JP7209799B2 - 神経培養システム - Google Patents
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Description
概念の選択を簡潔に述べてきたが、詳細については後述する。発明の概要は、発明の主題の主要な特徴または不可欠な特徴を特定したり、発明の主題の範囲を限定しようとするものでない。
βIII-チューブリン抗体染色のある種類は、TU-20である。TU-20は、ヒト由来のβIII-チューブリンのアミノ酸441-448に対するマウスモノクローナルIgG1である。
タンパク質遺伝子生成物(PGP9.5)は、ニューロン特異的エノラーゼとは、構造的および免疫学的に異なるニューロン特異的タンパク質である。標準的な免疫組織化学によれば、他の体細胞と同様に、多くの神経内分泌細胞における、中枢および末梢神経系のあらゆるレベルで、ニューロンおよび神経繊維でPGP9.5の存在が示された。この抗体は、ニューロンのマーカーとして価値のあるものである。
S100タンパク質は、脊椎動物に存在する低分子量タンパク質の系列であり、ヘリクス-ループ-ヘリクス配座を有する2つのカルシウム結合部位という特徴を持つ。S100タンパク質は、通常、神経堤から誘導される細胞、例えば、シュワン細胞およびメラノサイトに存在する。S100抗体染色は、通常のヒトシュワン細胞の存在を示すものである。
実験を行って、バイオアッセイ方法の能力を判断して、神経移植片の量を評価し、かつ/または組織標本の作製、染色および細切を含む実施形態における試験条件の影響を評価した。場合によっては、予備実験も行って、あるバイオアッセイパラメータの特性を改善した。例えば、陽性および陰性対照、不動態化技術、培養条件ならびに組織標本作製および染色技術について評価および試験した。本技術の利点を、実験結果により例証する。実験の詳細を後述する。実施例および実験は、本技術を限定するものではない。
図2は、試験構築物の免疫組織化学分析を含む実験に用いられる特定の材料および関連の方法の図を示す。図2に示すとおり、陽性または陰性対照を除く実験の方法フローには、概して、神経移植片を固定させるセグメントへと切断し(200)、各セグメントを標準または不動態化培地で処理し(210)、DRGをセグメントに付着(affix)させて、試験試料を作製し(220)、試料を培地中で培養し(230)、試料を固定、および様々な組織の高さで長手方向に細切し(240)、細片をスライドに置き、1種類以上の染料を適用し(250)、神経組織の突起成長を測定する(260)ことが含まれる。
バイオアッセイ信号(すなわち、移動距離/突起成長量)を増やす手段として培養時間および培地290の神経栄養因子内容を変えてみた。培養は、B27、グルタミン、抗生物質/抗真菌薬を補充したニューロバーサル媒地から誘導された化学的に定義された培地290で行った。「標準」培養では、培地290中25ng/mlの神経成長因子(NGF)を用いた。
培養後、組織標本の細切および染色用の全試料を準備した。全試料をパラフィン包埋し、長手方向に細切した(例えば、291)。予備実験で、厚さ4μmまたは8μmの細片を用いて、パラフィンベースの組織学的処理を行った。細片を、高さ200(高さ1)、400(高さ2)、600(高さ3)および800(高さ4)ミクロンで試料から採取した。
陽性対照を用いて、神経移植片セグメントで用いたのと同じ培養条件下であるが、神経移植片は用いない分析で用いたDRGの生存率を実証した。
不動態化は、生理活性の減じた神経移植片を作製して、バイオアッセイが、移植片の生理活性を測定することをさらに実証するものである。概して、不動態化により、神経移植片への神経突起/シュワン細胞の突起成長が減じる。実験結果の分析によれば、不動態化試料と不動態化処理していない試料には測定可能な差が示されており、バイオアッセイの妥当性を確認する補助となる。
実験結果
βIII-チューブリンを用いて染色を行って、神経突起成長を示し、S100を用いて、試料中のシュワン細胞の存在と位置を示した。全体として、βIII-チューブリンスライドの染色品質は分析で許容されるものであった。
主題は、構造的な特徴および/または作用に特有の言葉で記載されているが、請求項に定義された主題は、上述した特定の特徴または作用を必ずしも限定するものではない。むしろ、上述した特定の特徴および作用は、請求項を実施する例として開示され、請求項の範囲内に含まれるものとする。
Claims (16)
- 内面にラミニンを含む神経内膜管の足場を有する無細胞神経移植片のバイオアッセイをインビトロで実施する方法であって、
