JP2020511401A - 癌の治療法のためのbrd4阻害剤と葉酸代謝拮抗薬との組み合わせ物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、癌の治療または予防における使用のための葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)とBRD4阻害剤の組み合わせ物に関する。本発明はまた、BRD4阻害剤を用いた治療に対するBRD4阻害剤抵抗性癌の再感受性化における使用のための葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)にも関する。さらに、本発明は、BRD4阻害剤、葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)、および医薬的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物を提供する。そのうえ、本発明は、BRD4阻害剤を用いた治療に対する感受性または応答性を評価する方法を提供するものであり、ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われており、そして、前記方法は、該対象から入手したサンプル中の核内葉酸レベルおよび/またはMTHFD1の発現レベルを測定することを含む。
Description
本発明は、癌の治療または予防における使用のための葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)とBRD4阻害剤の組み合わせ物に関する。本発明はまた、BRD4阻害剤を用いた治療に対するBRD4阻害剤抵抗性癌の再感受性化における使用のための葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)にも関する。さらに、本発明は、BRD4阻害剤、葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)、および医薬的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物を提供する。そのうえ、本発明は、BRD4阻害剤を用いた治療に対する感受性または応答性を評価する方法を提供するものであり、ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われており、かつ、該方法は、該対象から入手したサンプル中の核内葉酸レベルおよび/またはMTHFD1の発現レベルを測定することを含む。
クロマチンは、環境シグナルに対応して遺伝子発現を制御する。このプロセスの主要な伝達物質は、クロマチン修飾酵素の補因子や阻害剤として機能する細胞内代謝物であり、細胞質からの非制御型の流入によって核に侵入すると考えられている。
ブロモドメイン含有タンパク質4(BRD4)は、遺伝子活性化、DNA損傷、細胞増殖、および癌の進行において上述の役割を有する重要なクロマチン調節物質である1-8。このブロモドメインタンパク質の少なくとも7個の阻害剤が、臨床段階に至り、そして現在、様々な癌におけるそれらの有効性について評価されている。BRD4阻害剤の臨床的利益は、ドライバー癌遺伝子c−MYCの直接的な抑制によって媒介されると主に考えられている2、7。この概念は、BRD4阻害剤に対する主要な抵抗性機構としてのMYC発現の回復およびWNTシグナル伝達の活性化に関する最近の発見によって支持される9、10。
その臨床的重要性やクロマチン機構におけるBRD4の幅広い役割にもかかわらず、BRD4機能のために直接必要とされる因子に関して驚くほどわずかしか知られていない。大部分の試験の焦点は、アセチル化ヒストンリジンへのタンデムブロモドメインの結合によって媒介されると考えられる、転写因子の動員および休止RNAポリメラーゼIIのpTEFb媒介型活性化をもたらす、転写活性化因子としてのBRD4の役割である。加えて、ウイルス性タンパク質LANA−111やクロマチンタンパク質NSD3、ATAD5、CHD4、LTSCR1、およびJMJD512-14を含めた、いくつかのタンパク質が、直接的なBRD4相互作用因子として同定された。
これらの、または他のタンパク質がBRD4機能に直接的に必要であるかどうかを決定するために、発明者らはBRD4の阻害を観察するためにレポーター細胞株を利用した。彼らは、機能的なBRD4阻害に関するレポータシステムの高選択性を確認し、かつ、BRD4とTAF1ブロモドメイン阻害剤のクロストークを首尾よく指摘した、REDS(エピジェネティック薬物スクリーニングレポーター)細胞株を最近樹立した15。REDSマーカーの作出に利用したKBM7細胞株のハプロイド性質が、Gene−Trap(GT)アプローチを使用した新しいBRD4の機能的パートナーの遺伝子スクリーニングのために、それを理想的に適合させた。ここで、BRD4の遺伝子的および物理的な相互作用因子としてメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ1(MTHFD1)の同定に通じる顕著な結果を、このストラテジーを用いて得た。本発明で同定されたこのC1テトラヒドロ葉酸シンターゼの核内役割の説明では、癌の後成的遺伝学と葉酸代謝とのロバスト関係を明らかにする。
実施例で詳しく述べられるように、発明者らは、葉酸経路酵素MTHFD1の直接的な転写における役割を見出し、そしてそれは、BRD4機能に必要とされる因子のハプロイド遺伝子スクリーニングから彼らが同定した。それは、MTHFD1が核内に移行し得ること、およびそのごく一部が、BRD4との直接的な物理的相互作用を介してクロマチン結合され、そして、ゲノム内のBRD4結合遺伝子座の一部を占有することを示した。そのうえ、それは、MTHFD1の阻害または下方制御がBRD4の阻害または下方制御と類似の転写における変化を引き起こすことを、複数の細胞株において示した。それは、BRD4またはMTHFD1のいずれかの阻害が、核代謝産物組成物の類似の変化をもたらすことをさらに実証した。そのうえ、2つの酵素の薬理学的阻害剤が相乗効果を示すこと、およびメトトレキサートが(S)−JQ1抵抗性細胞に感受性を与え得ることがわかった。加えて、二つの酵素の薬理学的阻害剤はまた、マウス異種移植モデルにおける腫瘍増殖のインビボでの抑制にも相乗効果を与える。最終的に、ヌクレオチド生合成に必要とされる生合成酵素の大部分が、密なクロマチン結合画分の状態で存在するという知見は、遺伝子発現の制御における核代謝の直接的な役割を示し、そして、癌におけるBRD4阻害剤のための新しい臨床ストラテジーを可能にする。
したがって、発明者らは、BRD4機能的な遺伝子の相互作用因子としてMTHFD1を認識し、MTHFD1表現型模写であるBRD4阻害の損失を示した。MTHFD1は葉酸代謝における主要酵素であり、その結果、ヌクレオチドおよびメチオニンの生合成のために重要な中間体を提供する。MTHFD1とBRD4は核において物理的に相互作用するので、いずれかのタンパク質の阻害は核代謝産物組成物に類似の変化を引き起こす。二つの酵素の阻害剤は、複数の癌細胞株の生存率を損なう相乗効果を与えることがわかった。
よって、本発明との関連において、葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤、例えばメトトレキサートなど)と組み合わせたBRD4阻害剤(例えば(S)−JQ1など)の使用が、幅広いさまざまな癌細胞に対して相乗的に高められた治療効果を提供し、これにより、改良されたが癌の治療法を可能にすることが、驚いたことに分かった。そのうえ、葉酸代謝拮抗薬(特に、メトトレキサートなどのMTHFD1阻害剤)が、BRD4阻害剤を用いた治療に対するBRD4阻害剤抵抗性癌(例えば(S)−JQ1抵抗性癌など)の再感受性化に使用できることがわかった。さらに、葉酸代謝拮抗薬(または、MTHFD1阻害剤)と一緒のBRD4阻害剤の併用は、癌におけるBRD4阻害剤に対する抵抗性の出現を予防または低減するのを可能にするので、有利である。よって、本発明は、特に、BRD4阻害剤抵抗性癌を含めた、癌の改良された治療法を提供するという問題を解決する。
したがって、本発明は、治療法における使用のための、好ましくは、癌の治療または予防において使用するための、BRD4阻害剤と葉酸代謝拮抗薬の組み合わせ物(特に、BRD4阻害剤とMTHFD1阻害剤の組み合わせ物)を提供する。
本発明はまた、治療法における使用のための、好ましくは、癌の治療または予防において使用するための、BRD4阻害剤を提供するものでもあり、ここで、該BRD4阻害剤は、葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)と組み合わせて投与されるべきである。
本発明はまた、治療法における使用のための、好ましくは、癌の治療または予防において使用するための、BRD4阻害剤を提供するものでもあり、ここで、該BRD4阻害剤は、葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)と組み合わせて投与されるべきである。
本発明は同様に、治療法における使用のための、好ましくは、癌の治療または予防において使用するための葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)に関するものであり、ここで、該葉酸代謝拮抗薬(または、MTHFD1阻害剤)は、BRD4阻害剤と組み合わせて投与されるべきである。
本発明は、BRD4阻害剤、葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)、および医薬的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。本発明はまた、癌の治療または予防において使用するための前述の医薬組成物にも関する。
そのうえ、本発明は、BRD4阻害剤を用いた治療に対してBRD4阻害剤抵抗性癌を再感受性化する際の使用のための葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)を提供する。前記BRD4阻害剤抵抗性癌は、特にBRD4阻害剤単独療法に対して抵抗性である癌であってもよい。
そのうえ、本発明は、BRD4阻害剤を用いた治療に対してBRD4阻害剤抵抗性癌を再感受性化する際の使用のための葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)を提供する。前記BRD4阻害剤抵抗性癌は、特にBRD4阻害剤単独療法に対して抵抗性である癌であってもよい。
さらに、本発明は、癌を治療するかまたは予防するための薬剤の調製のための、葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)と組み合わせたBRD4阻害剤の使用に関する。本発明は同様に、癌を治療するかまたは予防するための薬剤の調製のための、BRD4阻害剤の使用を提供するものであり、ここで、該BRD4阻害剤は、葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)と組み合わせて投与されるべきである。本発明はまた、癌を治療するかまたは予防するための薬剤の調製のための使用に関するものでもあり、ここで、葉酸代謝拮抗薬(または、MTHFD1阻害剤)は、BRD4阻害剤と組み合わせて投与されるべきである。そのうえ、本発明は、BRD4阻害剤を用いた治療に対して、BRD4阻害剤抵抗性癌(特にBRD4阻害剤単独療法に抵抗性である癌)を再感受性化するための薬剤の調製のための葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)の使用に関する。
本発明は同様に、疾患または障害、好ましくは癌を治療するかまたは予防する方法であって、それを必要としている対象(例えば、ヒト)に、葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)と組み合わせてBRD4阻害剤を投与することを含む方法に関する。本発明は、BRD4阻害剤を用いた治療に対して、BRD4阻害剤抵抗性癌を再感受性化する方法であって、それを必要としている対象(例えば、ヒト)に、葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)を投与することを含む方法をさらに提供する。
先に記載したように、本発明は、治療法における使用のための、好ましくは、癌の治療または予防において使用するための葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)とBRD4阻害剤との組み合わせ物に関する。BRD4阻害剤と葉酸代謝拮抗薬(または、BRD4阻害剤とMTHFD1阻害剤)とを別々の医薬製剤で提供することもできる。斯かる別々の製剤を同時に投与しても、または連続して投与してもよい(例えば、BRD4阻害剤を含む製剤を最初に投与し、それに続いて、葉酸代謝拮抗薬(または、MTHFD1阻害剤)を含む製剤を投与してもよく、またはその逆も同様でさる)。しかしながら、BRD4阻害剤と葉酸代謝拮抗薬(または、BRD4阻害剤とMTHFD1阻害剤)はまた、単一の医薬製剤で提供されてもよい。したがって、本発明はまた、BRD4阻害剤、葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)、および医薬的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物にも関する。この新規医薬組成物は、特に癌の治療または予防のために、有用である。
本発明によって治療されるかまたは予防される疾患/障害は、好ましくは、過剰増殖性障害であり、最も好ましくは、癌である。前記治療されるかまたは予防される癌は、例えば、消化器癌、結腸直腸癌、肝臓癌(例えば、肝細胞癌腫)、膵臓癌、胃癌、泌尿生殖器癌、膀胱癌、胆管癌、精巣癌、子宮頚癌、悪性中皮腫、食道癌、喉頭癌、前立腺癌(例えば、ホルモン抵抗性前立腺癌)、肺癌(例えば、小細胞肺癌または非小細胞肺癌)、乳癌(例えば、トリプルネガティブ乳癌、BRCA1および/またはBRCA2遺伝子突然変異を有する乳癌)、血液癌、白血病(例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、または慢性骨髄性白血病)、リンパ腫(例えば、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫、例えば、濾胞性リンパ腫またはびまん性大細胞型B細胞リンパ腫など)、多発性骨髄腫、卵巣癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、腎癌、類表皮癌、皮膚癌、黒色腫、頭部および/または頚部癌(例えば、頭頚部扁平上皮細胞癌)、ならびに口腔癌から選択され得る。好ましくは、前記治療されるかまたは予防される癌は、前立腺癌、乳癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、膀胱癌、頭頚部癌、神経膠芽腫、中皮腫、骨肉腫、絨毛癌、およびNUT正中線癌腫から選択される。(前述の特定のタイプの癌のいずれかを含めた)治療されるかまたは予防される癌は、BRD4依存性癌および/またはc−MYC依存性癌であることが特に好ましい。
先に記載したように、本発明はまた、本発明の複合製剤、すなわち、葉酸代謝拮抗薬(特にMTHFD1阻害剤)と組み合わせたBRD4阻害剤、を使用したBRD4阻害剤抵抗性癌の治療に関する。よって、(前段落で言及した特定のタイプの癌のいずれかを含めた)治療される癌はまた、BRD4阻害剤抵抗性癌、特にBRD4阻害剤単独療法に対して抵抗性である癌であってもよい。
