JP2018531892A - Pde3aまたはslfn12を発現するがんのための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる2015年8月13日に出願された米国仮特許出願第62/204875号の優先権および利益を主張するものである。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号3U54HG005032の下で、政府支援によってなされた。政府は本発明における一定の権利を有する。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を提供する:Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker編、1988);The Glossary of Genetics、第5版、R.Riegerら(編)、Springer Verlag(1991);およびHale&Marham、The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、他に特定されない限り、以下のそれらに帰属する意味を有する。
MAVPGDAARVRDKPVHSGVSQAPTAGRDCHHRADPASPRDSGCRGCWGDLVLQPLRSSRKLSSALCAGSLSFLLALLVRLVRGEVGCDLEQCKEAAAAEEEEAAPGAEGGVFPGPRGGAPGGGARLSPWLQPSALLFSLLCAFFWMGLYLLRAGVRLPLAVALLAACCGGEALVQIGLGVGEDHLLSLPAAGVVLSCLAAATWLVLRLRLGVLMIALTSAVRTVSLISLERFKVAWRPYLAYLAGVLGILLARYVEQILPQSAEAAPREHLGSQLIAGTKEDIPVFKRRRRSSSVVSAEMSGCSSKSHRRTSLPCIPREQLMGHSEWDHKRGPRGSQSSGTSITVDIAVMGEAHGLITDLLADPSLPPNVCTSLRAVSNLLSTQLTFQAIHKPRVNPVTSLSENYTCSDSEESSEKDKLAIPKRLRRSLPPGLLRRVSSTWTTTTSATGLPTLEPAPVRRDRSTSIKLQEAPSSSPDSWNNPVMMTLTKSRSFTSSYAISAANHVKAKKQSRPGALAKISPLSSPCSSPLQGTPASSLVSKISAVQFPESADTTAKQSLGSHRALTYTQSAPDLSPQILTPPVICSSCGRPYSQGNPADEPLERSGVATRTPSRTDDTAQVTSDYETNNNSDSSDIVQNEDETECLREPLRKASACSTYAPETMMFLDKPILAPEPLVMDNLDSIMEQLNTWNFPIFDLVENIGRKCGRILSQVSYRLFEDMGLFEAFKIPIREFMNYFHALEIGYRDIPYHNRIHATDVLHAVWYLTTQPIPGLSTVINDHGSTSDSDSDSGFTHGHMGYVFSKTYNVTDDKYGCLSGNIPALELMALYVAAAMHDYDHPGRTNAFLVATSAPQAVLYNDRSVLENHHAAAAWNLFMSRPEYNFLINLDHVEFKHFRFLVIEAILATDLKKHFDFVAKFNGKVNDDVGIDWTNENDRLLVCQMCIKLADINGPAKCKELHLQWTDGIVNEFYEQGDEEASLGLPISPFMDRSAPQLANLQESFISHIVGPLCNSYDSAGLMPGKWVEDSDESGDTDDPEEEEEEAPAPNEEETCENNESPKKKTFKRRKIYCQITQHLLQNHKMWKKVIEEEQRLAGIENQSLDQTPQSHSSEQIQAIKEEEEEKGKPRGEEIPTQKPDQ(配列番号3)
1 gggggccact gggaattcag tgaagagggc accctatacc atggcagtgc ccggcgacgc
61 tgcacgagtc agggacaagc ccgtccacag tggggtgagt caagccccca cggcgggccg
121 ggactgccac catcgtgcgg accccgcatc gccgcgggac tcgggctgcc gtggctgctg
181 gggagacctg gtgctgcagc cgctccggag ctctcggaaa ctttcctccg cgctgtgcgc
241 gggctccctg tcctttctgc tggcgctgct ggtgaggctg gtccgcgggg aggtcggctg
301 tgacctggag cagtgtaagg aggcggcggc ggcggaggag gaggaagcag ccccgggagc
361 agaagggggc gtcttcccgg ggcctcgggg aggtgctccc gggggcggtg cgcggctcag
421 cccctggctg cagccctcgg cgctgctctt cagtctcctg tgtgccttct tctggatggg
481 cttgtacctc ctgcgcgccg gggtgcgcct gcctctggct gtcgcgctgc tggccgcctg
541 ctgcgggggg gaagcgctcg tccagattgg gctgggcgtc ggggaggatc acttactctc
601 actccccgcc gcgggggtgg tgctcagctg cttggccgcc gcgacatggc tggtgctgag
661 gctgaggctg ggcgtcctca tgatcgcctt gactagcgcg gtcaggaccg tgtccctcat
721 ttccttagag aggttcaagg tcgcctggag accttacctg gcgtacctgg ccggcgtgct
781 ggggatcctc ttggccaggt acgtggaaca aatcttgccg cagtccgcgg aggcggctcc
841 aagggagcat ttggggtccc agctgattgc tgggaccaag gaagatatcc cggtgtttaa
901 gaggaggagg cggtccagct ccgtcgtgtc cgccgagatg tccggctgca gcagcaagtc
961 ccatcggagg acctccctgc cctgtatacc gagggaacag ctcatggggc attcagaatg
1021 ggaccacaaa cgagggccaa gaggatcaca gtcttcagga accagtatta ctgtggacat
1081 cgccgtcatg ggcgaggccc acggcctcat taccgacctc ctggcagacc cttctcttcc
1141 accaaacgtg tgcacatcct tgagagccgt gagcaacttg ctcagcacac agctcacctt
1201 ccaggccatt cacaagccca gagtgaatcc cgtcacttcg ctcagtgaaa actatacctg
1261 ttctgactct gaagagagct ctgaaaaaga caagcttgct attccaaagc gcctgagaag
1321 gagtttgcct cctggcttgt tgagacgagt ttcttccact tggaccacca ccacctcggc
1381 cacaggtcta cccaccttgg agcctgcacc agtacggaga gaccgcagca ccagcatcaa
1441 actgcaggaa gcaccttcat ccagtcctga ttcttggaat aatccagtga tgatgaccct
1501 caccaaaagc agatccttta cttcatccta tgctatttct gcagctaacc atgtaaaggc
1561 taaaaagcaa agtcgaccag gtgccctcgc taaaatttca cctctttcat cgccctgctc