ニューロンまたはニューロンの群を、無細胞神経移植片セグメントの第1の端部に付着させて、試験構築物を形成し、
前記ニューロンまたはニューロンの群が前記無細胞神経移植片セグメントへと神経が突起成長する期間にわたって、前記試験構築物を培地で培養し、
突起成長神経組織に関連する、1以上の末梢神経組織の長さまたは標的タンパク質の量もしくは標的タンパク質のためのmRNAの量、の少なくとも1つに基づき前記突起成長神経組織の量を決定するために、前記試験構築物の分析をし、
前記決定された突起成長神経組織の量に少なくとも部分的に基づいて、前記無細胞神経移植片セグメントの有効性を判断する
ことを含む、
神経移植片のバイオアッセイをインビトロで実施する方法。 - 前記突起成長神経組織の量が、前記突起成長神経組織に関連する、1以上の末梢神経組織の長さと、前記標的タンパク質の量または前記標的タンパク質のためのmRNAの量とに基づいて決定される、
請求項1に記載の方法。 - 前記突起成長神経組織の量が、前記突起成長神経組織に関連する2以上の末梢神経組織の長さに基づいて決定される、
請求項1に記載の方法。 - 前記突起成長神経組織の量が、1以上の末梢神経組織の長さに少なくとも基づいて決定され、
前記試験構築物の分析工程は、
細切用の前記試験構築物を準備することと、
前記試験構築物を複数の細片にそれぞれ細切することであって、前記複数の細片の各々が、前記第1の端部に垂直な前記無細胞神経移植片セグメントの側面から所定の距離で長手方向に除去される、ことと、
各細片を1種類以上の染料で染色することと、
を含む、
請求項1または2に記載の方法。 - 細切用の前記試験構築物の準備工程が、前記試験構築物を固定し、前記試験構築物をパラフィン包埋することを含む、
請求項4に記載の方法。 - 前記1種類以上の染料の1つの染料が、βIII-チューブリン、PGP9.5およびS100抗体からなる群から選択される、
請求項4に記載の方法。 - 前記突起成長神経組織の量が、1以上の末梢神経組織の長さに少なくとも基づいて決定され、
前記試験構築物の分析工程が、
拡散テンソル画像により、前記試験構築物の全てまたは一部を解析し、前記突起成長神経組織を識別するトラクトグラフィー画像を生成し、
前記突起成長神経組織の量を前記トラクトグラフィー画像により定量化する
ことを含む、
請求項1または2に記載の方法。 - 前記ニューロンまたはニューロンの群が、後根神経節(DRG)外植片である、
請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。 - 前記試験構築物の分析工程が、前記突起成長神経組織に関連する前記標的タンパク質の量を求めて評価することを含む、
請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記標的タンパク質が、βIII-チューブリン、S100およびGAP-43からなる群から選択される、
請求項9に記載の方法。 - 前記突起成長神経組織が、神経突起またはシュワン細胞である、
請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ニューロンまたはニューロンの群を前記神経移植片セグメントに付着させる前に、前記無細胞神経移植片セグメントを不動態化することをさらに含む、
請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。 - 前記培養期間が、約3日間~約7日間である、
請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ニューロンまたはニューロンの群の前記無細胞神経移植片セグメントへの付着工程が、前記ニューロンまたはニューロンの群を、コラーゲンゲルにより前記無細胞神経移植片セグメントに固定することを含む、
請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。 - 前記無細胞神経移植片セグメントが、ヒト組織から採取されたものである、
請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。 - 前記無細胞神経移植片セグメントが、動物組織から採取されたものである、
請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
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