JP2022520459A - ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトを特徴づけるための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒト又は動物用途の医療用製品をインビトロでテストするのに使用可能である、少なくとも１つの機能的且つ好ましくは連続的な細胞層で内側が覆われた管腔の少なくとも１つの部分を有するスキャフォールドを含む、ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトを特徴づけるための方法に関する。特に、前記特徴づけ方法は、ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトに含まれる細胞の生存性、形態、機能性、及び／又は分布について、その検証を可能にする。更に、本発明は、前記方法によって特徴づけられたティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクト、及び前記ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトによってヒト又は動物用途の医療用製品をインビトロでテストするための方法に関する。
Description
本発明は、ヒト又は動物用途の医療用製品をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でテストするのに使用可能である、少なくとも１つの機能的且つ好ましくは連続的な細胞層で内側が覆われた管腔の少なくとも１つの部分を有するスキャフォールドを含む、ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトを特徴づけるための方法に関する。特に、前記特徴づけ方法は、ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトに含まれる細胞の生存性、形態、機能性、及び／又は分布について、その検証を可能にする。更に、本発明は、前記方法によって特徴づけられたティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクト、及び前記ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトによってヒト又は動物用途の医療用製品をインビトロでテストするための方法に関する。
医療用製品の開発は長きにわたるプロセスを必要とすることが公知である。本発明の文脈において、医療用製品という表現が、ヒト及び動物の両方を対象とする医学的用途の任意の製品、例えば薬物若しくは医療機器、又はその組み合わせ等を示すのに使用される。基本的に、医療用製品開発プロセスにおいては、ヒト又は動物を対象として製品を使用する前に、医療用製品の生物学的安全性、有効性を評価し、またその使用に関係する潜在的問題を予測するために、医療用製品が接触することとなる組織に対する効果の種類を決定する必要がある。
今日、医療用製品の生物学的安全性及び有効性の評価は、最終的な使用条件に関して、特にヒトとは有意に異なる動物モデルを対象とするインビトロ、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）、及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのテストに基づく。そのような相違は、心血管領域及び末梢血管領域、例えば心臓弁、ステント、グラフト、カテーテル、包帯、ネット、又はフィルター等においてその使用を提供する、ヒト又は動物用途の医療用製品を評価するときに更に観察され得る。実際のところ、医療用製品の生物学的安全性及び有効性を立証できるように、血管組織や血液と、ヒト又は動物用途の医療用製品との相互作用を評価することは重要であり、また現在使用されているモデルでは、解剖学／構造の両面において、及び血液組成に関して重大な制約及び欠点が明らかである。
それに加えて、動物を対象としたインビボ又はエクスビボでのテストは、バイオメディカルテストにおける白熱した諸説紛々たる議論の中核をなしている。
今日、医療用製品の生物学的安全性及び有効性の評価は、最終的な使用条件に関して、特にヒトとは有意に異なる動物モデルを対象とするインビトロ、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）、及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのテストに基づく。そのような相違は、心血管領域及び末梢血管領域、例えば心臓弁、ステント、グラフト、カテーテル、包帯、ネット、又はフィルター等においてその使用を提供する、ヒト又は動物用途の医療用製品を評価するときに更に観察され得る。実際のところ、医療用製品の生物学的安全性及び有効性を立証できるように、血管組織や血液と、ヒト又は動物用途の医療用製品との相互作用を評価することは重要であり、また現在使用されているモデルでは、解剖学／構造の両面において、及び血液組成に関して重大な制約及び欠点が明らかである。
それに加えて、動物を対象としたインビボ又はエクスビボでのテストは、バイオメディカルテストにおける白熱した諸説紛々たる議論の中核をなしている。
血管のティッシュエンジニアリング業界において、例えばティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトの業界等において、主に内皮細胞（ＥＣ）からなる、機能的且つ好ましくは連続的な内皮（すなわち、コフルエント細胞の単層を有する）を生成できることが重要であることは公知である。
例えば、前記組織又はコンストラクトが埋め込まれたら、血栓症及び狭窄を予防する等のために、機能的且つ好ましくは連続的な内皮を生成することが、工学的に作出された血管組織又はコンストラクトのしかるべき有効性及び安全性を保証する上で重要な因子となる。
例えば、前記組織又はコンストラクトが埋め込まれたら、血栓症及び狭窄を予防する等のために、機能的且つ好ましくは連続的な内皮を生成することが、工学的に作出された血管組織又はコンストラクトのしかるべき有効性及び安全性を保証する上で重要な因子となる。
機能的且つ好ましくは連続的な細胞層を有する工学的に作出された血管コンストラクト又は組織、好ましくは内皮細胞（例えば、血管内皮）のインビトロでの生成は、要するに、下記の工程：
－ スキャフォールドの管腔内に内皮細胞を播種し、そしてその接着を後続させる工程、その後に
－ 機能的且つ好ましくは連続的な内皮細胞の１つ又は複数の層が取得されるまで、内皮細胞を、それが受ける機械的刺激（例えば、液体の流れ等）の関数として増殖／繁殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及び組織化させる工程、及び適宜、
－ 形成される又は形成された前記細胞の１つ又は複数の層を特徴づける工程
を含む。
－ スキャフォールドの管腔内に内皮細胞を播種し、そしてその接着を後続させる工程、その後に
－ 機能的且つ好ましくは連続的な内皮細胞の１つ又は複数の層が取得されるまで、内皮細胞を、それが受ける機械的刺激（例えば、液体の流れ等）の関数として増殖／繁殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及び組織化させる工程、及び適宜、
－ 形成される又は形成された前記細胞の１つ又は複数の層を特徴づける工程
を含む。
播種段階では、スキャフォールドの管腔において、細胞、好ましくは内皮細胞の均一な播種を可能にし、スキャフォールドに対する細胞の均質な接着及び播種効率の一般的増加を可能にする技術を使用することが重要である。細胞、好ましくは内皮細胞の増殖を刺激及び促進するのに使用される方法と同様に、細胞、例えば内皮細胞の１つ又は複数の機能的且つ好ましくは連続的な層を取得するために、播種後にそれを組織化させることも同じく重要である。
従って、機能的且つ好ましくは連続的な細胞層（例えば、内皮）を有する工学的に作出された血管組織又はコンストラクトを生み出すために、（ｉ）スキャフォールド内の気泡を除去しつつ、内皮細胞の均質且つ均一な接着を確実にすることができる、スキャフォールドの管腔内に細胞、主に内皮細胞を播種するための方法；並びに／又は（ｉｉ）産生システムにおける滅菌性及び気泡不存在の維持を確実にすることができる、細胞、主に内皮細胞の増殖／繁殖、及び組織化を刺激するための方法（例えば、潅流法）を開発する必要性が感じられる。
工学的に作出された心血管系組織又はコンストラクトを生成するために、特に細胞を播種し、そして細胞の増殖／繁殖及び組織化を刺激するために、先行技術で使用されている様々な技術が存在するが、しかしながら、これまでに達成された結果は全体として満足の行くものではない。
最後に、播種方法、並びにスキャフォールドの管腔内に接着した細胞の生存性、形態、機能性、及び組織化、並びに均一、均質で、機能的且つ好ましくは連続的な細胞層（例えば、内皮）の後続する生成を実証することができる好適な特徴づけ方法によって、選択された増殖及び細胞の組織化を刺激するための方法の有効性を判断できるようにする必要性が感じられる。
前記特徴づけ方法は、細胞の発達及びスキャフォールドへの細胞の接着に障害をもたらさないことを原則としなければならない。換言すれば、前記特徴づけ方法は、増殖中又は形成後の細胞層（例えば、内皮）の喪失を引き起こすおそれのある細胞変化を引き起こしてならない。
前記特徴づけ方法は、細胞の発達及びスキャフォールドへの細胞の接着に障害をもたらさないことを原則としなければならない。換言すれば、前記特徴づけ方法は、増殖中又は形成後の細胞層（例えば、内皮）の喪失を引き起こすおそれのある細胞変化を引き起こしてならない。
研究室及び工業レベルで、前記工学的に作出された血管コンストラクト又は組織を生成及び特徴づけるためには、特にＧＬＰ（医薬品安全性試験実施基準）認可された組織又はコンストラクトエンジニアリングラボ又は業界にとって、前記特徴づけ方法、前記播種方法及び接着方法、並びに細胞増殖及び組織化を刺激するための前記方法は、単純、迅速（オペレーターを問わず）であり、高度の再現性、信頼性を有し、且つ有効でなければならない。
最後に、実験動物の使用を回避するために、先進的な前臨床又は臨床テストを実施するための、機能的且つ好ましくは連続的な細胞層（例えば、内皮）を含む、インビトロで工学的に作出された血管組織又はコンストラクトの開発及び特徴づけが可能であることが必要と感じられる。
上記要件を満たすため、長期にわたり集中した研究及び開発活動を行った後に、本出願者は、ヒト又は動物用途の医療用製品をインビトロでテストするのに使用可能であり、添付の特許請求の範囲において主張されるような特性を有する、ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトを特徴づけるための方法を開発した。特に、前記特徴づけ方法は、ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトについて、そのスキャフォールドの管腔に接着した細胞又は細胞層の生存性、形態、機能性、分布、及び／又はその他の特性を検証可能にする。
本発明の方法は、現在利用可能な方法の限界を克服できるようにし、また動物モデルの使用に対して有効な代替案を提供する。
本発明の好ましい実施形態は、下記の発明を実施するための形態から明らかになろう。
図１～図３２が本明細書において後記される。
本発明の文脈において、ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトという表現が、少なくとも１つの機能的且つ好ましくは連続的な細胞の層、好ましくは内皮細胞、すなわちコフルエント細胞の単層（例えば、機能的且つ連続的な内皮）で内面が覆われた管腔を有するスキャフォールドを示すのに使用される。
本発明の文脈において、工学的に作出された血管組織及びティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトという用語は、交換可能に使用される。
本発明の文脈において、工学的に作出された血管組織及びティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトという用語は、交換可能に使用される。
本発明の文脈において、スキャフォールドという表現が、細胞（この場合、内皮細胞）の接着及び増殖を促進することができる生体適合性多孔性ポリマー媒体を示すのに使用される。
本発明の文脈において、機能的内皮という表現が、生理学的に類似した挙動を有する内皮を示すのに使用され、その場合、内皮細胞は相互に隣接し、スキャフォールドに接着し、そして内皮細胞に固有のマーカー、例えばフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）、表面抗原分類３１（ＣＤ３１）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ－１）等を発現している。更に、連続的な内皮という表現が、コフルエント細胞（例えば、少なくとも９０％）の単層を有する内皮を示すのに使用される。
本発明の文脈において、内皮、好ましくは血管組織の内皮を構成する細胞は、内皮細胞として定義される。
本発明の文脈において、細胞の各種類に対して固有の細胞増殖維持液が、増殖培地として定義される。例えば、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、コード２００－０５ｎ）内皮細胞の場合、使用可能である増殖培地は、内皮増殖培地（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＥＧＭとして省略、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、コード２１１－５００）であり得る。ＥＧＭは、ウシ胎仔血清（２％）、アデニン（０．２μｇ／ｍｌ）、メタバナジン酸アンモニウム（０．０００６μｇ／ｍｌ）、アンホテリシンＢ（０．３μｇ／ｍｌ）、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ（３００μｇ／ｍｌ）、塩化コリン（２０μｇ／ｍｌ）、硫酸銅・５Ｈ２Ｏ（０．００２μｇ／ｍｌ）、トリオプト酸（ｔｒｉｏｐｔｉｃ ａｃｉｄ）ＤＬ－６．８（０．００３μｇ／ｍｌ）、フォリン酸（カルシウム）（０．６μｇ／ｍｌ）、ヘパリン（４μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（２μｇ／ｍｌ）、Ｌ－アスパラギン酸（１５μｇ／ｍｌ）、Ｌ－システイン（３０μｇ／ｍｌ）、Ｌ－チロシン（２０μｇ／ｍｌ）、硫酸マンガン一水和物（０．０００２μｇ／ｍｌ）、モリブデン酸アンモニウム・４Ｈ２Ｏ（０．００４μｇ／ｍｌ）、ニコチンアミド（８μｇ／ｍｌ）、塩化ニッケル・６Ｈ２Ｏ（０．０００１μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（６０μｇ／ｍｌ）、フェノールレッドナトリウム塩（１５μｇ／ｍｌ）、塩化カリウム（３００μｇ／ｍｌ）、プトレシンジヒドロクロリド（０．０００２μｇ／ｍｌ）、塩酸ピリドキシン（３μｇ／ｍｌ）、メタケイ酸ナトリウム・９Ｈ２Ｏ（３μｇ／ｍｌ）、硫酸ナトリウム・７Ｈ２Ｏ（２００μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（０．０１μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン硫酸塩（１００μｇ／ｍｌ）、塩酸チアミン（４μｇ／ｍｌ）、及び硫酸亜鉛・７Ｈ２Ｏ（０．０００３μｇ／ｍｌ）を含有する。新鮮増殖培地は、これまでに使用されたことのない、製造業者により直接供給された滅菌培地である。高温の増殖培地という表現が、２０℃～４５℃の範囲に含まれる温度、好ましくは３７℃で予め加熱された増殖培地を示すのに使用される。