1621 ctcacctctc caagggactc ctgccagcag cctggtcagc aaaatttctg cagtgcagtt
1681 tccagaatct gctgacacaa ctgccaaaca aagcctaggt tctcacaggg ccttaactta
1741 cactcagagt gccccagacc tatcccctca aatcctgact ccacctgtta tatgtagcag
1801 ctgtggcaga ccatattccc aagggaatcc tgctgatgag cccctggaga gaagtggggt
1861 agccactcgg acaccaagta gaacagatga cactgctcaa gttacctctg attatgaaac
1921 caataacaac agtgacagca gtgacattgt acagaatgaa gatgaaacag agtgcctgag
1981 agagcctctg aggaaagcat cggcttgcag cacctatgct cctgagacca tgatgtttct
2041 ggacaaacca attcttgctc ccgaacctct tgtcatggat aacctggact caattatgga
2101 gcagctaaat acttggaatt ttccaatttt tgatttagtg gaaaatatag gaagaaaatg
2161 tggccgtatt cttagtcagg tatcttacag actttttgaa gacatgggcc tctttgaagc
2221 ttttaaaatt ccaattaggg aatttatgaa ttattttcat gctttggaga ttggatatag
2281 ggatattcct tatcataaca gaatccatgc cactgatgtt ttacatgctg tttggtatct
2341 tactacacag cctattccag gcctctcaac tgtgattaat gatcatggtt caaccagtga
2401 ttcagattct gacagtggat ttacacatgg acatatggga tatgtattct caaaaacgta
2461 taatgtgaca gatgataaat acggatgtct gtctgggaat atccctgcct tggagttgat
2521 ggcgctgtat gtggctgcag ccatgcacga ttatgatcat ccaggaagga ctaatgcttt
2581 cctggttgca actagtgctc ctcaggcggt gctatataac gatcgttcag ttttggagaa
2641 tcatcacgca gctgctgcat ggaatctttt catgtcccgg ccagagtata acttcttaat
2701 taaccttgac catgtggaat ttaagcattt ccgtttcctt gtcattgaag caattttggc
2761 cactgacctg aagaaacact ttgacttcgt agccaaattt aatggcaagg taaatgatga
2821 tgttggaata gattggacca atgaaaatga tcgtctactg gtttgtcaaa tgtgtataaa
2881 gttggctgat atcaatggtc cagctaaatg taaagaactc catcttcagt ggacagatgg
2941 tattgtcaat gaattttatg aacagggtga tgaagaggcc agccttggat tacccataag
3001 ccccttcatg gatcgttctg ctcctcagct ggccaacctt caggaatcct tcatctctca
3061 cattgtgggg cctctgtgca actcctatga ttcagcagga ctaatgcctg gaaaatgggt
3121 ggaagacagc gatgagtcag gagatactga tgacccagaa gaagaggagg aagaagcacc
3181 agcaccaaat gaagaggaaa cctgtgaaaa taatgaatct ccaaaaaaga agactttcaa
3241 aaggagaaaa atctactgcc aaataactca gcacctctta cagaaccaca agatgtggaa
3301 gaaagtcatt gaagaggagc aacggttggc aggcatagaa aatcaatccc tggaccagac
3361 ccctcagtcg cactcttcag aacagatcca ggctatcaag gaagaagaag aagagaaagg
3421 gaaaccaaga ggcgaggaga taccaaccca aaagccagac cagtgacaat ggatagaatg
3481 ggctgtgttt ccaaacagat tgacttgtca aagactctct tcaagccagc acaacattta
3541 gacacaacac tgtagaaatt tgagatgggc aaatggctat tgcattttgg gattcttcgc
3601 attttgtgtg tatattttta cagtgaggta cattgttaaa aactttttgc tcaaagaagc
3661 tttcacattg caacaccagc ttctaaggat tttttaagga gggaatatat atgtgtgtgt
3721 gtatataagc tcccacatag atacatgtaa aacatattca cacccatgca cgcacacaca
3781 tacacactga aggccacgat tgctggctcc acaatttagt aacatttata ttaagatata
3841 tatatagtgg tcactgtgat ataataaatc ataaaggaaa ccaaatcaca aaggagatgg
3901 tgtggcttag caaggaaaca gtgcaggaaa tgtaggttac caactaagca gcttttgctc
3961 ttagtactga gggatgaaag ttccagagca ttatttgaat tctgatacat cctgccaaca
4021 ctgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgaaaga gagacagaag
4081 ggaatggttt gagagggtgc ttgtgtgcat gtgtgtgcat atgtaaagag atttttgtgg
4141 tttaagtaac tcagaatagc tgtagcaaat gactgaatac atgtgaacaa acagaaggaa
4201 gttcactctg gagtgtcttt gggaggcagc cattccaaat gccctcctcc atttagcttc
4261 aataaagggc cttttgctga tggagggcac tcaagggctg ggtgagaggg ccacgtgttt
4321 ggtattacat tactgctatg caccacttga aggagctcta tcaccagcct caaacccgaa
4381 agactgaggc attttccagt ctacttgcct aatgaatgta taggaactgt ctatgagtat
4441 ggatgtcact caactaagat caaatcacca tttaagggga tggcattctt tatacctaaa
4501 cacctaagag ctgaagtcag gtcttttaat caggttagaa ttctaaatga tgccagagaa
4561 ggcttgggaa attgtacttc agcgtgatag cctgtgtctt cttaatttgc tgcaaaatat
