CN107849054A

CN107849054A - Notch通路信号传导抑制剂化合物

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Publication number: CN107849054A
Application number: CN201680039699.XA
Authority: CN
Inventors: J.M.克莱; A.埃奇; P.A.希普斯金; J.C.吉尔; B.K.帕特尔; H.H.G.范埃斯; A.D.弗罗布列斯基; 赵改英
Original assignee: Auditory Therapy Co; Eli Lilly and Co
Current assignee: Auditory Therapy Co; Eli Lilly and Co
Priority date: 2015-07-07
Filing date: 2016-07-01
Publication date: 2018-03-27
Anticipated expiration: 2036-07-01
Also published as: JO3491B1; UA120539C2; TN2017000495A1; LT3319967T; EA201792478A1; ME03495B; JP6571214B2; ZA201707858B; KR20180011314A; PE20180412A1; MY197519A; EA032634B1; CL2018000007A1; HUE044666T2; CR20170598A; DK3319967T3; RS59115B1; WO2017007702A1; TW201712016A; PT3319967T

Abstract

本发明提供可用作用于治疗指定癌症、由听毛细胞损失造成的感音神经性听力损失和诱导听毛细胞生成的Notch通路信号传导抑制剂的下列化合物或其可药用盐和含有所述化合物的药物组合物。

Description

NOTCH通路信号传导抑制剂化合物

通过老化、暴露于噪音、暴露于化学试剂、药物、疾病和遗传障碍发生的内耳感觉毛细胞的损失每年造成许多人的听力障碍。无论病因学如何，位于耳蜗的柯蒂氏器官内的机械感觉毛细胞的死亡或功能障碍是感音神经性听力损失（SNHL）的主要原因。抑制听力损失的预防措施主要局限于外围保护，如耳塞或降噪或消噪声耳机。SNHL的现行治疗主要基于电子技术，如使用助听器放大声音或通过使用耳蜗植入物电刺激存活的螺旋神经节神经元而绕过毛细胞。还已对突发性感音神经性听力损失提议甾族化合物给药，以提供全身治疗或鼓室内治疗。

耳蜗感觉上皮含有适合察觉声音振动的毛细胞，声音振动通过毛细胞顶表面处的静纤毛转换成电脉冲并经VIIIth脑神经传送至脑。在发育过程中产生的听毛细胞是有丝分裂后的并在损失后未被替代或作为哺乳动物中的正常细胞更新的一部分。因此，归因于听毛细胞损失的SNHL是不可逆的。在胚胎期过程中的听毛细胞发育包括分化，其中前感觉（prosensory）上皮细胞通过由Notch信号传导介导的侧抑制过程达到不同的结果——毛细胞或支持细胞。受相邻毛细胞上的配体刺激的活性Notch信号传导阻碍前感觉上皮细胞分化成毛细胞。这些细胞变成支持细胞。

Notch信号传导是在哺乳动物的发育和组织稳态中起到不可或缺的作用的进化保守通路。Notch受体和配体含有单程跨膜结构域，在细胞表面上表达，因此Notch信号传导在介导表达受体和配体的相邻细胞之间的通讯方面特别重要。在啮齿动物和人类中发现四种已知的Notch受体，被称作Notch 1至Notch 4。Notch受体是由最初作为单一多肽合成的细胞外和细胞内结构域构成的异源二聚体蛋白质。受体-配体相互作用引发Notch受体多肽的一系列蛋白水解裂解，其中涉及γ-分泌酶活性。γ-分泌酶活性从质膜内侧裂解Notch细胞内结构域，其易位到核上以形成转录因子复合物。Notch细胞内结构域（NICD）是蛋白质的活性形式。各种Notch信号传导功能包括增殖、分化、凋亡、血管生成、迁移和自我更新。Notch信号传导在正常组织的发育和维持过程中的这些多样化的作用在不同形式的癌症中异常活化。Notch信号传导的致癌功能包括抑制凋亡和促进细胞增殖。

γ-分泌酶在Notch活化级联中起到关键作用。因此，由于它们潜在阻断Notch受体活化，已经为癌症的治疗积极研究γ-分泌酶的抑制剂。尽管临床试验仍在继续，尚未出现商业Notch抑制剂化疗药物。

γ-分泌酶也通过Notch信号传导通路在前感觉细胞分化中起到关键作用。因此，由于它们潜在阻断Notch受体活化，已经为SNHL的治疗积极研究γ-分泌酶的抑制剂。以更靶向的表达水平和时间诱导耳蜗环境中的atonal homolog 1（无调同源物1）（Atoh1或Math1）表达是有用和合意的，而非通过各种进入体循环的方法给予Notch抑制剂以致以异常升高的水平和延长的时间诱导Atoh1表达。无法调节Atoh1仍然是听毛细胞研究和听毛细胞再生疗法开发的障碍。尽管研究继续，如WO 2014/039781，尚未出现用于治疗由听毛细胞损失造成的感音神经性听力损失的商业Notch抑制剂。

需要找到具有Notch通路信号传导抑制活性的化合物。还需要找到通过γ-分泌酶抑制活性抑制Notch通路信号传导的化合物。还需要找到具有有助于Notch通路信号传导和γ-分泌酶抑制活性的独特结构特征的化合物。还需要找到通过抑制Notch通路信号传导诱导Atoh1表达的化合物。还需要找到表现出合意的吸收、分布、代谢和排泄性质的化合物。

本发明的一个方面提供具有下列结构的化合物：

4,4,4-三氟-N-((2S)-1-((9-甲氧基-3,3-二甲基-5-氧代-2,3,5,6-四氢-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬（azepin）-6-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丁酰胺或其基本非对映体纯的异构体或上述任一种的可药用盐。

本发明的另一方面是具有下列结构的化合物：

N-((2S)-1-((8,8-二甲基-6-氧代-6,8,9,10-四氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-4,4,4-三氟丁酰胺或其基本非对映体纯的异构体或上述任一种的可药用盐。

本发明的另一方面提供包含化合物1或其基本纯的非对映体；或化合物2或其基本纯的非对映体；或上述任一种的可药用盐和可药用载体的药物组合物。

本发明的另一方面提供治疗患者的癌症的方法，所述癌症是T-细胞急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、红白血病、三阴性乳腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、结肠直肠癌、头颈癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、口腔鳞状细胞癌、皮肤癌、成神经管细胞瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、肝细胞癌、肝内和肝外胆管癌和腺样囊性癌，其包括将治疗有效量的化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐给药至需要其的患者。

本发明的另一方面提供治疗患者的肺癌的方法，其包括将治疗有效量的化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐给药至需要其的患者。

本发明的另一方面提供治疗需要其的患者的由听毛细胞损失造成的感音神经性听力损失的方法，其包括将治疗有效量的化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐给药至所述患者。

本发明的另一方面提供诱导需要其的患者的听毛细胞生成的方法，其包括将治疗有效量的化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐给药至所述患者。

本发明的另一方面提供用于治疗的化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐。

本发明的另一方面提供用于治疗T-细胞急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、红白血病、三阴性乳腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、结肠直肠癌、头颈癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、口腔鳞状细胞癌、皮肤癌、成神经管细胞瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、肝细胞癌、肝内或肝外胆管癌或腺样囊性癌的化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐。

本发明的另一方面提供用于治疗肺癌的化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐。

本发明的另一方面提供用于治疗由听毛细胞损失造成的感音神经性听力损失的化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐。

本发明的另一方面提供用于诱导听毛细胞生成的化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐。

本发明的另一方面提供化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐用于制备治疗T-细胞急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、红白血病、三阴性乳腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、结肠直肠癌、头颈癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、口腔鳞状细胞癌、皮肤癌、成神经管细胞瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、肝细胞癌、肝内或肝外胆管癌或腺样囊性癌的药物的用途。

本发明的另一方面提供化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐用于制备治疗肺癌的药物的用途。

本发明的另一方面提供化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐用于制备治疗由听毛细胞损失造成的感音神经性听力损失的药物的用途。

本发明的另一方面提供化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐用于制备诱导听毛细胞生成的药物的用途。

本发明的另一方面提供治疗犬类伴侣动物的由听毛细胞损失造成的感音神经性听力损失的方法，其包括将治疗有效量的化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐给药至所述犬类伴侣动物。

本发明的另一方面提供诱导需要其的犬类伴侣动物的听毛细胞生成的方法，其包括将治疗有效量的化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐给药至所述犬类伴侣动物。

术语“化合物1、其非对映体”是指4,4,4-三氟-N-((2S)-1-((9-甲氧基-3,3-二甲基-5-氧代-2,3,5,6-四氢-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-6-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丁酰胺；或非对映体4,4,4-三氟-N-((S)-1-(((S)-9-甲氧基-3,3-二甲基-5-氧代-2,3,5,6-四氢-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-6-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丁酰胺或4,4,4-三氟-N-((S)-1-(((R)-9-甲氧基-3,3-二甲基-5-氧代-2,3,5,6-四氢-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-6-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丁酰胺。类似地，术语“化合物2、其非对映体”是指N-((2S)-1-((8,8-二甲基-6-氧代-6,8,9,10-四氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-4,4,4-三氟丁酰胺；或非对映体N-((S)-1-(((S)-8,8-二甲基-6-氧代-6,8,9,10-四氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-4,4,4-三氟丁酰胺或N-((S)-1-(((R)-8,8-二甲基-6-氧代-6,8,9,10-四氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-4,4,4-三氟丁酰胺。

术语“患者”是指哺乳动物，“哺乳动物”包括，但不限于，产后期之后的人类。人类的产后期是在分娩后立即开始并延伸30天的时期。

“治疗有效量”或“有效量”是指抑制癌症患者中的Notch信号传导和破坏靶癌细胞或减慢或阻止患者的癌症进展所必需的化合物1、其基本纯的非对映体（其是异构体1或异构体2）或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体（其是异构体1或异构体2）或其可药用盐或含有上述任一种的药物组合物的剂量。类似地，“治疗有效量”或“有效量”是指抑制由听毛细胞损失或损伤造成的感音神经性听力损失患者中的Notch信号传导或诱导听毛细胞生成所必需的化合物1、其基本纯的非对映体（其是异构体1或异构体2）或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体（其是异构体1或异构体2）或其药学有效盐或含有上述任一种的药物组合物的剂量。

