12Cに示されるように、同様の結果が挫滅損傷をうけた神経において得られた。図12Dに示されるように、接合および注射の部位近くの組織のCSPGネオエピトープ標識は、免疫染色手順の一部としてコンドロイチナーゼでの二次処理を組織切片に適用した場合、せいぜいわずかにより強かっただけであった。これらの結果は、コンドロイチナーゼABCでのインビボでの処理が、神経損傷および修復の部位を含む、注射部位を囲む細胞外マトリックスにおいて、完全ではないにしても、実質的にCSPGを分解したことを示している。
【０１２０】
実施例 9 - コンドロイチナーゼ処理は神経挫滅損傷 ( 軸索断裂症 ) 後の軸索再生を変化させなかった
コンドロイチナーゼ処理は神経挫滅損傷の部位を通じた軸索伸長を向上させるという仮説を試験した。神経鞘の連続性を維持しつつ、座骨神経を重度に挫滅させることにより、左右相称の軸索断裂症が達せられた。損傷の時点において、一方の神経はコンドロイチナーゼABCを注射され、反対側の神経は溶媒単独を受けた。神経挫滅後の軸索の急速な再伸長のため、損傷部位を渡る軸索伸長は、損傷後2日目に調べられた。再生中の軸索は、GAP-43免疫蛍光により標識され、デジタル画像解析によりスコア化された。対照の神経において予想された通り、図13Aに示されるように、挫滅部位に対してすぐ遠位の軸索再生は、強くかつ神経横断面中に広く行き渡った。同様に、類似した再生応答および伸長パターンは、コンドロイチナーゼ処理された移植片にも観察された。両方の条件において、免疫染色は非常に濃く、多数の神経突起が各基底層管内に見られた。GAP-43免疫反応性の定量的評価は、神経挫滅損傷後の軸索再生がコンドロイチナーゼ適用により有意には影響を受けなかったことを示した(図13B)。同様に、軸索再生の潜伏期または速度は、コンドロイチナーゼ処理された神経において変化した徴候はなかった。
【０１２１】
実施例 10 - 神経切断 ( 神経断裂 ) 修復後の軸索の再生はコンドロイチナーゼ処理により増強される
コンドロイチナーゼ処理は神経接合部位を通じた軸索伸長を向上させるという仮説を試験した。座骨神経の鋏での切断により左右相称の神経断裂が達せられ、その後、神経上膜の縫合術およびフィブリン糊により修復された。一方の神経はコンドロイチナーゼABCを注射され、反対側の神経は溶媒単独を受けた。神経切断後の再生の潜伏期のため、接合を横切っての軸索伸長は、損傷後4日目に調べられた。対照神経において、軸索の侵入は、主に所々に生じ、遠位の神経の不連続の小区分に限定された；さもなければ、図14Aに示されるように、少数の軸索のみが、残っている神経の横断面中に散らばっているのが見出された。遠位部へとより遠くへ伸展する軸索の数(4日後)は、急速に減少し、接合部から3 mm以内でゼロに近づいた。対照的に、コンドロイチナーゼ処理された移植片への軸索の侵入は、より強く、神経横断面全体中を広く行き渡った。7/7の動物において、遠位の神経に侵入した軸索の数は、対照神経より、コンドロイチナーゼ処理された移植片において多かった。図14Bに示されるように、平均して、接合に対してすぐ近くの遠位の軸索のスコアは、コンドロイチナーゼ処理された神経において2倍大きく、3/7の動物は、3.5倍を超えて増加した。対照神経と比較したコンドロイチナーゼ処理神経における軸索数の比率は、2:1(ちょうど接合を越える地点)から、遠位の断端の中へとより遠くなる地点において、4:1を超えて累進的に増加した。このように、遠位の神経に侵入する軸索の数を増加させることに加えて、コンドロイチナーゼ処理はまた、軸索侵入の潜伏期を減少させ、かつ/または遠位の神経セグメント内の伸長速度を増加させた。遠位の神経のあらゆる部分における軸索伸長は、厳密に直線であり、神経の縦軸に整列していることは明らかであった。さらに、再生中の軸索(GAP-43)および基底層(ラミニン)についての二重免疫標識は、遠位の神経の基底層内に再伸長しうる軸索の強い性質がコンドロイチナーゼ処理により変化しないことを示した。
【０１２２】
これらの発見は、挫滅損傷後の軸索再伸長がコンドロイチナーゼ処理および対照の神経において類似していたことを示している。対照的に、コンドロイチナーゼを注射された神経において、切断された神経の接合を通しての軸索再伸長は加速され、遠位のセグメント中への軸索の侵入は数倍に増加した。このように、神経連続性が崩壊している場合の切断損傷において、コンドロイチナーゼ適用は、遠位の神経セグメントの基底層に接近する軸索の能力を有意に増加させ、かつ著しく再生を高めた。
【０１２３】
本発明に従って、単一のコンドロイチナーゼの注射が、接合された末梢神経の界面を横切っての軸索の再生を著しく向上させる。阻害性CSPGの分解が、より許容的な神経基底を創造し、軸索新芽の、遠位神経のシュワン細胞基底層の位置を捜し当てて接近するために、より大きな自由度を許容する。この過程に軸索が直面する困難性は、挫滅損傷と比較して切断損傷後の再生に関連する増加した潜伏期により証明される。特に、そのデータは、コンドロイチナーゼ処理の重要な効果が末梢神経切断モデルにおいて再生の潜伏期を減少させることであることを示唆している。さらに、軸索新芽が、接合を横断することができない場合には退化すると考えられることは公知である(Fu, S. Y.およびT. Gordon, 1997, Mol Neurobiol 14:67-116)。
【０１２４】
実施例 11 - 培養された神経セグメントの神経突起促進活性
新鮮に切除された(細胞性)ラット坐骨神経セグメントを0 %、2 %および10 %ウシ胎児血清を含む培地において、7日間までの間、培養した。対照(培養されていない)および培養された神経を凍結切片にし、それらの神経突起促進活性を凍結切片培養アッセイ法により評価した。結果は、図15Aに示されている。対照神経の切片上に成長した胚性ニワトリDRGニューロンは、118 μmの平均神経突起長であった。1日〜4日間培養された神経外植片の切片上の神経突起伸長は、有意に大きかった。既知組成培地(0 %血清)において培養された神経について、神経突起促進活性は、インビトロでの2日目に最大値に達し、対照神経と比較して43 %増加を示した。2 %血清を含む培地において1日または2日間培養された神経外植片について、神経突起促進活性における70 %を超える増加があった。そのうえ、10 %血清において培養された神経外植片は、インビトロでの2日目に、類似した最大値に達した。神経外植片の神経突起促進活性は、より長い培養期間後には衰え、7日目に、対照条件のレベル以下に落ちた。これらのデータは、神経外植片の神経突起促進活性が、培地への血清の添加の有りおよび無しで、インビトロで短期間培養された場合、著しく増加したことを示している。神経外植片は、培養容器へ付着するのを防止され、細胞増殖は観察されなかった。しかしながら、すべての条件における細胞生存力は、切り刻まれて押しつぶされた神経外植片から培養表面へ強い細胞移動が観察された別の実験において確認された。
【０１２５】
実施例 12 - インビトロおよびインビボでの事前変性の比較
凍結切片培養アッセイ法を用いて、インビトロであらかじめ変性されたラット坐骨神経の神経突起促進活性を、インビボであらかじめ変性されたものと比較した。上記のように(図15Aおよび図15Bを参照)、2 %血清中で2日間培養された神経外植片上のDRGニューロンの神経突起伸長は、対照神経(あらかじめ変性されていない)より70 %大きかった。また、より長い期間(4日間および7日間)の神経外植片培養は、結果として、累進的に少ない神経突起促進活性を生じた。7日間培養された神経は、対照条件より37 %少ない活性であった。比較すると、インビボであらかじめ変性された神経の神経突起促進活性は、インビトロであらかじめ変性されたものより非常に低かった。インビボで2日間あらかじめ変性された神経における神経突起伸長は、35.8 μmであり、対照条件(126.5 μm)より72 %少ない活性であった(t検定、p＜0.001)。しかしながら、この抑制は、十分時間が過ぎると逆転し、7日間のインビボでの事前変性は、結果として、対照条件より12 %大きい神経突起伸長を生じた(p = 0.06)。これらのデータは、インビトロでの事前変性が、インビボでの事前変性により達成されるものより大きい程度まで、神経セグメントの神経突起促進活性を増加させたことを示している。
【０１２６】
実施例 13 - インビトロ変性は MMP 依存性である
神経セグメントを、MMP阻害剤、GM6001の添加の有りおよび無しの2 %血清含有培地において、2日間培養した。培養された神経の神経突起促進活性は、凍結切片培養アッセイ法により評価された。結果は、図15Bに示されている。図15Aに示されているものと類似して、培養された神経(2日、2 %血清)上に伸長したDRGニューロンの平均神経突起長は、210 μmであり、(培養されていない)対照神経のそれに対して68 %増加を示した。しかしながら、この増加は、GM6001の存在下で培養された神経について、たった14 %までに低下した。各条件における神経セグメントの解離培養(押しつぶし標本)は、細胞生存力の損失がないことを示す豊富な細胞増殖を示した。さらに、単離されたシュワン細胞培養物のGM6001での処理が、このハイドロメート基盤の（hydromate-based）ジペプチドの非常に低い毒性を確証した。これらの結果により、MMP活性が、培養された神経外植片の神経突起促進活性を増加させる変性過程に強く結び付けられる。
【０１２７】
実施例 14 - 培養された神経セグメントにおける MMP 発現：酵素電気泳動ゲル分析
MMP-2およびMMP-9は、ゼラチン(開裂されたコラーゲン)を分解する能力がある主要な細胞外プロテイナーゼであり、それらの主な基質は、基底層のコラーゲンIV型である。MMP-2は、インビボでシュワン細胞により恒常的に発現され、ラットにおいて神経損傷後、上方制御される。他方、MMP-9は、正常な神経において検知されず、侵入している顆粒球およびマクロファージに関連して損傷後に存在する。本発明におけるインビトロでの神経変性の試験は、造血細胞による最小限の寄与により、常在の神経細胞によるMMP発現の役割を決定する唯一の機会を提供する。培養された神経外植片におけるMMPレベルは、まず、ゼラチン基質重層ゲル電気泳動法(酵素電気泳動法)により調べられた。ゼラチン酵素電気泳動法は、MMP-2およびMMP-9の検出において非常に感度が高く、潜在性型および活性型の両方を明らかにするという追加の利点をもつ。神経セグメントを2 %血清の存在下において1日、2日、4日、および7日間、培養した。抽出された神経の代表的な酵素電気泳動分析が図16に示されている。正常な(培養されていない対照)神経は、ヒト組換えMMP-2のプロ型と共移動するMr = 72 kDに優勢なゼラチン溶解バンドを示した。微量の活性MMP-2が観察された(Mr = 66 kD)が、MMP-9(Mr = 92 kDおよび84 kD)は検出されなかった。培養された神経において、活性MMP-2における急速な増加および全MMP-2含有量における実質的増加があった。MMP-9は、1日間または2日間培養された神経において検知されず、4日目および7日目の試料において活性MMP-9の痕跡量であった。同様の結果は、既知組成培地において培養された神経外植片について得られ、血清が神経試料において観察されたゼラチン溶解活性に寄与していなかったことが確認された。これらの発見は、MMP-2が、インビトロでの神経変性において、急速に活性化されかつ上方制御されることを示している。ゼラチン酵素電気泳動法は、MMP-2よりMMP-9を検出することにおいて数倍感度が高いことは注目に値し、(Ladwigら、[2002] Wound Repair Regen 10:26-37)、神経試料におけるMMP-9含有量は無視してよいことを意味している。