4621 gtggtagaga aagaaaagga aacagaaaaa tcactctggg ttatatagca agagatgaag
4681 gagaatattt caacacaggg tttttgtgtt gacataggaa aagcctgatt cttggcaact
4741 gttgtagttt gtctttcagg ggtgaaggtc ccactgacaa cccctgttgt ggtgttccac
4801 acgctgtttg ttggggtagc ttccatcggc agtctggccc attgtcagtc atgcttcttc
4861 tggccgggga gattatagag agattgtttg aagattgggt tattattgaa agtctttttt
4921 tttgtttgtt ttgttttggt ttgtttgttt atctacactt gtttatgctg tgagccaaac
4981 ctctatttaa aaagttgata ctcactttca atattttatt tcatattatt atatatgtca
5041 tgatagttat cttgatgtaa atatgaagat ttttttgttt ctgtagatag taaactcttt
5101 ttttaaaaaa ggaaaaggga aacattttta taaagttata ttttaatcac catttttata
5161 cattgtagtt ctctccaagc ccagtaagag aatgatgatt catttgcatg gaggtcgatg
5221 gacaaccaat catctacctt ttctaattta aatgataatc tgatatagtt ttattgccag
5281 ttaaatgagg atgctgcaaa gcatgttttt tcactagtaa cttttgctaa ctgaatgaat
5341 tctgggtcca tatctcccag atgaaaaact gttaaccaat accatatttt atagttggtg
5401 tccatttctt tccaacactg tttgttatga ttcttccttg agtacttata tacagacctg
5461 ctcattatct aaacaatctt accttctaag taaaccttga ttgtgatttc cagtttttat
5521 tttctctgac gtagtagaaa ggaatgttta cattaaaaat acttttgttt ctcataaatg
5581 gatattgtac tccccccttt caaagcatta ttttacaata attcatggca ttttaaaaaa
5641 taaggcaaag ataatacgac aaaaaatata catggtttca aggcaaattc tccaataagt
5701 tggaaaatgt aaaaaggatc aagtggatgc agcctctacc taaataatta aaatatattt
5761 cagtatattt ctgaattaac accaggtctt cattatttag aacttactaa attgttttca
5821 ttttcttagt tttacctgtg tatctccatg tttgcaaaaa ttactataag tcaaattttg
5881 ccagtgaatt taactatttt tctttccttg caattaaggg gaaaaaagca tttatcttat
5941 cttctcatac cccttgcatc taagtactta gcaaagtcaa tattttccca ttttccaaat
6001 gcgtccatct ctaacataaa tattaattga acatagagct atgtttggag tgagtggact
6061 ggcaggacag ttggaagtcc atcacagtct attgacagtt tcatcaaagc tgtatagtcc
6121 aactagtggg gcagcttggc tactatggtg gaagtctcag caaactgcct ggttttgttt
6181 gtttgttttg ttttaaggta caggaaataa gaggaataat agtggccaaa gcaattagaa
6241 catcttcatt ccagaactgt gttcagcaat ccaggcagat tgatacattt ttctttaaaa
6301 ataaattgct attacagcta gacgtcaatt gggataaata aagggatgaa gatccactaa
6361 gtttgtgact ttcatacaca cccagtacat ctcaaaggat gctaagggac attttctgcc
6421 agtagagttc tccccctttt tggtgacagc aatattatta tgttcacatc taactccaga
6481 gcttacttcc tgtggtgcca atgtatttgt tgcaatttac tacattttta tatgagccta
6541 tttataggtg ccattaaact caggtctttc aaatgaaaga gtttctagcc cacttaggga
6601 aaaagataat tgtttagaaa accataaaat caatggtagg aaaagttgga actggttacc
6661 tggatgccat ggttctctgt taaataaagt aagagaccag gtgtattctg agtgtcatca
6721 gtgttatttt cagcatgcta ataaatgtct ttccggttat atatctatct aaattaacct
6781 ttaaaatatt ggtttccttg ataaaagcac cacttttgct tttgttagct gtaatatttt
6841 ttgtcattta gataagacct ggtttggctc tcaataaaag atgaagacag tagctctgta
6901 cagggatata tctatattag tcttcatctg atgaatgaag aaattttctc atattatgtt
6961 caagaaagta tttacttcct aaaaatagaa ttcccgattc tgtctatttt ggttgaatac
7021 cagaacaaat ctttccgttg caatcccagt aaaacgaaag aaaaggaata tcttacagac
7081 tgttcatatt agatgtatgt agactgttaa tttgcaattt ccccatattt cctgcctatc
7141 ttacccagat aactttcttt gaaggtaaaa gctgtgcaaa aggcatgaga ctcaggccta
7201 ctctttgttt aaatgatgga aaaatataaa ttattttcta agtaataaaa gtataaaaat
7261 tatcattata aataaagtct aaagtttgaa attattaatt taaaaaaaaa aaaaaaaaa
(配列番号4)
MNISVDLETNYAELVLDVGRVTLGENSRKKMKDCKLRKKQNESVSRAMCALLNSGGGVIKAEIENEDYSYTKDGIGLDLENSFSNILLFVPEYLDFMQNGNYFLIFVKSWSLNTSGLRITTLSSNLYKRDITSAKVMNATAALEFLKDMKKTRGRLYLRPELLAKRPCVDIQEENNMKALAGVFFDRTELDRKEKLTFTESTHVEIKNFSTEKLLQRIKEILPQYVSAFANTDGGYLFIGLNEDKEIIGFKAEMSDLDDLEREIEKSIRKMPVHHFCMEKKKINYSCKFLGVYDKGSLCGYVCALRVERFCCAVFAKEPDSWHVKDNRVMQLTRKEWIQFMVEAEPKFSSSYEEVISQINTSLPAPHSWPLLEWQRQRHHCPGLSGRITYTPENLCRKLFLQHEGLKQLICEEMDSVRKGSLIFSRSWSVDLGLQENHKVLCDALLISQDSPPVLYTFHMVQDEEFKGYSTQTALTLKQKLAKIGGYTKKVCVMTKIFYLSPEGMTSCQYDLRSQVIYPESYYFTRRKYLLKALFKALKRLKSLRDQFSFAENLYQIIGIDCFQKNDKKMFKSCRRLT(配列番号5)