本発明にしたがって使用されるBRD4阻害剤は、これだけに特に限定されるものではなく、好ましくは、(S)−JQ1、CeMMEC2、I−BET151(またはGSK1210151A)、I−BET762(またはGSK525762)、PF−1、ブロモスポリン、OTX−015、TEN−010、CPI−203、CPI−0610、RVX−208、BI2536、TG101348、LY294002、またはこれらの剤のうちのいずれかの医薬的に許容され得る塩もしくは溶媒和物である。これらの化合物は市販されており、および/またはそれらの合成は文献に記載されている。例えば、化合物CeMMEC2は、AKos GmbH(Steinen、Germany)から入手できる。BRD4阻害剤はまた、WO2012/174487、WO2014/076146、US2014/0135336、WO2014/134583、WO2014/191894、WO2014/191896、US2014/0349990、またはWO2014/191906に開示された化合物のいずれか一つであってもよい。BRD4阻害剤が(S)−JQ1またはCeMMEC2であることが特に好ましく、より一層好ましくは、それが(S)−JQ1であることである。
葉酸代謝拮抗薬は、細胞プロセスに対する葉酸の効果を拮抗するかまたは妨げる薬理作用を有する物質の既存のクラスを構成する。メトトレキサートやペメトレキセドのような葉酸代謝拮抗薬は、癌化学療法で使用される承認薬である;それらは、主としてDHFRを標的とするが、また、MTHFD1を含めた葉酸代謝における他の酵素を阻害することも示された。本発明にしたがって使用される葉酸代謝拮抗薬は、好ましくはMTHFD1阻害剤、すなわち、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ1(MTHFD1)の阻害剤である。葉酸代謝拮抗薬の例としては、特にメトトレキサート、ペメトレキセド、トリメトレキサート、エドトレキサート、レメトレキソール、5−フルオロウラシル、プララトレキサート、アミノプテリン、ならびにこれらの剤の医薬的に許容され得る塩および溶媒和物が挙げられる。本発明により特に好ましい葉酸代謝拮抗薬(または、MTHFD1阻害剤)は、メトトレキサート、医薬的に許容され得るその塩または溶媒和物(例えば、メトトレキサートナトリウム)である。
本発明の範囲は、(本明細書中に提供した複合製剤の化合物とも呼ばれ;特に、BRD4阻害剤、葉酸代謝拮抗薬、および本願明細書で言及されたMTHFD1阻害剤を含む)本発明にしたがって使用される化合物のすべての医薬に許容される塩型を含み、これらの塩は、例えばプロトン化に感受性である孤立電子対を所持する原子、例えばアミノ基の、無機酸または有機酸でのプロトン化によって、あるいは生理学的に許容されるカチオン(カルボン酸基など)の塩として、形成されることも可能である。例示的な塩基付加塩は、例えばアルカリ金属塩、例えばナトリウムまたはカリウム塩;アルカリ土類金属塩、例えばカルシウムまたはマグネシウム塩;亜鉛塩;アンモニウム塩;脂肪族アミン塩、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、プロカイン塩、メグルミン塩、エチレンジアミン塩、またはコリン塩;アラルキルアミン塩、例えばN,N−ジベンジルエチレンジアミン塩、ベンザチン塩、ベネタミン塩;複素環芳香族アミン塩、例えばピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩またはイソキノリン塩;四級アンモニウム塩、例えばテトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアンモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩またはテトラブチルアンモニウム塩;ならびに塩基性アミノ酸塩、例えばアルギニン塩、リジン塩またはヒスチジン塩を含む。例示的な酸付加塩は、例えば:鉱酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩(例えば、硫酸塩または硫酸水素塩)、硝酸塩、リン酸塩(例えばリン酸塩、リン酸水素塩、またはリン酸二水素塩)、炭酸塩、炭酸水素酸塩、過塩素酸塩、ホウ酸塩、またはチオシアン酸塩;有機酸塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、ペンタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘプタン酸塩、オクタン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、デカン酸塩、ウンデカン酸塩、オレイン酸塩、ステアリン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、アジピン酸塩、グルコン酸、グリコール酸塩、ニコチン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、アスコルビン酸塩、パモ酸塩(エンボナート)、ショウノウ酸塩、グルコヘプタン酸塩、またはピバル酸塩;スルホン酸塩、例えばメタンスルホン酸塩(メシレート)、エタンスルホン酸塩(エシレート)、2−ヒドロキシエタンスルホン酸塩(イセチオレート)、ベンゼンスルホン酸塩(ベシレート)、p−トルエンスルホン酸塩(トシレート)、2−ナフタレンスルホン酸塩(ナプシレート)、3−フェニルスルホン酸塩、またはカンファースルホン酸塩;グリセロリン酸塩;ならびに酸性アミノ酸塩、例えばアスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩を含む。
さらに、本発明の範囲は、任意の溶媒和型で、本発明にしたがって使用される化合物としては、例えば水との溶媒和物(すなわち、水和物など)、あるいは有機溶媒、例えばメタノール、エタノールまたはアセトニトリルなどとの溶媒和物(すなわち、メタノレート、エタノレートまたはアセトニトリレート);あるいは任意の結晶形態のものが挙げられ、本発明にしたがって使用される化合物の斯かる溶媒和物はまた、それぞれの化合物の医薬的に許容され得る塩の溶媒和物を含むこともまた、理解されるべきである。
さらに、本発明にしたがって使用される化合物は、異なった異性体、特に立体異性体(例えば、幾何異性体(またはcis/trans異性体)、鏡像異性体およびジアステレオマーを含む)または互変異性体の形態で存在し得る。本願明細書で言及する化合物の斯かるすべての異性体は、混合物または純粋もしくは実質的に純粋な形態のいずれかで、本発明の一部として企図される。立体異性体に関して、本発明は、本発明により使用される化合物の単離された光学異性体、ならびに任意のその混合物(特にラセミ混合物/ラセミ体を含む)を含む。ラセミ体は、物理的方法、例えばジアステレオマー誘導体の分別再結晶、分離または結晶化、あるいはキラルカラムクロマトグラフィーによる分離などによって分離可能である。光学活性酸との塩形成、その後、結晶化を介して、個々の光学異性体をラセミ体から得ることも可能である。本発明はさらに、本明細書中に提供する化合物の任意の互変異性体も包含する。
本発明の範囲はまた、本発明にしたがって使用される化合物を含み、そしてそこで、1もしくは複数の原子が、対応する原子の特定の同位体によって置換される。例えば、本発明は、本願明細書で言及される化合物の使用を包含し、そしてそこで、1もしくは複数の水素原子(または、例えばすべての水素原子)が、重水素原子(すなわち、2H;「D」とも呼ばれる)で置換される。したがって、本発明はまた、重水素が豊富な本発明にしたがって使用される化合物も含む。天然に存在する水素は、約99.98mol−%の水素−1(1H)および約0.0156mol−%の重水素(2HまたはD)を含む同位体混合物である。本発明にしたがって使用される化合物の1もしくは複数の水素位置における重水素の含有量は、当該技術分野で知られている重水素化技術を使用して増強できる。例えば、本願明細書で言及した化合物、または対応する化合物の合成に使用されるべき反応物もしくは前駆体は、例えば、重水(D2O)を使用したH/D交換反応に供され得る。さらなる好適な重水素化技術は:Atzrodt J et al., Bioorg Med Chem, 20(18), 5658-5667, 2012; William JS et al., Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 53(11-12), 635-644, 2010;またはModvig A et al., J Org Chem, 79, 5861-5868, 2014に記載されている。重水素の含有量は、例えば質量分析法またはNMR分光法を使用して測定できる。別段の特定の指示がない限り、本発明にしたがって使用される化合物が重水素に富んでいないことが好ましい。したがって、本発明にしたがって使用される化合物内の水素原子または1H水素原子の存在が好まれる。
さらに、本発明は、BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法(特にインビトロ法)であって(ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されるか、または癌に罹患していることが疑われる)、対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルおよび/またはMTHFD1の発現レベルを測定することを含む方法を提供する。
核内葉酸のより少ない/より低いレベルおよび/またはMTHFD1のより少ない/より低い発現レベル、特に対応する細胞の核内のMTHFD1タンパク質のより少ない/より低いレベルは、BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象のより高い感受性/応答性と相関することがわかった。MTHFD1の総発現レベルも予測できると同時に、核内のMTHFD1タンパク質の量が、BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性/応答性のより一層正確な評価を可能にする。これにより、MTHFD1の発現レベルが、核内のMTHFD1タンパク質のレベル、すなわち、対応する細胞の核内のMTHFD1タンパク質の量を測定することによって決定されることが好ましい。
本発明は、BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法(特にインビトロ法)であって(ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる)、対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルおよび/またはMTHFD1の発現レベルを測定するステップを含む方法をさらに提供する(ここで、対象からのサンプル中の核内葉酸のより低いレベルおよび/またはMTHFD1のより低い発現レベルは、対象がBRD4阻害剤を用いた治療により感受性またはより応答性であることを示唆する)。この方法において、核内葉酸のレベル(すなわち、対応する細胞の核内葉酸レベル)、またはMTHFD1の発現レベル、あるいはその両方は、BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価するために決定されてもよい。
したがって、本発明はまた、BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法(特にインビトロ法)であって(ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたかまたは癌に罹患していることが疑われる)、対象から得られたサンプルの核内葉酸レベルを測定するステップを含む方法にも関する(ここで、該対象からのサンプル中の核内葉酸のより低いレベルは、BRD4阻害剤を用いた治療に対して対象がより感受性であるかまたはより応答性であることを示唆する)。
本発明は、BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法(特にインビトロ法)であって(ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる)、対象から得られたサンプルにおいてMTHFD1の発現レベルを測定するステップを含む方法にさらに関する(ここで、該対象からのサンプルにおけるMTHFD1のより低い発現レベルは、BRD4阻害剤を用いた治療に対して対象がより感受性またはより応答性であることを示唆する)。MTHFD1の発現レベルは、核内MTHFD1タンパク質のレベルを測定することによって、好ましくは測定される。
とりわけ、癌、BRD4阻害剤、および対象/患者の説明を含め、葉酸代謝拮抗薬(または、MTHFD1阻害剤)と、BRD4阻害剤との組み合わせに関して本明細書中に提供した代表的であるまたは好ましい特徴/実施形態の説明もまた、先に記載した方法に適用される。
先に記載した方法で使用されるサンプルは、好ましくは癌組織生検サンプルである。癌の特定のタイプに依存して、サンプルはまた、血液サンプル(例えば、全血サンプル、または末梢血単核細胞画分)などの体液であってもよい。
先に記載した方法のいくつかにおいて、MTHFD1の発現レベルは、調査する対象から得られたサンプルにおいて測定される。発現のレベルは、例えば、MTHFD1の翻訳レベルまたは転写レベルを測定することによって、測定できる。よって、MTHFD1の発現レベルを決定するために、サンプルにおけるMTHFD1タンパク質の量が決定されても、またはサンプルにおけるMTHFD1mRNAの量が確定されてもよい。これは、例えば、Greenら2012(すなわち、Green, MR et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Fourth Edition, 2012, ISBN: 978-1936113422)に記載のとおり、当該技術分野で知られている方法を使用して達成できる。好ましくは、MTHFD1の発現レベルは、MTHFD1の翻訳レベルを測定することによって決定される。より好ましくは、MTHFD1の発現レベルは、核内MTHFD1タンパク質のレベル、すなわち、対応する細胞の核内に特有のMTHFD1タンパク質の量を測定することによって決定される。
MTHFD1翻訳レベルは、例えば、免疫組織化学法、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)または放射免疫アッセイなどの抗体ベースのアッセイ(RIA)(ここで、定量化されるMTHFD1タンパク質に対して特異的に指向された抗体が利用される)、あるいは質量分析法、ゲルベースのもしくはブロットベースのアッセイ、またはフローサイトメトリー(例えば、FACS)を使用して決定できる。翻訳レベルが決定されるべき場合、対象からのサンプル中に1もしくは複数のプロテアーゼインヒビターを含んでいることが有利になり得る。
MTHFD1転写レベルは、例えば、定量的(リアルタイム)逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(「qRT−PCR」)を使用するか、またはマイクロアレイ(例えばDing C, et al. J Biochem Mol Biol. 2004; 37(1):1-10を参照)を使用して決定できる。サンプルからの単独細胞におけるMTHFD1転写レベルを測定するために、単独細胞qRT−PCRまたは単独細胞マイクロアレイ解析などの単独細胞遺伝子発現分析技術を使用することもまた可能である。転写レベルが決定されるべき場合、対象からのサンプル中に1もしくは複数のRNアーゼ阻害剤を含んでいることがさらに有利になり得る。