【０１２８】
実施例 15 - 培養された神経セグメントにおける MMP 活性：インサイチュー酵素電気泳動法
MMPの活性は、遺伝子転写、酵素前駆体活性化、およびメタロプロテイナーゼの組織阻害剤の作用により制御される。インサイチュー酵素電気泳動法による神経セグメントにおける正味のゼラチン溶解活性を調べた。組織切片を、組織内のゼラチン溶解活性により蛍光性ペプチドへ変換される、消光したフルオレセイン-ゼラチンで重層した。構成性のゼラチン溶解活性は、神経内膜基底層に沿って整列したシュワン細胞に大部分関連した正常な神経において検出された(図17Aおよび図17Bに示されるように)。図17Cおよび図17Dに示されるように、培養された神経において、神経内膜内に拡散したゼラチン溶解活性における広く行き渡った増加があり、シュワン細胞はより強く標識された。GM6001の存在下で培養された神経におけるゼラチン溶解活性もまた調べた。上で記載されているように、GM6001は、培養された神経に観察される神経突起促進の増加を妨害した。図17Eおよび図17Fに示されるように、GM6001処理された神経外植片におけるゼラチン溶解活性は、ほとんど検知されなかった。これらの発見を合わせると、ゼラチン溶解活性は神経外植片培養により著しく増加したこと、およびGM6001はインビトロ変性の間、新たなMMP活性を効果的に妨害したことを示している。
【０１２９】
実施例 16 - 培養された神経セグメントにおける MMP 局在化：免疫蛍光標識法
2日間培養された神経外植片におけるMMP-2およびMMP-9の分布を免疫蛍光顕微鏡により調べた。図18Aに示されるように、培養神経のMMP-2免疫標識は、シュワン細胞およびその周囲の基底層内で強かった。S-100でのシュワン細胞染色は、最も強いMMP-2免疫標識が、移動しているシュワン細胞と関連していることを示した(図18B；および下記参照)。また、MMP-2免疫発現は、インサイチュー酵素電気泳動法により得られたゼラチン溶解活性のパターンに非常に類似していた。他方、MMP-9免疫標識は、まれな細胞プロファイルを除いては、神経束内に事実上存在しなかった。図18Cに示されるように、いくらかのMMP-9の細胞免疫発現が周囲の神経上膜に見られた。図18Dに示されるように、OX42標識は、培養された神経の神経上膜全体およびまれに神経束内に散らばったマクロファージを同定するために用いられた。MMP-9およびOX42標識の区画別分布により、マクロファージがMMP-9の主要な供給源であることが示唆された。さらに、シュワン細胞、およびおそらくはいくつかの神経周膜の線維芽細胞が、MMP-2を発現しており、MMP-2免疫反応性はまた、周囲の細胞外マトリックスに拡散しているのが観察された。
【０１３０】
実施例 17 - 培養された神経セグメントにおける細胞分布および軸索変性
神経損傷後、シュワン細胞は活性化状態になり、それらのミエリンを解離し、広く移動する。図18Bに示されるように、培養された神経外植片のS-100免疫標識により、多くのシュワン細胞が、損傷応答の典型であるが、それらの細長い形態および軸索との密接な連合を喪失したことが示された。循環系から接続を断たれた場合に予想されるように、神経外植片におけるマクロファージの数が、インビボでの神経変性において観察されるものより、非常に低かった。さらになお、図18Dに示されるように、ごく少数のマクロファージだけが神経束内に見出され、ほとんどすべてのOX42標識細胞は、神経上膜に限られた。神経切除の時点で神経上膜区画に存在していたマクロファージが、培養の間に内部の神経区画へ侵入しなかったことは、明らかであった。従って、インビトロでの神経外植片は、シュワン細胞の寄与が、侵入しているマクロファージのそれとは独立して評価されうる神経変性のモデルを表している。
【０１３１】
軸索の分解を、培養された神経外植片において、神経フィラメントの免疫標識法により調べた。結果は、図19A〜図19Dに示されている。図19Aに示される、正常な神経において観察される連続的な神経フィラメント染色とは違って、2日間培養された神経セグメントにおける神経フィラメントのプロファイルは、図19Bに示されるように、断片化され、不揃いだった。インビボでの軸索の変性と類似して、培養された神経は、細胞骨格崩壊および軸索の変性を示す、環状および凝縮神経フィラメントの両方のプロファイルを含んだ。図19Dに示されるように、軸索の変性は、特に、残留するミエリン鞘内に空隙または高濃度の球粒を示したトルイジンブルーで染色されたやや薄い(semi-thin)切片において明らかであった。2日間培養された神経において観察される変性の変化は、インビボで見られるウォラーの変性(Wallerian degeneration)(StollおよびMuller, 1999, Brain Pathol 9:313-325により概説されている)の第一相を暗示した。図19Dに示されるように、ウォラーの変性の第二相の主要な特徴もまた、ミエリン鞘における形態的変化、およびシュワン細胞によるミエリン突出、加えてシュワン細胞増殖を含め、培養された神経において観察された。しかしながら、結果としてさらなるミエリン変性(崩壊および凝縮)ならびに貧食性除去を生じる変性過程は、2日目の神経外植片培養物において起こらなかった。図19Cに示されるように、実質的な変性の変化にも関わらず、基底層スキャホールドは、構造的に無傷のままであり、再構築が、シュワン細胞による高レベルのラミニン発現により示された。
【０１３２】
実施例 18 - 無細胞性間置移植片として培養された神経
本実験は、インビトロでの事前変性が無細胞性神経同種移植片を通しての神経再生を向上させるという仮説を試験する。宿主ラットは、1つの対照(あらかじめ変性されていない)および1つのインビトロであらかじめ変性されている(2日間、2 %血清中で培養される)、左右相称の無細胞性神経移植片を受けた。軸索再生は、8日後、横断切片におけるGAP-43免疫陽性プロファイルをスコア化することにより評価された。図20Aおよび図20Bに示されるように、軸索伸長はすべての移植片において観察され、中央に分布されて、近位の宿主神経と移植片の良好なアライメントおよび接合を示した。6/6の動物において、近位の神経-移植片の接合を横断し、移植片に侵入する軸索の数は、インビトロであらかじめ変性された移植片において、その反対側の対照移植片よりも多かった。図20Bに示されるように、平均して、インビトロであらかじめ変性された移植片内の軸索のスコアは、2倍大きかった。両方の移植片条件において、軸索伸長は、基底層管内に生じ、宿主由来シュワン細胞を伴った。これらの発見は、無細胞性神経移植片への軸索再生がインビトロでの事前変性により増強されることを示している。
【０１３３】
変性は、除神経した末梢神経および引き出した神経移植片の成長促進性質を増加させる。本実験は、神経外植片培養モデルを用いて、この変性過程におけるMMPの役割を研究した。また、インビボでの神経事前変性は、ヒト同種移植片の調製として適していないため、インビトロで事前変性された神経移植片の特性を調べた。本実験の結果は、以下の結論を支持する。まず、造血性マクロファージが存在しないにも関わらず、ウォラーの変性の初期段階が、末梢神経外植片の短期間培養において起こる。神経セグメントの神経突起促進活性は、インビトロでの変性により著しく増加し、かつインビボであらかじめ変性された神経よりも大きい程度まで増加する。インビトロでの変性から結果として生じた神経突起促進活性の増加は、シュワン細胞によって高められたMMP-2の発現および活性に起因する。最後に、インビトロでの事前変性は、無細胞性間置神経移植片の中への軸索再生を増強する。
【０１３４】
インビトロでの末梢神経変性の本実験は、MMP-9が、神経上膜鞘に制限された少数の細胞集団に大部分関連して痕跡量で存在することを見出している。MMP-9についての免疫標識は、培養された神経の神経内膜の区画において本質的に存在しない。対照的に、MMP-2、特にその活性型は、培養された神経の神経内膜内で急速に増加する。免疫位置測定およびインサイチュー酵素電気泳動データをひとまとめにして考えると、実験データより、MMP-2がシュワン細胞により発現され、活性酵素がインビトロでの神経変性の間に周囲の神経内膜へ放出されると結論づけられる。
【０１３５】
神経外植片の本観察と合わせると、実験データより、MMP-2が、除神経した神経(およびあらかじめ変性された神経移植片)の成長促進性質の増強のための、主要ではないにしても十分な変性機構を表すことが示される。
【０１３６】
本発明に従って、細胞生存力および増殖を支持する条件を用いる神経外植片の培養は、細胞介在性変性を可能にし、神経移植片の再生潜在能力を有意に増強させる。神経外植片は、凍結死滅されて、間置神経移植片として後の使用のために凍結保存されうる。凍結死滅した神経移植片は、事実上、移植片免疫拒絶の懸念を排除する。この理由で、無細胞性神経移植片は、免疫抑制せずに同種移植片を移植することにおいて、細胞性神経移植片を行うより、臨床的適用としての大きな可能性をもっている。
【０１３７】
本明細書に記載される実施例および態様は例示目的のためのみであり、かつそれらの観点からの様々な改変または変更は、当業者に示唆されると考えられ、本出願の趣旨および範囲内に含まれうることは、理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】コンドロイチナーゼ処理された無細胞性神経移植片のCSPGネオエピトープ免疫蛍光を示す。無細胞性(凍結死滅した)ラット坐骨神経セグメントは、インビトロで16時間、コンドロイチナーゼABCで一括して処理された。図1Aは、Ab1918でのネオエピトープ(コンドロイチナーゼ依存性)標識を示し、コンドロイチナーゼでの一括処理がすべての神経区画に効果的に浸透してCSPG側鎖を分解したことを実証している。図1Bにおいて、Ab1918免疫標識の強度は、図1Aに示される神経の切片をコンドロイチナーゼで追加的に処理することにより増加せず、最初の一括処理が完全であったことを示している。図1Cにおいて、コンドロイチナーゼ処理された無細胞性神経セグメントにおけるシュワン細胞基底層の構造的完全性は、ラミニン免疫蛍光により示された。図1Dは、インビボで8日後のコンドロイチナーゼ処理された無細胞性間置神経移植片のAb1918免疫標識を示す。
