CN117466866A - Hedgehog信号通路抑制剂 - Google Patents

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CN117466866A CN202210913501.3A CN202210913501A CN117466866A CN 117466866 A CN117466866 A CN 117466866A CN 202210913501 A CN202210913501 A CN 202210913501A CN 117466866 A CN117466866 A CN 117466866A
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Abstract

本发明涉及一种新型Hedgehog信号通路抑制剂及其制备方法，所述Hedgehog信号通路抑制剂具有式(I)所示结构。本发明的Hedgehog信号通路抑制剂能有效地抑制SMO受体活性，阻滞SHH信号通路。具有良好的阻滞由大脑中过度或超同步的神经元放电所引起的癫痫发作的作用。作为癫痫治疗候选药物具有良好应用前景。

Description

Hedgehog信号通路抑制剂
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种新型Hedgehog信号通路抑制剂、其制备方法及应用。
背景技术
癫痫是最常见的慢性中枢神经系统病之一，虽然癫痫的病因多种多样，但它们的特征通常是由大脑中过度或超同步的神经元放电所引起的重复、自发性癫痫发作。药物治疗是癫痫患者的首选途径，70-80％的癫痫患者在现有的抗癫痫药物治疗后，癫痫发作的症状会持续缓解，但它们并不能预防或逆转人类癫痫或癫痫其他临床表现)背后的病理过程，即它们不能阻止癫痫的发展。大约一半的患者报告在一线抗癫痫药物治疗期间至少有一种不良反应，如共济失调，肝肾功能损害等。过去三十年来，许多新型抗癫痫药物的出现，带来了更多的治疗选择。然而，新型抗癫痫药物的一个明显缺点是不能提供比第一代药物更好的疗效，并且几乎没有减少耐药癫痫患者的比例，仍有大约20-30％的癫痫患者继续出现癫痫发作。因此，人们迫切需要比现有药物副作用更少、疗效更好的新药。
Hedgehog(HH)基因家族的表达产物是一系列高度疏水的分泌蛋白，分泌后扩散形成浓度梯度，导致细胞形成浓度依赖效应，通过调控相关基因的转录，广泛参与胚胎发育和组织器官分化。在哺乳动物中，HH家族包括三种同源基因：Sonic Hedgehog(SHH)、DesertHedgehog(DHH)以及Indian Hedgehog(IHH)。虽然三种同源基因在体内的分布和功能不尽相同，但它们的信号通路都是相似的。其中，SHH信号通路主要在中枢神经系统的发育和稳态中发挥重要作用。SHH通过结合到细胞膜上的十二次跨膜受体PTCH，释放其对七次跨膜G蛋白偶联受体Smoothened(Smo)的抑制作用来介导相关功能。
在没有Shh配体的情况下，下游的Hedgehog信号被Hedgehog受体Patched(PTCH1)维持在抑制状态。PTCH1是一种12-跨膜结构域蛋白(显示转运蛋白样结构)，定位于纤毛的底部，虽然PTCH1抑制下游信号转导的机制尚未完全阐明，但已有研究表明，游离的PTCH1(未被Shh结合)通过阻止7次跨膜G蛋白偶联受体Smoothened(Smo)转位至纤毛，抑制Smo的活性，导致下游GLI转录因子在细胞质中与Suppressor of Fused(SUFU)形成复合物，从而被蛋白酶体水解，抑制目的基因的转录。经典的Shh信号转导由Shh配体触发：当Shh与PTCH1结合，同时解除其对Smo的抑制作用，并将Smo定位于纤毛。Smo的激活及其向纤毛的移位涉及Smo与G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)、β-arrestins的关联。研究表明，GRK2对Smo的磷酸化和β-arrestin的募集导致了Smo的内吞作用。丝氨酸/苏氨酸激酶(CK1α)在哺乳动物Smo的磷酸化过程中也起着关键作用，Shh信号征募CK1α启动Smo磷酸化，进而增加CK1α和GRK2与Smo的结合，形成正反馈环路，进一步提高Smo磷酸化水平。此外，β-arrestins通过介导其与哺乳动物细胞中Kif3A的相互作用，促进活性(磷酸化)Smo向纤毛的移位。然而，Shh通路解离下游GLI-UFU复合体的机制尚不清楚，但有证据表明，SUFU-Gli2和SUFU-Gli3复合体在纤毛中积累，在接触Shh配体后，它们会独立合成新的蛋白质，这导致Gli2和Gli3立即运输到纤毛，随后它们被磷酸化并从SUFU解离。通过一系列复杂的信号传递过程，GLI的全长激活形式向细胞核迁移，在那里它与目标基因启动子结合，促进目标基因的转录，包括Ptch和Gli1本身。Gli1的激活放大了Shh的下游反应，并且本身就是Shh靶基因，为该通路的研究提供了一个方便直观的方法。Gli2主要作为转录激活因子发挥作用，并被证明在某些特定的环境中具有抑制功能，如骨骼肌和中枢神经系统的发育。Gli3保持双潜能活性，在背侧中间神经元中作为转录抑制因子发挥功能，但在胚胎发育过程中也发挥激活功能。
由于Shh信号通路度的激活广泛存在于脑损伤，脑肿瘤等神经系统疾病过程中，目前的研究重点之一是设计合成Shh信号通路抑制剂或激动剂用于髓母细胞瘤或脑缺血造成的脑损伤等的靶向治疗。研究表明，七次跨膜蛋白SMO是G-蛋白偶联受体(GPCR)家族中的一员，是Shh信号通路的主要转导子，调控小脑的发育过程，可以作为一个重要的药物作用靶点。现在已经有很多SMO抑制剂运用于肿瘤治疗的临床试验中。其中，GDC-0449/vismodegib在2012年获得FDA批准，用于治疗Shh信号通路异常激活的基底细胞癌，但是由于分子靶点Smo-D473H突变引发耐药性，治疗并未取得成功。另一个Smo抑制剂LDE-225(sonidegib)在2015年也获得FDA批准用。但是，在髓母细胞瘤临床I期的实验中，LDE-225虽然能有效地抑制SHH信号通路，诱导髓母细胞瘤衰退，但也表现出耐药性以及肌肉震颤、味觉障碍等各种不良反应。因此，针对Shh信号通路的高效低毒新型药物研发仍是当前急需解决的一个难题。