本発明によると、MTHFD1の発現レベルが、MTHFD1の翻訳レベルを測定することによって、特に核内MTHFD1タンパク質のレベルを測定することによって、決定されることが好ましい。より好ましくは、MTHFD1(または、核内MTHFD1タンパク質のレベル)の翻訳レベルは、抗体ベースのアッセイ、質量分析法、ゲルベースのもしくはブロットベースのアッセイ、またはフローサイトメトリーを使用するか、より好ましくは、免疫組織化学法、酵素結合免疫吸着アッセイ、または放射免疫アッセイを使用して、より一層好ましくは、免疫組織化学法を使用して測定される。免疫組織化学的染色の方法は、当該技術分野で周知であり、例えば:Renshaw, S., Immunohistochemistry: Methods Express, Scion Publishing Ltd, Bloxham (UK), 2007, ISBN: 9781904842033 (particularly chapter 4 “Immunochemical staining techniques”);Key, M., Immunohistochemical staining methods: education guide, 2006 (particularly chapter 9);およびChen, X. et al. N Am J Med Sci 2(5), 241-245 (2010)に記載されている。
よって、核内MTHFD1の量が決定されることが最も好ましい。蛍光抗体法および免疫組織化学は、特異的抗体を用いてタンパク質を染色するために、および(例えば、DNA色素のようなDAPI、Hoechst33258またはHoechst33342を用いた同時染色することよる)核内蛍光シグナルのレベルの測定に好適な方法である。あるいは、核は、図9に記載の細胞株からの単離と同様に腫瘍生検から単離される。核溶解物から、例えば:ウエスタンブロッティング、ELISAおよび他の免疫学的な検出法;MTHFD1触媒ステップの基質と生成物を検出することに基づく酵素法;ならびにプロテオミクス法、のうちのいずれか一つのような技術を使用して、MTHFD1レベルが決定される。
MTHFD1は、葉酸代謝における3つの酵素反応を触媒するC−1−テトラヒドロ葉酸シンターゼであり、テトラヒドロ葉酸(THF)、10−ホルミルテトラヒドロ葉酸(10−CHO−THF)、5,10−メテニルテトラヒドロ葉酸(5,10−CH=THF)および5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸(5,10−CH2−THF)の相互変換をもたらす。MTHFD1またはBRD4のいずれかのノックダウンが低レベルの5,10−CH2−THFをもたらすことが、発明者らによって観察された。すべての葉酸代謝産物の核内レベルは、核の分離、溶解、タンパク質の沈殿および、例えば、HPLC−MS/MSやELISAのような抗体ベースの方法を含めた方法を用いた分析に続いて、測定されてもよい。
本発明は、対象における癌治療の際の使用のためのBRD4阻害剤にさらに関し、ここで、該対象は、BRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると、先に記載した方法のいずれかで同定された。
そのうえ、本発明は、BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法(特にインビトロ法)における、(i)遺伝子MTHFD1の転写産物(すなわち、それに結合する)のための1組のプライマー、(ii)遺伝子MTHFD1の転写産物のための(すなわち、それに結合する)核酸プローブ、(iii)遺伝子MTHFD1の転写産物のための(すなわち、それに結合する)核酸プローブを含むマイクロアレイ、または(iv)タンパク質MTHFD1に対する(すなわち、それに結合する)抗体の使用に関し、ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる(例えば、本明細書中で先に記載した任意の対応方法)。
(例えば、Green et al., 2012にも記載のように)当該技術分野で知られている方法を使用して、遺伝子MTHFD1の転写産物の特異的増幅/定量化を可能にするように、プライマーが設計される。さらに、プライマーは、好ましくはDNAプライマーである。
上述の転写産物は、好ましくは、遺伝子MTHFD1のmRNA、または遺伝子MTHFD1のmRNAから合成されるcDNAである。核酸プローブは、転写産物とハイブリダイズできる核酸を含む、またはそのような核酸からなる。核酸プローブは、好ましくは1本鎖DNAプローブまたは1本鎖RNAプローブであり、より好ましくは1本鎖DNAプローブである。(例えば、1本鎖DNAであってもよく、1本鎖RNAであってもよく、好ましくは1本鎖DNAである)核酸プローブは、例えば10〜80ヌクレオチド、好ましくは15〜60ヌクレオチド、より好ましくは20〜35ヌクレオチド、およびよりいっそう好ましくは約25ヌクレオチドを有する、オリゴヌクレオチドプローブであることがさらに好ましい。当技術分野において公知の(例えばGreen et al., 2012にも記載されているような)方法を使用して、対応する遺伝子の転写産物の特異的検出および定量を可能にするように、そのような核酸プローブを設計することができる。
タンパク質MTHFD1に対する上述の抗体は、タンパク質MTHFD1と特異的に結合し、例えば、ポリクローナル抗体であってもよく、またはモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。抗体は、さらに、完全/インタクトな免疫グロブリン分子またはその断片/一部(例えば、分離された軽鎖もしくは重鎖、Fab断片、Fab/c断片、Fv断片、Fab’断片、またはF(ab’)2断片など)であってもよいが、断片/部分が対応する完全免疫グロブリン分子の結合特異性を実質的に保持することを条件とする。抗体は、修飾および/もしくは改変抗体、例えばキメラもしくはヒト化抗体、二重特異性もしくは三重特異性抗体、または抗体構築物(例えば、1本鎖可変断片(scFv)もしくは抗体融合タンパク質)であってもよい。抗体は、例えばHarlow, E. et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998, ISBN: 978-0879695446にも記載されているような当技術分野において公知の方法を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術(例えばKohler G, et al. Nature. 1975; 256(5517):495-7を参照)、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(例えばKozbor D, et al. Immunol Today. 1983; 4(3):72-9を参照)またはEBV−ハイブリドーマ技術(例えばCole SPC, et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. 1985; 27:77-96を参照)などの方法によって調製することができる。
よって、先に記載したように、本発明は、特に下記のものを提供する:
(i)癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのBRD4阻害剤、該方法は:
−該対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルおよび/またはMTHFD1の発現レベルを測定し;
−該対象が、BRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低いレベルの核内葉酸および/またはより低い発現レベルのMTHFD1は、その対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であることを示唆し;そして
−該対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にBRD4阻害剤を投与すること、
を含む。
(i)癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのBRD4阻害剤、該方法は:
−該対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルおよび/またはMTHFD1の発現レベルを測定し;
−該対象が、BRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低いレベルの核内葉酸および/またはより低い発現レベルのMTHFD1は、その対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であることを示唆し;そして
−該対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にBRD4阻害剤を投与すること、
を含む。
(ii)癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのBRD4阻害剤、該方法は:
−該対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルを測定し;
−該対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低いレベルの核内葉酸は、その対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であるを示唆し;そして
−該対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にBRD4阻害剤を投与すること、
を含む。
−該対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルを測定し;
−該対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低いレベルの核内葉酸は、その対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であるを示唆し;そして
−該対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にBRD4阻害剤を投与すること、
を含む。
(iii)癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのBRD4阻害剤、該方法は:
−該対象から得られたサンプルにおいてMTHFD1の発現レベルを測定し;
−該対象が、BRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低い発現レベルのMTHFD1は、その対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であることを示唆し;そして
−該対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にBRD4阻害剤を投与すること、
を含む。
−該対象から得られたサンプルにおいてMTHFD1の発現レベルを測定し;
−該対象が、BRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低い発現レベルのMTHFD1は、その対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であることを示唆し;そして
−該対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にBRD4阻害剤を投与すること、
を含む。
(iv)癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのBRD4阻害剤、該方法は:
−該対象から得られたサンプル中の核内MTHFD1タンパク質レベルを測定し;
−該対象が、BRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低いレベルの核内MTHFD1タンパク質は、その対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であることを示唆し;そして
−該対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にBRD4阻害剤を投与すること、
を含む。
−該対象から得られたサンプル中の核内MTHFD1タンパク質レベルを測定し;
−該対象が、BRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低いレベルの核内MTHFD1タンパク質は、その対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であることを示唆し;そして
−該対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にBRD4阻害剤を投与すること、
を含む。
本発明にしたがって使用される化合物を、化合物自体として投与してもよいし、または医薬品として配合してもよい。医薬品/医薬組成物は、場合によって、1またはそれより多い医薬に許容される賦形剤、例えば担体、希釈剤、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、着色剤、顔料、安定化剤、保存剤、抗酸化剤、または溶解性増進剤を含んでもよい。
医薬組成物は、1またはそれより多い溶解性増進剤、例えば約200〜約5,000Daの範囲の分子量を有するポリ(エチレングリコール)を含むポリ(エチレングリコール)(例えば、PEG200、PEG300、PEG400、またはPEG600)、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、非イオン性界面活性剤、チロキサポール、ポリソルベート80、マクロゴール−15−ヒドロキシステアレート、(例えば、Kolliphor(登録商標)HS15、CAS70142−34−6)、リン脂質、レシチン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、シクロデキストリン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ジヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエチル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエチル−γ−シクロデキストリン、グルコシル−α−シクロデキストリン、グルコシル−β−シクロデキストリン、ジグルコシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、マルトトリオシル−β−シクロデキストリン、マルトトリオシル−γ−シクロデキストリン、ジマルトシル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、カルボキシアルキルチオエーテル、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、酢酸ビニルコポリマー、ビニルピロリドン、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、またはその組み合わせいずれかを含んでもよい。
