EA032634B1 - Соединения-ингибиторы передачи сигналов пути notch - Google Patents

Abstract

В изобретении предложены соединения или их фармацевтически приемлемые соли и фармацевтическая композиция, содержащая указанные соединения или их фармацевтически приемлемые соли, пригодные в качестве ингибитора передачи сигналов пути Notch для лечения указанных видов рака, сенсоневральной тугоухости, вызванной утратой слуховых волосковых клеток, и инициации образования слуховых волосковых клеток

Description

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ (45) Дата публикации и выдачи патента

2019.06.28 (21) Номер заявки

201792478 (22) Дата подачи заявки

2016.07.01 (51) 1п1. С1. С071) 487/14 (2006.01)

С071) 471/14 (2006.01)

А61К31/55 (2006.01)

А61Р27/16 (2006.01)

А61Р35/00 (2006.01) (54) СОЕДИНЕНИЯ-ИНГИБИТОРЫ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛОВ ПУТИ \ОТСН (31) 62/189,393 (32) 2015.07.07 (33) И8 (43) 2018.06.29 (86) РСТ/и82016/040612 (87) \УО 2017/007702 2017.01.12 (71) (73) Заявитель и патентовладелец:

ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (ϋδ);

АУДИОН ТЕРАПЕУТИКС (ΝΕ) (72) Изобретатель:

Клэй Джулия Мари (ϋδ), Эдж Альберт (ΝΕ), Хипскинд Филип Артур (ϋδ), Джилл Джон С. (ΝΕ), Пател Бхарвин Кумар (118), Ван Эе Хельмут

Хендрикус Герардус (ΝΕ), Вроблески

Аарон Д., Чжао Гайин (ϋδ) (74) Представитель:

Угрюмов В.М., Христофоров А.А., Строкова О.В., Гизатуллина Е.М., Карпенко О.Ю., Глухарёва А.О., Лыу Т.Н. (КБ) (56) Ш)-А1-2014039781 и8-А1-2013029972

ΟΑΤΕΚΙΝΑ ГАТТОКиЗЗО ЕТ АЬ.: 8рес1йс Таг§ейп§ ЕйдЫу Сопзепеб Кезккюз ίη 11ю ЕПУ-1 Кех егзе Тгапзспр1азе Рптег Опр Κο«ίοη. Эезфп, 8упЙ1ез18, апб Вю1о§1са1 1ла1на11оп оГ Νονοί. ΡοΙοηΙ. апб Вгоаб 8рес1тит ΝΝΚΤΙβ «ίΐΐι ΛηΐίνίπιΙ Αοΐίνίΐγ, ,ΙΟΝΚΝΑΙ, ΟΕ ΜΕϋΙΟΙΝΑΕ С1ΤΜΙ8ΤΚΥ. νοί. 48, по. 23, 1 ΝονοηιΕοΓ 2005 (2005-11-01), радез 7153-7165, ΧΡ055064516,188Ν: 0022-2623, ϋΟΙ: 10.1021/μη0502576 сотроипб 20а

032634 В1 (57) В изобретении предложены соединения или их фармацевтически приемлемые соли и фармацевтическая композиция, содержащая указанные соединения или их фармацевтически приемлемые соли, пригодные в качестве ингибитора передачи сигналов пути Νοίεΐι для лечения указанных видов рака, сенсоневральной тугоухости, вызванной утратой слуховых волосковых клеток, и инициации образования слуховых волосковых клеток

032634 Β1

032634 Β1

032634 Β1

Потеря с возрастом волосковых сенсорных клеток внутреннего уха, воздействие шума, влияние химических агентов, лекарственных препаратов, заболевания и генетические расстройства каждый год приводят к нарушениям слуха у многих людей. Независимо от этиологии гибель или дисфункция механосенсорных волосковых клеток, расположенных в кортиевом органе улиткового лабиринта, является основной причиной сенсоневральной тугоухости (8ΝΗΕ). Профилактические меры замедления потери слуха, главным образом, ограничены периферической защитой, такой как беруши, или уменьшение уровня шума, или отмена использования наушников. Современные способы лечения 8ΝΗΕ основаны в основном на электронных технологиях, таких как усиление звука с помощью слухового аппарата или в обход волосковых клеток посредством электрической стимуляции выживших нейронов спирального ганглия с помощью кохлеарного имплантата. Для внезапной сенсоневральной тугоухости предложено также введение стероидов для обеспечения системной терапии или интратимпанальной терапии.

Кохлеарный сенсорный эпителий содержит волосковые клетки, приспособленные для обнаружения звуковой вибрации, которая преобразуется стереоцилией на апикальных поверхностях волосковых клеток в электрические импульсы и передается в головной мозг через VIII черепной нерв. Слуховые волосковые клетки, образующиеся во время развития, являются постмитотическими, и они не заменяются после утраты или в процессе нормального обновления клеток у млекопитающих. В результате 8ΝΗΕ вследствие потери слуховых волосковых клеток является необратимой. Развитие слуховых волосковых клеток во время эмбрионального периода включает дифференцировку, в которой просенсорные эпителиальные клетки приобретают различные направления развития - либо волосковых клеток, либо поддерживающих клеток в процессе латерального торможения, опосредованного передачей сигналов Νοίοΐι. Активная передача сигналов Νοίοΐι, стимулированная лигандами на соседних волосковых клетках, препятствует дифференцировке просенсорных эпителиальных клеток в волосковые клетки. Такие клетки становятся поддерживающими клетками.

Передача сигналов Νοίοΐι представляет собой эволюционный консервативный путь, который играет ключевую роль в развитии и гомеостазе ткани у млекопитающих. Рецепторы и лиганды Νοίοΐι содержат однопроходные трансмембранные домены, экспрессируются на клеточной поверхности, и поэтому передача сигналов Νοίοΐι особенно важна для опосредования коммуникации между соседними клетками, экспрессирующими такие рецепторы и лиганды. Существует четыре известных рецептора Νοίοΐι, встречающихся у грызунов и людей, которые получили название от ΝοΙο1ι1 до Νοίοΐι 4. Рецепторы Νοίοΐι представляют собой гетеродимерные белки, состоящие из внеклеточного и внутриклеточного домена, которые первоначально синтезируются в виде одного полипептида. Взаимодействие рецептора и лиганда активирует серию протеолитических расщеплений полипептида рецептора Νοίοΐι, в которой участвует активность γ-секретазы. Активность γ-секретазы отщепляет внутриклеточный домен Νοίοΐι от внутренней стороны плазматической мембраны, который перемещается в ядро с образованием комплекса фактора транскрипции. Внутриклеточный домен Νοίοΐι (ΝΙΟΌ) является активной формой белка. Различные сигнальные функции Νοίοΐι включают пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, ангиогенез, миграцию и самообновление. Такие разнообразные функции передачи сигналов Νοίοΐι во время развития и сохранения нормальных тканей могут быть аберрантно активированы при различных формах рака. Онкогенные функции передачи сигналов Νοίοΐι включают подавление апоптоза и ускорение клеточной пролиферации.

γ-Секретаза играет определяющую роль в каскаде активации Νοίοΐι. В результате ингибиторы γсекретазы активно исследуют на предмет их возможности блокирования активации рецептора Νοίοΐι для лечения рака. Несмотря на продолжающиеся клинические испытания не существует ни одного промышленного химиотерапевтического лекарства, являющегося ингибитором Νοίοΐι.

γ-Секретаза через путь передачи сигналов Νοίοΐι также играет важнейшую роль в дифференцировке просенсорных клеток. В результате ингибиторы γ-секретазы активно исследуют на предмет их возможности блокирования активации рецептора Νοίοΐι для лечения 8ΝΗΕ. Вместо введения агента, ингибирующего Νοίοΐι, различными способами для доставки в системный кровоток и инициации экспрессии атонального гомолога 1 (Λΐοΐιΐ или Ма1й1) в патологически повышенных количествах и в течение продолжительных периодов времени, целесообразно и желательно инициировать экспрессию Λΐοΐιΐ в кохлеарном окружении с более конкретным уровнем экспрессии и в течение более конкретного периода времени. Невозможность модулирования Λΐοΐιΐ остается главным препятствием для изучения слуховых волосковых клеток и разработки терапевтических средств для регенерации слуховых волосковых клеток. Несмотря на продолжающиеся исследования, такие как \УО 2014/039781, не существует промышленных ингибиторов Νοίοΐι для лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной утратой слуховых волосковых клеток.

Существует потребность в обнаружении соединений, обладающих ингибирующей активностью в отношении передачи сигналов пути Νοίοΐι. Кроме того, существует потребность в обнаружении соединений, который ингибируют передачу сигналов пути Νοίοΐι посредством ингибирующей активности γсекретазы. Существует также потребность в обнаружении соединений, обладающих различными структурными особенностями, которые могут способствовать ингибирующей активности в отношении передачи сигналов пути Νοίοΐι и γ-секретазы. Дополнительная потребность заключается в обнаружении со

- 1 032634 единений, которые инициируют экспрессию ΑΐοΗ1 посредством ингибирования передачи сигналов пути ΝοΙοΗ. Существует также дополнительная потребность в обнаружении соединений, демонстрирующих требуемые свойства абсорбции, распределения, метаболизма и экскреции.

В одном аспекте настоящего изобретения предложено соединение структуры

4,4,4-трифтор-№((28)-1-((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1Н-бензо[£|пирроло[1,2а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид, или его, по существу, диастереомерно чистый изомер, или фармацевтически приемлемая соль любого из указанных выше соединений.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено соединение структуры

№((28)-1-((8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-£]пирроло[1,2-а]азепин-5ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид, или его, по существу, диастереомерно чистый изомер, или фармацевтически приемлемая соль любого из вышеуказанных соединений.

В другом аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение 1 или его, по существу, чистый диастереомер; или соединение 2 или его, по существу, чистый диастереомер; или фармацевтически приемлемую соль любого из вышеуказанных соединений и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения рака, который представляет собой Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфобластный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, эритролейкоз, трижды негативный рак молочной железы, рак молочной железы, рак яичников, меланому, рак легких, немелкоклеточный рак легких, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак толстой и прямой кишок, рак головы и шеи, рак шейки матки, рак предстательной железы, рак печени, плоскоклеточную карциному полости рта, рак кожи, медуллобластому, ангиосаркому, рабдомиосаркому, липосаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, гепатоцеллюлярную карциному, внутрипеченочную и внепеченочную холангиокарциному и аденокистозную карциному, у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1, его, по существу,чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения рака легких у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной потерей слуховых волосковых клеток, у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен способ инициации образования слуховых волосковых клеток у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли.

В другом аспекте настоящего изобретения предложено соединение 1, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль или соединение 2, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено соединение 1, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль или соединение 2, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль для применения при лечении Тклеточного острого лимф областного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, эритролейкоза, трижды негативного рака молочной железы, рака молочной железы, рака яичников, меланомы, рака лег

- 2 032634 ких, немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака толстой и прямой кишок, рака головы и шеи, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака печени, плоскоклеточной карциномы полости рта, рака кожи, медуллобластомы, ангиосаркомы, рабдомиосаркомы, липосаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, гепатоцеллюлярной карциномы, внутрипеченочной или внепеченочной холангиокарциномы или аденокистозной карциномы.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено соединение 1, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль или соединение 2, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль для применения при лечении рака легких.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено соединение 1, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль или соединение 2, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль для применения при лечении сенсоневральной тугоухости, вызванной потерей слуховых волосковых клеток.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено соединение 1, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль или соединение 2, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль для применения при инициации образования слуховых волосковых клеток.

В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения Т-клеточного острого лимф областного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, эритролейкоза, трижды негативного рака молочной железы, рака молочной железы, рака яичников, меланомы, рака легких, немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака толстой и прямой кишок, рака головы и шеи, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака печени, плоскоклеточной карциномы полости рта, рака кожи, медуллобластомы, ангиосаркомы, рабдомиосаркомы, липосаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, гепатоцеллюлярной карциномы, внутрипеченочной или внепеченочной холангиокарциномы или аденокистозной карциномы.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения рака легких.

В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной потерей слуховых волосковых клеток.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для инициации образования слуховых волосковых клеток.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной потерей слуховых волосковых клеток, у домашней собаки, включающий введение указанной домашней собаке терапевтически эффективного количества соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ инициации образования слуховых волосковых клеток у домашней собаки, включающий введение указанной домашней собаке терапевтически эффективного количества соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли.

Выражение соединение 1, его диастереомер означает 4,4,4-трифтор-Ы-((28)-1-((9-метокси-3,3диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1Н-бензо [Дпирроло [1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2ил)бутанамид; или диастереомер 4,4,4-трифтор-Ы-((8)-1-(((8)-9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6тетрагидро-1Н-бензо [ί] пирроло [1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид, или 4,4,4трифтор-Ы-((8)-1-(((В)-9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1Н-бензо[Г]пирроло[1,2а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид. Аналогично, выражение соединение 2, его диастереомер означает №((28)-1-((8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-£]пирроло[1,2а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид; или диастереомер Ν-((8)-1-(((8)-8,8диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-£]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2ил)-4,4,4-трифторбутанамид, или N-((8)-1 -(((В)-8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2ί] пирроло [1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид.

Термин пациент означает млекопитающее, а млекопитающее включает, но не ограничивается

- 3 032634 им, человека после постнатального периода. Постнатальный период у человека представляет собой период, начинающийся сразу после рождения ребенка и продолжающийся в течение 30 дней.

Терапевтически эффективное количество или эффективное количество означает дозу соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера, который представляет собой изомер 1 или изомер 2, или его фармацевтически приемлемой соли, или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера, который представляет собой изомер 1 или изомера 2, или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтической композиции, содержащей любое из указанных выше соединений, необходимую для ингибирования передачи сигналов Νοίοΐι у онкологического пациента и либо разрушения раковых клетокмишеней, либо замедления или остановки прогрессирования рака у пациента. Аналогично, терапевтически эффективное количество или эффективное количество означает дозу соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера, который представляет собой изомер 1 или изомер 2, или его фармацевтически приемлемой соли, или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера, который представляет собой изомер 1 или изомера 2, или его фармацевтически эффективной соли, или фармацевтической композиции, содержащей любое из указанных выше соединений, необходимую для ингибирования передачи сигналов Νοίοΐι у пациента с сенсоневральной тугоухостью, вызванной потерей или повреждением слуховых волосковых клеток, или для инициации образования слуховых волосковых клеток.

По существу, чистый диастереомер соединения 1 или соединения 2 означает изомер 1 или изомер 2, по существу, не содержащий другого изомера. Соединение 1 или соединение 2 является по существу, диастереомерно чистым, если изомерная чистота в положении 6 соединения 1 или в положении 5 соединения 2 составляет более 90% энантиомерного избытка. В другом варианте реализации изомерная чистота составляет более 95% энантиомерного избытка в положении 6 соединения 1 или в положении 5 соединения 2. В другом варианте реализации изомерная чистота составляет более 98% энантиомерного избытка в положении 6 соединения 1 или в положении 5 соединения 2. В другом варианте реализации изомерная чистота составляет более 99% энантиомерного избытка в положении 6 соединения 1 или в положении 5 соединения 2. Все стереоизомеры, включая диастереомерные смеси соединения 1 или соединения 2, входят в границы объема настоящего изобретения.

Предполагаемые дозы соединения 1, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли, или соединения 2, его, по существу, чистого диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака составляют от 0,1 до 100 мг/пациент/сутки. Предпочтительные дозы предположительно составляют от 1,0 до 75 мг/пациент/сутки. Наиболее предпочтительные дозы предположительно составляют от 2,0 до 50 мг/пациент/сутки. Предполагаемые дозы соединения 1, его диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли, или соединения 2, его диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли для лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной потерей или повреждением слуховых волосковых клеток, или для инициации образования слуховых волосковых клеток составляют от 0,01 до 100 мг/пациент/сутки. Предпочтительные дозы предположительно составляют от 0,1 до 10 мг/пациент/сутки. Наиболее предпочтительные дозы предположительно составляют от 0,2 до 1,0 мг/пациент/сутки.

Для лечения рака, сенсоневральной тугоухости или для образования слуховых волосковых клеток точную дозу, необходимую для лечения пациента, и продолжительность курса лечения определяет врач с учетом стадии и тяжести заболевания, а также особых потребностей и реакции конкретного пациента. Несмотря на то, что доза указана в посуточном выражении, схема введения может быть изменена для обеспечения более оптимального терапевтического эффекта для пациента и для регулирования и облегчения токсичности, связанной с лекарством. Помимо ежедневного введения, может быть уместно введение один раз в два дня (Ο2Ό). один раз в два дня в течение пятидневного периода с последующими двумя днями без введения дозы (Т.1.Ш.), один раз в три дня (¢30), или один раз в неделю (О.1.Ш.) в течение 21дневного цикла введения доз, или другие схемы введения.

Термины лечение, лечить или лечащий включают полный спектр вмешательств для лечения рака, сенсоневральной тугоухости, вызванной потерей или повреждение слуховых волосковых клеток, или для инициации образования слуховых волосковых клеток, например, введение активного соединения для облегчения, замедления или реверсирования одного или более симптомов и для отсрочки прогрессирования рака или потери или повреждения слуховых волосковых клеток, от которого страдает пациент, или для инициации образования слуховых волосковых клеток у пациента.

Домашняя собака означает одомашненных собак и собак домашних пород, включая, но не ограничиваясь ими, домашних питомцев, собак-поводырей, собак-спасателей, пастушьих собак и собак, предназначенных для охраны скота.