在非典型的I型信号通路中，PTCH1在没有Smo和GLI的情况下调节细胞的增殖和凋亡。在没有Hh配体的情况下，PTCH1受体与磷酸化的Cyclin B1，以及促凋亡复合物结合，在缺少Hh配体的情况下，异位表达PTCH1可诱导神经上皮细胞凋亡。有证据表明，PTCH1与促凋亡复合物的相互作用依赖于caspase-3切割PTCH1的C-末端结构域，并导致caspase-9的激活，活化的caspase-9通过激活caspase-3酶进一步促进促凋亡复合体的形成，从而导致细胞凋亡。这种关系会被Hh配体的存在而打破，Hh与PTCH1受体的结合通过PTCH1受体的构象变化抑制其与促凋亡复合物的相互作用，导致细胞存活和增殖增强。
在II型非典型信号通路中，Smo通过RhoA和Rac1等小GTPase家族调节肌动蛋白细胞骨架的活性。报道显示Shh通过Gi蛋白和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)依赖的机制通过Smo刺激rac1和RhoA，这是已知的诱导成纤维细胞细胞迁移的机制。在轴突引导中，Shh通过与其受体PTCH1和Boc结合，激活Smo，然后以分级的方式激活Src家族激酶(SFK)和Fyn。最近的研究发现，刺激花生四烯酸代谢产物，如由Shh合成的白三烯，能够诱导Smo依赖性的肌动蛋白细胞骨架重组，并且这种作用不依赖于GLI。
2011年Fang M发表于《Neuroscience》的文章中，阐述了shh在癫痫灶中的发展。该研究的人类样本来自30例耐药性颞叶癫痫患者通过颞叶组织切除术切割下来的致痫区，通过免疫组织化学染色发现Shh在难治性颞叶癫痫患者的病灶中有较强的增高表达。在动物实验中，他们通过构建pilocarpine诱导的慢性癫痫大鼠模型，分别在组织、细胞和蛋白水平检测到Shh的表达量升高。其中Shh蛋白水平自诱导第三天开始增加并持续升高至第三十天达到高峰。以上对难治性颞叶癫痫患者和实验动物的研究均显示。Shh蛋白在颞叶癫痫灶中的表达增加，并且这很可能是癫痫潜伏期发展的结果，而不是诱发慢性耐药性癫痫的触发因素。
另一篇来自Feng SJ和Ma SR于2016年发表于《EMBO reports》的文章中，证实了Shh信号通路作用于癫痫的发生工程。该研究首先表明在在体小鼠模型、急性脑片和体外神经元模型中，Shh蛋白在癫痫刺激的条件下表达水平显著升高。在Shh信号通路拮抗剂Cyclopamine预处理的条件下，急性脑片和培养的神经元的癫痫样放电频率，癫痫神经元所占比例等指标均显著降低，说明抑制Shh信号通路可以有效地抑制神经元的癫痫样放电。最后，pilocarpine小鼠模型中给予Shh信号通路靶向抑制剂或基因敲除Shh通路关键跨膜蛋白Smo均能够延缓小鼠癫痫的发病过程并降低癫痫发作频率。以上结果从细胞水平，脑片水平和整体动物水平，都表明抑制Shh通路具有很好的抗癫痫发生的作用，Smo可以成为一个潜在的治疗癫痫的药物靶点。
因此，筛选既能靶向Sonic hedgehog信号通路又能抑制神经元异常放电的化合物可能将为将来的癫痫治疗提供新的方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一类新型Hedgehog信号通路抑制剂及其制备方法，其能有效的抑制Smo受体活性，阻滞SHH信号通路，具有良好的阻滞由大脑中过度或超同步的神经元放电所引起的癫痫发作的作用。
本发明的一方面，提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐、其异构体或溶剂合物：
式中，
R1选自-C(O)R3、-S(O)2R3或-P(O)(R3)2；
R3选自羟基、氨基或-C1-3烷基；
R2选自-C1-6烷基；
X选自F、Cl、Br或I。
在一实施方案中，R1选自羧基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、甲磺酰基、乙磺酰基、丙磺酰基或磷酸基。
优选地，R2选自-C1-3烷基。
优选地，X选自Cl或Br。
在一实施方案中，所述化合物具有如下结构：
本发明的再一方面，提供一种上述化合物的制备方法，包括以下步骤：
式(IA)化合物与式(IB)化合物偶联反应得到式(I)化合物。
其中，X、R1、R2定义同式(I)化合物。
X’为卤素；优选地，X’为Br。
在一实施方案中，所述式(IA)化合物通过包括以下步骤的方法制备得到：
(1)
式(IA-1)化合物与式(IA-2)化合物缩合反应得到式(IA-3)化合物；
(2)
式(IA-3)化合物发生成环反应得到式(IA)化合物。
在一实施方案中，所述式(IB)化合物通过包括以下步骤的方法制备得到：
式(IB-1)催化氢化反应得到式(IB)化合物。
本发明的再一方面，提供一种药物组合物，其包括上述化合物或其药学上可接受的盐、其异构体或溶剂合物以及药学上可接受的辅料。
本发明的再一方面，提供上述化合物或其药学上可接受的盐、其异构体或溶剂合物、上述药物组合物在制备用于抑制Hedgehog信号通路的药物中的应用。
优选地，在制备用于抑制Sonic Hedgehog信号通路的药物中的应用。
本发明的再一方面，提供上述化合物或其药学上可接受的盐、其异构体或溶剂合物、上述药物组合物在制备治疗慢性脑部疾病的药物中的应用。
优选地，所述慢性脑部疾病为具有Smo D473H突变的脑部疾病。
优选地，所述慢性脑部疾病包括癫痫。
本发明的再一方面，提供一种索尼德吉(LDE225)在制备治疗慢性脑部疾病的药物或制备抗肿瘤的药物中的应用。
优选地，所述慢性脑部疾病包括癫痫。
根据本发明的研究，索尼德吉除了可以抑制βarr2-GFP聚集、抑制Shh-CM诱导的Gli1表达、有效抑制神经元异常癫痫样放电之外，相对于其他的Smo抑制剂，还可以更好的克服血脑屏障，在中枢系统达到足够的暴露量，对中枢系统相关疾病例如癫痫发挥良好的治疗作用。同时还能较好的被吸收，具有更好的脑/血浆比、较高的峰浓度、较短的达峰时间、良好的生物利用度、较低的清除率、良好的代谢稳定性等，其具有更好的药效学和药代动力学优势，因此具备较好的临床应用前景。
本发明的再一方面，提供一种用于治疗有需要的患者的由Hedgehog信号通路介导的病症的方法，其包含向所述患者施用上述化合物或其药学上可接受的盐、其异构体或溶剂合物、索尼德吉或上述药物组合物。