1 tttgtaactt cacttcagcc tcccattgat cgctttctgc aaccattcag actgatctcg
61 ggctcctatt tcatttacat tgtgtgcaca ccaagtaacc agtgggaaaa ctttagaggg
121 tacttaaacc ccagaaaatt ctgaaaccgg gctcttgagc cgctatcctc gggcctgctc
181 ccaccctgtg gagtgcactt tcgttttcaa taaatctctg cttttgttgc ttcattcttt
241 ccttgctttg tttgtgtgtt tgtccagttc tttgttcaac acgccaagaa cctggacact
301 cttcactggt aacatatttt ggcaagccaa ccaggagaaa agaatttctg cttggacact
361 gcatagctgc tgggaaaatg aacatcagtg ttgatttgga aacgaattat gccgagttgg
421 ttctagatgt gggaagagtc actcttggag agaacagtag gaaaaaaatg aaggattgta
481 aactgagaaa aaagcagaat gaaagtgtct cacgagctat gtgtgctctg ctcaattctg
541 gagggggagt gatcaaggct gaaattgaga atgaagacta tagttataca aaagatggaa
601 taggactaga tttggaaaat tcttttagta acattctgtt atttgttcct gagtacttag
661 acttcatgca gaatggtaac tactttctga tttttgtgaa gtcatggagc ttgaacacct
721 ctggtctgcg gattaccacc ttgagctcca atttgtacaa aagagatata acatctgcaa
781 aagtcatgaa tgccactgct gcactggagt tcctcaaaga catgaaaaag actagaggga
841 gattgtattt aagaccagaa ttgctggcaa agaggccctg tgttgatata caagaagaaa
901 ataacatgaa ggccttggcc ggggtttttt ttgatagaac agaacttgat cggaaagaaa
961 aattgacctt tactgaatcc acacatgttg aaattaaaaa cttctcgaca gaaaagttgt
1021 tacaacgaat taaagagatt ctccctcaat atgtttctgc atttgcaaat actgatggag
1081 gatatttgtt cattggttta aatgaagata aagaaataat tggctttaaa gcagagatga
1141 gtgacctcga tgacttagaa agagaaatcg aaaagtccat taggaagatg cctgtgcatc
1201 acttctgtat ggagaagaag aagataaatt attcatgcaa attccttgga gtatatgata
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2341 actctgtctg tagttcctga ataaattttc ttccatgctt gaactgggaa aattgcaaca
2401 cttttattct taatgacaac agtgaaaatc tcccagcata tacctagaaa acaattataa
2461 cttacaaaag attatccttg atgaaactca gaatttccac agtgggaatg aataagaagg
2521 caaaactcat(配列番号6)
PDE3Aモジュレーターの同定を、変異型tp53バックグラウンド中の細胞傷害性小分子を同定するよう設計された表現型スクリーニングに関連して行った。ケモゲノミクスアプローチは、広範なインビトロおよびインビボ標的検証からなる標的駆動薬物開発プログラムを補完し、逆ケモゲノミクスとも呼ばれ得る(Zhengら、Curr Issues Mol Biol 4、33〜43、2002)。こうして多くの米国食品医薬品局(FDA)承認標的療法が開発され、その中に発癌性体細胞ドライバー変異を標的とする小分子キナーゼ阻害剤がある(Moffatら、Nat Rev Drug Discov 13、588〜602、2014)。しかしながら、標的療法の発見および開発は、しばしば、標的の生物学的機能、その作用機序、および標的を選択的に阻害するための利用可能な化学物質に関する知識の限界によって妨げられる。
本発明の化合物は、化合物自体、ならびに適用可能であればそれらの塩およびそれらのプロドラッグを含む。塩は、例えば、アニオンと、本明細書に記載される化合物上の正に帯電した置換基(例えば、アミノ)との間で形成され得る。適切なアニオンには、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩および酢酸塩が含まれる。同様に、塩は、カチオンと、本明細書に記載される化合物上の負に帯電した置換基(例えば、カルボキシレート)との間でも形成され得る。適切なカチオンには、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンおよびアンモニウムカチオン(テトラメチルアンモニウムイオンなど)が含まれる。プロドラッグの例としては、対象に投与すると、活性化合物を提供することができるカルボン酸基のC1〜6アルキルエステルが挙げられる。
本発明は、がんの特徴付けのための診断アッセイを特徴とする。一実施形態では、PDE3Aおよび/またはSchlafen12(SLFN12)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを対象試料で測定し、PDE3Aモジュレーターによる治療に反応性のがんの指標として使用する。PDE3Aおよび/またはSchlafen12ポリヌクレオチドのレベルは、定量的PCR、ノーザンブロット、マイクロアレイ、質量分析およびin situハイブリダイゼーションなどの標準的な方法によって測定することができる。標準的な方法を使用して腫瘍由来の生体試料中のPDE3Aおよび/またはSchlafen12ポリペプチドのレベルを測定することができる。このような方法には、PDE3Aおよび/またはSchlafen12に結合する抗体用いるイムノアッセイ、ELISA、ウェスタンブロット法、ならびにラジオイムノアッセイが含まれる。基準に対するPDE3AおよびSchlafen12ポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルの上昇は、PDE3Aモジュレーターによる治療に反応性のがんの陽性指標と考えられる。
PDE3Aモジュレーター治療に対する対象の悪性腫瘍の反応性を特徴付ける際に、PDE3Aおよび/またはSLFN12発現のレベルを、様々な種類の生体試料で測定する。一実施形態では、生体試料が腫瘍試料である。
本明細書で以下に報告されるように、悪性腫瘍に罹患している対象を、治療方法を選択する過程でPDE3Aおよび/またはSLFN12の発現について試験することができる。基準レベルに対してPDE3Aおよび/またはSLFN12が増加していると特徴付けられた患者は、PDE3Aモジュレーター治療に反応性であると同定される。