【図２】コンドロイチナーゼで処理された無細胞性神経セグメントの凍結切片培養バイオアッセイ法による阻害性CSPGの不活化を示す。無細胞性神経セグメントは、コンドロイチナーゼ(「Ch'ase」)または溶媒単独で一括して処理された。神経は、薄片に切られ、その後、コンドロイチナーゼまたは溶媒単独での後処理として追加的に処理された。分離されたニワトリ胚性DRGニューロンが24時間、神経切片上に増殖され、神経突起長は、材料および方法に記載されているように、スコア化された。測定は、各条件において少なくとも250個のニューロンにスコア化することにより行われた。結果は、平均(-SEM)として表され、一括の溶媒およびコンドロイチナーゼの条件を比較する統計上の有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定された。*P＜0.001。
【図３】間置無細胞性神経移植片の連続性およびGAP-43免疫染色の評価を示す。各神経移植片の連続性は、縦方向の切片において近位および遠位の神経-移植片接合を調べることにより確認された。近位の接合において、GAP-43標識により、移植片の近位局面に侵入する多数の再生中の軸索が明らかにされた。GAP-43は、無細胞性移植片内のいずれの残留要素も標識しなかった。
【図４】8日後の無細胞性間置神経移植片中への軸索再生を示す。それぞれ、溶媒処理およびコンドロイチナーゼ処理の移植片を受けた、2匹の動物からの代表的な連続切片。近位の移植片(1.2 mm、先端)および後に続く0.56 mm間隔から取られた連続切片は、GAP-43で免疫標識された。左右相称の移植片を受けた各動物において(n = 9)、軸索伸長は、溶媒処理された対照よりコンドロイチナーゼで処理された無細胞性移植片中に向かって多かった。画像は、神経上膜で切り取られ、図5においてデジタル画像解析によりスコア化された範囲を近似した。
【図５】コンドロイチナーゼ処理された無細胞性神経移植片中への再生中の軸索のより多い到達を示す。8日目の間置神経移植片の連続切片(図4に示す)は、デジタル画像解析によりGAP-43標識軸索プロファイルについてスコア化された。データは、移植片への指定された距離において(近位から遠位まで)評価された9個の溶媒処理移植片および9個のコンドロイチナーゼ処理移植片の平均(-SEM)を表す。
【図６】4日後の無細胞性間置神経移植片の最初のセグメント中への軸索再生を示す。4日目の無細胞性移植片の神経-移植片界面とすぐ近くの近位領域が調べられた。GAP-43標識軸索プロファイルは、移植片中へ0.3 mmにおいて比較された。データは、3個の溶媒処理移植片および3個のコンドロイチナーゼ処理移植片の平均(-SEM)を表す。
【図７】移植片内における軸索再生とシュワン細胞移動の関係を示す。8日目の移植片の連続切片は、GAP-43(軸索)およびS-100(シュワン細胞)について免疫標識された。コンドロイチナーゼ処理された移植片の近位の領域において、シュワン細胞が、再生中の軸索と密接に関係しているのが最も頻繁に見出された。軸索のクラスターが、共移動しているシュワン細胞なしで時々観察された(矢印)。移植片中のより遠位の地点において、軸索は、しばしばシュワン細胞を伴わずに見出された。移植片のより遠位の領域において、ほんの少数の点在するシュワン細胞のみが、S-100について強く免疫標識され、凍結死滅したシュワン細胞残遺物に関連した弱いS-100染色を大部分含んだ。
【図８】遠位の移植片接合における軸索伸長およびシュワン細胞増殖を示す。8日目のコンドロイチナーゼ処理された移植片および遠位の神経断端の連続の縦方向切片が、図8Aに示されるようにGAP-43について(軸索)、および図8Bに示されるようにS-100について(シュワン細胞)、免疫標識された。図8Aにおいて、軸索(小さい矢印)は、遠位の接合に接近、横断し、宿主の遠位断端内に拡散的に伸長する。図8Bにおいて、S-100標識されたシュワン細胞は、遠位の宿主断端において豊富であるが、あるとしてもほんの少数のみが、移植片の遠位局面(凍結死滅したシュワン細胞残遺物に関連した弱いS-100免疫染色を含む)に侵入する。
【図９】図9Aおよび図9Bは、それぞれ、CSPGネオエピトープおよびラミニンについて染色されたヒト神経を示す。ヒト神経の全体構造はラット神経より複雑であるが、これらの結果は、軸索再生を支えている基底層が大概は類似しており、成長を制御する分子成分(CSPGおよびラミニン)が豊富であることを示している。図9Aはまた、ネオエピトープ標識により、CSPG側鎖がコンドロイチナーゼで処理されたヒト神経セグメントにおいて効果的に分解されたことを実証している。
【図１０】ヒト神経セグメントを用いる凍結切片培養アッセイ法による阻害性CSPGの不活化を示す。ヒト神経は、コンドロイチナーゼで処理され、その後、神経突起促進活性についてアッセイされた。分離されたニワトリDRGニューロンが24時間、切片上で増殖され、神経突起長がスコア化された。結果は、平均(-SEM)として表されている。溶媒処理およびコンドロイチナーゼ処理の条件を比較する統計上の有意性(P＜0.001)は、スチューデントのt検定を用いて見出された。
【図１１】ヒトからラットへの異種移植モデルにおいて、コンドロイチナーゼ処理された無細胞性神経移植片中へのより多い軸索の伸長を示す。(ラットの坐骨神経と類似した直径の)ヒト神経束が、ラットの坐骨神経に作られたギャップへ移植された。8日目の間置神経異種移植片の連続切片が、デジタル画像解析によりGAP-43標識軸索プロファイルについてスコア化された。データは、移植片への指定された距離において(近位から遠位まで)評価された2個の溶媒処理移植片および2個のコンドロイチナーゼ処理移植片の平均(-SEM)を表す。
【図１２】コンドロイチナーゼABCの単一の注射による、損傷をうけた坐骨神経におけるCSPGの分解を示す。2つの損傷モデル、左右相称の神経切断および修復(図12A、図12Bおよび図12D)ならびに左右相称の神経挫滅(図12C)が調べられた。損傷の時点において、右の坐骨神経は、神経損傷の部位に対して2 mm遠位の部位にコンドロイチナーゼABC(2 μl中1 U)を注射された。神経切断および修復後4日後、CSPG-ネオエピトープ免疫染色は、接合部位における神経内膜および神経鞘の全体(図12A)(神経上膜における縫い目に注目されたい)、ならびに接合に対して数mm遠位(図12B)および近位(示していない)両方の神経の横断面領域全体に強かった。図12Cに示されるように、コンドロイチナーゼ注射後2日目に調べられた挫滅損傷の神経において、同様の結果が得られた。図12Dに示されるように、インビボでのコンドロイチナーゼの注射によるCSPG分解の程度は、組織を切片にした後にコンドロイチナーゼでの2度目を処理された神経のCSPG-ネオエピトープ免疫標識により調べられた。2度目の適用後、連続切片に観察された染色強度は、顕著な違いはなく(図12Bと図12Dを比較)、単一のコンドロイチナーゼのインビボでの注射が、周囲の細胞外マトリックスにおいてCSPGを効果的に分解したことを示している。
【図１３】コンドロイチナーゼABCでの処理が神経挫滅損傷後の軸索再生を変化させなかったことを示す。成体ラットは、左右相称の坐骨神経挫滅を受け、一方の神経はコンドロイチナーゼABCを注射され、反対側の神経は溶媒単独を受けた。損傷後2日目に神経は取り出され、再生中の軸索は、GAP-43免疫細胞化学により標識された。2匹の代表する動物(それぞれ、溶媒およびコンドロイチナーゼの注射を受けている)において、神経挫滅に対してすぐ近くの遠位の再生された軸索プロファイルが図13Aに示されている。図13Bに示されるように、遠位神経の連続切片において、GAP-43免疫標識された軸索がスコア化された。溶媒処理された対照神経と比較して、コンドロイチナーゼ処理された(Ch'ase)神経において軸索再生に有意な違いはなかった。データは、遠位神経への0.56mm間隔で評価された6個のコンドロイチナーゼ処理移植片および6個の溶媒処理の神経の平均(±SEM)を表す。
【図１４】コンドロイチナーゼABCでの処理が、神経切断および神経縫合術での修復後の軸索再生を著しく増強させたことを示す。成体ラットは、左右相称の神経切断および末端から末端への修復を受けた。1つの神経はコンドロイチナーゼABCを注射され、反対側の神経は溶媒単独を受けた。神経は損傷後4日目に取り出され、再生中の軸索は、GAP-43免疫細胞化学により標識された。2匹の代表する動物(それぞれ、溶媒およびコンドロイチナーゼの注射を受けている)において、神経接合に対してすぐ近くの遠位の再生された軸索プロファイルが図14Aに示されている。図14Bに示されるように、遠位神経の連続切片において、GAP-43免疫標識された軸索がスコア化された。溶媒処理された対照と比較してコンドロイチナーゼ処理された(Ch'ase)神経において、軸索再生は有意に大きかった。データは、遠位神経への0.56mm間隔で評価された7個のコンドロイチナーゼ処理および7個の溶媒処理の神経の平均(±SEM)を表す。
【図１５】神経外植片培養の凍結切片培養アッセイ法を示す。図15Aに示されるように、新鮮に切除されたラット坐骨神経外植片は、0 %、2 %、または10 %ウシ胎児血清を含むDMEM/N2において、1日、2日、4日および7日間、培養された。図15Bに示されるように、神経外植片は、GM6001(MMP阻害剤)の添加無しおよび有りの2 %血清を含むDMEM/N2(培養標準(Culture Standard))において2日間、培養された。その後、神経は凍結切片にされ、胚性DRGニューロンが、NGFを含むDMEM/N2における組織切片上に播種された。24時間後、DRGニューロンは、GAP-43について免疫染色され、神経突起伸長は、デジタル顕微鏡写真および画像解析により測定された。対照条件は、正常な神経(培養の0日目)であった。データは、各条件において、2つまたはそれ以上の別々の実験で試験された少なくとも4つの別々の神経移植片培養物からの、スコア化された＞250個のニューロンの平均神経突起長(±SEM)を表す。
【図１６】神経外植片培養物の酵素電気泳動の分析を示す。神経外植片は、2 %血清を含むDMEM/N2において、0日(対照、C)、1日、2日、4日、および7日間、培養された。その後、神経は抽出され、ゼラチン重層電気泳動法により分析された。酵素電気泳動法により、染色されたゲル内に透明なバンドとして現れるプロ型および活性型の両方のゼラチナーゼが明らかにされる。対照神経は、大部分はプロMMP-2を含み、痕跡量の活性MMP-2を含んだ。2日間またはそれより長く培養された神経外植片内で、MMP-2含有量における累進的な増加および活性型への急速な変換があった。MMP-9は、4日目および7日目において痕跡量が検出されたが、対照および初期の外植片においては無視してよいものだった。分子量は、組換え型ヒトプロMMP-9(92 kD)、活性MMP-9(84 kD)、プロMMP-2(72 kD)および活性MMP-2(66 kD)の位置を指す。
【図１７】インサイチュー酵素電気泳動法による神経セグメントにおける正味のゼラチン溶解活性の局在化を示す。対照神経(図17Aおよび図17B)ならびに培養された神経外植片(2日、2 %血清)(図17Cおよび図17D)の組織切片は、組織内のゼラチン溶解活性により蛍光性ペプチドへ変換される、消光したフルオレセイン標識ゼラチンで表面を重層された。恒常的ゼラチン溶解活性が、正常な神経において検出され(図17A)、より高倍率において(図17B)、シュワン細胞と関連していた。図17Cおよび図17Dに示されるように、ゼラチン溶解活性は、培養された神経において、より強くかつ神経内膜中に拡散していた。図17Eおよび図17Fに示されるように、GM6001の存在下で培養された神経におけるゼラチン溶解活性は、著しく減少した。