本发明的再一方面，提供上述化合物或其药学上可接受的盐、其异构体或溶剂合物、上述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
附图说明
图1示出了U2OS细胞中βarr2-GFP易位到SMO的共聚焦图像，箭头显示βarr2-GFP在囊泡内聚集，比例尺，10μm。±SEM(t检验)，***P<0.001。
图2示出了TT22抑制βarr2-GFP的细胞内聚集，比例尺，20μm。
图3示出了U2OS细胞中新型Smo抑制剂TT22的鉴定，箭头显示βarr2-GFP在囊泡内聚集，比例尺，20μm。±SEM(t检验)，***P<0.001。
图4示出了TT22能够竞争性地取代Bodipy-cyclopamine与Smo的结合，使用流式细胞仪分析Bodipy-cyclopamine结合(绿色)的结果，所有数据均为均值±SEM(t检验)。***P<0.001。
图5示出了TT22可阻断HH诱导的Smo在初级纤毛上的积累，比例尺，5μm。±SEM(t检验)，***P<0.001。
图6示出了TT22可抑制Shh-CM诱导的Gli1表达，所有数据均为均值±SEM(t检验)。***P<0.001。
图7示出了TT22可抑制SAG诱导的Gli1表达，所有数据均为均值±SEM(t检验)。***P<0.001。
图8示出了TT22可减弱癫痫样放电，所有数据均为均值±SEM(t检验)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
具体实施方式
I.定义
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
本文中的数字范围，是指给定范围中的各个整数。例如，“C1-6”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子。
术语“SHH”是指Sonic Hedgehog，术语“HH”是指Hedgehog。
术语“Gli”是指Hedgehog信号途径的转录因子Ci(Cubitus interruptus，在脊椎动物中为Gli)；Gli1是SHH信号的下游靶基因，它是SHH信号通路是否激活的标志。
术语“SMO”是指Smoothened；Hedgehog(HH)信号传递受靶细胞膜上两种受体Patched(Ptc)和Smoothened(Smo)的控制。受体Ptc由肿瘤抑制基因Patched编码，是由12个跨膜区的单一肽链构成，能与配体直接结合，对HH信号起负调控作用。受体Smo由原癌基因Smothened编码，与G蛋白偶联受体同源，由7个跨膜区的单一肽链构成，N端位于细胞外，C端位于细胞内，跨膜区氨基酸序列高度保守，C末端的丝氨酸与苏氨酸残基为磷酸化部位，蛋白激酶催化时结合磷酸基团。
药物或药物组合物
术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有，与合理利益/风险比相称的，过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
术语“药学上可接受的盐”是指保留了特定化合物的游离酸和碱的生物学效力而没有生物学不良作用的盐。例如酸(包括有机酸和无机酸)加成盐或碱加成盐(包括有机碱和无机碱)。
本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。
本发明的药物或药物组合物可以经口地、局部地、肠胃外地或粘膜地(例如，含服地、通过吸入或直肠地)以包含常规的非-毒性药学可接受的载体的剂量单位配制剂施用。通常希望使用口服途径。所述活性试剂可以经口地以胶囊、片剂等形式(参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Edition)施用。
术语“药物组合物”意指包含本发明所述化合物或其药学上可接受的盐，以及依施用方式和剂型的性质而定的至少一种选自以下药学上可接受的成分的组合物，包括但不限于：载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂、分散剂、温敏材料、温度调节剂、黏附剂、稳定剂、助悬剂等。
缩写：
X-phos：2-双环己基膦-2',4',6'-三异丙基联苯；
HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
DCM：二氯甲烷；
DIEA：N-乙基二异丙胺；
DMF：N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛；
AcOH：乙酸；Pd(aba)3：三(二亚苄基丙酮)二钯。
II.具体实施例
1.材料与试剂
1.1化合物:
所有化合物均固体粉末放置，-20℃存储，化合物用DMSO溶解成10mmol/L作为母液放置-20℃，使用时用完全培养基稀释至所需浓度。
阳性对照1为GDC-0449，其结构式为
阳性对照2为LDE-225，其结构式为
1.2主要仪器设备及仪器
2.实验方法
2.1细胞转染
(1)准备：VigoFect 0.4ml 4℃，准备150mM NaCl(超纯水配制，高压或过滤灭菌)或注射用生理盐水作为VigoFect及DNA的稀释液，和要转染的DNA溶液(高纯度，浓度0.1-2μg/μl)。
(2)操作方法：
准备培养细胞：
1)转染前24小时，收集对数成长期的细胞并消化重悬至单细胞悬液，预估细胞生长速度接种适量细胞。至转染时细胞密度以40-60％为宜(80-90％亦可)。
2)转染前1小时，更换新鲜的完全培养液，置37℃，5％CO2培养箱培养。
配制转染工作液：(6孔板或35mm平皿，2ml培养液)
3)取5-8μg DNA(起始用量5μg)，加入稀释液中至总体积为100μl，轻轻混匀，室温放置。
4)取VigoFect 1-4μl(起始用量2μl)，加入稀释液中至总体积为100μl，轻轻混匀，室温放置5分钟。
5)将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置15分钟。
6)将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入2ml培养液中，轻轻混匀培养液，置37℃，5％CO2培养箱培养。
