RS59115B1 - Jedinjenja inhibitori notch puteva signalizacije - Google Patents

Description

Opis

[0001] Gubitak osetljivosti trepljastih ćelija u unutrašnjem uhu tokom starenja, izlaganja buci, izlaganja hemijskim sredstvima, lekovima, zbog bolesti i genetičkih poremećaja dovode do poremećaja sluha kod brojnih ljudi svake godine. Nezavisno od etiologije, gluvoća ili disfunkcija mehanoosetljivosti trepljastih ćelija smeštenih unutar Korti organa puža je primarni uzrok senzorineuralnog gubitka sluha (SNHL). Profilaktičke mere za sprečavanje gubitka sluha su primarno ograničene na perifernu zaštitu, kao što su čepići za uši ili smanjenje buke ili slušalice za eliminisanje buke. Savremeni tretmani za SNHL su prvenstveno zasnovani na elektronskim tehnologijama kao što su pojačivači zvuka pomoću slušnih aparata ili premoštavanje trepljastih ćelija električnom stimulacijom preživljavajućih spiralnih ganglioznih neurona pomoću kohelarnih implanta. Primena steroida, kao sistemska terapija ili intratimpalna terapija se takođe preporučuju u slučaju naglog senzorineuralnog gubitka sluha.

[0002] Kohlearni senzorni epitel sadrži trepljaste ćelije prilagođene za detekciju vibracije zvuka, koji se pomoću stereocilija na apikalnim površinama trepljastih ćelija pretvara u električne impulse i prenosi do mozga preko VIII kranijalnog nerva. Slušne trepljaste ćelije stvorene tokom razvoja su post-mitotičke i ne obnavljaju se nakon gubitka ili u procesu normalnog obnavljanja ćelija kod sisara. Kao zaključak, SNHL zbog gubitka slušnih trepljastih ćelija je nepovratan. Razvoj slušnih trepljastih ćelija u toku embrionog perioda obuhvata diferencijaciju, kada prosenzorijalne epitelijalne ćelije stiču različite odlike ili trepljastih ćelija ili potpornih ćelija, kroz proces lateralne inhibicije u kome je posrednik Notch signalizacija. Prosenzorijalne epitelne ćelije su zaštićene od diferencijacije u trepljaste ćelije aktivnom Notch signalizacijom stimulisanom ligandima na susednim trepljastim ćelijama. Ove ćelije postaju potporne ćelije.

[0003] Notch signalizacija je evoluciono sačuvan put koji igra integralnu ulogu u razvoju i homeostazi tkiva kod sisara. Notch receptori i ligandi imaju domene pojedinačno propustljive transmembrane i pojavljuju se na površini ćelije pa je zbog toga Notch signalizacija posebno važna u održavanju komunikacije između susednih ćelija u kojima se pojavljuju receptori i ligandi. Kod glodara i ljudi postoje četiri poznata Notch receptora, označena kao Notch 1 do Notch 4. Notch receptori su heterodimerični proteini sastavljeni od ekstracelularnih i intracelularnih domena koji su inicijalno sintetizovani kao pojedinačni polipeptid. Interakcija receptor-ligand dovodi do serije proteolitičkih cepanja polipeptida Notch receptora u kojima je uključeno delovanje γ-sekretaze. Delovanje γ-sekretaze cepa Notch intracelularni domen od unutrašnje strane membrane plazme koja se premešta u nukleus da formira kompleks faktora transkripcije. Notch intracelularni domen (NICD) je aktivni oblik proteina. Različite funkcije Notch signalizacije uključuju proliferaciju, diferencijaciju, apoptoze, angiogeneze, migraciju i samoobnavljanje. Ove različite uloge Notch signalizacije u toku razvoja i održavanja normalnih tkiva mogu nenormalno da se aktiviraju u različitim oblicima kancera.

Onkogenične funkcije Notch signalizacije uključuju inhibiciju apoptoza i promociju proliferacije ćelija.

[0004] γ-Sekretaza igra ključnu ulogu u kaskadi Notch aktivacije. Kao rezultat toga, inhibitori γ-sekretaze su aktivno istraživani zbog svog potencijala da blokiraju aktivaciju Notch receptora za tretman kancera. Za sada na tržištu ne postoje hemoterapeutski lekovi kao Notch inhibitori mada se klinička ispitivanja nastavljaju.

[0005] γ-Sekretaza, preko puteva Notch signalizacije, takođe igra ključnu ulogu u prosenzorijalnoj diferencijaciji ćelija. Kao rezultat toga, inhibitori γ-sekretaze su aktivno istraživani zbog svog potencijala da blokiraju aktivaciju Notch receptora za tretman SNHL. Radije nego da se sredstvo za Notch inhibiciju primeni različitim metodologijama za ulazak u sistemsku cirkulaciju zbog indukovanja ekspresije atonal homologa 1 (Atoh1 ili Math1) u nenormalno povećanim nivoima i u dužem vremenskom periodu, bilo bi korisno i poželjno da se indukuje ekspresija Atoh1, u kohlearnoj sredini, uz bolje ciljani nivo ekspresije i duži vremenski period. Nemogućnost moduliranja Atoh1 ostaje kao prepreka za istraživanje u slušnim trepljastim ćelijama i za razvoj terapeutskih sredstava za regeneraciju slušnih trepljastih ćelija. Mada se istraživanja nastavljaju, kao što je WO 2014/039781, na tržištu se nije pojavio Notch inhibitor za lečenje senzorineuralnog gubitka sluha izazvanog gubitkom slušnih trepljastih ćelija.

[0006] Postoji potreba za pronalaskom jedinjenja koja imaju inhibitorno delovanje na signalizaciju Notch puteva. Dalje postoji potreba za pronalaskom jedinjenja koja inhibiraju signalizaciju Notch puteva inhibitornim delovanjem na γ-sekretazu. Takođe postoji potreba da se pronađu jedinjenja koja imaju jasne strukturne karakteristike koja mogu da doprinesu signalizaciji Notch puteva i inhibitornom delovanju na γ-sekretazu. Dalje postoji potreba da se pronađu jedinjenja koja indukuju ekspresiju Atoh1 inhibicijom signalizacije Notch puteva. Dalje postoji potreba da se pronađu jedinjenja koja ispoljavaju poželjne osobine apsorpcije, distribucije, metabolizma i izlučivanja.

[0007] Jedan aspekt pronalaska je da obezbedi jedinjenje koje ima strukturu:

Jedinjenje 1

4,4,4-trifluoro-N-((2S)-1-((9-metoksi-3,3-dimetil-5-okso-2,3,5,6-tetrahidro-1H-benzo[f]pirolo[1,2-a]azepin-6-il)amino)-1-oksopropan-2-il)butanamid, ili njegov suštinski diastereomerno čist izomer, ili farmaceutski prihvatljiva so bilo koga od njih.

[0008] Naredni aspekt pronalaska je jedinjenje koje ima strukturu:

Jedinjenje 2

N-((2S)-1-((8,8-dimetil-6-okso-6,8,9,10-tetrahidro-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-5-il)amino)-1-oksopropan-2-il)-4,4,4-trifluorobutanamid, ili njegov suštinski diastereomerno čist izomer, ili farmaceutski prihvatljiva so bilo koga od njih.

[0009] Naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje ili Jedinjenje 1, ili njegov suštinski čist diastereomer; ili Jedinjenje 2, ili njegov suštinski čist diastereomer; ili farmaceutski prihvatljivu so bilo koga od njih i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0010] Naredni aspekt ovog otkrića obezbeđuje postupak za lečenje kancera koji je akutna limfoplastična leukemija T-ćelija, akutna limfoblastična leukemija, hronična limfoblastična leukemija, akutna mijelogena leukemija, hronična mijelogena leukemija, eritroleukemija, trostruko negativni kancer dojke, kancer dojke, kancer jajnika, melanoma, kancer pluća, kancer ne malih ćelija pluća, kancer pankreasa, glioblastoma, kolorektalni kancer, kancer glave i vrata, cervikalni kancer, kancer prostate, kancer jetre, karcinom oralnih skvamoznih ćelija, kancer kože, meduloblastoma, angiosarkoma, rabdomiosarkoma, liposarkoma, maligna fibrozna histiocitoma, hepatocelularni karcinom, intrahepatični i ekstrahepatični holangiokarcinom i adenoidni cistični karcinom kod pacijenta, koji uključuje primenu na pacijentu kome je to potrebno terapeutski efektivne količine Jedinjenja 1, njegovog suštinski čistog diastereomera ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenja 2, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0011] Naredni aspekt ovog otkrića obezbeđuje postupak za lečenje kancera pluća kod pacijenta, koji uključuje primenu na pacijentu kome je to potrebno terapeutski efektivne količine Jedinjenja 1, njegovog suštinski čistog diastereomera ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenja 2, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0012] Naredni aspekt ovog otkrića obezbeđuje postupak za lečenje senzorineuralnog gubitka sluha izazvanog gubitkom slušnih trepljastih ćelija kod pacijenta kome je to potrebno, koji uključuje primenu na pacijentu kome je to potrebno terapeutski efektivne količine Jedinjenja 1, njegovog suštinski čistog diastereomera ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenja 2, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli na tom pacijentu.

[0013] Naredni aspekt ovog otkrića obezbeđuje postupak za indukciju generisanja slušnih trepljastih ćelija kod pacijenta kome je to potrebno, koji uključuje primenu na pacijentu kome je to potrebno terapeutski efektivne količine Jedinjenja 1, njegovog suštinski čistog diastereomera ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenja 2, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli na tom pacijentu.

[0014] Naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje Jedinjenje 1, njegov suštinski čist diastereomer, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili Jedinjenje 2, njegov suštinski čist diastereomer, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u terapiji.

[0015] Naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje Jedinjenje 1, njegov suštinski čist diastereomer, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili Jedinjenje 2, njegov suštinski čist diastereomer, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u tretmanu akutne limfoblastične leukemije T-ćelija, akutne limfoblastične leukemije, hronične limfoblastične leukemije, akutne mijelogene leukemije, hronične mijelogene leukemije, eritroleukemije, trostruko negativnog kancera dojke, kancera dojke, kancera jajnika, melanoma, kancera pluća, kancera ne malih ćelija pluća, kancera pankreasa, glioblastoma, kolorektalnog kancera, kancera glave i vrata, cervikalnog kancera, kancera prostate, kancera jetre, karcinoma oralnih skvamoznih ćelija, kancera kože, meduloblastoma, angiosarkoma, rabdomiosarkoma, liposarkoma, maligne fibrozne histiocitome, hepatocelularnog karcinoma, intrahepatičnog i ekstrahepatičnog holangiokarcinoma i adenoidnog cističnog karcinoma.

[0016] Čak naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje Jedinjenje 1, njegov suštinski čist diastereomer, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili Jedinjenje 2, njegov suštinski čist diastereomer, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u tretmanu kancera pluća.

[0017] Naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje Jedinjenje 1, njegov suštinski čist diastereomer, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili Jedinjenje 2, njegov suštinski čist diastereomer, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u tretmanu senzorineuralnog gubitka sluha izazvanog gubitkom slušnih trepljastih ćelija.

[0018] Naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje Jedinjenje 1, njegov suštinski čist diastereomer, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili Jedinjenje 2, njegov suštinski čist diastereomer, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u indukciji generisanja slušnih trepljastih ćelija.

[0019] Naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje upotrebu Jedinjenja 1, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenja 2, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju medikamenta za tretman akutne limfoblastične leukemije T-ćelija, akutne limfoblastične leukemije, hronične limfoblastične leukemije, akutne mijelogene leukemije, hronične mijelogene leukemije, eritroleukemije, trostruko negativnog kancera dojke, kancera dojke, kancera jajnika, melanoma, kancera pluća, kancera ne malih ćelija pluća, kancera pankreasa, glioblastoma, kolorektalnog kancera, kancera glave i vrata, cervikalnog kancera, kancera prostate, kancera jetre, karcinoma oralnih skvamoznih ćelija, kancera kože, meduloblastoma, angiosarkoma, rabdomiosarkoma, liposarkoma, maligne fibrozne histiocitome, hepatocelularnog karcinoma, intrahepatičnog i ekstrahepatičnog holangiokarcinoma i adenoidnog cističnog karcinoma.

[0020] Naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje upotrebu Jedinjenja 1, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenja 2, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju medikamenta za tretman kancera pluća.

[0021] Naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje upotrebu Jedinjenja 1, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenja 2, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju medikamenta za tretman senzorineuralnog gubitka sluha izazvanog gubitkom slušnih trepljastih ćelija.

[0022] Naredni aspekt ovog pronalaska obezbeđuje upotrebu Jedinjenja 1, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenja 2, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju medikamenta za indukciju generisanja slušnih trepljastih ćelija.

[0023] Još jedan aspekt pronalaska obezbeđuje postupak za lečenje senzorineuralnog gubitka sluha izazvanog gubitkom slušnih trepljastih ćelija kod kućnih pasa koji uključuje primenu terapeutski efektivne količine Jedinjenja 1, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenja 2, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, na tom kućnom psu.

[0024] Naredni aspekt pronalaska obezbeđuje postupak za indukciju generisanja slušnih trepljastih ćelija kod kućnih pasa kojima je to potrebno, a koji uključuje primenu terapeutski efektivne količine Jedinjenja 1, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenja 2, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, na tom kućnom psu.