【図１８】培養された神経外植片におけるMMP-2およびMMP-9の免疫発現を示す。図18Aに示されるように、培養された神経(2日、2 %血清)のMMP-2免疫標識は、シュワン細胞および周囲の基底層(挿入写真)内で強かった。図18Bにおいて、S-100免疫標識は、神経内のシュワン細胞の増殖した集団の再配置を示した。図18Cに示されるように、MMP-9免疫標識は、まれな細胞のプロファイルを除いて、事実上、神経束内に存在しなかった。周囲の神経上膜におけるいくつかの細胞がMMP-9について標識された。図18Dにおいて、OX42標識は、培養された神経の神経上膜全体に散らばったマクロファージ、およびまれに神経束内に散らばったマクロファージを示した。
【図１９】培養された神経外植片におけるウォラーの変性を示す。2日間培養された神経セグメントにおいて観察される変性の変化は、インビボで見られるウォラーの変性の第一相を暗示した。図19Aにおいて、神経フィラメント免疫標識は、図19Bに示されるような培養された神経外植片(2日、2 %血清)において見出される環状および断片化された軸索と比較して、正常な神経において軸索の緻密かつ連続的な形態を示した(図19Aおよび図19Bの挿入写真、縦方向切片)。図19Cに示されるように、ラミニンについての免疫標識は、基底層が構造的に無傷であり、ラミニン発現がシュワン細胞において上方制御されたこと(挿入写真)を示した。図19Dに示されるように、軸索の変性およびシュワン細胞によるミエリンの放出は、特に、トルイジンブルーで染色されたやや薄い切片において明らかであった。図19Dの挿入写真に示されるように、結果としてさらなるミエリン変性(崩壊および凝縮)および貪食性除去を生じる変性過程は、2日間培養された神経セグメントにおいて観察されなかった。
【図２０】インビトロであらかじめ変性された無細胞性神経移植片内の軸索再生を示す。正常および培養された(2日、2 %血清)神経移植片は、凍結死滅され、長さ10 mmにトリミングされ、切断された坐骨神経の修復のための間置移植片として使用された。宿主ラットは、一方は正常(培養されていない)および一方はあらかじめ変性されている(培養された)、左右相称の移植片を受けた。軸索再生は、8日後に、横断切片におけるGAP-43免疫陽性プロファイルをスコア化することにより評価された。図20Aにおいて、2匹の動物からの対照およびあらかじめ変性された移植片の代表的な切片が示されている。切片は、移植片内へ1.5 mmのところで軸索再生を示す。免疫蛍光画像のピクセル値は反転された。図20Bに示されるように、定量的分析は、移植片内の測定された距離において行われた。データは、各条件における6つの神経の平均(±SEM)を表す。
Claims (331)
- 少なくとも1つのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を、損傷をうけた神経に適用する段階を含む、損傷をうけた神経の修復を促進するための方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ、またはそれらの組み合わせ、またはそれらの生物活性のある断片もしくは変異体からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、コンドロイチナーゼAC、ヒアルロニダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ-9、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、およびコンドロイチナーゼAC、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼである、請求項1記載の方法。
- 損傷をうけた神経に組織接着剤を共適用することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 組織接着剤が生物学的糊である、請求項6記載の方法。
- 組織接着剤が、フィブリン糊および血小板ゲルからなる群より選択される、請求項6記載の方法。
- 損傷をうけた神経に生物活性のある薬剤を適用する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 生物活性のある薬剤が成長因子である、請求項9記載の方法。
- 成長因子が、神経成長因子、線維芽細胞増殖因子-1、線維芽細胞増殖因子-2、上皮増殖因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、ニューロトロフィン-5、インスリン様成長因子-1、インスリン様成長因子-2、トランスフォーミング増殖因子、グリア成長因子-2、血管内皮成長因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびリンパ球浸潤因子/コリン作動性分化因子からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
- 損傷をうけた神経に細胞を適用する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 細胞が幹細胞である、請求項12記載の方法。
- 細胞がシュワン細胞である、請求項12記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、損傷をうけた神経の損傷部位、または損傷部位の付近に適用される、請求項1記載の方法。
- 神経損傷が、基底層、神経周膜および神経上膜からなる群より選択される損傷をうけた神経の神経鞘の少なくとも1つの、連続性における崩壊を含む、請求項1記載の方法。
- 神経損傷が神経断裂である、請求項1記載の方法。
- 神経損傷が神経断裂であり、方法が損傷をうけた神経を接合する段階をさらに含み、かつコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が接合部位に適用される、請求項1記載の方法。
- 損傷をうけた神経が部分的または完全に切断され、近位端および遠位端を有し、かつコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、損傷をうけた神経の近位端に、または損傷をうけた神経の遠位端に、または損傷をうけた神経の近位端および遠位端の両方に適用される、請求項1記載の方法。
- 損傷をうけた神経の近位端に、または損傷をうけた神経の遠位端に、または損傷をうけた神経の近位端および遠位端の両方に組織接着剤を適用する段階をさらに含む、請求項19記載の方法。
- 損傷をうけた神経の近位端および遠位端を共に縫合する段階をさらに含む、請求項19記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、損傷をうけた神経内のコンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、またはコンドロイチン-4-硫酸およびコンドロイチン-6-硫酸の両方の溶解を引き起こす、請求項1記載の方法。
- 損傷をうけた神経が部分的または完全に切断され、近位端および遠位端を有し、かつコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、神経の遠位端への軸索侵入の潜伏期を減少させる、請求項1記載の方法。
- 損傷をうけた神経が部分的または完全に切断されて、近位端および遠位端を有し、かつコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、損傷をうけた神経の遠位端への軸索侵入の速度を増加させる、請求項1記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、損傷をうけた神経に局所的に適用される、請求項1記載の方法。
- 神経損傷が神経断裂であり、かつコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が神経断裂のいずれかの側に局所的に適用される、請求項1記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が損傷をうけた神経へ注射される、請求項1記載の方法。
- 神経損傷が神経断裂であり、かつコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が神経断裂のいずれかの側へ注射される、請求項1記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が薬学的に許容される担体と共に適用される、請求項1記載の方法。
- 薬学的に許容される担体が、液体、ゲル、泡、固体、およびポリマーからなる群より選択される、請求項29記載の方法。
- 薬学的に許容される担体が、膜、スポンジ、繊維状構造物、粉末、フリース、および粒子からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
- 薬学的に許容される担体が徐放系である、請求項29記載の方法。
- 薬学的に許容される担体が外科用カフであり、かつ外科用カフが、適用されるときに、損傷をうけた神経を少なくとも部分的に取り囲む、請求項29記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼであり、かつコンドロイチナーゼが約10ユニット/mLから約1000ユニット/mLまでの濃度範囲内で、損傷をうけた神経に適用される、請求項1記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼであり、かつコンドロイチナーゼが約100ユニット/mLから約500ユニット/mLまでの濃度範囲内で、損傷をうけた神経に適用される、請求項34記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がマトリックスメタロプロテイナーゼであり、かつマトリックスメタロプロテイナーゼが約0.1 μg/mLから約100 μg/mLまでの濃度範囲内で、損傷をうけた神経に適用される、請求項1記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がマトリックスメタロプロテイナーゼであり、かつマトリックスメタロプロテイナーゼが約10 μg/mLから約50 μg/mLまでの濃度範囲内で、損傷をうけた神経に適用される、請求項36記載の方法。
- 損傷をうけた神経が、損傷をうけた末梢神経である、請求項1記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が細菌の酵素である、請求項1記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が哺乳動物の酵素である、請求項1記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が組換え酵素である、請求項1記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素の適用が、損傷をうけた神経に遺伝子改変された宿主を投与することを含み、宿主がコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素をコードするポリヌクレオチドで遺伝子改変されている、請求項1記載の方法。