细胞后续处理：
7)转染后3-6小时去除含转染液的培养液，更换为新鲜的完全培养液。
8)24-48小时后，观察或收取细胞。
9)稳定转染时，于转染后24-48小时消化细胞分至3-5个培养皿中，加适当浓度的相应抗生素(如G418)筛选。
表1：起始转染条件
2.2总RNA提取和实时荧光定量PCR
Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
(1)经过实验处理的贴壁细胞在6孔板中用1×PBS清洗两遍，各加入1ml Trizol，反复用枪吹打以裂解细胞
(2)将上述细胞的Trizol裂解液转移至EP管中,室温下放置2-5min(15-30℃)，同时75％乙醇预冷，离心机提前降温；
(3)按照每1ml TrizolL加200μl氯仿的量加入氯仿，剧烈震荡涡旋15秒，室温下放置2-3分钟，12000rpm以上(4℃)离心10分钟(从下往上依次为氯仿层(蛋白质)、中间层(DNA)、水相(RNA))；
(4)取上层水相于新EP管中，加入0.3-0.5ml异丙醇(等量)，混匀，在-20℃下放置10-30分钟(降低温度提高产率),12000rpm(4℃)离心10min；
(5)弃上清，注意不要将沉淀弃掉。加入400μl 75％乙醇(预冷)进行洗涤，12000rpm(4℃)离心2min，将乙醇轻轻倒掉；重复一次；再离心一次以去除壁上残留乙醇，吸干。
(6)让RNA沉淀在室温干燥，于超净台中挥干
(7)风干后，加入20-50μl DEPC水(Rnase-free water)溶解RNA沉淀。
(8)微量核酸定量仪Nano检测RNA浓度，测A260./A280值，在1.8-2.0之间说明RNA较纯，蛋白含量少。测得RNA值为Xng/ul。
(9)总RNA保存在-80℃低温冰箱中备用。
Real-time PCR
1.基因组DNA去除反应
反应体系：(10μl)：
Tatol mRNA：1μg
DNA Eraser：1μl
5×gDNA Eraser Buffer：2μl
补DEPC水至10μl，混匀
使用PCR仪于42℃条件下反应5min；
2.RT(逆转录反应，mRNA→cDNA)
反应体系(20μl)：
1中反应液：10μl
5×Prime Script Buffer 2：4μl
Prime Script RT Enzyme MixⅠ：1μl
RT Primer Mix：1μl
DEPC水：4μl
使用PCR仪于37℃条件下反应30min；再于85℃反应5s。将合成的cDNA用DEPC水稀释一倍，于-20℃保存
3.RT-PCR
PCR的扩增条件如下(总反应体系为20μl)：
cDNA(＜100ng)：1μl
Forward Primer(10μM)：0.8μl
Reverse Primer(10μM)：0.8μl
SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)：10μl
RoxⅡ：0.4μl
RNase Free ddH2O：7μl
操作按照试剂盒(QuantiTectTM SYBR Green PCR kits)说明进行。每样本重复三遍，设置阴性和阳性对照。
扩增特异性区域的引物为
鼠Gli1：
F：5′-CTCAACTGCCCAGCTTA ACCC-3′(SEQ ID NO:1)
R：5′-TGCGGCTGACTGTGTAAGCAGA-3′(SEQ ID NO:2)
鼠Actin：
F：5′GCAAGTGCTTCTAGGCGGAC-3′(SEQ ID NO:3)
R：5′-AAGAAAGGG TGTAAA ACGCAGC-3′(SEQ ID NO:4)
2.3Western-Blotting
(1)样品制备：NIH3T3细胞Gli1、α-tubulin检测
裂解法提取细胞内蛋白：
冰上操作，将RIPA裂解液(含100×cocktail)按比例加100×PMSF混匀，将经过相应处理的NIH3T3细胞去除培养基，12孔板每孔加1ml 1×PBS洗涤，每孔加RIPA100μl，用细胞刮刀沿一个方向刮落细胞，转移至1.5mlEP管中，冰上静置15min，每3-4min振荡一次，机械裂解，离心机最大转速离心10min(4℃)，吸取上清并转移至新的EP管中并做好标记。
BCA蛋白定量原理：在碱性条件下，Cu2+被蛋白质还原为Cu+，一价铜离子可以和两分子的BCA相互作用形成蓝紫色络合物，该络合物具有水溶性，在562rim波长处有强吸光度。在一定范围内，吸光度与蛋白浓度呈良好的线性关系，可以制作标准曲线，因此可以通过测定562nm波长处的吸光度计算蛋白浓度。
1)BCA工作液的配置：根据标准品和样品的数量，将BCA试剂与Cu试剂按50：1的比例配置成BCA工作液，混合均匀备用。
2)稀释标准品：将5mg/mL的蛋白标准品与PBS按1：9的比例稀释为5mg/mL，将标准品按0、2、4、6、8、12、16、20μl此加入到96孔板内，再分别加20、18、16、14、12、8、4、0μl此的PBS补充至20此，每个浓度设置两个复孔。
3)各孔加入200μl的BCA工作液，37℃恒温培养箱内孵育20min，用酶标仪测定其在562nm波长处的吸光度。根据562nm波长处的吸光度值和蛋白浓度做标准曲线。
4)蛋白样品浓度测定：取一块96孔板，每个空内加入19μl的PBS稀释液，200μl BCA混合工作液与1μl的蛋白样品，每个样品设置两个复孔，置于37℃恒温培养箱内孵育20min后测定其在562nm波长处的吸光度，并根据蛋白标曲计算蛋白浓度
5)95℃恒温加热块中变性5分钟，-20℃储存备用。
(2)SDS-PAGE凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)
1)聚丙烯酰胺凝胶的配制：
清洗玻璃板：将洁净待用的玻璃板用酒精擦拭干净，晾干。
检漏：将两片玻璃板置入卡槽内固定好，向玻璃槽内注满纯水，静置5分钟后观察槽内水面是否下降。若装置不漏水，则倒去纯水，用洁净滤纸将玻璃槽内残留的水滴吸干，备用。否则重新搭置。