“化合物1或化合物2的基本纯的非对映体”是指基本不含其它异构体的异构体1或异构体2。当在化合物1的6-位或化合物2的5-位的异构纯度大于90%异构体过量时，化合物1或化合物2是“基本非对映体纯的”。在另一实施方案中，在化合物1的6-位或化合物2的5-位的异构纯度大于95%异构体过量。在再一实施方案中，在化合物1的6-位或化合物2的5-位的异构纯度大于98%异构体过量。在再一实施方案中，在化合物1的6-位或化合物2的5-位的异构纯度大于99%异构体过量。所有立体异构体，包括化合物1或化合物2的非对映体混合物被认为在本发明范围内。

化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐用于治疗癌症的预期剂量在0.1至100毫克/患者/天的范围内。优选剂量预期在1.0至75毫克/患者/天的范围内。最优选的剂量预期在2.0至50毫克/患者/天的范围内。化合物1、其非对映体或其可药用盐或化合物2、其非对映体或其可药用盐用于治疗由听毛细胞损失或损伤造成的感音神经性听力损失或诱导听毛细胞生成的预期剂量在0.01至100毫克/患者/天的范围内。优选剂量预期在0.1至10毫克/患者/天的范围内。最优选的剂量预期在0.2至1.0毫克/患者/天的范围内。

对于癌症、感音神经性听力损失或诱导听毛细胞生成，医师将根据疾病的阶段和严重程度以及个体患者的特定需要和响应确定治疗患者所需的确切剂量和治疗时长。尽管以在每日基础上的剂量表示，但可以调节给药方案以向患者提供更优治疗益处并管理和改善任何药物相关毒性。除每日给药外，每2日一次（Q2D）；隔日给药五日接着停药两日（T.I.W.）；每3日一次（Q3D）；或经21日给药周期每周一次（Q.I.W.）；或其它给药方案也可能适当。

术语“治疗”意在包括对癌症、由听毛细胞损失或损伤造成的感音神经性听力损失或听毛细胞生成的诱导的全范围干预，如给予活性化合物以减轻、减慢或逆转一种或多种症状和延迟患者所患的癌症或听毛细胞损失或损伤的进展或诱导患者的听毛细胞生成。

“犬类伴侣动物”是指家养和家庭繁育的犬类，包括但不限于宠物、服务犬、搜救犬、放牧犬和牲畜护卫犬。

人类中的“听觉听力损失”、“感音神经性听力损失”或“听力损失”是指患者的听阈（在特定频率下听到的最轻声音（强度））在轻度下为21至40 dB；在中度下为41至55 dB；在中重度下为56至70 dB；在重度下为71至90 dB；和在极重度（profound）下为91 dB和更高。测试强度通常为0 dB至120 dB。测试频率通常为250、500、1000、2000、4000和8000 Hz。通过本领域技术人员已知和使用的常规测试进行诊断听力评估，包括纯音测听法，包括纯音听阈均值，言语测听法，包括言语接受阈、听觉脑干反应评价（ABR或BAER）、经鼓室耳蜗电图（transtympanic electrocochleography）（ECOG）和耳声发射测试（OAE）。也通过本领域技术人员已知和使用的常规测试进行儿童和婴儿评估，包括视觉强化测听法、游戏测听法、耳声发射（OAE）和听觉脑干反应评价。

本发明的化合物优选与可药用载体配制成药物组合物并通过各种途径给药。优选地，为了治疗癌症，此类组合物用于口服给药。

为了治疗由听毛细胞损失或损伤造成的感音神经性听力损失或诱导听毛细胞生成，可以配制和给药适合口服或肠胃外给药以提供局部或全身治疗的药物组合物。口服组合物包括片剂、包衣片剂、硬或软明胶胶囊、溶液剂、乳剂或混悬剂。肠胃外组合物可配制成允许如下给药，包括皮下注射、静脉、肌内、腹腔内、胸膜内、胸骨内、经鼓室、迷路内（intralabryinthine）或耳蜗内注射或输注。该药物组合物可配制成允许本发明的化合物在将该组合物给药于患者后生物可利用，或配制成提供活性药物成分的受控或持续释放。适合经鼓室给药于中耳腔的药物组合物是优选的，也优选给药于中耳的圆窗龛。也考虑迷路内注射和耳蜗内注射。用于听力损失治疗的优选给药途径是局部经鼓室注射，但这不排除适合替代性给药途径以提供全身给药的药物组合物，并可包括替代或除局部经鼓室给药之外的组合物和给药方案。也优选缓释局部给药组合物，其中根据化合物1或其基本纯的非对映体或其可药用盐结合在其中的给药载体或给药载体混合物，释放时间间隔可以为三(3)天至九十(90)天。

药物组合物、制备方法和用于靶向递送药物的递送体系是本领域中公知的。参见例如REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY（A. Gennaro等人, eds., 第19版, Mack Publishing Co., 1995）；Salt and Plontke, “Principles of Local DrugDelivery to the Inner Ear”, Audiol Neurotol, 2009, (14)；350-360；Rhee等人,“Sustained-Release Injectable Drug Delivery,” Pharmaceutical Technology,Special Issue Drug Delivery, 2010年11月01日。该药物组合物可含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、香料、用于改变渗透压的盐、缓冲剂、掩蔽剂或抗氧化剂。

本发明的化合物能与许多无机和有机酸反应以形成可药用酸加成盐。这样的可药用盐和它们的常用制备方法是本领域中公知的。参见例如P. Stahl等人, HANDBOOK OFPHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002)；S.M. Berge等人, “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Sciences,第66卷, 第1期, 1977年1月。

化合物1、其基本纯的非对映体或其可药用盐或化合物2、其基本纯的非对映体或其可药用盐可通过本领域中已知的各种程序以及下述那些制备。具体合成步骤可以以不同方式组合以制备化合物1、其非对映体或其可药用盐或化合物2、其非对映体或其可药用盐。

化合物1命名为：4,4,4-三氟-N-((2S)-1-((9-甲氧基-3,3-二甲基-5-氧代-2,3,5,6-四氢-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-6-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丁酰胺，也可命名为4,4,4-三氟-N-{(1S)-2-[(9-甲氧基-3,3-二甲基-5-氧代-2,3,5,6-四氢-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮杂䓬-6-基)氨基]-1-甲基-2-氧代乙基}丁酰胺；也可命名为：丁酰胺,4,4,4-三氟-N-[(1S)-1-甲基-2-氧代-2-[(2,3,5,6-四氢-9-甲氧基-3,3-二甲基-5-氧代-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮杂䓬-6-基)氨基]乙基]-；并且可以使用其它名称明确指定化合物1。非对映体命名为4,4,4-三氟-N-((S)-1-(((S)-9-甲氧基-3,3-二甲基-5-氧代-2,3,5,6-四氢-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-6-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丁酰胺和4,4,4-三氟-N-((S)-1-(((R)-9-甲氧基-3,3-二甲基-5-氧代-2,3,5,6-四氢-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-6-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丁酰胺。可以使用其它名称明确指定各非对映体。

化合物2命名为：N-((2S)-1-((8,8-二甲基-6-氧代-6,8,9,10-四氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-4,4,4-三氟丁酰胺，也可命名为N-{(1S)-2-[(8,8-二甲基-6-氧代-6,8,9,10-四氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-5-基)氨基]-1-甲基-2-氧代乙基}-4,4,4-三氟丁酰胺；也可命名为：丁酰胺, 4,4,4-三氟-N-[(1S)-1-甲基-2-氧代-2-[(6,8,9,10-四氢-8,8-二甲基-6-氧代-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-5-基)氨基]乙基]-；并且可以使用其它名称明确指定化合物2。非对映体命名为N-((S)-1-(((S)-8,8-二甲基-6-氧代-6,8,9,10-四氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-4,4,4-三氟丁酰胺和N-((S)-1-(((R)-8,8-二甲基-6-氧代-6,8,9,10-四氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-4,4,4-三氟丁酰胺。可以使用其它名称明确指定各非对映体。

要理解的是，化合物1和化合物2用固定的两个手性中心之一描绘。在此，使用(R)-和(S)-的Cahn-Ingold-Prelog名称指示特定异构体。可通过立体有择合成使用对映体纯或富含对映体的起始材料制备特定立体异构体。可通过本领域中公知的技术，如Stereochemistry of Organic Compounds, E. I. Eliel和S. H. Wilen (Wiley 1994)和Enantiomers, Racemates, and Resolutions, J., Jacques, A. Collet和S. H. Wilen(Wiley 1991)中记载的那些，包括在手性固定相上的色谱法、酶法拆分或分级结晶或为该目的形成的非对映体，如非对映体盐的色谱法拆分起始材料、中间体或包含化合物1或化合物2的外消旋混合物的特定立体异构体。在将手性化合物分离或拆分成其异构体但没有测定绝对构型或旋光性时，该异构体被任意指定为异构体1和异构体2，对应于从手性色谱法中洗脱的各自顺序并且如果在合成早期开始手性色谱法，对随后的中间体和实施例采用相同名称。尽管在本发明内涉及含有本发明的化合物的所有混合物，优选实施方案是化合物1，异构体2或化合物2，异构体2。

用作本发明的化合物的合成中的初始原材料的化合物是公知的并在不可购得的情况下，容易使用所提供的特定参考文献通过本领域普通技术人员常用的标准程序合成或可见于普通参考文本。

已知程序和方法的实例包括普通参考文本，如Comprehensive OrganicTransformations, VCH Publishers Inc, 1989；Compendium of Organic SyntheticMethods, 第1-10卷, 1974-2002, Wiley Interscience；Advanced Organic Chemistry,Reactions Mechanisms, and Structure, 第5版, Michael B. Smith和Jerry March,Wiley Interscience, 2001；Advanced Organic Chemistry, 第4版, Part B, Reactionsand Synthesis, Francis A. Carey和Richard J. Sundberg, Kluwer Academic /Plenum Publishers, 2000等和其中引用的参考文献中描述的那些。