[0025] Izraz "Jedinjenje 1, njegov diastereomer" označava 4,4,4-trifluoro-N-((2S)-1-((9-metoksi-3,3-dimetil-5-okso-2,3,5,6-tetrahidro-1H-benzo[f]pirolo[1,2-a]azepin-6-il)amino)-1-oksopropan-2-il)butanamid; ili diastereomer 4,4,4-trifluoro-N-((S)-1-(((S)-9-metoksi-3,3-dimetil-5-okso-2,3,5,6-tetrahidro-1H-benzo[f]pirolo[1,2-a]azepin-6- il)amino)-1-oksopropan-2-il)butanamida ili 4,4,4-trifluoro-N-((S)-1-(((R)-9-metoksi-3,3-dimetil-5-okso-2,3,5,6-tetrahidro-1H-benzo[f]pirolo[1,2-a]azepin-6-il)amino)-1-oksopropan-2-il)butanamida. Slično tome, izraz "Jedinjenje 2, njegov diastereomer" označava N-((2S)-1-((8,8-dimetil-6-okso6,8,9,10-tetrahidro-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-5-il)amino)-1-oksopropan-2-il)-4,4,4-trifluorobutanamid; ili diastereomer N-((S)-1-(((S)-8,8-dimetil-6-okso-6,8,9,10-tetrahidro-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-5-il)amino)-1-oksopropan-2-il)-4,4,4-trifluorobutanamida ili N-((S)-1-(((R)-8,8-dimetil-6-okso-6,8,9,10-tetrahidro-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-5-il)amino)-1-oksopropan-2-il)-4,4,4-trifluorobutanamida.

[0026] Izraz "pacijent" označava sisara a "sisar" obuhvata, ali bez ograničenja na, ljude nakon postnatalnog perioda. Postnatalni period kod ljudi je period koji počinje neposredno nakon rođenja i traje 30 dana.

[0027] "Terapeutski efektivna količina" ili "efektivna količina" označava dozu ili Jedinjenja 1, njegovog suštinski čistog diastereomera, koji je Izomer 1 ili Izomer 2, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenja 2, njegovog suštinski čistog diastereomera, koji je Izomer 1 ili Izomer 2, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži bilo koji oblik od prethodnih, potrebne da inhibira Notch signalizaciju kod pacijenta sa kancerom i ili uništi cilj (ćelije kancera) ili uspori ili zaustavi progresiju kancera kod pacijenta. Slično tome, "terapeutski efektivna količina" ili "efektivna količina" označava dozu ili Jedinjenja 1, njegovog suštinski čistog diastereomera, koji je Izomer 1 ili Izomer 2, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenja 2, njegovog suštinski čistog diastereomera, koji je Izomer 1 ili Izomer 2, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži bilo koji oblik od prethodnih, potrebne da inhibira Notch signalizaciju kod pacijenta sa senzorineuralnim gubitkom sluha izazvanog gubitkom ili oštećenjem slušnih trepljastih ćelija ili indukuje generisanje slušnih trepljastih ćelija.

[0028] Jedinjenje 1 ili Jedinjenje 2 je "suštinski diastereomerno čisto" a "suštinska čistoća diastereomera Jedinjenja 1 ili Jedinjenja 2", je, kada je izomerna čistoća na položaju 6 Jedinjenja 1 ili položaju 5 Jedinjenja 2 veća od 90% enantiomernog viška. U narednom ostvarenju, izomerna čistoća je veća od 95% enantiomernog viška na položaju 6 Jedinjenja 1 ili položaju 5 Jedinjenja 2. U još jednom ostvarenju, izomerna čistoća je veća od 98% enantiomernog viška na položaju 6 Jedinjenja 1 ili položaju 5 Jedinjenja 2. Čak u još jednom ostvarenju, izomerna čistoća je veća od 99% enantiomernog viška na položaju 6 Jedinjenja 1 ili položaju 5 Jedinjenja 2. Svi stereoizomeri, uključujući diastereomerne smeše Jedinjenja 1 ili Jedinjenja 2 se razmatraju u okviru ovog pronalaska. .

[0029] Očekivane doze Jedinjenja 1, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenja 2, njegovog suštinski čistog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za lečenje kancera su u rasponu od 0.1 do 100 mg/pacijent/dan. Preferirane očekivane doze su u rasponu od 1.0 do 75 mg/pacijent/dan.

Najpoželjnije očekivane doze su u rasponu od 2.0 do 50 mg/pacijent/dan. Očekivane doze Jedinjenja 1, njegovog diastereomera, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili Jedinjenja 2, njegovog diastereomera ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za lečenje senzorineuralnog gubitka sluha izazvanog gubitkom ili oštećenjem slušnih trepljastih ćelija, ili za indukciju generisanja slušnih trepljastih ćelija su u rasponu 0.01 do 100 mg/pacijent/dan. Očekivane preferirane doze su u rasponu od 0.1 do 10 mg/pacijent/dan. Najpoželjnije očekivane doze su u rasponu od 0.2 do 1.0 mg/pacijent/dan.

[0030] Kod kancera, senzorineuralnog gubitka sluha ili za indukciju generisanja slušnih trepljastih ćelija, tačnu zahtevanu dozu za lečenje pacijenta i dužinu trajanja tretmana će da odredi lekar u zavisnosti od stanja i težine bolesti, kao i specifičnih potreba i odgovora pojedinačnog pacijenta. Mada se izražava kao doza po danu, režim primene može da se podesi tako da obezbedi mnogo optimalniju terapeutsku korist za pacijenta i da kontroliše i ublaži bilo koju toksičnost povezanu sa lekom. Pored primene svakog dana, primena svakog drugog dana (Q2D); svakog drugog dana u toku pet dana a nakon toga dva dana bez doziranja (T.I.W.); svakog trećeg dana (Q3D); ili jedanput nedeljno (Q.I.W.) u toku ciklusa doziranja od 21 dan; ili mogu da budu odgovarajući i drugi režimi primene.

[0031] Izrazi "tretman," "lečenje," i "tretiranje," treba da obuhvate kompletan spektar intervencije za kancer, senzorineuralni gubitak sluha izazvan gubitkom ili oštećenjem slušnih trepljastih ćelija ili indukciju generisanja slušnih trepljastih ćelija, kao što je primena aktivnog jedinjenja za poboljšanje, usporavanje ili zaustavljanje jednog ili više simptoma i za odlaganje progresije kancera ili gubitka ili oštećenja slušnih trepljastih ćelija od kojih boluje pacijent, ili za indukciju generisanja slušnih trepljastih ćelija kod pacijenta.

[0032] "Psi kao kućni ljubimci" označavaju kućne i uzgajane pse uključujući, ali bez ograničenja na, kućne ljubimce, servisne pse, pse spasioce, pastirske pse i pse čuvare stoke.

[0033] "Auditivni gubitak sluha," "senzorineuralni gubitak sluha" ili "gubitak sluha" kod ljudi označava da je prag čujnosti (najtiši zvuk koji se čuje (intenzitet) na određenoj frekvenci) kod pacijenta 21 do 40 dB za blagi; 41 do 55 dB za umereni; 56 do 70 dB za umereno ozbiljan; 71 do 90 dB za ozbiljan; i 91 dB i iznad za težak. Obično se testiraju intenziteti u rasponu od 0 dB pa do 120 dB. Testirane frekvence su obično 250, 500, 1000, 2000, 4000 i 8000 Hz.

Dijagnostičke procene sluha se vrše rutinskim testovima koji su poznati i koje koriste stručnjaci sa iskustvom u tehnici, uključujući audiometriju čistog tona koja obuhvata prosečan ton, audimetriju govora koja uključuje prag prijema govora, procene audititivnog odgovora moždanog stabla (ABR ili BAER), transtimpalnu elektrokohleografiju (ECOG) i testiranje otoakustične emisije (OAE). Procene kod dece i novorođenčadi se takođe izvode rutinskim testiranjem koje je poznato i koje koriste stručnjaci sa iskustvom u tehnici a koje uključuju audiometriju vizuelnim podsticanjem, audiometriju kroz igru, otoakustične emisije (OAEs) i procene audititivnog odgovora moždanog stabla.

[0034] Jedinjenje iz ovog pronalaska je preferirano formulisano kao farmaceutska kompozicija sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i primenjuje se različitim načinima.

Preferirano, za lečenje kancera, ovakve kompozicije su za oralnu primenu.

[0035] Za lečenje senzorineuralnog gubitka sluha izazvanog gubitkom ili oštećenjem slušnih trepljastih ćelija, ili za indukciju generisanja slušnih trepljastih ćelija, može da se formuliše i primeni farmaceutska kompozicija pogodna za oralnu ili parenteralnu primenu, da se postigne lokalna ili sistemska terapija. U oralne kompozicije spadaju tablete, obložene tablete, čvrste ili meke želatinske kapsule, rastvori, emulzije ili suspenzije. Parenteralne kompozicije mogu da budu formulisane tako da omoguće primenu u obliku subkutanih injekcija, intravenskih, intramuskularnih, intraperitonealnih, intrapleuralnih, intrasteRNKlnih, transtimpalnih, intralabrintinskih ili intrakohelarnih injekcija ili infuzije. Farmaceutske kompozicije mogu da budu formulisane tako da omoguće jedinjenju iz pronalaska da bude bioraspoloživo nakon primene kompozicije na pacijentu, ili formulisane da omoguće kontrolisano ili kontinuirano oslobađanje aktivnog farmaceutskog sastojka. Preferirana je farmaceutska kompozicija pogodna za transtimpalnu primenu u šupljinu srednjeg uha, a takođe je preferirana primena u nišu ovalnog otvora srednjeg uha. Takođe se primenjuje intralabririntin injekcija i intrakohlearna injekcija. Preferirani način primene za tretman gubitka sluha je lokalna transtimpalna injekcija, međutim ove doze ne isključuju farmaceutske kompozicije pogodne za alternativne načine primene da se postigne sistemsko oslobađanje i mogu da uključe alternativne kompozicije i režime doziranja kao dodatak lokalnoj transtimpalnoj primeni. Takođe je prefirirano kontinuirano oslobađanje lokalno nanete kompozicije pri čemu interval oslobađanja može da bude u rasponu od tri (3) dana do devedeset (90) dana u zavisnosti od vehikuluma za oslobađanje ili smeše sastojaka vehikuluma za oslobađanje, u kojima se nalazi Jedinjenje 1, njegov suštinski čist diastereomer ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0036] Farmaceutske kompozicije, procesi za izradu i sistemi za ciljano oslobađanje leka su dobro poznati u tehnici. Videti, na primer, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro i saradnici, eds., 19th ed., Mack Publishing Co., 1995); Salt and Plontke, "Principles of Local Drug Delivery to the Inner Ear", Audiol Neurotol, 2009,

1

(14); 350-360; Rhee i saradnici, "Sustained-Release Injectable Drug Delivery," Pharmaceutical Technology, Special Issue Drug Delivery, 01 Nov.2010. Farmaceutske kompozicije mogu da sadrže konzervanse, solubilizatore, stabilizatore, sredstva za vlaženje, emulgatore, zaslađivače, boje, korigense ukusa, soli za promenu osmotskog pritiska, pufere, sredstva za maskiranje ukusa ili mirisa ili antioksidanse.

[0037] Jedinjenje iz ovog pronalaska je sposobno da reaguje sa brojnim neorganskim i organskim kiselinama da formira farmaceutski prihvatljive soli nastale dodatkom kiselina. Ovakve farmaceutski prihvatljive soli i uobičajena metodologija za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici. Videti, na primer, P. Stahl i saradnici, HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge i saradnici, "Pharmaceutical Salts, "Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.66, No.1, January 1977.

[0038] Jedinjenje 1, njegov suštinski čist diastereomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili Jedinjenje 2, njegov suštinski čist diastereomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu da se izrade različitim procedurama poznatim u tehnici, kao i onima koje su niže opisane. Specifične faze sinteze mogu da se kombinuju na različite načine da se izradi Jedinjenje 1, njegov diastereomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili Jedinjenje 2, njegov diastereomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0039] Jedinjenje 1 je označeno kao: 4,4,4-trifluoro-N-((2S)-1-((9-metoksi-3,3-dimetil-5-okso-2,3,5,6-tetrahidro-1H-benzo[f]pirolo[1,2-a]azepin-6-il)amino)-1-oksopropan-2-il)butanamid i može takođe da bude označeno kao 4,4,4-trifluoro-N-{(1S)- 2-[(9-metoksi-3,3-dimetil-5-okso-2,3,5,6-tetrahidro-1H-pirolo[1,2-a][1]benzazepin-6-il)amino]-1-metil-2-oksoetil}butanamid; a može takođe da bude označeno kao: butanamid, 4,4,4-trifluoro-N-[(1S)-1-metil-2-okso-2-[(2,3,5,6-tetrahidro-9- metoksi-3,3-dimetil-5-okso-1H-pirolo[1,2-a][1]benzazepin-6-il)amino]etil]-; i drugi nazivi mogu da se koriste za nedvosmislenu identifikaciju Jedinjenja 1. Diastereomeri su označeni kao 4,4,4-trifluoro-N-((S)-1-(((S)-9-metoksi-3,3-dimetil-5-okso-2,3,5,6-tetrahidro-1H-benzo[f]pirolo[1,2-a]azepin-6-il)amino)-1-oksopropan-2-il)butanamid i 4,4,4-trifluoro- N-((S)-1-(((R)-9-metoksi-3,3-dimetil-5-okso-2,3,5,6-tetrahidro-1H-benzo[f]pirolo[1,2-a]azepin-6-il)amino)-1-okso-propan-2-il)butanamid. Drugi nazivi mogu da se koriste za nedvosmislenu identifikaciju svakog od diastereomera.