Слуховая тугоухость, сенсоневральная тугоухость или потеря слуха у человека означает, что слуховой порог (самый тихий воспринимаемый звук (интенсивность) при определенной частоте) у пациентов составляет от 21 до 40 дБ для легкой степени; от 41 до 55 дБ для умеренной степени; от 56 до 70 дБ для умеренно тяжелой степени; от 71 до 90 дБ для тяжелой степени и 91 дБ и более для абсолютной потери слуха. Интенсивность обычно тестируют в диапазоне от 0 до 120 дБ. Тестируемая частота обычно составляет 250, 500, 1000, 2000, 4000 и 8000 Гц. Диагностическую оценку слуха проводят стандартными способами тестирования, известными и используемыми специалистами в данной области техники, вклю- 4 032634 чая аудиометрию чистого тона, в том числе среднее значение чистого тона, речевую аудиометрию, в том числе порог восприятия речи, оценку акустических стволовых вызванных потенциалов (АВК или ВЛЕК), транстимпаническую электрокохлеографию (ЕСОС) и испытание отоакустической эмиссии (ОАЕ). Оценку у детей и младенцев также осуществляют стандартными способами тестирования, известными и используемыми специалистами в данной области техники, включая визуально подкрепленную аудиометрию, игровую аудиометрию, отоакустическую эмиссию (ОАЕ) и оценку акустических стволовых вызванных потенциалов.

Соединение согласно настоящему изобретению предпочтительно составляют в виде фармацевтической композиции с фармацевтически приемлемым носителем и вводят различными способами. Предпочтительно для лечения рака такие композиции предназначены для перорального введения.

Для лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной потерей или повреждением слуховых волосковых клеток, или для инициации образования слуховых волосковых клеток может быть составлена и введена фармацевтическая композиция, подходящая для перорального или парентерального введения для обеспечения местной или системной терапии. Пероральные композиции включают таблетки, таблетки с покрытиями, твердые или мягкие желатиновые капсулы, растворы, эмульсии или суспензии. Парентеральные композиции могут быть составлены для обеспечения возможности введения, включая подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интраперитонеальные, интраплевральные, интрастернальные, транстимпанические, внутрилабиринтные или интракохлеарные инъекции или инфузии. Фармацевтические композиции могут быть составлены для обеспечения биодоступности соединения согласно настоящему изобретению при введении композиции пациенту или могут быть составлены для обеспечения контролируемого или устойчивого высвобождения активного фармацевтического ингредиента. Предпочтительна фармацевтическая композиция, подходящая для транстимпанического введения в полость среднего уха и предпочтительно также введения в нишу круглого окна среднего уха. Предусмотрена также внутрилабиринтная инъекция и интракохлеарная инъекция. Предпочтительный способ введения для лечения тугоухости представляет собой транстимпаническую инъекцию, однако это не исключает фармацевтические композиции, подходящие для альтернативных способов введения для обеспечения системной доставки, и может включать композиции и схемы лечения, альтернативные или дополнительные для местного транстимпанического введения. Предпочтительна также система местной доставки с устойчивым высвобождением, в которой интервал высвобождения может варьироваться от 3 дней до 90 дней в зависимости от доставляющего носителя или смеси доставляющих агентов-носителей, в которые введено соединение 1, или его, по существу, чистый диастереомер, или его фармацевтически приемлемая соль.

Фармацевтические композиции, способы получения и системы доставки для направленной доставки лекарств хорошо известны в данной области техники (см., например, ΒΕΜΙΝΟΓΟΝ: ТНЕ 8С1ЕЫСЕ ΆΝΏ РКАСТ1СЕ ОР РНАКМАСУ (А. Сеппаго, е( а1., ред., 19-е изд., Маск РиЫЫипд Со., 1995); 8а11 аиб Р1оп1кс. Рппс1р1е5 оГ Ьоса1 Эгид Пейуегу (о (Не 1ииег Еаг, Аибю1 №ито1о1, 2009, (14); 350-360; РНее. е( а1., 8и81атей-Ке1еа8е 1п]ес1аЫе Эгид Пейуету, Рйаттасеийса1 Тескио1оду, 8рес1а1 Ъвие Эгид Пейуету, 01 ноября 2010). Фармацевтические композиции могут содержать консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, подсластители, окрашивающие агенты, ароматизаторы, соли для изменения осмотического давления, буферы, маскирующие агенты или антиоксиданты.

Соединение согласно настоящему изобретению может взаимодействовать со многими неорганическими и органическими кислотами с образованием фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот. Такие фармацевтически приемлемые соли и общие способы их получения общеизвестны в данной области техники (см., например, Р. 81аН1, е( а1., ΗΑΝΏΒΟΟΚ ОР РНАКМАСЕиТЮЛЬ 8АЬТ8: РКОРЕВПЕ8, 8Е1.ЕСТ1ОХ А\1) И8Е, (УСНА/Айеу-УСН, 2002); 8.М. Вегде е! а1., Рйаттасеийса1 8аЙ8, 1оита1 оГ Рйагтасеийса1 Заеисев, том 66, № 1, январь 1977).

Соединение 1, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль или соединение 2, его, по существу, чистый диастереомер или его фармацевтически приемлемая соль могут быть получены многими способами, известными в данной области техники, а также способами, описанными ниже. Конкретные стадии синтеза могут быть объединены в различных вариантах для получения соединения 1, его диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли или соединения 2, его диастереомера или его фармацевтически приемлемой соли.

Соединение 1 имеет название 4,4,4-трифтор-№((28)-1-((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6тетрагидро-1Н-бензо[Г]пирроло[1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид, и может также иметь название 4,4,4-трифтор-№{(18)-2-[(9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1Нпирроло[1,2-а][1]бензазепин-6-ил)амино]-1-метил-2-оксоэтил}бутанамид; и может также иметь название бутанамид, 4,4,4-трифтор-№[(18)-1-метил-2-оксо-2-[(2,3,5,6-тетрагидро-9-метокси-3,3-диметил-5-оксо1Н-пирроло[1,2-а][1]бензазепин-6-ил)амино]этил]-; и для однозначного описания соединения 1 могут быть использованы другие названия. Его диастереомеры имеют название 4,4,4-трифтор-№((8)-1-(((8)-9метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1Н-бензо[Г]пирроло[1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид и 4,4,4-трифтор-№((8)-1-(((К)-9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро1Н-бензо[Г]пирроло[1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид. Для однозначного описания

- 5 032634 каждого из указанных диастереомеров могут быть использованы другие названия.

Соединение 2 имеет название М-((2§)-1-((8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2к]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид, также может иметь название М-{(18)-2-[(8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-Г|пирроло[1,2-а]азепин-5ил)амино]-1-метил-2-оксоэтил}-4,4,4-трифторбутанамид и также может иметь название бутанамид, 4,4,4трифтор-Ы-[(18)-1-метил-2-оксо-2-[(6,8,9,10-тетрагидро-8,8-диметил-6-оксо-5Н-пиридо[3,2к]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино]этил]-; и для однозначного описания соединения 2 могут быть использованы другие названия. Его диастереомеры имеют название Ы-((8)-1-(((8)-8,8-диметил-6-оксо6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-к]пирроло[1,2-а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4трифторбутанамид и №((8)-1-(((В)-8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-к]пирроло[1,2а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид. Для однозначного описания каждого из указанных диастереомеров могут быть использованы другие названия.

Следует понимать, что соединение 1 и соединение 2 изображены с одним зафиксированным хиральным центром из двух хиральных центров. В данном контексте для описания конкретных изомеров использованы обозначения Кана-Ингольда-Прелога (В)- и (8)-. Конкретные стереоизомеры могут быть получены посредством стереоспецифического синтеза с применением энантиомерно чистых или обогащенных исходных материалов. Конкретные стереоизомеры исходных материалов, промежуточные соединения или рацемические смеси, содержащие соединение 1 или соединение 2, могут быть выделены способами, хорошо известными в данной области техники, такими как способы, представленные в публикациях 81егеосйеш181ту ок Огдашс Сошроипбз, Ε.Ι. Е11е1 апб 8.Н. \УПеп (^йеу 1994) и Епаийошетз, Васеша1с8 апб ВезоШйопз, 1.. 1асцие8. А. Со11е1. апб 8.Н. ^йеп (^йеу 1991), включая хроматографию на хиральных неподвижных фазах, ферментативное разделение или фракционную кристаллизацию или хроматографию диастереомеров, полученных специально для этого, таких как диастереомерные соли. Если хиральное соединение выделено или разделено на свои изомеры, но абсолютные конфигурации или оптическое вращение не установлены, то изомеры произвольно обозначают как изомер 1 и изомер 2 в соответствии с порядком их элюирования в хиральной хроматографии, а если хиральная хроматография проведена на ранних стадиях синтеза, то такое же обозначение применяют в отношении всех последующих промежуточных соединений и примеров. Хотя в настоящем изобретении предусмотрены все смеси, содержащие соединения согласно настоящему изобретению, предпочтительным вариантом реализации является соединение 1, изомер 2, или соединение 2, изомер 2.

Соединения, используемые в качестве первоначальных исходных материалов для синтеза соединений согласно настоящему изобретению, общеизвестны и в случае их отсутствия в продаже могут быть легко синтезированы с помощью представленных специальных ссылок посредством стандартных технологий, обычно используемых специалистами в данной области техники или представленных в общих литературных источниках.

Примеры известных методик и способов включают те, которые описаны в общих литературных источниках, таких как Сотргейепйуе Огдашс Тгапзкогшайопз, УСН РиЬйзйегз 1пс, 1989; Сошрепйшш ок Огдашс 8уп1йейс МеШобз, т. 1-10, 1974-2002, ^йеу ШегзДепсе; Абуапсеб Отдашс Сйеш181ту, Веасйопз Месйашзшз, апб 8йис1иге, 5-е изд., Мюйае1 В. 8шйй апб 1еггу Магсй, \УПеу Шегзаепсе, 2001; Абуапсеб Отдашс Сйеш18йу, 4-е изд., ч. В, Веасйопз апб 8уп1йе515, кгапск А. Сагеу апб Вюйагб Е 8ипбЬегд, Ккитег Асабешю/Р1епиш РиЬйзйегз, 2000, и т.д., а также в ссылках, цитированных в них.

В данном контексте следующие термины имеют указанное значение: шАйоМ относится к белку атонального гомолога 1 мышей; 11А1о11 1 относится к белку атонального гомолога 1 человека; АЮ111 относится к гену атонального гомолога 1 человека; минимальная среда относится к 500 мл среды ОМЕМ/Р12+5 мл N2 100Х маточного раствора и 10 мл В27 50Х маточного раствора плюс 500 мкл маточного раствора ампициллина (1000Х, 50 мг/мл) и 1667 мкл фунгизона (300Х); ВЕСЕ относится к основному фактору роста фибробластов; ОМЕМ относится к среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко; ДМСО относится к диметилсульфоксиду; ЭДТК относится к этилендиаминтетрауксусной кислоте; ЕСЕ относится к эпидермальному фактору роста; ЭГТК относится к этиленгликоль-бис-(2аминоэтиловый эфир)^Д,№,№-тетрауксусной кислоте; ЭР/МС относится к электрораспылительной масс-спектроскопии; ЕВ8 относится к эмбриональной бычьей сыворотке; СЕР относится к зеленому флуоресцентному белку; ч. относится к часу или часам; НВ88 относится к сбалансированному солевому раствору Хэнкса; НЕК относится к почке эмбриона человека; 1С₅₀ относится к концентрации агента, которая вызывает 50% от максимального ингибирующего ответа, возможного для данного агента; 1дС относится к иммуноглобулину С; Ма1111 относится к гену атонального гомолога 1 человека; среда А относится к 200 мл минимальной среды+ЕСЕ ЬЕСЕ+1СЕ-1+гепарансульфат в концентрации 20, 10, 50 и 50 нг/мл соответственно; МЕМ относится к минимальной поддерживающей среде; мин относится к минутам; МС относится к масс-спектроскопии; Ν1Κ.Ό относится к внутриклеточному домену №1с111; пСЕР относится к ядерному зеленому флуоресцентному белку; ОС относится к кортиеву органу; РВ8 относится к фосфатно-солевому буферному раствору; РВ8Т относится к фосфатносолевому буферному раствору+Тетееп®; кПЦР относится к количественной полимеразной цепной реакции; кОТ-ПЦР относится к количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипци

- 6 032634 ей; об/мин относится к количеству оборотов в минуту; буфер ВЬТ относится к лизисному буферу для выделения РНК, КЫеа8уЬу818; ВТ относится к комнатной температуре; ТЬр относится к ТАТАсвязывающему белку.

Подготовительный синтез 1. 1-Бром-3-(2-бром-4-метоксифенил)пропан-2-он

По каплям добавляли триметилсилилдиазометан (118,4 мл, 236,80 ммоль, 2 М в гексане) к перемешиваемому при 0°С раствору 2-(2-бром-4-метоксифенил)ацетилхлорида (52 г, 197,3 ммоль) в тетрагидрофуране (197 мл) и ацетонитриле (197 мл) в атмосфере азота. Через 15 мин оставляли смесь нагреваться до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 ч в атмосфере азота. Концентрировали с получением густого красного маслянистого вещества (61 г). По каплям добавляли бромоводород (36 мл, 197 ммоль, 33% в уксусной кислоте) к перемешиваемому при 5°С раствору 2-(2-бром-4-метоксифенил)ацетилазида, полученного на предыдущей стадии, в уксусной кислоте (265 мл). После добавления оставляли нагреваться до комнатной температуры в атмосфере азота. Через 45 мин гасили смесью льда/воды (500 мл) с получением коричневого осадка. Отфильтровывали твердое вещество, промывали водой (100 мл) и гексанами (100 мл) и сушили под вакуумом при 45°С в течение 2 ч с получением указанного в заголовке соединения в виде оранжевого маслянистого вещества (63,0 г, 99%). ¹Н ЯМР (300 МГц, ΟΌΟ1₃): 7.17-7,12 (м, 2Н), 6,85 (дд, 1=2,5, 8,5 Гц, 1Н), 4,03 (с, 2Н), 3,97 (с, 2Н), 3,79 (с, 3Н).

Подготовительный синтез 2. (32)-1-(2-Бром-4-метоксифенил)-3-(3,3-диметилпирролидин-2илиден)пропан-2-он

Одной порцией добавляли 3,3-диметилпирролидин-2-тион (26,5 г, 205 ммоль) к суспензии промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 1, 1-бром-3-(2-бром-4метоксифенил)пропан-2-она (60,00 г, 186 ммоль) и йодида калия (31 г, 86 ммоль) в тетрагидрофуране (600 мл) при комнатной температуре и перемешивали в течение 1 ч. Добавляли метил-трет-бутиловый эфир (200 мл), отфильтровывали твердое вещество, и промывали осадок на фильтре метил-третбутиловым эфиром (100 мл) с получением 1-(2-бром-4-метоксифенил)-3-[(4,4-диметил-2,3дигидропиррол-1-ий-5-ил)сульфанил]пропан-2-она йодида в виде светло-желтого твердого вещества (100 г). К суспензии твердого вещества (100 г, 201 ммоль) в ацетонитриле (1 л) добавляли триэтиламин (56 мл, 401 ммоль) и трифенилфосфин (58 г, 221 ммоль) и перемешивали при 65°С в течение 2,5 ч. Добавляли метил-трет-бутиловый эфир (200 мл) и отфильтровывали твердое вещество. Выпаривали фильтрат, растирали остаток с метил-трет-бутиловым эфиром (20 мл) и отфильтровывали твердое вещество (два раза). Выпаривали объединенные фильтраты с получением 50 г неочищенного вещества. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 20-50% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения в виде грязновато-белого твердого вещества (41 г, 70%). МС (т/ζ): 338,0/340,0 (М+/М+2).

Подготовительный синтез 3. 9-Метокси-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-пирроло[1,2-А][1] бензазепин5(6Н)-он

Дегазировали/продували азотом (х3) смесь промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 2, (32)-1-(2-бром-4-метоксифенил)-3-(3,3-диметилпирролидин-2-илиден)пропан-2-она (40,0 г, 118 ммоль), ацетата палладия (2,7 г, 12 ммоль), карбоната цезия (77 г, 237 ммоль), 4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантена (13,7 г, 24 ммоль) и Ы-метил-2-пирролидона (1,2 л). Нагревали суспензию при 150°С в течение 4 ч. Охлаждали до комнатной температуры, отфильтровывали твердое вещество, промывали этилацетатом и отбрасывали твердое вещество. К фильтрату добавляли этилацетат (1 л) и воду (500 мл), отфильтровывали твердое вещество через диатомовую землю и отбрасывали. Разделяли слои фильтрата, экстрагировали из водной фазы этилацетатом (2х20 мл), затем дихлорметаном (3х100 мл). Дважды промывали объединенные органические слои 5%-ным водным раствором бикарбоната натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 100 мл темно-коричневого маслянистого вещества. Фильтровали вещество через слой диоксида кремния, элюируя дихлорметаном, затем 1%-ной смесью метанола/дихлорметана, и концентрировали фильтрат. Разделяли остаток между этилацетатом и 5%-ным водным раствором бикарбоната натрия, проводили обратную экстракцию из водной фазы этилацетатом, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением неочищенного продукта в виде темно-коричневого пенистого вещества. Растворяли

- 7 032634 полученное пенистое вещество в этилацетате (250 мл), добавляли 8ШаВоп6 ТЫо1® (80 г) и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Отфильтровывали твердое вещество, промывали осадок на фильтре этилацетатом и дихлорметаном, концентрировали фильтрат с получением указанного в заголовке соединения в виде светло-коричневого твердого вещества (19,6 г, 65%). МС (т/ζ): 258,0 (М+Н).