本文所用的下列术语具有所示含义：“mAtoh1”是指小鼠无调同源物1蛋白质；“hAtoh 1”是指人无调同源物 1蛋白质；“Atoh1”是指人基因无调同源物1；“基础培养基（Basic Medium）”是指500ml DMEM/F12培养基 + 5ml N2 100X储液（stock）和10ml B2750X储液 + 500µl氨苄西林（Ampicillin）储液(1000X, 50mg/ml)和1667µl两性霉素B（Fungizone） (300X)；“BFGF”是指碱性成纤维细胞生长因子；“DMEM”是指Dulbecco改良Eagle培养基；“DMSO”是指二甲亚砜；”EDTA”是指乙二胺四乙酸；“EGF”是指表皮生长因子；“EGTA”是指乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸；ES/MS是指电喷射质谱法；“FBS”是指胎牛血清；“GFP”是指绿色荧光蛋白；“h”是指小时；“HBSS”是指Hank平衡盐溶液；“HEK”是指人胚肾；“IC₅₀”是指产生该试剂可能的最大抑制响应的50%的试剂浓度；“IgG”是指免疫球蛋白G；“Math1”是指人基因无调同源物1；“培养基A”是指200ml基础培养基 + EGFbFGF + IGF-1 + 分别20、10、50和50ng/ml的硫酸乙酰肝素；“MEM”是指最低必需培养基；“min”是指分钟；“MS”是指质谱法；“N1ICD”是指Notch1胞内结构域；“nGFP”是指核绿色荧光蛋白；“OC”是指柯蒂氏器官；“PBS”是指磷酸盐缓冲盐水；“PBST”是指磷酸盐缓冲盐水 +Tween®；“qPCR”是指定量聚合酶链反应；“qRT-PCR”是指定量逆转录聚合酶链反应；“rpm”是指每分钟转数；“RLT缓冲液”是指RNeasyLysis缓冲液；“RT”是指室温；“Tbp”是指TATA-结合蛋白；。

制备1

1-溴-3-(2-溴-4-甲氧基-苯基)丙-2-酮

在氮气下在搅拌下将三甲基甲硅烷基重氮甲烷（118.4毫升，236.80毫摩尔，2M在己烷中）逐滴添加到2-(2-溴-4-甲氧基-苯基)乙酰氯（52克，197.3毫摩尔）在四氢呋喃（197毫升）和乙腈（197毫升）中的0℃溶液中。在15分钟后允许升温至室温并在氮气下搅拌2小时。浓缩以获得稠红色油（61克）。将溴化氢（36毫升，197毫摩尔，33%在乙酸中）在搅拌下逐滴添加到来自前一步骤的2-(2-溴-4-甲氧基-苯基)乙酰基叠氮化物在乙酸（265毫升）中的5℃溶液中。在添加后，允许在氮气下升温至室温。在45分钟后，用冰/水（500毫升）淬灭，以产生棕色沉淀物。过滤固体并用水（100毫升）和己烷（100毫升）洗涤并在真空下在45℃下干燥2小时以产生橙色油形式的标题化合物（63.0克，99%）。1H NMR (300 MHz, CDCl₃): 7.17-7.12 (m, 2H), 6.85 (dd, J= 2.5, 8.5 Hz, 1H), 4.03 (s, 2H), 3.97 (s, 2H), 3.79(s, 3H)。

制备2

(3Z)-1-(2-溴-4-甲氧基-苯基)-3-(3,3-二甲基吡咯烷-2-叉基（pyrrolidin-2-ylidene）)丙-2-酮

在室温下将3,3-二甲基吡咯烷-2-硫酮（26.5克，205毫摩尔）一次性添加到通过制备1提供的中间体1-溴-3-(2-溴-4-甲氧基-苯基)丙-2-酮（60.00克，186毫摩尔）和碘化钾（31克，86毫摩尔）在四氢呋喃（600毫升）中的悬浮液中并搅拌1小时。加入甲基叔丁基醚（200毫升），滤出固体并用甲基-叔丁基醚（100毫升）冲洗滤饼以提供浅黄色固体形式的碘化1-(2-溴-4-甲氧基-苯基)-3-[(4,4-二甲基-2,3-二氢吡咯-1-鎓-5-基)硫烷基]丙-2-酮（100克）。向该固体（100克，201毫摩尔）在乙腈（1升）中的悬浮液中加入三乙胺（56毫升，401毫摩尔）和三苯基膦（58克，221毫摩尔）并在65℃下搅拌2.5小时。加入甲基叔丁基醚（200毫升）并滤出固体。蒸发滤液，用甲基叔丁基醚（20毫升）研制残留物并滤出固体（两次）。蒸发合并的滤液以获得50克粗材料。通过用20-50%梯度乙酸乙酯/己烷洗脱的基于二氧化硅的快速柱色谱法提纯该残留物以获得灰白色固体形式的标题化合物（41克，70%）。MS (m/z):338.0/340.0 (M+/M+2)。

制备3

9-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢-1H-吡咯并[1,2-A][1]苯并氮杂䓬-5(6H)-酮

将通过制备2提供的中间体(3Z)-1-(2-溴-4-甲氧基-苯基)-3-(3,3-二甲基吡咯烷-2-叉基)丙-2-酮（40.0克，118毫摩尔）、乙酸钯（2.7克，12毫摩尔）、碳酸铯（77克，237毫摩尔）、4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨（13.7克，24毫摩尔）和N-甲基-2-吡咯烷酮（1.2升）的混合物用氮气脱气/吹扫（x3）。将该悬浮液在150℃下加热4小时。冷却至RT，滤出固体，用乙酸乙酯洗涤并丢弃固体。将乙酸乙酯（1升）和水（500毫升）添加到滤液中，经硅藻土滤出固体并丢弃。分离滤液层，用乙酸乙酯（2 x 20毫升），接着二氯甲烷（3 x 100毫升）从水相中萃取。用5%碳酸氢钠水溶液洗涤合并的有机层两次，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以获得100毫升深棕色油。经过用二氯甲烷，接着1%甲醇/二氯甲烷洗脱的硅胶垫（silica pad）过滤材料并浓缩滤液。在乙酸乙酯和5%碳酸氢钠水溶液之间分配残留物，用乙酸乙酯从水相中反萃取，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以获得深棕色泡沫形式的粗产物。将所得泡沫溶解在乙酸乙酯（250毫升）中，加入SiliaBond Thiol®（80克）并在室温下搅拌过夜。滤出固体，用乙酸乙酯和二氯甲烷洗涤滤饼，浓缩滤液以获得浅棕色固体形式的标题化合物（19.6克，65%）。MS (m/z): 258.0 (M+H)。

制备4

6-羟基亚氨基-9-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮杂䓬-5(6H)-酮

在搅拌下将叔丁醇钾（11克，98毫摩尔）分几份添加到通过制备3提供的中间体9-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢-1H-吡咯并[1,2-A][1]苯并氮杂䓬-5(6H)-酮（16.8克，65毫摩尔）在四氢呋喃（336毫升）中的0℃溶液中并搅拌15分钟。逐滴加入亚硝酸戊酯（12.2毫升，91毫摩尔）并将混合物在0℃下搅拌30分钟。将反应混合物倒在冰/水（200毫升）上并用乙酸乙酯（2 x 200毫升）萃取该混合物。滤出结晶固体，用二氯甲烷（2 x 100毫升）从滤液中萃取。用盐水（100毫升）洗涤合并的有机物，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以提供浅棕色固体。用1:1甲基叔丁基醚/己烷研制固体，与之前收集的固体合并以获得浅黄色固体形式的标题化合物（16.5克，88%）。MS (m/z): 287.1 (M+H)。

制备5

6-氨基-9-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮杂䓬-5(6H)-酮

在搅拌下将三氟乙酸（17毫升，231毫摩尔）经10分钟逐滴添加到通过制备4提供的中间体6-羟基亚氨基-9-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮杂䓬-5(6H)-酮（16.5克，58毫摩尔）和锌粉（11.3克，173毫摩尔）在二氯甲烷（248毫升）中的5℃-10℃悬浮液中，然后允许升温至室温。经硅藻土垫过滤混合物，将滤液倒在冰和饱和碳酸钠水溶液的混合物（1:1, 500毫升）上。经硅藻土过滤所得悬浮液并用二氯甲烷冲洗过滤垫。用二氯甲烷（100毫升）从水层中萃取，将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以获得浅棕色泡沫形式的标题化合物（14.7克，94%）。MS (m/z): 273.1 (M+H)。

制备6

(2S)-2-(4,4,4-三氟丁酰基氨基)丙酸苄酯

在搅拌下将L-丙氨酸苄酯盐酸盐（7克，32.5毫摩尔）、二异丙基乙胺（28毫升，162毫摩尔）、水合羟基苯并三唑（7.5克，49毫摩尔）和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（9.3克，49毫摩尔）添加到4,4,4-三氟丁酸（7.1克，49毫摩尔）在二氯甲烷（162毫升）中的溶液中并在N₂下在室温下搅拌20小时。用20%柠檬酸水溶液（150毫升）淬灭，将混合物搅拌5分钟，分离层并用二氯甲烷（100毫升）从水层中萃取。用饱和碳酸氢钠水溶液（150毫升）洗涤合并的有机层，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩以获得10.6克浅黄色固体。通过用25-50%梯度乙酸乙酯/己烷洗脱的基于二氧化硅的快速柱色谱法提纯该残留物以获得白色固体形式的标题化合物（9.2克，94%）。MS (m/z): 304.2 (M+H)。