配制聚丙烯酰胺凝胶：根据所要测的目的蛋白分子量的大小来配制不同浓度的分离胶，一般蛋白分子量越大，所需配制的分离胶浓度越低。配制10ml的12％分离胶，取50ml离心管用双蒸水冲洗干净，依次加纯水3.3ml，30％丙烯酰胺溶液4ml，1.5MTris-HCl(pH8.8)2.5ml，10％(m/v)SDS 0.1ml，10％AP(m/v)AP 0.1ml，TEMED 0.004ml充分混匀，将约7ml分离胶加入1.5mm厚度玻璃槽内后，缓缓加入异丙醇1ml封闭，使胶面水平，大约15分钟后，分离胶凝固。倾倒出胶面上的异丙醇，并用洁净的滤纸吸去残留的溶剂。配制8ml的5％积层胶，依次加入纯水5.4ml，30％丙烯混1.3ml，1.5MTris-HCl(pH6.8)1ml，10％(m/v)SDS 0.08ml，10％(m/v)AP 0.08ml，TEMED 0.008ml充分混匀后注满玻璃槽，快速向积层胶插入1.0mm10齿的梳子。大约15分钟后，积层胶凝固，向电泳槽内注满电泳液后轻轻拔出梳子，保持上样孔竖直以避免电泳过程中泳道之间相互干扰。
2)上样：根据Bradford法标准曲线所测的蛋白浓度，计算所需上样量。将蛋白样品按顺序使用上样枪头注入孔内，并在旁边注入蛋白marker标记蛋白分子量。一般不使用两端的上样孔，为避免边缘效应注入与样品相近体积的1×Loading Buffer。
3)凝胶电泳：向凝胶电泳槽外槽注入适量的电泳缓冲液，开始恒压80V进行凝胶电泳，电泳约30分钟后，蛋白样品浓缩至一条直线并从积层胶逐渐进入分离胶，由于电阻增大，恒压升高至120V，继续电泳约40分钟至各分子量蛋白质充分分离即可结束。
4)转膜：凝胶电泳结束后，切下40-200KDa分子量范围内的凝胶，将其浸入蒸馏水里。将上层滤纸，0.45μm孔径NC膜，下层滤纸分别充分浸泡在Top Buffer,Balance Buffer,Down Buffer里。然后按照自上往下的顺序将上层滤纸，凝胶，0.45μm孔径NC膜，下层滤纸平铺于电转槽中在此过程中，需保证每层之间无气泡充斥。盖上电转槽盖，插入半干转膜仪中。设置转膜时间为10分钟左右。由于转膜过程电流大，电阻也较大，故产热量高，长时间高热会破坏蛋白质，所以转完膜后需迅速将膜取出转移至蒸馏水或1×TBST缓冲液中。
5)封闭牛奶：转膜结束后，用丽春红能够迅速与NC膜上的蛋白质结合显色，借此来检验转膜成功及确定蛋白质条带位置。用1×TBST溶解脱脂奶粉，配制质量体积比为5％的牛奶封闭液，然后用牛奶封闭条带，室温孵育1小时。
6)孵育一抗：用抗体稀释液(1×TBST和BSA配制质量体积比为5％)分别稀释比例为Gli1(1:1000)、α-tubulin(1:2000)，对应的抗体孵育蛋白条带，4℃摇床过夜。
7)孵育二抗：一抗孵育结束后，回收一抗，1×TBST洗涤蛋白条带三次，洗去未结合的一抗，每次10分钟。加入用封闭液(5％牛奶的TBST)稀释的辣根过氧化物酶标记的对应一抗种属的二抗(1:5000)，在摇床上室温杂交1h。弃去二抗，1×TBST洗涤膜3次，每次10分钟。
8)曝光：配制ECL发光液(A液：B液＝1:1)，将蛋白条带放入化学发光成像仪，用滤纸吸干条带上残存的TBST，然后将ECL发光液均匀的涂在条带表面。自动感应曝光时间，600dpi,tiff格式保存曝光图片。使用Image J软件来进行灰度值分析。
2.4Bodipy-cyclopamine竞争结合实验
将人Flag Smo WT或Smo突变体(D473H)转染HEK293细胞。24h后，胰酶消化，加0.5％胎牛血清的无酚红DMEM洗涤，4％多聚甲醛室温固定10min，5nM BODIPY-Cyclopamine和不同浓度的指示化合物在37℃孵育2h。处理后的细胞离心，流式细胞仪分析荧光信号。
2·5Smo-D473H突变株的构建
FLAG Smo-D473H点突变是利用转基因生物技术(Fast Mutagenesis System，TRANGEN BIOTECH)建立的。引物如下：F：5′-AGCTGCCACTTCTAC(SEQ ID NO:5)。CACTTCTTCAA-3′(SEQ ID NO:6)，R：5′-GGTAGAAGTGGCAGC(SEQ ID NO:7)TGAAGGTAATG-3′(SEQ ID NO:8)。
2.6原代皮层神经元培养
(1)原代取材前准备工作：
1)高压灭菌：原代神经元培养取材前一天，将手术器械、培养皿、ddH2O、枪头等进行高压灭菌。
2)神经元接种培养基配制：DMEM高糖培养基+胎牛血清(FBS,10％)+马血清(HS,5％)+青/链双抗(1％)。
3)神经元维持培养基配制：neurobasal培养基+B27(2％)+青/链双抗(1％)。
4)包被培养板：以高压过的ddH2O稀释10×多聚赖氨酸母液为0.1mg/ml工作液包被培养板。室温过夜后于超净台中弃掉包被液，风干，以ddH2O洗涤2次，5min/次。然后加入接种培养基，置于超净台中待用。
5)取材前将解剖显微镜、高压过的手术器械、培养皿等放入取材超净台中，打开紫外灯照射1小时。
(2)原代胎鼠皮层神经元培养实验步骤：
1)麻醉：将孕16-18d SD大鼠以10％水合氯醛腹腔注射麻醉(400μl/100g)。
2)取大鼠子宫：75％酒精消毒后在通风橱内以高压灭菌的大剪刀逐层剪开大鼠腹部至腹腔，以止血钳牵拉暴露手术视野。将大鼠子宫拖出，用手术剪剪断子宫系膜及血管，尽量保持子宫完整，避免损伤肠道，避免接触大鼠皮毛造成污染。取出子宫后迅速放于含低温DMEM培养基的一次性灭菌培养皿内，盖好盖子，于冰盒内转移至取材超净台中。
3)分离胎鼠：在取材超净台中将手术器械、冰袋等备好，将含1％青-链双抗的取材DMEM培养基倒入4个培养皿。以镊子撕开子宫取出胎鼠，放入含低温取材DMEM培养基的培养皿内，分离所有胎鼠的胎盘和脐带。将胎鼠置于新的含低温取材DMEM培养基的培养皿内。
4)分离胎鼠皮层：左手持镊子固定胎鼠头部，右手持镊子分离颅骨和硬脑膜，剥离大脑半球放入新的含取材培养基的培养皿内。在显微镜下去除丘脑及脑干，余双侧大脑半球。将所有胎鼠的皮层全部取出，置于新的培养皿内。
5)剥除脑膜及血管：在显微镜下以显微镊逐个剥除脑膜和血管，务必保证脑膜和血管全部剥离干净。否则在消化后为了制作单细胞悬液，会被迫增加吹打力度和次数，从而造成神经元损伤。分离全部皮层脑膜及血管后，盖上培养皿盖子，转移至细胞间超净台中。为降低神经元代谢，保证细胞活力，整个过程均在冰上完成操作。