Подготовительный синтез 4. 6-Гидроксиимино-9-метокси-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-пирроло[1,2а][1]бензазепин-5(6Н)-он

Несколькими порциями добавляли трет-бутоксид калия (11 г, 98 ммоль) к перемешиваемому при 0°С раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 3, 9-метокси-3,3диметил-2,3-дигидро-1Н-пирроло[1,2-А][1]бензазепин-5(6Н)-она (16,8 г, 65 ммоль) в тетрагидрофуране (336 мл), и перемешивали в течение 15 мин. По каплям добавляли амилнитрит (12,2 мл, 91 ммоль), и перемешивали смесь в течение 30 мин при 0°С. Выливали реакционную смесь в смесь лед/вода (200 мл), и экстрагировали смесь этилацетатом (2x200 мл). Отфильтровывали кристаллизованное твердое вещество, экстрагировали из фильтрата дихлорметаном (2x100 мл). Промывали объединенные органические вещества насыщенным солевым раствором (100 мл), сушили сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением светло-коричневого твердого вещества. Растирали твердое вещество с 1:1 смесью метил-трет-бутилового эфира/гексана, объединяли с собранным ранее твердым веществом с получением указанного в заголовке соединения в виде светло-желтого твердого вещества (16,5 г, 88%). МС (т/ζ): 287,1 (М+Н).

Подготовительный синтез 5. 6-Амино-9-метокси-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-пирроло[1,2а][1]бензазепин-5(6Н)-он

По каплям в течение 10 мин добавляли трифторуксусную кислоту (17 мл, 231 ммоль) к перемешиваемой при 5-10°С суспензии промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 4, 6-гидроксиимино-9-метокси-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-пирроло[1,2-а][1]бензазепин-5(6Н)-она (16,5 г, 58 ммоль) и цинковой пыли (11,3 г, 173 ммоль) в дихлорметане (248 мл), затем оставляли нагреваться до комнатной температуры. Фильтровали смесь через слой диатомовой земли, выливали фильтрат в смесь льда и насыщенного водного раствора бикарбоната натрия (1:1, 500 мл). Фильтровали полученную суспензию через диатомовую землю, и промывали фильтровальную подложку дихлорметаном. Экстрагировали из водного слоя дихлорметаном (100 мл), сушили объединенные органические слои сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде светлокоричневого пенистого вещества (14,7 г, 94%). МС (т/ζ): 273,1 (М+Н).

Подготовительный синтез 6. Бензил-(28)-2-(4,4,4-трифторбутаноиламино)пропаноат

Добавляли гидрохлорид бензилового эфира Ь-аланина (7 г, 32,5 ммоль), диизопропилэтиламин (28 мл, 162 ммоль), гидрат гидроксибензотриазола (7,5 г, 49 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3этилкарбодиимида гидрохлорид (9,3 г, 49 ммоль) к перемешанному раствору 4,4,4-трифтормасляной кислоты (7,1 г, 49 ммоль) в дихлорметане (162 мл) и перемешивали при комнатной температуре в атмосфере Ν₂ в течение 20 ч. Гасили 20%-ным водным раствором лимонной кислоты (150 мл), перемешивали смесь в течение 5 мин, разделяли слои и экстрагировали из водного слоя дихлорметаном (100 мл). Промывали объединенные органические слои насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (150 мл), сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали с получением 10,6 г бледно-желтого твердого вещества. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 25-50% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (9,2 г, 94%). МС (т/ζ): 304,2 (М+Н).

Подготовительный синтез 7. (28)-2-(4,4,4-Трифторбутаноиламино)пропановая кислота СЫга1

Ρ μ О

Р^у^он о =

Добавляли палладий (1,8 г, 0,8 ммоль, 5% на С) к перемешанному раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 6, бензил-(28)-2-(4,4,4-трифторбутаноилами

- 8 032634 но)пропаноата (8,8 г, 29 ммоль) в метаноле (88 мл) при комнатной температуре. Дегазировали смесь и перемешивали в атмосфере водорода (из баллона) в течение 5 ч. Фильтровали смесь через диатомовую землю, промывали фильтровальную подушку метанолом и концентрировали фильтрат с получением белого твердого вещества. Растирали твердое вещество с дихлорметаном и сушили под вакуумом в течение ночи при комнатной температуре с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (6,11 г, выход 99%). МС (т/ζ): 214,1 (М+Н).

Подготовительный синтез 8. Метил-3-(3,3-диметил-2-тиоксопирролидин-1-ил)пропаноат

Растворяли 3,3-диметилпирролидин-2-тион (15,7 г, 122 ммоль) и метилакрилат (12 мл, 134 ммоль) в тетрагидрофуране (100 мл) и перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота. Добавляли гидроксид натрия (0,8 г, 20 ммоль) и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере азота. Разбавляли насыщенным солевым раствором, экстрагировали этилацетатом, разделяли слои, промывали органический слой насыщенным солевым раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 27,5 г неочищенного твердого вещества. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 20-50% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (25,9 г, 99%). МС (т/ζ): 216,2 (М+Н).

Подготовительный синтез 9. Метил-3-[(22)-2-(2-этокси-2-оксоэтилиден)-3,3-диметилпирролидин-1ил]пропаноат о

% о сн₃

Добавляли тетракис(ацетато)диродий (II) (3,74 г, 8,5 ммоль) к перемешанному раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 8, метил-3-(3,3-диметил-2-тиоксопирролидин-1-ил)пропаноата (41,4 г, 192 ммоль) в толуоле (156 мл) и нагревали до 110°С в атмосфере азота. По каплям добавляли этилдиазоацетат (89 мл, 844 ммоль) в течение примерно 18 ч, затем нагревали в течение ночи при 110°С. Концентрировали и очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя 30% смесью этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого маслянистого вещества (34,5 г, 67%). МС (т/ζ): 270,2 (М+Н).

Подготовительный синтез 10. Этил-(22)-2-(3,3-диметилпирролидин-2-илиден)ацетат

По каплям в течение 45 мин добавляли гексаметилдисилазид калия (301 мл, 0,5 М в толуоле, 151 ммоль) к перемешанному раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 9, метил-3-[(22)-2-(2-этокси-2-оксоэтилиден)-3,3-диметилпирролидин-1-ил]пропаноата (33,8 г, 126 ммоль) в тетрагидрофуране (430 мл) в атмосфере азота, используя баню из смеси воды/льда для поддержания температуры <30°С. После завершения добавления перемешивали в течение 40 мин. Гасили насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (250 мл), затем концентрировали. Разделяли между диэтиловым эфиром и насыщенным солевым раствором, экстрагировали из водного слоя этилацетатом (х4), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 37 г вещества. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя 10%-ной смесью этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения (9,1 г, 40%). МС (т/ζ): 184,2 (М+Н).

Подготовительный синтез 11. Этил-(22)-2-[3,3-диметил-1-(3-метил-2-пиридил)пирролидин-2илиден]ацетат

I* 1-1

С> СН₃

В реакционном сосуде смешивали 2-бром-3-метилпиридин (1,5 г, 8,7 ммоль), промежуточное соединение, полученное подготовительным синтезом 10, этил-(22)-2-(3,3-диметилпирролидин-2илиден)ацетат (1,6 г, 8,7 ммоль) и сим-диметилэтилендиамин (0,77 мл, 8,7 ммоль) в 1,4-диоксане (15 мл). Через раствор пропускали азот при перемешивании в течение 10 мин. Одной порцией добавляли карбонат калия (3,6 г, 26 ммоль) и йодид меди (I) (0,83 г, 4,4 ммоль), закрывали и нагревали перемешанную

- 9 032634 смесь при 120°С в течение 2 дней. Разбавляли дихлорметаном, фильтровали через диатомовую землю и концентрировали фильтрат. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 5-100% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого маслянистого вещества (1,58 г, 66%). МС (т/ζ): 275,0 (М+Н).

Подготовительный синтез 12. 8,8-Диметил-9,10-дигидро-5Н-пиридо[3,2-1]пирроло[1,2-а]азепин6(8Н)-он

В реакционный сосуд шприцом добавляли бис-(триметилсилил)амид натрия (22 мл, 1 М в тетрагидрофуране, 22 ммоль) к перемешанному раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 11, этил-(22)-2-[3,3-диметил-1-(3-метил-2-пиридил)пирролидин-2-илиден]ацетата (2,88 г, 10,5 ммоль) и тетрагидрофурана (60 мл). Закрывали сосуд и нагревали при 70°С при перемешивании в течение 3 дней. Охлаждали до комнатной температуры, гасили насыщенным солевым раствором, экстрагировали этилацетатом, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением коричневого маслянистого вещества. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 50-100% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого твердого вещества (1,70 г, 71%). МС (т/ζ): 229,2 (М+Н).

Подготовительный синтез 13. 6-Азидо-10-аза-3,3-диметил-2,6-дигидро-1Н-пирроло[1,2а][ 1]бензазепин-5-он

В течение 10 мин добавляли диизопропиламид лития (7,0 мл, 10,5 ммоль, 1,5 М в гексанах) к перемешиваемому при -78°С раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 12, 8,8-диметил-9,10-дигидро-5Н-пиридо[3,2-1]пирроло[1,2-а]азепин-6(8Н)-она (1,85 г, 8,1 ммоль) в тетрагидрофуране (50 мл) в атмосфере азота. Через 30 мин через шприц добавляли уксусную кислоту (2,3 мл, 41 ммоль), затем оставляли нагреваться до комнатной температуры в атмосфере азота. Гасили насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Разделяли смесь между насыщенным солевым раствором и этилацетатом, разделяли слои, промывали этилацетатный слой насыщенным солевым раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением коричневого твердого вещества. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 5-60% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения (1,2 г, 55%). МС (т/ζ): 270,2 (М+Н).

Подготовительный синтез 14. 5-Амино-3,3-диметил-9,10-дигидро-5Н-пиридо[3,2-£|пирроло[1,2а]азепин-6(8Н)-он +^СНз

СН₃ о

Добавляли цинковую пыль (1,2 г, 18 ммоль), затем хлорид аммония (5 г, 66 ммоль) к перемешанному раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 13, 6-азидо-10-аза3,3-диметил-2,6-дигидро-1Н-пирроло[1,2-а][1]бензазепин-5-она (1,2 г, 4,5 ммоль) в этаноле (50 мл) и воде (15 мл) при комнатной температуре. Через 1 ч разбавляли этилацетатом, отфильтровывали твердое вещество и концентрировали фильтрат. Суспендировали остаток между этилацетатом и насыщенным солевым раствором, разделяли слои, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 5-40% [10% 2М раствора аммиака в метаноле/дихлорметане] в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого твердого вещества (0,72 г, 67%). МС (т/ζ): 244,2 (М+Н).

Подготовительный синтез 15. трет-бутил-Ы-[(18)-2-[(10-аза-3,3-диметил-5-оксо-2,6-дигидро-1Нпирроло [1,2-а][1]бензазепин-6-ил)амино]-1 -метил-2-оксоэтил]карбамат

Добавляли (28)-2-(трет-бутоксикарбониламино)пропановую кислоту (0,69 г, 3,6 ммоль), гидрат 1гидроксибензотриазола (0,55 г, 3,6 ммоль) и диизопропилэтиламин (0,67 мл, 3,9 ммоль) к перемешиваемому при 0°С раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 14, 5амино-3,3-диметил-9,10-дигидро-5Н-пиридо[3,2-1]пирроло[1,2-а]азепин-6(8Н)-она (0,72 г, 3,0 ммоль) в

- 10 032634 тетрагидрофуране (10 мл) в атмосфере азота. Добавляли 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид (0,68 г, 3,6 ммоль), и оставляли смесь нагреваться до комнатной температуры в атмосфере азота. Через 2 ч разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом. Промывали органическое вещество насыщенным солевым раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 50-100% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого твердого вещества (1,04 г, 84%). МС (т/ζ): 415,0 (М+Н).

Подготовительный синтез 16. (28)-2-Амино-Ы-(10-аза-3,3-диметил-5-оксо-2,6-дигидро-1Нпирроло [1,2-а][ 1]бензазепин-6-ил)пропанамида гидрохлорид

Добавляли хлороводород (12,5 мл, 50 ммоль, 4 М в диоксане) к перемешанному раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 15, трет-бутил-К-[(18)-2-[(10-аза-3,3диметил-5 -оксо-2,6-дигидро-1 Н-пирроло [1,2-а][1] бензазепин-6-ил)амино]- 1-метил-2-оксоэтил] карбамата (1,04 г, 2,5 ммоль) в 1,4-диоксане (40 мл) и нагревали до 45°С при перемешивании. По завершении реакции по данным ЖХ-МС концентрировали смесь с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого желтого вещества (0,93 г, неочищенное). МС (т/ζ): 315,2 (М+1).

Пример 1. 4,4,4-Трифтор-К-((28)-1-((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1Нбензо [Г] пирроло [1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид

Часть 1. Диастереомерный 4,4,4-трифтор-К-((28)-1-((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6тетрагидро-1 Н-бензо Щ пирроло [1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1 -оксопропан-2-ил)бутанамид.

Добавляли 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид (12,4 г, 65 ммоль) к перемешанному раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 5,6-амино9-метокси-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-пирроло[1,2-а][1]бензазепин-5(6Н)-она, и промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 7, (28)-2-(4,4,4-трифторбутаноиламино)пропановой кислоты (10,9 г, 51 ммоль) в дихлорметане (294 мл) при комнатной температуре. Охлаждали смесь до 5°С, добавляли 1-гидроксибензотриазол (8,75 г, 65 ммоль) и продолжали перемешивание при комнатной температуре в течение 10 мин. Промывали смесь водой (3x100 мл), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением темного твердого вещества. Растирали с метил-третбутиловым эфиром с получением указанного в заголовке соединения (смесь диастереомеров) в виде грязновато-белого твердого вещества (22,0 г, 87%). МС (т/ζ): 468,1 (М+Н).

Часть 2. 4,4,4-трифтор-К-((28)-1-((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1Нбензо[Г]пирроло[1,2-а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид изомеры 1 и 2.

Разделяли смесь диастереомеров, полученных в примере 1, части 1, на колонке СЫта1рак ΆΌ, элюируя 10% смесью ацетонитрила/этанола (0,2% диметилэтиламина), с получением соединения изомера 1 0=3,20 мин.) в виде белого твердого вещества (9,8 г, 38%) и соединения изомера 2 0=7,37 мин) в виде белого твердого вещества (9,0 г, 36%). МС (т/ζ): 468,2 (М+Н) для обоих изомеров.

Пример 2. К-((28)-1-((8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-Г]пирроло[1,2а]азепин-5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид

Часть 1. Диастереомерный К-{(18)-2-[(8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2Г] пирроло [1,2-а] азепин-5-ил)амино]-1 -метил-2-оксоэтил}-4,4,4-трифторбутанамид.

Добавляли 4,4,4-трифтормасляную кислоту (0,45 г, 3,2 ммоль), гидрат 1-гидроксибензотриазола (0,49 г, 3,2 ммоль) и диизопропилэтиламин (2,3 мл, 13,2 ммоль) к перемешиваемому при 0°С раствору промежуточного соединения, полученного подготовительным синтезом 16, (28)-2-амино-Ы-(10-аза-3,3диметил-5-оксо-2,6-дигидро-1Н-пирроло[1,2-а][1]бензазепин-6-ил)пропанамида гидрохлорида (0,93 г, 2,6 ммоль) в тетрагидрофуране (50 мл) в атмосфере азота. Добавляли 1-(3-диметиламинопропил)-3этилкарбодиимида гидрохлорид (0,61 г, 3,2 ммоль), и оставляли смесь нагреваться до комнатной температуры в атмосфере азота в течение 16 ч. Разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом. Промывали

- 11 032634 органический слой насыщенным солевым раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Очищали остаток колоночной флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя градиентом 75-100% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения (смесь диастереомеров) в виде грязновато-белого твердого вещества (0,82 г, 71%). МС (т/ζ): 439,2 (М+1).

Часть 2. М-((28)-1-((8,8-диметил-б-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-1]пирроло[1,2-а]азепин5-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид изомеры 1 и 2.

Разделяли смесь диастереомеров, полученных в примере 2, части 1, на колонке СЫта1рак ΑΌ-Η, элюируя 15% МеОН/СО₂(_газ), с получением изомера 1 (К_!=1,60 мин) в виде белого твердого вещества (194 мг, 24%, эпимеризуется до д.и. (диастереомерного избытка) 32%)) и изомера 2 (Ρ,=2.31 мин) в виде белого твердого вещества (469 мг, 57%). МС (т/ζ): 439,0 (М+Н) для обоих изомеров.

Рак все чаще рассматривают как гетерогенную совокупность заболеваний, возникновение и развитие которых вызвано аберрантной функцией одного или более генов, регулирующих репарацию ДНК, геномную стабильность, клеточную пролиферацию, гибель клеток, адгезию, ангиогенез, инвазию и метастаз в клеточном и тканевом микроокружении. Вариантная или аберрантная функция раковых генов может возникать в результате природного полиморфизма ДНК, изменений количестве геномных копий (посредством амплификации, делеции, утраты хромосом или дупликации), изменений в структуре генов и хромосом (посредством хромосомной транслокации, инверсии или другой перегруппировки, которая приводит к разрегулированной генной экспрессии) и точечных мутаций. Раковые неоплазмы могут быть вызваны одной аберрантной функцией гена, и они поддерживаются той же аберрантной функцией гена, или их сохранение и прогрессирование усилены дополнительными аберрантными функциями генов.

Помимо генетических хромосомных отклонений, упомянутых выше, каждый вид рака также может включать эпигенетические модификации генома, включая метилирование ДНК, геномный импринтинг и модификацию гистона ацетилированием, метилированием или фосфорилированием. Эпигенетическая модификация может играть роль в инициации и/или сохранении злокачественного заболевания.

Составлены обширные каталоги цитогенетических отклонений при раковых заболеваниях человека, и они поддерживаются и регулярно обновляются в режиме онлайн (см. базу данных хромосомных аберраций злокачественных новообразований, составленную Мительманом (Т1зе Мйе1тап Эа1аЬаке о£ Сйтотокоте АЬеггайопк ίη Сапсег), на странице проекта по анатомии ракового генома (Сапсег Оепоте Апа!оту Рго_)ес! (СОАР)) Национального онкологического института США (ЫС1). Указанная база данных включает хромосомные отклонения, характерные, по меньшей мере, для некоторых злокачественных заболеваний согласно настоящему изобретению. Проект Раковый геном (Сапсег Оепоте) института Сенгера научного фонда Хе11соте Тгик! (Хе11соте Тгик! 8апдет 1пкй!и!е) поддерживает подробный онлайн Реестр раковых генов (Сапсег Оепе Сепкик) всех человеческих генов, которые каузально связаны с опухолеобразованием, а также базу данных СО8М1С (каталог соматических мутаций при раке) соматических мутаций при раке человека. Дополнительный источник, содержащий богатую информацию о цитогенетических изменениях, каузально связанных с различными раковыми заболеваниями, представляет собой Атлас генетики и цитогенетики в онкологии и гематологии (А!1ак о£ Оепейск апй Су!одепейск ш Опсо1оду апй Наета!о1оду).