医薬組成物を、当業者に知られる技術、例えば“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, Pharmaceutical Press, 22nd editionに公表される技術によって配合してもよい。医薬組成物を、経口、非経口、例えば筋内、静脈内、皮下、皮内、動脈内、心腔内、結腸、鼻、局所、エアロゾルまたは膣投与のための投薬型として配合してもよい。経口投与のための投薬型には、コーティングおよび非コーティング錠剤、軟ゼラチンカプセル、硬ゼラチンカプセル、ロゼンジ、トローチ、溶液、エマルジョン、懸濁物、シロップ、エリキシル剤、再構成用の粉末および顆粒、分散性粉末および顆粒、薬用ガム、咀嚼錠剤および発泡錠が含まれる。非経口投与用の投薬型には、溶液、エマルジョン、懸濁物、分散物、ならびに再構成用の粉末および顆粒が含まれる。非経口投与には、エマルジョンが好ましい投薬型である。結腸および膣投与のための投薬型には、座薬および膣座薬が含まれる。鼻投与のための投薬型を、吸入および吹送法によって、例えば計測吸入装置によって、投与してもよい。局所投与のための投薬型には、クリーム、ジェル、軟膏、膏薬、パッチおよび経皮送達系が含まれる。
本発明にしたがって使用される化合物、あるいは斯かる化合物を含む上記の医薬組成物を、全身性/末梢性のいずれかで、または所望の作用部位で、任意の慣用的な投与経路によって対象に投与してもよく、限定されるわけではないが:経口(例えば錠剤、カプセルとして、または摂取可能溶液として)、局所(例えば経皮、鼻内、目、頬、および舌下)、非経口(例えば注射技術または注入技術を用いて、そして例えば、注射、例えば皮下、皮内、筋内、静脈内、動脈内、心内、クモ膜下腔内、脊髄内、嚢内、嚢下、眼内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、クモ膜下、または胸骨内によるもの、例えば皮下または筋内へのデポーの移植によるものを含む)、肺(例えば口または鼻を通じた、例えばエアロゾルを用いた吸入または吹送療法による)、胃腸、子宮内、眼内、皮下、目(ガラス体内または前房内を含む)、結腸、または膣投与のうちの1もしくは複数が含まれる。
化合物または医薬組成物を非経口投与する場合、こうした投与の例には:化合物または医薬組成物の静脈内、動脈内、腹腔内、クモ膜下腔内、心室内、尿道内、胸骨内、心臓内、頭蓋内、筋内または皮下投与、および/または注入技術を用いることによる投与のうちの1もしくは複数が含まれる。非経口投与のため、化合物は、溶液を血液と等張にするため、他の物質、例えば十分な塩またはグルコースを含有してもよい無菌水溶液の形で、最適に用いられる。水溶液は、必要であれば、適切に緩衝しなければならない(好ましくは3〜9のpHに)。無菌条件下での適切な非経口配合物の調製は、当業者に周知の標準的医薬技術によって容易に達成される。
また、前記化合物または医薬組成物を、フレーバー剤または着色剤を含有してもよい、即時、遅延、修飾、持続、断続または調節放出適用のための、錠剤、カプセル、膣座薬、エリキシル剤、溶液または懸濁物の形で、経口投与してもよい。
錠剤は、賦形剤、例えば微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびグリシン、崩壊剤、例えばデンプン(好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン)、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよび特定の複合ケイ酸、ならびに顆粒化結合剤、例えばポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、スクロース、ゼラチンおよびアカシアを含有してもよい。さらに、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクが含まれてもよい。また、類似のタイプの固形組成物をゼラチンカプセル中の充填剤として用いてもよい。これに関連して好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、または高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁物および/またはエリキシル剤には、剤を、多様な甘味剤またはフレーバー剤、着色物質または顔料と、乳化剤および/または懸濁剤と、そして希釈剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリン、ならびにその組み合わせと組み合わせてもよい。
あるいは、前記化合物または医薬組成物を座薬またはペッサリーの形で投与してもよいし、あるいはジェル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏または散布剤の形で局所適用してもよい。また、本発明の化合物を、例えば皮膚パッチの使用によって、皮膚または経皮投与することも可能である。
また、前記化合物または医薬組成物は、徐放性システムによって投与されてもよい。徐放性組成物の好適な例は、造形品の形態での半透過性重合体マトリックス、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルを含む。徐放性マトリックスとしては、例えば、ポリラクチド(例えばUS3,773,919を参照)、L−グルタミン酸およびγ−エチル−L−グルタミン酸のコポリマー(Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556 (1983))、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)(R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981)およびR. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982))、エチレン酢酸ビニル(R. Langerら、同上)またはポリ−D−(−)−3−ヒドロキシブチル酸(EP133988)が挙げられる。徐放性医薬組成物としては、リポソーム封入型化合物も挙げられる。本発明の化合物を含むリポソームは、例えば:DE3218121;Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985);Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980);EP0052322;EP0036676;EP088046;EP0143949;EP0142641;JP83−118008;US4,485,045;US4,544,545;およびEP0102324のうちのいずれか1つに記載の方法など、当該技術分野で知られている方法によって調製される。
また、前記化合物または医薬組成物を、肺経路、直腸経路、または目の経路によって投与することも可能である。目への使用のため、これらを、等張pH調整無菌生理食塩水中の微粒子化懸濁物として、または好ましくは等張pH調整無菌生理食塩水中の溶液として、場合によって塩化ベンジルアルコニウムなどの保存剤と組み合わせて配合してもよい。あるいは、これらをペトロラタムなどの軟膏中に配合してもよい。
肺内投与、特に吸入法のための、本発明にしたがって使用される化合物の乾燥粉末配合物を調製することも想定される。斯かる乾燥粉末は、実質的に非結晶性ガラス質または実質的に結晶性の生理活性粉末をもたらす条件下での噴霧乾燥法によって調製され得る。したがって、本発明に使用される化合物の乾燥粉末は、WO99/16419またはWO01/85136に開示された乳化/噴霧乾燥法によって作製できる。それぞれの化合物の溶液製剤の噴霧乾燥が、例えば、"Spray Drying Handbook", 5th ed., K. Masters, John Wiley & Sons, Inc., NY (1991)、WO97/41833、またはWO03/053411に一般に記載されているように実施できる。
皮膚への局所適用のため、例えば、1またはそれより多い以下:ミネラルオイル、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、乳化ろうおよび水の混合物中に懸濁または溶解された活性化合物を含有する適切な軟膏として、前記化合物または医薬組成物を配合してもよい。あるいは、これらを、例えば、1またはそれより多い以下:ミネラルオイル、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、2−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水の混合物中に懸濁または溶解された適切なローションまたはクリームとして配合してもよい。
それにより、本発明は、本明細書中に提供する化合物または医薬組成物に関し、ここで、対応する化合物または医薬組成物は:経口経路;経皮、鼻腔内、眼、頬側、または舌下経路を含めた局所経路;皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、くも膜下腔内、脊髄内、嚢内、被膜下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下、胸骨内、心室内、尿管内、または頭蓋内経路を含めた、注入技術または輸液技術を使用した腸管外経路;吸入法または吹送治療法によるものを含めた肺経路;胃腸経路;子宮内経路;眼内経路;皮下経路;硝子体内または前房内経路によるものを含めた眼経路;直腸経路;あるいは膣経路、のいずれかによって投与される。特に好ましい投与経路は、経口投与または非経口投与である。
典型的には、医師が、個々の対象に最も適しているであろう実際の投薬量を決定するであろう。任意の特定の個々の対象のための特定の用量レベルおよび投薬頻度は多様である可能性もあり、そして使用する特定の化合物、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食餌、投与様式および時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、特定の状態の重症度、ならびに療法を受けている個々の対象を含む、多様な要因に応じるであろう。
本発明による葉酸代謝拮抗薬と(またはMTHFD1阻害剤と)BRD4阻害剤との組み合わせ物はまた、癌の治療または予防のために、特に他の抗癌剤を含めた他の治療薬と組み合わせて使用されてもよい。本発明にしたがって上述の複合製剤が同じ疾患に対して活性なさらなる治療薬と組み合わせて使用されるとき、それぞれの化合物の用量は、化合物が単独で使用されるときの用量とは異なり得る。さらなる治療薬を伴った本発明の複合製剤の組み合わせ物は、本発明による複合製剤の化合物と同時に/併用してまたは連続して/別々に、さらなる治療薬の投与を含んでもよい。
好ましくは、本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて投与しようとする、さらなる治療薬は、抗癌薬剤である。抗癌薬剤は:腫瘍血管新生阻害剤(例えばプロテアーゼ阻害剤、上皮増殖因子受容体キナーゼ阻害剤、または血管内皮増殖因子受容体キナーゼ阻害剤);細胞傷害性薬剤(例えば代謝拮抗剤、例えばプリンおよびピリミジン類似体代謝拮抗剤);有糸分裂阻害剤(例えば微小管安定化薬剤または抗有糸分裂アルカロイド);白金配位錯体;抗腫瘍抗生物質;アルキル化剤(例えばナイトロジェンマスタードまたはニトロソ尿素);内分泌剤(例えば副腎皮質ステロイド、アンドロゲン、抗アンドロゲン、エストロゲン、抗エストロゲン、アロマターゼ阻害剤、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト、またはソマトスタチン類似体);あるいは腫瘍細胞において過剰発現される、および/または誤って制御されている特定の代謝経路に別の方式で関与する、酵素または受容体をターゲットとする化合物(例えばATPおよびGTPホスホジエステラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤(例えばセリン、スレオニンおよびチロシンキナーゼ阻害剤(例えばAbelsonプロテインチロシンキナーゼ阻害剤など))ならびに多様な増殖因子、対応する受容体およびキナーゼ阻害剤(例えば上皮増殖因子受容体キナーゼ阻害剤、血管内皮増殖因子受容体キナーゼ阻害剤、線維芽細胞増殖因子阻害剤、インスリン様増殖因子受容体阻害剤および血小板由来増殖因子受容体キナーゼ阻害剤));メチオニン;アミノペプチダーゼ阻害剤;プロテアソーム阻害剤;シクロオキシゲナーゼ阻害剤(例えばシクロオキシゲナーゼ−1またはシクロオキシゲナーゼ−2阻害剤);トポイソメラーゼ阻害剤(例えばトポイソメラーゼI阻害剤またはトポイソメラーゼII阻害剤)、ポリADPリボースポリメラーゼ阻害剤(PARP阻害剤)、ならびに上皮成長因子受容体(EGFR)阻害剤/拮抗薬から選択されてもよい。
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて抗癌薬剤として使用可能なアルキル化剤は、例えばナイトロジェンマスタード(例えばシクロホスファミド、メクロレタミン(クロルメチン)、ウラムスチン、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ベンダムスチン、またはトロホスファミド)、ニトロソ尿素(例えばカルムスチン、ストレプトゾシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、プレドニムスチン、ラニムスチン、またはセムスチン)、アルキルスルホネート(例えば、ブスルファン、マンノスルファン、またはトレオスルファン)、アジリジン(例えばヘキサメチルメラミン(アルトレタミン)、トリエチレンメラミン、チオテパ(N,N’N’−トリエチレンチオホスホラミド)、カルボクオン、またはトリアジクオン)、ヒドラジン(例えばプロカルバジン)、トリアゼン(例えばダカルバジン)、またはイミダゾテトラジン(例えばテモゾロミド)であってもよい。
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて、抗癌薬剤として使用可能な白金配位錯体は、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、または四硝酸トリプラチンであってもよい。
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて抗癌薬剤として使用可能な細胞傷害性薬剤は、例えば、葉酸類似体代謝拮抗剤(例えばアミノプテリン、メトトレキセート、ペメトレキセド、またはラルチトレキセド)、プリン類似体代謝拮抗剤(例えばクラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、6−メルカプトプリン(そのプロドラッグ型アザチオプリンを含む)、ペントスタチン、または6−チオグアニン)、およびピリミジン類似体代謝拮抗剤(例えばシタラビン、デシタビン、5−フルオロウラシル(そのプロドラッグ型カペシタビンおよびテガファーを含む)、フロクスウリジン、ゲムシタビン、エノシタビン、またはサパシタビン)を含む、代謝拮抗剤であってもよい。
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて抗癌薬剤として使用可能な有糸分裂阻害剤は、例えば、タキサン(例えばドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル/タキソール、またはテセタキセル、ビンカアルカロイド(例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンフルニン、ビンデシン、またはビノレルビン)、エポチロン(例えばエポチロンA、エポチロンB、エポチロンC、エポチロンD、エポチロンE、またはエポチロンF)あるいはエポチロンB類似体(例えばイキサベピロン/アザエポチロンB)であってもよい。