ヒト又は動物用途の医療用製品をインビトロでテストするのに使用可能である、少なくとも１つの機能的細胞層で内面が覆われた管腔の少なくとも１つの部分を有するスキャフォールドを含む、ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトを特徴づけるための方法（以後、本発明の特徴づけ方法）が本発明の目的をなし、前記方法は、
－ バイオリアクター（図３、１１）－スキャフォールド（図２、２１）システムを取得するために、バイオリアクター（１１）のチャンバー内でスキャフォールド（２１）を調製する工程Ｉ、その後に
－ 前記スキャフォールド（２１）の管腔の少なくとも１つの部分に細胞培養物を播種し、及びスキャフォールド（２１）に対する前記細胞の接着を可能にして、播種済みのバイオリアクター（１１）－スキャフォールド（２１）システムを取得するための播種方法を適用する工程ＩＩ、その後に
－ 機能的細胞の少なくとも１つの層が形成されるまで、前記細胞の増殖及び組織化を刺激する工程ＩＩＩ、その後又はそれと同時に
－ スキャフォールド（２１）の管腔に前記接着した細胞を、その生存性、形態、機能性、分布、及び／若しくは当業者にとって公知であるその他の特性を検証するために特徴づける工程ＩＶ
を含む。
－ バイオリアクター（図３、１１）－スキャフォールド（図２、２１）システムを取得するために、バイオリアクター（１１）のチャンバー内でスキャフォールド（２１）を調製する工程Ｉ、その後に
－ 前記スキャフォールド（２１）の管腔の少なくとも１つの部分に細胞培養物を播種し、及びスキャフォールド（２１）に対する前記細胞の接着を可能にして、播種済みのバイオリアクター（１１）－スキャフォールド（２１）システムを取得するための播種方法を適用する工程ＩＩ、その後に
－ 機能的細胞の少なくとも１つの層が形成されるまで、前記細胞の増殖及び組織化を刺激する工程ＩＩＩ、その後又はそれと同時に
－ スキャフォールド（２１）の管腔に前記接着した細胞を、その生存性、形態、機能性、分布、及び／若しくは当業者にとって公知であるその他の特性を検証するために特徴づける工程ＩＶ
を含む。
ヒト又は動物用途の医療用製品をインビトロでテストするのに使用可能である、少なくとも１つの機能的細胞層で内面が覆われた管腔の少なくとも１つの部分を有するスキャフォールドを含む、ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトを特徴づけるための方法（以後、本発明の特徴づけ方法）が本発明の目的をなし、前記方法は、
－ バイオリアクター１１－スキャフォールド２１システムを取得するために、バイオリアクター１１のチャンバー内でスキャフォールド２１を調製する工程Ｉ、その後に
－ 前記スキャフォールド２１の管腔の少なくとも１つの部分に細胞培養物を播種し、及びスキャフォールド２１に対する前記細胞の接着を可能にして、播種済みのバイオリアクター１１－スキャフォールド２１システムを取得するための播種方法を適用する工程ＩＩ、その後に
－ スキャフォールド２１の管腔の少なくとも１つの部分に接着した機能的細胞の少なくとも１つの層が形成されるまで、スキャフォールド２１の管腔内の前記播種された細胞の増殖及び組織化を刺激する工程ＩＩＩ、その後又はそれと同時に
－ スキャフォールド２１の管腔の少なくとも１つの部分の内面を覆う前記細胞を、その生存性、形態、機能性、分布、及び／若しくは当業者にとって公知であるその他の特性について検証するために特徴づける工程ＩＶ
を含み、
但し、スキャフォールド（２１）の管腔の少なくとも１つの部分の内面を覆う前記細胞を特徴づける工程ＩＶは、機能的細胞の少なくとも１つの層を形成する工程ＩＩＩの期間中に細胞に適用される少なくとも１つの非破壊的方法、及び／又は機能的細胞の少なくとも１つの層を形成する工程ＩＩＩ完了時に適用される少なくとも１つの非破壊的方法を含む。
－ バイオリアクター１１－スキャフォールド２１システムを取得するために、バイオリアクター１１のチャンバー内でスキャフォールド２１を調製する工程Ｉ、その後に
－ 前記スキャフォールド２１の管腔の少なくとも１つの部分に細胞培養物を播種し、及びスキャフォールド２１に対する前記細胞の接着を可能にして、播種済みのバイオリアクター１１－スキャフォールド２１システムを取得するための播種方法を適用する工程ＩＩ、その後に
－ スキャフォールド２１の管腔の少なくとも１つの部分に接着した機能的細胞の少なくとも１つの層が形成されるまで、スキャフォールド２１の管腔内の前記播種された細胞の増殖及び組織化を刺激する工程ＩＩＩ、その後又はそれと同時に
－ スキャフォールド２１の管腔の少なくとも１つの部分の内面を覆う前記細胞を、その生存性、形態、機能性、分布、及び／若しくは当業者にとって公知であるその他の特性について検証するために特徴づける工程ＩＶ
を含み、
但し、スキャフォールド（２１）の管腔の少なくとも１つの部分の内面を覆う前記細胞を特徴づける工程ＩＶは、機能的細胞の少なくとも１つの層を形成する工程ＩＩＩの期間中に細胞に適用される少なくとも１つの非破壊的方法、及び／又は機能的細胞の少なくとも１つの層を形成する工程ＩＩＩ完了時に適用される少なくとも１つの非破壊的方法を含む。
工程Ｉ～ＩＶ（並びに適宜、工程Ｉ．１、ＩＩ．１～ＩＩ．２、ＩＩ．１～ＩＩ．４、ＩＩ．１～ＩＩ．９、ＩＩＩ．１～ＩＩＩ．３、２．１～２．１１、及び／又は３．１～３．１３）を含む、本発明による特徴づけ方法の一実施形態によれば、前記スキャフォールドの管腔の少なくとも１つの部分の内側を覆う細胞は、血管組織の内皮を構成する細胞の中から選択され；好ましくはＨＡＯＥＣ（ヒト大動脈内皮細胞）、ＨＣＡＥＣ（ヒト冠動脈内皮細胞）、ＨＭＶＥＣ（ヒト皮膚微小血管内皮細胞）、及びＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の中から選択される内皮細胞である。
工程Ｉ～ＩＶ（並びに適宜、工程Ｉ．１、ＩＩ．１～ＩＩ．２、ＩＩ．１～ＩＩ．４、ＩＩ．１～ＩＩ．９、ＩＩＩ．１～ＩＩＩ．３、２．１～２．１１、及び／又は３．１～３．１３）を含む、本発明による特徴づけ方法の一実施形態によれば、前記スキャフォールドの管腔は、少なくとも１つの機能的且つ連続的な細胞層、好ましくはコフルエント細胞を有する機能的且つ連続的な内皮細胞の単層（すなわち、機能的且つ連続的な内皮）で、少なくとも部分的に内側が覆われている。
工程Ｉ～ＩＶ（並びに適宜、工程ＩＩ．１～ＩＩ．２、ＩＩ．１～ＩＩ．４、ＩＩ．１～ＩＩ．９、ＩＩＩ．１～ＩＩＩ．３、２．１～２．１１、及び／又は３．１～３．１３）を含む、本発明による特徴づけ方法の一実施形態によれば、スキャフォールドを調製する前記工程Ｉは、
Ｉ．１：バイオリアクター（１１）－スキャフォールド（２１）システムを取得するために、バイオリアクターチャンバー（１１）内にスキャフォールド（２１）を取り付ける工程を含む。好ましくは、スキャフォールドホルダー（図１、１３、１３ａ、１３ｂ）のグリップ上にスキャフォールド（２１）を取り付ける工程、及びスキャフォールド（２１）を含む前記スキャフォールドホルダー（１３、１３ａ、１３ｂ）を、バイオリアクターチャンバー（１１）内に収容する工程。バイオリアクターの両端部（上流及び下流）には、ロータリーコネクター（図４；ＣＲ１、ＣＲ２）及びＴ字コネクター（図４；Ｔ２、Ｔ３）が適用される。
Ｉ．１：バイオリアクター（１１）－スキャフォールド（２１）システムを取得するために、バイオリアクターチャンバー（１１）内にスキャフォールド（２１）を取り付ける工程を含む。好ましくは、スキャフォールドホルダー（図１、１３、１３ａ、１３ｂ）のグリップ上にスキャフォールド（２１）を取り付ける工程、及びスキャフォールド（２１）を含む前記スキャフォールドホルダー（１３、１３ａ、１３ｂ）を、バイオリアクターチャンバー（１１）内に収容する工程。バイオリアクターの両端部（上流及び下流）には、ロータリーコネクター（図４；ＣＲ１、ＣＲ２）及びＴ字コネクター（図４；Ｔ２、Ｔ３）が適用される。
本発明の文脈において、バイオリアクター－スキャフォールドシステムという用語が、バイオリアクター及びスキャフォールドアセンブリ（図３；１１、２１）、好ましくはバイオリアクター内に、例えばスキャフォールドホルダーに収容及び固定されている、実質的に管状形状のスキャフォールドを示すのに使用される。スキャフォールドは、滅菌されたテフロンテープを用いてスキャフォールドを保護した後、自己緊結性ストリップ（ｓｅｌｆ－ｆａｓｔｅｎｉｎｇ ｓｔｒｉｐ）を備えたスキャフォールドホルダー（スキャフォールドの潅流を可能にするために内部が中空である）のグリップによって掴むことができる。バイオリアクターチャンバーの上流側インレット（図４；ＣＲ１、４１）がスキャフォールドの端部（図４；１３ａ）と合致し、且つバイオリアクターチャンバーの下流側開口部（図４；ＣＲ２、４２）がスキャフォールドの他方の端部（図４；１３ｂ）と合致するように、スキャフォールドホルダー（１３）がバイオリアクター１１中に挿入される。このように、スキャフォールド（２１）は、スキャフォールドホルダーにより生成される潅流経路に関して完全に同軸上にある。バイオリアクター内に取り付けられるスキャフォールドの方向を定める際の基準となるより長い軸は、縦軸として定義される。
本発明のスキャフォールド（２１）は、合成又は天然起源のポリマー性スキャフォールドであり、そして１つのポリマーのみ、又はコポリマー（一連のポリマー）、例えば静電紡糸型絹フィブロイン（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ）、又はＰＧＡ／ＰＬＡ（ポリグリコール酸／ポリ乳酸）若しくはＰＧＡ／ＰＣＬ（ポリグリコール酸／ポリカプロラクトン）コポリマー等から構成される。
好ましくは、本発明のスキャフォールドは、実質的に管状形状の静電紡糸型絹フィブロインからなる。
本発明のスキャフォールド（２１）は、合成又は天然起源のポリマー性スキャフォールドであり、そして１つのポリマーのみ、又はコポリマー（一連のポリマー）、例えば静電紡糸型絹フィブロイン（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ）、又はＰＧＡ／ＰＬＡ（ポリグリコール酸／ポリ乳酸）若しくはＰＧＡ／ＰＣＬ（ポリグリコール酸／ポリカプロラクトン）コポリマー等から構成される。
好ましくは、本発明のスキャフォールドは、実質的に管状形状の静電紡糸型絹フィブロインからなる。
工程Ｉ～ＩＶ（並びに適宜、工程Ｉ．１、ＩＩＩ．１～ＩＩＩ．３、２．１～２．１１、及び／又は３．１～３．１３）を含む本発明による特徴づけ方法の一実施形態によれば、工程ＩＩに含まれる前記播種方法は、
ＩＩ．１：前記細胞培養物、好ましくは内皮細胞を、新鮮増殖培地及び細胞、好ましくは内皮細胞を含む細胞懸濁物の形態で、ロータリーコネクター（図１０、ＣＲ１）によってバイオリアクター（１１）の上流に配置されているＴ字コネクター（図１０、Ｔ２）上に取り付けられたコンテナ（図１０、９１）内に放出する工程；その後に
ＩＩ．２：流体速度によって、前記細胞懸濁物が気泡を生成することなくＴ字コネクター（Ｔ２）中に滴下され、そしてスキャフォールド（２１）の管腔内部に存在する気泡が、バイオリアクター（１１）の下流に配置されたＴ字コネクター（図１０、Ｔ３）の開口部に向かって押し出され、その流出が可能となるように、定常流を用いながら、前記細胞培養物、好ましくは内皮細胞を、バイオリアクター（１１）内に存在するスキャフォールド（２１）の管腔内部に放出する工程
を含む。前記コンテナ（図１０、９１）は、シリンジ等の中空の部分であり得る。
ＩＩ．１：前記細胞培養物、好ましくは内皮細胞を、新鮮増殖培地及び細胞、好ましくは内皮細胞を含む細胞懸濁物の形態で、ロータリーコネクター（図１０、ＣＲ１）によってバイオリアクター（１１）の上流に配置されているＴ字コネクター（図１０、Ｔ２）上に取り付けられたコンテナ（図１０、９１）内に放出する工程；その後に
ＩＩ．２：流体速度によって、前記細胞懸濁物が気泡を生成することなくＴ字コネクター（Ｔ２）中に滴下され、そしてスキャフォールド（２１）の管腔内部に存在する気泡が、バイオリアクター（１１）の下流に配置されたＴ字コネクター（図１０、Ｔ３）の開口部に向かって押し出され、その流出が可能となるように、定常流を用いながら、前記細胞培養物、好ましくは内皮細胞を、バイオリアクター（１１）内に存在するスキャフォールド（２１）の管腔内部に放出する工程
を含む。前記コンテナ（図１０、９１）は、シリンジ等の中空の部分であり得る。
前記播種方法の工程ＩＩ．１及びＩＩ．２は、気泡が播種した細胞、好ましくは内皮細胞と接触するリスクを低下させ、従って細胞に対する損傷が回避され、そしてスキャフォールド（例えば、機能的且つ好ましくは連続的な内皮）の管腔に接着した機能的且つ好ましくは連続的な細胞（すなわち、コフルエント細胞）の単層を取得できるようにする。
工程Ｉ～ＩＶ（並びに適宜、工程Ｉ．１、ＩＩＩ．１～ＩＩＩ．３、２．１～２．１１、及び／又は３．１～３．１３）を含む、本発明による特徴づけ方法の一実施形態によれば、工程ＩＩに含まれる前記播種方法は、－工程ＩＩ．１及びＩＩ．２の他に－工程ＩＩ．２の後に、
ＩＩ．３：スキャフォールド（２１）の管腔内部への細胞の均一な接着を可能にするために、スキャフォールド（２１）をその縦軸に沿って、２～４８時間の間に含まれる時間、好ましくは２４時間、０．５～５ｒｐｍ、好ましくは１．５～２ｒｐｍの間に含まれる回転スピードで、より好ましくは１．５～２ｒｐｍで２４時間、連続的に回転させる工程；その後又はそれと同時に
ＩＩ．４：２～４８時間の間に含まれる時間、好ましくは２４時間、２０～４５℃の間の温度、好ましくは３７℃において、１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２の存在下で；より好ましくは５％のＣＯ２の存在下、３７℃において２４時間、バイオリアクター（１１）内に収容されたスキャフォールド（２１）をインキュベートする工程
を含む。
好ましくは、インキュベートする工程ＩＩ．４は、工程ＩＩ．３に従いスキャフォールド（２１）を回転させながら行われる。
ＩＩ．３：スキャフォールド（２１）の管腔内部への細胞の均一な接着を可能にするために、スキャフォールド（２１）をその縦軸に沿って、２～４８時間の間に含まれる時間、好ましくは２４時間、０．５～５ｒｐｍ、好ましくは１．５～２ｒｐｍの間に含まれる回転スピードで、より好ましくは１．５～２ｒｐｍで２４時間、連続的に回転させる工程；その後又はそれと同時に
ＩＩ．４：２～４８時間の間に含まれる時間、好ましくは２４時間、２０～４５℃の間の温度、好ましくは３７℃において、１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２の存在下で；より好ましくは５％のＣＯ２の存在下、３７℃において２４時間、バイオリアクター（１１）内に収容されたスキャフォールド（２１）をインキュベートする工程
を含む。
好ましくは、インキュベートする工程ＩＩ．４は、工程ＩＩ．３に従いスキャフォールド（２１）を回転させながら行われる。
回転させる工程ＩＩ．３は、スキャフォールドの管腔に対する細胞の接着を改善し、そしてそれを均一にし、バイオリアクターチャンバー内に存在する増殖培地によってスキャフォールドが継続して濡れた状態に保つことができ、またチャンバー内（スキャフォールドの外部）に存在する培地とスキャフォールドの管腔内に播種された細胞懸濁物との間の栄養分の流通を可能にする。
工程Ｉ～ＩＶ（並びに適宜、工程Ｉ．１、ＩＩＩ．１～ＩＩＩ．３、２．１～２．１１、及び／又は３．１～３．１３）を含む、本発明による特徴づけ方法の一実施形態によれば、工程ＩＩ．１～ＩＩ．４による前記播種方法は、詳細には、無菌条件下で順番通りに実施される、以下に例証する工程ＩＩ．１～ＩＩ．９を含む。
工程Ｉ．１には、バイオリアクターチャンバー（１１）内に配置された前記スキャフォールドホルダー（１３）上に固定された前記スキャフォールド（２１）の管腔内に新鮮増殖培地を注入する工程ＩＩ．５工程（すなわち、スキャフォールドの事前調整）が後続する。
工程ＩＩ．５には、前記増殖培地が注入された、スキャフォールド（２１）を含む前記スキャフォールドホルダー（１３、１３ａ、１３ｂ）が存在するバイオリアクターチャンバー（１１）内に前記新鮮増殖培地を添加する工程ＩＩ．６が後続する。