Для диагностики раковых злокачественных заболеваний известны и широко используются методы биопсии, иммунофенотипирования и другие тесты. Помимо дифференциального окрашивания хромосом с высоким разрешением и технологии усовершенствованной хромосомной визуализации, хромосомные аберрации при подозрении на рак можно определить с помощью цитогенетического анализа, такого как флуоресцентная гибридизация ш кйи (М8Н), кариотипирование, спектральное кариотипирование (8ΚΥ), мультиплексная Н8Н (М-Н8Н), сравнительная геномная гибридизация (ССН), наборы для анализа однонуклеотидного полиморфизма (чипы 8ΝΡ) и другие диагностические и аналитические тесты, известные и используемые специалистами в данной области техники.

Онкогенная роль №1с11 впервые описана при Т-клеточном лейкозе человека, затрагивающем транслокацию внутриклеточного домена №1с111 в область промотора Т-клеточного рецептора β, что приводит к сверхэкспрессии внутриклеточного домена №1с111 (ОтаЬЬет е! а1. №!ите Ксу1С\\· Сапсег, 2006(6): 347359; Хепд е! а1. 8с1епсе, 2004(306):269-271). Сверхэкспрессия внутриклеточного домена №1с111 в гематопоэтических клетках-предшественниках мышей приводит к проявлению у мышей Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, как у человека. Помимо Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, появляется все больше данных о том, что сигналы №1с11 являются онкогенными при других раковых заболеваниях, действуя через многие механизмы, включая рецепторную амплификацию и сверхэкспрессию лигандов и/или рецепторов, включая острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфобластный лейкоз (Кокай е! а1., В1оой, 2009(113): 856-865), острый миелогенный лейкоз (81|\та е! а1. 1п! 1 Сйп Ехр Ра1йо1. 2014(7(3)): 882-889), хронический миелогеный лейкоз Щакайата е! а1., В1оой, 2010(115(14)): 2872-2881) и эритролейкоз (КоЬей-Мотепо е! а1., Ьеикетза. 2007(21): 1496-1503). Аберрантная конститутивная передача сигналов №1с11 вследствие мутации или сверхэкспрессии лигандов и/или рецепторов также участвует в ряде солидных опухолевых злокачественных заболеваний, включая трижды негативный рак молочной железы (8!оеск е! а1., Сапсег ПЕсоуету, 2014(4): 1154-1167), рак молочной железы, рак яичников (Рагк е! а1. Сапсег Кекеатсй, 2006(66):6312-6318), меланому (Сак! е! а1. Сепек, Сйтотокотек & Сапсег,

- 12 032634

2010(49):733-745), рак легких, немелкоклеточный рак легких (АеЮюГГ е! а1. Р№А8, 2009(106):2229322298), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак толстой и прямой кишок, рак головы и шеи, рак шейки матки, рак предстательной железы, рак печени, плоскоклеточную карциному (полости рта), рак кожи и медуллобластому (КапдаШап е! а1., №а!иге Ре\зе\\· Сапсег, 2011(11):338-351 и дополнительная информация 81 (таблица)). Аберрантная конститутивная передача сигналов №о!сй вследствие мутации или сверхэкспрессии лигандов и/или рецепторов также участвует в ангиосаркоме (Ρηνί е! а1., 1 С1т Опсо1. 2007, (25(188, 20 июня, Дополнение)): реферат 10030), рабдомиосаркоме (Ве1уеа е! а1., Сйп Сапсег Ке5, 2011(17(23)): 7324-7336; Рота е! а1, СПп Сапсег Ве5. 2011(17(3)): 505-513), липосаркоме (1 С1ш Опсо1. 2009, (27(158, Дополнение)): реферат 10526), злокачественной фиброзной гистиоцитоме (Аапд е! а1., Сапсег Ке5. 2012, (72): 1013-1022), гепатоцеллюлярной карциноме (УШапиеуа е! а1., Оа5!тоеп!ето1оду. 2012, (143): 1660-1669), внутрипеченочной и внепеченочной холангиокарциноме (Аи е! а1., 1п! 1 Ехр Ра!1о1. 2014, (7(6)): 3272-3279; 8ек1уа е! а1., 1 С1ш 1п\еЧ. 2012, (122(11)): 3914-3918; Уооп е! а1., Аог1б 1 Са5!тоеп!ето1. 2011, (17(35)): 4023-4030) и аденокистозной карциноме (Ве11 е! а1., Аппак оГ Э1адпо511с Ра!1о1оду, 2014, (18): 10-13; 8!оеск е! а1, Сапсег Эксоу. 2014, (4): 1154-1167). Ингибирование передачи сигналов №о(с11 представляет собой привлекательную мишень для обеспечения терапевтической пользы для онкологических пациентов, заболевание которых вызвано аберрантной активацией конститутивного пути передачи сигналов №о!с11. 8Ый е! а1. Сапсег Векеатсй. 2007(67)1879-1882.

Одним из определяющих генов для развития волосковых клеток внутреннего уха является гомолог гена млекопитающих основного фактора транскрипции типа спираль-петля-спираль А!опа1-1 (А!о11). Экспрессия А(о111 в кохлеарных клетках необходима для генеза слуховых волосковых клеток. Просенсорные эпителиальные клетки в развивающемся кортиевом органе, экспрессирующие А!о11, в дальнейшем подвергаются дифференцировке в слуховые волосковые клетки (Не1т₈ е! а1., Эеуе1ортеп1 2000, (127(6)): 1185-1196), и А(о111 является одним из наиболее ранних маркеров дифференцировки слуховых волосковых клеток. Поддерживающие клетки кортиева органа поддерживают способность развития характеристик волосковых клеток, включая формирование ресничек (УНепд е! а1., №а!иге №еиго5с1епсе, 2000,(3(6)): 580-586; Ка^ато!о е! а1., 1 №еиго5с1. 2003, (23(11)): 4395-4400; 1/ит1ка\уа е! а1., №11 Меб, 2005, (11(3)):271-276; и надлежащую функцию волосковых клеток (Ка^ато!о е! а1., 2003).

Каждая волосковая клетка в улитке окружена нечувствительными поддерживающими клетками, которые обеспечивают трофическую и структурную поддержку волосковых клеток и ганглий и являются необходимыми для сохранения надлежащей ионной концентрации в кортиевом органе посредством межклеточной коммуникации через щелевой контакт. Существует два типа волосковых клеток: внутренние и внешние волосковые клетки. Кохлеарные волосковые клетки у млекопитающих, включая людей, состоят из одного ряда внутренних волосковых клеток и трех рядов внешних волосковых клеток. Внутренние волосковые клетки являются фактическими сенсорными рецепторами, и 95% волокон слухового нерва, направленного в головной мозг, происходят из этой субпопуляции. Почти все окончания на внешних волосковых клетках находятся на эфферентных аксонах, которые образуются из клеток головного мозга, и эти клетки действуют как предварительные усилители звука. Поддерживающие клетки играют ключевую роль в образовании слуховых волосковых клеток после утраты или повреждения слуховых волосковых клеток. Во время развития волосковые и поддерживающие клетки развиваются из общего предшественника, и при появлении волосковой клетки в окружающие клетки поступает сигнал, приводящий к их развитию, в поддерживающие клетки посредством контактного ингибирования, опосредованного сигнальным каскадом №о!с1 (Ке11еу, №11 Кеу №еиго5с1. 2006, (11): 837-849).

На основании способности поддерживающих клеток к трансдифференцировке в слуховые волосковые клетки, а также на основании их общего пути развития постулировано, что поддерживающие клетки могут выполнять функцию предшественников волосковых клеток (Рагкег е! а1., Аибю1оду апб №еигоо!о1оду. 2004, (9(2)): 72-80). В нескольких исследованиях показано, что параллельное подавление клеточного цикла поддерживающих клеток может приводить к образованию слуховых волосковых клеток у млекопитающих (Ьотепйет е! а1., Ргос №а!1 Асаб 8с1 И8А. 1999, (96): 4084-4088; ТотсЫпкку е! а1., 1 №еигосу!о1, 1999, (28(10-11)): 913-924; Мшоба е! а1., Неаг Ке5. 2007, (232): 44-51). Таким образом, поддерживающие клетки взрослого млекопитающего сохраняют способность к трансдифференцировке в слуховые волосковые клетки, если они могут свободно вступить в клеточный цикл.

Медикаментозная терапия для восстановления слуховых волосковых клеток является новым подходом, и интратимпаническое введение жидкости в среднее ухо, предпочтительно в нишу круглого окна, без фактической инъекции в улитку в терапевтической дозе и в течение подходящего времени может эффективно активировать экспрессию А!о11 для трансдифференцировки поддерживающих клеток улитки в слуховые волосковые клетки. В публикации М12и!ап е! а1., №еигоп. 2013, (77(1)): 58-69 показано, что доставка в среднее ухо ингибитора гамма-секретазы (ΕΥ411575) может быть использована для регенерации слуховых волосковых клеток, утраченных вследствие акустической травмы, у мышей, и что новое поколение волосковых клеток, образованных из поддерживающих клеток, приводит к значительному поддающемуся измерению восстановлению слуха. В указанной работе представлены концептуальные данные о терапевтическом эффекте ингибирования сигнального пути №о!сй на образование слуховых волосковых клеток и восстановление слуха в модели на мышах, а также представлено механистическое

- 13 032634 объяснение данного физиологического эффекта (дифференцировка поддерживающих клеток в слуховые волосковые клетки). Показана дозолимитирующая токсичность при системном введении ЬУ411575.

Следующие ίη νίΐτο и ίη νίνο исследования демонстрируют ингибирующее действие на сигнальный путь Νοίοΐι и эффективность соединений 1 и 2 или их, по существу, чистых диастереомеров в отношении конкретной линии раковых клеток. Представленные анализы общепризнаны специалистами в данной области техники как свидетельствующие о клинической химиотерапевтической активности при применении у людей. Ингибирование расщепления внутриклеточного домена Νοίοΐι под действием γ-секретазы предположительно является эффективным в отношении каждого из рецепторов Νοίοΐι 1, Νοίοΐι 2, Νοίοΐι 3 и Νοίοΐι 4. Анализы, свидетельствующие об ингибирующей активности в отношении сигнального пути Νοίοΐι. могут быть проведены, по существу, так, как описано ниже, или подобными способами, приводящими к получению аналогичных данных.

Анализ клеточной визуализации накопления Ν1ΙΟΟ Νοίοΐι 1 в ядре.

Клетки НЕК293АЕ12 (клетки НЕК293 конструировали для устойчивой экспрессии мышиной кДНК ΝοΐεΗ1, кодирующей аминокислоты 1703-2183, ΝΡ_032740.3 (полноразмерный мышиный белокпредшественник Νοίοΐι 1: 8ЕС ΙΌ ΝΟ:1), с сигнальной пептидной последовательностью из 23 аминокислот, МРКЕЕТРЕЕСЕТЕЕРАЕААКСЬК (8ЕС ΙΌ ΝΟ:2) на Ν-конце) помещали на 96-луночные планшеты в концентрации 5000 клеток на лунку, инкубировали в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (И МЕМ), с высоким содержанием глюкозы и 5% эмбриональной бычьей сыворотки (ЕВ8) при 37°С, 5% СО₂ в течение 24 ч. Клетки обрабатывали исследуемым соединением, вводя дозы в 10 точках с разбавлениями 1:3 в диапазоне от 1000 до 0,05 нМ, и с конечной концентрацией диметилсульфоксида (ДМСО) 0,2%. Через 24 ч обработки клеточные планшеты процессировали, применяя последовательно следующие стадии: фиксировали клетки с помощью 100 мкл на лунку фиксатора РКЕЕЕК™ в течение 30 мин при комнатной температуре (ВТ); пермеабилизировали клетки с помощью 100 мкл на лунку 0,1% ΤΡΙΤΟΝ® Х100 в фосфатно-солевом буферном растворе (РВ8) в течение 20 мин при комнатной температуре; промывали 3 раза, каждый раз используя 100 мкл на лунку РВ8; добавляли 50 мкл на лунку кроличьего анти-ЫНСИ (внутриклеточный домен ΝοΙο1ι1) антитела в разбавлении 1:2000 в РВ8 с 1% альбумина бычьей сыворотки и инкубировали в течение 1,5 ч при 37°С; промывали 3 раза, каждый раз используя 100 мкл на лунку РВ8; инкубировали с 50 мкл на лунку козьего антикроличьего 1дС (иммуноглобулин С) А1еха 488 в разбавлении 1:1000 в РВ8 с 1% альбумина бычьей сыворотки, и инкубировали в течение 1 ч при 37°С; промывали 3 раза, каждый раз используя 100 мкл на лунку РВ8, и добавляли 100 мкл на лунку 15 мкМ раствора йодида пропидия с 50 мкг/мл РНКазы в течение 30 мин для окрашивания ядер. Планшеты сканировали с помощью флуоресцентного цитометра с лазерным сканированием для микропланшетов АСИМЕМ ЕХРЬОКЕК™ (ТТР ЬАВТЕСН ЬТИ) для измерения общего количества клеточных ядер на лунку и общей площади ядер на лунку при флуоресценции при 655-705 нм (эмиссия ДНК, связанной с йодидом пропидия) и при флуоресценции антитела, связанного с Ν1ΙΟΟ в области ядра, при 505-530 нм. Главным результатом анализа является отношение общей флуоресценции ядерного Ν1ΙΟΟ к общей площади ядра, нормализованный сигнал ядерного Ν1ΙΟΟ. Относительный профиль цитотоксичности определяли как % количества клеток к количеству контрольных клеток с 0,2% ДМСО. Образуется антитело, которое распознает расщепленный ΝοΙο1ι1 или Ν1ΙΟΟ, к человеческому пептиду, соответствующему аминоконцевому сайту расщепления человеческого ΝοΙο1ι1 в положении Уа11744. В необработанных контрольных клетках Ν1ΙΟΟ, образованный из ΝοΙοΙιΕ транслоцируется и накапливается в ядре. При обработке клеток соединением-ингибитором расщепления Νοίοΐι 1 сигнал ядерного Ν1ΙΟΟ снижается. Зависимость от концентрации и Ιί.'₅₀ определяли аппроксимацией кривой к четырехпараметрической логистической функции для сигнала ядерного Ν1ΙΟΟ, а % количества клеток наносили на тот же график для определения профиля цитотоксичности. Выполняя анализ, по существу, так, как описано выше, определяли среднюю Ιί.’₅₀ для соединения 1, изомера 2, которая составила 0,37 нМ (+/-0,16; η=2), и для соединения 2, изомера 2, которая составила 1,55 нМ (+/-1,12; η=2). Ни одно из соединений не влияло на количество клеток при их использовании в концентрации до 1000 нМ. Полученные данные свидетельствуют о том, что соединение 1, изомер 2, и соединение 2, изомер 2, обладают аффинностью к Νοίοΐι 1 и ингибируют внутриклеточное накопление внутриклеточного домена Νοίοΐι 1 клеточного сигнального пептида.

Ιη νίνο испытания ингибирования мишени исследования на животных.

Для оценки ίη νίνο влияния соединения 1, изомера 2, и соединения 2, изомера 2, на подавления фармакодинамики (ФД) процессинга Νοίοΐι проводили исследования на животных, используя мышей Ва1Ь/С, не являющихся опухоленосителем (Сйат1е8 Р|уег). Для каждой группы использовали по 5 мышей. Мышам обеспечивали доступ к нормальному корму аб 11Ьйиш. Лечение начинали с перорального введения (через зонд) соединения или носителя (1% №1-КМЦ в 0,25% Т\уеео-80) в объеме 0,2 мл. В заданные моменты времени (через 4 или 8 ч после введения доз) после лечения животных усыпляли посредством асфиксии с СО₂ и цервикальной дислокации. Извлекали ткани (легкие) и использовали для анализа ФД ответа, измеряемого по расщепленному Ν1ΙΟΟ.

Анализ Ν1ΙΟΟ.