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせた抗癌薬剤として使用可能な抗腫瘍抗生物質は、例えばアントラサイクリン(例えばアクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、またはゾルビシン)、アントラセンジオン(例えばミトキサントロン、またはピキサントロン)またはストレプトミセス属(Streptomyces)から単離された抗腫瘍抗生物質(例えばアクチノマイシン(アクチノマイシンDを含む)、ブレオマイシン、マイトマイシン(マイトマイシンCを含む)、またはプリカマイシン)であってもよい。
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて抗癌薬剤として使用可能なチロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、アキシチニブ、ボスチニブ、セディラニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レスタウルチニブ、ニロチニブ、セマキサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、またはバンデタニブであってもよい。
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて抗癌薬剤として使用可能なトポイソメラーゼ阻害剤は、例えば、トポイソメラーゼI阻害剤(例えばイリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ベロテカン、ルビテカン、またはラメラリンD)またはトポイソメラーゼII阻害剤(例えばアムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、またはドキソルビシン)であってもよい。
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて抗癌剤として使用できるPARP阻害剤は、例えば、BMN−673、オラパリブ、ルカパリブ、ベリパリブ、CEP9722、MK4827、BGB−290、または3−アミノベンズアミドであってもよい。
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて抗癌剤として使用できるEGFR阻害剤/拮抗薬は、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、アファチニブ、ネラチニブ、ABT−414、ダコミチニブ、AV−412、PD153035、バンデタニブ、PKI−166、ペリチニブ、カネルチニブ、イコチニブ、ポジオチニブ、BMS−690514、CUDC−101、AP26113、XL647、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、またはマツズマブであってもよい。
さらなる抗癌薬剤を、本発明の化合物と組み合わせて用いてもよい。抗癌薬剤は、TNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)、タモキシフェン、アムサクリン、ベキサロテン、エストラムスチン、イロフルベン、トラベクテジン、セツキシマブ、パニツムマブ、トシツモマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、エドレコロマブ、ゲムツズマブ、アルボシジブ、セリシクリブ、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、エファプロキシラル、ポルフィマーナトリウム、タラポルフィン、テモポルフィン、ベルテポルフィン、アリトレチノイン、トレチノイン、アナグレリド、亜ヒ酸、アトラセンタン、ボルテゾミブ、カルモフール、セレコキシブ、デメコルシン、エレスクロモル、エルサミトルシン、エトグルシド、ロニダミン、ルカントン、マソプロコール、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトタン、オブリメルセン、オマセタキシン、シチマジーン、セラデノベック、テガファー、テストラクトン、チアゾフリン、チピファルニブ、ボリノスタット、またはイニパリブのような生物学的または化学的分子を含んでもよい。
また、増殖性疾患に関与する癌または腫瘍マーカー/因子/サイトカインに対して向けられる、抗体、抗体断片、抗体構築物(例えば一本鎖構築物)、および/または修飾抗体(CDR移植抗体、ヒト化抗体、「完全ヒト化」抗体などのようなもの)のような生物学的薬剤を、本発明の複合製剤の化合物との併用療法アプローチで使用してもよい。こうした生物学的分子の例は、抗HER2抗体(例えばトラスツズマブ、ハーセプチン(登録商標))、抗CD20抗体(例えばリツキシマブ、リツキサン(登録商標)、マブテラ(登録商標)、レディタクス(登録商標))、抗CD19/CD3構築物(例えばEP1071752を参照)および抗TNF抗体(例えばTaylor PC. Antibody therapy for rheumatoid arthritis. Curr Opin Pharmacol. 2003. 3(3):323-328を参照)である。本発明の複合製剤の化合物との併用療法アプローチにおいて使用されるさらなる抗体、抗体断片、抗体構築物および/または修飾抗体は:Taylor PC. Curr Opin Pharmacol. 2003. 3(3):323-328;またはRoxana A. Maedica. 2006. 1(1):63-65に見出され得る。
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて使用できる抗癌剤は、特に、CTLA−4、PD−1/PD−L1、TIM3、LAG3、OX4、CSF1R、IDO、またはCD40を標的化する、癌免疫治療薬(抗体(例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体)など)、抗体フラグメント、抗体構築物(例えば、一本鎖構築物)、または修飾抗体(例えば、CDRグラフト抗体、ヒト化抗体、または「完全ヒト化」抗体)などであってもよい。斯かる癌免疫治療薬としては、例えば、抗CTLA−4抗体(特に拮抗性または経路遮断型抗CTLA−4抗体;例えば、イピリムバブまたはトレメリムマブ)、抗PD−1抗体(特に拮抗性または経路遮断型抗PD−1抗体;例えば、ニボルマブ(BMS−936558)、ペムブロリズマブ(MK−3475)、ピジリズマブ(CT−011)、AMP−224、またはAPE02058)、抗PD−L1抗体(特に経路遮断型抗PD−L1抗体;例えば、BMS−936559、MEDI4736、MPDL3280A(RG7446)、MDX−1105、またはMEDI6469)、抗TIM3抗体(特に経路遮断型抗TIM3抗体)、抗LAG3抗体(特に拮抗性または経路遮断型抗LAG3抗体;例えば、BMS−986016、IMP701、またはIMP731)、抗OX4抗体(特に作動性抗OX4抗体;例えば、MEDI0562)、抗CSF1R抗体(特に経路遮断型抗CSF1R抗体;例えば、IMC−CS4またはRG7155)、抗IDO抗体(特に経路遮断型抗IDO抗体)、あるいは、抗CD40抗体(特に作動性抗CD40抗体;例えば、CP−870,893またはChi Lob7/4)が挙げられる。さらなる癌免疫治療薬が、当該技術分野で知られており、例えば:Kyi C et al., FEBS Lett, 2014, 588(2):368-76;Intlekofer AM et al., J Leukoc Biol, 2013, 94(1):25-39;Callahan MK et al., J Leukoc Biol, 2013, 94(1):41-53;Ngiow SF et al., Cancer Res, 2011, 71(21):6567-71;およびBlattman JN et al., Science, 2004, 305(5681):200-5に記載されている。
上記のさらなる抗癌剤との組み合わせは、医薬製剤の形で使用するために好適に提示され得る。こうした組み合わせの個々の構成要素を、連続してまたは同時に/相伴ってのいずれかで、別個のまたは組み合わせた医薬製剤中で、任意の好適な経路によって、投与してもよい。投与が連続である場合、本発明の複合製剤の化合物、あるいは(単数もしくは複数の)さらなる治療薬のいずれが、最初に投与されてもよい。投与が同時である場合、組み合わせを同じ医薬組成物または異なる医薬組成物のいずれで投与されてもよい。同じ配合物中で組み合わせる場合、異なる化合物は安定で、そして互いにおよび配合物中の他の構成要素と適合しなければならないことが認識されるであろう。別個に配合される場合、これらは任意の好適な配合で提供されてもよい。
本発明の複合製剤の化合物を、物理的療法、例えば放射線療法と組み合わせて投与する。放射線療法は、本発明の複合製剤の化合物投与の前に、その後に、またはそれと同時に開始されてもよい。例えば、放射線療法は、対応する化合物投与の1〜10分後、1〜10時間後または24〜72時間後に開始されてもよい。なお、これらの時間枠は、限定として解釈されないものとする。対象は放射線、好ましくはガンマ線に曝露され、それによって放射線は、単回線量、あるいは数時間、数日および/または数週にわたって投与される多数回線量を提供されてもよい。ガンマ線は、標準被曝量および措置を用いた標準放射線療法プロトコールにしたがって、送達されてもよい。
よって、本発明は、癌の治療または予防において使用するための、本明細書中に先に記載した、葉酸代謝拮抗薬と(またはMTHFD1阻害剤と)BRD4阻害剤との組み合わせ物に関し、ここで、この複合製剤(すなわち、BRD4阻害剤と葉酸代謝拮抗薬またはMTHFD1阻害剤、あるいはこれらの剤を含む医薬組成物)の化合物は、さらなる抗癌剤と組み合わせて、および/または放射線療法と組み合わせて投与されるべきである。
本発明により治療される対象または患者は、動物(例えば、ヒト以外の動物)、脊椎動物、哺乳動物、げっ歯類(例えばモルモット、ハムスター、ラット、マウス)、ネズミ(例えばマウス)、イヌ科動物(canine)(例えばイヌ)、ネコ科動物(feline)(例えばネコ)、ブタの仲間(porcine)(例えば、ブタ(pig))、ウマの仲間(equine)(例えばウマ)、霊長類もしくはサルの仲間(simian)(例えばサル(monkey)または類人猿(ape))もしくはサル、例えばマーモセット、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザルなど)、あるいは、ヒトであってもよい。本発明によると、経済的に、農学的に、または科学的に重要である動物が、治療されることが想定される。科学的に重要な生物には、限定されるわけではないが、マウス、ラット、およびウサギが含まれる。下等生物、例えばキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)のようなショウジョウバエ、およびエレガンス線虫(Caenorhabditis elegans)のような線虫もまた、科学的なアプローチに使用され得る。農学的に重要な動物の限定されない例は、ヒツジ、ウシおよびブタであり、一方、例えばネコおよびイヌは、経済的に重要な動物と見なされ得る。好ましくは、対象/患者は哺乳動物である。より好ましくは、対象/患者はヒト、あるいは、ヒト以外の哺乳類(例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、サル、類人猿、マーモセット、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル、ヒツジ、ウシ、またはブタなど)である。最も好ましくは、対象/患者はヒトである。
障害または疾患の「治療」という用語は、本明細書において(例えば、癌の「治療」)、当該技術分野において周知である。障害または疾患の「治療」は、障害または疾患が患者/対象で疑われるか、または診断されたことを暗示する。障害または疾患を患うと推測される患者/対象は、典型的には、当業者が特定の病的状態に容易に起因させうる(すなわち障害または疾患の診断)、特定の臨床および/または病的症状を示す。
障害または疾患の「治療」は、例えば、障害または疾患の進行の停止(例えば症状の悪化がまったくない)あるいは障害または疾患の進行の遅延(進行の停止が一過性の性質のもののみである場合)を導くことも可能である。障害または疾患の「治療」はまた、障害または疾患を患う対象/患者の部分的反応(例えば症状の寛解)または完全反応(例えば症状の消失)を導くことも可能である。したがって、障害または疾患の「治療」はまた、例えば、障害または疾患の寛解も指し、そしてそれは、例えば、障害または疾患の進行の停止、あるいは障害または疾患の進行の遅延を導くことも可能である。こうした部分的または完全反応の後には、再発が続くこともありうる。対象/患者が、治療に対して広い範囲の反応(例えば、本明細書において上述するような、例示的な反応など)を経験しうることを理解すべきである。障害または疾患の治療は、とりわけ、治療処置(好ましくは、完全反応を導き、そして最終的に障害または疾患の治癒を導く)および緩和治療(症状軽減を含む)を含んでもよい。
障害または疾患の「予防」という用語は、本明細書において(例えば、癌の「予防」)、当該技術分野に周知である。例えば、障害または疾患を患う傾向があると推測される患者/対象は、特に、障害または疾患の予防から利益を受けうる。対象/患者は、限定されるわけではないが、遺伝的素因を含む、障害または疾患に対する感受性または素因を有する可能性もある。こうした素因は、例えば遺伝子マーカーまたは表現型指標を用いた標準的方法またはアッセイによって決定可能である。本発明にしたがって予防しようとする障害または疾患は、患者/対象において、診断されていないか、あるいは診断不能である(例えば患者/対象がいかなる臨床的または病的症状も示さない)ことが理解されるものとする。したがって、用語「予防」は、任意の臨床および/または病的症状が診断されるかまたは決定される、あるいは主治医によって診断されるかまたは決定されることが可能であるより前の、本発明の化合物の使用を含む。
本明細書中に使用される場合、別段の明確な指示がないかまたは文脈に矛盾しない限り、「a」、「an」および「the」という用語は、「1もしくは複数の」および「少なくとも1つ」と互換的に使用される。よって、例えば、「a」BRD4阻害剤を含む組成物は、「1もしくは複数」のBRD4阻害剤を含む組成物を指すと解釈できる。本明細書中に使用される場合、「about」という用語は、好ましくは、示した数値の±10%を指し、より好ましくは、示した数値の5±%を指し、そして特に、ちょうど示した数値を指す。例えば、「約100」という表現は、好ましくは、100±10%、より好ましくは、100±5%、そしてより一層好ましくは、特定値の100を指す。
本明細書中に使用される場合、「含む(comprising)」(または、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含有する(contain)」、「含有する(contains)」もしくは「含有する(containing)」)という用語は、別段の明確な指示がないかまたは文脈に矛盾しない限り、「とりわけ含有すること」、すなわち、「さらなる任意の要素の中に、...を含有すること」を意味する。それに加えて、この用語はまた、「から実質的に成る」および「から成る」といったより狭い意味も含む。例えば、「BとCを含むA」という用語は、「BとCをとりわけ含有する」という意味があり、ここで、Aはさらなる任意の要素を含む可能性があるが(例えば、「B、CおよびDを含有するA」が包含されるであろう)、この用語はまた、「BとCから実質的に成るA」といった意味および「BとCから成るA」といった意味も含む(すなわち、BとC以外の成分はAに含まれない)。