- 遺伝子改変された宿主が細胞である、請求項42記載の方法。
- 神経損傷が疾患により引き起こされた、請求項1記載の方法。
- 神経損傷が外傷により引き起こされた、請求項1記載の方法。
- 神経損傷が外科的手順により引き起こされた、請求項1記載の方法。
- 損傷をうけた神経が哺乳動物の神経である、請求項1記載の方法。
- 損傷をうけた神経がヒトのものである、請求項47記載の方法。
- 少なくとも1つのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ、またはそれらの組み合わせ、またはそれらの生物活性のある断片もしくは変異体からなる群より選択される、請求項49記載の薬学的組成物。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、コンドロイチナーゼAC、ヒアルロニダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ-9、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項49記載の薬学的組成物。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、およびコンドロイチナーゼAC、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項49記載の薬学的組成物。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼである、請求項49記載の薬学的組成物。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、約10ユニット/mLから約1000ユニット/mLまでの濃度範囲内のコンドロイチナーゼである、請求項49記載の薬学的組成物。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、約100ユニット/mLから約500ユニット/mLまでの濃度範囲内のコンドロイチナーゼである、請求項49記載の薬学的組成物。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、約0.1 μg/mLから約100 μg/mLまでの濃度範囲内のマトリックスメタロプロテイナーゼである、請求項49記載の薬学的組成物。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、約10 μg/mLから約50 μg/mLまでの濃度範囲内のマトリックスメタロプロテイナーゼである、請求項49記載の薬学的組成物。
- 組織接着剤をさらに含む、請求項49記載の薬学的組成物。
- 組織接着剤がフィブリン糊および血小板ゲルからなる群より選択される、請求項58記載の薬学的組成物。
- 薬学的に許容される担体が固体、液体、ゲル、クリーム、軟膏および泡からなる群より選択される、請求項58記載の薬学的組成物。
- 薬学的に許容される担体が徐放系である、請求項58記載の薬学的組成物。
- 薬学的に許容される担体が外科用カフである、請求項58記載の薬学的組成物。
- 少なくとも1つのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素、および神経移植片または損傷をうけた神経に適用されるスリーブを含む、損傷をうけた神経の修復を促進するための外科用カフ。
- スリーブがチューブを含み、かつチューブが神経移植片または損傷をうけた神経の挿入のための管腔を規定する、請求項63記載の外科用カフ。
- チューブが該チューブの長さに沿って縦方向に伸びるスリットを有する、請求項64の外科用カフ。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を損傷をうけた神経へ送達するための手段をさらに含む、請求項63記載の外科用カフ。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を送達する手段がポリマーを含む、請求項66記載の外科用カフ。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を送達する手段が、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を産生するための発現系を含む、請求項67記載の外科用カフ。
- 発現系が遺伝子改変された細胞を含み、該遺伝子改変された細胞がコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項68記載の外科用カフ。
- スリーブ上に播種された生きている細胞をさらに含む、請求項63記載の外科用カフ。
- 生きている細胞がシュワン細胞を含む、請求項70記載の外科用カフ。
- 生きている細胞がコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素をコードするポリヌクレオチドで遺伝子改変される、請求項70記載の外科用カフ。
- スリーブが可撓性である、請求項63記載の外科用カフ。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ、またはそれらの組み合わせ、またはそれらの生物活性のある断片もしくは変異体からなる群より選択される、請求項63記載の外科用カフ。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、コンドロイチナーゼAC、ヒアルロニダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ-9、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項63記載の外科用カフ。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼである、請求項63記載の外科用カフ。
- スリーブが神経移植片または損傷をうけた神経と接触させられるシートを含む、請求項63記載の外科用カフ。
- シートが平らなシートである、請求項77記載の外科用カフ。
- シートが自動巻き込みシートであり、かつ該シートが神経移植片または損傷をうけた神経と接触させられた場合、該神経移植片または損傷をうけた神経を自動的に取り囲む、請求項77記載の外科用カフ。
- 少なくとも1つのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を含む第一の区画、および組織接着剤を含む第二の区画を含む、損傷をうけた神経組織の修復を促進するためのキット。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項80記載のキット。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼである、請求項80記載のキット。
- 組織接着剤がフィブリン糊および血小板ゲルからなる群より選択される、請求項80記載のキット。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素および組織接着剤を混合するための第三の区画をさらに含む、請求項80記載のキット。
- 少なくとも1つのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を神経移植片に適用する段階を含む、移植のための神経移植片を調製するための方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ、またはそれらの組み合わせ、またはそれらの生物活性のある断片もしくは変異体からなる群より選択される、請求項85記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、コンドロイチナーゼAC、ヒアルロニダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ-9、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項85記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、およびコンドロイチナーゼAC、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項85記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼである、請求項85記載の方法。
- 神経移植片が第一の末端および第二の末端を有し、かつコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、神経移植片の第一の末端に、または神経移植片の第二の末端に、または神経移植片の第一の末端および第二の末端の両方に適用される、請求項85記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が神経移植片に一括して適用される、請求項85記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が神経移植片に局所的に適用される、請求項85記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が神経移植片へ注射される、請求項85記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、神経移植片をコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を含む培地中に配置することにより、神経移植片に適用される、請求項85記載の方法。
- 培地が既知組成培地である、請求項94記載の方法。
- 培地が未知組成培地である、請求項94記載の方法。
- 組織接着剤を神経移植片に適用する段階をさらに含む、請求項85記載の方法。
- 組織接着剤がフィブリン糊である、請求項97記載の方法。
- 組織接着剤が血小板ゲルである、請求項97記載の方法。
- 生物活性のある薬剤を神経移植片に適用する段階をさらに含む、請求項85記載の方法。
- 生物活性のある薬剤が成長因子である、請求項100記載の方法。
- 成長因子が神経成長因子、線維芽細胞増殖因子-1、線維芽細胞増殖因子-2、上皮増殖因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4、ニューロトロフィン-5、インスリン様成長因子-1、インスリン様成長因子-2、トランスフォーミング増殖因子、グリア成長因子-2、血管内皮成長因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、およびリンパ球浸潤因子/コリン作動性分化因子からなる群より選択される、請求項101記載の方法。