工程ＩＩ．６には、１時間～１８時間の間に含まれる時間、２０℃～３０℃の間に含まれる温度、好ましくは２５℃で、前記増殖培地を、スキャフォールド（２１）の管腔内部、及びスキャフォールド（２１）を含む前記スキャフォールドホルダー（１３）が、前記増殖培地が注入された状態で存在するバイオリアクターチャンバー（１１）内に留める工程ＩＩ．７が後続する。
工程ＩＩ．５には、前記増殖培地が注入された、スキャフォールド（２１）を含む前記スキャフォールドホルダー（１３、１３ａ、１３ｂ）が存在するバイオリアクターチャンバー（１１）内に前記新鮮増殖培地を添加する工程ＩＩ．６が後続する。
工程ＩＩ．６には、１時間～１８時間の間に含まれる時間、２０℃～３０℃の間に含まれる温度、好ましくは２５℃で、前記増殖培地を、スキャフォールド（２１）の管腔内部、及びスキャフォールド（２１）を含む前記スキャフォールドホルダー（１３）が、前記増殖培地が注入された状態で存在するバイオリアクターチャンバー（１１）内に留める工程ＩＩ．７が後続する。
詳しくは、スキャフォールドは、Ｔ字コネクター（図９；Ｔ２）によってバイオリアクターの両端部のうちの１つとカップリングしているルアーロックコネクターを備えたシリンジを使用することで事前調整される。その後、バイオリアクターの上流及び下流に配置されているコネクターの開放端部が、スキャフォールドの管腔が空になるのを回避するために、キャップを使用して閉鎖される。更に、新鮮増殖培地が、バイオリアクターチャンバー内に、その中に収容されたスキャフォールドが完全に覆われるまで導入される。このように、バイオリアクターチャンバーに収容されたスキャフォールドは、内部（管腔内）及び外部の両方において、好ましくは約２５℃で約１時間、新鮮増殖培地を使用することで事前調整される。
工程ＩＩ．７には、好ましくは滅菌ピペットを使用して、増殖培地をスキャフォールド（２１）の管腔の内側及びバイオリアクターチャンバー（１１）から除去する工程ＩＩ．８が後続する。バイオリアクターの下流及び上流に配置されているコネクター（回転式及びＴ字形）中に存在する増殖培地残渣は、スキャフォールドを壊さないように、ピペットを使用して減圧しながら除去される。
工程ＩＩ．８には、工程ＩＩ．１に従い、前記細胞培養物、好ましくは内皮細胞培養物を前記コンテナ（９１）内に放出するための、既記載の工程ＩＩ．１が後続するが、好ましくは、前記コンテナ（９１）はシリンジである。
工程ＩＩ．１には、前記細胞培養物、好ましくは内皮細胞を、バイオリアクター（１１）内に存在するスキャフォールド（２１）の管腔内部に、定常流を用いて放出するための、既記載の工程ＩＩ．２が後続する。
詳しくは、バイオリアクター（その中にあるスキャフォールドがグリップ上に取り付けられている）の端部の上流（図９、Ｔ２）及び下流（図９；Ｔ３）に配置されているＴ字コネクターは、上部開口部が上向きになっている（バイオリアクター－スキャフォールドシステムが置かれた面に対して９０°）。その後、バイオリアクターの下流（Ｔ３）及び上流（Ｔ２）に配置されているＴ字コネクターの水平方向の開口部がキャップ止めされる。バイオリアクターの上流に配置されているＴ字コネクター（図９；Ｔ２）の上向き開口部に、コンテナ、好ましくは、そのプランジャーを含めないで例えば５ｍｌの容積を有する、ルアーロックコネクターを備えたシリンジ（図９；９１）が取り付けられる。バイオリアクターの下流に配置されているＴ字コネクター（図９；Ｔ３）の開口部は開放したままである（図９）。
ピペット、好ましくは、例えば２５ｍｌの容積を有する滅菌プラスチックピペット（図１０；１０１）を使用して、新鮮増殖培地及び内皮細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ）からなる細胞懸濁物が、それが調製されたコンテナから取り出される。その後、取り出された細胞懸濁物が、バイオリアクター上流のＴ字コネクターエレメント（図１０；Ｔ２）に取り付けられたコンテナ中又はシリンジ（図１０；９１）中に、エレメント（図１０；ＣＲ１）を通じて放出される。流体速度によって、細胞懸濁物が気泡を生成することなくＴ字コネクター（図１０；Ｔ２）中に滴下され、そしてスキャフォールド内に存在する可能性のある気泡が、バイオリアクター１１の下流に配置されたＴ字コネクターＴ３（図１０、Ｔ３）の開口部に向かって押し出され、従って流出するのが可能となるように、定常流を用いながら、例えば２５ｍｌの容積を有するピペット（図１０；１０１）を使用して細胞懸濁物が放出されなければならない（図１０）。
細胞懸濁物－シリンジを使用して負荷される－が、気泡が発生するおそれもなく、バイオリアクターの下流に配置されているＴ字コネクターＴ３の開放端部に達したとき、バイオリアクターの上流に配置されているＴ字コネクターＴ２の開口部は、キャップを使用して閉鎖される（図１１）。
その後、細胞懸濁物残渣を含むシリンジ（９１）を、それが位置する面に対して約９０°だけ回転させる（図１２）；この位置において、シリンジのプランジャー（１０２）が、スキャフォールド内部に圧力がかからないように密閉性の黒色部分のみを挿入することにより、シリンジの開放端部に再挿入される（図１２）。その後、バイオリアクターの上流のＴ字コネクターＴ２から、気泡が形成されることなく、シリンジ（９１）のねじを外すことができ（図１３）、そしてコネクターの端部はキャップを使用して閉鎖される（図１４）。
詳しくは、バイオリアクター（その中にあるスキャフォールドがグリップ上に取り付けられている）の端部の上流（図９、Ｔ２）及び下流（図９；Ｔ３）に配置されているＴ字コネクターは、上部開口部が上向きになっている（バイオリアクター－スキャフォールドシステムが置かれた面に対して９０°）。その後、バイオリアクターの下流（Ｔ３）及び上流（Ｔ２）に配置されているＴ字コネクターの水平方向の開口部がキャップ止めされる。バイオリアクターの上流に配置されているＴ字コネクター（図９；Ｔ２）の上向き開口部に、コンテナ、好ましくは、そのプランジャーを含めないで例えば５ｍｌの容積を有する、ルアーロックコネクターを備えたシリンジ（図９；９１）が取り付けられる。バイオリアクターの下流に配置されているＴ字コネクター（図９；Ｔ３）の開口部は開放したままである（図９）。
ピペット、好ましくは、例えば２５ｍｌの容積を有する滅菌プラスチックピペット（図１０；１０１）を使用して、新鮮増殖培地及び内皮細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ）からなる細胞懸濁物が、それが調製されたコンテナから取り出される。その後、取り出された細胞懸濁物が、バイオリアクター上流のＴ字コネクターエレメント（図１０；Ｔ２）に取り付けられたコンテナ中又はシリンジ（図１０；９１）中に、エレメント（図１０；ＣＲ１）を通じて放出される。流体速度によって、細胞懸濁物が気泡を生成することなくＴ字コネクター（図１０；Ｔ２）中に滴下され、そしてスキャフォールド内に存在する可能性のある気泡が、バイオリアクター１１の下流に配置されたＴ字コネクターＴ３（図１０、Ｔ３）の開口部に向かって押し出され、従って流出するのが可能となるように、定常流を用いながら、例えば２５ｍｌの容積を有するピペット（図１０；１０１）を使用して細胞懸濁物が放出されなければならない（図１０）。
細胞懸濁物－シリンジを使用して負荷される－が、気泡が発生するおそれもなく、バイオリアクターの下流に配置されているＴ字コネクターＴ３の開放端部に達したとき、バイオリアクターの上流に配置されているＴ字コネクターＴ２の開口部は、キャップを使用して閉鎖される（図１１）。
その後、細胞懸濁物残渣を含むシリンジ（９１）を、それが位置する面に対して約９０°だけ回転させる（図１２）；この位置において、シリンジのプランジャー（１０２）が、スキャフォールド内部に圧力がかからないように密閉性の黒色部分のみを挿入することにより、シリンジの開放端部に再挿入される（図１２）。その後、バイオリアクターの上流のＴ字コネクターＴ２から、気泡が形成されることなく、シリンジ（９１）のねじを外すことができ（図１３）、そしてコネクターの端部はキャップを使用して閉鎖される（図１４）。
工程ＩＩ．２には、高温の新鮮増殖培地（これまでに定義した通り）を、バイオリアクターチャンバー（１１）（前記細胞懸濁物を管腔内に含有する播種済みのスキャフォールド（２１）を含め、前記スキャフォールドホルダー（１３）が存在する）内に、スキャフォールドが増殖培地中に半分浸漬されるまで添加する工程ＩＩ．９が後続する。
工程ＩＩ．９には、工程ＩＩ．３に従いスキャフォールド（２１）を連続的に回転させるための、既記載の工程ＩＩ．３が後続する。
詳しくは、連続的な回転は、スキャフォールドの縦軸に沿って、例えば１．５～２ｒｐｍの間に含まれる回転スピードを用いて２４時間適用される。回転することで、スキャフォールドの管腔への均一な細胞接着が可能となり、スキャフォールドをバイオリアクターチャンバー中に存在する増殖培地によって継続的に濡れた状態に保つことができ、そしてチャンバー中に存在する媒体（スキャフォールドの外部）とスキャフォールドの管腔内に播種された細胞懸濁物との間で栄養分の流通が可能となる。
工程ＩＩ．３には、バイオリアクターチャンバー内に収容されたスキャフォールド（２１）を、好ましくは５％のＣＯ２を用いて、３７℃で２４時間インキュベートする（回転させながら）ための、既記載の工程ＩＩ．４が後続する。
有利には、工程Ｉ～ＩＶ（並びに適宜、工程Ｉ．１、ＩＩＩ．１～ＩＩＩ．３、２．１～２．１１、及び／又は３．１～３．１３）に従う特徴づけ方法において、工程ＩＩ．１～ＩＩ．２、又は工程ＩＩ．１～ＩＩ．４、又は工程ＩＩ．１～ＩＩ．９に従う播種方法が存在することで、無菌条件下での作業、並びにバイオリアクター－スキャフォールドシステム中に存在する気泡及び播種期間中に形成される気泡の両方が除去され、従って細胞に対する障害が回避された細胞の播種が可能となる。これは、機能的且つ好ましくは連続的な細胞の層（すなわち、コフルエント細胞の単層を有する）、例えば連続的且つ機能的な内皮等で内側が覆われた管腔の少なくとも１つの部分を持つスキャフォールドを有する工学的に作出された血管組織又はコンストラクトの生成を可能にする。基本的に、本播種方法の各工程は、迅速であり、標準化されており、且つ再現性を有する他に、コスト及び操作時間を最適化する。
工程Ｉ～ＩＶ（並びに適宜、工程Ｉ．１、ＩＩ．１～ＩＩ．２、ＩＩ．１～ＩＩ．４、ＩＩ．１～ＩＩ．９、２．１～２．１１、及び／又は３．１～３．１３）を含む、本発明による特徴づけ方法の一実施形態によれば、前記細胞、好ましくは内皮細胞の増殖及び組織化を刺激する前記工程ＩＩＩは、前記播種済みのスキャフォールド（２１）の管腔内に存在する細胞に、２０℃～４５℃の範囲に含まれる温度、好ましくは３７℃を有する高温の新鮮増殖培地を用いて潅流方法を適用する工程を含み、但し前記潅流方法は、以下に記載する工程ＩＩＩ．１～ＩＩＩ．３を含む。
工程ＩＩＩ．１：変更可能な順番で、気泡を除去するためのエレメント（図８、７１～７２又は図２２、ＢＴ）及び前記播種済みのバイオリアクター（１１）－スキャフォールド（２１）システムを潅流回路（図５、５１～５６）に接続する工程。但し、前記気泡を除去するためのエレメントは播種済みのバイオリアクター（１１）－スキャフォールド（２１）システムの上流に挿入され；潅流回路（図５、５１～５６）は、増殖培地を含有するリザーバー（図５、５６）を備える。
工程ＩＩＩ．１は、前記気泡を除去するためのエレメント（図８、７１～７２又は図２２ＢＴ）の少なくとも１つの部分を、前記高温の新鮮増殖培地で充填する工程ＩＩＩ．２に先行し又は後続するが、但し前記気泡を除去するためのエレメント（図８、７１～７２又は図２２ＢＴ）は、チャンバー、前記チャンバーを閉鎖するためのキャップ、流入機能を有するアクセス（２１１）及び流出機能を有するアクセス（２１２）を備え、前記チャンバーはある容量を有し、前記容量の第１の部分は前記新鮮増殖培地で充填され、及び前記容量の第２の部分は空気で充填されており、前記容量の前記第２の部分は、前記流入機能を有するアクセス（２１１）及び前記流出機能を有するアクセス（２１２）を流通する前記新鮮増殖培地中に存在する気泡をトラップする機能を有する。
好ましくは、前記気泡を除去するためのエレメント（図８、７１～７２、又は図２２、ＢＴ）は、バブルトラップ等である。
工程ＩＩＩ．１及びＩＩＩ．２には、播種済みのスキャフォールド（２１）の、前記高温の新鮮増殖培地を用いた潅流を、好ましくはペリスタポンプによって可能にする工程ＩＩＩ．３が後続する。
工程ＩＩＩ．１：変更可能な順番で、気泡を除去するためのエレメント（図８、７１～７２又は図２２、ＢＴ）及び前記播種済みのバイオリアクター（１１）－スキャフォールド（２１）システムを潅流回路（図５、５１～５６）に接続する工程。但し、前記気泡を除去するためのエレメントは播種済みのバイオリアクター（１１）－スキャフォールド（２１）システムの上流に挿入され；潅流回路（図５、５１～５６）は、増殖培地を含有するリザーバー（図５、５６）を備える。
工程ＩＩＩ．１は、前記気泡を除去するためのエレメント（図８、７１～７２又は図２２ＢＴ）の少なくとも１つの部分を、前記高温の新鮮増殖培地で充填する工程ＩＩＩ．２に先行し又は後続するが、但し前記気泡を除去するためのエレメント（図８、７１～７２又は図２２ＢＴ）は、チャンバー、前記チャンバーを閉鎖するためのキャップ、流入機能を有するアクセス（２１１）及び流出機能を有するアクセス（２１２）を備え、前記チャンバーはある容量を有し、前記容量の第１の部分は前記新鮮増殖培地で充填され、及び前記容量の第２の部分は空気で充填されており、前記容量の前記第２の部分は、前記流入機能を有するアクセス（２１１）及び前記流出機能を有するアクセス（２１２）を流通する前記新鮮増殖培地中に存在する気泡をトラップする機能を有する。
好ましくは、前記気泡を除去するためのエレメント（図８、７１～７２、又は図２２、ＢＴ）は、バブルトラップ等である。
工程ＩＩＩ．１及びＩＩＩ．２には、播種済みのスキャフォールド（２１）の、前記高温の新鮮増殖培地を用いた潅流を、好ましくはペリスタポンプによって可能にする工程ＩＩＩ．３が後続する。
機能的な細胞の少なくとも１つの層が形成されるまで、細胞の増殖及び組織化を刺激する工程ＩＩＩに含まれ、工程Ｉ～ＩＶ（及び適宜、工程Ｉ．１、ＩＩ．１～ＩＩ．２、ＩＩ．１～ＩＩ．４、ＩＩ．１～ＩＩ．９）を含む本発明による特徴づけ方法に含まれる工程ＩＩＩ．１～ＩＩＩ．３は、以下に記載する工程２．１～２．１１（図５～８、１８～２１に示す）を含む第１の実施形態に従い、或いは工程３．１～３．１３を含む第２の実施形態に従い（図２２～２７に示す）実施可能である。
前記第１の実施形態（工程２．１～２．１１）及び前記第２の実施形態（工程３．１～３．１３）の工程は、順番通り及び無菌条件下で実施される。
前記工程２．１～２．１１又は３．１～３．１３は、工程ＩＩ．１～ＩＩ．２又はＩＩ．１～ＩＩ．４又はＩＩ．１～ＩＩ．９に従い実施される工程ＩＩに後続する。
前記第１の実施形態（工程２．１～２．１１）及び前記第２の実施形態（工程３．１～３．１３）の工程は、順番通り及び無菌条件下で実施される。
前記工程２．１～２．１１又は３．１～３．１３は、工程ＩＩ．１～ＩＩ．２又はＩＩ．１～ＩＩ．４又はＩＩ．１～ＩＩ．９に従い実施される工程ＩＩに後続する。
前記第１の実施形態（工程２．１～２．１１）は、要するに、潅流回路を播種済みのバイオリアクター－スキャフォールドシステムと最初に接続し、次に気泡を除去するためにエレメントを増殖培地で充填し、その後気泡を除去するためにエレメントを、播種済みのバイオリアクター－スキャフォールドシステムと予め接続している潅流回路中に挿入する。
２．１ 閉鎖した潅流回路のチューブ又はアンダーポンプ（図５；５２）を、ペリスタポンプ（図５；５５）－作動すると液体、この場合高温の新鮮増殖培地を吸引することができる蠕動力（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ ｆｏｒｃｅ）を生成する－のヘッドの下に配置する。閉鎖されると、リザーバー（図５；５６）と接続した潅流回路のチューブ（図５；５１）によって、リザーバー内に予め注入された高温の新鮮増殖培地を吸引することに起因して、閉鎖した潅流回路が充填される。新鮮増殖培地が、閉鎖した潅流回路のチューブ５４（図５；５４）を通じて、リザーバーに戻るまで、潅流回路のすべてのチューブを高温の新鮮増殖培地で充填する。バイオリアクター－スキャフォールドシステムを、潅流回路と同一の滅菌条件下に置く。