本明細書中に使用される場合、「任意選択の」、「任意選択で」および「であり得る」という用語は、示した特徴が存在し得るが、不存在である可能性もあることを意味する。「任意選択の」、「任意選択で」または「であり得る」という用語が使用されるときはいつも、本発明は具体的に、両方の可能性、すなわち、対応する特徴が存在するか、または選択的に、対応する特徴が不存在である可能性に関する。例えば、組成物の成分が「任意選択」であると示されている場合、本発明は具体的には、両方の可能性、すなわち、対応する成分が存在する(組成物中に含まれる)か、または対応する成分が該組成物に不存在である可能性に関する。
本発明は具体的に、全体的なおよび/または好ましい特徴/実施形態のあらゆる組み合わせを含めた、本明細書中に記載した特徴および実施形態のありとあらゆる組み合わせに関することは、理解されるべきである。
本明細書において、特許文献および科学文献を含む多くの文書が引用される。これらの文書の開示は、本発明の特許可能性に対して関連するとは見なされないが、その全体が本明細書に援用される。より具体的には、すべての言及される文書は、各個々の文書が具体的にそして個々に、援用されると示されるのと同じ度合いに、援用される。
本願明細書における、あらゆる先行文献(またはそれより派生する情報)への言及は、対応する先行文献(またはそれより派生する情報)が本明細書の関連する技術分野における共通の一般知識の一部を形成するという同意もしくは承認、またはあらゆる形式の示唆と見なされないし、見なされてはならない。
本発明はまた、以下の例示的な図面によっても説明される。この付帯図面は、以下を示す:
以下の実施例の参照によって、本発明をこれから説明するが、これらの実施例は単に例示するためだけのものであり、本発明の範囲を限界するものとして解釈されるべきではない。
方法:
細胞培養とトランスフェクション
KBM7(ヒト慢性骨髄性白血病細胞株)、MV4−11(B骨髄性単球性混合型白血病)、MEG−01(ヒト慢性骨髄性白血病)、K−562(ヒト慢性骨髄性白血病)およびHAP1(KBM7由来)細胞株を、10%のウシ胎仔血清(FBS;Gibco)を補ったIscove’s変法ダルベッコ培地(IMDM、Gibco)中で培養した。HEK293T(ヒト胚腎臓)およびHELA(子宮頚部腺癌)細胞株を、10%のFBSを補ったダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Gibco)中で培養した。MOLM−13(ヒト急性単球性白血病)、NOMO−1(ヒト急性単球性白血病)およびA549(肺癌)細胞株を、10%のFBSを補ったRPMI−1640(Roswell Park Memorial Institute、Gibco)中で培養した。言及したすべての細胞株を、37℃にて5%のCO2雰囲気中でインキュベートした。HEK293T細胞を、製造業者の取扱説明書にしたがって、Lipofectamine2000(Invitrogen)で形質移入した。
細胞培養とトランスフェクション
KBM7(ヒト慢性骨髄性白血病細胞株)、MV4−11(B骨髄性単球性混合型白血病)、MEG−01(ヒト慢性骨髄性白血病)、K−562(ヒト慢性骨髄性白血病)およびHAP1(KBM7由来)細胞株を、10%のウシ胎仔血清(FBS;Gibco)を補ったIscove’s変法ダルベッコ培地(IMDM、Gibco)中で培養した。HEK293T(ヒト胚腎臓)およびHELA(子宮頚部腺癌)細胞株を、10%のFBSを補ったダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Gibco)中で培養した。MOLM−13(ヒト急性単球性白血病)、NOMO−1(ヒト急性単球性白血病)およびA549(肺癌)細胞株を、10%のFBSを補ったRPMI−1640(Roswell Park Memorial Institute、Gibco)中で培養した。言及したすべての細胞株を、37℃にて5%のCO2雰囲気中でインキュベートした。HEK293T細胞を、製造業者の取扱説明書にしたがって、Lipofectamine2000(Invitrogen)で形質移入した。
レトロウイルスGene−Trapベクター(pGT−GFP;以下を参照)は、the Cell biology, Signaling, Therapeutics Program, Ludwig Cancer Research (Oxford, UK)のグループリーダーであるDr. Sebastian Nijmanから進呈された。
GFP−MTHFD1プラスミドは、the Division of Nutritional Sciences, Cornell University (Ithaca, NY)のディレクターであるPatrick Stover教授(イタケー(NY))から進呈された。
GFP−MTHFD1プラスミドは、the Division of Nutritional Sciences, Cornell University (Ithaca, NY)のディレクターであるPatrick Stover教授(イタケー(NY))から進呈された。
ウエスタンブロット法と免疫沈降反応
ウエスタンブロットのために、タンパク質を、SDS泳動バッファー(50mMのTris、380mMのグリシン、7mMのSDS)を用いてポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースブロッティング膜に移した。すべての膜を、ブロッキングバッファー(TBST(Tweenを伴ったTris緩衝生理食塩水:50mMのTris(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、150mMのNaCl、0.05%(v/v)のTween20)、pH7.6に調整)中の5%(m/v)の粉ミルク(BioRad))でブロッキングした。タンパク質を、BRD4(ab128874、1:1000、Abcam)、アクチン(ab16039、1:1000、Abcam)、MTHFD1(ab70203、Abcam;H120、Santa Cruz;A8、Santa Cruz、すべて1:1000にて使用)、GFP(G10362、1:1000、Life Technology)、RCC1(C−20、1:1000、Santa Cruz)、β−チューブリン(T−4026、1:1000、Sigma)、SHMT1(ab186130、1:1000、Abcam)およびH2B(ab156197、1:1000、Abcam)に対する抗体で探査し、HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)複合ロバ抗ウサギIgG抗体(ab16284、1:5000、Abcam)またはロバ抗マウスIgG抗体(Pierce)によって検出し、そして、提供したプロトコールにしたがって、Pierce ECLウエスタンブロッティング基質(Amersham)を用いて可視化した。
ウエスタンブロットのために、タンパク質を、SDS泳動バッファー(50mMのTris、380mMのグリシン、7mMのSDS)を用いてポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースブロッティング膜に移した。すべての膜を、ブロッキングバッファー(TBST(Tweenを伴ったTris緩衝生理食塩水:50mMのTris(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、150mMのNaCl、0.05%(v/v)のTween20)、pH7.6に調整)中の5%(m/v)の粉ミルク(BioRad))でブロッキングした。タンパク質を、BRD4(ab128874、1:1000、Abcam)、アクチン(ab16039、1:1000、Abcam)、MTHFD1(ab70203、Abcam;H120、Santa Cruz;A8、Santa Cruz、すべて1:1000にて使用)、GFP(G10362、1:1000、Life Technology)、RCC1(C−20、1:1000、Santa Cruz)、β−チューブリン(T−4026、1:1000、Sigma)、SHMT1(ab186130、1:1000、Abcam)およびH2B(ab156197、1:1000、Abcam)に対する抗体で探査し、HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)複合ロバ抗ウサギIgG抗体(ab16284、1:5000、Abcam)またはロバ抗マウスIgG抗体(Pierce)によって検出し、そして、提供したプロトコールにしたがって、Pierce ECLウエスタンブロッティング基質(Amersham)を用いて可視化した。
免疫沈降反応のために、1mgのタンパク質抽出物を、1μgのBRD4(ab128874、Abcam)、MTHFD1(A8、Santa Cruz)またはGFP(G10362、Life Technology)抗体と共に4℃にて一晩プレインキュベートした、10μlのDynabeads(AまたはGのいずれか、Life Technology)と共に4℃にて2時間インキュベートした。
免疫蛍光法と生細胞イメージング
免疫蛍光法のために、細胞を、Polylysine(Sigma)で事前にコーティングしたカバーガラス上で培養した。所望の処理後に、細胞を、PBSで洗浄し、少なくとも24時間冷メタノールで固定した。ブロッキングを、PBS/3%のウシ血清アルブミンの(BSA)/0.1%のTriton中で30分間実施した。次に、細胞を、一次抗体(MTHFD1 H120、Santa Cruz、BRD4 ab128874、Abcam)と共に室温にて30分間インキュベートした。洗浄後に、それらを、二次抗体(Alexa Fluor 488ヤギ抗ウサギおよびAlexa Fluor 546ロバ抗マウス、Thermo Fisher Scientific)と共に暗所において30分間インキュベートした。最後に、それらを、洗浄し、そして、DAPI(4,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)と共に暗所において室温にて5分間インキュベートした。3回PBS洗浄ステップをおこない、過剰な抗体およびDAPIを取り除き、そしてカバーガラスを、没食子酸プロピル(Sigma)と共にスライド上に乗せた。写真を、Leica DMI6000B倒立顕微鏡および63×油浸対物レンズを用いて撮影し、Fiji(ImageJ)を用いて分析した。
免疫蛍光法のために、細胞を、Polylysine(Sigma)で事前にコーティングしたカバーガラス上で培養した。所望の処理後に、細胞を、PBSで洗浄し、少なくとも24時間冷メタノールで固定した。ブロッキングを、PBS/3%のウシ血清アルブミンの(BSA)/0.1%のTriton中で30分間実施した。次に、細胞を、一次抗体(MTHFD1 H120、Santa Cruz、BRD4 ab128874、Abcam)と共に室温にて30分間インキュベートした。洗浄後に、それらを、二次抗体(Alexa Fluor 488ヤギ抗ウサギおよびAlexa Fluor 546ロバ抗マウス、Thermo Fisher Scientific)と共に暗所において30分間インキュベートした。最後に、それらを、洗浄し、そして、DAPI(4,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)と共に暗所において室温にて5分間インキュベートした。3回PBS洗浄ステップをおこない、過剰な抗体およびDAPIを取り除き、そしてカバーガラスを、没食子酸プロピル(Sigma)と共にスライド上に乗せた。写真を、Leica DMI6000B倒立顕微鏡および63×油浸対物レンズを用いて撮影し、Fiji(ImageJ)を用いて分析した。
生細胞イメージング写真を、Operetta High Content Screening System(PerkinElmer)、20×対物レンズ、および非共焦モードで、透明な平底96ウェルまたは384ウェルプレート(Corning)上に播種した細胞で撮影した。RFP定量化を、使用した特定の細胞株の核直径範囲(KBM7、13μm)に合わせた、核検出および分析のための基本的なPerkinElmerのソフトウェアを使用しておこなった。RFP陽性核だけを検出し、カウントした。
細胞サイクルアッセイ
細胞周期アッセイのために、100万個の細胞を、70%のエタノールで24時間固定し、PBS/1%のBSA/0.1%のTweenで洗浄し、そして、リボヌクレアーゼと共に20分間インキュベートした。核を、5μg/mlのPI(ヨウ化プロピジウム、Sigma)で10分間染色し、その後、FACS分析(BD FACSCalibur Flow Cytometer)した。
細胞周期アッセイのために、100万個の細胞を、70%のエタノールで24時間固定し、PBS/1%のBSA/0.1%のTweenで洗浄し、そして、リボヌクレアーゼと共に20分間インキュベートした。核を、5μg/mlのPI(ヨウ化プロピジウム、Sigma)で10分間染色し、その後、FACS分析(BD FACSCalibur Flow Cytometer)した。
RNA抽出とRT−PCR
RNA抽出を、標準的なプロトコールにしたがって、TRIzol試薬(Life Technologies)を用いておこない、そして、逆転写(RT)を、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)を使用して実施した。
QPCRを、製造業者のプロトコールに記載のPower SYBR Green Masterミックス(Invitrogen)を使用して実施した。
RNA抽出を、標準的なプロトコールにしたがって、TRIzol試薬(Life Technologies)を用いておこない、そして、逆転写(RT)を、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)を使用して実施した。
QPCRを、製造業者のプロトコールに記載のPower SYBR Green Masterミックス(Invitrogen)を使用して実施した。
使用したQPCRプライマー:
アクチン(Sigma;フォワード5’−ATGATGATATCGCCGCGCTC、リバース5’−CCACCATCACGCCCTGG)。
BRD1(Sigma;フォワード5’−GAAGAAGCAGTTTGTGGAGC、リバース5’−GCAGTCTCAGCGAAGCTCAC)。
BRD2(Sigma;フォワード5’−GCTTGGGAAGACTTTGTTGG、リバース5’−TGTCAGTCACCAGGCAGAAG)。
BRD3(Sigma;フォワード5’−AAGAAGAAGGACAAGGAGAAGG、リバース5’−CTTCTTGGCAGGAGCCTTCT)。
BRD4(Sigma;フォワード5’−CAGGAGGGTTGTACTTATAGCA、リバース5’−CTACTGTGACATCATCAAGCAC)。
BRDT(Sigma;フォワード5’−TCAAAGATCCCGATTGAACC、リバース5’−CGGAAAGGTACTTGGGACAA)。
アクチン(Sigma;フォワード5’−ATGATGATATCGCCGCGCTC、リバース5’−CCACCATCACGCCCTGG)。
BRD1(Sigma;フォワード5’−GAAGAAGCAGTTTGTGGAGC、リバース5’−GCAGTCTCAGCGAAGCTCAC)。
BRD2(Sigma;フォワード5’−GCTTGGGAAGACTTTGTTGG、リバース5’−TGTCAGTCACCAGGCAGAAG)。
BRD3(Sigma;フォワード5’−AAGAAGAAGGACAAGGAGAAGG、リバース5’−CTTCTTGGCAGGAGCCTTCT)。
BRD4(Sigma;フォワード5’−CAGGAGGGTTGTACTTATAGCA、リバース5’−CTACTGTGACATCATCAAGCAC)。
