JP6971975B2 - 神経培養システム - Google Patents
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Description
本出願は、その全内容が本明細書に組み込まれる2015年5月28日出願の米国一部継続特許出願第14/724,365号の優先権を主張する。
βIII−チューブリン抗体染色のある種類は、TU−20である。TU−20は、ヒト由来のβIII−チューブリンのアミノ酸441−448に対するマウスモノクローナルIgG1である。
タンパク質遺伝子生成物(PGP9.5)は、ニューロン特異的エノラーゼとは、構造的および免疫学的に異なるニューロン特異的タンパク質である。標準的な免疫組織化学によれば、他の体細胞と同様に、多くの神経内分泌細胞における、中枢および抹消神経系のあらゆるレベルで、ニューロンおよび神経繊維でPGP9.5の存在が示された。この抗体は、ニューロンのマーカーとして価値のあるものである。
S100タンパク質は、脊椎動物に存在する低分子量タンパク質の系列であり、ヘリクス−ループ−ヘリクス配座を有する2つのカルシウム結合部位という特徴を持つ。S100タンパク質は、通常、神経堤から誘導される細胞、例えば、シュワン細胞およびメラノサイトに存在する。S100抗体染色は、通常のヒトシュワン細胞の存在を示すものである。
実験を行って、バイオアッセイ方法の能力を判断して、神経移植片の量を評価し、かつ/または組織標本の作製、染色および細切を含む実施形態における試験条件の影響を評価した。場合によっては、予備実験も行って、あるバイオアッセイパラメータの特性を改善した。例えば、陽性および陰性対照、不動態化技術、培養条件ならびに組織標本作製および染色技術について評価および試験した。本技術の利点を、実験結果により例証する。実験の詳細を後述する。実施例および実験は、本技術を限定するものではない。
図2は、試験構築物の免疫組織化学分析を含む実験に用いられる特定の材料および関連の方法の図を示す。図2に示すとおり、陽性または陰性対照を除く実験の方法フローには、概して、神経移植片を固定させるセグメントへと切断し(200)、各セグメントを標準または不動態化培地で処理し(210)、DRGをセグメントに付着(affix)させて、試験試料を作製し(220)、試料を培地中で培養し(230)、試料を固定、および様々な組織の高さで長手方向に細切し(240)、細片をスライドに置き、1種類以上の染料を適用し(250)、神経組織の突起成長を測定する(260)ことが含まれる。
バイオアッセイ信号(すなわち、移動距離/突起成長量)を増やす手段として培養時間および培地290の神経栄養因子内容を変えてみた。培養は、B27、グルタミン、抗生物質/抗真菌薬を補充したニューロバーサル媒地から誘導された化学的に定義された培地290で行った。「標準」培養では、培地290中25ng/mlの神経成長因子(NGF)を用いた。
培養後、組織標本の細切および染色用の全試料を準備した。全試料をパラフィン包埋し、長手方向に細切した(例えば、291)。予備実験で、厚さ4μmまたは8μmの細片を用いて、パラフィンベースの組織学的処理を行った。細片を、高さ200(高さ1)、400(高さ2)、600(高さ3)および800(高さ4)ミクロンで試料から採取した。
陽性対照を用いて、神経移植片セグメントで用いたのと同じ培養条件下であるが、神経移植片は用いない分析で用いたDRGの生存率を実証した。
不動態化は、生理活性の減じた神経移植片を作製して、バイオアッセイが、移植片の生理活性を測定することをさらに実証するものである。概して、不動態化により、神経移植片への神経突起/シュワン細胞の突起成長が減じる。実験結果の分析によれば、不動態化試料と不動態化処理していない試料には測定可能な差が示されており、バイオアッセイの妥当性を確認する補助となる。
βIII−チューブリンを用いて染色を行って、神経突起成長を示し、S100を用いて、試料中のシュワン細胞の存在と位置を示した。全体として、βIII−チューブリンスライドの染色品質は分析で許容されるものであった。
Claims (20)
- 内面にラミニンを含む神経内膜管の足場を有する無細胞神経移植片のバイオアッセイをインビトロで実施する方法であって、
ニューロンまたはニューロンの群を、前記無細胞神経移植片における無細胞神経移植片セグメントの第1の端部に付着させて、試験構築物を形成し、
前記ニューロンまたは前記ニューロンの群が前記無細胞神経移植片セグメントへと神経が突起成長する期間にわたって、前記試験構築物を培地で培養し、
突起成長神経組織の量が示されるように、前記試験構築物の分析をし、
前記分析から導出される測定基準から前記無細胞神経移植片の有効性を判断する
ことを含み、
前記試験構築物の分析工程は、
前記ニューロンまたは前記ニューロンの群から前記無細胞神経移植片セグメントへと伸びる少なくとも3つの最長の突起成長神経組織を特定し、
前記ニューロンまたは前記ニューロンの群が付着された前記無細胞神経移植片セグメントの前記第1の端部から、前記無細胞神経移植片セグメントの前記少なくとも3つの最長の突起成長神経組織のそれぞれの端部までの長さを測定し、
前記少なくとも3つの最長の突起成長神経組織の測定された長さを平均化する
ことを含む、
神経移植片のバイオアッセイを実施する方法。 - 前記試験構築物の分析工程は、さらに、
細切用の前記試験構築物を準備し、