[0040] Jedinjenje 2 je označeno kao: N-((2S)-1-((8,8-dimetil-6-okso-6,8,9,10-tetrahidro-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-5-il)amino)-1-oksopropan-2-il)-4,4,4-trifluorobutanamid i može takođe da bude označeno kao N-{(1S)-2-[(8,8-dimetil-6- okso-6,8,9,10-tetrahidro-5Hpirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-5-il)amino]-1-metil-2-oksoetil}-4,4,4-trifluorobutanamid; a može takođe da bude označeno kao: butanamid, 4,4,4-trifluoro-N-[(1S)-1-metil-2-okso-2-[(6,8,9,10-tetrahidro-8,8-dimetil-6-okso-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-5-il)amino]etil]-; i drugi nazivi mogu da se koriste za nedvosmislenu identifikaciju Jedinjenja 2. Diastereomeri su označeni kao N-((S)-1-(((S)-8,8-dimetil-6-okso-6,8,9,10-tetrahidro-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-5-il)amino)-1-oksopropan-2-il)-4,4,4-trifluorobutanamid i N-((S)-1-(((R)-8,8-dimetil-6-okso-6,8,9,10-tetrahidro-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-5-il)amino)-1-oksopropan-2-il)-4,4,4-trifluorobutanamid. Drugi nazivi mogu da se koriste za nedvosmislenu identifikaciju svakog od diastereomera.

[0041] Jasno je da su Jedinjenje 1 i Jedinjenje 2 opisani sa jednim od dva fiksna asimetrična centra. Ovde se Cahn-Ingold-Prelog označavanja za (R)- i (S)- koriste u odnosu na specifične izomere. Specifični stereoizomeri mogu da se izrade stereospecifičnim sintezama upotrebom enantiomerno čistih ili obogaćenih početnih materijala. Specifični stereoizomeri ili početnih materijala, međuproizvoda ili racematnih smeša koje uključuju Jedinjenje 1 ili Jedinjenje 2 mogu da se razdvoje postupcima dobro poznatim u tehnici, kao što je navedeno u Stereochemistry of Organic Compounds, E. I. Eliel and S. H. Wilen (Wiley 1994) i Enantiomers, Racemates and Resolutions, J., Jacques, A. Collet and S. H. Wilen (Wiley 1991), uključujući hromatografiju na asimetričnim stacionarnim fazama, enzimatičke rezolucije, ili frakcionu kristalizaciju ili hromatografiju diastereomera formiranih u tu svrhu, kao što su diastereomerne soli. Kada je asimetirčno jedinjenje izolovano ili razdvojeno u svoje izomere, ali nije određena apsolutna konfiguracija ili optička rotacija, izomeri se proizvoljno označavaju kao Izomer 1 i Izomer 2 po redosledu svakog eluata iz asimetrične hromatografije a ukoliko je asimetrična hromatografija započeta ranije u sintezama, isto označavanje se primenjuje na naknadne međuproizvode i primere. Mada su sve smeše koje sadrže jedinjenja iz ovog pronalaska obuhvaćene ovim pronalaskom, preferirana ostvarenja su Jedinjenje 1, Izomer 2, ili Jedinjenje 2, Izomer 2.

[0042] Jedinjenja korišćena kao inicijalni početni materijali u sintezama jedinjenja iz ovog pronalaska su dobro poznata a u slučaju kada nisu komercijalno raspoloživa lako se sintetišu po datim specifičnim referencama, standardnim procedurama koje stručnjak sa iskustvom u tehnici uobičajeno primenjuje ili koje mogu da se nađu u tekstovima opštih referenci.

[0043] Primeri poznatih procedura i postupaka obuhvataju primere opisane u tekstovima opštih referenci kao što su Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc, 1989; Compendium of Organic Synthetic Methods, Volumes 1-10, 1974-2002, Wiley Interscience; Advanced Organic Chemistry, Reactions Mechanisms and Structure, 5th Edition, Michael B. Smith and Jerry March, Wiley Interscience, 2001; Advanced Organic Chemistry, 4th Edition, Part B, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey and Richard J. Sundberg, Kluwer Academic / Plenum Publishers, 2000, itd i referencama navedenim u njima.

[0044] Kako se ovde koristi, naredni nazivi imaju navedena značenja: "mAtoh1" se odnosi na atonal homolog 1 protein glodara; "hAtoh 1" se odnosi na humani atonal homolog 1 protein; "Atoh1" se odnosi na humani genski atonal homolog 1; "bazni medijum" se odnosi na 500ml DMEM/F12 medijuma 5ml N2100X osnovnog rastvora i 10ml B2750X osnovnog rastvora plus 500µl ampicilin osnovnog rastvora (1000X, 50mg/ml) i 1667µl Fungizona (300X); "BFGF" se odnosi na bazni faktor rasta fibroblasta; "DMEM" se odnosi na Dulbecco-ov modifikovani iglov medijum; "DMSO" se odnosi na dimetilsulfoksid; "EDTA" se odnosi na etilendiamintetrasirćetnu kiselinu; "EGF" se odnosi na epidermalni faktor rasta; "EGTA" se odnosi na etilen glikol-bis(2-aminoetiletar)-N,N,N’,N’-tetra sirćetnu kiselinu; ES/MS se odnosi na elektrosprej masenu spektroskopiju; "FBS" se odnosi na serum fetusa govečeta; "GFP" se odnosi na zeleni fluorescentni protein; "h" se odnosi na sat ili sate; "HBSS" se odnosi na Hank-ov balansirani rastvor soli; "HEK" se odnosi na bubreg humanog embriona; "IC50" se odnosi na koncentraciju sredstva koja produkuje 50% maksimalnog mogućeg inhibitornog odgovora za to sredstvo; "IgG" se odnosi na imunoglobulin G; "Math1" se odnosi na humani genski atonal homolog 1; "medijum A" se odnosi na 200ml baznog medijuma EGF bFGF IGF-1 Heparan sulfat u količini od 20, 10, 50 i 50ng/ml tim redom; "MEM" se odnosi na minimum esencijalnog medijuma; "min" se odnosi na minute; "MS" se odnosi na masenu spektroskopiju; "N1ICD" se odnosi na Notch1 intracelularni domen; "nGFP" se odnosi na nuklearni zeleni fluorescentni protein; "OC" se odnosi na kortijev organ; "PBS" se odnosi na puferovane fosfatne soli; "PBST" se odnosi na puferovane fosfatne soli Tween®; "qPCR" se odnosi na kvantitativnu lančanu reakciju polimeraze; "qRT-PCR" se odnosi na kvantitativnu reverznu transkripciju lančane reakcije polimeraze; "opm" se odnosi na obrtaje po minutu; "RLT pufer" se odnosi na RneasyLysis pufer; "RT" se odnosi na sobnu temperaturu; "Tbp" se odnosi na TATA-vezujući protein;

Izrada 1

1-Bromo-3-(2-bromo-4-metoksi-fenil)propan-2-on

1

[0046] Trimetilsilildiazometan (118.4 mL, 236.80 mmol, 2M rastvor u heksanima) se na 0°C u kapima doda u izmešani rastvor 2-(2-bromo-4-metoksi-fenil)acetil hlorida (52 g, 197.3 mmol) u tetrahidrofuranu (197 mL) i acetonitrilu (197 mL) u atmosferi azota. Nakon 15 minuta se ostavi da se zagreje na RT i meša 2h u atmosferi azota. Koncentruje se da se dobije gusto crveno ulje (61 g). U kapima se na 5°C u izmešani rastvor 2-(2-bromo- 4-metoksifenil)acetil azida iz prethodne faze u sirćetnoj kiselini (265 mL) doda bromovodonik (36 mL, 197 mmol, 33% u sirćetnoj kiselini). Nakon dodavanja, ostavi se da se zagreje na RT u atmosferi azota. Nakon 45 minuta, neutrališe se sa smešom led/voda, (500 mL) što za rezultat ima braon precipitat. Čvrste supstance se filtriraju i isperu sa vodom (100 mL) i heksanima (100 ml) i suše pod vakuumom 2h na 45°C da se dobije naslovljeno jedinjenje kao narandžasto ulje (63.0 g, 99%).<1>H NMR (300 MHz, CDCl3): 7.17-7.12 (m, 2H), 6.85 (dd, J= 2.5, 8.5 Hz, 1H), 4.03 (s, 2H), 3.97 (s, 2H), 3.79 (s, 3H).

Izrada 2

(3Z)-1-(2-Bromo-4-metoksi-fenil)-3-(3,3-dimetilpirolidin-2-iliden)propan-2-on

[0047]

[0048] U suspenziju međuproizvoda dobijenog u Izradi 1, 1-bromo-3-(2-bromo-4-metoksifenil)propan-2-ona (60.00 g, 186 mmol) i kalijum jodida (31 g, 86 mmol) u tetrahidrofuranu (600 mL) se na RT u jednoj porciji doda 3,3-dimetilpirolidin-2-tion (26.5 g, 205 mmol) i meša 1h. Doda se metil terc-butil etar (200 mL), čvrste supstance se izdvoje filtriranjem i filter pogača ispere sa metil-terc-butil etrom (100 mL) da se dobije 1-(2-bromo-4-metoksifenil)-3-[(4,4-dimetil-2,3-dihidropirol-1-ium-5-il)sulfanil]propan-2-on jodid kao svetlo žuta čvrsta supstanca (100 g). U suspenziju čvrste supstance (100 g, 201 mmol) u acetonitrilu (1 L), se dodaju trietilamin (56 mL, 401 mmola) i trifenilfosfin (58 g, 221 mmol) i meša 2.5 h na 65 °C. Doda se metil terc-butil etar (200 ml) i čvrste supstance se izdvoje filtriranjem. Filtrat se upari, ostatak triturira sa metil terc-butil etrom (20 mL) i čvrste supstance se izdvoje filtriranjem (dva puta). Kombinovani filtrati se upare da se dobije 50 g sirovog materijala. Ostatak se prečisti fleš hromatografijom na koloni silika gela uz eluiranje sa gradijentom 20-50% etil acetata u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje kao beličasta čvrsta supstanca (41 g, 70%). MS (m/z): 338.0/340.0 (M+/M+2).

Izrada 3

9-Metoksi-3,3-dimetil-2,3-dihidro-1H-pirolo[1,2-A][1]benzazepin-5(6H)-on

[0049]

[0050] Smeša međuproizvoda dobijenog u Izradi 2, (3Z)-1-(2-bromo-4-metoksi-fenil)-3-(3,3-dimetilpirolidin-2-iliden)propan-2-ona (40.0 g, 118 mmol), paladijum acetata (2.7 g, 12 mmol), cezijum karbonata (77 g, 237 mmol), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilksantena (13.7 g, 24 mmol) i N-metil-2-pirolidona (1.2 L) se degasira/ispere sa azotom (x3). Suspenzija se zagreva 4h na 150°C. Ohladi se na RT, čvrste supstance se izdvoje filtriranjem, isperu sa etil acetatom i čvrste supstance odbace. U filtrat se dodaju etil acetat (1 L) i voda (500 mL), čvrste supstance se izdvoje filtriranjem kroz diatomejsku zemlju i odbace. Filtrirani slojevi se razdvoje, ekstrahuju iz vode sa etil acetatom (2 x 20 mL), a nakon toga sa dihlorometanom (3 x 100 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu dva puta sa 5% vodenim rastvorom natrijum bikarbonata, suše preko natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju da se dobije 100 mL tamno braon ulja. Materijal se filtrira kroz ploču silika gela uz eluiranje sa dihlorometanom a nakon toga sa smešom 1% metanol/dihlorometan i filtrat se koncentruje. Ostatak se podeli

1

između etil acetata i 5% vodenog rastvora natrijum bikarbonata, ponovo ekstrahuje iz vodenog sloja sa etil acetat, suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje da se dobije sirovi produkt kao tamno braon pena. Dobijena pena se rastvori u etil acetatu (250 mL), doda se SiliaBond Thiol® (80 g) i meša na RT u toku noći. Čvrste supstance se izdvoje filtriranjem, filter pogača ispere sa etil acetatom i dihlorometanom, a filtrat koncentruje da se dobije naslovljeno jedinjenje kao svetlo braon čvrsta supstanca (19.6 g, 65%). MS (m/z): 258.0 (M+H).