- 14 032634

Для оценки уровня Ν1Ιί'.Ό в легких из замороженной ткани вырезали примерно 75 мг и мелко нарезали перед гомогенизацией (записывали фактическую массу). Замороженные образцы опухоли переносили в пробирки для лизиса Ма1пх-Э™ и ресуспендировали в ледяном лизисном буфере ΧΥ (25 мМ Тпз, рН 7,5, 10 мкг/мл ингибитора трипсина/химотрипсина, 10 мкг/мл апротинина, 60 мМ бетаглицерофосфата , 1% Ттйоп® Х-100, 10 мМ ΝαΕ. 2,5 мМ пирофосфата, 150 мМ Ν;·ιί.Ί. 15 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), рН 8,0, 5 мМ этиленгликоль-бис (2-аминоэтиловый эфир)-ННИИтетрауксусной кислоты (ЭГТК), рН 8,0, 1 мМ ванадата Ыа, 10 мкг/мл лейпептина, 1 мМ дитиотреитола, 1 мкМ микроцистина ЬВ, 10 мкг/мл Ν-п-тозил-Ь-фенилаланин-хлорметил-кетона (ТРСК), 2 мМ гидрохлорида метилового эфира Να-п-тозил-Ь-аргинина (ТАМЕ), 15 мМ ди(трис) соли 4-нитрофенилфосфата (ΡΝΡΡ), 0,1 мМ гидрохлорида 4-(2-аминоэтил)бензлсульфонилфторида (АЕВ8Р), 5 мМ бензамидина, 1 мкМ окадаиковой кислоты, содержащем 1Χ таблетку Сотр1е1е (Восйе Сотр1е1е™ № 11697498001) и 1Χ коктейль ингибиторов протеазы (8фта-А1бпсй Р8340) в соотношении массы:объема 75 мг/мл буфера. Ткани гомогенизировали в гомогенизаторе Раз! Ргер ΕΡ120 (Тйегто 8с1епййс, Рокфорд, штат Иллинойс) при скорости 6,0 в течение 30 с при 4°С, затем инкубировали на льду в течение 15 мин. Процедуру повторяли, в целом, 2-3 цикла до полной гомогенизации. Лизаты вращали в центрифуге ЕррепбогГ при 4°С при 30000 об/мин в течение 15 мин для удаления дебриса. Извлекали 400 мкл надосадочной жидкости, переносили в новую пробирку ЕррепбогГ и подвергали циклу замораживания/оттаивания. Образцы снова вращали в центрифуге ЕррепбогГ при 4°С при 30000 об/мин в течение 30 мин и собирали для анализа 120 мкл надосадочной жидкости. Общую концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа белка Р1егсе ВСА™ (Тйегто 8с1епбйс, Рокфорд, штат Иллинойс), используя планшет-ридер Тйегтотах™ (Мо1еси1аг Оеуюез, Саннивейл, штат Калифорния). Концентрацию Ν1Ιί.Ό определяли с помощью стандартного твердофазного иммуноферментного анализа ΝΊΙΟΟ. Аналит фиксировали расщепленным Хо1сй1(Уа11744)-специфическим обычным кроличьим моноклональным антителом и обнаруживали с помощью С-концевого №1сй1 ЗиЬЕО-ТАО™ (Мезо 8са1е П1зсоуегу, Гейтерсберг, штат Мэриленд) поликлонального козьего антитела (Β&Ό 8уз1етз, Миннеаполис, штат Миннесота). Лизаты разбавляли до 2 мкг/мкл в ледяном лизисном буфере Тпз для иммуноферментного твердофазного анализа (В6ОТХ) (Мезо 8са1е О1зсоуегу, Гейтерсберг, штат Мэриленд), содержащем 1Х таблетку Сотр1е!е (Восйе Сотр1е!е™ мини, № 11836153001) и 1Х коктейль ингибиторов протеазы (8щта-А1бпсй Р8340), и помещали 25 мкл на планшет для иммуноферментного твердофазного анализа. Инкубацию 50 мкг лизата белка проводили при комнатной температуре в течение одного часа для фиксации аналита и с детекторным антителом. Планшеты считывали на приборе 8ес1ог 1тадег 6000™ (Мезо 8са1е П1зсоуегу, Гейтерсберг, штат Мэриленд). Фоновый вычитаемый ΝΊΙΟΟ нормировали к общему содержанию белка и выражали как % ингибирования относительно группы, обработанной носителем. % Ингибирования ИПСО и статистическую значимость (значение р), измеренную методом Дуннета на опухолях, собранных через 4 ч после введения последней дозы соединения 1, изомера 2, или соединения 2, изомера 2, анализировали, по существу, так, как описано выше, и обобщали данные в табл. 1.

Таблица 1

Соединение	Доза (мг/кг)	Время (ч.) после лечения	% Ингибирования ΝΙΚΏ (Ср ±СОС; η—1)	Значение р
1, Изомер 2	10	4	70±12	<0,0001
1, Изомер 2	10	8	65=1=11	<0,0001
1, Изомер 2	100	8	92±3	<0,0001
1, Изомер 2	30	8	87±3	<0,0001
1, Изомер 2	10	8	52±31	0.0054
1, Изомер 2	3	8	11±13	Незначимое
1, Изомер 2	1	8	6±15	Незначимое
1, Изомер 2	0,3	8	-7±26	Незначимое
2, Изомер 2	10	4	65±11	<0.0001
2, Изомер 2	10	8	15±14	Незначимое

Данные в табл. 1 свидетельствуют об ингибировании расщепления ЙЕПСО соединением 1, изомером 2, и соединением 2, изомером 2, в легочной ткани мышей. Данные в табл. 1 дополнительно демонстрируют 1п у|уо корреляцию с данными функциональной активности, описанными выше.

- 15 032634

Инициация экспрессии шЛйЫ в слуховых сферах.

В общем, выделение клеток Корти осуществляли на 0 день в основном способом, описанным в публикации ОкЫта с1 а1., Мейобк Μοί ΒίοΙ., 2009; 493: 141-162. Выращивание и размножение клеток проводили в течение 3-4 дней. На 3 или 4 день клетки помещали на планшет и обрабатывали исследуемым соединением. В течение следующих 7 дней клетки оставляли для прикрепления и дифференцировки. На 10 или 11 день проводили лизис клеток и выделение РНК. кОТ-ПЦР ТацМап проводили на 12 день, а результаты экспрессии А1о111 и ТЬр1 анализировали на 13-15 день.

Выделение клеток.

Окружающую ткань из каменистой части височной кости извлекали из постнатальных мышей в возрасте от 1 до 4 дней (трансгенная линия: тА1о111-управляемый пСЕР; Ьцтркш ЕА, с1 а1., Сепе Ехрг РаИспъ. 2003; (36): 389-95 обоих полов). Полукруглые улитки уха отделяли от вестибулярной системы с помощью кусачек. На этой стадии развития костный лабиринт не полностью кальцифицирован и легко разрезается кусачками. Осторожно открывали костный лабиринт улитки уха и извлекали спиральную связку и прикрепленный кортиев орган, свернутые вместе по спирали стержня улитки, апикально раскручивая со стержня улитки. Начиная с основания отделяли спиральную связку от кортиева органа с помощью тонких кусачек.

Переносили иссеченный кортиев орган (ОС) в отдельные пробирки объемом 1,5 мл, наполненные 850 мкл ледяного ΗΒ88. В одну пробирку помещали до 12 тканей ОС. Быстро осаждали ткани ОС центрифугированием и удаляли ΗΒ88. Разделяли клетки, добавляя 100 мкл предварительно нагретого раствора ТтурЬЕ™ 8с1сс1 (ЫГс Тесйпо1од1е8), и инкубировали при 37°С в течение 13 мин. Быстро осаждали разделенные ткани ОС центрифугированием. Удаляли раствор ТтурЬЕ™ 8е1ес1. Добавляли 100 мкл среды А (ЬМЕМ/Е12 с добавлением N2 (Ь1ГеТесйпо1од1е8) с добавлением В27 (ЬИеТесйпо1од1е8), ампициллина (50 мкг/мл) и фунгизона (Ь1ГеТесйпо1од1е8), ЕСЕ (20 нг/мл), ЬЕСЕ (10 нг/мл), 1СЕ-1 (50 нг/мл) и гепарансульфата (50 нг/мл)). Затем иссеченную и переработанную ткань измельчали с помощью кончика пипетки Р200. Удаляли клеточные агрегаты и дебрис; переносили клеточную суспензию и промывали через предварительно смоченный сетчатый фильтр для клеток с размером отверстий 70 мкм, сливая суспензию в одну чистую культуральную пробирку. Промывали пробирки, использованные для разделения, и сетчатый фильтр для клеток достаточным количеством среды А и объединяли с клеточной суспензией. Подсчитывали плотность клеток с помощью гемоцитометра или Соип1е55® (ЫГе Тес1шо1още5). В клеточную суспензию добавляли свежую среду А до достижения конечной плотности до нанесения на планшет 1,0Е5 клеток на мл и наносили на культуральный планшет с ультранизким связыванием, Т-75 (Стешет).

Выращивание в суспензии для размножения ОС сфер.

Диссоциированные одиночные клетки выращивали на культуральном планшете с ультранизким связыванием (Стешет) в среде А в течение 3-4 дней в увлажненном инкубаторе с 5% СО₂ при 37°С с получением клонально выращенных сфер, называемых сферами первого поколения, из плавающих клеток. В случае налипания клеток на чашки с низким связыванием в процессе их выращивания их можно отделить посредством осторожного перемешивания.

Связывание и обработка культуры.

После выращивания сфер в течение 3-4 дней визуально подсчитывали количество сфер с помощью микроскопа для стандартизации плотности посева слуховых сфер на один мл для данной стадии. Собирали клетки центрифугированием и ресуспендировали сферы в минимальной среде в концентрации примерно 2000 сфер на мл. Высевали сферы в объеме 150 мкл на лунку 96-луночного обработанного планшета для клеточных культур с получением примерно 300 сфер на лунку. Обрабатывали сферы экспериментальными агентами в четырех экземплярах в конечном объеме 200 мкл в минимальной среде (ПМЕМ/Е12, с добавлением N2 (Ь1ГеТесйпо1од1е8), с добавлением В27 (ЬИеТесйпо1од1е8), ампициллина (50 мкг/мл) и фунгизона (Ь|ГеТес1шо1още5)). Выращивали обработанные сферы в течение 7 дней в увлажненном инкубаторе с регулируемой температурой при 5% СО2, 37°С. Удаляли среду и проводили экстракцию РНК.

Экстракция РНК.

Добавляли буфер РЬТ Р1ц§ (С1адеп) с добавлением 1% бета-меркаптоэтанола, 175 мкл на лунку. В каждую лунку добавляли 2,5 мкл 4 нг/мкл раствора носителя РНК (микро-набор К.№а§у® Р1ц§; р1адеп), разбавленного в буфере РЬТ Р1ц§, затем проводили экстракцию РНК. Общую РНК экстрагировали с помощью микро-набора Р№а§у® Р1п5 (С1а§еп) по инструкциям производителя.

Синтез кДНК.

Синтез кДНК проводили с помощью системы синтеза первой цепи Бцрегаспр!® III (ЫГеТес1шо1ощех, № по каталогу 18080-051) по протоколу производителя, используя случайные гексамеры для синтеза кДНК. Разбавляли кДНК до 50%, добавляя 21 мкл ультрачистой воды, не содержащей нуклеазы. 5 мкл разбавленной кДНК использовали для кПЦР.

кПЦР.

Для количественного измерения экспрессии маркеров волосковых клеток из культур обработанных сфер проводили кПЦР с зондами для обнаружения рассматриваемого гена тА1ой1 и эндогенного кон

- 16 032634 трольного гена в одной, двухцветной мультиплексной реакции. Использовали мастер-микс экспрессии гена ТацМап (ЫГеТсс11по1од1С5. 4369016) и рассматриваемый зонд (ΆΐοΜ; Мт00476035_к1 и эндогенный контрольный зонд (ТЬр1; Мт00446971_т1, Ь1ГсТссЬпо1од1С8) по инструкциям производителя. Для каждого зонда поддерживали постоянные условия. Относительную генную экспрессию между экспериментальными группами анализировали методом ААС_Т и усредняли данные повторных измерений. Эксперименты проводили как минимум в трех экземплярах и записывали как истинное среднее значение.

Таблица 2

Соединение	КО при 10 нМ	КО при 100 нМ	КО при 1 мкМ
1« Изомер 2	1,43±0Д7*	1,76±0Д7*	1,64±0ДЗ‘
2, Изомер 2	1Д4±0,07	1,21±0ДЗ	1,57±0Д1’

Данные в табл. 2 демонстрируют относительные количественные значения (КЦ) экспрессии ΆΐοΜ, маркера образования волосковых клеток, в слуховых сферах, обработанных каждым из соединения 1, изомера 2, и соединения 2, изомера 2, в трех концентрациях (10, 100 нМ и 1 мкМ). Данные (± стандартная ошибка среднего, СОС) представляют кратность инициации генной экспрессии относительно отрицательных контрольных образцов, обработанных носителем (ДМСО). (* - значимая разность относительно отрицательного контроля, р<0,05).

Инициация экспрессии 1ιΛΐο1ι1 в клеточных линиях опухолей человека.

Для оценки эффективности соединения 1, изомера 2, и соединения 2, изомера 2, в отношении их способности инициировать экспрессию 11ЛЮ111 использовали клеточную линию опухоли человека. Эндогенная регуляция передачи сигналов ΝοίΟι для данной клеточной линии аналогична регуляции во внутреннем ухе. В общем, представленный анализ проводили в соответствии с принципами, описанными в публикации Кахапрап с1 а1., Оа81госп1сго1о§у, 2010, 139(3): 918-928 апб §црр1стсп1агу Ма1спа1к апб Мс111обк.

В общем, использовали стандартные технологии выращивания клеток. Клеточную линию аденокарциномы толстой и прямой кишок человека с низким числом пересевов Ь8174Т (АТСС СЬ-188), поддерживаемую в питательной среде (МЕМ с 10% ЕВ8), помещали в 96-луночные обработанные планшеты для тканевых культур в концентрации 10000 клеток на лунку в 100 мкл аналитической среды (МЕМ с 1% ЕВ8).

На следующий день проводили полулогарифмические серийные разбавления 10 мМ исходных растворов исследуемых соединений (разбавленных в 100% ДМСО) с получением одиннадцати понижающихся доз лекарственного соединения. Конечные концентрации составляли от 10 мкМ до 0,127 нМ. Использовали 3,16-кратное серийное разбавление с концентрациями ДМСО в каждой лунке 100%. Следующее разбавление 1:10 исходного разбавления ДМСО проводили в аналитической среде. Другое разбавление 1:100 также проводили в аналитической среде.

100 мкл растворов исследуемых соединений добавляли в каждую лунку, содержащую клетки и питательную среду, и выращивали в течение 72 ч при 37 °С в 5% СО₂.

Клетки собирали с планшетов на 4 день и экстрагировали и очищали РНК, используя набор для РНК К№аку® Р1ик 96 (01адсп) по протоколу производителя.

Синтез кДНК проводили с помощью системы синтеза первой цепи §ирсг8спр1® III (Ь1ГсТссЬио1ощск, 18080-051) по протоколу производителя, используя случайные гексамеры для синтеза кДНК. кДНК разбавляли до 50%, добавляя 21 мкл ультрачистой воды, не содержащей нуклеазы. 5 мкл разбавленной кДНК использовали для кПЦР.

кПЦР.

Для количественного определения экспрессии маркеров волосковых клеток из культур обработанных сфер проводили кПЦР с зондами для обнаружения экспрессии 11Л1о111 или ТВР в одной двухцветной мультиплексной реакции. Для измерения относительной генной экспрессии для каждого образца использовали мастер-микс экспрессии генов ТацМап (Ь1ГсТссЬпо1од1с8, 4369016) и рассматриваемый зонд (человеческий Л1о111; ^^ГсТссЬиο1οд^С8, Ш для анализа Нк00944192_к1) и эндогенный контроль (человеческий ТВР; ^^ГсТссЬиο1οд^С8, Ш для анализа Нк00427620_т1) по инструкциям производителя. Для каждого зонда поддерживали постоянные условия. Относительную генную экспрессию между экспериментальными группами анализировали методом ААС_Т, и усредняли данные повторных измерений.

Проводили четыре отдельных анализа для получения значений 1С₅₀ для каждого исследуемого соединения. Значение 1С₅₀ определяли аппроксимацией данных, полученных в зависимости от концентрации, к модели зависимости 1од(антагониста) от ответа (три параметра, используя программное обеспечение ОгарЬРаб Рикш®, для 12 доз в диапазоне концентраций от 4,0Е-11 до 1,0Е-6 М, анализируя, в целом, 108 точек для каждого соединения. Значения 1С₅₀ для соединения 1, изомера 2, и для соединения 2, изомера 2, представлены в табл. 3.

- 17 032634

Таблица 3

Соединение	1Сбо, нМ
1, Изомер 2	16,64
2, Изомер 2	54,34

Данные в табл. 3 демонстрируют значения 1С₅₀ для соединения 1, изомера 2, и для соединения 2, изомера 2, рассчитанные в данном анализе по относительной экспрессии ЬЛЮЫ, маркера образования слуховых волосковых клеток.

Реакция на соединения в анализе эксплантата кортиева органа.

В общем, выращивание органотипического эксплантата кортиева органа осуществляли на 0 день в соответствии со способом, описанным в публикации Рагкег с1 а1., 1оигиа1 о£ УЬнаНхсб ЕхрсптсиК 2010, (36), с1685. Выращивание эксплантата проводили в течение 4-7 дней, после чего культуру либо готовили для клеточного лизиса для кОТ-ПЦР, либо для тканевой фиксации для иммуногистохимии.

Выделение и выращивание эксплантатов кортиева органа.

Слуховой пузырь и окружающую ткань из каменистой части височной кости извлекали из постнатальных мышей в возрасте от 1 до 4 дней (трансгенная линия: ΑίοΗΙ - управляемый пСЕР; Ьитркш Е.А. с! а1., Сспс Ехрг РаИсгик, 2003, (36):389-95) обоих полов. Кортиевы органы иссекали в растворе Хэнкса, удаляли спиральную связку и помещали эксплантаты на покровные стекла, покрытые поли-Ь-орнитином (0,01%, 81§та) и ламинином (50 мг/мл, Всс1ои Эккткои) с получением препарата с плоской кохлеарной поверхностью. Затем каждый кохлеарный эксплантат помещали в одну лунку 24-луночного планшета (Еа1сои) и выращивали в среде ЭМЕМ (1иуЦгодси) с 5% эмбриональной бычьей сыворотки, 5% лошадиной сыворотки и пенициллином-стрептомицином (Ы£сТссйио1од1с8). Экспериментальные соединения добавляли вместе со средой на 0 день и заменяли каждые 2-3 дня. Все культуры выдерживали в увлажненном инкубаторе с 5% СО₂ при 37°С.

Анализ генной экспрессии с помощью кОТ-ПЦР.