- 細胞を神経移植片に適用する段階をさらに含む、請求項85記載の方法。
- 細胞が幹細胞である、請求項103記載の方法。
- 細胞がシュワン細胞である、請求項104記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、神経移植片内のコンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、またはコンドロイチン-4-硫酸およびコンドロイチン-6-硫酸の両方の溶解を引き起こす、請求項85記載の方法。
- いったん神経移植片が損傷をうけた神経へ接合されると、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、神経移植片への軸索侵入の潜伏期を減少させる、請求項85記載の方法。
- いったん神経移植片が損傷をうけた神経へ接合されると、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、神経移植片への軸索侵入の速度を増加させる、請求項85記載の方法。
- 神経移植片が末梢神経組織を含む、請求項85記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼであり、かつコンドロイチナーゼが約10ユニット/mLから約1000ユニット/mLまでの濃度範囲内で神経移植片に適用される、請求項85記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼであり、かつコンドロイチナーゼが約100ユニット/mLから約500ユニット/mLまでの濃度範囲内で神経移植片に適用される、請求項85記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がマトリックスメタロプロテイナーゼであり、かつマトリックスメタロプロテイナーゼが約0.1 μg/mLから約100 μg/mLまでの濃度範囲内で神経移植片に適用される、請求項85記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がマトリックスメタロプロテイナーゼであり、かつマトリックスメタロプロテイナーゼが約10 μg/mLから約50 μg/mLまでの濃度範囲内で神経移植片に適用される、請求項85記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が細菌の酵素である、請求項85記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が哺乳動物の酵素である、請求項85記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が組換え酵素である、請求項85記載の方法。
- 神経移植片の長さが、約1センチメートルから約10センチメートルまでの範囲内である、請求項85記載の方法。
- 神経移植片の長さが、約10センチメートルより大きい、請求項85記載の方法。
- 神経移植片が生きている神経移植片である、請求項85記載の方法。
- 神経移植片が生きている移植片であり、かつ方法が、生きている神経移植片を無細胞性にする段階をさらに含む、請求項85記載の方法。
- 神経移植片が生きている移植片であり、かつコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を神経移植片に適用する前に、生きている神経移植片が無細胞性にされる、請求項120記載の方法。
- 神経移植片が生きている移植片であり、かつ方法が、神経移植片を凍結死滅させることにより生きている神経移植片を無細胞性にする段階をさらに含む、請求項85記載の方法。
- 神経移植片が生きている移植片であり、かつ方法が、界面活性剤での化学的抽出により生きている神経移植片を無細胞性にする段階をさらに含む、請求項85記載の方法。
- 神経移植片が哺乳動物由来である、請求項85記載の方法。
- 神経移植片がヒト、非ヒト霊長類、ブタ、齧歯類およびウシからなる群より選択される哺乳動物由来である、請求項85記載の方法。
- 神経移植片が自己移植片である、請求項85記載の方法。
- 神経移植片が同種移植片である、請求項85記載の方法。
- 神経移植片が異種移植片である、請求項85記載の方法。
- 神経移植片を損傷の部位に移植する段階、および少なくとも1つのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を以下のものに適用する段階を含む、損傷をうけた神経の修復を促進するための方法：
(a)神経移植片；または
(b)損傷をうけた神経；または
(c)神経移植片および損傷をうけた神経の両方 - コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ、またはそれらの組み合わせ、またはそれらの生物活性のある断片もしくは変異体からなる群より選択される、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、コンドロイチナーゼAC、ヒアルロニダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ-9、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼA、コンドロイチナーゼC、およびコンドロイチナーゼAC、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼである、請求項129記載の方法。
- 組織接着剤を以下のものに適用する段階をさらに含む、請求項129記載の方法：
(a)神経移植片；または
(b)損傷をうけた神経；または
(c)神経移植片および損傷をうけた神経の両方。 - 細胞を以下のものに適用する段階をさらに含む、請求項129記載の方法：
(a)神経移植片；または
(b)損傷をうけた神経；または
(c)神経移植片および損傷をうけた神経の両方。 - 細胞が幹細胞である、請求項135記載の方法。
- 細胞がシュワン細胞である、請求項135記載の方法。
- 神経損傷が、基底層、神経周膜、および神経上膜からなる群より選択される損傷をうけた神経の神経鞘の少なくとも1つの、連続性における崩壊を含む、請求項129記載の方法。
- 神経損傷が神経断裂である、請求項129記載の方法。
- 神経損傷が神経断裂であり、移植する段階が神経移植片を損傷をうけた神経へ接合する段階を含み、かつコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が接合部位に適用される、請求項129記載の方法。
- 損傷をうけた神経が部分的にまたは完全に切断され、近位端および遠位端を有し、神経移植片が第一の末端および第二の末端を有し、かつ移植する段階が損傷をうけた神経の近位端と遠位端との間に神経移植片を間置する段階を含み、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が以下の少なくとも1つに適用される、請求項129記載の方法：
(a)損傷をうけた神経の近位端；
(b)損傷をうけた神経の遠位端；
(c)神経移植片の第一の末端；および
(d)神経移植片の遠位端。 - 組織接着剤を以下の少なくとも1つに適用する段階をさらに含む、請求項141記載の方法：
(a)損傷をうけた神経の近位端；
(b)損傷をうけた神経の遠位端；
(c)神経移植片の第一の末端；および
(d)神経移植片の遠位端。 - 移植する段階が、神経移植片を損傷をうけた神経へ接合する段階および神経移植片を損傷をうけた神経に縫合する段階を含む、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、またはコンドロイチン-4-硫酸およびコンドロイチン-6-硫酸の両方の溶解を引き起こす、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、損傷をうけた神経から神経移植片への軸索侵入の潜伏期を減少させる、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、損傷をうけた神経から神経移植片への軸索侵入の速度を増加させる、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が局所的に適用される、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が注射により適用される、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が神経移植片に一括して適用される、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が薬学的に許容される担体と共に適用される、請求項129記載の方法。
- 薬学的に許容される担体が、液体、ゲル、泡、固体、およびポリマーからなる群より選択される、請求項150記載の方法。
- 薬学的に許容される担体が、膜、スポンジ、繊維状構造物、粉末、フリース、および粒子からなる群より選択される、請求項150記載の方法。
- 薬学的に許容される担体が徐放系である、請求項150記載の方法。
- 薬学的に許容される担体が外科用カフであり、外科用カフが、移植された神経移植片を少なくとも部分的に取り囲む、請求項150記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼであり、かつコンドロイチナーゼが約10ユニット/mLから約1000ユニット/mLまでの濃度範囲内で、損傷をうけた神経に適用される、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼであり、かつコンドロイチナーゼが、約100ユニット/mLから約500ユニット/mLまでの濃度範囲内で、損傷をうけた神経に適用される、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がマトリックスメタロプロテイナーゼであり、かつマトリックスメタロプロテイナーゼが、約0.1 μg/mLから約100 μg/mLまでの濃度範囲内で、損傷をうけた神経に適用される、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がマトリックスメタロプロテイナーゼであり、かつマトリックスメタロプロテイナーゼが、約10 μg/mLから約50 μg/mLまでの濃度範囲内で、損傷をうけた神経に適用される、請求項129記載の方法。
- 損傷をうけた神経が、損傷をうけた末梢神経である、請求項129記載の方法。