Izrada 4

6-Hidroksiimino-9-metoksi-3,3-dimetil-2,3-dihidro-1H-pirolo[1,2-a][1]benzazepin-5(6H)-on

[0051]

[0052] U izmešani rastvor međuproizvoda dobijenog u Izradi 3, 9-metoksi-3,3-dimetil-2,3-dihidro-11H-pirolo[1,2-A][1]benzazepin-5(6H)-ona (16.8 g, 65 mmol) u tetrahidrofuranu (336 mL) se na 0°C u nekoliko porcija doda kalijum terc-butoksid (11 g, 98 mmol) i meša 15 minuta. Doda se amil nitrit (12.2 mL, 91 mmol) u kapima i smeša meša 30 minuta na 0°C. Reaktivna smeša se sipa na kombinaciju led/voda (200 mL) i smeša se ekstrahuje sa etil acetatom (2 x 200 mL). Kristalizovane čvrste supstance se izdvoje filtriranjem a filtrat ekstrahuje sa dihlorometanom (2 x 100 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu sa slanim rastvorom (100 mL), suše preko natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju da se dobije svetlo braon čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca se triturira sa smešom 1:1 metil terc-butil etar/heksan, kombinuje sa prethodno sakupljenom čvrstom supstancom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao svetlo žuta čvrsta supstanca (16.5 g, 88%). MS (m/z): 287.1 (M+H).

Izrada 5

1

6-Amino-9-metoksi-3,3-dimetil-3-2,3-dihidro-1H-pirolo[1,2-a][1]benzazepin-5(6H)-on

[0053]

[0054] U izmešanu suspenziju međuproizvoda dobijenog u Izradi 4, 6-hidroksiimino-9-metoksi-3,3-dimetil-2,3-dihidro-1H-pirolo[1,2-a][1]benzazepin-5(6H)-ona (16.5 g, 58 mmol) i cink praha (11.3 g, 173 mmol) u dihlormetanu (248 mL) se na 5°C-10°C u toku 10 minuta u kapima dodaje trifluorosirćetna kiselina (17 mL, 231 mmol) a nakon toga ostavi da se zagreje na RT. Smeša se filtrira kroz ploču diatomejske zemlje, filtrat se sipa preko smeše leda i zasićenog vodenog rastvora natrijum karbonata (1:1, 500 mL). Dobijena suspenzija se filtrira kroz diatomejsku zemlju i filter ploča ispere sa dihlorometanom. Ekstrahuje se iz vodenog sloja sa dihlorometanom (100 mL), kombinovani organski slojevi suše preko natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju da se dobije naslovljeno jedinjenje kao svetlo braon pena (14.7 g, 94%). MS (m/z); 273.1 (M+H).

Izrada 6

Benzil (2S)-2-(4,4,4-trifluorobutanoilamino)propanoat

[0055]

[0056] U izmešani rastvor 4,4,4-trifluorobuterne kiseline (7.1 g, 49 mmol) u dihlormetanu (162 mL) se dodaju L-alanin benzil estar hidrohlorid (7 g, 32.5 mmol), diizopropiletilamin (28 mL, 162 mmol), hidroksibenzotriazol hidrat (7.5 g, 49 mmol) i 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (9.3 g, 49 mmol) i meša 20h na RT u atmosferi N2. Neutrališe se sa 20% vodenim rastvorom limunske kiseline (150 mL), mešavina meša 5 minuta, slojevi

1

razdvoje i vodeni sloj ekstrahuje sa dihlorometanom (100 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (150 mL), suše preko magnezijum sulfata, filtriraju i koncentruju da se dobije 10.6 g bledo žute čvrste supstance. Ostatak se prečisti fleš hromatografijom na koloni silika gela uz eluiranje sa gradijentom 25-50% etil acetata u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (9.2 g, 94%). MS (m/z): 304.2 (M+H).

Izrada 7

(2S)-2-(4,4,4-trifluorobutanoilamino)propanoatna kiselina

[0057]

Asimetrični

[0058] U izmešani rastvor međuproizvoda dobijenog u Izradi 6 benzil (2S)-2-(4,4,4-trifluorobutanoilamino)propanoata (8.8 g, 29 mmol) u metanolu (88 mL) se na RT doda paladijum (1.8 g, 0.8 mmol, 5% na C). Smeša se degasira i meša 5 h u atmosferi vodonika (atmosferski balon). Smeša se filtrira preko diatomejske zemlje, ploča ispere sa metanolom i filtrat koncentruje da se dobije bela čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca se triturira sa dihlorometanom i suši pod vakuumom u toku noći na RT da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (6.11 g, 99% prinos). MS (m/z): 214.1 (M+H).

Izrada 8

Metil 3-(3,3-dimetil-2-tioksopirolidin-1-il)propanoat

[0059]

1

[0060] 3,3-Dimetilpirolidin-2-tion (15.7 g, 122 mmol) i metil akrilat (12 mL, 134 mmol) se rastvore u tetrahidrofuranu (100 mL) i mešaju na RT u atmosferi azota. Doda se natrijum hidroksid (0.8 g, 20 mmol) i meša u toku noći na RT u atmosferi azota. Razblaži sa slanim rastvorom, ekstrahuje sa etil acetatom, slojevi se razdvoje, organski sloj se ispere sa slanim rastvorom, suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje da se dobije 27.5 g sirove čvrste supstance. Ostatak se prečisti fleš hromatografijom na koloni silika gela uz eluiranje sa gradijentom 20-50% etil acetata u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (25.9 g, 99%). MS (m/z): 216.2 (M+H).

Izrada 9

Metil 3-[(2Z)-2-(2-etoksi-2-okso-etiliden)-3,3-dimetil-pirolidin-1-il]propanoat

[0061]

[0062] U izmešani rastvor međuproizvoda dobijenog u Izradi 8, metil 3-(3,3-dimetil-2-tioksopirolidin-1-il)propanoata (41.4 g, 192 mmol) u toluenu (156 mL) se doda tetrakis(acetato)dirodijum(II) (3.74 g, 8.5 mmol) i zagreva na 110°C u atmosferi azota. U kapima se dodaje etildiazoacetat (89 mL, 844 mmol) u toku približno 18 h, nakon toga zagreva u toku noći na 110°C. Koncentruje se i ostatak prečisti fleš hromatografijom na koloni silika gela uz eluiranje sa 30% etil acetata u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuto ulje (34.5 g, 67%). MS (m/z): 270.2 (M+H).

Izrada 10

Etil (2Z)-2-(3,3-dimetilpirolidin-2-iliden)acetat

[0063]

1

[0064] U izmešani rastvor međuproizvoda dobijenog u Izradi 9, metil 3-[(2Z)-2-(2-etoksi-2-okso-etiliden)-3,3-dimetil- pirolidin-1-il]propanoata (33.8 g, 126 mmol) u tetrahidrofuranu (430 mL) se u kapima u toku 45 minuta dodaje kalijum heksametildisilazid (301 mL, 0.5 M rastvor u toluenu, 151 mmol) u atmosferi azota uz upotrebu ledeno/vodenog kupatila da se temperatura održi na <30°C. Po završenom dodavanju se meša 40 minuta. Neutrališe se sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (250 mL) a nakon toga koncentruje. Podeli se između dietil etra i slanog rastvora, ekstrahuje iz vodenog sloja sa etil acetatom (x 4), suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje da se dobije 37 g materijala. Ostatak se prečisti fleš hromatografijom na koloni silika gela uz eluiranje sa 10% etil acetata u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje (9.1 g, 40%). MS (m/z): 184.2 (M+H).

Izrada 11

Etil (2Z)-2-[3,3-dimetil-1-(3-metil-2-piridil)pirolidin-2-iliden]acetat

[0065]

[0066] U reaktivnoj posudi se kombinuju 2-bromo-3-metilpiridin (1.5 g, 8.7 mmol), međuproizvod dobijen u Izradi 10, etil (2Z)-2-(3,3-dimetilpirolidin-2-iliden)acetat (1.6 g, 8.7 mmol) i sim-dimetiletilen diamin (0.77 mL, 8.7 mmol) u 1,4-dioksanu (15 mL). U mehurićima se propušta gas azot uz 10 minuta mešanja. Kalijum karbonat (3.6 g, 26 mmol) i bakar (I) jodid (0.83 g, 4.4 mmol) se odjedanput dodaju, smeša se zatvori i zagreva 2 dana na 120°C. Razblaži sa dihlorometanom, filtrira kroz diatomejsku zemlju i filtrat koncentruje. Ostatak se prečisti fleš hromatografijom na koloni silika gela uz eluiranje sa gradijentom 5-

2

100% etil acetata u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bledo žuto ulje (1.58 g, 66%). MS (m/z): 275.0 (M+H).

Izrada 12

8,8-Dimetil-9,10-dihidro-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-6(8H)-on

[0067]

[0068] U izmešani rastvor međuproizvoda dobijenog u Izradi 11, etil (2Z)-2-[3,3-dimetil-1-(3-metil-2-piridil)pirolidin-2-iliden]acetata (2.88 g, 10.5 mmol) i tetrahidrofurana (60 mL) u reaktivnoj posudi se špricem doda natrijum bis(trimetilsilil)amid (22 mL, 1M rastvor u tetrahidrofuranu, 22 mmol). Posuda se zatvori i zagreva 3 dana na 70°C uz mešanje. Ohladi se na RT, neutrališe sa slanim rastvorom, ekstrahuje sa etil acetatom, suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje da se dobije braon ulje. Ostatak se prečisti fleš hromatografijom na koloni silika gela uz eluiranje sa gradijentom 50-100% etil acetata u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuta čvrsta supstanca (1.70 g, 71%). MS (m/z): 229.2 (M+H).

Izrada 13

6-Azido-10-aza-3,3-dimetil-2,6-dihidro-1H-pirolo[1,2-a][1]benzazepin-5-on

[0069]

[0070] U izmešani rastvor međuproizvoda dobijenog u Izradi 12, 8,8-dimetil-9,10-dihidro-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-6(8H)-ona (1.85 g, 8.1 mmol) u tetrahidrofuranu (50 mL) se na -78°C, u atmosferi azota u toku 10 minuta dodaje litijum diizopropilamid (7.0 mL, 10.5 mmol, 1.5 M rastvor u heksanima). Nakon 30 minuta se špricem doda se sirćetna kiselina (2.3 mL, 41 mmol) a nakon toga ostavi da se zagreje na RT u atmosferi azota. Neutrališe se sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata. Smeša se podeli između slanog rastvora i etil acetata, slojevi razdvoje, sloj etil acetata ispere sa slanim rastvorom, suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje da se dobije braon čvrsta supstanca. Ostatak se prečisti fleš hromatografijom na koloni silika gela uz eluiranje sa gradijentom 5-60% etil acetata u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje (1.2 g, 55%). MS (m/z): 270.2 (M+H).

Izrada 14

5-Amino-3,3-dimetil-9,10-dihidro-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-6(8H)-on

[0071]

[0072] U izmešani rastvor međuproizvoda dobijenog u Izradi 13, 6-azido-10-aza-3,3-dimetil-2,6-dihidro-1H-pirolo[1,2-a][1]benzazepin-5-ona (1.2 g, 4.5 mmol) u etanolu (50 mL) i vodi (15 mL) se na RT dodaje cink u prahu (1.2 g, 18 mmol) a nakon toga amonijum hlorid (5 g, 66 mmol). Nakon 1 h se reakcija razblaži sa etil acetatom, čvrste supstance se izdvoje filtriranjem i filtrat koncentruje. Ostatak se suspenduje između etil acetata i slanog rastvora, slojevi razdvoje, suše preko natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju. Ostatak se prečisti fleš hromatografijom na koloni silika gela uz eluiranje sa gradijentom 5-40% [10% 2M amonijum u smeši metanol/dihlorometan] u dihlormetanu da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuta čvrsta supstanca (0.72 g, 67%). MS (m/z): 244.2 (M+H).

Izrada 15

terc-butil N-[(1S)-2-[(10-aza-3,3-dimetil-5-okso-2,6-dihidro-1H-pirolo[1,2-a][1]benzazepin-6-il)amino]-1-metil-2-okso-etil] karbamat

[0074] U izmešani rastvor međuproizvoda dobijenog u Izradi 14, 5-amino-3,3-dimetil-9,10-dihidro-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-6(8H)-ona (0.72 g, 3.0 mmol) u tetrahidrofuranu (10 mL) se na 0°C u atmosferi azota dodaju (2S)-2-(terc-butoksikarbonilamino)propanoatna kiselina (0.69 g, 3.6 mmol), 1-hidroksibenzotriazol hidrat (0.55 g, 3.6 mmol) i diizopropiletilamin (0.67 mL, 3.9 mmol). Doda se 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (0.68 g, 3.6 mmol) i smeša ostavi da se zagreje na RT u atmosferi azota. Nakon 2 h, smeša se razblaži sa vodom i ekstrahuje sa etil acetatom. Organski sloj se ispere sa slanim rastvorom, suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje. Ostatak se prečisti fleš hromatografijom na koloni silika gela uz eluiranje sa gradijentom 50-100% etil acetata u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuta čvrsta supstanca (1.04 g, 84%). MS (m/z): 415.0 (M+H).

Izrada 16

(2S)-2-Amino-N-(10-aza-3,3-dimetil-5-okso-2,6-dihidro-1H-pirolo[1,2-a][1]benzazepin-6-il)propanamid hidrohlorid

[0075]

[0076] U izmešani rastvor međuproizvoda dobijenog u Izradi 15, terc-butil N-[(1S)-2-[(10-aza-3,3-dimetil-5-okso-2,6-dihidro-1H-pirolo[1,2-a][1]benzazepin-6-il)amino]-1-metil-2-okso-etil] karbamata (1.04 g, 2.5 mmol) u 1,4-dioksanu (40 mL) se doda vodonik hlorid (12.5 mL, 50 mmol, 4M rastvor u dioksanu) i zagreje na 45°C uz mešanje. Kada LC/MS pokaže da

2

je reakcija završena, koncentruje se da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuta čvrsta supstanca (0.93 g, sirovi). MS (m/z): 315.2 (M+1).