２．２ バイオリアクターの上流に配置されているＴ字コネクターＴ２の上部及び水平端部を開放する。
２．３ バイオリアクターの上流に配置されているＴ字コネクターＴ２の上部及び水平端部からキャップを除去したら、気泡が生成する可能性は、高温の新鮮増殖培地と同一の容量を手作業により添加すること（好ましくはパスツールピペットを使用して）により相殺される（図１６）。
２．４ 閉鎖した潅流回路のチューブ５４を、好ましくはクランプ（図１７；１７１）を使用して、潅流回路のチューブ５４とチューブ５３間のコネクターに近接する位置で塞ぐ（図１７）。閉鎖した潅流回路のチューブ５３が空になるのを防止するために、ポンプのヘッドが閉鎖した状態に保つように注意する。
２．５ 閉鎖した潅流回路のチューブ５３を垂直位置に保持し、潅流回路のチューブ５３とチューブ５４間に配置されているコネクター（図５、Ｃ）のねじを外し、そして好ましくはキャップを用いて潅流回路のチューブ５４を閉鎖する。
２．６ 潅流回路のチューブ５３を、バイオリアクターの上流、その水平アクセスにおいてＴ字コネクターＴ２の開放水平端部にねじ止めする。バイオリアクターの上流に位置するコネクターは、常に垂直位置に保たれなければならない（図１８）。
２．７ バイオリアクターの下流に位置するＴ字コネクターＴ３を、水平開口部のキャップのねじを外して開放する。
２．８ 潅流回路のチューブ５４のコネクターからキャップを取り除き（図１９Ａ）、そしてそれをバイオリアクターの下流に位置するＴ字コネクターの水平開口部にねじ止めする（図１９Ｂ）。
２．９ 潅流回路のチューブ５４を塞いでいるクランプ１７１を取り除く（図２０）。
２．１０ 本発明の文脈においてバブルトラップ（ＢＴ）という技術的表現を用いて定義される、気泡を除去するためのエレメントを充填する（図２１、７１～７２）。バブルトラップは、キャップを使用して閉鎖され、並びに流入及び流出機能を持つ２つのアクセスを有するチャンバーにより代表されるエレメントから構成される。バブルトラップチャンバーは、ある容量の液体（この特別なケースでは高温の新鮮増殖培地）、及びバブルトラップチャンバーの２つのアクセスを流通する灌流液中に存在し得る気泡をトラップするある容量の空気を含有する。
所定の空気容量を残すようにバブルトラップを高温の新鮮増殖培地で充填し、そして各キャップを使用してチャンバー並びにその２つのアクセスを閉鎖する。
所定の空気容量を残すようにバブルトラップを高温の新鮮増殖培地で充填し、そして各キャップを使用してチャンバー並びにその２つのアクセスを閉鎖する。
２．１１ バブルトラップを、バイオリアクター－スキャフォールドシステムと予め接続している潅流回路に、以下の通り接続する（図７）：
ａ．Ｔ字コネクターＴ１（潅流回路のチューブ５３とチューブ５２間に配置されている）の水平端部にチューブ５３を接続するコネクター近傍に配置されているクランプを使用して潅流回路のチューブ５３を閉鎖し、そしてねじを外す（図７；５２）。
ｂ．好ましくは、キャップを使用して潅流回路のチューブ５３を閉鎖する。そのような操作は、潅流回路のチューブ５３が空になるのを防止する。
ｃ．Ｔ字コネクターＴ１（潅流回路のチューブ５３とチューブ５２間に配置されている）の水平端部にキャップをし、そしてその上端部を開放する。
ｄ．バブルトラップチャンバーの流入アクセスを開放し、そしてそれを上端部のアクセスに接続し、そしてＴ字コネクターＴ１に対して垂直に配置する。
ｅ．バブルトラップの流出アクセスを開放し、そしてチューブを絶対にねじらないように注意しながらそれを潅流回路のチューブ５３に接続する。
ｆ．バブルトラップを垂直位置に保つ。
ｇ．バブルトラップチャンバーに接続したばかりの潅流回路のチューブ５３からクランプ７１を取り除く。
ポンプの稼働を開始し、そしてプロセス期間中にチューブ５３内に形成された可能性のある気泡を取り除き、気泡がスキャフォールドに到達するのを防止するために、バイオリアクターの上流に位置するＴ字コネクターＴ２の上端部のキャップを開放する。潅流回路及びバイオリアクター－スキャフォールドシステムからなるアセンブル後のシステムに対してポンプにより蠕動力が適用されると、スキャフォールドの潅流が可能になる。
ｈ．そのような検証の後、バイオリアクターの上流に位置するＴ字コネクターＴ２をそのキャップを使用して閉鎖する。
ａ．Ｔ字コネクターＴ１（潅流回路のチューブ５３とチューブ５２間に配置されている）の水平端部にチューブ５３を接続するコネクター近傍に配置されているクランプを使用して潅流回路のチューブ５３を閉鎖し、そしてねじを外す（図７；５２）。
ｂ．好ましくは、キャップを使用して潅流回路のチューブ５３を閉鎖する。そのような操作は、潅流回路のチューブ５３が空になるのを防止する。
ｃ．Ｔ字コネクターＴ１（潅流回路のチューブ５３とチューブ５２間に配置されている）の水平端部にキャップをし、そしてその上端部を開放する。
ｄ．バブルトラップチャンバーの流入アクセスを開放し、そしてそれを上端部のアクセスに接続し、そしてＴ字コネクターＴ１に対して垂直に配置する。
ｅ．バブルトラップの流出アクセスを開放し、そしてチューブを絶対にねじらないように注意しながらそれを潅流回路のチューブ５３に接続する。
ｆ．バブルトラップを垂直位置に保つ。
ｇ．バブルトラップチャンバーに接続したばかりの潅流回路のチューブ５３からクランプ７１を取り除く。
ポンプの稼働を開始し、そしてプロセス期間中にチューブ５３内に形成された可能性のある気泡を取り除き、気泡がスキャフォールドに到達するのを防止するために、バイオリアクターの上流に位置するＴ字コネクターＴ２の上端部のキャップを開放する。潅流回路及びバイオリアクター－スキャフォールドシステムからなるアセンブル後のシステムに対してポンプにより蠕動力が適用されると、スキャフォールドの潅流が可能になる。
ｈ．そのような検証の後、バイオリアクターの上流に位置するＴ字コネクターＴ２をそのキャップを使用して閉鎖する。
前記第２の実施形態（工程３．１～３．１３）は、要するに、初めに気泡を除去するためのエレメントと潅流回路との接続、その後に気泡を除去するためのエレメントの増殖培地による充填、及び最後に、気泡を除去するためのエレメントと予め接続した潅流回路内への播種済みのバイオリアクター－スキャフォールドシステムの挿入を実現する。
３．１ 接続－無菌条件下－潅流回路のチューブ（図２２；５１；５２；５３；５４；５５）、バブルトラップという技術的表現を用いて本発明の文脈において定義した、気泡を除去するためのエレメント（図２２；ＢＴ）、及びリザーバー（図２２；５６）。気泡を除去するためのエレメント又はバブルトラップ（ＢＴ）は、キャップを使用して閉鎖され、そして２つの非対称アクセスを有するチャンバー（好ましくはガラス製）により代表されるエレメントから構成される：タップ及び接続ノズルを有するアクセスは流入側として機能する（図２７、２１１）一方、接続ノズルのみを有するアクセスは流出側として機能する（図２７、２２１）。バブルトラップチャンバーは、ある容量の液体（この特別なケースでは高温の新鮮増殖培地）及びバブルトラップチャンバーの２つのアクセスを流通する、潅流液中に存在する可能性のある気泡をトラップするある容量の空気を含有する。
３．２ 閉鎖した潅流回路のアンダーポンプ（図２２；５２）を、ペリスタポンプ（作動すると液体、この場合高温の新鮮増殖培地を吸引する能力を有する蠕動力を発生する）（図２２；５７）のヘッドの下に配置する。リザーバー（図２２；５６）と接続した潅流回路のチューブ（図２２；５１）により、リザーバー（図２２；５６）内に予め注入された高温の新鮮増殖培地が吸引されることに起因して、閉鎖した潅流回路が充填され、次に閉鎖される。高温の新鮮増殖培地が、閉鎖した潅流回路のチューブ５５（図２２；５５）を通じてリザーバーに戻るまで、潅流回路のすべてのチューブ、バブルトラップ（図２２、ＢＴ）、及びリザーバー（図２２；５６）を潅流液、例えば高温の新鮮増殖培地等（上記で定義した通り）で充填する。ＢＴ及びリザーバーは、所定の空気容量が残るように充填される。特に、バブルトラップ（図２２、ＢＴ）は、前記バブルトラップチャンバーが、前記新鮮増殖培地で充填されたその容量の第１の部分、及び空気で充填されたその容量の第２の部分を有するように充填され、前記容量の前記第２の部分は、バブルトラップ（ＢＴ）の流入側として働く前記アクセス（２１１）と流出側として働く前記アクセス（２１２）を流通する潅流液（高温の新鮮増殖培地）中に存在する気泡をトラップする機能を有する（図２２）。
３．３ ＢＴ近傍の位置において、好ましくはクランプ（図２３；１７２）を使用してチューブ５４（図２３）を塞ぎ、そしてＢＴのタップを閉鎖位置（潅流回路のチューブに対して直角の位置）まで移動させる。
３．４ バイオリアクター－スキャフォールドシステムを、潅流回路と同一の無菌条件下に置く。
３．５ 好ましくはクランプ（図２３；１７１；図１７；１７１）を使用して、チューブ５４とのコネクションＣ（図２３；Ｃ）近傍の位置においてチューブ５５（図２３）を塞ぐ。バイオリアクターの上流に配置されているＴ字コネクターＴ２（図４；Ｔ２）の上部及び水平端部を開放する。
３．６ バイオリアクターの上流に配置されているＴ字コネクターＴ２（図４）の上部及び水平端部からキャップを除去したら、気泡が生成する可能性は、高温の新鮮増殖培地と同一の容量を手作業により添加すること（好ましくは、パスツールピペットを使用して）により相殺される（図１６）。
３．７ 閉鎖した潅流回路のチューブ５４（図２３）を垂直の位置に保持し、潅流回路のチューブ５４（図２３）とチューブ５５（図２３）間に配置されているコネクターのねじを外し、そして好ましくはキャップを使用して潅流回路のチューブ５５にキャップをする（図２４）。
３．８ 潅流回路のチューブ５４（図２７）を、バイオリアクターの上流に位置するＴ字コネクターＴ２（図２７）の開放水平端部に、その水平アクセスにおいてねじ止めする。バイオリアクターの上流に位置するコネクターは、常に垂直位置に保たれなければならない（図１８又は図２７）。
３．９ バイオリアクターの下流に位置するＴ字コネクターＴ３（図４）を、水平開口部のキャップのねじを外して開放する。
３．１０ ロータリーコネクターＴ３とＴ字コネクターＣＲ２とを繋ぐねじを外し（図４）、歯車Ｒ（図４）をロックした状態に保持し、そしてチューブ５５のコネクター（図２５）をスキャフォールドホルダー１４ａの水平開口部にねじ止めする（図１）（図２５）。
３．１１ 潅流回路のチューブ５５を塞いでいるクランプ１７１を取り外す（図２６）。
３．１２ 潅流回路と接続している播種済みのバイオリアクター－スキャフォールドシステムを約３７℃及び約５％のＣＯ２に置き、アンダーポンプ５２（図２７）を自由位置に配置し、バブルトラップＢＴのタップ（図２７）を、潅流回路のチューブに対して平行にそれを配置することにより開放し、クランプ１７２（図２７）を取り外す。
３．１３ ポンプのスイッチをＯＮにする（図２７、５７）。潅流回路、気泡を除去するためのエレメント、及びバイオリアクター－スキャフォールドシステムからなるアセンブル後のシステムに対して、ポンプにより蠕動力が適用されると、スキャフォールドの潅流が可能になる。
本発明の文脈において、潅流回路（図５及び図２２）は、チューブ（図５；５１～５４又は図２２；５１～５５）、リザーバー（図５又は図２２；５６）、及びペリスタポンプ（図５；５５又は図２２；５７）からなるアセンブリとして定義される。前記チューブは生体適合性材料からなり、そして同チューブは、バイオリアクター１１内に収容された、好ましくは実質的に管状形状のスキャフォールド（図２１及び図２７）の潅流が、Ｅａｓｙ－Ｌｏａｄ ＩＩ ７７２００－６２（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ、Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ社）ヘッドを備えたペリスタポンプ（図５；５５、図２２；５７）（そのようなケースでは、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ（登録商標）、Ｌ／Ｓ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ Ｐｕｍｐ Ｄｒｉｖｅｓ０７５５１－２０、Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ社）によって可能となるように相互に接続している。
上記で記載した、図２７で例証される潅流方法（工程３．１～３．１３）の第２の実施形態を参照すると、潅流回路は、内径が３／１６インチの５つのチューブ：リザーバーから吸引するための第１のチューブ５１、第２のアンダーポンプチューブ５２、回路をバブルトラップＢＴに接続する第３のチューブ５３、ＢＴをバイオリアクター－スキャフォールドシステムの上流に位置するＴ字コネクターＴ２に接続する第４のチューブ５４、バイオリアクター－スキャフォールドシステムの下流に位置するＴ字コネクターＴ３と接続したリザーバー５６に戻すための第５のチューブ５５から主に構成される。
上記で記載し、図５に示す潅流方法（工程２．１～２．１１）の第１の実施形態を参照すると、チューブ５１はアンダーポンプチューブ５２に、アンダーポンプチューブ５２はＢＴに、ＢＴはチューブ５３に、５３はバイオリアクター－スキャフォールドシステムの上流に位置するＴ字コネクターＴ２に、５４はバイオリアクター－スキャフォールドシステムの下流に位置するＴ字コネクターＴ３及びリザーバー５６に接続している。
リザーバー（図５又は図２２、５６）は、高温の新鮮増殖培地（例えば、内皮増殖培地ＥＧＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有するエレメントであり、回路全体及びバイオリアクター－播種済みのスキャフォールドシステムを閉鎖系に保ちつつ、チューブ５１（図５又は図２２）がそこから吸引し、またチューブ５４（図５）又は５５（図２２）がそこに戻る。リザーバー（図５又は図２２、５６）は大気圧下にあり、リザーバーのキャップ上に存在する０．２２μｍフィルターに起因して、空気の滅菌性が保証される。
上記で記載した、図２７で例証される潅流方法（工程３．１～３．１３）の第２の実施形態を参照すると、潅流回路は、内径が３／１６インチの５つのチューブ：リザーバーから吸引するための第１のチューブ５１、第２のアンダーポンプチューブ５２、回路をバブルトラップＢＴに接続する第３のチューブ５３、ＢＴをバイオリアクター－スキャフォールドシステムの上流に位置するＴ字コネクターＴ２に接続する第４のチューブ５４、バイオリアクター－スキャフォールドシステムの下流に位置するＴ字コネクターＴ３と接続したリザーバー５６に戻すための第５のチューブ５５から主に構成される。
上記で記載し、図５に示す潅流方法（工程２．１～２．１１）の第１の実施形態を参照すると、チューブ５１はアンダーポンプチューブ５２に、アンダーポンプチューブ５２はＢＴに、ＢＴはチューブ５３に、５３はバイオリアクター－スキャフォールドシステムの上流に位置するＴ字コネクターＴ２に、５４はバイオリアクター－スキャフォールドシステムの下流に位置するＴ字コネクターＴ３及びリザーバー５６に接続している。
リザーバー（図５又は図２２、５６）は、高温の新鮮増殖培地（例えば、内皮増殖培地ＥＧＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有するエレメントであり、回路全体及びバイオリアクター－播種済みのスキャフォールドシステムを閉鎖系に保ちつつ、チューブ５１（図５又は図２２）がそこから吸引し、またチューブ５４（図５）又は５５（図２２）がそこに戻る。リザーバー（図５又は図２２、５６）は大気圧下にあり、リザーバーのキャップ上に存在する０．２２μｍフィルターに起因して、空気の滅菌性が保証される。