本発明は、PDE3Aモジュレーター治療に対する対象の反応性または抵抗性を特徴付けるためのキットを提供する。
実施例1.細胞選択的細胞傷害性小分子の同定
細胞選択的細胞傷害活性を有する抗がん化合物を同定するために、2つの肺腺癌細胞株、A549およびNCI−H1734(いずれも発癌性KRAS変異および短縮型STK11変異を有し、それぞれTP53野生型および変異体(R273L)であった)で不偏化学スクリーニングを行った。1924種の化合物を、2連で384ウェルフォーマットの10μMの単一濃度でA549およびNCI−H1734細胞株の分子ライブラリー小分子貯蔵確認セットからスクリーニングした。細胞生存率の代理として、化合物処理の48時間後にATP含量を測定した。
6−(4−(ジエチルアミノ)−3−ニトロフェニル)−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3(2H)−オン(DNMDP)による強力な細胞選択的増殖阻害を考慮して、その作用機序をより詳細に調べた。DNMDPの分子標的を決定するために、がん細胞株百科事典(CCLE、Barretinaら、2012)の一部として突然変異、コピー数および遺伝子発現特徴について以前特徴付けられた766の試験細胞株のケモゲノミクス分析を行って、これらのゲノム特徴とDNMDP感受性との間の相関を探した。細胞株セットにわたるDNMDP感受性と個々の遺伝子の発現との間のピアソン相関の分析は、ホスホジエステラーゼ3AをコードするPDE3A遺伝子の発現と強い相関を示した(図5A)。DNMDP感受性とPDE3A発現との間の相関は完全ではなく(図18)、全766細胞株の手動検証がロジスティックに実行可能ではないため、細胞株感受性特性のハイスループット性のためいくつかの誤差が導入される可能性がある。対照的に、突然変異およびコピー数の特徴はDNMDP感受性と相関しなかった。逆に、試験した480種の化合物で、DNMDP感受性はPDE3A発現と最も相関しており(図5B)、PDE3A発現の高いがん細胞株は他の試験化合物よりもDNMDPに対してより明確に感受性であることが示された。最初のスクリーニングの動機とは対照的に、TP53突然変異またはp53機能の他の尺度とDNMDP感受性との間に相関はなかった。
6−(4−(ジエチルアミノ)−3−ニトロフェニル)−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3(2H)−オン(DNMDP)およびいくつかのPDE3阻害剤がHeLaおよび他のDNMDP感受性細胞を死滅させるが、他のPDE3阻害剤は細胞生存率に影響を与えない、ホスホジエステラーゼ3A(PDE3A)阻害と細胞死滅との複雑な関係は、以下を含むいくつかの可能な解釈を示した:1)細胞傷害活性はPDE3非依存性であり、スクリーニングを通した異なるタンパク質に対する作用により、234種のキナーゼは10μMのDNMDPによるキナーゼ阻害を見出さなかった;2)細胞傷害性および非細胞傷害性のPDE3阻害剤は、タンパク質内の異なる部位に結合し、異なる活性を発揮する可能性がある;または3)細胞傷害性および非細胞傷害性のPDE3阻害剤はPDE3活性部位に結合するが、タンパク質の立体配座および活性に異なる効果を有する可能性がある。この第3の可能性は予期されないかもしれないが、PDE4のアロステリックモジュレーターはPDE4活性部位に結合し、上流(UCR2)および下流(CR3)調節ドメインと相互作用し、それによって特異的な不活性コンフォメーションを安定化することが示されている(Burginら、Nat Biotechnol 28巻、63〜70頁、2010)。最も重要なことに、インビトロでのcAMP加水分解について類似のIC50を有するPDE4競合阻害剤およびPDE4アロステリックモジュレーターは、動物試験において異なる細胞活性および安全性プロファイルを有していた(Burginら、Nat Biotechnol 28、63〜70、2010)。PDE阻害剤または他の小分子がDNMDPと競合するかどうかを評価するために、1600種の生物活性化合物のPHARMAKON 1600コレクション(PHARMAKON 1600は米国および国際薬局方の1600の既知の薬物の独特なコレクションである)をスクリーニングして、DNMDPによって誘発される細胞死を救済することができた化合物を同定した。HeLa細胞を30nMのDNMDP(EC70濃度)および20μMの各生物活性化合物で同時処理した。48時間処理後の細胞生存率を、先に記載されるようにATP消費によって評価した。DNMDPによって誘発された細胞死を救済した5種の最も強力な化合物は全てPDE阻害剤であり、3種の最も強力な化合物、レボシメンダン、ミルリノンおよびシロスタゾールは全て選択的PDE3阻害剤であった(図9A)。
ホスホジエステラーゼ3A(PDE3A)タンパク質存在量への6−(4−(ジエチルアミノ)−3−ニトロフェニル)−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3(2H)−オン(DNMDP)細胞傷害性の依存性は、セレブロンとIKAROSファミリージンクフィンガー1(IKZF1)およびIKZF3との間の相互作用を安定化することによって新形態または高次形態機序によって作用するレナリドミドについて最近観測されたものと同様の可能な機序を示した(Kronkeら、Science 343、301〜305、2014;Luら、Science343、305〜309、2014)。さらに、PDE4アロステリックモジュレーターは、競合阻害剤ではないが、PDE4パートナータンパク質DISC1に独特に結合することが独立に示されている「閉じた」タンパク質コンフォメーションに結合し、これを安定化することが示されている(Millarら、Science 310、1187〜1191、2005)。PDE3Aが存在するタンパク質複合体を正常条件下で特徴付け、PDE3AがDNMDPまたは非細胞傷害性PDE3阻害剤トレキンシンに結合した場合、これらの複合体がどのように変化するかを調べた。Hela細胞からのPDE3Aおよび相互作用タンパク質を、DNMDPおよびトレキンシンの存在下で免疫沈降させ、引き続いて相対存在量のために同重体安定同位体タグによる標識化をし、質量分析によって定量化した(iTRAQ/MS、図13A)。HeLa細胞からのPDE3A免疫沈降物は、タンパク質ホスファターゼ2サブユニット(PPP2CA、PPP2R1A、PPP2R1B、PPP2R2A、PPP2R2D)、カルシニューリン(PPP3R1、PPP3CA、Becaら、Circ.Res.112、289〜297、2013)、14−3−3(YWHAB、YWHAQ、YWHAG、YWHAZ、Pozuelo Rubioら、Biochem.J.392、163〜172、2005)およびチューブリン(TUBA1C、TUBA1B)ファミリーメンバーを含む複数のタンパク質ホスファターゼサブユニットについて濃縮されていた(図13Bおよび図14A)。さらに、PDE3AおよびPDE3Bは以前に報告された同じタンパク質複合体に存在することが見出された(Malovannayaら、Cell 145、787〜799、2011)。
1500個のNCI−H1734または1000個のA549細胞を、10%ウシ胎児血清および1%Pen/Strepを補充した40μlのRPMI中384ウェルプレートに蒔いた。プレーティング24時間後、1924種の小分子の化合物ライブラリーを10μMの濃度で添加した。スタウロスポリンを10μMの濃度で細胞傷害性についての陽性対照として使用し、DMSOを1%の濃度で陰性対照として使用した。全ての化合物を、示される小分子と共に48時間インキュベートした。48時間後、384ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、20分間室温に冷却させた。THERMO COMBI(商標)またはマルチチャネルピペットを用いてPBS中25%CELLTITERGLO(登録商標)(Promega)40μlを添加し、10分間インキュベートすることによって細胞生存率を評価した。Perkin−Elmer EnVisionを用いて発光シグナルを読み取った。生存率を、DMSO対照に正規化することによって計算した。