制备7

(2S)-2-(4,4,4-三氟丁酰基氨基)丙酸

在室温下在搅拌下将钯（1.8克，0.8毫摩尔，5%在C上）添加到通过制备6提供的中间体(2S)-2-(4,4,4-三氟丁酰基氨基)丙酸苄酯（8.8克，29毫摩尔）在甲醇（88毫升）中的溶液中。将该混合物脱气并在氢气（气球气氛）下搅拌5小时。经硅藻土过滤该混合物，用甲醇洗涤垫并浓缩滤液以获得白色固体。用二氯甲烷研制固体并在真空下在室温下干燥过夜以产生白色固体形式的标题化合物（6.11克，99%收率）。MS (m/z): 214.1 (M+H)。

制备8

3-(3,3-二甲基-2-硫代吡咯烷-1-基)丙酸甲酯

将3,3-二甲基吡咯烷-2-硫酮（15.7克，122毫摩尔）和丙烯酸甲酯（12毫升，134毫摩尔）溶解在四氢呋喃（100毫升）中并在氮气下在室温下搅拌。加入氢氧化钠（0.8克，20毫摩尔）并在氮气下在室温下搅拌过夜。用盐水稀释，用乙酸乙酯萃取，分离层，用盐水洗涤有机层，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以产生27.5克粗制固体。通过用20-50%梯度乙酸乙酯/己烷洗脱的基于二氧化硅的快速柱色谱法提纯该残留物以获得白色固体形式的标题化合物（25.9克，99%）。MS (m/z): 216.2 (M+H)。

制备9

3-[(2Z)-2-(2-乙氧基-2-氧代-乙叉基)-3,3-二甲基-吡咯烷-1-基]丙酸甲酯

在搅拌下将四(乙酸)二铑(II)（3.74克，8.5毫摩尔）添加到通过制备8提供的中间体3-(3,3-二甲基-2-硫代吡咯烷-1-基)丙酸甲酯（41.4克，192毫摩尔）在甲苯（156毫升）中的溶液中并在氮气下加热至110℃。经大约18小时逐滴加入重氮基乙酸乙酯（89毫升，844毫摩尔），然后在110℃下加热过夜。浓缩并通过用30%乙酸乙酯/己烷洗脱的基于二氧化硅的快速柱色谱法提纯该残留物以获得黄色油形式的标题化合物（34.5克，67%）。MS (m/z):270.2 (M+H)。

制备10

(2Z)-2-(3,3-二甲基吡咯烷-2-叉基)乙酸乙酯

使用保持温度<30℃的水/冰浴在氮气下在搅拌下将六甲基二硅基氨基钾（potassiumhexamethyldisilazide）（301毫升，0.5 M在甲苯中，151毫摩尔）经45分钟逐滴添加到通过制备9提供的中间体3-[(2Z)-2-(2-乙氧基-2-氧代-乙叉基)-3,3-二甲基-吡咯烷-1-基]丙酸甲酯（33.8克，126毫摩尔）在四氢呋喃（430毫升）中的溶液中。在添加完成后搅拌40分钟。用饱和碳酸氢钠水溶液（250毫升）淬灭，然后浓缩。在二乙醚和盐水溶液之间分配，用乙酸乙酯从水相中萃取（x 4），经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以获得37克材料。通过用10%乙酸乙酯/己烷洗脱的基于二氧化硅的快速柱色谱法提纯该残留物以获得标题化合物（9.1克，40%）。MS (m/z): 184.2 (M+H)。

制备11

(2Z)-2-[3,3-二甲基-1-(3-甲基-2-吡啶基)吡咯烷-2-叉基]乙酸乙酯

在反应容器中在1,4-二氧杂环己烷（15毫升）中合并2-溴-3-甲基吡啶（1.5克，8.7毫摩尔）、通过制备10提供的中间体(2Z)-2-(3,3-二甲基吡咯烷-2-叉基)乙酸乙酯（1.6克，8.7毫摩尔）和sym-二甲基乙二胺（0.77毫升，8.7毫摩尔）。在搅拌下将氮气鼓泡通过该溶液10分钟。一次性加入碳酸钾（3.6克，26毫摩尔）和碘化铜(I)（0.83克，4.4毫摩尔），密封并在120℃下加热搅拌混合物2天。用二氯甲烷稀释，经硅藻土过滤并浓缩滤液。通过用5-100%梯度乙酸乙酯/己烷洗脱的基于二氧化硅的快速柱色谱法提纯该残留物以获得浅黄色油形式的标题化合物（1.58克，66%）。MS (m/z): 275.0 (M+H)。

制备12

8,8-二甲基-9,10-二氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-6(8H)-酮

在搅拌下经注射器将双(三甲基甲硅烷基)氨基钠（22毫升，1M在四氢呋喃中，22毫摩尔）添加到在反应容器中的通过制备11提供的中间体(2Z)-2-[3,3-二甲基-1-(3-甲基-2-吡啶基)吡咯烷-2-叉基]乙酸乙酯（2.88克，10.5毫摩尔）和四氢呋喃（60毫升）的溶液中。密封容器并在搅拌下在70℃下加热3天。冷却至室温，用盐水淬灭，用乙酸乙酯萃取，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以获得棕色油。通过用50-100%梯度乙酸乙酯/己烷洗脱的基于二氧化硅的快速柱色谱法提纯该残留物以获得黄色固体形式的标题化合物（1.70克，71%）。MS (m/z): 229.2 (M+H)。

制备13

6-叠氮基-10-氮杂-3,3-二甲基-2,6-二氢-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮杂䓬-5-酮

在氮气下在搅拌下将二异丙基氨基锂（7.0毫升，10.5毫摩尔，1.5 M在己烷中）经10分钟添加到通过制备12提供的中间体8,8-二甲基-9,10-二氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-6(8H)-酮（1.85克，8.1毫摩尔）在四氢呋喃（50毫升）中的-78℃溶液中。在30分钟后经注射器加入乙酸（2.3毫升，41毫摩尔），然后允许在氮气下升温至室温。用饱和碳酸氢钠水溶液淬灭。在盐水和乙酸乙酯之间分配混合物，分离层，用盐水洗涤乙酸乙酯层，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以获得棕色固体。通过用5-60%梯度乙酸乙酯/己烷洗脱的基于二氧化硅的快速柱色谱法提纯该残留物以获得标题化合物（1.2克，55%）。MS (m/z): 270.2(M+H)。

制备14

5-氨基-3,3-二甲基-9,10-二氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-6(8H) -酮

在室温下在搅拌下将锌粉（1.2克，18毫摩尔），接着是氯化铵（5克，66毫摩尔）添加到通过制备13提供的中间体6-叠氮基-10-氮杂-3,3-二甲基-2,6-二氢-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮杂䓬-5-酮（1.2克，4.5毫摩尔）在乙醇（50毫升）和水（15毫升）中的溶液中。在1小时后，用乙酸乙酯稀释，滤出固体并浓缩滤液。将残留物悬浮在乙酸乙酯和盐水之间，分离层，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过用5-40%梯度[10% 2M氨/（甲醇/二氯甲烷）]/二氯甲烷洗脱的基于二氧化硅的快速柱色谱法提纯该残留物以获得黄色固体形式的标题化合物（0.72克，67%）。MS (m/z): 244.2 (M+H)。

制备15

N-[(1S)-2-[(10-氮杂-3,3-二甲基-5-氧代-2,6-二氢-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮杂䓬-6-基)氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯

在氮气下在搅拌下将(2S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸（0.69克，3.6毫摩尔）、1-羟基苯并三唑水合物（0.55克，3.6毫摩尔）和二异丙基乙胺（0.67毫升，3.9毫摩尔）添加到通过制备14提供的中间体5-氨基-3,3-二甲基-9,10-二氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-6(8H) -酮（0.72克，3.0毫摩尔）在四氢呋喃（10毫升）中的0℃溶液中。在氮气下加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（0.68克，3.6毫摩尔）并允许混合物升温至室温。在2小时后，用水稀释并用乙酸乙酯萃取。用盐水洗涤有机层，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过用50-100%梯度乙酸乙酯/己烷洗脱的基于二氧化硅的快速柱色谱法提纯该残留物以获得黄色固体形式的标题化合物（1.04克，84%）。MS (m/z): 415.0 (M+H)。

制备16

(2S)-2-氨基-N-(10-氮杂-3,3-二甲基-5-氧代-2,6-二氢-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮杂䓬-6-基)丙酰胺盐酸盐

在搅拌下将氯化氢（12.5毫升，50毫摩尔，4M在二氧杂环己烷中）添加到通过制备15提供的中间体N-[(1S)-2-[(10-氮杂-3,3-二甲基-5-氧代-2,6-二氢-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮杂䓬-6-基)氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯（1.04克，2.5毫摩尔）在1,4-二氧杂环己烷（40毫升）中的溶液中并在搅拌下升温至45℃。当LC/MS指示完全反应时，浓缩以获得黄色固体形式的标题化合物（0.93克，粗制）。MS (m/z): 315.2 (M+1)。

实施例1

4,4,4-三氟-N-((2S)-1-((9-甲氧基-3,3-二甲基-5-氧代-2,3,5,6-四氢-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-6-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丁酰胺

部分1

非对映体4,4,4-三氟-N-((2S)-1-((9-甲氧基-3,3-二甲基-5-氧代-2,3,5,6-四氢-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-6-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丁酰胺

在室温下在搅拌下将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（12.4克，65毫摩尔）添加到通过制备5提供的中间体6-氨基-9-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氢-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮杂䓬-5(6H)-酮和通过制备7提供的中间体(2S)-2-(4,4,4-三氟丁酰基氨基)丙酸（10.9克，51毫摩尔）在二氯甲烷（294毫升）中的溶液中。将混合物冷却至5℃，加入1-羟基苯并三唑（8.75克，65毫摩尔）并在室温下继续搅拌10分钟。用水（3 x 100毫升）洗涤混合物，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩以提供深色固体。用甲基叔丁基醚研制以提供灰白色固体形式的标题化合物（非对映体的混合物）（22.0克，87%）。MS (m/z): 468.1 (M+H)。

部分2

4,4,4-三氟-N-((2S)-1-((9-甲氧基-3,3-二甲基-5-氧代-2,3,5,6-四氢-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-6-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丁酰胺异构体1和2