- 損傷をうけた神経が中枢神経系の神経であり、神経移植片が末梢神経組織を含む、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が細菌の酵素である、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が哺乳動物の酵素である、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が組換え酵素である、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素の適用が、損傷をうけた神経に、または神経移植片に、または損傷をうけた神経および神経移植片の両方に、遺伝子改変された宿主を投与する段階を含み、宿主がコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素をコードするポリヌクレオチドで遺伝子改変されている、請求項129記載の方法。
- 遺伝子改変された宿主が細胞である、請求項164記載の方法。
- 神経移植片が損傷をうけた神経に対して自己である、請求項129記載の方法。
- 神経移植片が損傷をうけた神経に対して同種である、請求項129記載の方法。
- 神経移植片が損傷をうけた神経に対して異種である、請求項129記載の方法。
- 神経移植片が哺乳動物由来である、請求項129記載の方法。
- 神経移植片がヒト、非ヒト霊長類、ブタ、齧歯類、およびウシからなる群より選択される哺乳動物由来である、請求項129記載の方法。
- 損傷をうけた神経がヒトのものであり、かつ神経移植片が、非ヒト霊長類、ブタ、齧歯類、およびウシからなる群より選択される哺乳動物由来である、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、移植する段階の前に神経移植片に適用される、請求項129記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、移植する段階の後に神経移植片に適用される、請求項129記載の方法。
- 神経移植片が生きている移植片を含む、請求項129記載の方法。
- 神経移植片が生きている移植片を含み、かつ方法が、無細胞性神経移植片を移植する段階の前に、生きている神経移植片を無細胞性にする段階をさらに含む、請求項129記載の方法。
- 神経移植片を移植する段階の前に、損傷をうけた神経を切除する段階をさらに含む、請求項129記載の方法。
- 神経移植片が終神経移植片である、請求項129記載の方法。
- 神経移植片が間置神経移植片である、請求項129記載の方法。
- 神経損傷が疾患により引き起こされた、請求項129記載の方法。
- 神経損傷が外傷により引き起こされた、請求項129記載の方法。
- 神経損傷が外科的手順により引き起こされた、請求項129記載の方法。
- 神経損傷が、基底層、神経周膜、および神経上膜からなる群より選択される損傷をうけた神経の神経鞘の少なくとも1つの、連続性における崩壊を含み、方法が、神経移植片を損傷をうけた神経に移植する段階、およびコンドロイチナーゼを、神経移植片に、または損傷をうけた神経に、または神経移植片および損傷をうけた神経の両方に適用する段階を含む、損傷をうけた神経の修復を促進するための方法。
- 神経移植片が末梢神経組織を含む、請求項182記載の方法。
- 神経移植片が損傷をうけた神経に対して自己である、請求項182記載の方法。
- 神経移植片が損傷をうけた神経に対して同種である、請求項182記載の方法。
- 神経移植片が損傷をうけた神経に対して異種である、請求項182記載の方法。
- 神経移植片が哺乳動物由来である、請求項182記載の方法。
- 神経移植片がヒト、非ヒト霊長類、ブタ、齧歯類、およびウシからなる群より選択される哺乳動物由来である、請求項182記載の方法。
- 損傷をうけた神経がヒトであり、かつ神経移植片が非ヒト霊長類、ブタ、齧歯類、およびウシからなる群より選択される哺乳動物由来である、請求項182記載の方法。
- 神経移植片が終神経移植片である、請求項182記載の方法。
- 神経移植片が間置神経移植片である、請求項182記載の方法。
- 少なくとも1つのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を、神経組織に適用する段階を含む方法により調製される神経組織を含む神経移植片。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ、またはそれらの組み合わせ、またはそれらの生物活性のある断片もしくは変異体からなる群より選択される、請求項192記載の神経移植片。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼである、請求項192記載の神経移植片。
- 方法が組織接着剤を神経組織に適用することをさらに含む、請求項192記載の神経移植片。
- 神経組織が生きている組織を含み、かつ方法が、該生きている神経組織を無細胞性にする段階をさらに含む、請求項192記載の神経移植片。
- 神経組織を無細胞性にする段階が、該神経組織を凍結死滅させる段階を含む、請求項196記載の神経移植片。
- 神経組織が末梢神経組織である、請求項192記載の神経移植片。
- 神経移植片が終神経移植片である、請求項192記載の神経移植片。
- 神経移植片が間置神経移植片である、請求項192記載の神経移植片。
- 神経組織が哺乳動物の組織である、請求項192記載の神経移植片。
- 神経組織が、ヒト組織、非ヒト霊長類組織、ブタ組織、齧歯類組織、およびウシ組織からなる群より選択される、請求項192記載の神経移植片。
- 神経組織がヒト組織である、請求項201記載の神経移植片。
- 神経移植片が自己移植片である、請求項192記載の神経移植片。
- 神経移植片が同種移植片である、請求項192記載の神経移植片。
- 神経移植片が異種移植片である、請求項192記載の神経移植片。
- 少なくとも一つのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素および培地を含む、神経移植片のための貯蔵溶液。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ、またはそれらの組み合わせ、またはそれらの生物活性のある断片もしくは変異体からなる群より選択される、請求項207記載の貯蔵溶液。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼである、請求項207記載の貯蔵溶液。
- 培地が既知組成培地を含む、請求項207記載の貯蔵溶液。
- 培地が未知組成培地を含む、請求項207記載の貯蔵溶液。
- 神経移植片として使用するための神経組織を調製するための方法であって、神経組織がインビトロで増殖するのを可能にし、その後に移植された場合に神経組織の神経突起促進活性を増加させる条件下において、インビトロで神経組織を培養する段階を含む方法。
- 神経突起促進活性の増加が、神経組織のインビトロ神経突起伸長アッセイ法により測定されるものである、請求項212記載の方法。
- インビトロの神経突起伸長アッセイ法が、凍結切片培養バイオアッセイ法を含む、請求項213記載の方法。
- 神経突起促進活性の増加が、神経組織のインビボ神経突起伸長アッセイ法により測定されるものである、請求項212記載の方法。
- インビトロで神経組織を培養する段階が、インビトロでの神経組織の事前変性を可能にする期間である、請求項212記載の方法。
- インビトロで神経組織を培養する段階が、その後に移植された場合に神経組織内での軸索侵入および伸長の程度の増加を達成する期間である、請求項212記載の方法。
- インビトロで神経組織を培養する段階が、約24時間から約96時間までの範囲内の期間である、請求項212記載の方法。
- インビトロで神経組織を培養する段階が、約24時間から約72時間までの範囲内の期間である、請求項212記載の方法。
- インビトロで神経組織を培養する段階が約48時間の期間である、請求項212記載の方法。
- インビトロで神経組織を培養する段階が、約10℃から約37℃までの範囲内の温度で行われる、請求項212記載の方法。
- インビトロで神経組織を培養する段階が、約30℃から約37℃までの範囲内の温度で行われる、請求項212記載の方法。
- インビトロで神経組織を培養する段階が、約37℃の温度で行われる、請求項212記載の方法。
- 神経組織が外植片である、請求項212記載の方法。
- 神経組織が哺乳動物の組織である、請求項212記載の方法。
- 神経組織が、ヒト組織、非ヒト霊長類組織、ブタ組織、齧歯類組織、およびウシ組織からなる群より選択される哺乳動物の組織である、請求項212記載の方法。
- 神経組織がヒト組織である、請求項212記載の方法。
- 神経移植片が自己移植片である、請求項212記載の方法。
- 神経移植片が同種移植片である、請求項212記載の方法。
- 神経移植片が異種移植片である、請求項212記載の方法。
- 神経組織が生きている神経組織を含み、かつ方法が、培養する段階の後に生きている神経組織を無細胞性にする段階をさらに含む、請求項212記載の方法。
- 神経組織が生きている神経組織であり、かつ方法が、培養する段階の後に生きている神経組織を凍結死滅させる段階をさらに含む、請求項212記載の方法。
- 貯蔵のために神経組織を凍結させる段階をさらに含む、請求項212記載の方法。
- 凍結させる段階が、インビトロで培養する段階の後に行われる、請求項233記載の方法。
- 少なくとも1つのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を神経組織に適用する段階をさらに含む、請求項212記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、培養する段階の間に神経組織に適用される、請求項235記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、培養する段階の後に神経組織に適用される、請求項235記載の方法。
- インビトロで培養する段階の後に神経組織を凍結死滅させる段階をさらに含み、かつコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が該凍結死滅させる段階の後に神経組織に適用される、請求項235記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項235記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素がコンドロイチナーゼである、請求項235記載の方法。
- 神経組織が末梢神経組織を含む、請求項212記載の方法。
- 培養する段階が、神経組織を培地と接触した状態に配置する段階を含む、請求項212記載の方法。
- 培地が既知組成培地を含む、請求項242記載の方法。
- 培地が血清を追加した既知組成培地を含む、請求項242記載の方法。
- 培地が未知組成培地を含む、請求項242記載の方法。
- 培地がダルベッコの改変イーグル培地を含む、請求項242記載の方法。
- インビトロで神経組織を培養する段階の前に、哺乳動物から神経組織を単離する段階をさらに含む、請求項212記載の方法。
- 組織接着剤を神経組織に適用することをさらに含む、請求項212記載の方法。
- 神経移植片として使用するための神経組織の、再生潜在能力を増強するための方法であって、神経組織をインビトロで約24時間から約96時間までの範囲内の期間培養する段階を含む方法。