6)消化及终止：在超净台中，以灭菌显微剪将脑组织剪碎至约1mm，加入预热的0.25％胰酶4ml，置于37℃培养箱中消化10min，每5min摇晃震荡一次。消化后以含10％FBS和5％HS的DMEM培养基终止。
7)过滤：以吸管轻柔吹打数下，尽量避免产生气泡，造成神经元损伤。吸出上清消化过的细胞悬液，以70目细胞筛过滤，过滤后的液体离心，1000r/min离心5min。
8)接种：离心后去除上清，加入1ml接种培养基重悬细胞，轻柔吹打混匀。取10μl细胞悬液加入细胞计数板计数后接种于预先以多聚赖氨酸包被好的培养板中。接种密度不宜过高，否则易产生接触抑制，也不宜过低，因过低神经元不易存活或生长状态不良。
9)摇晃：接种后“十字”摇晃培养板，使细胞均匀分布，避免晃圈，否则细胞易分布密度不均。
10)培养及换液：将培养板置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。4小时后细胞大部分贴壁，以无血清维持培养基全量换液后继续培养，换液过程手法轻柔，以免将细胞吹起。以后隔日半量换液，至培养7天后神经元生长状态良好，胞体饱满、折光性强、神经网络形成，可用于后续实验。
关于换液时间，有研究在接种后12小时换液，但此时胶质细胞会开始分裂，故培养的神经元纯度相对较低。如果为提高纯度，加入阿糖胞苷抑制胶质细胞生长，其毒性又会影响神经元生长状态。本实验发现在4小时换液效果较好，如小于4小时，则神经元未完全贴壁，换液时神经元会被吹起造成密度不均。
2.7海马神经元电生理
在室温(23-24℃)条件下，用奥林巴斯40X浸水透镜(日本奥林巴斯，BX51WI)红外差分干涉对比显微镜对不同剂量药物孵育的原代神经元进行全细胞记录。所有的记录都是在pCLAMP Clampex10.3软件的控制下用膜片钳放大器(MultiCLAMP 700B)采集的。数据采集频率为10kHz，低通滤波频率为1kHz。记录电极(电阻3-6MΩ)由硼硅酸盐玻璃毛细管(BF150-86-75，Sutter Instruments，美国)使用垂直吸管拉取器(PC100NARISHIGE，日本)制备。电极内液的配制(单位mM)：葡萄糖酸钾120，氯化钾20，HEPES 10，EGTA10，MgCl22，Na2ATP 2(以KOH调节pH 7.3，渗透压为300mOsm)。标准细胞外液包括(单位mM)：140NaCl，2.4KCl，10HEPES，10葡萄糖，4MgCl2，2CaCl2(用NaOH调节pH 7.35,310mOsm)。
当I＝0时，测定静息膜电位(Vm)。用0Mg2+/HighK+(8K+)致痫液替代标准细胞外液记录痫样放电。在电流模式下，连续记录30min。痫样放电可分为两种形式：一种是大的去极化位移，≥为10mV，≥为300ms，至少有5个动作电位；另一种是动作电位，其特征是幅度明显高于基线和(或)信号的高频。将细胞转移到致痫外液中，使细胞在10-20min内达到稳定的癫痫样状态时开始记录上述事件。“溶剂”组给予等量的溶剂溶液(DMSO)预处理，“药物”组给予不同浓度的药物预处理，20min后进行电生理记录。
2.8统计分析
所有的统计分析都是从至少三个独立的实验中获得的，两个样本或多个样本的比较使用非配对的t检验(two tailed Student’s t test)和单因素方差分析(one-wayANOVA)。*P<0.05为有统计学意义。使用GraphPad Prism 8.0软件(GraphPad Software公司)提供所有统计分析.
实施例1:化合物TT22的合成
(1)
向溶于DCM(50mL)的化合物1溶液中(5.0g，21.4mmol，1.0eq)中添加HATU(16.3g，42.8mmol，2.0eq)、DIEA(5.5g，42.8mmol，2.0eq)和化合物2(2.6g，21.4mmol，1.0eq)。在室温下将反应混合物搅拌2小时。完成后，添加H2O(30mL)并通过DCM(20mLx3)提取，用盐水(10mLx3)洗涤，通过Na2SO4干燥，过滤。分离合并的有机相，在真空中浓缩，得到化合物3(8.0g，粗品)，直接用于下一步，无需进一步纯化。LCMS:339.0,341.0([M+H]+).
(2)
在AcOH(30mL)溶液中回流加热化合物3(8.0g，23.7mmol，1.0eq)1h。完成后，将反应混合物冷却至室温，添加H2O(60mL)并通过DCM(20mLx3)萃取，用盐水(10mLx3)洗涤，通过Na2SO4干燥，过滤。分离合并的有机相，在真空中浓缩。将残余物溶解在DMSO(5.0mL)中，并通过反相制备级HPLC(Waters XBridge Prep C18 OBD；CH3CN:H2O＝50-65-100-10分钟，5mmol NH4HCO3作为添加物)纯化，得到白色固体化合物4(1.0g，14.5％，两步)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δppm 8.24(d,J＝1.8Hz,1H),7.89(d,J＝2.1Hz,1H),7.83(d,J＝8.1Hz,1H),7.71-7.63(m,2H),7.35-7.24(m,2H),3.90(s,3H).LCMS:321.1,323.2([M+H]+).
(3)
在溶于二甲基亚砜(80mL)的化合物5(8.0g，38.5mmol，1.0当量)和化合物6(5.1g，50.0mmol，1.3当量)混合溶液中加入CuI(743mg，3.9mmol，0.1当量)、K3PO4(10.6g，50.0mmol，1.3当量)和L-脯氨酸(886mg，7.7mmol，0.2当量)。将混合物在110℃下加热过夜。完成后，将反应混合物冷却至室温，添加H2O(200mL)并通过DCM(50mLx3)萃取，用盐水(30mLx3)洗涤，在Na2SO4上干燥，过滤。分离合并的有机相，在真空中浓缩。通过硅胶柱色谱法(石油醚：EtOAc＝1:1)纯化粗产物，得到白色固体化合物7(3.0g，37.5％)。1H NMR(300MHz,CDCl3):δppm 9.41(s,1H),8.72(d,J＝5.7Hz,1H),8.53(s,1H),8.20(d,J＝8.7Hz,1H),8.07(d,J＝8.7Hz,1H),7.83(d,J＝5.7Hz,1H),3.15(s,3H).LCMS:208.1([M+H]+).