1000個のHeLa(DMEM)、1000個のA549(RPMI)、500個のMCF−7(DMEM)、4000個のPC3(F12−K)、1000個のNCI−H2122(RPMI)または1500個のNCI−H1563(RPMI)細胞を、10%ウシ胎児血清を補充した対応する増殖培地40μl中384ウェルプレートに蒔いた。プレーティング24時間後、示される化合物を示される濃度で添加し、48時間インキュベートした。NCI−H1734およびA549細胞株における化合物ライブラリースクリーニングに記載されるように細胞生存率を評価した。
1000個のHeLa細胞を、10%ウシ胎児血清を補充した対応する増殖培地40μl中384ウェルプレートに蒔いた。プレーティング24時間後、示される化合物を示される濃度で添加し、48時間インキュベートした。Promega製のCaspase−Gloを製造者の推奨に従って添加し、NCI−H1734およびA549細胞株における化合物ライブラリースクリーニングに記載されるように発光を測定した。
DNMDPに対する、23の異なる系統から引き抜いた777のがん細胞株(CCL)の感受性を測定した。各細胞株を、500個の細胞/ウェルの密度で、白色不透明の1536個のプレート中の好ましい培地に蒔いた。一晩インキュベートした後、DNMDPを、2連で、2倍段階で66.4μM〜2nMに及ぶ16濃度で音響伝達により添加した(Labcyte Echo 555,Labcyte Inc.、Sunnyvale、CA)。72時間の処理後、ViewLux Microplateイメージャ(PerkinElmer、Waltham、MA)を用いて製造業者のプロトコルに従って、細胞ATPレベルを生存率の代用として測定し(CELLTITERGLO(登録商標)、Promega Corporation、Madison、WI)、バックグラウンド(媒体のみ)およびビヒクル(DMSO)処理対照ウェルに正規化した。
Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayで測定された遺伝子中心ロバストマルチチップ平均(RMA)−正規化基礎mRNA遺伝子発現データを、がん細胞株百科事典(CCLE、ヒトがん細胞の大きな一団の詳細な遺伝的特徴付け;Barretinaら、Nature 483、603〜607、2012)からダウンロードした。ピアソン相関係数を、760個の重複するCCLにわたり遺伝子発現(18988個の転写産物)と曲線下面積(AUC)との間で計算した。異なる数のCCLに曝露された小分子間の比較のために、フィッシャーの変換を用いて相関係数を変換した。
一般的な詳細
全ての反応は窒素(N2)雰囲気下で行った。全ての試薬および溶媒は、商業的供給業者から購入し、受け取ったまま使用した。核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、Bruker(300または400MHz 1H、75または101MHz 13C)分光計で記録した。プロトンおよび炭素化学シフトは、NMR溶媒を基準とするppm(δ)で報告する。データを以下の通り報告する:化学シフト、多重度(br=ブロード、s=一重項、d=二重項、t=三重項、q=四重項、m=多重項;1つまたは複数のカップリング定数(Hz))。フラッシュクロマトグラフィーは、Teledyne Isco Combiflash Rfで40〜60μmのシリカゲル(60Åメッシュ)を用いて行った。一定の0.1%ギ酸を含む2.5分にわたり水中0〜100%CH3CNの勾配を用いるWaters Symmetry C18カラム(3.5μm、4.6X100mm)を用いて、Waters 2795分離モジュールおよび3100質量検出器で、タンデム液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)を行った。分析用薄層クロマトグラフィー(TLC)は、EM Reagent 0.25mmシリカゲル60−Fプレートで行った。元素分析は、Robertson Microlit Laboratories、Ledgewood NJによって行った。
DNMDP−2L 18mg(0.04mmol)のCH2Cl2 0.8mL中溶液に、トリフルオロ酢酸(TFA)0.2mLを添加し、溶液を2時間撹拌した後、濃縮し、DMSO0.5mLに溶解した。これにEt3N 10μL(0.07mmol)およびN,N’−ジスクシンイミジルカーボネート(DSC)12mg(0.05mmol)を添加し、溶液を一晩撹拌した。LC分析が反応が完了していないことを示したので、N,N’−ジスクシンイミジルカーボネートさらに25mg(0.1mmol)を添加した。2時間後のLC分析は、約5:1比のDSC生成物:アミンを示した。Affi−Gel 102樹脂の1mL試料を遠心分離機を用いてDMSOで5回すすぎ、次いで、DMSO0.5mLに懸濁した。樹脂にDSC生成物溶液30μLおよびEt3N 25μLを添加し、混合物を渦巻かせた。2日後、DMSO溶液のLC分析は、DCS付加物の完全な消失を示した。未誘導体化アミンが依然として存在していた。DMSOを遠心分離によって除去し、デカントし、樹脂をDMSOで数回すすぎ、PBS緩衝液に保存した。
1000個のHeLa細胞を、10%ウシ胎児血清および1%Pen/Strepを補充した40μlのDMEM中384ウェルプレートに蒔いた。プレーティング24時間後、1600種の生理活性分子(Pharmacon)の化合物ライブラリーを20μMの濃度で添加した。生物活性化合物のインキュベーションと並行して、DNMDPを30nMの最終濃度まで添加し、48時間インキュベートした。NCI−H1734およびA549細胞株における化合物ライブラリースクリーニングに記載されるように細胞生存率を評価した。
HeLa細胞を氷冷PBSで洗浄した後、EDTAを含まないプロテアーゼ阻害剤(Roche)ならびにホスファターゼ阻害剤混合物IおよびII(Calbiochem)を補充したNP−40溶解緩衝液(150mM NaCl、10%グリセロール、50mMトリス−Cl pH8.0、50mM MgCl2、1%NP−40)で溶解した。細胞溶解物を氷上で少なくとも2分間インキュベートし、その後、4℃で15700×gで10分間遠心分離し、その後、BCAタンパク質アッセイキット(Pierce)を用いて上清を定量化した。合計200μgのHeLa細胞溶解物を、親和性リンカーDNMDP−2Lに結合した3μlのAffi−Gel102樹脂(BioRad)と総体積400μlで4時間インキュベートした。インキュベーションの前に、示される化合物を10μMの最終濃度で親和性精製に添加した。10μMの対応する化合物濃度を含有する溶解緩衝液で試料を3回洗浄した。Affi−Gel 102樹脂に結合したタンパク質を、還元し、変性させ、トリス−グリシンゲル(Novex)を用いて分離し、iBlot移送システム(Novex)を用いてニトロセルロース膜に移した。膜をPDE3Aに対する一次抗体(1:1000、Bethyl)と共に4℃で一晩インキュベートした。室温で2時間の二次抗体(1:20000、LI−COR Biosciences)とのインキュベーションおよびその後の検出(Odyssey Imaging System、LI−COR Biosciences)を、製造業者の推奨に従って行った。
HeLa細胞を示される濃度のDNMDPおよびスタウロスポリンで36時間処理した。HeLa細胞を溶解し、DNMDPの分子標的のリンカー親和性精製および免疫ブロットに記載されるように処理した。膜をPARPに対する抗体(1:1000、Cell Signaling#9532)およびアクチンと共にインキュベートし、その後、DNMDPの分子標的のリンカー親和性精製および免疫ブロットに記載されるように画像化した。