- インビトロで神経組織を培養する段階が、約24時間から約72時間までの範囲内の期間である、請求項249記載の方法。
- インビトロで神経組織を培養する段階が約48時間の期間である、請求項249記載の方法。
- インビトロで神経組織を培養する段階が、約10℃から約37℃までの範囲内の温度で行われる、請求項249記載の方法。
- インビトロで神経組織を培養する段階が、約30℃から約37℃までの範囲内の温度で行われる、請求項249記載の方法。
- インビトロで神経組織を培養する段階が約37℃の温度で行われる、請求項249記載の方法。
- 培養する段階が神経組織を培地と接触した状態に配置する段階を含む、請求項249記載の方法。
- 神経組織がインビトロで増殖するのを可能にし、かつその後に移植された場合に神経組織の神経突起促進活性を増加させる条件下において、インビトロで神経組織を培養する段階を含む方法により調製される神経組織を含む、神経移植片。
- 神経突起促進活性の増加が、神経組織のインビトロの神経突起伸長アッセイ法により測定されるものである、請求項256記載の神経移植片。
- インビトロの神経突起伸長アッセイ法が凍結切片培養バイオアッセイ法を含む、請求項257記載の神経移植片。
- 神経突起促進活性の増加が、神経組織のインビボの神経突起伸長アッセイ法により測定されるものである、請求項257記載の神経移植片。
- インビトロで神経組織を培養する段階が、その後に移植された場合に神経組織内での軸索侵入および伸長の程度の増加を達成する期間である、請求項256記載の神経移植片。
- インビトロで神経組織を培養する段階が、約24時間から約96時間までの範囲内の期間である、請求項256記載の神経移植片。
- インビトロで神経組織を培養する段階が、約24時間から約72時間までの範囲内の期間である、請求項256記載の神経移植片。
- インビトロで神経組織を培養する段階が約48時間の期間である、請求項256記載の神経移植片。
- インビトロで神経組織を培養する段階が、約10℃から約37℃までの範囲内の温度で行われる、請求項249記載の神経移植片。
- インビトロで神経組織を培養する段階が、約30℃から約37℃までの範囲内の温度で行われる、請求項249記載の神経移植片。
- インビトロで神経組織を培養する段階が約37℃の温度で行われる、請求項249記載の神経移植片。
- 神経組織が生きている神経組織を含み、かつ方法が、生きている神経組織を無細胞性にする段階をさらに含む、請求項256記載の神経移植片。
- 神経組織が生きている神経組織を含み、かつ方法が、生きている神経組織を凍結死滅させることをさらに含む、請求項256記載の神経移植片。
- 方法が、貯蔵のために神経組織を凍結させる段階をさらに含む、請求項256記載の神経移植片。
- 凍結させる段階がインビトロで培養する段階の後に行われる、請求項268記載の神経移植片。
- 培養する段階が神経組織を培地と接触した状態に配置する段階を含む、請求項256記載の神経移植片。
- 培地が既知組成培地を含む、請求項271記載の神経移植片。
- 培地が血清を追加した既知組成培地を含む、請求項271記載の神経移植片。
- 培地が未知組成培地を含む、請求項271記載の神経移植片。
- 神経組織が哺乳動物の組織である、請求項256記載の神経移植片。
- 神経組織が、ヒト組織、非ヒト霊長類組織、ブタ組織、齧歯類組織、およびウシ組織からなる群より選択される哺乳動物の組織である、請求項256記載の神経移植片。
- 神経組織がヒト組織である、請求項256記載の神経移植片。
- 神経組織が末梢神経組織を含む、請求項256記載の神経移植片。
- 神経移植片が自己移植片である、請求項256記載の神経移植片。
- 神経移植片が同種移植片である、請求項256記載の神経移植片。
- 神経移植片が異種移植片である、請求項256記載の神経移植片。
- 損傷部位に神経移植片を移植する段階を含む、損傷をうけた神経の修復を促進するための方法であって、神経移植片がインビトロで増殖するのを可能にし、かつその後に移植された場合に神経移植片の神経突起促進活性を増加させる条件下において、インビトロで神経移植片を培養する段階を含む工程により神経移植片が調製されている方法。
- インビトロで神経移植片を培養する段階が、その後に移植された場合に神経移植片内での軸索侵入および伸長の程度の増加を達成する期間である、請求項282記載の方法。
- 神経突起促進活性の増加が、神経移植片のインビトロ神経突起伸長アッセイ法により測定されるものである、請求項282記載の方法。
- インビトロ神経突起伸長アッセイ法が、凍結切片培養アッセイ法を含む、請求項284記載の方法。
- 神経突起促進活性の増加が、神経移植片のインビボ神経突起伸長アッセイ法により測定されるものである、請求項284記載の方法。
- インビトロで神経移植片を培養する段階が、約24時間から約96時間までの範囲内の期間である、請求項282記載の方法。
- インビトロで神経移植片を培養する段階が、約24時間から約72時間までの範囲内の期間である、請求項282記載の方法。
- インビトロで神経移植片を培養する段階が約48時間の期間である、請求項282記載の方法。
- インビトロで神経移植片を培養する段階が、約10℃から約37℃までの範囲内の温度で行われる、請求項282記載の方法。
- インビトロで神経移植片を培養する段階が、約30℃から約37℃までの範囲内の温度で行われる、請求項282記載の方法。
- インビトロで神経移植片を培養する段階が約37℃の温度で行われる、請求項282記載の方法。
- 神経移植片が生きている神経組織を含み、かつ工程が、生きている神経組織を無細胞性にする段階をさらに含む、請求項282記載の方法。
- 神経移植片が生きている神経組織を含み、かつ工程が生きている神経組織を凍結死滅させる段階をさらに含む、請求項282記載の方法。
- 工程が、貯蔵のために神経移植片を凍結させる段階をさらに含む、請求項282記載の方法。
- 凍結させる段階がインビトロでの培養後に行われる、請求項295記載の方法。
- 培養する段階が神経移植片を培地と接触した状態に配置する段階を含む、請求項282記載の方法。
- 培地が既知組成培地を含む、請求項282記載の方法。
- 培地が血清を追加した既知組成培地を含む、請求項282記載の方法。
- 培地が未知組成培地を含む、請求項282記載の方法。
- 神経移植片が哺乳動物の組織である、請求項282記載の方法。
- 神経移植片が、ヒト組織、非ヒト霊長類組織、ブタ組織、齧歯類組織、およびウシ組織からなる群より選択される哺乳動物の組織である、請求項282記載の方法。
- 神経移植片がヒト組織である、請求項282記載の方法。
- 神経移植片が末梢神経組織を含む、請求項282記載の方法。
- 損傷をうけた神経が中枢神経系の神経組織を含む、請求項282記載の方法。
- 組織接着剤を、損傷をうけた神経に、または神経移植片に、または損傷をうけた神経および神経移植片の両方に適用する段階をさらに含む、請求項282記載の方法。
- 神経移植片が終神経移植片である、請求項282記載の方法。
- 神経移植片が間置神経移植片である、請求項282記載の方法。
- 少なくとも1つのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素を、損傷をうけた神経、または神経移植片、または損傷をうけた神経および神経移植片の両方に適用する段階をさらに含む、請求項282記載の方法。
- コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、インビトロで培養する段階の後に神経移植片に適用される、請求項309記載の方法。
- 神経移植片の適用の前に損傷をうけた神経を切除する段階をさらに含む、請求項282記載の方法。
- 神経移植片が損傷をうけた神経に対して自己である、請求項282記載の方法。
- 神経移植片が損傷をうけた神経に対して同種である、請求項282記載の方法。
- 神経移植片が損傷をうけた神経に対して異種である、請求項282記載の方法。
- 潜在的な神経移植片レシピエントの損傷をうけた神経へ移植するための神経移植片を提供する方法であって、損傷をうけた神経が近位の神経断端を含み、かつ方法が以下の段階を含む方法：
(a)潜在的なレシピエントの近位の神経断端の横断面の特徴を決定する段階；
(b)潜在的なレシピエントの近位の神経断端の横断面の特徴を、複数の候補ドナー神経移植片の横断面の特徴と比較する段階；および
(c)潜在的なレシピエントの近位の神経断端の横断面の特徴に類似する横断面の特徴を有する、候補ドナー神経移植片を選択する段階。 - 決定する段階が、潜在的なレシピエントの近位の神経断端のデジタル画像データを生成する段階を含み、画像データが、潜在的なレシピエントの近位の神経断端の横断面の特徴に関する情報を含む、請求項315記載の方法。
- 比較する段階が、潜在的なレシピエントの鋳型を作製するために、画像データを解析して神経要素の座標位置および神経要素直径を定義する段階、ならびに潜在的なレシピエント鋳型を候補ドナー移植片神経鋳型と比較する段階を含み、候補ドナー移植片鋳型が、神経要素の座標位置および神経要素直径を含み、該座標位置が、複数の候補ドナー神経移植片から生成される画像データの解析により得られる、請求項316記載の方法。
- 潜在的なレシピエントの近位の神経断端の横断面の特徴、および複数の候補ドナー神経移植片の横断面の特徴が、潜在的なレシピエントの近位の神経断端および複数の候補ドナー神経移植片内の、1つまたは複数の神経構造要素の1つまたは複数のパラメーターを含む、請求項315記載の方法。
- 1つまたは複数のパラメーターが、直径、厚さ、および空間的配列からなる群より選択される、請求項318記載の方法。
- 1つまたは複数の神経構造要素が、神経上膜、束、線維束群、ミエリン鞘、および軸索からなる群より選択される、請求項319記載の方法。
- 選択されたドナー神経移植片が、潜在的なレシピエントの神経断端との最高度の神経構造要素のアライメントを有する、請求項315記載の方法。
- 複数の候補ドナー神経移植片が凍結保存される、請求項315記載の方法。
- 複数の候補ドナー神経移植片が、神経組織が変性するのを可能にする条件下においてインビトロで培養される、請求項315記載の方法。
- 複数の候補ドナー神経移植片が、インビトロの培養の前または後に凍結される、請求項315記載の方法。
- 複数の候補ドナー神経移植片が自家性である、請求項315記載の方法。
- 複数の候補ドナー神経移植片が、潜在的なレシピエントの近位の神経断端に対して同種である、請求項315記載の方法。
- 複数の候補ドナー神経移植片が、潜在的なレシピエントの近位の神経断端に対して異種である、請求項315記載の方法。
- 複数の候補ドナー移植片が哺乳動物のものである、請求項315記載の方法。
- 複数の候補ドナー神経移植片がヒトのものである、請求項315記載の方法。
- 潜在的なレシピエントがヒトのものである、請求項315記載の方法。
- 少なくとも1つのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素が、複数の候補ドナー神経移植片に適用される、請求項315記載の方法。
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