有利には、本明細書に記載する潅流方法（工程ＩＩＩ．１～ＩＩＩ．３）は、第１の実施形態（工程２．１～２．１１）及び第２の実施形態（工程３．１～３．１３）のいずれにおいても、気泡の形成を回避し、また気泡がたとえ形成されたとしても、バイオリアクター－スキャフォールドシステムのスキャフォールド（細胞、好ましくは内皮細胞が播種された）に到達するのを阻止しつつ、潅流回路及び気泡を除去するためのエレメントと、播種済みのバイオリアクター－スキャフォールドシステムとの接続を可能にする。更に、回路内に気泡を除去するためのエレメント（図２１、７１～７２又は図２７、ＢＴ）が存在することに起因して、潅流回路内にすでに存在している可能性のある気泡でもスキャフォールドには到達しない。
従って、工程Ｉ～ＩＶ（及び適宜、工程Ｉ．１、ＩＩ．１～ＩＩ．２、ＩＩ．１～ＩＩ．４、又はＩＩ．１～ＩＩ．９）を含む特徴づけ方法において、工程ＩＩＩ．１～ＩＩＩ．３が存在することで、第１の実施形態（工程２．１～２．１１）及び第２の実施形態（工程３．１～３．１３）のいずれにおいても、工程ＩＩＩ．１～ＩＩ．２、ＩＩ．１～ＩＩ．４、又はＩＩ．１～ＩＩ．９のみの適用に対してそれより高い安全性を有して、スキャフォールドの管腔内に気泡が完全に存在しないこと、及び細胞の機能的且つ好ましくは連続的な層（すなわち、コフルエント細胞の単層を有する）、例えば連続的且つ機能的な内皮等で内側が覆われた管腔の少なくとも一部分を持つスキャフォールドを有する工学的に作出された血管組織又はコンストラクトの生成を保証する。
更に、播種済みのバイオリアクター－スキャフォールドシステムと本潅流方法の潅流回路とを接続する工程（工程ＩＩＩ．１）の期間中に、血管細胞層の増殖を可能にする上で重要な因子である細胞接着の状態に変化は生じない。
従って、工程Ｉ～ＩＶ（及び適宜、工程Ｉ．１、ＩＩ．１～ＩＩ．２、ＩＩ．１～ＩＩ．４、又はＩＩ．１～ＩＩ．９）を含む特徴づけ方法において、工程ＩＩＩ．１～ＩＩＩ．３が存在することで、第１の実施形態（工程２．１～２．１１）及び第２の実施形態（工程３．１～３．１３）のいずれにおいても、工程ＩＩＩ．１～ＩＩ．２、ＩＩ．１～ＩＩ．４、又はＩＩ．１～ＩＩ．９のみの適用に対してそれより高い安全性を有して、スキャフォールドの管腔内に気泡が完全に存在しないこと、及び細胞の機能的且つ好ましくは連続的な層（すなわち、コフルエント細胞の単層を有する）、例えば連続的且つ機能的な内皮等で内側が覆われた管腔の少なくとも一部分を持つスキャフォールドを有する工学的に作出された血管組織又はコンストラクトの生成を保証する。
更に、播種済みのバイオリアクター－スキャフォールドシステムと本潅流方法の潅流回路とを接続する工程（工程ＩＩＩ．１）の期間中に、血管細胞層の増殖を可能にする上で重要な因子である細胞接着の状態に変化は生じない。
工程Ｉ～ＩＩＩ（並びに適宜、工程Ｉ．１、ＩＩ．１～ＩＩ．２、ＩＩ．１～ＩＩ．４、ＩＩ．１～ＩＩ．９、ＩＩ．１～ＩＩＩ．３、２．１～２．１１、及び／又は３．１～３．１３）によって取得された、ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトに含まれるスキャフォールドの管腔に接着した前記細胞を特徴づける工程ＩＶは、前記工程Ｉ～ＩＩＩ（並びに適宜、工程Ｉ．１、ＩＩ．１～ＩＩ．２、ＩＩ．１～ＩＩ．４、ＩＩ．１～ＩＩ．９、ＩＩ．１～ＩＩＩ．３、２．１～２．１１、及び／又は３．１～３．１３）、特に使用される播種方法及び潅流方法の有効性を検証及び証明する目的、従って機能的細胞の少なくとも１つの層、好ましくは機能的内皮細胞（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）（機能的内皮（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ））の層；より好ましくはコフルエント細胞を有する機能的且つ連続的な内皮細胞の層（機能的且つ連続的な内皮）で内側が覆われた管腔の少なくとも１つの部分を有するスキャフォールドの形成について検証及び証明する目的を有する。
前記特徴づけ工程ＩＶは、以下に記載する、又は当業者にとって公知の好適な分析法によって、スキャフォールドに接着した前記細胞の生存性、形態、機能性、分布、及び／又はその他の適する特徴を分析することを含む。
この分析法は、細胞の発達及びスキャフォールドに対するその接着に障害を与えてはならない。実際、スキャフォールドの管腔に接着した細胞は、機能的、均質的、且つ好ましくは連続的な血管内皮（コフルエント細胞を含む）を誘発するために、その形態、生存性、及び機能性を維持しなければならない。従って、増殖中の又は形成された血管層の喪失を引き起こすおそれのある特徴づけ工程ＩＶの期間中に何らかの細胞変化を避けることが重要である。
実施可能な分析法は、非破壊的分析法及び破壊的分析法に区別され得る。
この分析法は、細胞の発達及びスキャフォールドに対するその接着に障害を与えてはならない。実際、スキャフォールドの管腔に接着した細胞は、機能的、均質的、且つ好ましくは連続的な血管内皮（コフルエント細胞を含む）を誘発するために、その形態、生存性、及び機能性を維持しなければならない。従って、増殖中の又は形成された血管層の喪失を引き起こすおそれのある特徴づけ工程ＩＶの期間中に何らかの細胞変化を避けることが重要である。
実施可能な分析法は、非破壊的分析法及び破壊的分析法に区別され得る。
有利には、スキャフォールドに接着した前記細胞、好ましくは内皮細胞を特徴づける工程ＩＶは、機能的細胞の少なくとも１つの層を形成する工程の期間中に細胞に適用される少なくとも１つの非破壊的方法、及び／又は、代替的に、細胞の機能的且つ好ましくは連続的な層からなる少なくとも１つの層を形成する工程の完了時に適用される少なくとも１つの非破壊的又は破壊的方法を含む。
好ましくは、前記非破壊的方法は、試薬に対する細胞の代謝反応に関するアッセイ法である；一方、前記破壊的方法は、ＤＮＡ定量アッセイ法、又はＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、ＩＵＰＡＣ名２－（４－アミジノフェニル）－１Ｈ－インドール－６－カルボキサミジン、ＣＡＳＳ４７１６５－０４－８）、若しくはローダミン－ファロイジン（ファロイジンＣＡＳＳ番号１７４６６－４５－４）、若しくはヘマトキシリン（ＩＵＰＡＣ名７，１１ｂ－ジヒドロインデノ［２，１－ｃ］クロメン－３，４，６ａ，９，１０（６Ｈ）－ペントール、ＣＡＳＳ番号５１７－２８－２）、若しくはエオシンＹ（ＩＵＰＡＣ名２－（２，４，５，７－テトラブロモ－６－オキシド－３－オキソ－３Ｈ－キサンテン－９－イル）ベンゾエート（脱プロトン化の形態）、ＣＡＳＳ番号１７３７２－８７－１）を用いた比色分析法の中から選択される。破壊的方法を用いたアッセイ法は、前記機能的細胞層のサンプル、又は少なくとも１つの機能的細胞層で内側が覆われた管腔を有する前記スキャフォールド、例えば内皮化したスキャフォールド等のサンプルにおいて実施される。
本発明の主題である特徴づけ方法の工程Ｉ～ＩＩＩによりスキャフォールドに接着した細胞の生存性は、例えば細胞の代謝反応のアッセイによって、及び／又はサンプル中に存在するＤＮＡの定量によって評価される。
細胞生存性を評価するための前記代謝反応アッセイ法は、試薬として、例えばレサズリン（商標名Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ、ＩＵＰＡＣ名７－ヒドロキシ－１０－オキシドフェノキサジン－１０－イウム－３－オン、ＣＡＳ５５０－８２－３）、又は当業者にとって公知のその他の指示薬を使用する。そのようなアッセイ法は、指示薬の酸化－還元に起因して細胞生存性の定量を可能にする代謝反応から構成される；例えば、レサズリンは、生活細胞の還元的な雰囲気の存在下で還元されて、ピンク色の蛍光化合物であるレゾルフィンになる。前記代謝反応アッセイ法は、スキャフォールド上に機能的細胞の層を形成する工程の期間中に、細胞増殖を損ねることなく細胞に適用される非破壊的方法である。そのような代謝反応アッセイ法は、細胞生存性の指標（細胞の数ではない）である任意単位の蛍光値（Ａ．Ｕ．として省略される）を提供する。
細胞の生存性は、スキャフォールドに接着した細胞中に存在するゲノムＤＮＡを定量化するためのアッセイ法によっても分析可能であり、代謝反応アッセイで使用されるサンプルにおいて実施される。
ＤＮＡ定量アッセイ法は、サンプル中に存在する機能的生存細胞の数値を提供し、そして代謝反応アッセイ法を用いて取得されたＡ．Ｕ．の相対的数値を絶対値にすることが可能である。そのようなアッセイ法は、ＤＮＡの二本鎖に対するＰｉｃｏｇｒｅｅｎ（登録商標）（蛍光化合物）の結合、従って分光光度計の適する波長における、可視サンプル中へのＤＮＡの蛍光放出に基づく。特に、ゲノムＤＮＡは、スキャフォールドに接着した細胞から溶解を通じて抽出され、そしてＱｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）ｄｓＤＮＡアッセイ（Ｐ７５８９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を使用してその後定量化されるが、核酸の蛍光染色剤（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標））は、標準参照曲線を通じて溶液中のゲノムＤＮＡの濃度の決定を可能にする。
このアッセイは破壊的方法であり、従ってスキャフォールドに接着した細胞の機能的且つ好ましくは連続的な層（例えば、機能的且つ連続的な内皮）を形成する工程が完了したときに限り、結果を検証するために使用可能である。
ＤＮＡ定量アッセイ法は、サンプル中に存在する機能的生存細胞の数値を提供し、そして代謝反応アッセイ法を用いて取得されたＡ．Ｕ．の相対的数値を絶対値にすることが可能である。そのようなアッセイ法は、ＤＮＡの二本鎖に対するＰｉｃｏｇｒｅｅｎ（登録商標）（蛍光化合物）の結合、従って分光光度計の適する波長における、可視サンプル中へのＤＮＡの蛍光放出に基づく。特に、ゲノムＤＮＡは、スキャフォールドに接着した細胞から溶解を通じて抽出され、そしてＱｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）ｄｓＤＮＡアッセイ（Ｐ７５８９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を使用してその後定量化されるが、核酸の蛍光染色剤（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標））は、標準参照曲線を通じて溶液中のゲノムＤＮＡの濃度の決定を可能にする。
このアッセイは破壊的方法であり、従ってスキャフォールドに接着した細胞の機能的且つ好ましくは連続的な層（例えば、機能的且つ連続的な内皮）を形成する工程が完了したときに限り、結果を検証するために使用可能である。
本発明の主題である特徴づけ方法の工程Ｉ～ＩＩＩによりスキャフォールドに接着した細胞の形態は、例えばＤＡＰＩを用いた比色分析法、又はローダミン－ファロイジンを用いた比色分析法、又はヘマトキシリンを用いた比色分析法、又はエオシンを用いた比色分析法、又は当業者にとって公知の任意のその他のアッセイ法によって検証することができ、形態の特徴づけアッセイ法は、破壊的アッセイ法である。
ＤＡＰＩ及びヘマトキシリンを用いた２つのアッセイ法は、コア染色により、及び光学蛍光顕微鏡又は共焦点顕微鏡下で観察することで細胞形態の評価を可能にする；一方、ローダミン－ファロイジン及びエオシンを用いた２つのアッセイ法は、細胞質染色により細胞形態の評価を可能にする。
ＤＡＰＩ染色は、ＤＮＡのＡ－Ｔ領域に特異的に結合するという原理、従ってコアにおける青色の蛍光発光に基づく。ローダミン－ファロイジン染色は、ファロイジンがアクチンフィラメントに特異的に結合するという原理、従って細胞質における赤色の発光に基づく。ヘマトキシリン染色は、ヘマトキシリンが負に荷電した細胞コンポーネント（核酸、膜タンパク質等）に特異的に結合するという原理、従って青紫色の発光に基づく。エオシン染色は、エオシンが細胞質に特異的に結合するという原理、従ってピンク色の発光に基づく（図３０、ＤＡＰＩ／ローダミン－ファロイジン（ｆａｌｌｏｉｄｉｎｅ）染色）。
ＤＡＰＩ及びヘマトキシリンを用いた２つのアッセイ法は、コア染色により、及び光学蛍光顕微鏡又は共焦点顕微鏡下で観察することで細胞形態の評価を可能にする；一方、ローダミン－ファロイジン及びエオシンを用いた２つのアッセイ法は、細胞質染色により細胞形態の評価を可能にする。
ＤＡＰＩ染色は、ＤＮＡのＡ－Ｔ領域に特異的に結合するという原理、従ってコアにおける青色の蛍光発光に基づく。ローダミン－ファロイジン染色は、ファロイジンがアクチンフィラメントに特異的に結合するという原理、従って細胞質における赤色の発光に基づく。ヘマトキシリン染色は、ヘマトキシリンが負に荷電した細胞コンポーネント（核酸、膜タンパク質等）に特異的に結合するという原理、従って青紫色の発光に基づく。エオシン染色は、エオシンが細胞質に特異的に結合するという原理、従ってピンク色の発光に基づく（図３０、ＤＡＰＩ／ローダミン－ファロイジン（ｆａｌｌｏｉｄｉｎｅ）染色）。
更に、細胞形態は、ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクト（例えば、内皮化したスキャフォールド）のいくつかの部分の組織学的分析、及びパラフィン包埋、及び後続するミクロトームによる切片化によってテスト可能である。
本発明の主題である特徴づけ方法の工程Ｉ～ＩＩＩによりスキャフォールドに接着した細胞の機能性は、例えばいくつかの代表的な細胞マーカー遺伝子発現を評価することにより検証可能である。内皮細胞の場合、代表的マーカーは、例えばフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）、表面抗原分類３１（ＣＤ３１）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ－１）である。
フォン・ヴィルブランド（ＶＷＦ）因子は、内皮細胞に固有である一方、表面抗原分類３１（ＣＤ３１）因子は、内皮細胞間の細胞－細胞接着の代表的因子である。
細胞機能性を特徴づけるのに使用される技術は、免疫蛍光法と免疫組織化学法とに区別され得る。
免疫蛍光アッセイ法は、抗体と、ＶＷＦタンパク質（細胞質に見出される）又はＣＤ３１タンパク質（細胞膜に見出される）の抗原との間のコンジュゲーション、及び光学顕微鏡による蛍光検出システムに基づく。
免疫組織化学アッセイ法は、抗体と、ＶＷＦタンパク質（細胞質に見出される）又はＣＤ３１タンパク質（細胞膜に見出される）の抗原との間のコンジュゲーション、及び光学顕微鏡による酵素的検出システムに基づく。
細胞機能性は、フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）及び表面抗原分類３１（ＣＤ３１）因子について、リアルタイムＰＣＲアッセイ法によってもテストされる。
アッセイ法は、遺伝子発現の評価に基づき、また同法は全ＲＮＡの抽出をもたらし、そして－ｃＤＮＡへの逆転写後－リアルタイムＰＣＲ技術を使用しながら、特異的なＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用することで定量化する。
これまでに列挙したマーカーの遺伝子発現に対する機能レベルは、スキャフォールドの管腔に接着した細胞の良好な機能性及び生存性の指標である。
フォン・ヴィルブランド（ＶＷＦ）因子は、内皮細胞に固有である一方、表面抗原分類３１（ＣＤ３１）因子は、内皮細胞間の細胞－細胞接着の代表的因子である。
細胞機能性を特徴づけるのに使用される技術は、免疫蛍光法と免疫組織化学法とに区別され得る。
免疫蛍光アッセイ法は、抗体と、ＶＷＦタンパク質（細胞質に見出される）又はＣＤ３１タンパク質（細胞膜に見出される）の抗原との間のコンジュゲーション、及び光学顕微鏡による蛍光検出システムに基づく。
免疫組織化学アッセイ法は、抗体と、ＶＷＦタンパク質（細胞質に見出される）又はＣＤ３１タンパク質（細胞膜に見出される）の抗原との間のコンジュゲーション、及び光学顕微鏡による酵素的検出システムに基づく。