Primer 1

4,4,4-trifluoro-N-((2S)-1-((9-metoksi-3,3-dimetil-5-okso-2,3,5,6-tetrahidro-1H-benzo[f]pirolo[1,2-a]azepin-6-il)amino)-1-oksopropan-2-il)butanamid

[0077]

Odeljak 1

Diastereomerni 4,4,4-trifluoro-N-((2S)-1-((9-metoksi-3,3-dimetil-5-okso-2,3,5,6-tetrahidro-1H-benzo[f]pirolo[1,2-a]azepin-6-il)amino)-1-oksopropan-2-il)butanamid

[0078] U izmešani rastvor međuproizvoda dobijenog u Izradi 5, 6-amino-9-metoksi-3,3-dimetil-2,3-dihidro-1H-pirolo[1,2-a][1]benzazepin-5(6H)-ona i međuproizvoda dobijenog u Izradi 7 (2S)-2-(4,4,4-trifluorobutanoilamino)propanoatne kiseline (10.9 g, 51 mmol) u dihlormetanu (294 mL) se doda 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (12.4 g, 65 mmol). Smeša se ohladi na 5°C, doda se 1-hidroksibenzotriazol (8.75 g, 65 mmol) i mešanje nastavi 10 minuta na RT. Smeša se ispere sa vodom (3 x 100 mL), suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje da se dobije tamna čvrsta supstanca. Dobijena supstanca se triturira sa metil terc-butil etrom da se dobije naslovljeno jedinjenje (smeša diastereomera) kao beličasta čvrsta supstanca (22.0 g, 87%). MS (m/z): 468.1 (M+H).

Odeljak 2

4,4,4-trifluoro-N-((2S)-1-((9-metoksi-3,3-dimetil-5-okso-2,3,5,6-tetrahidro-1H-benzo[f]pirolo[1,2-a]azepin-6-il)amino)-1-oksopropan-2-il)butanamid, Izomeri 1 i 2

[0079] Smeša diastereomera izi Primera 1, Odeljak 1 se razdvoji na Chiralpak AD koloni uz eluiranje sa smešom 10% acetonitril/etanol (0.2% dimetiletilamin) da se dobije Izomer 1 jedinjenja (Rt=3.20 minuta) kao bela čvrsta supstanca (9.8 g, 38%) i Izomer 2 jedinjenja (Rt=7.37 minuta) kao bela čvrsta supstanca (9.0 g, 36%). MS (m/z): 468.2 (M+H) za oba izomera.

Primer 2

N-((2S)-1-((8,8-dimetil-6-okso-6,8,9,10-tetrahidro-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-5-il)amino)-1-oksopropan-2-il)-4,4,4-trifluorobutanamid

[0080]

Odeljak 1

Diastereomerni N-{(1S)-2-[(8,8-Dimetil-6-okso-6,8,9,10-tetrahidro-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-5-il)amino]-1-metil-2-oksoetil}-4,4,4-trifluorobutanamid

[0081] U izmešani rastvor međuproizvoda dobijenog u Izradi 16, (2S)-2-amino-N-(10-aza-3,3-dimetil-5-okso-2,6-dihidro-1H-pirolo[1,2-a][1]benzazepin-6-il)propanamid hidrohlorida (0.93 g, 2.6 mmol), u tetrahidrofuranu (50 mL) se na 0°C u atmosferi azota dodaju 4,4,4-trifluorobutanoatna kiselina (0.45 g, 3.2 mmol), 1-hidroksibenzotriazol hidrat (0.49 g, 3.2 mmol) i diizopropiletilamin (2.3 mL, 13.2 mmol). Doda se 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (0.61 g, 3.2 mmol) i smeša ostavi 16 h da se zagreje na RT u atmosferi azota. Smeša se rzblaži sa vodom i ekstrahuje sa etil acetatom. Organski sloj se ispere sa slanim rastvorom, suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje. Ostatak se

2

prečisti fleš hromatografijom na koloni silika gela uz eluiranje sa gradijentom 75-100% etil acetata u heksanima da se dobije naslovljeno jedinjenje (smeša diastereomera) kao beličasta čvrsta supstanca (0.82 g, 71%). MS (m/z): 439.2 (M+1).

Odeljak 2

N-((2S)-1-((8,8-dimetil-6-okso-6,8,9,10-tetrahidro-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-5-il)amino)-1-oksopropan-2-il)-4,4,4-trifluorobutanamid, Izomeri 1 i 2

[0082] Smeša diastereomera iz Primera 2, Odeljak 1, se razdvoji na Chiralpak AD-H koloni uz eluiranje sa 15% MeOH/CO2(gas) da se dobije Izomer 1 (Rt=1.60 mins.) kao bela čvrsta supstanca (194 mg, 24%, epimerizuje do 32% DE (diastereomerni višak)) i Izomer 2 (Rt=2.31 mins.) kao bela čvrsta supstanca (469 mg, 57%). MS (m/z): 439.0 (M+H) za oba izomera.

[0083] Kancer se sve više prepoznaje kao heterogeni zbir bolesti čiji su početak i progresija indukovani nenormalnom funkcijom jednog ili više gena koji regulišu obnovu DNK, stabilnošću genoma, proliferacijom ćelija, smrću ćelija, adhezijom, agiogenezama, invazijom i metastazama u ćeliji i mikrookruženju tkiva. Promena ili nenormalna funkcija "kancer" gena može da bude rezultat prirodno nastalog DNK polimorfizma, promena u broju kopija genoma (kroz amplifikaciju, odbacivanje, gubitak hromozoma ili duplikaciju), promena u strukturi gena i hromozoma (kroz hromozomnu translokaciju, inverziju ili drugih preraspodela koje dovode do poremećene regulacije ekspresije gena) i tačaka mutacije. Kancerogene neoplazme mogu da budu indukovane jednom nenormalnom funkcijom gena i održavaju se istom nenormalnom funkciojom gena ili se održavanje i progresija pogoršavaju dodatnim nenormalnim funkcijama gena.

[0084] Pored prethodno pomenutih genetičkih hromozomnih aberacija, svaki od kancera može takođe da uključi epigenične modifikacije genoma uključujući DNK metilaciju, genomično utiskivanje i modifikaciju histona acetilacijom, metilacijom ili fosforilacijom. Epigenična modifikacija može da igra ulogu u indukciji i/ili održavanju maligniteta.

[0085] Sastavljeni su i održavani opsežni katalozi citogenetskih aberacija kancera kod ljudi su i regularno se ažuriraju online (videti The Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer at US National Cancer Institute (NCI) Cancer Genome Anatomy Project (CGAP). Baze podataka uključuju hromozomne aberacije najmanje za neke od maligniteta iz ovog pronalaska. The Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project održava detaljnu

2

online listu "Cancer Gene Census" svih humanih gena koji su uzročno povezani sa tumorogenezama kao i COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) baza podataka somatskih mutacija u humanom kanceru. Drugi izvor koji sadrži obimnu informaciju genetskih promena uzročno povezanih sa različitim kancerima je Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology.

[0086] Dijagnoze kancerogenih maligniteta biopsijom, imunofenotipizacijom i drugim testovima su poznate i rutinski se koriste. Pored tehnike trake visoke rezolucije hromozoma i naprednih tehnologija snimanja hromozoma, aberacije hromozoma u sumnjivim slučajevima mogu da se odrede preko citogeničnih analiza kao što su fluorescencija na mestu hibridizacije (FISH), kariotipizacija, spektralna kariotipizacija (SKY), multipleks FISH (M-FISH), komparativna genomična hibridizacija (CGH), nizovi polimorfizma pojedinačnih nukleotida (SNP Chips) i drugi dijagnostički i analitički testovi poznati i korišćeni od strane stručnjaka sa iskustvom u tehnici.

[0087] Onkogenična uloga Notch je prvi put zabeležena kod leukemije T-ćelija ljudi uključujući translokaciju Notch1 intracelularnog domena u region β promotera receptora T-ćelija, što dovodi do prekomerne ekspresije Notch1 intracelularnog domena (Grabber i saradnici, Nature Review Cancer, 2006(6):347-359; Weng i saradnici, Science, 2004 (306):269-271). Prekomerna ekspresija Notch1 intracelularnog domena u hematopoietičnim progenitor ćelijama miševa dovodi do pojave akutne limfoblastične leukemije T-ćelija miševa sličnoj ljudima. Pored akutne limfoblastične leukemije T-ćelija, sve je više dokaza da su Notch signali onkogenični u drugim kancerima preko višestrukih mehanizama, uključujući amplifikaciju receptora i prekomernu ekspresiju liganda i/ili receptora, uključujući akutnu limfoblastičnu leukemiju, hroničnu limfoblastičnu leukemiju (Rosati i saradnici, Blood, 2009 (113): 856-865), akutnu mijelogenu leukemiju (Sliwa i saradnici, Int J Clin Exp Pathol, 2014 (7(3)): 882-889), hroničnu mijelogenu leukemiju (Nakahara i saradnici, Blood, 2010 (115(14)): 2872-2881) i eritroleukemiju (Robert-Moreno i saradnici, Leukemia, 2007 (21): 1496-1503). Aberantna konstitucija Notch signalizacije zbog mutacije ili prekomerna ekspresija liganda i/ili receptora je takođe uključena u malignitete brojnih čvrstih tumora, uključujući trostruki negativni kancer dojke (Stoeck i saradnici, Cancer Discovery, 2014(4): 1154-1167), kancer dojke, kancer jajnika (Park i saradnici, Cancer Research, 2006(66):6312-6318), melanomu (Gast i saradnici, Genes, Chromosomes & Cancer, 2010(49):733-745), kancer pluća, kancer ne malih ćelija pluća (Westhoff i saradnici, PNAS, 2009(106):22293-22298), kancer pankreasa, glioblastomu, kancer kolorektuma, kancer glave i vrata, kancer

2

grlića materice, kancer prostate, kancer jetre, karcinom skvamoznih ćelija (oralnih), kancer kože i meduloblastomu (Rangathan i saradnici, Nature Review Cancer, 2011(11):338-351 and Suplementary information S1 (tabela)). Aberantna konstitucija Notch signalizacije zbog mutacije ili prekomerna ekspresija liganda i/ili receptora je takođe uključena u angiosarkom (Ravi i saradnici, J Clin Oncol, 2007, (25(18S, June 20 Suplement)): Abstract 10030), rabdomiosarkom (Belyea i saradnici, Clin Cancer Res, 2011(17(23)): 7324-7336; Roma i saradnici, Clin Cancer Res, 2011(17(3)): 505-513), liposarkom (J Clin Oncol, 2009, (27(15S, Suplement)): Abstract 10526), malignu fibroznu histiocitomu (Wang i saradnici, Cancer Res, 2012, (72): 1013-1022), hepatocelularni karcinom (Villanueva i saradnici, Gastroenterology, 2012, (143): 1660-1669), intrahepatični i ekstrahepatični holangiokarcinom (Wu i saradnici, Int J Exp Pathol, 2014, (7(6)): 3272-3279; Sekiya i saradnici, J Clin Invest, 2012, (122(11)): 3914-3918; Yoon i saradnici, World J Gastroenterol, 2011, (17(35)): 4023-4030) i adenoidni cistični karcinom (Bell i saradnici, Annals of Diagnostic Pathology, 2014, (18): 10-13; Stoeck i saradnici, Cancer Discov, 2014, (4): 1154-1167). Inhibicija Notch signalizacije predstavlja atraktivni cilj za obezbeđivanje terapeutskih koristi za pacijente sa kancerom čija je bolest indukovana aberantnom aktivacijom konstitutivnih puteva Notch signalizacije. Shih i saradnici, Cancer Research, 2007(67)1879-1882.

[0088] Jedan od potvrđenih gena za razvoj trepljastih ćelija unutrašnjeg uha je homolog sisara atonal-1, faktor transkripcije bazne heliks-petlja-heliks (Atoh1). Ekspresija Atohl u kohlearnim ćelijama je potrebna za genezu slušnih trepljastih ćelija. Prosenzorne epitelijalne ćelije unutar Korti organa koje se razvijaju i koje ekspresuje Atohl će da se diferenciraju u slušne trepljaste ćelije (Helms i saradnici, Development 2000, (127(6)): 1185-1196) a Atoh1 je jedan od najranijih markera diferencijacije slušnih trepljastih ćelija. Ćelije za podršku Korti organa održavaju potencijal za razvoj karakteristika trepljastih ćelija, uključujući formiranje cilija (Zheng i saradnici, Nature Neuroscience, 2000,(3(6)): 580-586 ; Kawamoto i saradnici, J Neurosci, 2003, (23(11)): 4395-4400; Izumikawa i saradnici, Nat Med, 2005, (11(3)):271-276; i odgovarajuću funkciju trepljastih ćelija (Kawamoto i saradnici, 2003).