BRDT(Sigma;フォワード5’−TCAAAGATCCCGATTGAACC、リバース5’−CGGAAAGGTACTTGGGACAA)。
リアルタイム増幅の結果物を、内因性ハウスキーピング遺伝子であるアクチンに対して正規化した。相対量を、比較CT(サイクル閾値)法(ΔΔCT法)を使用して計算した。
Gene−Trap遺伝子スクリーニング
pGT−GFPは、不活性な3’LTR、強力なアデノウイルス(Ad40)スプライス受容部位、GFPおよびSV40ポリアデニル化シグナルを含む。Gene trapウイルスを、レトロウイルスパッケージングプラスミドと組み合わせたpGT−GFPを用いた、T150ディッシュ内の293T細胞のトランスフェクションによって作出した。ウイルス含有上清を、トランスフェクションの30、48および72時間後に回収し、そして、SW32Tiローターを使用したBeckman Coulter Optima L−100 XP超遠心機により24100rpmにて1.5時間超遠心を使用して濃縮した。
pGT−GFPは、不活性な3’LTR、強力なアデノウイルス(Ad40)スプライス受容部位、GFPおよびSV40ポリアデニル化シグナルを含む。Gene trapウイルスを、レトロウイルスパッケージングプラスミドと組み合わせたpGT−GFPを用いた、T150ディッシュ内の293T細胞のトランスフェクションによって作出した。ウイルス含有上清を、トランスフェクションの30、48および72時間後に回収し、そして、SW32Tiローターを使用したBeckman Coulter Optima L−100 XP超遠心機により24100rpmにて1.5時間超遠心を使用して濃縮した。
REDS1クローンを、2000rpmにて45分間スピン感染を使用して、1ウェルあたり100万個の細胞を含む24ウェル組織培養ディッシュの感染によって突然変異誘発した。GT感染細胞を、FACSによって評価して、感染のパーセンテージ(GFP陽性細胞のパーセンテージ)を測定した。斯かるパーセンテージが70%を超えた場合、REDS1 GFP/RFP二重陽性細胞を、ソートし、培養状態に2週間おいて、配列決定のためのライブラリー作成に使用するために適当な量の細胞を得た。
細胞ソーティング
RFP/GFP二重陽性細胞ソーティングを、FACSAria(BD Biosciences)ソーターを使用して実施した。陽性または陰性RFPまたはGFP集団のためのゲートを、適切な陽性または陰性対照を使用しておこなった。RFP/GFP二重陽性細胞を、GT感染の7日後にソートした。RFP/GFP二重陽性細胞を、培養して、DNAライブラリー作成のために必要な量(3000万個)を得た。
RFP/GFP二重陽性細胞ソーティングを、FACSAria(BD Biosciences)ソーターを使用して実施した。陽性または陰性RFPまたはGFP集団のためのゲートを、適切な陽性または陰性対照を使用しておこなった。RFP/GFP二重陽性細胞を、GT感染の7日後にソートした。RFP/GFP二重陽性細胞を、培養して、DNAライブラリー作成のために必要な量(3000万個)を得た。
DNAライブラリー調製
DNAを、3000万個のGFP/RFP二重陽性REDS1細胞から、Genomic DNA単離QIAamp DNAミニキット(Qiagen)を使用して抽出した。4μgをNlaIIIまたはMseIで消化した(各酵素で4回消化)。スピンカラム精製(Qiagen)後に、1μgの消化DNAを、300μlの体積(4回のライゲーションの合計)でT4 DNAリガーゼ(NEB)を使用してライゲーションした。反応混合物を精製し、そして、レトロウイルス挿入部位を、次の作出配列決定に合わせた逆PCRプロトコールによって同定した16。
DNAを、3000万個のGFP/RFP二重陽性REDS1細胞から、Genomic DNA単離QIAamp DNAミニキット(Qiagen)を使用して抽出した。4μgをNlaIIIまたはMseIで消化した(各酵素で4回消化)。スピンカラム精製(Qiagen)後に、1μgの消化DNAを、300μlの体積(4回のライゲーションの合計)でT4 DNAリガーゼ(NEB)を使用してライゲーションした。反応混合物を精製し、そして、レトロウイルス挿入部位を、次の作出配列決定に合わせた逆PCRプロトコールによって同定した16。
FISHアッセイ
RFP特異的プローブ(RFP_プローブ)を、RFP特異的プライマー(Sigma;フォワード5’−CGGTTAAAGGTGCCGTCTCG、リバース5’−AGGCTTCCCAGGTCACGATG)を使用して実施したPCRにかけ、そして、dig−dUTP(DIG Nick Translation Mix、Roche)を使用して標識した。FISHアッセイ手順を、先に記載したとおりに実施した15。
RFP特異的プローブ(RFP_プローブ)を、RFP特異的プライマー(Sigma;フォワード5’−CGGTTAAAGGTGCCGTCTCG、リバース5’−AGGCTTCCCAGGTCACGATG)を使用して実施したPCRにかけ、そして、dig−dUTP(DIG Nick Translation Mix、Roche)を使用して標識した。FISHアッセイ手順を、先に記載したとおりに実施した15。
AlphaLISAアッセイ
Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay(AlphaLISAc)(均質、かつ、化学発光ベースの方法)を、BRD4とアセチル化基質との直接的な相互作用を調査するために実施した。
Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay(AlphaLISAc)(均質、かつ、化学発光ベースの方法)を、BRD4とアセチル化基質との直接的な相互作用を調査するために実施した。
簡単に言えば、このアッセイでは、ビオチン化MTHFD1アセチル化ペプチド(可能性のある基質)を、ストレプトアビジン結合ドナービーズによって捕獲した。GSTタグ付与BRD4(先に記載のとおり作製15)は、アクセプタービーズと複合化した抗GST抗体によって認識され、そして、結合される。BRD4とあるアセチル化ペプチドとの間の相互作用の場合、パートナー間の近接(<200nm)は、ドナービーズの励起(680nmの波長)が、その後のアクセプタービーズのエネルギー移行カスケードを引き起こす一重線酸素分子(1O2)の放出を誘発し、615nmにおける発光の鋭いピークをもたらすことを可能にする。
GST−BRD4および各MTHFD1アセチル化ペプチドを一緒にインキュベートした。30分後、GSH(グルタチオン)アクセプタビーズ(PerkinElmer)を加え、30分間のさらなるインキュベーション時間後に、ストレプトアビジン複合化ドナービーズ(PerkinElmer)を加えた。シグナルのカウント(アルファカウント)を、EnVision2104 Multilabel Reader(PerkinElmer)によって読み取った。
プロテオミクスのための有核細胞抽出物の調製
核抽出物を、5.0×10e6細胞/mLにて培養した新しい細胞から作製した。細胞を、遠心分離によって回収し、PBSで洗浄し、そして、低張バッファーA(25mlあたり10mMのTris−Cl、pH7.4、1.5mMのMgCl2、10mMのKCl、25mMのNaF、1mMのNa3VO4、1mMのDTT、および1錠のRocheプロテアーゼインヒビター錠剤)中に再懸濁した。約3分後に、細胞を、遠心処理して沈下させ、バッファーA中に再懸濁し、そして、ダンス型ホモジェナイザーを使用して均質化した。核を、3300rpmにて10分間の遠心分離によって微量遠心管内に回収し、バッファーAで洗浄し、そして、1当量の抽出バッファーB(25mlあたり50mMのTris−Cl、pH7.4、1.5mMのMgCl2、20%のグリセロール、420mMのNaCl、25mMのNaF、1mMのNa3VO4、1mMのDTT、400単位/mlのDNアーゼI、および1錠のRocheプロテアーゼインヒビター錠剤)中で均質化した。抽出は、その抽出物を13000gの遠心分離によって浄化する前に、4℃にて30分間、撹拌しながら進められた。抽出物を、バッファーD(50mMのTris−Cl、pH7.4(RT)、1.5mMのMgCl2、25mMのNaF、1mMのNa3VO4、0.6%のNP40、1mMのDTT、およびRocheプロテアーゼインヒビター)中に3:1で希釈し、再び遠心分離し、そして、アリコートを、液体窒素中で急冷し、−80℃にて保存した。
核抽出物を、5.0×10e6細胞/mLにて培養した新しい細胞から作製した。細胞を、遠心分離によって回収し、PBSで洗浄し、そして、低張バッファーA(25mlあたり10mMのTris−Cl、pH7.4、1.5mMのMgCl2、10mMのKCl、25mMのNaF、1mMのNa3VO4、1mMのDTT、および1錠のRocheプロテアーゼインヒビター錠剤)中に再懸濁した。約3分後に、細胞を、遠心処理して沈下させ、バッファーA中に再懸濁し、そして、ダンス型ホモジェナイザーを使用して均質化した。核を、3300rpmにて10分間の遠心分離によって微量遠心管内に回収し、バッファーAで洗浄し、そして、1当量の抽出バッファーB(25mlあたり50mMのTris−Cl、pH7.4、1.5mMのMgCl2、20%のグリセロール、420mMのNaCl、25mMのNaF、1mMのNa3VO4、1mMのDTT、400単位/mlのDNアーゼI、および1錠のRocheプロテアーゼインヒビター錠剤)中で均質化した。抽出は、その抽出物を13000gの遠心分離によって浄化する前に、4℃にて30分間、撹拌しながら進められた。抽出物を、バッファーD(50mMのTris−Cl、pH7.4(RT)、1.5mMのMgCl2、25mMのNaF、1mMのNa3VO4、0.6%のNP40、1mMのDTT、およびRocheプロテアーゼインヒビター)中に3:1で希釈し、再び遠心分離し、そして、アリコートを、液体窒素中で急冷し、−80℃にて保存した。
免疫精製(IP−MS)
抗BRD4(A301−985A、Bethyl Labs)抗体(50μg)を、100μlのAminoLink樹脂(Thermo Fisher Scientific)に連結した。細胞溶解物サンプル(5mg)を、予洗した免疫樹脂と共に振盪機上で4℃にて2時間インキュベートした。ビーズを、0.4%のIgepal−CA630を含有する溶解バッファー中で、および界面活性剤を含まない溶解バッファー中で洗浄し、続いて、150mMのNaClを用いた2回の洗浄ステップをおこなった。サンプルを、それらを還元し、アルキル化し、トリプシンで消化する前に、Lys−Cおよびグリシンプロテアーゼを用いたビーズ上での消化によって加工した。
抗BRD4(A301−985A、Bethyl Labs)抗体(50μg)を、100μlのAminoLink樹脂(Thermo Fisher Scientific)に連結した。細胞溶解物サンプル(5mg)を、予洗した免疫樹脂と共に振盪機上で4℃にて2時間インキュベートした。ビーズを、0.4%のIgepal−CA630を含有する溶解バッファー中で、および界面活性剤を含まない溶解バッファー中で洗浄し、続いて、150mMのNaClを用いた2回の洗浄ステップをおこなった。サンプルを、それらを還元し、アルキル化し、トリプシンで消化する前に、Lys−Cおよびグリシンプロテアーゼを用いたビーズ上での消化によって加工した。
ナノLC−MS分析
使用したナノHPLCシステムは、Proxeonナノスプレーソース(Thermo Fisher Scientific、Odense, Denmark)を備えたQ Exactive質量分析計(Thermo Fisher Scientific、Bremen, Germany)に連結したUltiMate3000HPLC−RSLCナノシステム(Thermo Fisher Scientific、Amsterdam, Netherlands)であった。
使用したナノHPLCシステムは、Proxeonナノスプレーソース(Thermo Fisher Scientific、Odense, Denmark)を備えたQ Exactive質量分析計(Thermo Fisher Scientific、Bremen, Germany)に連結したUltiMate3000HPLC−RSLCナノシステム(Thermo Fisher Scientific、Amsterdam, Netherlands)であった。
Q Exactive質量分析計を、完全スキャンを使用して(m/z範囲350〜1650、70000の公称分解能、標的値1E6)、データ依存モードで操作し、続いて、12種類の最も豊富なイオンのMS/MSスキャンをおこなった。正規化衝突エネルギー30%、分離幅2を使用し、および標的値を5E4に設定して、MS/MSスペクトルを得た。断片化のために選択した前駆イオン(荷電状態2以上)を、30秒間、動的除外リストに載せた。さらに、アンダーフィル比を20%に設定し、2E4の強度閾値をもたらした。ペプチドマッチ特性および除外同位体特性を有効にした。
データ分析
ペプチド同定のために、RAW−ファイルを、Proteome Discoverer(バージョン1.4.0.288、Thermo Scientific)にロードした。すべての本明細書によって得られたMS/MSスペクトルを、ヒトswissprotタンパク質配列データベースに対してMascot2.2.07(Matrix Science, London, UK)を使用して検索した。以下の検索パラメーターを使用した:システイン上のβ−メチルチオール化を、固定修飾、メチオニンの酸化として設定した。モノアイソトピック質量を、トリプシンペプチドの無制限タンパク質質量の範囲内で検索した。ペプチド質量の許容範囲を、±5ppmに設定し、断片質量の許容範囲を±30mmuに設定した。切れ残りの最大数を2に設定した。タンパク質領域の計算のために、Event DetectorノードおよびPrecursor Ions Area Detectorノード(Thermo Proteome Discovererに組み込まれている両方)を使用した。結果を、Thermo Proteome Discovererに組み込まれているPercolatorアルゴリズムを使用して1%のFDRにフィルタリングした。無標識定量化を含めた三連反復試験の実施の追加データ処理を、Mascotデータベース検索と同じ検索パラメーターを適用したAndromedaサーチエンジンを使用したMaxQuantで実施した。その後の統計解析のために、Perseusソフトウェアプラットフォームを、Volcanoプロット、ヒートマップ、および階層的なクラスタリングを作成するために使用した。
ペプチド同定のために、RAW−ファイルを、Proteome Discoverer(バージョン1.4.0.288、Thermo Scientific)にロードした。すべての本明細書によって得られたMS/MSスペクトルを、ヒトswissprotタンパク質配列データベースに対してMascot2.2.07(Matrix Science, London, UK)を使用して検索した。以下の検索パラメーターを使用した:システイン上のβ−メチルチオール化を、固定修飾、メチオニンの酸化として設定した。モノアイソトピック質量を、トリプシンペプチドの無制限タンパク質質量の範囲内で検索した。ペプチド質量の許容範囲を、±5ppmに設定し、断片質量の許容範囲を±30mmuに設定した。切れ残りの最大数を2に設定した。タンパク質領域の計算のために、Event DetectorノードおよびPrecursor Ions Area Detectorノード(Thermo Proteome Discovererに組み込まれている両方)を使用した。結果を、Thermo Proteome Discovererに組み込まれているPercolatorアルゴリズムを使用して1%のFDRにフィルタリングした。無標識定量化を含めた三連反復試験の実施の追加データ処理を、Mascotデータベース検索と同じ検索パラメーターを適用したAndromedaサーチエンジンを使用したMaxQuantで実施した。その後の統計解析のために、Perseusソフトウェアプラットフォームを、Volcanoプロット、ヒートマップ、および階層的なクラスタリングを作成するために使用した。