細胞機能性は、フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）及び表面抗原分類３１（ＣＤ３１）因子について、リアルタイムＰＣＲアッセイ法によってもテストされる。
アッセイ法は、遺伝子発現の評価に基づき、また同法は全ＲＮＡの抽出をもたらし、そして－ｃＤＮＡへの逆転写後－リアルタイムＰＣＲ技術を使用しながら、特異的なＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用することで定量化する。
これまでに列挙したマーカーの遺伝子発現に対する機能レベルは、スキャフォールドの管腔に接着した細胞の良好な機能性及び生存性の指標である。
実験パートで報告される結果から明らかなように、本発明の特徴づけ方法の特徴づけ工程ＩＶは、前記方法の工程Ｉ～ＩＩＩ（並びに適宜、段階Ｉ．１、ＩＩ．１～ＩＩ．２、ＩＩ．１～ＩＩ．４、ＩＩ．１～ＩＩ．９、ＩＩ．１～ＩＩＩ．３、２．１～２．１１、及び／又は３．１～３．１３）、特に播種方法及び潅流方法が有効であり、また分析対象の様々な管腔セクションに沿って、生存細胞、好ましくは内皮細胞の均質的、均一的、且つ再現性のある播種、接着、及び増殖を保証することを示す。
換言すれば、工程Ｉ～ＩＶ（並びに適宜、工程Ｉ．１、ＩＩ．１～ＩＩ．２、ＩＩ．１～ＩＩ．４、ＩＩ．１～ＩＩ．９、ＩＩ．１～ＩＩＩ．３、２．１～２．１１、及び／又は３．１～３．１３）を含む本発明の特徴づけ方法は、少なくとも１つの機能的且つ好ましくは連続的な細胞層、例えばコフルエント細胞を有する機能的且つ好ましくは連続的な内皮層等で内側が覆われた管腔の少なくとも１つの部分を有するスキャフォールドを含む、ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトについて、研究室スケール及び工業スケールの両方において、容易且つ再現性のある方式で製造すること、及びその特徴づけを可能にする。
本発明の主題である特徴づけ方法（工程Ｉ～ＩＶ）によって取得可能である少なくとも１つの機能的細胞層で内側が覆われた管腔の少なくとも１つの部分を有するスキャフォールド（２１）を含むティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトが本発明の目的を形成する。
好ましくは、前記少なくとも１つの機能的細胞層は、機能的な内皮細胞の層である；より好ましくは、それは、コフルエント細胞を有する内皮細胞の機能的且つ連続的な単層である。
有利には、前記スキャフォールドは、細胞、好ましくは筋肉細胞で外部表面を覆うことができる。
好ましくは、前記少なくとも１つの機能的細胞層は、機能的な内皮細胞の層である；より好ましくは、それは、コフルエント細胞を有する内皮細胞の機能的且つ連続的な単層である。
有利には、前記スキャフォールドは、細胞、好ましくは筋肉細胞で外部表面を覆うことができる。
ヒト又は動物用途の、好ましくは心血管領域及び末梢血管領域で使用するための医療用製品の有効性、毒性、及び／又は安全性をインビトロでテストするための方法が、本発明の目的を形成し、前記方法は、下記の工程：
－ 本発明による特徴づけ方法（工程Ｉ～ＩＶ）により取得可能であるティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトを含む、血管構造のインビトロモデルを調製する工程であって、前記ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトが、機能的な解剖学上及び生理学上の特性を有し、或いは動脈瘤、狭窄、硬化症プラーク、腫瘍の形成、又は心筋症に起因する損傷、又は変形、又は変性をシミュレートするのに適する機能障害的な解剖学上及び生理学上の特性を有し；好ましくは、前記血管構造が、血管、血液ダクト、及び中央又は末梢循環系の弁の中から選択され；より好ましくは、前記血管構造が、動脈、静脈、毛細血管、大動脈弁及び僧帽弁の中から選択される工程；その後に
－ テストされる医療用製品を前記血管構造のインビトロモデル中に導入する工程であって；好ましくは、医療用製品は、弁、心臓弁、ステント、グラフト、カテーテル、包帯、ネット、又はフィルターの中から選択される工程；その後に
－ 前記医療用製品の挙動、及びそれとヒト全血サンプル、人工血液、又はその誘導体との相互作用を評価するために、前記ヒト全血サンプル、人工血液、又はその誘導体が、前記医療用製品を含む前記血管構造を循環するのを、前記インビトロモデルにおいて可能にする工程
を含む。
－ 本発明による特徴づけ方法（工程Ｉ～ＩＶ）により取得可能であるティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトを含む、血管構造のインビトロモデルを調製する工程であって、前記ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトが、機能的な解剖学上及び生理学上の特性を有し、或いは動脈瘤、狭窄、硬化症プラーク、腫瘍の形成、又は心筋症に起因する損傷、又は変形、又は変性をシミュレートするのに適する機能障害的な解剖学上及び生理学上の特性を有し；好ましくは、前記血管構造が、血管、血液ダクト、及び中央又は末梢循環系の弁の中から選択され；より好ましくは、前記血管構造が、動脈、静脈、毛細血管、大動脈弁及び僧帽弁の中から選択される工程；その後に
－ テストされる医療用製品を前記血管構造のインビトロモデル中に導入する工程であって；好ましくは、医療用製品は、弁、心臓弁、ステント、グラフト、カテーテル、包帯、ネット、又はフィルターの中から選択される工程；その後に
－ 前記医療用製品の挙動、及びそれとヒト全血サンプル、人工血液、又はその誘導体との相互作用を評価するために、前記ヒト全血サンプル、人工血液、又はその誘導体が、前記医療用製品を含む前記血管構造を循環するのを、前記インビトロモデルにおいて可能にする工程
を含む。
実験パート
細胞生存性の評価：スキャフォールドに接着した細胞の代謝反応に対するレサズリンを用いたアッセイ
方法論１：
接着から約２４時間後、播種済みのスキャフォールドを、グリップから取り出す。その後、スキャフォールドを、細胞懸濁物の注入部位からの距離に応じて約２ｃｍの各寸法を有する３つのエリア：近位部、中央部、及び遠位部に切片化する（切断する）。その後、各切片を約１ｃｍ２の面積を有する４つの部分に分割する。内皮細胞が接着したスキャフォールドの各領域（近位部、中央部、及び遠位部）を代表する３つのサンプルそれぞれを、レサズリンを用いたアッセイ用として選択した。各サンプルを２４ウェルプレートのウェル内に配置し、そして新鮮増殖培地を含む０．０２ｍｇ／ｍｌレサズリンナトリウム塩溶液、１ｍｌと共に、好ましくは５％のＣＯ２において３７℃で３時間インキュベートした。新鮮増殖培地を含む０．０２ｍｇ／ｍｌレサズリンナトリウム塩溶液とスキャフォールドサンプル（内皮細胞が接着している）との間で発現する反応を、分光蛍光光度計を使用することにより、５９０ｎｍにおける任意単位の蛍光値（Ａ．Ｕ．）を検出し、それを使用して分析する。
細胞生存性の評価：スキャフォールドに接着した細胞の代謝反応に対するレサズリンを用いたアッセイ
方法論１：
接着から約２４時間後、播種済みのスキャフォールドを、グリップから取り出す。その後、スキャフォールドを、細胞懸濁物の注入部位からの距離に応じて約２ｃｍの各寸法を有する３つのエリア：近位部、中央部、及び遠位部に切片化する（切断する）。その後、各切片を約１ｃｍ２の面積を有する４つの部分に分割する。内皮細胞が接着したスキャフォールドの各領域（近位部、中央部、及び遠位部）を代表する３つのサンプルそれぞれを、レサズリンを用いたアッセイ用として選択した。各サンプルを２４ウェルプレートのウェル内に配置し、そして新鮮増殖培地を含む０．０２ｍｇ／ｍｌレサズリンナトリウム塩溶液、１ｍｌと共に、好ましくは５％のＣＯ２において３７℃で３時間インキュベートした。新鮮増殖培地を含む０．０２ｍｇ／ｍｌレサズリンナトリウム塩溶液とスキャフォールドサンプル（内皮細胞が接着している）との間で発現する反応を、分光蛍光光度計を使用することにより、５９０ｎｍにおける任意単位の蛍光値（Ａ．Ｕ．）を検出し、それを使用して分析する。
方法論２：
ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）１×中の０．２ｍｇ／ｍｌレサズリン溶液及び０．１μｍフィルターを使用して予め濾過したＥＧＭ培地から開始して、ラミナーフローフード下、ＥＧＭ（内皮増殖培地）内で、０．０２ｍｇ／ｍｌレサズリン溶液を調製する。サーモスタット式水浴内で使用する前に、３７℃まで予備加熱する。
バイオリアクターチャンバー（滅菌性のラミナーフローフード下でＨＵＶＥＣが予め播種されたスキャフォールドがその中に挿入されている）を移動させる。クランプ及びコネクター用のキャップを使用して、バイオリアクターチャンバーと接続しているあらゆる回路を切り離す。チャンバーを傾けることによって、重力によりスキャフォールドの管腔内に存在するＥＧＭを除去する。
スキャフォールド細胞播種手順（ＭＭＭ－０５－００）を使用して、ＥＧＭ中の０．０２ｍｇ／ｍｌレサズリン溶液をスキャフォールドの管腔内に注入する。
同一のインキュベーター内に配置された滅菌状態の１５ｍｌチューブ内に３ｍｌの同レサズリン溶液を添加して、分析用のブランクを調製する。インキュベーター内、３７℃＋５％ＣＯ２において３０分間インキュベートする。
３０分後、バイオリアクターチャンバーをラミナーフローフード下に戻し、そしてチャンバーを傾けることによって、重力によりスキャフォールドの管腔を空にし、そして１５ｍｌチューブ内に溶液を収集する。
分光蛍光光度計読み取り用のディッシュを負荷するために、サンプルをベンチに移動する。
１ｍｌの各サンプルを予めラベル表示した１．５ｍｌチューブ内に移すのにｐ１０００マイクロピペットを使用する。分光蛍光光度計分析後、サンプルを－２０℃の冷蔵庫内の特別なボックスにおいて保管する。
ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）１×中の０．２ｍｇ／ｍｌレサズリン溶液及び０．１μｍフィルターを使用して予め濾過したＥＧＭ培地から開始して、ラミナーフローフード下、ＥＧＭ（内皮増殖培地）内で、０．０２ｍｇ／ｍｌレサズリン溶液を調製する。サーモスタット式水浴内で使用する前に、３７℃まで予備加熱する。
バイオリアクターチャンバー（滅菌性のラミナーフローフード下でＨＵＶＥＣが予め播種されたスキャフォールドがその中に挿入されている）を移動させる。クランプ及びコネクター用のキャップを使用して、バイオリアクターチャンバーと接続しているあらゆる回路を切り離す。チャンバーを傾けることによって、重力によりスキャフォールドの管腔内に存在するＥＧＭを除去する。
スキャフォールド細胞播種手順（ＭＭＭ－０５－００）を使用して、ＥＧＭ中の０．０２ｍｇ／ｍｌレサズリン溶液をスキャフォールドの管腔内に注入する。
同一のインキュベーター内に配置された滅菌状態の１５ｍｌチューブ内に３ｍｌの同レサズリン溶液を添加して、分析用のブランクを調製する。インキュベーター内、３７℃＋５％ＣＯ２において３０分間インキュベートする。
３０分後、バイオリアクターチャンバーをラミナーフローフード下に戻し、そしてチャンバーを傾けることによって、重力によりスキャフォールドの管腔を空にし、そして１５ｍｌチューブ内に溶液を収集する。
分光蛍光光度計読み取り用のディッシュを負荷するために、サンプルをベンチに移動する。
１ｍｌの各サンプルを予めラベル表示した１．５ｍｌチューブ内に移すのにｐ１０００マイクロピペットを使用する。分光蛍光光度計分析後、サンプルを－２０℃の冷蔵庫内の特別なボックスにおいて保管する。
分光蛍光光度計分析：
ひとたび、レサズリン溶液及びブランクが１５ｍｌチューブ内に収集されたら、ｐ２００マイクロピペットを使用して、９６ウェルブラックプレート中に１００μｌの各サンプルを三重で負荷する。
５１０ｎｍでの励起及び５９０ｎｍでの発光蛍光を、Ａ．Ｕ．値（任意単位の蛍光値）を読み取るための検出パラメーターとして設定して、分光蛍光光度計下でプレートを読み取る。
ひとたび、レサズリン溶液及びブランクが１５ｍｌチューブ内に収集されたら、ｐ２００マイクロピペットを使用して、９６ウェルブラックプレート中に１００μｌの各サンプルを三重で負荷する。
５１０ｎｍでの励起及び５９０ｎｍでの発光蛍光を、Ａ．Ｕ．値（任意単位の蛍光値）を読み取るための検出パラメーターとして設定して、分光蛍光光度計下でプレートを読み取る。
細胞生存性の評価：ＰＩＣＯＧＲＥＥＮを使用するスキャフォールドに接着した細胞のゲノムＤＮＡの定量化
方法論
ゲノムＤＮＡ定量分析法は、スキャフォールド切片に接着したＨＵＶＥＣのサンプル、１ｃｍ２に適用可能である。
Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ試薬及びキット（Ｐ７５８９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）というキットと、以下に列挙する試薬を使用する。
ＨＵＶＥＣが接着したスキャフォールド切片を１．５ｍｌチューブ内に配置し、そして１８０μｌのＡＵＴ溶液及び２０μｌのプロテイナーゼＫを添加し、プッシュボタンモードを使用して１５秒間ボルテックス混合する。サーモブロック内、５６℃、オーバーナイトでインキュベートする。２００μｌのＡＵＬ溶液を添加し、そしてプッシュボタンモードを使用して１５秒間ボルテックス混合する。サーモブロック内、７０℃で１０分間インキュベートする。遠心機内で回転させる。２００μｌのエタノールを添加し（溶媒が２５℃を超えないことを確実にする）、そしてプッシュボタンモードを使用して１５秒間ボルテックス混合する。
６０００×ｇ（８０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離する。ライセートを、２ｍｌチューブに挿入されたＱＩＡａｍｐ ＵＣＰ ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに移す。
６０００×ｇ（８０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離する。カラムを新しい２ｍｌチューブに移し、そして５００μｌのバッファーＡＵＷ１を添加する。
６０００×ｇ（８０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離する。カラムを新しい２ｍｌチューブに移し、そして５００μｌのバッファーＡＵＷ２を添加する。
６０００×ｇ（８０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離する。カラムを新しい２ｍｌチューブに移し、そして２００００×ｇ（１２０００ｒｐｍ）で３分間遠心分離する。カラムを予めラベル表示された１．５ｍｌチューブに移し、そして２０μｌのＩ型Ｈ２Ｏを膜上に直接添加し、そしてＲＴで５分間インキュベートする。
２００００×ｇ（１２０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離する。カラムを廃棄し、そしてサンプルを－２０℃で保管する。
下記の分析法は、Ｈ２Ｏ中で再懸濁したゲノムＤＮＡのサンプルに適用可能である。
方法論
ゲノムＤＮＡ定量分析法は、スキャフォールド切片に接着したＨＵＶＥＣのサンプル、１ｃｍ２に適用可能である。
Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ試薬及びキット（Ｐ７５８９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）というキットと、以下に列挙する試薬を使用する。
ＨＵＶＥＣが接着したスキャフォールド切片を１．５ｍｌチューブ内に配置し、そして１８０μｌのＡＵＴ溶液及び２０μｌのプロテイナーゼＫを添加し、プッシュボタンモードを使用して１５秒間ボルテックス混合する。サーモブロック内、５６℃、オーバーナイトでインキュベートする。２００μｌのＡＵＬ溶液を添加し、そしてプッシュボタンモードを使用して１５秒間ボルテックス混合する。サーモブロック内、７０℃で１０分間インキュベートする。遠心機内で回転させる。２００μｌのエタノールを添加し（溶媒が２５℃を超えないことを確実にする）、そしてプッシュボタンモードを使用して１５秒間ボルテックス混合する。