CRISPR標的部位を、MIT CRISPR設計ツール(オンラインMIT CRISPR設計ポータル)を用いて同定した。sgRNAのクローニングのために、順方向および逆方向オリゴをアニールし、リン酸化し、BsmBI消化pXPR_BRD001に連結した。オリゴ配列は以下の通りである:
HeLa細胞を96ウェルプレートに蒔き、製造者の推奨に従って、PDE3Aおよび非標的siRNAスマートプール(On Target Plus、Thermo Scientific)で24時間後にトランスフェクトした。HeLa細胞溶解物をトランスフェクションの24時間後および72時間後に得て、DNMDPの分子標的のリンカー−親和性精製および免疫ブロットに記載されるように、PDE3Aおよびアクチン(1:20000、Cell Signaling)について免疫ブロットした。HeLa細胞を示される濃度の化合物3で48時間処理した。NCI−H1734およびA549細胞株における化合物ライブラリースクリーニングに記載されるように細胞生存率を評価した。
5000個のHeLa細胞を96ウェルプレートに蒔いた。プレーティングの24時間後、HeLa細胞を示される濃度の示される化合物と共に1時間インキュベートした。cAMPレベルを、製造業者の推奨に従ってCAMP−GLO(商標)アッセイ(Promega)を用いて測定した。製造業者の推奨に従って作成された標準曲線に正規化することによって、cAMPの細胞濃度を決定した。
HeLa細胞におけるPDE3Aの免疫沈降
HeLa細胞を、10μMの示される化合物:DMSO、DNMDPおよびトレキンシンで溶解前に4時間処理した。DNMDPの分子標的のリンカー−親和性精製および免疫ブロットに記載されるように、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤、ならびに最終濃度10μMまでの上記の示される化合物を補充したModRipa溶解緩衝液(1%NP−40:50mMトリス−HCl、pH7.8、150mM NaCl、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、1mM EDTA)でHeLa細胞を溶解した。HeLa全細胞溶解物13mgを0.5%PDE3A抗体(Bethyl)と共にインキュベートし、一晩インキュベートした。PDE3A抗体に対するブロッキングペプチド(Bethyl)を、対応する条件でPDE3A抗体と同時に添加した。次いで、全細胞溶解物と抗体混合物をプロテインAプラスアガロース10μl(Fisher Scientific)と共に4℃で30分間インキュベートした。次いで、プロテインAプラスアガロースを、10μMの濃度の示される化合物を含有する溶解緩衝液で2回洗浄した。最後に、プロテインAプラスアガロースを、NP−40を含有せず、10μMの濃度の示される化合物を含有する溶解緩衝液で1回洗浄した。
免疫精製からのビーズをIP溶解緩衝液で1回洗浄し、次いで、PBSで3回洗浄し、各反復の3つの異なる溶解物を90μL消化緩衝液(2M尿素、50mMトリスHCl)に再懸濁し、配列決定グレードのトリプシン2μgを添加し、700rpmで1時間振盪した。上清を取り出し、新しいチューブに入れた。次いで、ビーズを消化緩衝液50μLで2回洗浄し、上清と合わせた。合わせた上清を還元し(2μL500mM DTT、30分間、室温)、アルキル化し(4μL500mM IAA、45分間、暗所)、より長い一晩の消化を行った:トリプシン2μg(4μL)、一晩振盪。次いで、試料を10%葉酸(FA)20uLでクエンチし、10mgのSEP−PAK(登録商標)カラムで脱塩した。
脱塩されたペプチドを、製造者の指示(AB Sciex、Foster City、CA)に従って相対および絶対定量(iTRAQ)−試薬のために同重体タグで標識した。ペプチドを0.5M TEAB pH8.5溶液30μlに溶解し、標識試薬をエタノール70μlに添加した。1時間のインキュベーション後、50mM Tris/HCl pH7.5で反応を停止させた。示差的に標識したペプチドを混合し、その後、10mgのSEP−PAK(登録商標)カラムで脱塩した。
1:酢酸アンモニウム50mM、pH4.5、
2:酢酸アンモニウム50mM pH5.5、
3:酢酸アンモニウム50mM、pH6.5、
4:重炭酸アンモニウム50mM pH8、
5:水酸化アンモニウム0.1%pH9、
6:水酸化アンモニウム0.1%pH11。
再構成されたペプチドを、オンラインナノフローEASY−NLC(商標)1000UHPLCシステム(Thermo Fisher Scientific)上で分離し、卓上Orbitrap Q EXACTIVE(商標)質量分析計(Thermo Fisher Scientific)で分析した。ペプチド試料を、20cm C18シリカ材料(1.9μm REPROSIL−PUR(登録商標)C18−AQ培地、Dr.Maisch GmbH、r119.aq)を用いて社内で充填したキャピラリーカラム(10μm先端開口部/直径75μmのPICOFRIT(登録商標)、New Objective、PF360−75−10−N−5)に注入した。UHPLCセットアップを、カスタムフィットマイクロ適合ティー(360μm、IDEX Health&Science、UH−753)と接続し、キャピラリーカラムをカラムヒータースリーブ(Phoenix−ST)で50℃に加熱して、UHPLC分離中の背圧を低減した。注入したペプチドを、100%溶媒A(3%アセトニトリル、0.1%ギ酸)から30%溶媒B(90%アセトニトリル、0.1%ギ酸)の線形80分勾配、引き続いて30%溶媒Bから90%溶媒Bの直線形6分勾配で、200nL/分の流量で分離した。各試料を、試料ローディングおよびカラム平衡時間を含めて120分間流した。Q EXACTIVE(商標)装置を、3×106イオンのMS1イオン標的および5×104イオンのMS2標的を用いて、12種の上位の最も豊富なイオンで各MS1スキャン(R=70000)後の高エネルギー衝突解離(HCD)MS/MSスキャン(R=17500)を取得するデータ依存モードで運転した。MS/MSスキャンに利用した最大イオン時間は120msであった;HCD正規化衝突エネルギーを27に設定した;動的排除時間を20秒に設定し、ペプチドの一致および同位体排除機能を使用可能にした。
全ての質量スペクトルを、相対および絶対定量(iTRAQ)に基づく定量のための同重体タグのために出願人によって開発されたモジュールを含むSpectrum Millソフトウェアパッケージv4.1ベータ(Agilent Technologies)を用いて処理した。前駆体イオン定量を、各前駆体イオンについて抽出イオンクロマトグラム(XIC’s)を用いて行った。MS/MSに供された各前駆体イオンのXICのピーク面積を、Spectrum Millソフトウェアによって、同位体クラスターの各個々のメンバーの周りの狭い窓を用いた液体クロマトグラフィー(LC)−MS/MS実行の介在する高分解能MS1スキャンで自動的に計算した。同位体クラスター内のピークの相対的分布に関する品質メトリクス対理論を条件に、MSスキャン分解能、前駆体電荷およびm/zに基づいて、時間とm/z領域の両方におけるピーク幅を動的に決定した。+/−60秒以内に同じ解離モードで同じ前駆体m/zで得られた類似のMS/MSスペクトルを併合した。シーケンスタグ長>1(すなわち、アミノ酸の鎖内質量によって分離される3質量の最小)を有さないことによって品質フィルタに不合格であった前駆体電荷>7および品質の悪いMS/MSスペクトルを有するMS/MSスペクトルを検索から除外した。