在用10%乙腈/乙醇（0.2%二甲基乙胺）洗脱的Chiralpak AD柱上分离来自实施例1，部分1的非对映体混合物以获得白色固体形式的异构体1化合物（R_t=3.20 mins.）（9.8克，38%）和白色固体形式的异构体2化合物（Rt=7.37 mins.）（9.0克，36%）。这两种异构体的MS(m/z): 468.2 (M+H)。

实施例2

N-((2S)-1-((8,8-二甲基-6-氧代-6,8,9,10-四氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-4,4,4-三氟丁酰胺

部分1

非对映体N-{(1S)-2-[(8,8-二甲基-6-氧代-6,8,9,10-四氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-5-基)氨基]-1-甲基-2-氧代乙基}-4,4,4-三氟丁酰胺

在氮气下在搅拌下将4,4,4-三氟丁酸（0.45克，3.2毫摩尔）、1-羟基苯并三唑水合物（0.49克，3.2毫摩尔）和二异丙基乙胺（2.3毫升，13.2毫摩尔）添加到通过制备16提供的中间体(2S)-2-氨基-N-(10-氮杂-3,3-二甲基-5-氧代-2,6-二氢-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮杂䓬-6-基)丙酰胺盐酸盐（0.93克，2.6毫摩尔）在四氢呋喃（50毫升）中的0℃溶液中。加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（0.61克，3.2毫摩尔）并允许混合物在氮气下升温至室温16小时。用水稀释并用乙酸乙酯萃取。用盐水洗涤有机层，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过用75-100%梯度乙酸乙酯/己烷洗脱的基于二氧化硅的快速柱色谱法提纯该残留物以获得灰白色固体形式的标题化合物（非对映体的混合物）（0.82克，71%）。MS (m/z): 439.2 (M+1)。

部分2

N-((2S)-1-((8,8-二甲基-6-氧代-6,8,9,10-四氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-4,4,4-三氟丁酰胺异构体1和2

在用15% MeOH/CO_2(气体)洗脱的Chiralpak AD-H柱上分离来自实施例2，部分1的非对映体混合物以获得白色固体形式的异构体1（R_t=1.60 mins.）（194毫克，24%，差向异构至32%DE（非对映体过量））和白色固体形式的异构体2（R_t=2.31 mins.）（469毫克，57%）。这两种异构体的MS (m/z): 439.0 (M+H)。

癌症越来越被认为是疾病的异类集合，所述疾病的开始和发展通过一种或多种调节细胞和组织微环境中的DNA修复、基因组稳定性、细胞增殖、细胞死亡、粘附、血管生成、侵入和转移的基因的异常功能诱导。“癌症”基因的变异或异常功能可能由天然存在的DNA多态性、基因组拷贝数的变化(通过扩增、缺失、染色体缺失或复制)、基因和染色体结构的变化(通过染色体易位、倒位或其它导致失控的基因表达的重排)和点突变产生。癌肿瘤可能由一种异常基因功能诱导，并由相同的异常基因功能维持，或者维持和发展由另外的异常基因功能加重。

除了上述遗传染色体畸变之外，各个癌症还可包括基因组的表观遗传修饰，包括DNA甲基化，基因组印迹和通过乙酰化、甲基化或磷酸化进行的组蛋白修饰。表观遗传修饰可在恶性肿瘤的诱导和/或维持中发挥作用。

人癌症中细胞遗传学异常的广泛目录已被汇集并被在线维护和定期更新(参见The Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer at the US NationalCancer Institute(NCI) Cancer Genome Anatomy Project(CGAP))。数据库包括至少一些本发明的恶性肿瘤的染色体畸变。Wellcome Trust Sanger Institute Cancer GenomeProject维护了与肿瘤发生有因果联系的所有人基因的详细在线“癌症基因普查”以及人癌症中的体细胞突变的COSMIC(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer)数据库。包含与多种癌症有因果联系的细胞遗传学变化的丰富信息的另外来源为Atlas of Geneticsand Cytogenetics in Oncology and Haematology。

通过活组织检查、免疫表型和其它试验诊断癌症恶性肿瘤是已知和常规使用的。除了高分辨率染色体显带和高级染色体成像技术之外，能通过细胞遗传学分析如荧光原位杂交(FISH)、核型分析、光谱核型分析(SKY)、多重FISH(M-FISH)、比较基因组杂交(CGH)、单核苷酸多态性阵列(SNP芯片)和本领域技术人员已知和使用的其它诊断和分析试验确定癌症疑似病例中的染色体畸变。

Notch的致癌作用最早在人T-细胞白血病中报道，其涉及Notch1胞内结构域易位至T-细胞受体-β启动子区域，这导致Notch1胞内结构域的过度表达(Grabher等人，Nature Review Cancer，2006(6):347-359；Weng等人，Science，2004(306):269-271)。Notch1胞内结构域在小鼠造血祖细胞中的过度表达导致小鼠表现与人类相似的T-细胞急性淋巴细胞白血病。除了T-细胞急性淋巴细胞白血病之外，有越来越多的证据表明Notch信号通过包括受体扩增和配体和/或受体的过度表达的多重机制而在其它癌症中是致癌的，所述癌症包括急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病（Rosati等人, Blood, 2009(113): 856-865）、急性髓细胞白血病（Sliwa等人Int J Clin Exp Pathol, 2014(7(3)): 882-889）、慢性髓细胞白血病（Nakahara等人Blood, 2010(115(14)): 2872-2881）和红白血病（Robert-Moreno等人, Leukemia, 2007(21): 1496-1503）。归因于配体和/或受体突变或过度表达的异常的组成性Notch信号传导也牵涉到许多恶性实体瘤，包括三阴性乳腺癌（Stoeck等人, Cancer Discovery, 2014(4): 1154-1167）、乳腺癌、卵巢癌（Park等人Cancer Research, 2006(66):6312-6318）、黑素瘤（Gast等人Genes, Chromosomes & Cancer,2010(49):733-745）、肺癌、非小细胞肺癌（Westhoff等人PNAS, 2009(106):22293-22298）、胰腺癌、胶质母细胞瘤、结肠直肠癌、头颈癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、鳞状上皮细胞癌（口腔）、皮肤癌和成神经管细胞瘤（Ranganathan等人, Nature Review Cancer, 2011(11):338-351和Supplementary Information S1（表））。归因于配体和/或受体突变或过度表达的异常的组成性Notch信号传导也牵涉到血管肉瘤（Ravi等人, J Clin Oncol, 2007, (25(18S, 6月20日增刊)): Abstract 10030）、横纹肌肉瘤（Belyea等人, Clin Cancer Res,2011(17(23)): 7324-7336；Roma等人, Clin Cancer Res, 2011(17(3)): 505-513）、脂肪肉瘤（J Clin Oncol, 2009, (27(15S, 增刊)): 摘要10526）、恶性纤维组织细胞瘤（Wang等人, Cancer Res, 2012, (72): 1013-1022）、肝细胞癌（Villanueva等人,Gastroenterology, 2012, (143): 1660-1669）、肝内和肝外胆管癌（Wu等人, Int J Exp Pathol, 2014, (7(6)): 3272-3279；Sekiya等人, J Clin Invest, 2012, (122(11)):3914-3918；Yoon等人, World J Gastroenterol, 2011, (17(35)): 4023-4030）和腺样囊性癌（Bell等人, Annals of Diagnostic Pathology, 2014, (18): 10-13；Stoeck等人,Cancer Discov, 2014, (4): 1154-1167）。Notch信号传导的抑制代表为其疾病由组成性Notch信号传导通路的异常活化诱发的癌症患者提供治疗益处的有吸引力的目标。Shih等人Cancer Research, 2007(67)1879-1882。

内耳毛细胞发育的决定性基因之一是碱性螺旋-环-螺旋转录因子atonal-1的哺乳动物同源物（Atohl）。耳蜗细胞中的Atohl表达是听毛细胞发生所需的。发育中的表达Atohl的柯蒂氏器官内的前感觉上皮细胞分化成听毛细胞（Helms等人, Development2000, (127(6)): 1185-1196），且Atohl是听毛细胞分化的最早标记物之一。柯蒂氏器官的支持细胞保持形成毛细胞特征，包括纤毛形成（Zheng等人, Nature Neuroscience, 2000,(3(6)): 580-586；Kawamoto等人, J Neurosci, 2003, (23(11)): 4395-4400；Izumikawa等人, Nat Med, 2005, (11(3)):271-276）的潜力；和适当的毛细胞功能（Kawamoto等人,2003）。

耳蜗中的各毛细胞被非感觉支持细胞包围，其为毛细胞和神经节提供营养和结构支持并且是通过间隙连接细胞间通讯维持柯蒂氏器官中的适当离子浓度所必需的。有两种类型的毛细胞：内和外毛细胞。哺乳动物，包括人类的耳蜗毛细胞由一行内毛细胞和三行外毛细胞构成。内毛细胞是实际感觉受体，并且95%的伸向脑的听神经纤维来源于这一亚群。外毛细胞上的终端几乎都来自来源于脑中的细胞的传出轴突并且这些细胞充当声音前置放大器。支持细胞在听毛细胞损失或损伤后的听毛细胞生成中起到关键作用。在发育过程中，毛细胞和支持细胞由共同的祖细胞发育而来并且毛细胞的出现通过Notch信号传导通路介导的接触抑制向周围细胞发出信号以发育成支持细胞（Kelley, Nat Rev Neurosci,2006, (11): 837-849）。

基于支持细胞转分化成听毛细胞的能力，以及它们共有的发育路径，已经推定支持细胞可充当毛细胞祖细胞（Parker等人, Audiology and Neurootology, 2004, (9(2)): 72-80）。若干研究已证实绕开支持细胞中的细胞周期抑制可导致哺乳动物中的听毛细胞生成（Lowenheim等人, Proc Natl Acad Sci USA, 1999, (96): 4084-4088；Torchinsky等人, J Neurocytol, 1999, (28(10-11)): 913-924；Minoda等人, Hear Res, 2007, (232): 44-51）。因此成年哺乳动物支持细胞保持一旦自由进入细胞周期就转分化成听毛细胞的能力。