６０００×ｇ（８０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離する。ライセートを、２ｍｌチューブに挿入されたＱＩＡａｍｐ ＵＣＰ ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに移す。
６０００×ｇ（８０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離する。カラムを新しい２ｍｌチューブに移し、そして５００μｌのバッファーＡＵＷ１を添加する。
６０００×ｇ（８０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離する。カラムを新しい２ｍｌチューブに移し、そして５００μｌのバッファーＡＵＷ２を添加する。
６０００×ｇ（８０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離する。カラムを新しい２ｍｌチューブに移し、そして２００００×ｇ（１２０００ｒｐｍ）で３分間遠心分離する。カラムを予めラベル表示された１．５ｍｌチューブに移し、そして２０μｌのＩ型Ｈ２Ｏを膜上に直接添加し、そしてＲＴで５分間インキュベートする。
２００００×ｇ（１２０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離する。カラムを廃棄し、そしてサンプルを－２０℃で保管する。
下記の分析法は、Ｈ２Ｏ中で再懸濁したゲノムＤＮＡのサンプルに適用可能である。
校正曲線の調製：
ＴＥ２０×（コンポーネントＢ）を、Ｉ型Ｈ２Ｏを使用して、試験管又はチューブ内でＴＥ１×に希釈する。
ＴＥ１×を用いてＱｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ試薬（コンポーネントＡ）を１：２００希釈することによりＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬を調製するが、但し使用時に試験管内で調製する。
ｄｓＤＮＡラムダ（１００μｇ／ｍｌ、コンポーネントＣ）の標準ストック溶液から開始して希釈ＤＮＡ溶液を調製し、そして校正曲線を、希釈ＮＡ溶液を使用して以下のように調製するが、但しサンプル中のｄｓＤＮＡ推定含有量に関連してその溶液を選択する。
ＴＥ２０×（コンポーネントＢ）を、Ｉ型Ｈ２Ｏを使用して、試験管又はチューブ内でＴＥ１×に希釈する。
ＴＥ１×を用いてＱｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ試薬（コンポーネントＡ）を１：２００希釈することによりＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬を調製するが、但し使用時に試験管内で調製する。
ｄｓＤＮＡラムダ（１００μｇ／ｍｌ、コンポーネントＣ）の標準ストック溶液から開始して希釈ＤＮＡ溶液を調製し、そして校正曲線を、希釈ＮＡ溶液を使用して以下のように調製するが、但しサンプル中のｄｓＤＮＡ推定含有量に関連してその溶液を選択する。
高濃度範囲標準曲線：
ｄｓＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）の標準ストック溶液から開始して、２μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ溶液を調製し、ＴＥ１×を使用して１．５ｍｌ試験管内で１：５０希釈する。
図２８に示すように、２μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ溶液を１．５ｍｌ試験管内で連続希釈する。
ｄｓＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）の標準ストック溶液から開始して、２μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ溶液を調製し、ＴＥ１×を使用して１．５ｍｌ試験管内で１：５０希釈する。
図２８に示すように、２μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ溶液を１．５ｍｌ試験管内で連続希釈する。
低濃度範囲標準曲線：
２μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ溶液から開始して、５０ｎｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ溶液を調製し、ＴＥ１×を使用して１．５ｍｌ試験管内で１：４０希釈する。
図２９に示すように、５０ｎｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ溶液を１．５ｍｌ試験管内で連続希釈する。
２μｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ溶液から開始して、５０ｎｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ溶液を調製し、ＴＥ１×を使用して１．５ｍｌ試験管内で１：４０希釈する。
図２９に示すように、５０ｎｇ／ｍｌのｄｓＤＮＡ溶液を１．５ｍｌ試験管内で連続希釈する。
サンプル分析：
選択した曲線の各ポイントについて、２５μｌを、９６ウェルブラックプレートのウェル内に重複して負荷する。
ＴＥ１×（ブランク）溶液、２５μｌを、同じ９６ウェルブラックプレートのウェル内に重複して負荷する。
定量化する各サンプル、２５μｌを、同じ９６ウェルブラックプレートのウェル内に三重で負荷するが、好適には、必要な場合、ＴＥ１×を使用してサンプルを希釈する。
負荷したウェル（曲線の各ポイント、ブランク、及びサンプル）のそれぞれに、等しい容量２５μｌのＰｉｃｏＧｒｅｅｎを添加し、十分混合する。
９６ウェルブラックプレートを、ＲＴ、暗光にて２～５分インキュベートする。
励起波長を４８０ｎｍに、そして発光波長を５２０ｎｍに設定して、分光蛍光光度計下で蛍光を測定する。
ブランクサンプルの任意単位の蛍光値（Ｕ．Ａ）を、定量化するサンプルのそれぞれ、及び曲線用の各サンプルの蛍光値から減じる。
取得した数値を使用して、ＤＮＡ濃度に対して蛍光標準曲線を生成する（エクセルファイルを使用する）。
蛍光標準曲線を使用して、各サンプルのｄｓＤＮＡ量（総ｎｇ／ｍｌ及びｎｇ）を計算する。
選択した曲線の各ポイントについて、２５μｌを、９６ウェルブラックプレートのウェル内に重複して負荷する。
ＴＥ１×（ブランク）溶液、２５μｌを、同じ９６ウェルブラックプレートのウェル内に重複して負荷する。
定量化する各サンプル、２５μｌを、同じ９６ウェルブラックプレートのウェル内に三重で負荷するが、好適には、必要な場合、ＴＥ１×を使用してサンプルを希釈する。
負荷したウェル（曲線の各ポイント、ブランク、及びサンプル）のそれぞれに、等しい容量２５μｌのＰｉｃｏＧｒｅｅｎを添加し、十分混合する。
９６ウェルブラックプレートを、ＲＴ、暗光にて２～５分インキュベートする。
励起波長を４８０ｎｍに、そして発光波長を５２０ｎｍに設定して、分光蛍光光度計下で蛍光を測定する。
ブランクサンプルの任意単位の蛍光値（Ｕ．Ａ）を、定量化するサンプルのそれぞれ、及び曲線用の各サンプルの蛍光値から減じる。
取得した数値を使用して、ＤＮＡ濃度に対して蛍光標準曲線を生成する（エクセルファイルを使用する）。
蛍光標準曲線を使用して、各サンプルのｄｓＤＮＡ量（総ｎｇ／ｍｌ及びｎｇ）を計算する。
レサズリンを用いた代謝反応に関するアッセイ及びＰＩＣＣＯＧＲＥＥＮを使用するスキャフォールドに接着した細胞のゲノムＤＮＡの定量化の結果
図１５Ａ及び図１５Ｂでは、３つの異なる実験（ＤＹＮ１、ＤＹＮ２、及びＤＹＮ３と命名）において、内皮細胞が播種され、そして２４時間インキュベートしたスキャフォールドの各領域（近位部、中央部、及び遠位部）を代表するサンプルを対象として、方法論１に従い、レサズリンを用いた代謝反応アッセイを使用して得られた数値がチャートに表わされている。図１５Ａ及び図１５Ｂのチャートは、内皮細胞の良好な接着及び生存性を示している。
このデータは、内皮細胞のゲノムＤＮＡ含有量が約７ｐｇであることを考慮して計算されたゲノムＤＮＡの定量化（図１５Ｃ及び図１５Ｄ）により確認された。
内皮細胞が播種されたスキャフォールドの様々な近位、中央、及び遠位切片において、細胞生存性に有意な差異は観測されなかった。特に、細胞生存性及びその数は、その近位、中央、及び遠位部分における長さ方向（スキャフォールドの主要な軸）に沿って比較可能である。
図１５Ａ及び図１５Ｂでは、３つの異なる実験（ＤＹＮ１、ＤＹＮ２、及びＤＹＮ３と命名）において、内皮細胞が播種され、そして２４時間インキュベートしたスキャフォールドの各領域（近位部、中央部、及び遠位部）を代表するサンプルを対象として、方法論１に従い、レサズリンを用いた代謝反応アッセイを使用して得られた数値がチャートに表わされている。図１５Ａ及び図１５Ｂのチャートは、内皮細胞の良好な接着及び生存性を示している。
このデータは、内皮細胞のゲノムＤＮＡ含有量が約７ｐｇであることを考慮して計算されたゲノムＤＮＡの定量化（図１５Ｃ及び図１５Ｄ）により確認された。
内皮細胞が播種されたスキャフォールドの様々な近位、中央、及び遠位切片において、細胞生存性に有意な差異は観測されなかった。特に、細胞生存性及びその数は、その近位、中央、及び遠位部分における長さ方向（スキャフォールドの主要な軸）に沿って比較可能である。
このエビデンスを裏付けるために、内皮細胞が播種され、そして約２４時間インキュベートしたスキャフォールドの各領域（近位部、中央部、遠位部）を代表するサンプルを対象として、ＤＡＰＩ（Ｄ１３０６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及びローダミン－ファロイジン（Ｒ４１５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用する共染色を実施した。約２４時間の培養後、その結果は、内皮細胞が生存しており、またスキャフォールドの管腔上に均一に分布していることを示している。特に、この結果は、少なくとも９０％の細胞コンフルエンスを示している。
結論として、本発明の特徴づけ方法の特徴づけ工程ＩＶは、前記方法の工程Ｉ～ＩＩＩ、特に播種方法及び潅流方法が効果的であり、また分析対象の様々な管腔切片に沿って（ｌｏｎｇ）、生存性の内皮細胞の均質、均一、且つ再現性のある播種、接着、及び増殖を保証することを示す。
結論として、本発明の特徴づけ方法の特徴づけ工程ＩＶは、前記方法の工程Ｉ～ＩＩＩ、特に播種方法及び潅流方法が効果的であり、また分析対象の様々な管腔切片に沿って（ｌｏｎｇ）、生存性の内皮細胞の均質、均一、且つ再現性のある播種、接着、及び増殖を保証することを示す。
コア及びＦ－アクチンフィラメント染色による細胞形態の評価
下記の分析方法が、スキャフォールド切片に接着したＨＵＶＥＣのコア及びＦ－アクチンフィラメント染色に適用される。該方法は破壊的方法である。
この方法は、コアを染色するのにＤＡＰＩ、及び細胞質染色にローダミン－ファロイジンを使用する。
下記の分析方法が、スキャフォールド切片に接着したＨＵＶＥＣのコア及びＦ－アクチンフィラメント染色に適用される。該方法は破壊的方法である。
この方法は、コアを染色するのにＤＡＰＩ、及び細胞質染色にローダミン－ファロイジンを使用する。
方法論
ＨＵＶＥＣが接着したスキャフォールド切片、１ｃｍ２を、２４ウェルプレートのウェル内に配置する。２４時間前に細胞約２．５×１０５個が播種されたスキャフォールド、１ｃｍ２と同一タイプの切片を、陽性コントロール分析として使用する。
各サンプルについて以下のように進める。
１×ＰＢＳを使用して連続３回の迅速洗浄を実施し、プラスチック製パスツールピペットを使用してサンプルウェルを覆う。痕跡量の１×ＰＢＳを残さず取り除き、そして－ヒュームフード下で－プラスチック製パスツールピペットを使用して、１０％の中性緩衝ホルマリンを添加し、各サンプルウェルを覆う。室温で１０分間インキュベートする。１×ＰＢＳを使用して洗浄を５分間、３回実施するが、撹拌プレート上で撹拌しながら行えばなお良い。
７０％ＥｔＯＨ中のスダンブラック溶液を添加し、サンプルウェルを覆い、そして暗光、室温で３０分間インキュベートする。ここより先、サンプルは暗光において取り扱う。
サンプルを１×ＰＢＳを含むウェルに移し、そして痕跡量のスダンブラックがもはや認められなくなるまで、１×ＰＢＳを使用して反復洗浄を実施する。１×ＰＢＳ中の０．１％トリトン溶液を添加し、サンプルウェルを覆い、そして暗光、室温で５分間インキュベートする。１×ＰＢＳを使用して洗浄を５分間、２回実施するが、撹拌プレート上で撹拌しながら行えばなお良い。
１×ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液を添加し、サンプルウェルを覆い、そして室温で２０分間インキュベートする。１×ＰＢＳを使用して洗浄を５分間、２回実施するが、撹拌プレート上で撹拌しながら行えばなお良い。
マイクロピペットを使用して、新たに調製した、１×ＰＢＳの１％ＢＳＡ中の１：１００ローダミン－ファロイジン溶液を添加し、サンプルウェルを覆い、そして室温で２０分間インキュベートする。１×ＰＢＳを使用して洗浄を５分間、３回実施するが、撹拌プレート上で撹拌しながら行えばなお良い。
マイクロピペットを使用して、新たに調製した、１×ＰＢＳ中のＤＡＰＩ １：２００溶液を添加し、サンプルウェルを覆い、そして３７℃で３分間インキュベートする。１×ＰＢＳを使用して洗浄を５分間、２回実施するが、撹拌プレート上で撹拌しながら行えばなお良い。
スライド及びカバースリップを使用しながら、マウント化しないで、蛍光顕微鏡下でサンプルを観察する。
青色チャンネルを通じて核染色を観察し、また赤色チャンネルを通じてアクチンフィラメントの色味を観察する。サンプルを１×ＰＢＳ内、４℃で保管する。
ＨＵＶＥＣが接着したスキャフォールド切片、１ｃｍ２を、２４ウェルプレートのウェル内に配置する。２４時間前に細胞約２．５×１０５個が播種されたスキャフォールド、１ｃｍ２と同一タイプの切片を、陽性コントロール分析として使用する。
各サンプルについて以下のように進める。
１×ＰＢＳを使用して連続３回の迅速洗浄を実施し、プラスチック製パスツールピペットを使用してサンプルウェルを覆う。痕跡量の１×ＰＢＳを残さず取り除き、そして－ヒュームフード下で－プラスチック製パスツールピペットを使用して、１０％の中性緩衝ホルマリンを添加し、各サンプルウェルを覆う。室温で１０分間インキュベートする。１×ＰＢＳを使用して洗浄を５分間、３回実施するが、撹拌プレート上で撹拌しながら行えばなお良い。
７０％ＥｔＯＨ中のスダンブラック溶液を添加し、サンプルウェルを覆い、そして暗光、室温で３０分間インキュベートする。ここより先、サンプルは暗光において取り扱う。
サンプルを１×ＰＢＳを含むウェルに移し、そして痕跡量のスダンブラックがもはや認められなくなるまで、１×ＰＢＳを使用して反復洗浄を実施する。１×ＰＢＳ中の０．１％トリトン溶液を添加し、サンプルウェルを覆い、そして暗光、室温で５分間インキュベートする。１×ＰＢＳを使用して洗浄を５分間、２回実施するが、撹拌プレート上で撹拌しながら行えばなお良い。
１×ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液を添加し、サンプルウェルを覆い、そして室温で２０分間インキュベートする。１×ＰＢＳを使用して洗浄を５分間、２回実施するが、撹拌プレート上で撹拌しながら行えばなお良い。
マイクロピペットを使用して、新たに調製した、１×ＰＢＳの１％ＢＳＡ中の１：１００ローダミン－ファロイジン溶液を添加し、サンプルウェルを覆い、そして室温で２０分間インキュベートする。１×ＰＢＳを使用して洗浄を５分間、３回実施するが、撹拌プレート上で撹拌しながら行えばなお良い。