[0089] Svaka trepljasta ćelija u kohlei je okružena ne-senzornim potpornim ćelijama što obezbeđuje trofičnu i strukturnu potporu za trepljaste ćelije i ganglion i esencijalne su u održavanju pravilne jonske koncentracije u Korti organu preko propusne veze intracelularne komunikacije. Postoje dva tipa trepljastih ćelija: unutrašnje i spoljašnje trepljaste ćelije.

Kohlearne trepljaste ćelije kod sisara, uključujući ljude, se sastoje od jednog reda unutrašnjih trepljastih ćelija i tri reda spoljašnjih trepljastih ćelija. Unutrašnje trepljaste ćelije su pravi

2

senzorni receptori i 95% vlakana slušnog nerva koji se projektuje u mozgu potiču iz ove subpopulacije. Završeci na spoljašnjim trepljastim ćelijama su skoro svi od odvodnih aksona koji nastaju iz ćelija u mozgu i ove ćelije funkcionišu kao akustični pred-pojačivači. Potporne ćelije igraju ključnu ulogu u generisanju slušnih trepljastih ćelija nakon gubitka ili oštećenja slušnih trepljastih ćelija. U toku razvoja, trepljaste i potporne ćelije se razvijaju iz zajedničkog progenitora a pojava trepljastih ćelija šalje signal okolnim ćelijama da se razviju u potporne ćelije inhibicijom kontakta posredstvom puteva Notch signalizacije (Kelley, Nat Rev Neurosci, 2006, (11): 837-849.

[0090] Na osnovu sposobnosti potpornih ćelija da se transdiferenciraju u slušne trepljaste ćelije, zajedno sa njihovim zajedničkim putevima razvoja, postavljen je postulat da potporne ćelije mogu da funkcionišu kao progenitori trepljastih ćelija (Parker i saradnici, Audiology i Neurootology, 2004, (9(2)): 72-80). Više studija je pokazalo da premoštavanje inhibicije ćelijskog ciklusa u potpornim ćelijama može da dovede do generisanja slušnihi trepljastih ćelija kod sisara (Lowenheim i saradnici, Proc Natl Acad Sci USA, 1999, (96): 4084-4088; Torchinsky i saradnici, J Neurocytol, 1999, (28(10-11)): 913-924; Minoda i saradnici, Hear Res, 2007, (232): 44-51). Prema tome, potporne ćelije odraslih sisara podržavaju sposobnost da se transdiferenciraju u slušne trepljaste ćelije kada su slobodne da uđu u ćelijski ciklus.

[0091] Terapija lekovima za obnavljanje slušnih trepljastih ćelija je novi pristup a intratimpalna primena u fluid srednjeg uha, preferirano u šupljinu srednjeg uha, bez stvarnog ubrizgavanja u kohleu, može u terapeutskoj dozi efikasno da indukuje ekspresiju Atoh1 i u pogodnom vremenskom periodu da dovede do transdiferencijacije potpornih ćelija u slušne trepljaste ćelije u kohlei. Mizutari i saradnici, Neuron, 2013, (77(1)): 58-69 su pokazali da oslobađanje inhibitora gama sekretaze (LY411575) u srednjem uhu može da se koristi za regenerisanje slušnih trepljastih ćelija izgubljenih zbog akustične traume kod miševa i da ovo generisanje novih trepljastih ćelija iz potpornih ćelija dovodi do značajnog merljivog obnavljanja sluha. Ovaj rad obezbeđuje konceptualni dokaz terapeutskog efekta inhibicije puteva Notch signalizacije na generisanje slušnih trepljastih ćelija i obnavljanja sluha kod modela miševa i obezbeđuje mehanističko (diferencijacija potpornih ćelija u slušne trepljaste ćelije) objašnjenje za fiziološki efekat. Doze ograničavajuće toksičnosti su pokazane u toku sistemske primene LY411575.

[0092] Niže date in vitro i in vivo studije pokazuju inhibitornu aktivnost i efikasnost jedinjenja 1 i 2 ili njihovog suštinski čistog diastereomera na puteve Notch signalizacije specifične ćelijske linije kancera. Stručnjak sa iskustvom u tehnici ova ispitivanja generalno

2

prepoznaje kao indikativnu kliničku hemoterapeutsku aktivnost na ljudima. Veruje se da je cepanje intracelularnog domena γ-sekretazom efikasno za svaki od Notch 1, Notch 2, Notch 3 i Notch 4 receptora. Ispitivanja koja pokazuju inhibitornu aktivnost i efikasnost na puteve Notch signalizacije mogu da se izvedu suštinski kako je niže dato ili sličnim ispitivanjima koja dovode do sličnih rezultata.

Ispitivanje Notch1 nuklearnim N1ICD snimanjem ćelijske akumulacije

[0093] HEK293ΔE12 ćelije (HEK293 su izrađene za stabilnu ekspresiju Notch1 cDNK miševa koja kodira amino kiselinu 1703-2183, NP_032740.3, (ukupna dužina prekursora Notch 1 proteina miševa: SEQ ID NO:1) sa sekvencom amino kiseline 23 peptida signala, MPRLLTPLLCLTLLPALAARGLR (SEQ ID NO:2), na njegovom N-terminusu) se nanesu na ploče sa 96 udubljenja u količini od 5000 ćelija/udubljenje i inkubiraju 24 sata u Dulbeccoovom modifikovanom Eagle medijumu (DMEM)-visok sadržaj glukoze sa 5% seruma fetusa govečeta (FBS) na 37 °C, sa 5 % CO2. Ćelije se tretiraju sa test jedinjenjem, doziranjem na 10 tačaka razblaženja 1:3 u rasponu od 1000 nM do 0.05 nM i sa finalnom koncentracijom dimetil sulfoksida (DMSO) od 0.2%. Nakon 24 sata tretmana, ploče sa ćelijama se po redu procesuiraju po sledećim fazama: ćelije se fiksiraju sa 100ml/udubljenje PREFER™ fiksativom u toku 30 minuta, na sobnoj temperaturi (RT); ćelije se permeabilizuju sa 100ml/udubljenje 0.1% TRITON® X100 u puferu fosfatnih soli (PBS) u toku 20 min na RT; isperu 3 puta sa po 100µl /udubljenje PBS; doda se 50µl/udubljenje zečjeg anti-N1ICD (Notch1 intracelularni domen) antitela, u količini od 1:2000 u PBS sa 1 % albumina seruma govečeta i inkubiraju 1.5 sat na 37 °C; isperu 3 puta sa po 100µl/udubljenje PBS; inkubiraju sa 50µl/udubljenje kozjeg anti-zečjeg IgG (Imunoglobulin G) Alexa 488 u razblaženju od 1:1000 u PBS sa 1 % albumina seruma govečeta i inkubiraju 1 sat na 37 °C ; isperu 3 puta sa po 100µl/udubljenje PBS i doda se 100µl/udubljenje 15 µM propidijum jodida sa 50µg/ml RNKze u toku 30 minuta da se oboji nukleus. Ploče se snimaju sa ACUMEN EXPLORER™ Laser-citomerom za fluorescentno skeniranje mikroploča (TTP LABTECH LTD) da se izmeri ukupan broj nuklearnih ćelija/udubljenje i ukupna nuklearna oblast/udubljenje sa fluorescencijom na 655nm-705nm (emisija DNK vezanog propidijum jodida) i fluorescencija antitela vezanog za N1ICD u nuklearnom regionu na 505nm-530nm. Glavni izlazni test je odnos ukupne fluorescencije nuklearnog N1ICD i ukupne nuklearne oblasti, normalizovanog nuklearnog N1ICD signala. Profil relativne citotoksičnosti se uzima kao % broja ćelija prema kontrolnim ćelijama u 0.2% DMSO. Antitelo koje prepoznaje cepane Notch1 ili N1ICD je podignuto na humani peptid koji odgovara mestu cepanja amino terminala humanog Notch1 za Val1744. U netretiranim kontrolnim ćelijama, N1ICD generisan od Notch1 se premešta i akumulira u nukleusu. Kada se ćelije tretiraju sa jedinjenjem koje inhibira cepanje Notch 1, signal nuklearnog N1ICD se smanjuje. Koncentracija odgovora i IC50su određeni četvoroparametarskom logističkom krivom za signal nuklearnog N1ICD, dok se procenat broja ćelija nanosi na isti grafik zbog profilisanja citotoksičnosti. Po analizi izvedenoj u osnovi kako je prethodno opisano, prosečna IC50za Jedinjenje 1, Izomer 2 je 0.37 nM (+/-0.16; n=2) a za Jedinjenje 2, Izomer 2 je 1.55 nM (+/- 1.12; n=2). Ni jedno jedinjenje ne utiče na broj ćelija do koncentracije od 1000 nM. Ovi rezultati pokazuju da svako od Jedinjenja 1, Izomer 2 i Jedinjenja 2, Izomer 2 ima afinitet za Notch 1 i inhibira intracelularnu akumulaciju Notch 1 intracelularnog domena peptida ćelijske signalizacije.

Studije ciljane inhibicije in-vivo

Studije na životinjama

[0094] Za in vivo procenu efekta Jedinjenja 1, Izomer 2 i Jedinjenja 2, Izomer 2 na inhibiciju farmakodinamike (PD) koju ima Notch, studije na životinjama su izvedene na Balb/C miševima bez tumora (Charles River). Za svaku grupu je korišćeno ukupno 5 miševa. Miševi su hranjeni ad libitum normalnom hranom. Tretman je započet sa oralnom primenom (gavažom) Jedinjenja ili vehikuluma (1% Na-CMC u 0.25% Tween-80) u zapremini od 0.2 mL. U označenim vremenskim tačkama (4 ili 8 sati nakon doze) nakon tretmana, životinje se žrtvuju CO2asfikacijom i odsecanjem glave. Tkiva (pluća) se odvoje i koriste za analizu PD odgovora mereno cepanjem N1ICD.

N1ICD analize

[0095] Za procenu nivoa N1ICD u plućima, približno 75 mg se odseče od zamrznutog tkiva i usitni pre homogenizacije (zabeleži se tačna masa). Zamrznuti uzorci tumora se prenesu u Lysing Matrix-D™ kivete i re-suspenduju u ledeno hladnom XY puferu za lizu (25 mM Tris pH 7.5, 10 µg/ml tripsin/Chymotrypsin inhibitora, 10 mg/ml aprotinina, 60 mM Beta-glicerol fosfata, 1% Triton® X-100, 10 mM NaF, 2.5 mM pirofosfata, 150 mM NaCl, 15 mM etilen

1

diamin tetra sirćetne kiseline (EDTA) pH 8.0, 5 mM etilen glikol-bis(2-aminoetiletar)-N,N,N’,N’-tetra sirćetne kiseline (EGTA) pH 8.0, 1 mM Na vanadata, 10 µg/ml leupeptina, 1 mM ditiotreitola, 1 µM mikrocistina LR, 10 µg/ml N-p-tosil-L-fenilalanin hlorometil ketona (TPCK), 2 mM Nα-p-tosil-L-arginin metil estar hidrohlorida (TAME), 15 mM 4-nitrofenil fosfat di(tris) soli (PNPP), 0.1 mM 4-(2-aminoetil) benzensulfonil fluorid hidrohlorida (AEBSF), 5 mM benzamidina, 1 µM okadainske kiseline) koji sadrži 1X Complete tabletu (Roche Complete™ No.11697 498 001) i 1X koktel inhibitora proteaze (Sigma-Aldrich P8340) u odnosu masa : zapremina od 75 mg/ml pufera. Tkiva se homogenizuju u Fast Prep FP120 homogenizatoru (Thermo Scientific, Rockford, IL) 30 sekundi na 4°C pri brzini od 6.0, a nakon toga inkubiraju 15 minuta na ledu. Postupak se ponovi ukupno 2-3 ciklusa sve dok se homogenizacija ne kompletira. Lizati se centrifugiraju 15 minuta na 4°C u ependorf centrifugi pri 30,000 opm da se uklone nečistoće. Izdvoji se 400 µl supernatanta i prenese u novu ependorf kivetu i podvrgne ciklusu zamrzavanje/topljenje. Uzorci se ponovo centrifugiraju 30 minuta na 4°C u ependorf centrifugi pri brzini od 30,000 opm i uzme se 120 µl supernatanta za analizu. Koncentracija ukupnih proteina se određuje pomoću Pierce BCA Protein Assay Kit™ (Thermo Scientific, Rockford, IL) koristeći Thermomax™ čitač ploča (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Vrednosti N1ICD se određuju koristeći N1ICD prilagođeni ELISA test. Anilat je vezan za cepano Notch1(Val1744)-specifično pripremljeno zečje monoklonalno antitelo i detektuje sa C-završetkom Notch1 SULFO-TAG™ (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland) poliklonalnog antitela ovce (R&D Systems, Minneapolis, MN). Lizati se razblaže do 2 µg/ml u ledeno hladnom ELISA tris puferu za lizu (R6OTX) (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland) koji sadrži 1X Complete tabletu (Roche Complete™ mini No.11 836 153 001) i 1X koktel inhibitora proteaze (Sigma-Aldrich P8340) i doda se 25µl u ELISA ploču. Inkubacija 50 µg protein lizata se vrši 1 sat na RT za svaki vezani anilat i sa detekcijom antitela. Ploče se očitavaju na Sector Imager 6000™ (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland). Ostatak bez N1ICD se normalizuje do ukupnog proteina i izražava se kao % inhibicije u odnosu na grupu tretiranu vehikulumom. % Inhibicije N1ICD i statistički značajna (p vrednost) mereno Dunett-ovom metodom u tumorima uzetim 4 sata nakon poslednje doze za Jedinjenje 1, Izomer 2 ili Jedinjenje 2, Izomer 2 se u osnovi analizira kako je prethodno opisano i sumirano je u Tabeli 1.