(4)
在室温下向溶于EtOH(30mL)的化合物7(3.0g，14.5mmol，1.0eq)溶液中添加PtO2(0.6g，20％wt)得到混合物。混合物室温下在H2气氛中搅拌过夜。完成后，过滤混合物，并浓缩滤液，得到白色固体化合物8(2.0g，65.4％)。粗产物用于下一步，无需进一步净化。1HNMR(300MHz,CDCl3):δppm 7.67-7.65(m,2H),7.19(d,J＝8.7Hz,1H),4.07(s,2H),3.15(t,J＝6.0Hz,2H),3.03(s,3H),2.87(t,J＝6.0Hz,2H).LCMS:212.1([M+H]+).
(5)
将化合物4(2.3g，7.3mmol，1.0eq)、Pd2(dba)3(1.4g，1.5mmol，0.2eq)、X-phos(1.7g，2.9mmol，0.4eq)和Cs2CO3(4.7g，14.6mmol，2.0eq)加入溶于DMF(20mL)的化合物8(2.0g，9.5mmol，1.3eq)的混合物中。将混合物在85℃下加热3小时。完成后，将反应混合物冷却至室温并过滤。向滤液中添加H2O(60mL)，并通过DCM(20mLx3)萃取，用盐水(15mLx3)洗涤，通过Na2SO4干燥，过滤。分离合并的有机相，在真空中浓缩。通过反相制备级HPLC(WatersXBridge Prep C18 OBD；CH3CN:H2O＝50-58-100-10分钟，5mmol NH4HCO3作为添加物)纯化粗产物，得到白色固体Bellen00064255-N(236.0mg，7.2％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δppm7.88(d,J＝6.8Hz,1H),7.78(s,1H),7.74(d,J＝8.0Hz,1H),7.68(s,1H),7.58(d,J＝8.0Hz,1H),7.45-7.32(m,5H),4.47(s,2H),3.91(s,3H),3.52(t,J＝5.6Hz,2H),3.17(t,J＝5.6Hz,2H),3.06(s,3H).LCMS:452.0([M+H]+).
实施例2:化合物TT22对βarr2-GFP在细胞中点状聚集的抑制
1.1Smo蛋白抑制剂筛选平台构建
βarr2-GFP单独在U2OS细胞中表达时，在细胞质中均匀分布，选用U2OS细胞用于高通量癌症药物筛选。分别用溶剂DMSO(组B)、1μM Cyclo(组C)、1μM Cyclo和1μM SAG(组D)在37℃下培养U2OS细胞24h，通过共聚焦实验观察检测βarr2-GFP聚集数目的百分比。
图1A为未处理的U2OS细胞，与SMO-633共表达βarr2-GFP会导致βarr2-GFP表达重新分布到细胞内聚集体/小囊泡，细胞核周围会出现明亮的聚集体(图1B)。SMO拮抗剂cyclopamine(Cyclo)处理能导致绿色囊泡消失(图1C)。在Cyclo存在的情况下，添加Smo激动剂SAG会导致绿色囊泡聚集体的重新出现(图1D)。在此基础上，建立初步的高通量筛选方法，筛选出合适的小分子文库，筛选出能够阻止βarr2-GFP在囊泡内聚集的小分子。
1.2TT22抑制βarr2-GFP的细胞内聚集
向稳定表达βarr2-GFP和SMO-633的U2OS细胞中加入梯度浓度(10-3-104nM)的TT22、阳性对照1、阳性对照2，在37℃的条件下培养24h，定量检测βarr2-GFP聚集数目的百分比并计算IC50。
化合物TT22可以抑制βarr2-GFP在细胞中的点状聚集(图2A)。TT22、阳性对照1和阳性对照2抑制βarr2-GFP聚集的IC50分别为4.7nM、44.6nM和26.8nM(图2B)。
1.3U2OS细胞中新型Smo抑制剂TT22的鉴定
根据1.1构建的筛选方法，分别用溶剂DMSO(组A)、1μM Cyclo(组B)、100nM TT22(组C)、100nM TT22和1μM SAG(组D)在37℃下培养U2OS细胞24h，检测βarr2-GFP聚集数目的百分比(图3E)。
从图3可见，TT22处理能导致绿色囊泡消失(图3C)，在TT22存在的情况下，添加Smo激动剂SAG会导致绿色囊泡聚集体的重新出现(图3D)。Smo/βarr2-GFP内化实验进一步验证了TT22对Smo的活性，并以Cyclo和SAG为对照。
实施例3:化合物TT22与Bodipy-cyclopamine的竞争结合
为了进一步验证TT22与Smo的结合，进行了Bodipy-cyclopamine竞争结合实验，具体使用梯度浓度Smo拮抗剂TT22、阳性对照1在瞬时转染人Smo-WT的HEK293细胞中与Smo进行竞争结合。发现已知的Smo拮抗剂(Cyclopamine，阳性对照1)和TT22能够以类似的亲和力取代Smo中的5nM Bodipy-cyclopamine(图4A)。
最近的研究报道，Smo突变Smo-D473H从而对阳性对照1和阳性对照2的治疗耐药。为了检测TT22是否能与Smo-D473H结合，在HEK293细胞中过表达了Smo-D473H，并在瞬时转染人Smo-D473H的HEK293细胞中进行Bodipy-cyclopamine竞争实验，使用流式细胞仪分析Bodipy-cyclopamine结合(绿色)的结果，所有数据均为均值±SEM(t检验)。***P＜0.001。
结果表明TT22能有效地取代Smo-D473H中的5nM的Bodipy-cyclopamine。然而，阳性对照1在低浓度时不能与突变体Smo-D473H结合，而在高浓度时表现出部分作用(图4B)。上述结果表明，TT22可以与Cyclopamine竞争结合WT-Smo和Smo-D473H受体。
实施例4:化合物TT22对Smo在纤毛上聚集的阻断
Smo通过定位在纤毛上介导Shh信号通路，测试了TT22对Sonic Hedgehog(Shh)信号的抑制作用。
用DMSO、5μM阳性对照1和5μM TT22处理PTCH-/-MEF细胞24h，并用抗Smoothened和ARL13B的抗体进行免疫组化染色，观察TT22对SMO在原生纤毛累积的调控作用。具体地，血清饥饿的PTCH-/-MEF细胞在37℃时加入DMSO(Vehicle组)、5μM TT22和5μM阳性对照1处理24h。然后细胞用Smoothed(绿色)抗初级纤毛标志物ARL13B(红色)的抗体染色。随后对Smo占初级纤毛的百分比进行定量(n＝100)。
结果表明，与DMSO对照相比，TT22抑制Smo在初级纤毛累积的效果与阳性对照1相似，阳性对照1也可以抑制Smo初级纤毛积累(图5)。可见，TT22可阻断HH诱导的Smo在初级纤毛上的积累。
实施例5:化合物TT22对Shh信号转导的抑制