マイクロピペットを使用して、新たに調製した、１×ＰＢＳ中のＤＡＰＩ １：２００溶液を添加し、サンプルウェルを覆い、そして３７℃で３分間インキュベートする。１×ＰＢＳを使用して洗浄を５分間、２回実施するが、撹拌プレート上で撹拌しながら行えばなお良い。
スライド及びカバースリップを使用しながら、マウント化しないで、蛍光顕微鏡下でサンプルを観察する。
青色チャンネルを通じて核染色を観察し、また赤色チャンネルを通じてアクチンフィラメントの色味を観察する。サンプルを１×ＰＢＳ内、４℃で保管する。
組織学的分析法を使用する細胞形態の評価
パラフィン包埋及び組織学的評価のためのサンプルの調製を、以下の記載に従い実施する。
パラフィン包埋及び組織学的評価のためのサンプルの調製を、以下の記載に従い実施する。
非滅菌の１×ＰＢＳ内で管状切片をリンスする。チューブ内で切片を１０％ホルマリンに浸漬し、そして＋４℃で４時間インキュベートする。切片を７０％エタノール内でリンスする。切片をチューブ内で７０％エタノールに浸漬し、そして＋４℃で保管する。
２つの切片を各サンプルから取得する：一方は、高さ２～３ｍｍの寸法である横方向、及び他方（残りの部分）。調製を以下のように継続する：
－清澄化：脱水後の調製物にはエタノールが含まれるが、エタノールは包埋工程において調製物に浸透する物質（パラフィン）と混ざり合うことができないので、エタノール及びパラフィンの両方と混ざり合うことができる中間溶媒で置換しなければならない。使用される清澄化剤はキシレンである。
－包埋：５６～５８℃の温度で実施される浸透工程は以下の通りである：
－キシレン／パラフィン（５０％－５０％）
－純粋なパラフィン（２～３回交換する）
－切片化：ミクロトームを、厚さ５μｍを有するスライスを取得するのに使用する。
－キシレン／パラフィン（５０％－５０％）
－純粋なパラフィン（２～３回交換する）
－切片化：ミクロトームを、厚さ５μｍを有するスライスを取得するのに使用する。
－脱蝋：パラフィン切片は幾分疎水的であり、染色するためにはパラフィンを除去しなければならない；従って、スライドは、
－キシレン
－キシレン／エタノール（５０％－５０％）
－１００％エタノール
－９５％エタノール
－７０％エタノール
－５０％エタノール
－蒸留水
を用いて処理しなければならない。
－キシレン
－キシレン／エタノール（５０％－５０％）
－１００％エタノール
－９５％エタノール
－７０％エタノール
－５０％エタノール
－蒸留水
を用いて処理しなければならない。
－染色：ヘマトキシリンエオシン
－脱水：切片を再度脱水し、そしてキシレンに戻されなければならない：
－蒸留水
－７０％エタノール
－９０％エタノール
－９５％エタノール
－１００％エタノール（２回交換）
－キシレン
－蒸留水
－７０％エタノール
－９０％エタノール
－９５％エタノール
－１００％エタノール（２回交換）
－キシレン
－マウント化：カバースリップは、スライドにしっかりと固定しなければならない。これは、２つのエレメントを相互に完全接着するのを保証すると共に、乾燥すると調製物を安定且つ不変的にする天然樹脂又は合成樹脂を使用して得られる（カナダバルサム）。
－観察：下記の倍率：２５×；５０×；１００×；２００×；４００×、及び１０００×での光学顕微鏡による。
スキャフォールドの内部表面上の細胞形態と分布、及び細胞状態の評価を、ヘマトキシリンとエオシンを使用する染色により実施する。
サンプルを切片化し、そしてパラフィン中に含め、次に５μｍスライスを切断し、そしてヘマトキシリンとエオシンを使用して染色した（図３１及び図３２）。
すべてのサンプルを、次に顕微鏡下、異なる倍率で検査した。
サンプルを切片化し、そしてパラフィン中に含め、次に５μｍスライスを切断し、そしてヘマトキシリンとエオシンを使用して染色した（図３１及び図３２）。
すべてのサンプルを、次に顕微鏡下、異なる倍率で検査した。
Claims (13)
- ヒト又は動物用途の医療用製品をインビトロでテストするのに使用可能である、少なくとも１つの機能的細胞層で内側が覆われた管腔の少なくとも１つの部分を有するスキャフォールドを含む、ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトを特徴づけるための方法であって、
－ Ｉ．バイオリアクター（１１）－スキャフォールド（２１）システムを取得するために、バイオリアクター（１１）のチャンバー内でスキャフォールド（２１）を調製する工程、その後に
－ ＩＩ．前記スキャフォールド（２１）の管腔の少なくとも１つの部分に細胞培養物を播種し、及びスキャフォールド（２１）に対する前記細胞の接着を可能にして、播種済みのバイオリアクター（１１）－スキャフォールド（２１）システムを取得するための播種方法を適用する工程、その後に
－ ＩＩＩ．前記スキャフォールド（２１）の管腔の少なくとも１つの部分に接着した機能的細胞の少なくとも１つの層が形成されるまで、前記スキャフォールド（２１）の管腔内の前記播種された細胞の増殖及び組織化を刺激する工程、その後又はそれと同時に
－ ＩＶ．前記スキャフォールド（２１）の管腔の少なくとも１つの部分の内側を覆う前記細胞を、その生存性、形態、機能性、及び／若しくは分布について検証するために特徴づける工程
を含み、
前記スキャフォールド（２１）の管腔の少なくとも１つの部分の内側を覆う前記細胞を特徴づける工程ＩＶが、機能的細胞の少なくとも１つの層を形成する工程ＩＩＩの期間中に細胞に適用される少なくとも１つの非破壊的方法、及び／又は機能的細胞の少なくとも１つの層を形成する工程ＩＩＩの完了時に適用される少なくとも１つの非破壊的方法を含む、
方法。 - 前記スキャフォールド（２１）の管腔の少なくとも１つの部分の内側を覆う前記細胞が、血管組織の内皮を構成する細胞の中から選択され；好ましくはＨＡＯＥＣ（ヒト大動脈内皮細胞）、ＨＣＡＥＣ（ヒト冠動脈内皮細胞）、ＨＭＶＥＣ（ヒト皮膚微小血管内皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の中から選択される内皮細胞である、請求項１に記載の特徴づけ方法。
- 前記スキャフォールドの管腔が、少なくとも１つの機能的且つ連続的な細胞層、好ましくは機能的且つ連続的な内皮細胞の単層で少なくとも部分的に内側が覆われている、請求項１又は２に記載の特徴づけ方法。
- 前記播種方法が、
－ 前記細胞培養物、好ましくは内皮細胞を、新鮮増殖培地及び細胞、好ましくは内皮細胞を含む細胞懸濁物の形態で、ロータリーコネクター（ＣＲ１）によって、バイオリアクター（１１）の上流に配置されているＴ字コネクター（Ｔ２）上に取り付けられたコンテナ（９１）内に放出する工程、その後に
－ 流体速度によって、前記細胞懸濁物が気泡を生成することなくＴ字コネクター（Ｔ２）中に滴下され、そして前記スキャフォールド（２１）の管腔内部に存在する気泡が、バイオリアクター（１１）の下流に配置されたＴ字コネクター（Ｔ３）の開口部に向かって押し出され、その流出が可能となるように、定常流を用いながら、前記細胞培養物、好ましくは内皮細胞を、バイオリアクター（１１）内に存在する前記スキャフォールド（２１）の管腔内部に放出する工程、
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の特徴づけ方法。 - 前記播種方法が、細胞培養物、好ましくは内皮細胞を、前記スキャフォールド（２１）の管腔内に放出する工程の後に、
－ 前記スキャフォールド（２１）の管腔内部への細胞の均一な接着を可能にするために、前記スキャフォールド（２１）を、その縦軸に沿って、２～４８時間の間に含まれる時間、好ましくは２４時間、０．５～５ｒｐｍの間、好ましくは１．５～２ｒｐｍに含まれる回転スピードで連続的に回転させる工程、その後に
－ ２～４８時間の間に含まれる時間、好ましくは２４時間、２０～４５℃の温度、好ましくは３７℃において、１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２の存在下で、バイオリアクター（１１）内に収容された前記スキャフォールド（２１）をインキュベートする工程
を更に含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の特徴づけ方法。 - 前記細胞、好ましくは内皮細胞の増殖及び組織化を刺激する工程ＩＩＩが、前記播種済みのスキャフォールド（２１）の管腔内に存在する細胞に、２０℃～４５℃の範囲に含まれる温度、好ましくは３７℃を有する高温の新鮮増殖培地を用いた潅流方法を適用する工程を含み、
前記潅流方法が、
－ 気泡を除去するためのエレメント（７１～７２又はＢＴ）及び前記播種済みのバイオリアクター（１１）－スキャフォールド（２１）システムを潅流回路（５１～５６）に接続する工程であって、前記気泡を除去するためのエレメントが前記播種済みのバイオリアクター（１１）－スキャフォールド（２１）システムの上流に挿入される工程；その後又はそれに先行して
－ 前記気泡を除去するためのエレメント（７１～７２又はＢＴ）の少なくとも１つの部分を、前記高温の新鮮増殖培地で充填する工程であって、前記気泡を除去するためのエレメント（７１～７２又はＢＴ）が、チャンバー、前記チャンバーを閉鎖するためのキャップ、流入機能を有するアクセス（２１１）及び流出機能を有するアクセス（２１２）を備え、前記チャンバーが、ある容量を有し、並びに前記容量の第１の部分が前記高温の新鮮増殖培地で充填され、及び前記容量の第２の部分が空気で充填されており、前記容量の前記第２の部分が、前記流入機能を有するアクセス（２１１）及び前記流出機能を有するアクセス（２１２）を流通する前記新鮮増殖培地中に存在する気泡をトラップする機能を有し；好ましくは前記気泡を除去するためのエレメント（７１～７２又はＢＴ）がバブルトラップ等である工程；その後に
－ 前記高温の新鮮増殖培地を用いた前記播種済みのスキャフォールド（２１）の潅流を、好ましくはペリスタポンプによって可能にする工程
を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の特徴づけ方法。 - 前記非破壊的方法が、試薬に対する細胞の代謝反応に関するアッセイ法である、請求項１から６のいずれか一項に記載の特徴づけ方法。
- 前記スキャフォールド（２１）の管腔の少なくとも１つの部分の内側を覆う前記細胞、好ましくは内皮細胞を特徴づける工程ＩＶが、機能的細胞の少なくとも１つの層を形成する工程ＩＩＩの完了時に適用される少なくとも１つの破壊的方法を更に含み；好ましくは、前記破壊的な方法が、ＤＮＡ定量アッセイ、又は２－（４－アミジノフェニル）－１Ｈ－インドール－６－カルボキサミジン（ＤＡＰＩ）、若しくはローダミン－ファロイジン、若しくはヘマトキシリン、若しくはエオシンを用いた比色分析法の中から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の特徴づけ方法。
- スキャフォールドを調製する前記工程Ｉが、
－ バイオリアクター（１１）－スキャフォールド（２１）システムを取得するために、バイオリアクターチャンバー（１１）内のスキャフォールド（２１）を、スキャフォールドホルダー（１３）によって取り付ける工程であって、前記スキャフォールド（２１）が、実質的に管状形状のポリマー性スキャフォールドであり、好ましくは静電紡糸型絹フィブロインからなる工程
を含み；並びに
前記播種方法が、
－ 新鮮増殖培地を、バイオリアクターチャンバー（１１）内部に配置されている前記スキャフォールドホルダー（１３）上に固定された前記スキャフォールド（２１）の管腔内に注入する工程；その後に
－ 前記新鮮増殖培地をバイオリアクターチャンバー（１１）中に添加する工程であって、前記スキャフォールド（２１）を含む前記スキャフォールドホルダー（１３、１３ａ、１３ｂ）が、前記増殖培地が注入された状態で存在する工程；その後に
－ １時間～１８時間の間に含まれる時間、２０℃～３０℃の間に含まれる温度、好ましくは２５℃で、前記増殖培地を、前記スキャフォールド（２１）の管腔内部及びバイオリアクターチャンバー（１１）内に留める工程であって、前記スキャフォールド（２１）を含む前記スキャフォールドホルダー（１３）が、前記増殖培地が注入された状態で存在する工程；その後に
－ 前記スキャフォールド（２１）の管腔及びバイオリアクターチャンバー（１１）の内部から増殖培地を除去する工程；その後に
－ 請求項１に従い、前記細胞培養物、好ましくは内皮細胞培養物を、前記コンテナ（９１）内に放出する工程であって；好ましくは前記コンテナ（９１）が、実質的にシリンジ等である工程；その後に
－ 請求項１に従い、前記細胞懸濁物を、前記スキャフォールド（２１）の管腔内に放出する工程；その後に
－ 前記新鮮増殖培地をバイオリアクターチャンバー（１１）内に添加する工程であって、前記スキャフォールド（２１）を含む前記スキャフォールドホルダー（１３）が播種された状態で存在し、前記細胞懸濁物を管腔内に含有する工程；その後に
－ 請求項５に従い、前記スキャフォールド（２１）を連続的に回転させる工程、その後に
－ 請求項５に従い、前記スキャフォールド（２１）をインキュベートする工程
を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の特徴づけ方法。 - 請求項１～９のいずれか一項に記載の特徴づけ方法によって取得可能である、少なくとも１つの機能的細胞層で内側が覆われた管腔の少なくとも１つの部分を有するスキャフォールド（２１）を含むティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトであって、好ましくは前記少なくとも１つの機能的細胞層が、機能的内皮細胞の層であり、より好ましくは内皮細胞の機能的且つ連続的な単層である、ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクト。
- 前記スキャフォールド（２１）が、合成起源、好ましくは静電紡糸型絹フィブロイン、又はＰＧＡ／ＰＬＡ（ポリグリコール酸／ポリ乳酸）若しくはＰＧＡ／ＰＣＬ（ポリグリコール酸／ポリカプロラクトン）コポリマーのポリマー性スキャフォールドである、請求項１０に記載のティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクト。
- 前記スキャフォールド（２１）が、実質的に管状形状の静電紡糸型絹フィブロインからなる、請求項１０又は１１に記載のティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクト。
- ヒト又は動物用途、好ましくは心血管領域及び末梢血管領域で使用するための医療用製品について、その有効性及び／又は毒性をインビトロでテストするための方法であって、
－ 請求項１０～１２のいずれか一項に記載のティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトを含む、血管構造のインビトロモデルを調製する工程であって、前記ティッシュエンジニアリングにより作出されたコンストラクトが、機能的な解剖学上及び生理学上の特性を有し、或いは動脈瘤、狭窄、硬化症プラーク、腫瘍の形成、又は心筋症に起因する損傷、又は変形、又は変性をシミュレートするのに適する機能障害的な解剖学上及び生理学上の特性を有し；好ましくは前記血管構造が、血管、血液ダクト、及び中央又は末梢循環系の弁の中から選択され；より好ましくは前記血管構造が、動脈、静脈、毛細血管、大動脈弁及び僧帽弁の中から選択される工程；その後に
－ テストされる前記医療用製品を、前記血管構造のインビトロモデルの中に導入する工程であって；好ましくは医療用製品が、弁、心臓弁、ステント、グラフト、カテーテル、包帯、ネット、又はフィルターの中から選択される工程；その後に
－ 前記医療用製品の挙動、及びそれとヒト全血サンプル、人工血液、又はその誘導体との相互作用を評価するために、前記ヒト全血サンプル、人工血液、又はその誘導体が、前記医療用製品を含む血管構造を循環するのを、前記インビトロモデルにおいて可能にする工程
を含む方法。
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