2

Tabela 1

[0096] Rezultati u Tabeli 1 pokazuju inhibiciju cepanja N1ICD sa Jedinjenjem 1, Izomer 2 i Jedinjenjem 2, Izomer 2 u tkivu pluća miševa. Rezultati u Tabeli 1 dalje obezbeđuju in vivo korelaciju sa prethodno opisanim rezultatima funkcionalne aktivnosti.

Indukcija ekspresije mAtoh1 u ušnim sferama

[0097] Generalno, izolacija ćelija Korti organa se izvodi na Dan 0, uglavnom po postupku koji su dali Oshima i saradnici, Methods Mol Biol., 2009; 493: 141-162. Ćelijska kultura i razmnožavanje se vrše 3-4 dana. Prekrivanje ćelija i tretman test jedinjenjem se vrše na Dan 3 ili 4. Vezivanje i diferencijacija se ostavi da se izvodi u toku narednih 7 dana. Na Dane 10 ili 11, izvrši se liza ćelija i izolacija RNK. TaqMan qRT-PCR se vrši na Dan 12 a rezultati na ekspresiju Atoh1 i Tbp1 analiziraju na Dane 13-15.

Izolacija ćelija

[0098] Okolno tkivo sa petrous dela temporalne kosti se ukloni kod 1 do 4 dana postnatalno starih miševa (transgenični soj: mAtoh1-vođeni nGFP; Lumpkin EA i saradnici, Gene Expr Patterns, 2003; (36): 389-95 oba pola. Kohlea u obliku školjke se odvoji od vestibularnog sistema pomoću forcepsa. Na ovom nivou razvoja, koštani labirint nije potpuno kalcificiran i lako se iseca pomoću forcepsa. Koštani labirint kohlee se pažljivo otvori i ukloni se spiralni ligament i vezani kalem Korti organa zajedno sa spiralom stožera odmotavanjem vrha stožera. Počevši od osnove, odvoji se spiralni ligament od Korti organa pomoću finog forcepsa.

[0099] Odvojeni Korti organ (OC) se prenese u pojedinačne kivete zapremine 1.5 ml napunjene sa 850 µl ledeno hladnog HBSS. U istu kivetu se prenese do 12 OC tkiva. OC tkiva se istalože brzim centrifugiranjem i ukloni se HBSS. Ćelije se razdvoje dodavanjem 100 µl prethodno zagrejanog TrypLE™ Select (Life Technologies) i inkubiraju 13 minuta na 37°C. Brzim centrifugiranjem se istalože razdvojena OC tkiva. TrypLE™ Select se ukloni. Doda se 100 µl medijuma A (DMEM/F12, N2suplement (LifeTechnologies), B27 suplement (LifeTechnologies), ampicilin (50mg/ml) i Fungizone (LifeTechnologies), EGF (20 ng/ml), bFGF (10 ng/ml), IGF-150 ng/ml) i heparan sulfat (50 ng/ml)). Isečeno i digestirano tkivo se nakon toga triturira sa pipetom P200 tipa. Uklone se bilo kakvi agregati ćelija i onečišćenja; suspenzija ćelija se prenese i ispere preko prethodno ovlažene cediljke ćelija promera 70 µm da se ćelijska suspenzija spoji u pojedinačne kivete sa svežom kulturom. Kivete za disocijaciju i cediljka ćelija se isperu sa dovoljno medijuma A i spoji sa ćelijskom suspenzijom. Gustina ćelija se broji sa hemocitometrom ili Countess® (Life Technologies). U ćelijsku suspenziju se doda svež Medijum A da se postigne finalna gustina nanosa od 1.0E5 ćelija/ml i nanese u kulture sa ultra-niskim vezivanjem, T-75 (Greiner).

Uzgajanje u suspenziji za širenje OC sfera

[0100] Razdvojene, pojedinačne ćelije se uzgajaju u kulturi sa ultra-niskim vezivanjem, (Greiner) u Medijumu A 3 do 4 dana na 37°C u inkubatoru ovlaženim sa 5% CO2da se dobiju klonalno uzgajane sfere, označene kao sfere prve generacije, iz plivajućih ćelija. Ukoliko su ćelije zalepljene za ne-adherentne posude u toku perioda uzgajanja, mogu da se odvoje blagim mešanjem.

Vezivanje kulture i tretman

[0101] Nakon uzgajanja sfera u toku 3-4 dana, sfere se vizuelno broje pomoću mikroskopa da se standardizuje gustina zasejavanja ušnih sfera po ml za ovu fazu. Ćelije se sakupe centrifugiranjem i sfere resuspenduju u Basic medijumu u koncentraciji od približno 2000

4

sfera po ml. Sfere se zaseju u zapremini od 150 µl po udubljenju u ploče za tretiranje ćelijske kulture sa 96 udubljenja da se dobije približno 300 sfera po udubljenju. Sfere se četvorostruko tretiraju sa eksperimentalnim sredstvima, do finalne zapremine od 200 µl u Basic medijumu (DMEM/F12, N2suplement (LifeTechnologies) B27 suplement (LifeTechnologies), ampicilin (50 µg/ml) i Fungizone (LifeTechnologies). Tretirane sfere se uzgajaju 7 dana u inkubatoru sa kontrolisanom vlagom i temperaturom i 5% CO2, na 37°C. Medijum se ukloni i postupak nastavi ekstrakcijom RNK.

RNK ekstrakcija

[0102] Doda se pufer RLT plus (Qiagen) obogaćen sa 1% Beta-merkaptoetanola, 175 µl po udubljenju. U svako udubljenje se pre ekstrakcije RNK doda po 2.5 µl od 4 ng/µl nosača RNK (RNeasy® Plus Micro Kit; Qiagen) razblaženog u puferu RLT Plus. Ukupna RNK se ekstrahuje pomoću RNeasy® Plus Micro Kit (Qiagen) prema uputstvima proizvođača.

Sinteza cDNK

[0103] cDNK sinteza se izvodi pomoću SuperScript® III First-Strand Synthesis System (LifeTechnologies, katalog 18080-051) po protokolu proizvođača koristeći nasumične heksamere za sintezu cDNK. cDNK se razblaži na 50% dodavanjem 21 µl ultra čiste vode bez nukleaze. 5 µl razblažene cDNK se koristi za qPCR.

qPCR

[0104] Za kvantifikaciju ekspresije markera trepljastih ćelija iz tretiranih kultura sfera, qPCR sa probama za detekciju gena od interesa mAtoh1 i endogenih kontrolnih gena se izvodi pojedinačnom, dvobojnom multipleksnom reakcijom. TaqMan Gene Expression Master Mix (LifeTechnologies, 4369016) i proba od interesa (Atoh1; Mm00476035_s1) i endogene kontrolne probe (Tbp1; Mm00446971_m1, LifeTechnologies) se izvode u skladu sa uputstvima proizvođača. Za svaku probu se održavaju konstantni uslovi. Odnos ekspresije gena između tretiranih grupa se analizira pomoću ΔΔCTpostupka a izračunava se prosek ponovljenih merenja. Eksperimenti se izvode u triplikatu, minimalno, a prikazuju kao veliki prosek.