用于修复听毛细胞的药物疗法是一种新方法并且鼓室内给药至中耳液，优选给药至圆窗龛而不实际注射到耳蜗中可以以治疗剂量和合适的时长有效诱发Atoh1表达以引起耳蜗中的支持细胞的听毛细胞转分化。Mizutari等人, Neuron, 2013, (77(1)): 58-69表明，γ分泌酶抑制剂（LY411575）的中耳递送可用于在小鼠中再生由于声创伤损失的听毛细胞并且这种由支持细胞生成新的毛细胞导致显著、可测量的听力恢复。这一著作提供Notch通路信号传导抑制在小鼠模型中对听毛细胞生成和听力恢复的治疗效果的概念证据，并提供对该生理效应的机理（支持细胞分化成听毛细胞）解释。在LY411575的全身给药过程中表现出剂量限制性毒性。

下列体外和体内研究证明化合物1和2或其基本纯的非对映体对特定癌细胞系的Notch通路信号传导抑制活性和功效。这些检测通常被本领域技术人员公认为人临床化疗活性的指示。认为通过γ-分泌酶抑制Notch胞内结构域裂解对各个Notch 1、Notch 2、Notch 3和Notch 4受体有效。可基本上如下所述或通过产生相似数据的相似检测进行证实Notch通路信号传导抑制活性和功效的检测。

Notch1 N1ICD核积累细胞成像检测

在96孔板中，将HEK293ΔE12细胞(设计HEK293细胞稳定表达小鼠Notch1 cDNA，其编码氨基酸1703-2183、NP_032740.3(全长小鼠Notch1蛋白质前体：SEQ ID NO:1)，其中23个氨基酸信号肽序列，MPRLLTPLLCLTLLPALAARGLR(SEQ ID NO:2)，在它的N-端)以5000细胞/孔平板接种，在37℃，5% CO₂下在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)-具有5%胎牛血清(FBS)的高葡萄糖中培养24小时。用受试化合物处理细胞，在1000 nM至0.05 nM的范围内以1:3稀释在10点给药，并且最终二甲亚砜(DMSO)浓度为0.2%。在24小时处理之后，相继通过下列步骤处理细胞板：在室温(RT)下使用100µl/孔PREFER™固定剂固定细胞30分钟；在室温下使用100 µl/孔 0.1% TRITON® X100（于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中）渗透细胞20 min；每个使用100 µl/孔 PBS洗涤3次；以1:2000添加在具有1%牛血清白蛋白的PBS中的50 µl/孔兔抗N1ICD(Notch1胞内结构域)抗体并在37℃下培养1.5小时；每个使用100 µl/孔 PBS洗涤3次；使用在具有1%牛血清白蛋白的PBS中的以1:1000稀释的50 µl/孔羊抗兔IgG（免疫球蛋白G）Alexa 488培养并在37℃下培养1小时；每个使用100 µl/孔 PBS洗涤3次并添加100 µl/孔的具有50µg/ml RNAse的15 µM碘化丙啶达30分钟以染色核。使用ACUMEN EXPLORER™激光扫描荧光微孔板细胞分析仪(TTP LABTECH LTD)扫描板以测量总细胞核计数/孔和总核面积/孔，荧光为655 nm-705 nm(DNA结合碘化丙啶的发射)和在505 nm-530 nm的与核区域中的N1ICD结合的抗体的荧光。主要检测产物为核N1ICD的总荧光与总核面积的比，归一化核N1ICD信号。以相对0.2% DMSO对照细胞的%细胞数形式收集相对细胞毒性分析。使识别裂解的Notch1或N1ICD的抗体成为相应于在Val1744处人Notch1的氨基端裂解位点的人肽。在未处理的对照细胞中，从Notch1产生的N1ICD在核中易位和积累。当通过Notch 1裂解抑制化合物处理细胞时，核N1ICD的信号减少。通过对核N1ICD信号曲线拟合为四参数对数测定浓度反应和IC₅₀，同时在相同的曲线图中绘制%细胞数用于细胞毒性分析。基本上如上所述进行检测，化合物1，异构体2的平均IC₅₀为0.37 nM(+/- 0.16；n=2)且化合物2，异构体2的平均IC₅₀为1.55 nM(+/- 1.12；n=2)。化合物不影响细胞数，高达1000 nM浓度。这些数据证明化合物1，异构体2和化合物2，异构体2各自具有对Notch 1的亲合力并且抑制Notch 1胞内结构域细胞信号传导肽的细胞内积累。

体内靶向抑制研究

动物研究

为了评估化合物1，异构体2和化合物2，异构体2对抑制Notch处理（processing）药效动力学（PD）的体内效果，在非荷瘤Balb/C小鼠（Charles River）中进行动物研究。各组使用总计5只小鼠。小鼠随意饲喂正常饮食。通过以0.2毫升体积口服给药（灌胃）化合物或载体（在0.25% Tween-80中的1% Na-CMC），开始处理。在处理后的指定时间点（给药后4或8小时），通过CO₂窒息和颈脱位法处死动物。取出组织（肺）并用于通过裂解N1ICD测量的PD响应分析。

N1ICD分析

为了评价肺中的N1ICD水平，从冷冻组织中切下约75 mg并在均质化(记录实际质量)之前切碎。将冷冻肿瘤样品转移至裂解Matrix-D™管并以75 mg/ml缓冲液的质量:体积比重新悬浮在包含1X Complete片(Roche Complete™ No. 11697 498 001)和1X蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich P8340)的冰冷XY裂解缓冲液(25 mM Tris pH 7.5、10 µg/ml胰蛋白酶/糜蛋白酶抑制剂、10 µg/ml抑肽酶、60 mM β-甘油磷酸、1% Triton® X-100、10 mMNaF、2.5 mM焦磷酸盐、150 mM NaCl、15 mM 乙二胺四乙酸(EDTA) pH 8.0、5 mM 乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N’,N’-四乙酸(EGTA) pH 8.0、1 mM钒酸钠、10 µg/ml 亮抑肽酶、1mM二硫苏糖醇、1 µM微囊藻素LR、10 µg/ml N-对甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸氯甲基酮(TPCK)、2 mM Nα-对甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯盐酸盐(TAME)、15 mM 4-硝基苯基磷酸二(三)盐(PNPP)、0.1 mM 4-(2-氨基乙基)苯磺酰基氟盐酸盐(AEBSF)、5 mM苄脒、1 µM 冈田酸)中。在4℃下将组织在Fast Prep FP120均质机(Thermo Scientific, Rockford, IL)中以6.0的速率均质30秒，随后在冰上孵育15分钟。将该操作重复总共2-3个循环直至均质完全。将裂解物在4℃eppendorf离心机中以30,000 rpm旋转15分钟以去除碎片。去除400 µl的上清液并转移至新的eppendorf管并使其进行冷冻/解冻循环。将样品在4℃eppendorf离心机中以30,000 rpm再旋转30分钟并收集120 µl的上清液用于分析。使用Thermomax™读板仪(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)，用Pierce BCA Protein Assay Kit™(Thermo Scientific, Rockford, IL)测定总蛋白质浓度。使用定制N1ICD ELISA测定N1ICD水平。使用裂解的Notch1(Val1744)-特异性定制兔单克隆抗体捕获分析物并使用C-端Notch1 SULFO-TAG®(Meso Scale Diagnostics, Gaithersburg, Maryland)多克隆羊抗体(R&D Systems, Minneapolis, MN)检测。在包含1X Complete片(Roche Complete™mini No. 11 836 153 001)和1X蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Aldrich P8340)的冰冷ELISA tris裂解缓冲液(R6OTX)(Meso Scale Diagnostics, Gaithersburg, Maryland)中将裂解物稀释至2 µg/µl，并将25 µl加入至ELISA板。在室温下进行各个50 µg蛋白质裂解物的孵育1小时以捕获分析物和检测抗体。在Sector Imager 6000™(Meso ScaleDiscovery, Gaithersburg, Maryland)上读板。背景去除的N1ICD归一化为总蛋白质并且表示为相对于溶媒处理组的%抑制。基本上如上所述分析在最后给予化合物1，异构体2或化合物2，异构体2之后4小时收获的肿瘤中通过Dunett方法测定的N1ICD%抑制和统计显著性(p值)并在表1中概述概括。

表1中的数据证实在小鼠肺组织中通过化合物1，异构体2和化合物2，异构体2抑制N1ICD裂解。表1中的数据进一步提供与上述功能活性数据的体内相关性。

耳球体（Otic Spheres）中的 mAtoh1表达的诱导

通常，在第0天，基本通过Oshima等人, Methods Mol Biol., 2009；493: 141–162中的方法进行柯蒂氏器官细胞分离。进行细胞培养和繁殖3-4天。在第3或4天进行细胞平板接种（plating）和受试化合物处理。允许经过接下来的7天发生附着和分化。在第10或11天，进行细胞裂解和RNA分离。在第12天进行TaqMan qRT-PCR并在第13-15天分析Atoh1和Tbp1表达的结果。

细胞的分离

从两种性别的1至4日龄的新生小鼠（转基因品系: mAtoh1-driven nGFP；Lumpkin EA等人, Gene Expr Patterns, 2003；(36): 389-95）中除去来自颞骨岩部的周围组织。使用镊子从前庭系统中分离海螺形耳蜗。在这一发育阶段，骨迷路没有完全钙化并容易使用镊子剖开。小心打开耳蜗的骨迷路并通过从耳蜗轴向顶部解卷移除沿耳蜗轴的螺旋卷在一起的螺旋韧带和附着的柯蒂氏器官。从底部开始，使用精细镊将螺旋韧带与柯蒂氏器官分离。