Экстракцию РНК проводили посредством лизиса ткани эксплантата с применением 35 мкл буфера ВЬТ Р1и8 (0|адсг1) на лунку, и общую РНК очищали с помощью мини-набора В№а8у® Р1и§ Оа^си). Синтез кДНК осуществляли с помощью системы синтеза первой цепи §ирсг8сг1р1® III (Е1£сТссйио1од1с8), используя случайные гексамеры. Для количественного измерения индукции экспрессии маркеров волосковых клеток проводили кПЦР с мастер-миксом экспрессии генов ТацМаи (Е1£сТссйио1од1с8, 4369016) и зондами для обнаружения рассматриваемых генов (например, 11А1о111; ГО для анализа Мт00476035_к1, Рои413; ГО для анализа Мт04213795_к1 и Муо7а; ГО для анализа Мт01274015_т1, Е1£сТссйио1од1с8) и эндогенным контрольным геном, ТЬр (ГО для анализа Мт00446971_т1, Е1£сТссйио1од1с8). Относительную генную экспрессию между экспериментальными группами анализировали методом ААС_Т и усредняли данные повторных измерений. Эксперименты проводили как минимум в трех экземплярах и записывали как истинное среднее значение.

Таблица 4

Соединение	Αΐοΐιΐ	Рои4/3	Муо7а
1, Изомер 2	3,72±0,54	2,04±0,35	1,73±0,33
2, Изомер 2	3,10±0,69	1,65±0,25	1,49±0,22

Данные в табл. 4 демонстрируют относительные количественные значения (ВО) экспрессии маркеров образования волосковых клеток, А1о11Е Рои413 и Муо7а, в эксплантатах кортиева органа, обработанных соединением 1, изомером 2, и соединением 2, изомером 2, в концентрации 1 мкМ. Данные (±СОС) представляют кратность инициации генной экспрессии относительно образцов, обработанных отрицательным контролем.

Иммуноокрашивание новых волосковых клеток, экспрессирующих А1о11Е

После выращивания эксплантата ткани фиксировали в 24-луночном планшете с помощью 200 мкл смеси Су1оПх/Су1орсгт (ΒΌ) в течение 30 мин, промывали РВ8, содержащим ТгкойХ100 (РВ8Т), и окрашивали с помощью 200 мкл раствора первичного антитела, состоящего из 4% нормальной ослиной сыворотки в РВ8Т с козьим анти-СЕР (1:2500; АЬСАМ, аЬ5450) и кроличьим антимиозином У11а (1:1000; Рго1си8 Вшкасисс № 25-6790) в течение 1 ч. Затем ткани тщательно промывали РВ8Т и окрашивали раствором вторичного антитела, состоящим из А1сха Е1иог 488 ослиного антикозьего 1дС (1:1000; 1иу11годси, А-11055) и А1сха Е1иог 568 ослиного антикроличьего 1дС (1:1000; 1иуЦгодси, А10042), в течение 1 ч. Затем их тщательно промывали РВ8Т и устанавливали на предметные стекла для микроскопа. Отдельные волосковые клетки идентифицировали по экспрессии А1ой1-суррогатного маркера СЕР (зеленый) и миозина УНа (красный), визуализировали, а затем считывали в интервале 100 мкМ в среднеапикальной области для изучения образования зарождающихся волосковых клеток в экспериментальных обработанных соединением образцах по сравнению с количеством волосковых клеток в необработанных образцах или в образцах, обработанных отрицательным контролем (биологически неактивным соединением). Количество клеток подсчитывали в слепом режиме в пяти отдельных экспериментах.

- 18 032634

Таблица 5

Соединение	Количество внешних волосковых клеток (на 100 мкМ)	Процентное увеличение
1, Изомер 2	50,4±4,9	14,15±1,9%
2, Изомер 2	55,8±3,1	17,26±1,2%

Данные в табл. 5 демонстрируют количество внешних волосковых клеток в эксплантатах кортиева органа, выращенных в течение четырех дней в присутствии соединения 1, изомера 2 (п=13), или соединения 2, изомера 2 (п=15), при 1 мкМ, и иммунноокрашенных для СЕР (суррогатного маркера А1оЫ) и миозина УПа. Процентное увеличение волосковых клеток выражено относительно образцов, обработан ных отрицательным контролем.

Анализ генной экспрессии после ототоксичного повреждения.

Для моделирования регенерации волосковых клеток в ответ на лечение исследуемым соединением после ототоксичного повреждения использовали вариант культуры органотипического эксплантата кортиева органа. Данную модель повреждения осуществляли в соответствии со способом, описанным в публикации Когтарай е! а1., РЙО8Опе, 2013, 8(8), е73276, в которой описано 95%-ное сокращение среднеапикальных волосковых клеток. На 0 день для повреждения и выборочного уничтожения волосковых клеток в эксплантате кортиевая органа осуществляли обработку аминогликозидом (гентамицин (100 мкМ)) в течение 18-24 ч. На 1 день гентамицин удаляли и начинали обработку соединением 1, изомером 2, и соединением 2, изомером 2 в концентрации 5 мкМ. Выращивание эксплантатов продолжали, в целом, 4 дня, после чего культуру готовили к проведению протокола кОТ-ПЦР, описанного выше. Можно наблюдать очевидное подтверждение вызванного гентамицином повреждения в культурах, обработанных соединениями отрицательного контроля. Однако количественное измерение для определения реакции на обработку соединением 1, изомером 2, и соединением 2, изомером 2, после ототоксичного повреждения, полученное с помощью кОТ-ПЦР, демонстрирует увеличение генной экспрессии для маркеров просенсорных волосковых клеток Л1оЫ и Рои4Г3 и для маркера волосковых клеток Муо7А.

Таблица 6

	% Индукции по сравнению с поврежденным кортиевым органом, обработанным контролем (среднее ± СОС; значение ρ) η = 11
Соединение (5 мкМ)	А1оЬ1	Рои4ЕЗ	Муо7А
1, Изомер 2	242±16; <0,0005*	114±25; <0,05*	102±18; 0,0522
2, Изомер 2	169±24; <0,05*	28±11; 0,0633	52±15; незначимое

Данные в табл. 6 демонстрируют, по данным кОТ-ПЦР, относительное увеличение генной экспрессии маркеров образования волосковых клеток, ΆΐοΗ1, Рои4Г3 и Муо7а, в эксплантатах кортиева органа, обработанных соединением 1, изомером 2, и соединением 2, изомером 2, в концентрации 5 мкМ после повреждения гентамицином (100 мкМ). Данные демонстрируют процентное увеличение генной экспрессии относительно образцов, обработанных отрицательных контролем, с повреждением волосковых клеток, вызванным гентамицином (* - значимая разность относительно отрицательного контроля, р<0,05).

Индукция маркера волосковых клеток в культуре целой слуховой капсулы.

Слуховую капсулу (эксплантат слуховой капсулы), состоящую из кохлеарного костного лабиринта и вестибулярной системы, вырезали из постнатальных мышей в возрасте от 1 до 4 дней (трансгенная линия: Άΐοή 1-управляемый пСРР; Ьитркш Е.А., е! а1., Сепе Ехрг. Райегпз, 2003, 3(4): 389-95) обоих полов, в целом, в соответствии со способом, описанным в публикации Рагкег е! а1., 1оигпа1 оГ У1ша11/.ес1 Ехрепшеп18, 2010, (36), е1685. Целую слуховую капсулу извлекали из теменной кости и выдерживали ех-У1Уо в системе для выращивания культур с вращающимися пробирками в течение до 3 дней, в среде, содержащей 1)МЕМ, высокую концентрацию глюкозы, 5% РВ8, 5% лошадиной сыворотки, 1 мкг/мл ампициллина.

Эксплантат слуховой капсулы использовали для оценки проникновения во внутреннее ухо исследуемого соединения в различных носителях для его доставки. Испытания проводили с композициями соединения 1, изомера 2 (7,2 мМ) в различных носителях для его доставки. Небольшие объемы (100-200 нм) напрямую наносили на нишу круглого окна улитки уха. Улитку иссекали, обрабатывали, инкубировали в течение 1-2 ч, затем вносили в культуру роллерного типа. Через 48 ч эксплантат слуховой капсулы открывали для извлечения кортиева органа из костного лабиринта улитки уха, и проводили анализ ОТПЦР.

Композицию оставляли на 1-2 ч, затем смывали культуральной средой. Затем эксплантат слуховой капсулы выращивали в течение 48 ч в необработанной среде. Улитку разламывали, и затем вырезали це

- 19 032634 лый кортиев орган и готовили для количественной ОТ-ПЦР для измерения уровня экспрессии маркера волосковых клеток Л1о111 (как описано выше в анализе эксплантата кортиева органа). В табл. 7 представлены данные индукции Л1о111 в конкретных носителях для доставки. Повышающую регуляцию Л1о111 под действием соединения 1, изомера 2, во всех исследуемых композициях (кратность 2-3 раза, п от 12 до 17) измеряли в сравнении с эксплантатами слуховой капсулы, обработанными только контрольным носителем, через 48 ч выращивания.

Таблица 7

Экспрессия гена Л1оН1 (ОТ-ПЦР)

45-70% ПЭГ (Полиэтиленгликоль 400)

10% полоксамера (Р1игоп1С^ Г108)

20% полоксамера (ΡΙιίΓοηίς® Г108)

1-2% гиалуроновой кислоты

Состояние жидкости	Вязкая жидкость	Вязкая жидкость	Гель	Гель
Растворимость исследуемого соединения	Прозрачный раствор	Суспензия	Суспензия	Суспензия
Среднекратная индукция	2,933	2,398	2,612	2,459
СОС	0,3193	0,2653	0,4441	0,2567
Значение р	<0,0001	0,0002	0,0019	0,0001

Усвоение исследуемого соединения в перилимфе внутреннего уха ίη у1уо.

Самок альбиносов морских свинок линии Хартли (СНаг1с5 К!уег, Франция) анестезировали смесью кетамина/ксилазина, затем вводили инъекцию 70 мкл соединения 1, изомера 2, в виде композиций, описанных выше для анализа культуры целой слуховой капсулы, транстимпаническим путем для полного заполнения среднего уха. Образцы перилимфы (жидкого содержимого лабиринта внутреннего уха) извлекали через 0,5, 1, 6, 24 и 48 ч после инъекции и проводили анализ ЖХМС (п=5) для определения концентрации исследуемого соединения. В табл. 8 представлены данные об усвоении исследуемого соеди нения во внутреннем ухе после транстимпанического введения в среднее ухо с применением указанных носителей для его доставки.

Таблица 8

Содержание в перилимфе ίη у1уо

	70% ПЭГ (Полиэтилен гликоль 400)	10% полоксаме ра (Р1игопи® Е108)	20% полоксаме ра (Р1игоп1с® ΡΊ08)	1% гиалуроновой кислоты
Стах (мкМ)	327,1	753,0 ±	1926,2 ±	187,3 ±
±сос	±93	306	493	113
Время до Стах	1 час	30 мин.	30 мин.	1 час
% введенного исследуемоге соединения в перилимфе	1,04	2,39	6,11	0,59
В-квадрат	0,5262	0,7640	0,5600	0,4229

лис (МКМ0ЛЬ.Ч.Л’ 2)

1451

7002

8634

2711

- 20 032634

Аминокислотные последовательности §ЕО П) N0:1 (Белок-предшественник Νοίοΐι 1 мышей, полная длина)

МРКЕЕТРЕЕСЕТЕЕРАЕААКСЕКС80Р5СТСЕМСгОКСЕУАМ€гТЕАСУС8ОАГУСг ОЕС0О5МРСЬ81Е(ЖМАетСНУ\ТЭН(ЮТУОУАС8СРЕОР8ОРЕСЬТРЬОМАСЬА №СКМССТСОЬЬТЬТЕ¥КСКСРРО\У8СК5С00АОРСА8№САМ6<ЗрСЕРЕЕ58¥1 СКСРРОГНОРТСкрПУР^С80ЫРОЕСГШ66ТСННЕ1С8УКСАСкАТНТ6РНСЕЬР ¥ХТС8Р8РС0Ж6ТСКРТ6ОТТНЕСАСЕРОГА60ЖЕЕКУЭОСРОЖСКН6ОАС νΏΟνΝΤΥΝΟΚεΡΡΕλνΤΟρΥΕΤΕΟνϋΕεΟΕΜΡΝΑΕΟΝΟΟΤΕΗΝΤΗΟΟΥΝΕνΟν Жт\УТ(тЕОС8ЕЯ10ОСА8ААСЕООАТСНОКУА8Е¥СЕСРНОК.Т6ЕЕСНЕЫ0АС18 ЖСЖСЗЖОТЖХ^ЮКАГСТСРЗСАТОРАСЗООУОЕСАЕСАКРСЕНАОКСЕМТ ЕО8РЕС0СЕ0О¥ТОРКСЕГО\ЖС18ЖС0МОАТСЕО0ЮЕГ0С1СМРС¥ЕСУ¥СЕ ШТОЕСА88РСЕННОНСМОК1ЖРОСОСРКОЕЖНЕСС>¥ПУПЕСА8ТРСКЖАК €ΕΟΟΡΝΤΥΤ€ν€ΤΕΟΥΤΟΤΗΕΕ\Τ)ΙΏΕ0ϋΡϋΡ€ΗΥΟ8€ΚΟθνΑΤΡΤ€Ε€ΟΡΟΥΤ ОННСЕтаП^ЕСНЗЗРСВДООТСООКОЖУЕСЕСЕКОТТОРЖЕПЖОПСА^НРСО ЗОТСЕОКГООУЕСАСЕРОУТСЗМСЖТЧГОЕСАОЗРСННСОТСЕООЕУОГТСЕСРЕ (‘ίΥΗϋΡΊ'('Ρ8Ε\ΕΈ(Ε8ΕΡΕΙΗ6Λ(Ί<υΕΡΝ6ΥΚ('ϋ€ΛΡ(ι\ν86ΤΝΕϋΙΕΕΕΈίΈ8Ν Ρ€νΝΟΟΤ€ΚΟΜΤ8ΟΥνΕΤ€ΒΕΟΡ8ΟΡΝ€0ΤΝΙΝΕΕΑ8ΝΡ€ΕΝ0ΟΤΕΙΌθνΑΘΥΚ СЖРЕР¥ТСАТСЕУ\ЪАРСАТ8РСК№ОУСКЕ8ЕО\Ъ8Р8СУСРТОУ/рО0ТСЕУ Γ)]ΝΕΕ\Κ8ΡΕΕ1Ι€ιΑ8Ε9ΝΤΝΕι8ΥΚΕ1.ΕςΑ€ιΥΤΕιΚΝΕΕ8Οΐηη€ΡΡΝΡΕΗΝΕιΕι8Ε ΤΟΟΙΝΤΑΡ€Ο€ΕΡΟΡ0ΟΑΡ€ΕΕΟΙΝΕ€Α8ΝΡε0ΝΟΑΝ€ΤΟ€νΏ8ΥΤΰΤ€ΡνθΡΝΟ ШСЕЖТРОСТЕ88СЕН66ТС¥061Н8ЕТСЕСРРОЕТО8¥С0¥ОУЖСО8КРСЕН6 6ТС0О8¥6Т¥КСТСР0О¥Т6ЕЖ0ЖУК\УСО8АРСКМ6ОКС\У0ТЫТС)¥НСЕС ЕЗО\УТ6УЖОУЕ8У8СЕУАА0КК61Е>УТЕЕС0Н6СЕСУЕ>ЕСОКН¥СНС0АО¥ ТО8УСЕОЕУПЕС8РМРС0МОАТСТО¥Е6ОЕ8СКСУАОУНО8Ж8ЕЕ1ЖСЕ80РС ΟΝΟΟΤΕΙΟΕΤΝ8ΥΚΕ8€ΡΚΟΤΟθνΉ€ΕΙΝνθΟΕΗΡΡΕΟΡΑ8Κ8ΡΚΕΡΝΝΟΤΕνθΟ УООТТСТСРРСЕУОЕКСЕООУЖСЕЗЧРСОРКОТрЖУрКУЖРНСЕСКАОНТ СККСЕ8У1К6СКСКРСКК<К}УСАУА8МТАКСГ1СКСРА6ГЕОАТСЕ№АКТС68 ЬКСЬМ6<тТС18ОРК8РТСЕСЕО8РТОРЕС0РРА88РСУО81УРС¥Х0ОТСЕРТ8ЕМРР УКСЬСРАКРЯОЕЬСШЕОУЗРТбОАОМЛРРРрЕЕАСЕЬРЕСОУОАОМКУСКЬО €ΝΝΗΑΕσλν0σσ0€8ΕΝΕΝηΡ\νΚΝατρ8ΕρΕ\νΚΥΡ80σΗ€08Ρ€Ν8Ασ€ΕΡ0σ РПСрЕТЕ60СМ>Е¥О0¥СКПНГ8ООНСО0ЖМ8АЕСЕ\УОСЬОСАЕНУРЕКЬАА ΟΤΕνΕννΕΕΡΡϋΟΕΚΝΝ8ΡΗΡΕΚΕΕ8ΗνΕΗΤΝννΕΚΚΏΑΟΟΟΟΜΙΡΡΥΥΟΗΕΕΕ ΕΚΚΗΡΙΚΚ8Τν6λ¥ΑΤ88ΕΕΡ6Τ8ΟΟ^ΚΒΕΕΟΡΜΠΙΚΟ8ΐνΥΕΕΙΠΝΚ<)Ενρ888ρ СВАТОУ ΑΑΓΕ6ΑΕΑ8ΕΟ8ΕΝΙΡΥΚΕΑνΚ8ΕΡνΕΡΡΕΡ89ΕΗΕΜΥνΑΑΑΑΓνΕ ΕΡΡν0ε0νΕΕ8ΚΚΚΚΚρΗ0ρΕ\νΡΡΕ0ΡΚν8ΕΑ8ΚΚΚΚΚΕΡΕ0Ε08ν0ΕΚΡΕΚΝΑ 8θ6ΑΕΜΟΠΝ0ΝΕλναθΕΟΕΕΤΚΚΡΚΡΕΕΡννΕΡΟΕ8ϋ0ΤΠΗΚ0ΑνΤ00ΗΕΟΑΑΠ ЕКМ8АМАРТРР0ОЕУПАОСМЛУНУКОРООРТРЕМ1А8С8ОООЕЕТОН8ЕЕЕЕОА ΡΑνΐ80ΡΙΥΡ0Α8ΕΗΝρΐΌΚΤΘΕΤΑΕΗΕΑΑΚΥ8Κ80ΑΑΚΚΕΕΕΑ8Α0ΑΝΐρϋΝΜ СКТРЕНААУ8АПА0ОУГ01ЬЫШКАТОЕОАКМНПСТТРЫЕААКЕАУЕОМЕЕОЕ ΙΝ8ΗΑηνΝΑνθϋΕΟΚ8ΑΕΗ\νΑΑΑνΝΝνϋΑΑννΕΕΚΝ6ΑΝΚΟΜ0ΝΝΚΕΕΤΡΕΡ ЬААКЕО8УЕТАКУЬЬОНРАНКО1ТОНМОКЬРКО1А0ЕКМННО1УКЬЬОЕ¥ЖУК 8Р0ЕНОТАЕ6СТРТЕ8РТЕС8РНС¥ЬОЖК8АТрОККАЙКР8ТКОЕАСС8КЕАК ОРКАШЖК80ОСКОСЬРО888МЕ8РУП8РЕ8РН6УЬ8ПУА8РРЕЕР8РР008Р8М ΡΕ8ΗΕΡΟΜΡϋΤΗΕΟΙ8ΗΕΝνΑΑΚΡΕΜΑΑΕΑΟΟ8ΚΕΑΕΕΡΡΡΡΚΕ8ΗΕΡνΑ88Α8Τν Ε8ΤΝ6ΤθΑΜΝΡΤνθΑΡΑ8ΕΝΘ0ΕΕννΕΡΚΕ0ΝθΜνΡ80ΥΝΡΕΚΡθνΤΡθΤΕ8Τ0Α