Tabela 2

[0105] Rezultat u Tabeli 2 pokazuje vrednosti relativne kvantifikacije (RQ) Atoh1 ekspresije, marker generisanja trepljastih ćelija u ušnim sferama tretiranih sa svakim od Jedinjenja 1, Izomer 2 i Jedinjenja2, Izomer 2 u tri koncentracije (10nM, 100nM i 1µM). Rezultat (± standardna greška proseka, SEM) predstavlja koliko se puta indukcijom gen ekspresuje u odnosu na uzorke tretirane negativnom kontrolom (DMSO nosač). (*, značajna razlika od negativne kontrole, p<0.05). ;;Indukcija ekspresije hAtoh1 u ćelijskim linijama humanog tumora ;;[0106] Za procenu potencije Jedinjenja 1, Izomer 2 i Jedinjenja 2, Izomer 2 u sposobnosti da indukuju ekspresiju hAtoh1, korišćena je ćelijska linija humanog tumora. Endogena regulacija Notch signalizacije za ovu ćelijsku liniju je slična sa onom u unutrašnjem uhu. Generalno, ovo ispitivanje se izvodi po principima koje su dali Kazanjian i saradnici, Gastroenterology, 2010, 139(3): 918-928 i u dodatnim materijalima i postupcima. ;[0107] Generalno, korišćene su standardne tehnike uzgajanja ćelija. Ćelijska linija humanog kolorektalnog adenokarcinoma LS174T (ATCC CL-188) niskog prolaza održavana u medijumu za rast (MEM 10% FBS) se nanese u količini od 10,000 ćelija u 100 µl medijuma za analizu (MEM 1% FBS) po udubljenju u pločama za tretiranje kulture tkiva sa 96 udubljenja. ;[0108] Narednog dana, izvrše se polu-log serijska razblaženja od 10 mM osnovnih test jedinjenja (razblažena u 100% DMSO) da se dobije jedanaest opadajućih doza lekovitog jedinjenja. Finalne koncentracije se kreću od 10 µM do 0.127 nM. Koristi se 3.16- puta serijsko razblaženje, sa koncentracijama DMSO od 100% u svakom udubljenju. Dalje razblaženje 1:10 početnog DMSO razblaženja se izvrši u medijumu za analizu. Ponovo se razblaži 1:100 u medijumu za analizu. ;[0109] 100 µl razblaženja test jedinjenja se doda u svako udubljenje koje sadrži ćelije i medijum za rast i ostavi 72 sata na 37°C u 5% CO2. ;[0110] Ćelije se sakupe iz ploča na dan 4, RNK se ekstrahuje i prečisti pomoću RNeasy® Plus 96 RNK (Qiagen) po protokolu proizvođača. ;[0111] Izvrši se sinteza cDNK pomoću SuperScript® III First-Strand Synthesis System (LifeTechnologies, 18080-051) po protokolu proizvođača koristeći proizvoljno odabrane heksamere za sintezu cDNK. cDNK se razblaži 50% dodavanjem 21 µl ultra-čiste vode bez nukleaze. Za qPCR se koristi 5 µl razblažene cDNK. ;;qPCR ;;[0112] Za kvantifikaciju ekspresije markera trepljastih ćelija iz kultura tretiranih sfera, izvrše se qPCR probe za detekciju hAtoh1 ili ekspresiju TBP pojedinačnom dvobojnom multipleksnom reakcijom. Za merenje odnosa ekspresije gena za svaki uzorak, koristi se TaqMan Gene Expression Master Mix (LifeTechnologies, 4369016) i proba od interesa (humani Atoh1; LifeTechnologies Assay Id Hs00944192_s1) plus endogena kontrola (humani TBP; LifeTechnologies Assay Id Hs00427620_m1) u skladu sa uputstvima proizvođača. Uslovi se održavaju konstantnim za svaku probu. Odnos ekspresije gena između tretiranih grupa se analizira pomoću ΔΔCTmetoda a izračunava se prosek ponovljenih merenja. ;[0113] Za dobijanje IC50vrednosti za svako test jedinjenje, izvode se četiri odvojene analize. Vrednost IC50se određuje nanošenjem rezultata odgovora na koncentraciju na "log(antagonist) prema odgovor (tri parametra)" model pomoću GraphPad Prism® softvera za 12 doza u koncentraciji u rasponu od 4.0E-11 do 1.0E-6 M sa ukupno 108 tačaka analize za svako Jedinjenje. Vrednosti IC50za Jedinjenje 1, Izomer 2 i Jedinjenje 2, Izomer 2 su pokazani u Tabeli 3. ;;Tabela 3 ;;; ;;; [0114] Rezultat u Tabeli 3 pokazuje IC50vrednosti Jedinjenja 1, Izomer 2 i Jedinjenja 2, Izomer 2 kako je izračunato iz relativne ekspresije hAtoh1, markera generisanja slušnih trepljastih ćelija u ovoj analizi. ;Odgovor na Jedinjenja u ispitivanju eksplanta Kortijevog organa ;;[0115] Generalno, kultura organotipnog Kortijevog organa se vrši na dan 0 u skladu sa postupkom koji su opisali Parker i saradnici, Journal of Visualized Experiments, 2010, (36), e1685. Kultura eksplanta se vrši 4-7 dana, nakon čega se kultura ili pripremi za celijske lize za qRT-PCR, ili za fiksaciju tkiva za imunohistohemiju. ;;Izdvajanje i gajenje eksplanta Kortijevog organa ;;[0116] Mehur i okolno tkivo iz pertous dela temporalne kosti se odvoje kod 1-4 dana postnatalno starih miševa (transgenična vrsta: Atohl-driven nGFP; Lumpkin EA i saradnici, Gene Expr Patterns, 2003, (36):389-95) oba pola. Kortijevi organi se disektuju u Hank-ovom rastvoru, spiralni ligament se odvoji a eksplanti se prenesu na pokrovne ljuspice obložene sa poli-L-ornitinom (0.01%, Sigma) i lamininom (50 mg/ml, Becton Dickinson) da se dobije preparat sa ravnom kohlearnom površinom. Svaki kohlearni eksplant se nakon toga pojedinačno prenese u udubljenje ploče sa 24 udubljenja (Falcon) i uzgaja u DMEM (Invitrogen) sa 5% seruma fetusa govečeta, 5% seruma konja i penicilin-streptomicinom (LifeTech- nologies). Eksperimentalna jedinjenja se dodaju sa medijumom na Dan 0 i zamene svaka 2-3 dana. Sve kulture se održavaju na 37°C u inkubatoru uz vlažnost sa 5% CO2. ;;Analize ekspresije gena pomoću qRT-PCR ;;[0117] Ekstrakcija RNK se izvodi liziranjem tkiva eksplanta sa 350µl RLT Plus pufera (Qiagen) po udubljenju i ukupna RNK se prečisti pomoću RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen). Sinteza cDNK se izvodi sa SuperScript® III First-Strand Synthesis sistemom (LifeTechnologies) koristeći proizvoljno izabrane heksamere. Za kvantifikaciju indukcije markera ekspresije trepljastih ćelija, qPCR se izvodi sa TaqMan Gene Expression Master Mix (LifeTechnologies, 4369016) i probom za detekciju gena od interesa (na primer hAtoh1; Assay ID Mm00476035_s1, Pou4f3; Assay ID Mm04213795_s1 i Myo7a; Assay ID Mm01274015_m1, LifeTechnologies) i endogenom kontrolom gena, Tbp (Assay ID Mm00446971_m1, LifeTechnologies). Odnos ekspresije gena između tretiranih grupa se analizira pomoću ΔΔCTmetoda a izračunava se prosek ponovljenih merenja. Eksperimenti se izvodi u triplikatu, kao minimum, i iskazuju kao veliki prosek. ;;Tabela 4 ;; ;;; [0118] Rezultat u Tabeli 4 pokazuje vrednosti relativne kvantifikacije (RQ) ekspresije markera generisanja trepljastih ćelija; Atoh1, Pou4f3 i Myo7a, u eksplantima Kortijevog organa tretiranih sa Jedinjenjem 1, Izomer 2 i Jedinjenjem 2, Izomer 2 u količini od 1µM. Rezultat (±SEM) predstavlja broj preklapanja u ekspresiji gena u odnosu na uzorke tretirane negativnom kontrolom. ;;Imunohistohemijsko bojenje novih Atohl-ekspresovanih u trepljastim ćelijama ;;[0119] Nakon kulture eksplanta, tkiva se fiksiraju u pločama sa 24 udubljenja 30 min sa 200µl Cytofix/Cytoperm (BD), isperu sa PBS koji sadrži TritonX100 (PBST) i oboje sa 200µl primarnog rastvora antitela, koji se sastoji od 4% normalnog seruma magarca u PBST sa kozjim anti-GFP (1:2500; AbCAM, ab5450) i zečjim anti-miozin VIIa (1:1000; Proteus Bioscience #25-6790) u toku 1 sat. Tkiva se nakon toga dobro operu sa pBST i oboje sa sekundarnim rastvorom antitela koji se sastoji od Alexa Fluor 488 magarećeg anti-kozjeg IgG (1:1000; Invitrogen, A-11055) i Alexa Fluor 568 magarećeg anti-zečjeg IgG (1:1000; ;Invitrogen, A 10042) u toku 1 sat. Nakon toga se dobro operu sa PBST i prenesu na mikroskopske pločice. Pojedinačne trepljaste ćelije se identifikuju ekspresijom Atohl-surogat markera GFP (Green) i miozina VIIa (crveno), slikaju a nakon toga broje u okviru dužine od 100 µM na mid-apex regionu da se ispita formiranje novonastalih trepljastih ćelija u eksperimentalnim uzorcima tretiranih jedinjenjem nasuprot broja trepljastih ćelija u netretiranim uzorcima ili uzorcima tretiranih negativnom kontrolom (biološki neaktivno jedinjenje). Broj ćelija slepe probe se meri u pet odvojenih eksperimenata. ;Tabela 5 ;; ;;; [0120] Rezultat u Tabeli 5 pokazuje broj spoljašnjih trepljastih ćelija u eksplantima Kortijevog organa uzgajanih četiri dana u prisustvu Jedinjenja 1, Izomer 2 (n=13) ili Jedinjenja 2, Izomer 2 (n=15) u količini od 1 µM i imunohistohemijskim bojenjem za GFP (surogat Atoh1 marker) i miozin VIIa. Procenat povećanja trepljastih ćelija je u odnosu na uzorke tretirane negativnom kontrolom (n=18). ;;Analiza ekspresije gena nakon ototoksičnog oštećenja ;;[0121] Organotipična promena kulture eksplanta Kortijevog organa se koristi kao model regeneracije trepljastih ćelija u odgovoru na naknadni tretman jedinjenjem nakon ototoksičnog oštećenja. Ovaj model oštećenja se izvodi u skladu sa postupkom koji su opisali Korrapati i saradnici, PLOSOne, 2013, 8(8), e73276 gde je zabeleženo 95% redukcije midapikalnih trepljastih ćelija. Na dan 0, za oštećenje i selektivno ubijanje trepljastih ćelija unutar eksplanta Kortijevog organa, vrši se tretman aminoglikozidom (gentamicin (100 µM)) u toku 18-24 sata. Na dan 1, gentamicin se ukloni a počinje tretman sa Jedinjenjem 1, Izomer 2 i Jedinjenjem 2, Izomer 2 u količini od 5 µM. Uzgajanje eksplanta se nastavi još ukupno 4 dana kada se kultura pripremi za prethodno opisan qRT-PCR protokol. Vizuelna potvrda oštećenja indukovanog gentamicinom se lako uočava u odnosu na kulture tretirane sa jedinjenjima negativne kontrole. Međutim, kvantitativno merenje za odgovor na tretman Jedinjenjem 1, Izomer 2 i Jedinjenjem 2, Izomer 2 nakon toksičnog oštećenja dobijenog merenjem qRT-PCR raste u ekspresiji gena za Atohl i Pou4f3 markere prosenzornih trepljastih ćelija i Myo7A marker trepljastih ćelija. ;;;4 ;Tabela 6 ;; ;;; [0122] Rezultat u Tabeli 6 pokazuje relativno povećanje ekspresije gena sa qRT-PCR Atoh1 markerima, Pou4f3 i Myo7a, generisanja trepljastih ćelija u eksplantima Kortijevih organa tretiranih sa Jedinjenjem 1, Izomer 2 i Jedinjenjem 2, Izomer 2 u količini od 5 µM nakon oštećenja gentamicinom (100 µM). Rezultat pokazuje procenat povećanja u ekspresiji gena u odnosu na uzorke tretirane negativnom kontrolom kod oštećenja trepljastih ćelija indukovanog gentamicinom (*, značajna razlika od negativne kontrole, p < 0.05)

Indukcija markera trepljastih ćelija u kulturi cele otičke kapsule

[0123] Otička kapsula (eksplant otičke kapsule), sastavljena od labirinta kohelarne kosti i vestibularnih sistema, je odvojena od 1-4 dana postnatalno starih miševa (transgenični soj: Atoh 1-driven nGFP; Lumpkin EA i saradnici, Gene Expr. Patterns, 2003, 3(4): 389-95) oba pola generalno u skladu sa postupkom koji su opisali Parker i saradnici, Journal of Visualized Experiments, 2010, (36), e1685. Cela otička kapsula se izdvoji od parietalne kosti i održava ex-vivo u okrugloj kiveti sistema za kulturu do 3 dana u medijumu koji sadrži DMEM, visok sadržaj glukoze, 5% FBS, 5% seruma konja, 1µg/ml ampicilina.

[0124] Eksplant otičke kapsule se koristi za procenu penetracije test jedinjenja u unutrašnje uho, u različitim vehikulumima za oslobađanje. Testovi se izvode sa kompozicijama Jedinjenja 1, Izomer 2, (7.2 mM) u različitim vehikulumima za oslobađanje. Male zapremine (100-200 nl) se direktno nanesu u šupljinu srednjeg uha kohlee. Kohlea se disektuje, tretira, inkubira 1-2 h, a nakon toga unese u okruglu kivetu za kulturu. Nakon 48 h, eksplant otičke kapsule se otvori da se ukloni Kortijev organ od labirinta kostiju kohlee i ispita pomoću RT-PCR.

[0125] Kompozicija se ostavi da stoji 1-2 sata a nakon toga ukloni ispiranjem sa medijumom za kulturu. Eksplant otičke kapsule se nakon toga uzgaja 48 sati u netretiranom medijumu.

Kohlea se otvori a unutrašnji Kortijev organ se nakon toga disektuje i pripremi za kvantitativnu RT-PCR za merenje nivoa Atoh1 markera ekspresije trepljastih ćelija (kako je prethodno opisano u analizi eksplanta Kortijevog organa). Tabela 7 pokazuje indukciju Atohl u navedenom vehikulumu za oslobađanje. Povećana regulacija Atoh1 sa Jedinjenjem 1, Izomer 2, u svim testiranim kompozicijama (2-3 puta, n je 12-17) je merena u poređenju sa eksplantima otičke kapsule tretirane kontrolom samo sa vehikulumom nakon 48 sata u kulturi.

Tabela 7 Ekspresija Atoh1 gena (RT-PCR)

In Vivo perilimfno preuzimanje test jedinjenja u unutrašnjem uhu

[0126] Ženke albino Hartley zamoraca (Charles River, France) se anesteziraju sa smešom ketamin/ksilazin a nakon toga se injektuje 70 µl Jedinjenja 1, Izomer 2, u kompozicijama kako je prethodno opisano u analizi kulture cele otičke kapsule, transtimpalnim putem do kompletnog punjenja srednjeg uha. Uzorci perilimfe (fluid unutrašnjeg uha) se ekstrahuju 0.5, 1, 6, 24 i 48 sati nakon injekcije i ispituju pomoću LCMS (n je5) na koncentraciju test jedinjenja. Tabela 8 pokazuje da je test jedinjenje ušlo u unutrašnje uho nakon transtimpalne primene u srednje uho sa ovim vehikulumima za oslobađanje.

Tabela 8 IN VIVO vrednosti perilimfe

Sekvence amino kiselina

[0127]

SEQ ID NO:1 (prekursor Mouse Notch 1 proteina; puna dužina)

4

SEQ ID NO:2 (signal peptidA)

MPRLLTPLLCLTLLPALAARGLR

4

�

�

�

�

�

�

�

Claims (8)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje strukture:

   naznačeno time što je to 4,4,4-trifluoro-N-((2S)-1-((9-metoksi-3,3-dimetil-5-okso-2,3,5,6-tetrahidro-1H-benzo[f]pirolo[1,2-a]azepin-6- il)amino)-1-oksopropan-2-il)butanamid, njegov diastereomerni izomer sa izomernom čistoćom na položaju 6 većom od 90% enantiomernog viška, ili farmaceutski prihvatljiva so bilo kog od prethodnih.
2. 2. Jedinjenje strukture:

   naznačeno time što je to N-((2S)-1-((8,8-dimetil-6-okso-6,8,9,10-tetrahidro-5H-pirido[3,2-f]pirolo[1,2-a]azepin-5-il)amino)-1-oksopropan- 2-il)-4,4,4-trifluorobutanamid, diastereomerni izomer sa izomernom čistoćom na položaju 5 većom od 90% enantiomernog viška, ili farmaceutski prihvatljiva so bilo kog od prethodnih.
3. 3. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje ili Jedinjenje iz patentnog zahteva 1 ili 2, ili njegov diastereomer u skladu sa patentnim zahtevim 1 ili 2, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i farmceutski prihvatljiv nosač.
4. 4. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, ili njegov diastereomer u skladu sa patentnim zahtevima 1 ili 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu u terapiji.
5. 5. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, ili njegov diastereomer u skladu sa patentnim zahtevima 1 ili 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu akutne limfoblastične leukemije T-ćelija, akutne limfoblastične leukemije, hronične limfoblastične leukemije, akutne mijelogene leukemije, hronične mijelogene leukemije, eritroleukemije, trostruko negativnog kancera dojke, kancera dojke, kancera jajnika, melanoma, kancera pluća, kancera ne malih ćelija pluća, kancera pankreasa, glioblastoma, kolorektalnog kancera, kancera glave i vrata, cervikalnog kancera, kancera prostate, kancera jetre, karcinoma oralnih skvamoznih ćelija, kancera kože, meduloblastoma, angiosarkoma, rabdomiosarkoma, liposarkoma, maligne fibrozne histiocitome, hepatocelularnog karcinoma, intrahepatičnog ili ekstrahepatičnog holangiokarcinoma ili adenoidnog cističnog karcinoma..
6. 6. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, ili njegov diastereomer u skladu sa patentnim zahtevima 1 ili 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 5 u tretmanu kancera pluća.
7. 7. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, ili njegov diastereomer u skladu sa patentnim zahtevima 1 ili 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu senzorineuralnog gubitka sluha izazvanog gubitkom slušnih trepljastih ćelija.
8. 8. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, ili njegov diastereomer u skladu sa patentnim zahtevima 1 ili 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu u indukciji generisanja slušnih trepljastih ćelija. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5