将切除的柯蒂氏器官（OC）转移到装有850微升冰冷HBSS的独立的1.5毫升管中。将最多12个OC组织转移到同一个管中。快速旋转（Quick-spin down）OC组织并除去HBSS。通过添加100微升预热的TrypLE^TM Select（Life Technologies）离解细胞并在37℃下培养13分钟。快速旋转离解的OC组织。除去TrypLE^TM Select。加入100微升培养基A（DMEM/F12, N2supplement (LifeTechnologies、B27 supplement (LifeTechnologies)、氨苄西林(50µg/ml)和两性霉素B(LifeTechnologies)、EGF (20 ng/ml)、bFGF (10 ng/ml)、IGF-1 50 ng/ml)和硫酸乙酰肝素(50 ng/ml)）。随后用P200吸管端研制切除和消化的组织。除去任何细胞团块和碎屑；转移该细胞悬浮液并通过预湿70 μm细胞滤网（cell strainer）洗涤以将细胞悬浮液汇集在单个新鲜培养管中。用足够的培养基A冲洗离解管和细胞滤网并与细胞悬浮液汇集。用血细胞计数器或Countess®（Life Technologies）计数细胞密度。将新鲜培养基A添加到细胞悬浮液中以实现1.0E5个细胞/毫升的最终平板接种密度并平板接种到超低吸附培养器皿T-75（Greiner）中。

悬浮培养以繁殖OC球体（spheres）

将离解的单细胞在超低吸附培养器皿（Greiner）中在培养基A中在5% CO₂加湿培养器中在37℃下培养3至4天以由漂浮细胞获得克隆生长球体，被称作第一代球体。如果细胞在培养期过程中粘着到非贴壁皿（non-adherent dishes）上，它们可通过温和混合剥落。

贴壁培养和处理

在将球体培养3-4天后，通过显微镜目测计数球体以将用于这一步骤的每毫升耳球体的接种密度标准化。通过离心收集细胞并将球体以每毫升大约2000个球体的浓度再悬浮在基础培养基中。以细胞培养物处理过的96孔板的每孔150微升的体积接种球体以获得每孔大约300个球体。以在基础培养基（DMEM/F12, N2 supplement (LifeTechnologies) B27supplement (LifeTechnologies)、氨苄西林（50 µg/ml）和两性霉素B(LifeTechnologies)）中200微升的最终体积一式四份用实验试剂处理球体。在加湿的温度受控培养器中在5% CO₂，37℃下培养经处理的球体7天。除去培养基并继续RNA提取。

RNA提取

加入补充了1% β-巯基乙醇的缓冲液RLT plus (Qiagen)，每孔175微升。在RNA提取前将2.5微升在缓冲液RLT Plus中稀释的4 ng/µl RNA载体（RNeasy® Plus Micro Kit；Qiagen ）添加到各孔中。使用RNeasy® Plus Micro Kit (Qiagen)根据制造商的说明书提取总RNA。

cDNA合成

使用SuperScript® III First-Strand Synthesis System (LifeTechnologies, 目录18080-051)根据制造商的程序使用用于cDNA合成的随机六聚体进行cDNA合成。通过添加21微升超纯无核酸酶水稀释cDNA 50%。5微升经稀释的cDNA用于qPCR。

qPCR

为了量化来自经处理的球体培养物的毛细胞标记物的表达，在单个双色多重反应中用检测相关基因mAtoh1和内源性对照基因的探针进行qPCR。根据制造商的说明书使用TaqManGene Expression Master Mix（LifeTechnologies, 4369016）和相关探针（Atoh1；Mm00476035_s1）和内源性对照探针（Tbp1；Mm00446971_m1, LifeTechnologies）。对于各探针，条件保持恒定。使用∆∆C_T方法分析处理组之间的相对基因表达并得出重复测量结果的平均值。一式三份、在最低限度上进行实验，并报道为总平均值（grand mean）。

表2

化合物	在10 nM下的 RQ	在100 nM下的 RQ	在1 µM下的 RQ
				1, 异构体2	1.43±0.17^*	1.76±0.17^*	1.64±0.13^*
2, 异构体2	1.14±0.07	1.21±0.13	1.57±0.11^*

表2中的数据显示在用各化合物1，异构体2和化合物2，异构体2以三种浓度（10nM、100nM和1µM）处理的耳球体中Atoh1（毛细胞生成的标记物）表达的相对定量值（RQ）。数据（± 平均值的标准误差，SEM）代表相对于阴性对照（DMSO载体）处理样品的基因表达倍数诱导（fold-induction）。（^*，与阴性对照的显著差异，p˂0.05）。

人肿瘤细胞系中的hAtoh1表达的诱导

为了评估化合物1，异构体2和化合物2，异构体2在其诱导hAtoh1表达的能力方面的效力，使用人肿瘤细胞系。用于这种细胞系的内源性Notch信号传导调节类似于在内耳中的调节。通常，根据Kazanjian等人, Gastroenterology, 2010, 139(3): 918-928和补充材料和方法中的原理进行这一检测。

通常，使用标准细胞培养技术。将保存在生长培养基（Growth Medium）（MEM 10%FBS）中的低传代人结肠直肠腺癌细胞系LS174T（ATCC CL-188）以每孔中在100 µl检测培养基（Assay Medium）（MEM 1% FBS）中10,000个细胞平板接种到96孔组织培养物处理的板中。

第二天，进行10 mM储液受试化合物（在100% DMSO中稀释）的半对数连续稀释以获得药物化合物的11个递减剂量。最终浓度跨越10 µM至0.127 nM。使用3.16倍连续稀释，在每孔中使用100%的DMSO浓度。在检测培养基中进行初始DMSO稀释的进一步1:10稀释。再另外1:100稀释到检测培养基中。

将100微升受试化合物稀释物添加到含有细胞和Growth Media的各孔中并在5%CO₂中在37℃下生长72小时。

在第4天从板中收集细胞并使用RNeasy® Plus 96 RNA (Qiagen)根据制造商的程序提取和提纯RNA。

使用SuperScript® III First-Strand Synthesis System(LifeTechnologies, 18080-051)根据制造商的程序使用用于cDNA合成的随机六聚体进行cDNA合成。通过添加21微升超纯无核酸酶水将cDNA稀释 50%。5微升经稀释的cDNA用于qPCR。

qPCR

为了量化来自经处理的球体培养物的毛细胞标记物的表达，在单个双色多重反应中用qPCR探针检测hAtoh1或TBP表达。为了测量各样品的相对基因表达，根据制造商的说明书使用TaqMan Gene Expression Master Mix（LifeTechnologies, 4369016）和相关探针（人Atoh1；LifeTechnologies Assay Id Hs00944192_s1）+内源性对照物（人TBP；LifeTechnologies Assay Id Hs00427620_m1）。对于各探针，条件保持恒定。使用∆∆C_T方法分析处理组之间的相对基因表达并得出重复测量结果的平均值。

对各受试化合物进行四个单独检测以获得IC₅₀值。通过使用GraphPad Prism®软件对4.0E-11至1.0E-6 M浓度范围内的12个剂量将浓度响应数据拟合至“log(拮抗剂) vs.响应(三参数)”模型，测定IC₅₀值，对各化合物分析总共108个点。化合物1，异构体2和化合物2，异构体2的IC₅₀值显示在表3中。

表3

化合物	IC₅₀ nM
		1, 异构体2	16.64
2, 异构体2	54.34

表3中的数据显示通过在这一检测中的hAtoh1（听毛细胞生成的标记物）的相对表达计算出的化合物1，异构体2和化合物2，异构体2的IC₅₀值。

在柯蒂氏器官外植体检测中对化合物的响应

通常，在第0天，根据Parker等人, Journal of Visualized Experiments, 2010,(36), e1685中描述的方法进行柯蒂氏器官的器官型外植体培养。外植体培养进行4-7天，此时将培养物制备用于qRT-PCR的细胞裂解或用于免疫组织化学的组织固定。

柯蒂氏器官外植体的分离和培养

从两种性别的1至4日龄的新生小鼠（转基因品系: Atoh1-driven nGFP；Lumpkin EA等人, Gene Expr Patterns, 2003；(36): 389-95）中除去来自颞骨岩部的大泡（bulla）和周围组织。在Hanks溶液中剖开柯蒂氏器官，移除螺旋韧带并将外植体置于用聚-L-鸟氨酸（0.01%, Sigma）和层粘连蛋白（50 mg/ml, Becton Dickinson）涂布的盖玻片上以获得具有平耳蜗表面的制品。然后将各耳蜗外植体置于24孔板（Falcon）的单孔中并在含5%胎牛血清、5%马血清和青霉素-链霉素（LifeTechnologies）的DMEM（Invitrogen）中培养。在第0天与培养基一起加入实验化合物并且每2-3天更换。将所有培养物保存在37℃的5% CO₂加湿培养器中。

通过qRT-PCR分析基因表达

通过用每孔350µl RLT Plus缓冲液(Qiagen)裂解外植体组织，进行RNA提取，并通过RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen)提纯全部RNA。用SuperScript® III First-StrandSynthesis System (LifeTechnologies)使用随机六聚体进行cDNA合成。为了量化毛细胞标记物表达的诱导，用TaqMan Gene Expression Master Mix（LifeTechnologies,4369016）和检测相关基因（例如hAtoh1；Assay ID Mm00476035_s1, Pou4f3；Assay IDMm04213795_s1和Myo7a；Assay ID Mm01274015_m1, LifeTechnologies）和内源性对照基因Tbp（Assay ID Mm00446971_m1, LifeTechnologies）的探针进行qPCR。使用∆∆C_T方法分析处理组之间的相对基因表达并得出重复测量结果的平均值。一式三份、在最低限度上进行实验，并报道为总平均值。

表4

化合物	Atoh1	Pou4f3	Myo7a
				1, 异构体2	3.72±0.54	2.04±0.35	1.73±0.33
2, 异构体2	3.10±0.69	1.65±0.25	1.49±0.22

表4中的数据显示在用化合物1，异构体2和化合物2，异构体2以1µM处理的柯蒂氏器官外植体中毛细胞生成标记物；Atoh1、Pou4f3和Myo7a的表达的相对定量值（RQ）。数据（±SEM）代表相对于阴性对照处理样品的基因表达的倍数诱导。