所定の距離で長手方向に、垂直側面から前記第1の端部へと採取されるように、前記試験構築物を複数の細片にそれぞれ細切し、
前記複数の細片の各細片を1種類以上の染色方法で染色して、前記突起成長神経組織を前記ニューロンまたは前記ニューロンの群から識別する
ことを含む、
請求項1に記載の方法。 - 細切用の前記試験構築物の準備工程が、前記試験構築物を固定し、前記試験構築物をパラフィン包埋することを含む、
請求項2に記載の方法。 - 前記1種類以上の染色方法の1つが、βIII−チューブリン抗体染色、PGP9.5抗体染色およびS100抗体染色からなる群から選択される、
請求項2に記載の方法。 - 前記試験構築物の分析工程が、さらに、
拡散テンソル画像により、前記試験構築物の全てまたは一部を解析し、前記突起成長神経組織を識別するトラクトグラフィー画像を生成し、
前記突起成長神経組織の量を前記トラクトグラフィー画像により定量化する
ことを含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記ニューロンまたは前記ニューロンの群が、後根神経節(DRG)外植片である、
請求項1に記載の方法。 - 前記試験構築物の分析工程が、さらに、前記突起成長神経組織に関連する標的タンパク質の量を求めて評価することを含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記標的タンパク質が、βIII−チューブリン、S100およびGAP−43からなる群から選択される、
請求項7に記載の方法。 - 前記突起成長神経組織が、神経突起またはシュワン細胞である、
請求項1に記載の方法。 - 前記ニューロンまたは前記ニューロンの群を前記無細胞神経移植片セグメントに付着させる前に、前記無細胞神経移植片セグメントを不動態化することをさらに含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記培養期間が、約3日〜約7日間である、
請求項1に記載の方法。 - 前記ニューロンまたは前記ニューロンの群の前記無細胞神経移植片セグメントへの付着工程が、前記ニューロンまたは前記ニューロンの群を、コラーゲンゲルにより前記無細胞神経移植片セグメントに固定することを含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記無細胞神経移植片セグメントが、無細胞の処理済み神経同種移植から採取される、
請求項1に記載の方法。 - 研究プロトコルに従って、内面にラミニンを含む神経内膜管の足場を有する無細胞神経移植片の無細胞神経移植片セグメントを処理し、
ニューロンまたはニューロンの群を前記処理された無細胞神経移植片セグメントの第1の端部に付着させ、試験構築物を形成し、
前記ニューロンまたは前記ニューロンの群が前記無細胞神経移植片セグメントへ神経突起成長する期間にわたって、培地で前記試験構築物を培養し、
突起成長神経組織の量が示されるように、前記試験構築物の分析を実施し、
前記分析から導出された1つ以上の分析測定基準を、前記研究プロトコルによる処理がされていない神経移植片セグメントから求められた1つ以上の対照測定基準と比較することにより、前記研究プロトコルの影響を判断する、ことを含み、
前記試験構築物の分析工程は、
前記ニューロンまたは前記ニューロンの群から前記無細胞神経移植片セグメントへと伸びる少なくとも3つの最長の突起成長神経組織を特定し、
前記ニューロンまたは前記ニューロンの群が付着された前記無細胞神経移植片セグメントの前記第1の端部から、前記無細胞神経移植片セグメントの前記少なくとも3つの最長の突起成長神経組織のそれぞれの端部までの長さを測定し、
前記少なくとも3つの最長の突起成長神経組織の測定された長さを平均化する
ことを含む、
条件が神経突起成長に与える影響を試験する方法。 - 前記研究プロトコルが、
試験化合物を含む溶液に、前記無細胞神経移植片セグメントを浸漬する、
前記無細胞神経移植片セグメントに放射線または熱を与える、
前記無細胞神経移植片セグメントに突起成長抑制剤を与える、
前記無細胞神経移植片セグメントのミクロ構造またはマクロ構造に機械的に修飾する、
前記無細胞神経移植片セグメントに突起成長促進剤を与える、
前記無細胞神経移植片セグメントに電場を与える、および
前記無細胞神経移植片セグメントに幹細胞もしくはシュワン細胞を播種する、
の1つ以上を含む、
請求項14に記載の方法。 - 前記突起成長抑制剤が、
タンパク質を分解する薬剤、
前記無細胞神経移植片セグメントの前記ミクロ構造または前記マクロ構造を破壊する薬剤、
前記無細胞神経移植片セグメントの化学構造に修飾する材料、および
機能性ブロック抗体
からなる群から選択される、
請求項15に記載の方法。 - 前記試験構築物の分析が、
拡散テンソル画像により、前記試験構築物の全てまたは一部を解析し、前記突起成長神経組織を識別するトラクトグラフィー画像を生成し、
前記突起成長神経組織の量が、前記トラクトグラフィー画像により定量化される
ことを含む、
請求項14に記載の方法。 - 前記ニューロンまたは前記ニューロンの群が、後根神経節(DRG)である、
請求項14に記載の方法。 - 前記突起成長神経組織が、神経突起またはシュワン細胞である、
請求項14に記載の方法。 - 前記無細胞神経移植片セグメントが、無細胞の処理済み神経同種移植から採取される、
請求項14に記載の方法。
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