HeLa細胞を、V5タグ化SIRT7、V5タグ化SLFN12またはV5タグ化GFPを発現するORF過剰発現構築物でトランスフェクトした。ORF発現構築物を、TRC(クローンID:TRCN0000468231、TRCN0000476272、ccsbBroad304_99997)から得た。トランスフェクションの72時間後、細胞を10μM DNMDPまたはトレキンシンで4時間処理し、引き続いてModRipa溶解緩衝液を用いて溶解し、PDE3Aを免疫沈降させた。各条件について、全タンパク質溶解物2mgを抗PDE3A抗体1μgと4℃で一晩インキュベートし、その後、プロテインA−およびプロテインG−Dynabeadsそれぞれ7.5μl(Life Technologies 10001Dおよび10003D)を添加し、さらに1時間インキュベートした。ビーズを洗浄し、結合したタンパク質をLDS PAGEゲルローディング緩衝液30μlで溶出させた。4〜12%トリス−グリシンPAGEゲル上でインプット(全タンパク質溶解物約60μg)およびIP生成物を分離し、抗V5抗体(Life Technologies R96205、1:5000)、Bethyl抗PDE3A抗体(1:1000)およびLiCOR Biosciences製の二次抗体(カタログ番号926−32210および926068021、それぞれ1:10000)で免疫ブロットした。ブロットを洗浄し、LiCOR Odyssey赤外線撮像装置を用いて画像化した。
SLFN12を標的とするshRNAを発現する構築物、または対照ベクターをレンチウイルスにパッケージングし、ウイルス形質導入によってHeLa細胞に送達した。3つのSLFN12標的化shRNAを使用したが、これらの全てをTRC(クローンID:TRCN0000152141およびTRCN0000153520)から得た。感染した細胞を1μg/mlピューロマイシンを用いて3日間選択し、次いで、非選択培地でさらに3日間増殖させた。次いで、細胞を384ウェルアッセイプレートに蒔き、上記のように薬物感受性について試験した。SLFN12のノックダウンをqPCRによって検証した。キット試薬(RNeasy Mini Kit(Qiagen#74104)およびQIAschredder(Qiagen#79656))を用いて全RNAを抽出した。キット試薬(SuperScript III First−Strand Synthesis System(Life Technologies#18080−051))を用いてcDNAを作製した。qPCRを、製造業者の推奨に従ってGAPDHおよびSLFN12(Life Technologies Hs00430118_m1)について行った。SLFN12発現を、対応する試料GAPDH ct値に正規化した。
上記の説明から、種々の使用および条件に採用するために、本明細書に記載される本発明に対して変更および修正を行うことができることは明らかであろう。このような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
[[TBD]]バイトのサイズを有する2016年8月[[TBD]]に作成された「167741_011202.txt」という表題のEFS−Webを介してここに提出されたASCIIテキストファイルは、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (18)
- ホスホジエステラーゼ3A(PDE3A)モジュレーターに反応性であるとして選択されたがん細胞を死滅させるまたはその生存を減少させる方法であって、前記細胞をPDE3Aモジュレーターと接触させるステップであって、前記細胞が基準に対するPDE3Aおよび/またはSchlafen12(SLFN12)ポリペプチドまたはポリヌクレオチドレベルの増加を有するとして選択され、それによって前記がん細胞の生存を減少させるステップを含む方法。
- PDE3Aモジュレーターに反応性であるがんを有するとして予め選択された対象におけるがん細胞増殖を減少させる方法であって、PDE3Aモジュレーターを前記対象に投与するステップであって、前記対象が基準に対するPDE3Aおよび/またはSLFN12ポリペプチドまたはポリヌクレオチドレベルの増加を検出することによって予め選択され、それによって前記対象におけるがん細胞増殖を減少させるステップを含む方法。
- 前記PDE3Aモジュレーターが、6−(4−(ジエチルアミノ)−3−ニトロフェニル)−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3(2H)−オン(DNMDP)、ザルダベリンおよびアナグレリド、またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- PDE3A調節に反応性のがん細胞を有する対象を同定する方法であって、基準に対する前記対象の生体試料中のPDE3Aおよび/またはSLFN12ポリペプチドまたはポリヌクレオチドレベルの増加を検出し、それによってPDE3A調節に反応性のがんを有するとして前記対象を同定するステップを含む方法。
- PDE3A調節に耐性のがんを有する対象を同定する方法であって、基準に対する前記対象の生体試料中のSCLFN12ポリペプチドまたはポリヌクレオチドレベルの低下を検出し、それによってPDE3A調節に耐性のがんを有するとして前記対象を同定するステップを含む方法。
- PDE3AまたはSLFN12レベルを免疫ブロット、質量分析および免疫沈降からなる群から選択される方法によって検出する、請求項1、2、4および5のいずれか一項に記載の方法。
- PDE3AまたはSLFN12ポリヌクレオチドレベルを定量的PCR、ノーザンブロット、マイクロアレイ、質量分析およびin situハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法によって検出する、請求項1、2、4および5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記がん細胞が黒色腫、子宮内膜がん、肺がん、造血/リンパがん、卵巣がん、子宮頸がん、軟部組織肉腫、平滑筋肉腫、尿路がん、膵がん、甲状腺がん、腎臓がん、膠芽腫または乳がん細胞である、請求項1、2、4および5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記がん細胞がB細胞増殖型がんではない、請求項1、2、4および5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記がん細胞が多発性骨髄腫ではない、請求項1、2、4および5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PDE3AモジュレーターがPDE3Aの活性を低下させる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記PDE3Aモジュレーターが経口投与される、請求項2に記載の方法。
- 前記PDE3Aモジュレーターが静脈内注射によって投与される、請求項2に記載の方法。
- 前記生体試料ががん細胞を含む組織試料である、請求項4に記載の方法。
- PDE3A調節に反応性のがんを有する対象を同定するためのキットであって、PDE3Aポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する第1の捕捉試薬およびSLFN12ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する第2の捕捉試薬を含むキット。
- PDE3Aモジュレーターに反応性であるとして予め選択された対象におけるがん細胞増殖を減少させるためのキットであって、有効量のDNMDP、ザルダベリンおよび/またはアナグレリド、またはその薬学的に許容される塩を含むキット。
- 6−(4−(ジエチルアミノ)−3−ニトロフェニル)−5−メチル−4,5−ジヒドロピリダジン−3(2H)−オン(DNMDP)、ザルダベリンおよびアナグレリド、またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される、がんを治療するための医薬品を製造するためのPDE3Aモジュレーターの使用。
- 前記がんが黒色腫、子宮内膜がん、肺がん、造血/リンパがん、卵巣がん、子宮頸がん、軟部組織肉腫、平滑筋肉腫、尿路がん、膵がん、甲状腺がん、腎臓がん、膠芽腫または乳がんである、請求項17に記載の使用。
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