ΑΟΕΡΗ8ΜΜ6ΡΕΗ88Ε8ΤΝΤΕ8ΡΙΙΥ0σΕΡΝΤΚΕΑΤ0ΡΗΕν0Τ(20ν0Ρ0ΝΕ(2Ε0Ρ0 ΝΕ0ΡΡ80ΡΗΕ8ν88ΑΑΝΟΗΕΟΚ8ΡΕ8ΟΕΡ80Αην0ΡΕ6Ρ88ΕΡ\ΉΤΙΕΡ0Ε80ΑΕΡΤ 8ΕΡ88ΜνΡΡΜΤΤΤ9ΡΕΤΡΡ8ρΗ8Υ888ΡνηΝΤΡ8Η0Ε9νΡΕΗΡΓΕΤΡ8ΡΕ8Ρϋ9\ν88 88ΡΗ8ΝΙ8ϋ\ν8ΕΟΙ88ΡΡΤΤΜΡ80ΙΤΗΙΡΕΑΡΚ

8Ε(^ ΙΟ N0:2 (сигнальный пептид)

МРЕЕЕТРЬЕСЬТЕЕРАЕЛАКбЕК

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Эли Лилли энд Компани

Аудион Терапеутикс

СОЕДИНЕНИЯ-ИНГИБИТОРЫ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛОВ ПУТИ ЫОТСН