新的表达Atoh1的毛细胞的免疫染色

在外植体培养后，将组织在24孔板中用200µl Cytofix/Cytoperm (BD)固定30分钟，用含TritonX100的PBS（PBST）冲洗并用由在含羊抗-GFP（1:2500；AbCAM, ab5450）和兔抗-肌球蛋白VIIa（1:1000；Proteus Bioscience #25-6790）的PBST中的4%正常驴血清构成的200微升一抗溶液染色1小时。然后将该组织用PBST充分洗涤并用由Alexa Fluor 488驴抗羊IgG（1:1000；Invitrogen, A-11055）和Alexa Fluor 568驴抗兔IgG（1:1000；Invitrogen,A10042）构成的二抗溶液染色1小时。然后将它们用PBST充分洗涤并安置在显微镜载玻片上。通过Atoh1-替代标记物GFP（绿）和肌球蛋白VIIa（红）的表达识别独立毛细胞，成像，然后在中顶部（mid-apex）区在100 µM长度内计数以检查实验化合物处理样品中的新生毛细胞的形成——与未处理或阴性对照（无生物活性化合物）处理样品中的毛细胞数相比。在五个单独实验中测量盲（Blinded）细胞计数。

表5

化合物	外毛细胞数(每100µM)	提高百分比
			1, 异构体2	50.4±4.9	14.15±1.9%
2, 异构体2	55.8±3.1	17.26±1.2%

表5中的数据显示在1 µM的化合物1，异构体2 (n=13)或化合物2，异构体2 (n=15)存在下培养4天并进行GFP（替代Atoh1标记物）和肌球蛋白VIIa免疫染色的柯蒂氏器官外植体中的外毛细胞数。毛细胞的提高百分比是相对于阴性对照处理的样品（n=18）。

耳毒性损伤后的基因表达分析

使用柯蒂氏器官的器官型外植体培养物的变体模拟在耳毒性损伤后响应后续化合物处理的毛细胞再生。这一损伤模型根据Korrapati等人, PLOSOne, 2013, 8(8), e73276中描述的方法进行，其中报道了中顶部毛细胞的95%减少。在第0天，为了破坏和选择性杀死柯蒂氏器官外植体内的毛细胞，加入氨基糖苷处理（庆大霉素(100 µM)）18-24小时。在第1天，除去庆大霉素并开始用5 µM的化合物1，异构体2和化合物2，异构体2处理。外植体培养持续总共4天，此时该培养物制备用于上述qRT-PCR程序。在用阴性对照化合物处理的培养物之间容易观察到庆大霉素诱发的损伤的明显证实。但是，通过qRT-PCR获得的对耳毒性损伤后的化合物1，异构体2和化合物2，异构体2处理的响应的定量测量测得前感觉毛细胞标记物Atoh1和Pou4f3和毛细胞标记物Myo7A的基因表达提高。

表6中的数据显示在庆大霉素（100 µM）损伤后用5 µM的化合物1，异构体2和化合物2，异构体2处理的柯蒂氏器官外植体中，通过qRT-PCR测得的毛细胞生成标记物Atoh1、Pou4f3和Myo7a的基因表达的相对提高。数据代表相对于庆大霉素诱发的毛细胞损伤的阴性对照处理样品的基因表达提高百分比（^*，与阴性对照的显著差异，p˂0.05）。

全耳囊培养物中的毛细胞标记物诱导

大致根据Parker等人, Journal of Visualized Experiments, 2010, (36), e1685中描述的方法从两种性别的1至4日龄的新生小鼠（转基因品系: Atoh 1-driven nGFP；Lumpkin EA等人, Gene Expr. Patterns, 2003, 3(4): 389-95）中切除由耳蜗骨迷宫和前庭系统构成的耳囊（耳囊外植体）。从顶骨中分离整个耳囊并在转管培养系统中在含有DMEM、高葡萄糖、5% FBS、5%马血清、1µg/ml氨苄西林的培养基中离体保存最多3天。

使用该耳囊外植体评估在各种递送载体中的渗透入内耳中的受试化合物。用化合物1，异构体2（7.2 mM）在各种递送载体中的组合物进行试验。将小体积（100-200 nl）直接施加到耳蜗的圆窗龛。切除耳蜗，处理，培养1-2小时，然后输入转管培养。在48小时后，打开耳囊外植体以从耳蜗的骨迷路中取出柯蒂氏器官并通过RT-PCR检测。

允许该组合物保留1-2小时，然后用培养基洗掉。然后将耳囊外植体在未处理的培养基中培养48小时。打开耳蜗，然后剖出整个柯蒂氏器官，并制备用于定量RT-PCR以测量Atoh1毛细胞标记物表达水平（如上文的柯蒂氏器官外植体检测中所述）。表7显示在指定递送载体中的Atoh1诱导。在培养48小时后，与仅载体的对照处理耳囊外植体相比，测得在所有受试组合物中通过化合物1，异构体2上调Atoh1（2-3倍，n为12-17）。

表7: Atoh1基因表达(RT-PCR)

	45-70% PEG (聚乙二醇 400)	10% Poloxamer (Pluronic^® F108)	20% Poloxamer (Pluronic^® F108)	1-2%透明质酸
					液态	粘性液体	粘性液体	凝胶	凝胶
受试化合物溶解度	清澈溶液	悬浮液	悬浮液	悬浮液
					平均倍数诱导	2.933	2.398	2.612	2.459
SEM	0.3193	0.2653	0.4441	0.2567
					P值	<0.0001	0.0002	0.0019	0.0001

体内外淋巴液受试化合物吸收到内耳中

将雌性白化Hartley豚鼠（Charles River, France）用氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物麻醉，然后通过经鼓室途径注射70微升在上文对全耳囊培养检测所述的组合物形式的化合物1, 异构体2以完全填满中耳。在注射后0.5、1、6、24和48小时提取外淋巴液（内耳液）样品并通过LCMS（n为5）检测受试化合物的浓度。表8显示受试化合物在用这些递送载体经鼓室给药至中耳后吸收到内耳中。

表8: 体内外淋巴液水平

	70% PEG (聚乙二醇 400)	10% Poloxamer (Pluronic® F108)	20% Poloxamer (Pluronic® F108)	1%透明质酸
					Cmax (µM) ±SEM	327.1± 93	753.0 ±306	1926.2 ±493	187.3 ±113
Cmax时间	1 hr	30 min	30 min	1 hr
					外淋巴液中的%施加的受试化合物	1.04	2.39	6.11	0.59
R平方	0.5262	0.7640	0.5600	0.4229
					AUC (µmol.hr.L^-1)	1451	7002	8634	2711

氨基酸序列

SEQ ID NO:1 (小鼠Notch 1蛋白质前体；全长)

SEQ ID NO:2 (信号肽)

Claims

1.具有下列结构的化合物：

4,4,4-三氟-N-((2S)-1-((9-甲氧基-3,3-二甲基-5-氧代-2,3,5,6-四氢-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-6-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丁酰胺、其基本非对映体纯的异构体或上述任一种的可药用盐。

2.具有下列结构的化合物：

N-((2S)-1-((8,8-二甲基-6-氧代-6,8,9,10-四氢-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮杂䓬-5-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-4,4,4-三氟丁酰胺、其基本非对映体纯的异构体或上述任一种的可药用盐。

3.包含权利要求1或2的任一种化合物或其基本纯的非对映体或其可药用盐和可药用载体的药物组合物。

4.治疗患者的癌症的方法，所述癌症是T-细胞急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、红白血病、三阴性乳腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、结肠直肠癌、头颈癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、口腔鳞状细胞癌、皮肤癌、成神经管细胞瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、肝细胞癌、肝内和肝外胆管癌和腺样囊性癌，其包括将治疗有效量的权利要求1或2的任一种化合物或其基本纯的非对映体或其可药用盐给药至需要其的患者。

5.治疗需要其的患者的肺癌的方法，其包括给药治疗有效量的权利要求1或2的任一种化合物或其基本纯的非对映体或其可药用盐。

6.治疗需要其的患者的由听毛细胞损失造成的感音神经性听力损失的方法，其包括将治疗有效量的权利要求1或2的任一种化合物或其基本纯的非对映体或其可药用盐给药至所述患者。

7.诱导需要其的患者的听毛细胞生成的方法，其包括将治疗有效量的权利要求1或2的任一种化合物或其基本纯的非对映体或其可药用盐给药至所述患者。

8.用于治疗的权利要求1或2的化合物或其基本纯的非对映体或其可药用盐。

9.用于治疗T-细胞急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、红白血病、三阴性乳腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、结肠直肠癌、头颈癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、口腔鳞状细胞癌、皮肤癌、成神经管细胞瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、肝细胞癌、肝内或肝外胆管癌或腺样囊性癌的权利要求1或2的化合物或其基本纯的非对映体或其可药用盐。

10.用于治疗肺癌的权利要求1或2的化合物或其基本纯的非对映体或其可药用盐。

11.用于治疗由听毛细胞损失造成的感音神经性听力损失的权利要求1或2的化合物或其基本纯的非对映体或其可药用盐。

12.用于诱导听毛细胞生成的权利要求1或2的化合物或其基本纯的非对映体或其可药用盐。

13.权利要求1或2的化合物或其基本纯的非对映体或其可药用盐用于制备治疗T-细胞急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、红白血病、三阴性乳腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、结肠直肠癌、头颈癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、口腔鳞状细胞癌、皮肤癌、成神经管细胞瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、肝细胞癌、肝内或肝外胆管癌或腺样囊性癌的药物的用途。

14.权利要求1或2的化合物或其基本纯的非对映体或其可药用盐用于制备治疗肺癌的药物的用途。

15.权利要求1或2的化合物或其基本纯的非对映体或其可药用盐用于制备治疗由听毛细胞损失造成的感音神经性听力损失的药物的用途。

16.权利要求1或2的化合物或其基本纯的非对映体或其可药用盐用于制备诱导听毛细胞生成的药物的用途。