Gli1是Shh信号的下游靶基因，它是Shh信号通路活性的读数。为了验证TT22对Shh信号的抑制作用，使用N-Shh条件培养基(Shh-CM)或已知的Smo激动剂SAG来增强Gli1的转录。首先制备了Shh-CM，并通过梯度浓度处理探索了SAG的最佳有效浓度，即100nM。然后用20％Shh-CM或100nM SAG刺激血清饥饿的NIH3T3细胞，发现Gli1的mRNA水平分显著增加。为探讨TT22的抑制作用，用20％Shh-CM与DMSO、TT22(0.01、0.1、1、10μM)或阳性对照2(1μM)、阳性对照1(1μM)共同诱导血清饥饿的NIH3T3细胞24h。
图6A为用Shh-CM处理血清饥饿的NIH3T3细胞24小时后Gli1的mRNA水平结果。图6B和图6C分别为以TT22、1μM阳性对照2或1μM阳性对照1处理血清饥饿的NIH3T3细胞24h，Gli1mRNA(6B)和蛋白表达水平(6C)的检测结果。图6D为Gli1蛋白水平定量测量TT22对Shh刺激的HH通路活性的剂量依赖性抑制测试结果。观察到TT22呈剂量依赖性地降低Gli1mRNA和蛋白水平。阳性对照1、阳性对照2也能抑制Gli1的表达。可见，TT22可抑制Shh-CM诱导的Gli1表达。
实施例6:化合物TT22对SAG诱导Gli1表达的抑制
通过与Shh-CM相似的方法证明Smo激动剂SAG刺激的Shh活性可以被TT22抑制。
图7A为用DMSO或SAG诱导血清饥饿的NIH3T3细胞24h后Gli1mRNA水平的检测结果。图7B和图7C为用10-7M(100nM)SAG与TT22、1μM阳性对照2或1μM阳性对照1诱导血清饥饿NIH3T3细胞24h，细胞内Gli1mRNA水平(图7B)和蛋白水平(图7C)的检测结果。图7D为Gli1蛋白水平定量测量TT22对SAG刺激的HH通路活性的剂量依赖性抑制作用实验结果。可见，TT22可抑制SAG诱导的Gli1表达。TT22可以作为一种有效的抑制剂，并呈剂量依赖性地抑制Shh信号通路的靶基因表达。
实施例7:化合物TT22对神经元异常癫痫样放电的抑制
通过如图8A所示的方法评价Smo抑制剂对神经元电生理反应的影响。
体外培养的海马神经元(n＝7-14)分别用DMSO、TT22、阳性对照1和阳性对照2在37℃处理培养30min。然后将神经元转移到膜片钳平台上，灌流HighK+/0Mg2+细胞外液诱导癫痫样放电，直至细胞完全诱发。然后用膜片钳稳定记录细胞30min。取10-20min的记录数据进行分析。如图所示(图8B)，TT22、阳性对照1和阳性对照2的处理不影响神经元的静息膜电位。
使用全细胞膜片钳记录TT22、阳性对照1和阳性对照2处理抑制癫痫样放电的神经元的电活动。在指示药物孵育30min后，将神经元转移到标准细胞外液中，进行全细胞记录。当I＝0时，测定神经元静息膜电位(Vm)。神经元在指定处理下的电活动情况的代表性记录见图8C。单个爆发(箭头所指)的扩展视图见图8D。
除此之外，对神经元放电频率(图8E)和放电平均间隔时间(图8F)进行了定量测定，并记录了10-20min的痫样放电次数记录(图8G)。TT22以及阳性对照1和阳性对照2可以减少癫痫样放电的频率(图8E)，并增加癫痫发作的间隔时间(图8F)。此外，第10-20分钟的的记录数据显示，浓度为1μM TT22、10μM的TT22以及1μM阳性对照1和1μM阳性对照2预孵育抑制了癫痫样放电(图8G)。这些结果表明TT22、阳性对照1和阳性对照2可以有效抑制神经元异常癫痫样放电。

Claims (10)

1.式(I)化合物或其药学上可接受的盐、其异构体或溶剂合物：
式中，
R1选自-C(O)R3、-S(O)2R3或-P(O)(R3)2；
R3选自羟基、氨基或-C1-3烷基；
R2选自-C1-6烷基；
X选自F、Cl、Br或I。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐、其异构体或溶剂合物，其特征在于，R1选自羧基、甲酰基、乙酰基、丙酰基、甲磺酰基、乙磺酰基、丙磺酰基或磷酸基；
优选地，R2选自-C1-3烷基；
优选地，X选自Cl或Br。
3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐、其异构体或溶剂合物，所述化合物具有如下结构：
4.根据权利要求1-3任一项所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
式(IA)化合物与式(IB)化合物偶联反应得到式(I)化合物；
其中，X、R1、R2定义同式(I)化合物；
X’为卤素；优选地，X’为Br；
优选地，所述式(IA)化合物通过包括以下步骤的方法制备得到：
(1)
式(IA-1)化合物与式(IA-2)化合物缩合反应得到式(IA-3)化合物；
(2)
式(IA-3)化合物发生成环反应得到式(IA)化合物；
优选地，所述式(IB)化合物通过包括以下步骤的方法制备得到：
式(IB-1)催化氢化反应得到式(IB)化合物。
5.药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、其异构体或溶剂合物以及药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求1-4任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、其异构体或溶剂合物、权利要求5所述的药物组合物在制备用于抑制Hedgehog信号通路的药物中的应用；
优选地，在制备用于抑制Sonic Hedgehog信号通路的药物中的应用。
7.根据权利要求1-4任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、其异构体或溶剂合物、权利要求5所述的药物组合物在制备治疗慢性脑部疾病的药物中的应用；
优选地，所述慢性脑部疾病为具有Smo D473H突变的脑部疾病；
优选地，所述慢性脑部疾病包括癫痫。
8.根据权利要求1-4任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、其异构体或溶剂合物、权利要求5所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.索尼德吉(LDE-225)在制备治疗慢性脑部疾病的药物或制备抗肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述慢性脑部疾病包括癫痫。
10.一种用于治疗有需要的患者的由Hedgehog信号通路介导的病症的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求1-4任一项的化合物或其药学上可接受的盐、其异构体或溶剂合物、索尼德吉或权利要求5所述的药物组合物。
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