Х20729

62/189,393 2015-07-07

РаГепЫп версия 3.5

2531

БЕЛОК

Миз тизси1из

- 21 032634 <400> 1

МеГ 1

Рго Агд

Ьеи Ьеи Ткг 5

Рго

Ьеи Ьеи Суз 10

Ьеи

Ткг

Ьеи

Ьеи

Рго 15

А1а

Ьеи

А1а

А1а

Агд

О1у

Ьеи

Агд

Суз

5ег

О1п

Рго

5ег

О1у

Ткг

Суз

Ьеи

20

25

30

Азп

О1у

О1у

Агд

Суз

О1и

Уа1

А1а

Азп

О1у

Ткг

О1и

А1а

Суз

Уа1

Суз

35

40

45

5ег

О1у

А1а

Рке

Уа1

О1у

О1п

Агд

Суз

О1п

Азр

5ег

Азп

Рго

Суз

Ьеи

50

55

60

5ег

Ткг

Рго

Суз

Ьуз

Азп

А1а

О1у

Ткг

Суз

Н1з

Уа1

Уа1

Азр

Н1з

О1у

65

70

75

80

О1у

Ткг

Уа1

Азр

Туг

А1а

Суз

5ег

Суз

Рго

Ьеи

О1у

Рке

5ег

О1у

Рго

85

90

95

Ьеи

Суз

Ьеи

Ткг

Рго

Ьеи

Азр

Азп

А1а

Суз

Ьеи

А1а

Азп

Рго

Суз

Агд

100

105

110

Азп

О1у

О1у

Ткг

Суз

Азр

Ьеи

Ьеи

Ткг

Ьеи

Ткг

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Агд

115

120

125

Суз

Рго

Рго

О1у

Тгр

5ег

О1у

Ьуз

5ег

Суз

О1п

О1п

А1а

Азр

Рго

Суз

130

135

140

А1а

5ег

Азп

Рго

Суз

А1а

Азп

О1у

О1у

О1п

Суз

Ьеи

Рго

Рке

О1и

5ег

145

150

155

160

5ег

Туг

11е

Суз

Агд

Суз

Рго

Рго

О1у

Рке

Н1з

О1у

Рго

Ткг

Суз

Агд

165

170

175

О1п

Азр

Уа1

Азп

О1и

Суз

5ег

О1п

Азп

Рго

О1у

Ьеи

Суз

Агд

Н1з

О1у

180

185

190

О1у

Ткг

Суз

Н1з

Азп

О1и

11е

О1у

5ег

Туг

Агд

Суз

А1а

Суз

Агд

А1а

195

200

205

Ткг

Н1з

Ткг

О1у

Рго

Н1з

Суз

О1и

Ьеи

Рго

Туг

Уа1

Рго

Суз

5ег

Рго

210

215

220

5ег

Рго

Суз

О1п

Азп

О1у

О1у

Ткг

Суз

Агд

Рго

Ткг

О1у

Азр

Ткг

Ткг

225

230

235

240

Н1з

О1и

Суз

А1а

Суз

Ьеи

Рго

О1у

Рке

А1а

О1у

О1п

Азп

Суз

О1и

О1и

- 22 032634

245

250

255

Азп Уа1

Азр Азр 260

Суз

Рго

О1у

Азп Азп Суз 265

Ьуз

Азп О1у

О1у 270

А1а

Суз

Уа1

Азр

О1у

Уа1

Азп

ТЬг

Туг

Азп

Суз

Агд

Суз

Рго

Рго

О1и

Тгр

ТЬг

275

280

285

О1у

О1п

Туг

Суз

ТЬг

О1и

Азр

Уа1

Азр

О1и

Суз

О1п

Ьеи

МеЬ

Рго

Азп

290

295

300

А1а

Суз

О1п

Азп

О1у

О1у

ТЬг

Суз

Н1з

Азп

ТЬг

Н1з

О1у

О1у

Туг

Азп

305

310

315

320

Суз

Уа1

Суз

Уа1

Азп

О1у

Тгр

ТЬг

О1у

О1и

Азр

Суз

5ег

О1и

Азп

11е

325

330

335

Азр

Азр

Суз

А1а

5ег

А1а

А1а

Суз

Рке

О1п

О1у

А1а

ТЬг

Суз

Н1з

Азр

340

345

350

Агд

Уа1

А1а

5ег

Рке

Туг

Суз

О1и

Суз

Рго

Н1з

О1у

Агд

ТЬг

О1у

Ьеи

355

360

365

Ьеи

Суз

Н1з

Ьеи

Азп

Азр

А1а

Суз

11е

5ег

Азп

Рго

Суз

Азп

О1и

О1у

370

375

380

5ег

Азп

Суз

Азр

ТЬг

Азп

Рго

Уа1

Азп

О1у

Ьуз

А1а

11е

Суз

ТЬг

Суз

385

390

395

400

Рго

5ег

О1у

Туг

ТЬг

О1у

Рго

А1а

Суз

5ег

О1п

Азр

Уа1

Азр

О1и

Суз

405

410

415

А1а

Ьеи

О1у

А1а

Азп

Рго

Суз

О1и

Н1з

А1а

О1у

Ьуз

Суз

Ьеи

Азп

ТЬг

420

425

430

Ьеи

О1у

5ег

Рке

О1и

Суз

О1п

Суз

Ьеи

О1п

О1у

Туг

ТЬг

О1у

Рго

Агд

435

440

445

Суз

О1и

11е

Азр

Уа1

Азп

О1и

Суз

11е

5ег

Азп

Рго

Суз

О1п

Азп

Азр

450

455

460

А1а

ТЬг

Суз

Ьеи

Азр

О1п

11е

О1у

О1и

Рке

О1п

Суз

11е

Суз

МеЬ

Рго

465

470

475

480

О1у

Туг

О1и

О1у

Уа1

Туг

Суз

О1и

11е

Азп

ТЬг

Азр

О1и

Суз

А1а

5ег

485

490

495

- 23 032634

5ег

Рго

Суз

Ьеи 500

Н1з

Азп

О1у

Н1з

Суз 505

МеЬ

Азр

Ьуз

11е

Азп 510

О1и

Рке

О1п

Суз

О1п

Суз

Рго

Ьуз

О1у

Рке

Азп

О1у

Н1з

Ьеи

Суз

О1п

Туг

Азр

515

520

525

ναι

Азр

О1и

Суз

А1а

5ег

ТЬг

Рго

Суз

Ьуз

Азп

О1у

А1а

Ьуз

Суз

Ьеи

530

535

540

Азр

О1у

Рго

Азп

ТЬг

Туг

ТЬг

Суз

Уа1

Суз

ТЬг

О1и

О1у

Туг

ТЬг

О1у

545

550

555

560

ТЬг

Н1з

Суз

О1и

Уа1

Азр

11е

Азр

О1и

Суз

Азр

Рго

Азр

Рго

Суз

Н1з

565

570

575

Туг

О1у

5ег

Суз

Ьуз

Азр

О1у

Уа1

А1а

ТЬг

Рке

ТЬг

Суз

Ьеи

Суз

О1п

580

585

590

Рго

О1у

Туг

ТЬг

О1у

Н1з

Н1з

Суз

О1и

ТЬг

Азп

11е

Азп

О1и

Суз

Н1з

595

600

605

5ег

О1п

Рго

Суз

Агд

Н1з

О1у

О1у

ТЬг

Суз

О1п

Азр

Агд

Азр

Азп

5ег

610

615

620

Туг

Ьеи

Суз

Ьеи

Суз

Ьеи

Ьуз

О1у

ТЬг

ТЬг

О1у

Рго

Азп

Суз

О1и

11е

625

630

635

640

Азп

Ьеи

Азр

Азр

Суз

А1а

5ег

Азп

Рго

Суз

Азр

5ег

О1у

ТЬг

Суз

Ьеи

645

650

655

Азр

Ьуз

11е

Азр

О1у

Туг

О1и

Суз

А1а

Суз

О1и

Рго

О1у

Туг

ТЬг

О1у

660

665

670

5ег

МеЬ

Суз

Азп

Уа1

Азп

11е

Азр

О1и

Суз

А1а

О1у

5ег

Рго

Суз

Н1з

675

680

685

Азп

О1у

О1у

ТЬг

Суз

О1и

Азр

О1у

11е

А1а

О1у

Рке

ТЬг

Суз

Агд

Суз

690

695

700

Рго

О1и

О1у

Туг

Н1з

Азр

Рго

ТЬг

Суз

Ьеи

5ег

О1и

Уа1

Азп

О1и

Суз

705

710

715

720

Азп

5ег

Азп

Рго

Суз

11е

Н1з

О1у

А1а

Суз

Агд

Азр

О1у

Ьеи

Азп

О1у

725

730

735

Туг

Ьуз

Суз

Азр

Суз

А1а

Рго

О1у

Тгр

5ег

О1у

ТЬг

Азп

Суз

Азр

11е

740

745

750

- 24 032634

Азп Азп Азп

О1и

Суз

О1и

5ег Азп Рго 760

Суз

Уа1

Азп С1у 765

О1у

ТИг

Суз

755

Ьуз

Азр

МеЬ

ТИг

5ег

О1у

Туг

Уа1

Суз

ТИг

Суз

Агд

О1и

О1у

РИе

5ег

770

775

780

О1у

Рго

Азп

Суз

О1п

ТИг

Азп

11е

Азп

О1и

Суз

А1а

5ег

Азп

Рго

Суз

785

790

795

800

Ьеи

Азп

О1п

О1у

ТИг

Суз

11е

Азр

Азр

Уа1

А1а

О1у

Туг

Ьуз

Суз

Азп

805

810

815

Суз

Рго

Ьеи

Рго

Туг

ТИг

О1у

А1а

ТИг

Суз

О1и

Уа1

Уа1

Ьеи

А1а

Рго

820

825

830

Суз

А1а

ТИг

5ег

Рго

Суз

Ьуз

Азп

5ег

О1у

Уа1

Суз

Ьуз

О1и

5ег

О1и

835

840

845

Азр

Туг

О1и

5ег

РИе

5ег

Суз

Уа1

Суз

Рго

ТИг

О1у

Тгр

О1п

О1у

О1п

850

855

860

ТИг

Суз

О1и

Уа1

Азр

11е

Азп

О1и

Суз

Уа1

Ьуз

5ег

Рго

Суз

Агд

Н1з

865

870

875

880

О1у

А1а

5ег

Суз

О1п

Азп

ТИг

Азп

О1у

5ег

Туг

Агд

Суз

Ьеи

Суз

О1п

885

890

895

А1а

О1у

Туг

ТИг

О1у

Агд

Азп

Суз

О1и

5ег

Азр

11е

Азр

Азр

Суз

Агд

900

905

910

Рго

Азп

Рго

Суз

Н1з

Азп

О1у

О1у

5ег

Суз

ТИг

Азр

О1у

11е

Азп

ТИг

915

920

925

А1а

РИе

Суз

Азр

Суз

Ьеи

Рго

О1у

РИе

О1п

О1у

А1а

РИе

Суз

О1и

О1и

930

935

940

Азр

11е

Азп

О1и

Суз

А1а

5ег

Азп

Рго

Суз

О1п

Азп

О1у

А1а

Азп

Суз

945

950

955

960

ТИг

Азр

Суз

Уа1

Азр

5ег

Туг

ТИг

Суз

ТИг

Суз

Рго

Уа1

О1у

РИе

Азп

965

970

975

О1у

11е

Н1з

Суз

О1и

Азп

Азп

ТИг

Рго

Азр

Суз

ТИг

О1и

5ег

5ег

Суз

980

985

990

РИе Азп О1у О1у ТИг

995

Суз

Уа1

Азр

1000

ТИг Суз Ьеи

С1у 11е Азп 5ег РИе

1005

- 25 032634

Суз

Рго 1010

Рго О1у

Рке

ТЬг

О1у 1015

5ег Туг

Суз

О1п

Туг 1020

Азр

Уа1

Азп

О1и

Суз

Азр

5ег

Агд

Рго

Суз

Ьеи

Н1з

О1у

О1у

ТЬг

Суз

О1п

Азр

1025

1030

1035

5ег

Туг

О1у

ТЬг

Туг

Ьуз

Суз

ТЬг

Суз

Рго

О1п

О1у

Туг

ТЬг

О1у

1040

1045

1050

Ьеи

Азп

Суз

О1п

Азп

Ьеи

Уа1

Агд

Тгр

Суз

Азр

5ег

А1а

Рго

Суз

1055

1060

1065

Ьуз

Азп

О1у

О1у

Агд

Суз

Тгр

О1п

ТЬг

Азп

ТЬг

О1п

Туг

Н1з

Суз

1070

1075

1080

О1и

Суз

Агд

5ег

О1у

Тгр

ТЬг

О1у

Уа1

Азп

Суз

Азр

Уа1

Ьеи

5ег

1085

1090

1095

Уа1

5ег

Суз

О1и

Уа1

А1а

А1а

О1п

Ьуз

Агд

О1у

11е

Азр

Уа1

ТЬг

1100

1105

1110

Ьеи

Ьеи

Суз

О1п

Н1з

О1у

О1у

Ьеи

Суз

Уа1

Азр

О1и

О1у

Азр

Ьуз

1115

1120

1125

Н1з

Туг

Суз

Н1з

Суз

О1п

А1а

О1у

Туг

ТЬг

О1у

5ег

Туг

Суз

О1и

1130

1135

1140

Азр

О1и

Уа1

Азр

О1и

Суз

5ег

Рго

Азп

Рго

Суз

О1п

Азп

О1у

А1а

1145

1150

1155

ТЬг

Суз

ТЬг

Азр

Туг

Ьеи

О1у

О1у

Рке

5ег

Суз

Ьуз

Суз

Уа1

А1а

1160

1165

1170

О1у

Туг

Н1з

О1у

5ег

Азп

Суз

5ег

О1и

О1и

11е

Азп

О1и

Суз

Ьеи

1175

1180

1185

5ег

О1п

Рго

Суз

О1п

Азп

О1у

О1у

ТЬг

Суз

11е

Азр

Ьеи

ТЬг

Азп

1190

1195

1200

5ег

Туг

Ьуз

Суз

5ег

Суз

Рго

Агд

О1у

ТЬг

О1п

О1у

Уа1

Н1з

Суз

1205

1210

1215

О1и

11е

Азп

Уа1

Азр

Азр

Суз

Н1з

Рго

Рго

Ьеи

Азр

Рго

А1а

5ег

1220

1225

1230

Агд

5ег

Рго

Ьуз

Суз

Рке

Азп

Азп

О1у

ТЬг

Суз

Уа1

Азр

О1п

Уа1

- 26 032634

1235

1240

1245

О1у О1у 1250

Туг

ТЪг Суз

ТЪг Суз 1255

Рго

Рго

О1у

РЪе Уа1 1260

О1у

О1и

Агд

Суз

О1и

О1у

Азр

Уа1

Азп

О1и

Суз

Ьеи

5ег

Азп

Рго

Суз

Азр

Рго

1265

1270

1275

Агд

О1у

ТЬг

О1п

Азп

Суз

Уа1

О1п

Агд

Уа1

Азп

Азр

РЪе

Н1з

Суз

1280

1285

1290

О1и

Суз

Агд

А1а

О1у

Н1з

ТЪг

О1у

Агд

Агд

Суз

О1и

5ег

Уа1

11е

1295

1300

1305

Азп

О1у

Суз

Агд

О1у

Ьуз

Рго

Суз

Ьуз

Азп

О1у

О1у

Уа1

Суз

А1а

1310

1315

1320

Уа1

А1а

5ег

Азп

ТЬг

А1а

Агд

О1у

РЪе

11е

Суз

Агд

Суз

Рго

А1а

1325

1330

1335

О1у

Рке

О1и

О1у

А1а

ТЪг

Суз

О1и

Азп

Азр

А1а

Агд

ТЪг

Суз

О1у

1340

1345

1350

5ег

Ьеи

Агд

Суз

Ьеи

Азп

О1у

О1у

ТЪг

Суз

11е

5ег

О1у

Рго

Агд

1355

1360

1365

5ег

Рго

ТЬг

Суз

Ьеи

Суз

Ьеи

О1у

5ег

РЪе

ТЪг

О1у

Рго

О1и

Суз

1370

1375

1380

О1п

Рке

Рго

А1а

5ег

5ег

Рго

Суз

Уа1

О1у

5ег

Азп

Рго

Суз

Туг

1385

1390

1395

Азп

О1п

О1у

ТЬг

Суз

О1и

Рго

ТЪг

5ег

О1и

Азп

Рго

РЪе

Туг

Агд

1400

1405

1410

Суз

Ьеи

Суз

Рго

А1а

Ьуз

РЪе

Азп

О1у

Ьеи

Ьеи

Суз

Н1з

11е

Ьеи

1415

1420

1425

Азр

Туг

5ег

Рке

ТЬг

О1у

О1у

А1а

О1у

Агд

Азр

11е

Рго

Рго

Рго

1430

1435

1440

О1п

11е

О1и

О1и

А1а

Суз

О1и

Ьеи

Рго

О1и

Суз

О1п

Уа1

Азр

А1а

1445

1450

1455

О1у

Азп

Ьуз

Уа1

Суз

Азп

Ьеи

О1п

Суз

Азп

Азп

Н1з

А1а

Суз

О1у

1460

1465

1470

- 27 032634

Тгр

Азр 1475

О1у О1у Азр

Суз

Бег 1480

Ьеи

Азп

РЬе

Азп

Азр 1485

Рго

Тгр

Ьуз

Азп

Суз

ТЬг

О1п

Бег

Ьеи

О1п

Суз

Тгр

Ьуз

Туг

РЬе

Бег

Азр

О1у

1490

1495

1500

Н1з

Суз

Азр

Бег

О1п

Суз

Азп

Бег

А1а

О1у

Суз

Ьеи

РЬе

Азр

О1у

1505

1510

1515

РЬе

Азр

Суз

О1п

Ьеи

ТЬг

О1и

О1у

О1п

Суз

Азп

Рго

Ьеи

Туг

Азр

1520

1525

1530

О1п

Туг

Суз

Ьуз

Азр

Н1з

РЬе

Бег

Азр

О1у

Н1з

Суз

Азр

О1п

О1у

1535

1540

1545

Суз

Азп

Бег

А1а

О1и

Суз

О1и

Тгр

Азр

О1у

Ьеи

Азр

Суз

А1а

О1и

1550

1555

1560

Н1з

Уа1

Рго

О1и

Агд

Ьеи

А1а

А1а

О1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

1565

1570

1575

Ьеи

Ьеи

Рго

Рго

Азр

О1п

Ьеи

Агд

Азп

Азп

Бег

РЬе

Н1з

РЬе

Ьеи

1580

1585

1590

Агд

О1и

Ьеи

Бег

Н1з

Уа1

Ьеи

Н1з

ТЬг

Азп

Уа1

Уа1

РЬе

Ьуз

Агд

1595

1600

1605

Азр

А1а

О1п

О1у

О1п

О1п

МеЕ

11е

РЬе

Рго

Туг

Туг

О1у

Н1з

О1и

1610

1615

1620

О1и

О1и

Ьеи

Агд

Ьуз

Н1з

Рго

11е

Ьуз

Агд

Бег

ТЬг

Уа1

О1у

Тгр

1625

1630

1635

А1а

ТЬг

Бег

Бег

Ьеи

Ьеи

Рго

О1у

ТЬг

Бег

О1у

О1у

Агд

О1п

Агд

1640

1645

1650

Агд

О1и

Ьеи

Азр

Рго

МеЕ

Азр

11е

Агд

О1у

Бег

11е

Уа1

Туг

Ьеи

1655

1660

1665

О1и

11е

Азр

Азп

Агд

О1п

Суз

Уа1

О1п

Бег

Бег

Бег

О1п

Суз

РЬе

1670

1675

1680

О1п

Бег

А1а

ТЬг

Азр

Уа1

А1а

А1а

РЬе

Ьеи

О1у

А1а

Ьеи

А1а

Бег

1685

1690

1695

Ьеи

О1у

Бег

Ьеи

Азп

11е

Рго

Туг

Ьуз

11е

О1и

А1а

Уа1

Ьуз

Бег

1700

1705

1710

- 28 032634

О1и

Рго 1715

Уа1

О1и

Рго

Рго

Ьеи 1720

Рго

5ег

О1п

Ьеи

Н1з 1725

Ьеи

МеЬ

Туг

ν&1

А1а

А1а

А1а

А1а

РЬе

Уа1

Ьеи

Ьеи

РЬе

РЬе

Уа1

О1у

Суз

О1у

1730

1735

1740

Уа1

Ьеи

Ьеи

5ег

Агд

Ьуз

Агд

Агд

Агд

О1п

Н1з

О1у

О1п

Ьеи

Тгр

1745

1750

1755

РЬе

Рго

О1и

О1у

РЬе

Ьуз

Уа1

5ег

О1и

А1а

5ег

Ьуз

Ьуз

Ьуз

Агд

1760

1765

1770

Агд

О1и

Рго

Ьеи

О1у

О1и

Азр

5ег

Уа1

О1у

Ьеи

Ьуз

Рго

Ьеи

Ьуз

1775

1780

1785

Азп

А1а

5ег

Азр

О1у

А1а

Ьеи

МеЬ

Азр

Азр

Азп

О1п

Азп

О1и

Тгр

1790

1795

1800

О1у

Азр

О1и

Азр

Ьеи

О1и

ТЬг

Ьуз

Ьуз

РЬе

Агд

РЬе

О1и

О1и

Рго

1805

1810

1815

Уа1

Уа1

Ьеи

Рго

Азр

Ьеи

5ег

Азр

О1п

ТЬг

Азр

Н1з

Агд

О1п

Тгр

1820

1825

1830

ТЬг

О1п

О1п

Н1з

Ьеи

Азр

А1а

А1а

Азр

Ьеи

Агд

МеЬ

5ег

А1а

МеЬ

1835

1840

1845

А1а

Рго

ТЬг

Рго

Рго

О1п

О1у

О1и

Уа1

Азр

А1а

Азр

Суз

МеЬ

Азр

1850

1855

1860

Уа1

Азп

Уа1

Агд

О1у

Рго

Азр

О1у

РЬе

ТЬг

Рго

Ьеи

МеЬ

11е

А1а

1865

1870

1875

5ег

Суз

5ег

О1у

О1у

О1у

Ьеи

О1и

ТЬг

О1у

Азп

5ег

О1и

О1и

О1и

1880

1885

1890

О1и

Азр

А1а

Рго

А1а

Уа1

11е

5ег

Азр

РЬе

11е

Туг

О1п

О1у

А1а

1895

1900

1905

5ег

Ьеи

Н1з

Азп

О1п

ТЬг

Азр

Агд

ТЬг

О1у

О1и

ТЬг

А1а

Ьеи

Н1з

1910

1915

1920

Ьеи

А1а

А1а

Агд

Туг

5ег

Агд

5ег

Азр

А1а

А1а

Ьуз

Агд

Ьеи

Ьеи

1925

1930

1935

О1и

А1а

5ег

А1а

Азр

А1а

Азп

11е

О1п

Азр

Азп

МеЬ

О1у

Агд

ТЬг

1940

1945

1950

- 29 032634

Рго

Ьеи 1955

Н1з

А1а

А1а

Уа1

5ег 1960

А1а

Азр

А1а

О1п

О1у 1965

Уа1

Рке

О1п

11е

Ьеи

Ьеи

Агд

Азп

Агд

А1а

Ткг

Азр

Ьеи

Азр

А1а

Агд

МеГ

Н1з

1970

1975

1980

Азр

О1у

Ткг

Ткг

Рго

Ьеи

11е

Ьеи

А1а

А1а

Агд

Ьеи

А1а

Уа1

О1и

1985

1990

1995

О1у

МеГ

Ьеи

О1и

Азр

Ьеи

11е

Азп

5ег

Н1з

А1а

Азр

Уа1

Азп

А1а

2000

2005

2010

Уа1

Азр

Азр

Ьеи

О1у

Ьуз

5ег

А1а

Ьеи

Н1з

Тгр

А1а

А1а

А1а

Уа1

2015

2020

2025

Азп

Азп

Уа1

Азр

А1а

А1а

Уа1

Уа1

Ьеи

Ьеи

Ьуз

Азп

О1у

А1а

Азп

2030

2035

2040

Ьуз

Азр

МеГ

О1п

Азп

Азп

Ьуз

О1и

О1и

Ткг

Рго

Ьеи

Рке

Ьеи

А1а

2045

2050

2055

А1а

Агд

О1и

О1у

5ег

Туг

О1и

Ткг

А1а

Ьуз

Уа1

Ьеи

Ьеи

Азр

Н1з

2060

2065

2070

Рке

А1а

Азп

Агд

Азр

11е

Ткг

Азр

Н1з

МеГ

Азр

Агд

Ьеи

Рго

Агд

2075

2080

2085

Азр

11е

А1а

О1п

О1и

Агд

МеГ

Н1з

Н1з

Азр

11е

Уа1

Агд

Ьеи

Ьеи

2090

2095

2100

Азр

О1и

Туг

Азп

Ьеи

Уа1

Агд

5ег

Рго

О1п

Ьеи

Н1з

О1у

Ткг

А1а

2105

2110

2115

Ьеи

О1у

О1у

Ткг

Рго

Ткг

Ьеи

5ег

Рго

Ткг

Ьеи

Суз

5ег

Рго

Азп

2120

2125

2130

О1у

Туг

Ьеи

О1у

Азп

Ьеи

Ьуз

5ег

А1а

Ткг

О1п

О1у

Ьуз

Ьуз

А1а

2135

2140

2145

Агд

Ьуз

Рго

5ег

Ткг

Ьуз

О1у

Ьеи

А1а

Суз

О1у

5ег

Ьуз

О1и

А1а

2150

2155

2160

Ьуз

Азр

Ьеи

Ьуз

А1а

Агд

Агд

Ьуз

Ьуз

5ег

О1п

Азр

О1у

Ьуз

О1у

2165

2170

2175

Суз

Ьеи

Ьеи

Азр

5ег

5ег

5ег

МеГ

Ьеи

5ег

Рго

Уа1

Азр

5ег

Ьеи

- 30 032634

2180

2185

2190

О1и

5ег 2195

Рго

Н1з

О1у

Туг

Ьеи 2200

5ег

Азр

Уа1

А1а

5ег 2205

Рго

Рго

Ьеи

Ьеи

Рго

5ег

Рго

Рке

О1п

О1п

5ег

Рго

5ег

МеЬ

Рго

Ьеи

5ег

Н1з

2210

2215

2220

Ьеи

Рго

О1у

МеЬ

Рго

Азр

ТЬг

Н1з

Ьеи

О1у

11е

5ег

Н1з

Ьеи

Азп

2225

2230

2235

Уа1

А1а

А1а

Ьуз

Рго

О1и

МеЬ

А1а

А1а

Ьеи

А1а

О1у

О1у

5ег

Агд

2240

2245

2250

Ьеи

А1а

Рке

О1и

Рго

Рго

Рго

Рго

Агд

Ьеи

5ег

Н1з

Ьеи

Рго

Уа1

2255

2260

2265

А1а

5ег

5ег

А1а

5ег

ТЬг

Уа1

Ьеи

5ег

ТЬг

Азп

О1у

ТЬг

О1у

А1а

2270

2275

2280

МеЬ

Азп

Рке

ТЬг

Уа1

О1у

А1а

Рго

А1а

5ег

Ьеи

Азп

О1у

О1п

Суз

2285

2290

2295

О1и

Тгр

Ьеи

Рго

Агд

Ьеи

О1п

Азп

О1у

МеЬ

Уа1

Рго

5ег

О1п

Туг

2300

2305

2310

Азп

Рго

Ьеи

Агд

Рго

О1у

Уа1

ТЬг

Рго

О1у

ТЬг

Ьеи

5ег

ТЬг

О1п

2315

2320

2325

А1а

А1а

О1у

Ьеи

О1п

Н1з

5ег

МеЬ

МеЬ

О1у

Рго

Ьеи

Н1з

5ег

5ег

2330

2335

2340

Ьеи

5ег

ТЬг

Азп

ТЬг

Ьеи

5ег

Рго

11е

11е

Туг

О1п

О1у

Ьеи

Рго

2345

2350

2355

Азп

ТЬг

Агд

Ьеи

А1а

ТЬг

О1п

Рго

Н1з

Ьеи

Уа1

О1п

ТЬг

О1п

О1п

2360

2365

2370

Уа1

О1п

Рго

О1п

Азп

Ьеи

О1п

Ьеи

О1п

Рго

О1п

Азп

Ьеи

О1п

Рго

2375

2380

2385

Рго

5ег

О1п

Рго

Н1з

Ьеи

5ег

Уа1

5ег

5ег

А1а

А1а

Азп

О1у

Н1з

2390

2395

2400

Ьеи

О1у

Агд

5ег

Рке

Ьеи

5ег

О1у

О1и

Рго

5ег

О1п

А1а

Азр

Уа1

2405

2410

2415

- 31 032634

О1п

Рго 2420

Ьеи

О1у

Рго

Бег

Бег 2425

Ьеи

Рго

Уа1

Н1з

ТИг 2430

11е

Ьеи

Рго

О1п

О1и

Бег

О1п

А1а

Ьеи

Рго

ТИг

Бег

Ьеи

Рго

Бег

Бег

МеЕ

Уа1

2435

2440

2445

Рго

Рго

МеЕ

ТИг

ТИг

ТИг

О1п

РИе

Ьеи

ТИг

Рго

Рго

Бег

О1п

Н1з

2450

2455

2460

Бег

Туг

Бег

Бег

Бег

Рго

Уа1

Азр

Азп

ТИг

Рго

Бег

Н1з

О1п

Ьеи

2465

2470

2475

О1п

Уа1

Рго

О1и

Н1з

Рго

РИе

Ьеи

ТИг

Рго

Бег

Рго

О1и

Бег

Рго

2480

2485

2490

Азр

О1п

Тгр

Бег

Бег

Бег

Бег

Рго

Н1з

Бег

Азп

11е

Бег

Азр

Тгр

2495

2500

2505

Бег

О1и

О1у

11е

Бег

Бег

Рго

Рго

ТИг

ТИг

МеЕ

Рго

Бег

О1п

11е

2510

2515

2520

ТИг Н13 11е Рго О1и А1а РИе Ьуз

2525 2530

<210> <211> <212> <213>	2 23 БЕЛОК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическая	конструкция
<400>	2

МеЕ Рго Агд Ьеи Ьеи ТИг Рго Ьеи Ьеи Суз Ьеи ТИг Ьеи Ьеи Рго А1а

5 10 15

Ьеи А1а А1а Агд О1у Ьеи Агд

- 32 032634

Claims (7)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение структуры

   4,4,4-трифтор-И-((2§)-1-((9-метокси-3,3-диметил-5-оксо-2,3,5,6-тетрагидро-1Н-бензо[1]пирроло[1,2а]азепин-6-ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)бутанамид, его диастереомер или фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Соединение структуры

   И-((2§)-1-((8,8-диметил-6-оксо-6,8,9,10-тетрагидро-5Н-пиридо[3,2-1]пирроло[1,2-а]азепин-5ил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-4,4,4-трифторбутанамид, или его диастереомер, или фармацевтически приемлемая соль.
3. 3. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель, для лечения Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, эритролейкоза, трижды негативного рака молочной железы, рака молочной железы, рака яичников, меланомы, рака легких, немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака толстой и прямой кишок, рака головы и шеи, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака печени, плоскоклеточной карциномы полости рта, рака кожи, медуллобластомы, ангиосаркомы, рабдомиосаркомы, липосаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, гепатоцеллюлярной карциномы, внутрипеченочной или внепеченочной холангиокарциномы, аденокистозной карциномы или сенсоневральной тугоухости, вызванной утратой слуховых волосковых клеток.
4. 4. Применение соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, хронического лимфобластного лейкоза, острого миелогенного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, эритролейкоза, трижды негативного рака молочной железы, рака молочной железы, рака яичников, меланомы, рака легких, немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака толстой и прямой кишок, рака головы и шеи, рака шейки матки, рака предстательной железы, рака печени, плоскоклеточной карциномы полости рта, рака кожи, медуллобластомы, ангиосаркомы, рабдомиосаркомы, липосаркомы, злокачественной фиброзной гистиоцитомы, гепатоцеллюлярной карциномы, внутрипеченочной или внепеченочной холангиокарциномы или аденокистозной карциномы.
5. 5. Применение по п.4 для производства лекарственного средства для лечения рака легких.
6. 6. Применение соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения сенсоневральной тугоухости, вызванной утратой слуховых волосковых клеток.
7. 7. Применение соединения по п.1 или 2, или его диастереомера, или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для инициации образования слуховых волосковых клеток.