ChIPmentation
ChIPmentation実験を、Schmidl et al., Nature Methods 201517に記載のとおり実施した。
ChIPmentation実験を、Schmidl et al., Nature Methods 201517に記載のとおり実施した。
ChIP−Seqサンプル調製
70〜80%の集密度の細胞を伴った3枚の15cmディッシュを、1回のChIP実験に使用した。簡単に言えば、細胞を、1%のホルムアルデヒドを用いて、室温にて10分間架橋処理し、次に、125mMのグリシンで、室温にて5分間クエンチした。次に、細胞を、冷たいPBSで洗浄し、15mlチューブ内に回収し、そして、4℃、1200rpmにて5分間の遠心分離によって冷たいPBSで再び洗浄して、最終的に急冷した。
70〜80%の集密度の細胞を伴った3枚の15cmディッシュを、1回のChIP実験に使用した。簡単に言えば、細胞を、1%のホルムアルデヒドを用いて、室温にて10分間架橋処理し、次に、125mMのグリシンで、室温にて5分間クエンチした。次に、細胞を、冷たいPBSで洗浄し、15mlチューブ内に回収し、そして、4℃、1200rpmにて5分間の遠心分離によって冷たいPBSで再び洗浄して、最終的に急冷した。
ChIPを、BRD4(Bethyl Laboratories, Inc.)およびMTHFD1(sc−271413、Santa Cruz)抗体を使用することによって、記載のとおり実施した18。要するに、架橋細胞溶解物を、クロマチンを200〜500bpの断片に破砕するために超音波処理した。断片化したクロマチンを、抗体と一緒に4℃にて一晩インキュベートし、続いて、あらかじめブロッキングしておいたDynabeads Protein G(Thermo Fisher Scientific)と共に4℃にて2時間インキュベートした。ビーズを、低塩バッファーで2回洗浄し、高塩バッファーで2回洗浄し、LiClバッファーで2回洗浄し、1×TEバッファーで2回洗浄し、最後に、溶出バッファーで65℃にて20分間溶出した。溶出生成物を、RNaseAで37℃にて30分間処理し、続いて、プロテイナーゼKで55℃にて1時間処理し、次に、65℃にて一晩インキュベートして、架橋を取り除いた。サンプルを、PCR精製キット(Qiagen)を使用することによってさらに精製した。ChIP−seqライブラリーを、Illumina HiSeq3000/4000プラットフォームおよび50bpのシングルエンド形状を使用して、CeMMのBiomedical Sequencing Facilityによって配列決定した。
ChIP−seqデータ分析
アダプターを含む読み出しを、Skewer19を使用してトリミングし、「超高感度」パラメーターを用いたBowtie220を使用してヒトゲノムのhg19/GRCh37組立物に対してアラインし、そして、二連反復試験の読み出しにマークを付し、sambambaを用いて除外した。ライブラリーの質を、phantomPeakQualtoolsスクリプト21を用いて評価した。視覚化だけのために、発明者らは、BEDTools22のgenomeCoverageBedコマンドを用いてゲノムブラウザトラックを作り出し、そして、各値が、マッピングおよびフィルタリングした読み出し100万個あたりの1塩基対あたりの読み出しカウントを表すように正規化した。これを、個別に各サンプルについて、および組み合わせた複製についておこなった。視覚化において、発明者らは、IGV23を使用して、それぞれ組み合わせたIPからそれぞれ組み合わせた対照IgGトラックを差し引いた。彼らは、「因子」モードでHOMER findPeaks24を使用して、バックグラウンドとして対応するIgG対照を用いて両複製におけるピークを呼び出し、そして、DiffBind25を使用して、dBET6処理に依存するH3K27acピークにおけるBRD4またはMTHFD1の示差的結合を検出した。(p値でソートした)各比較に関する上位500個の示差的領域を、SeqPlots26を用いた視覚化、およびDiffBindを用いて見積もられた各条件のそれぞれの因子の濃度値を使用することを伴ったクラスタリングのために使用した。同じ上位の示差的領域を、BEDファイルとしてEnrichr27に入力し、そして、リアクトーム経路に関する強化を拾い出した。
アダプターを含む読み出しを、Skewer19を使用してトリミングし、「超高感度」パラメーターを用いたBowtie220を使用してヒトゲノムのhg19/GRCh37組立物に対してアラインし、そして、二連反復試験の読み出しにマークを付し、sambambaを用いて除外した。ライブラリーの質を、phantomPeakQualtoolsスクリプト21を用いて評価した。視覚化だけのために、発明者らは、BEDTools22のgenomeCoverageBedコマンドを用いてゲノムブラウザトラックを作り出し、そして、各値が、マッピングおよびフィルタリングした読み出し100万個あたりの1塩基対あたりの読み出しカウントを表すように正規化した。これを、個別に各サンプルについて、および組み合わせた複製についておこなった。視覚化において、発明者らは、IGV23を使用して、それぞれ組み合わせたIPからそれぞれ組み合わせた対照IgGトラックを差し引いた。彼らは、「因子」モードでHOMER findPeaks24を使用して、バックグラウンドとして対応するIgG対照を用いて両複製におけるピークを呼び出し、そして、DiffBind25を使用して、dBET6処理に依存するH3K27acピークにおけるBRD4またはMTHFD1の示差的結合を検出した。(p値でソートした)各比較に関する上位500個の示差的領域を、SeqPlots26を用いた視覚化、およびDiffBindを用いて見積もられた各条件のそれぞれの因子の濃度値を使用することを伴ったクラスタリングのために使用した。同じ上位の示差的領域を、BEDファイルとしてEnrichr27に入力し、そして、リアクトーム経路に関する強化を拾い出した。
分子モデリング
BRD4に対するMTHFD1(K56ac)の結合親和力を計算するために、任意のペプチドと共結晶化したBRD4の6つの結晶構造を、RCSB Protein Databank(PDB;www.rcsb.org)28からダウンロードした。X線構造を、MOEソフトウェアパッケージのQuickPrepプロトコールを使用して調製した。それで、水素となくなった原子を加え、荷電を計算し、プロトン化状態を最適化し、そして衝突と変形を、不足エネルギーを最小化することによって取り除いた。共結晶化ペプチドをMTHFD1(K56ac)に変異させる前に、Asn140とアセチル化Lysとの重要な相互作用を抑制した。仮想変異、ならびに親和性と安定性の計算を、MOEソフトウェアパッケージのProtein Designツール(既定の設定用いたResidue Scan)を使用して実施した。
BRD4に対するMTHFD1(K56ac)の結合親和力を計算するために、任意のペプチドと共結晶化したBRD4の6つの結晶構造を、RCSB Protein Databank(PDB;www.rcsb.org)28からダウンロードした。X線構造を、MOEソフトウェアパッケージのQuickPrepプロトコールを使用して調製した。それで、水素となくなった原子を加え、荷電を計算し、プロトン化状態を最適化し、そして衝突と変形を、不足エネルギーを最小化することによって取り除いた。共結晶化ペプチドをMTHFD1(K56ac)に変異させる前に、Asn140とアセチル化Lysとの重要な相互作用を抑制した。仮想変異、ならびに親和性と安定性の計算を、MOEソフトウェアパッケージのProtein Designツール(既定の設定用いたResidue Scan)を使用して実施した。
MTHFD1(アセチル化および非アセチル化)へのメトトレキサート(MTX)の結合を予測するために、X線構造1A4Iを、MOEのQuickPrepプロトコールによって調製した。1A4Iの結合ポケットが高度に溶解性である場合、水分子が、結合実行中にMTX結合を妨げるであろう。そのため、すべての計算について、水分子を取り除いた。アセチル化対非アセチル化MTHFD1の結合の比較のために、調製した結晶構造を、MOEのProtein Builderを使用してアセチル化し、続いて、変異残基の不足エネルギーを最小化した。さらに、MTXを調製し、そして、MOEでプロトン化した。既定の設定を用いたLowModeMD方法を使用した立体構造解析が、37個の異なったMTX立体構造を提供する。これらの37個の立体構造を、既定の設定を用いたMOEの誘導適合型結合プロトコールを使用して、MTHFD1のアセチル化および非アセチル化構造に結合させた。結合した構造の相互作用フィンガープリントを、MOEのPLIFツールを使用して計算した。
クロマチン精製とLC−MS/MS分析法
細胞画分およびクロマチンの濃縮を、いくつかの改変を加えて先に記載29のとおりおこなった。簡単に言えば、1億個の細胞に関して、クロマチン濃縮ペレットを、洗浄後に、250μlのベンゾナーゼ消化バッファー(15mMのHEPES、1mMのEDTA、1mMのEGTA、0.1%のNP40、プロテアーゼインヒビターカクテル(cOmplete、Roche))中に溶かし、そして、以下の設定:ピークパワー140;デューティーファクター10.0;サイクル/バースト200を用いたCovaris S220集束超音波処理器により120秒間、超音波処理した。0.25Uのベンゾナーゼおよび2.5μgのRNアーゼ添加後に、クロマチンを、回転振盪培養器上で4℃にて40分間インキュベートした。2×SDS溶解バッファー(100mMのHEPES、4%のSDS、2mMのPMSFおよびプロテアーゼインヒビターカクテル(cOmplete、Roche))を1:1の比でサンプルに追加し、室温にて10分間インキュベートし、続いて、99℃にて5分間変性させた。室温、16.000gにて10分間の遠心分離後に、新しいチューブに上清を移した。MSサンプル調製を、先に記載30のFASPプロトコールを使用しておこなった。高または低pHにおける逆相クロマトグラフィーを、MSMS分析前の二次元ペプチド分離のためにおこなった。ペプチドを、固相抽出(SPE)(MacroSpin Columns、30〜300μgの容量、Nest Group Inc. Southboro, MA, USA)を使用して精製し、そして、23μLの5%のアセトニトリル、10mMのギ酸アンモニウム中で再構成した。Gemini−NX C18(150×2mm、3μm、110Å、Phenomenex, Torrance, US)カラムを備えたAgilent1200HPLCシステム(Agilent Biotechnologies, Palo Alto, CA)は液体クロマトグラフィーを、最初の次元に使用した。ペプチドを、100μL/分の流量にて、10mMのギ酸アンモニウム、pH10を含有する5から90%へのアセトニトリルの範囲に及ぶ30分間のグラジエントの間に20個の時間ベースの画分に分けた。サンプルを、5μLの5%ギ酸の添加によって酸性化した。溶媒を、真空濃縮器により取り除き、そして、サンプルを5%のギ酸中で再構成した。
細胞画分およびクロマチンの濃縮を、いくつかの改変を加えて先に記載29のとおりおこなった。簡単に言えば、1億個の細胞に関して、クロマチン濃縮ペレットを、洗浄後に、250μlのベンゾナーゼ消化バッファー(15mMのHEPES、1mMのEDTA、1mMのEGTA、0.1%のNP40、プロテアーゼインヒビターカクテル(cOmplete、Roche))中に溶かし、そして、以下の設定:ピークパワー140;デューティーファクター10.0;サイクル/バースト200を用いたCovaris S220集束超音波処理器により120秒間、超音波処理した。0.25Uのベンゾナーゼおよび2.5μgのRNアーゼ添加後に、クロマチンを、回転振盪培養器上で4℃にて40分間インキュベートした。2×SDS溶解バッファー(100mMのHEPES、4%のSDS、2mMのPMSFおよびプロテアーゼインヒビターカクテル(cOmplete、Roche))を1:1の比でサンプルに追加し、室温にて10分間インキュベートし、続いて、99℃にて5分間変性させた。室温、16.000gにて10分間の遠心分離後に、新しいチューブに上清を移した。MSサンプル調製を、先に記載30のFASPプロトコールを使用しておこなった。高または低pHにおける逆相クロマトグラフィーを、MSMS分析前の二次元ペプチド分離のためにおこなった。ペプチドを、固相抽出(SPE)(MacroSpin Columns、30〜300μgの容量、Nest Group Inc. Southboro, MA, USA)を使用して精製し、そして、23μLの5%のアセトニトリル、10mMのギ酸アンモニウム中で再構成した。Gemini−NX C18(150×2mm、3μm、110Å、Phenomenex, Torrance, US)カラムを備えたAgilent1200HPLCシステム(Agilent Biotechnologies, Palo Alto, CA)は液体クロマトグラフィーを、最初の次元に使用した。ペプチドを、100μL/分の流量にて、10mMのギ酸アンモニウム、pH10を含有する5から90%へのアセトニトリルの範囲に及ぶ30分間のグラジエントの間に20個の時間ベースの画分に分けた。サンプルを、5μLの5%ギ酸の添加によって酸性化した。溶媒を、真空濃縮器により取り除き、そして、サンプルを5%のギ酸中で再構成した。
質量分析を、Agilent1200シリーズの複式ポンプHPLCシステム(Agilent Biotechnologies, Palo Alto, CA)にオンラインで連結したQ Exactive質量分析計(ThermoFisher, Bremen, Germany)によりおこなった。サンプルを、45μL/分の一定流量にて、サーモスタット付オートサンプラー(4℃)からトラップカラム(Zorbax 300SB−C18 5μm、5×0.3mm、Agilent Biotechnologies, Palo Alto, CA, USA)に移した。検体分離は、20cmの75μm内径分析カラムにおいて起こり、そしてそれには、社内でReprosil C18(Dr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germany)を充填した。60分間のグラジエントは、250nL/分の一定流速にて、3%から40%への有機相の範囲にわたった。HPLCに使用した移動相は、それぞれ水相および有機相に0.4%のギ酸および90%のアセトニトリル+0.4%のギ酸であった。Q Exactive質量分析計を、それぞれの完全スキャンに続いて、最大10のMSMSスキャンを伴うデータ依存モードで操作した。以前に断片化したイオンを、20秒間の反復断片化から動的に除外した。MSおよびMSMSスキャンのための最大イオン射出時間として、それぞれ100msおよび120msを許容した。アナライザー分解能を、MSスキャンについて70,000に、そして、MSMSスキャンについて35、000に設定した。自動利得コントロールを、C−トラップの過剰充填を予防するために、MSおよびMSMSについて、それぞれ3×106および2×105に設定した。MSMSのアンダーフィル比を6%に設定したが、それは、断片化のためのペプチドを受け入れるための1×105の強度閾値に相当する。34個の正規化した衝突エネルギー(NCE)における高衝突エネルギー誘起解離(HCD)を、ペプチド断片化およびレポーターイオン作出のために利用した。遍在する混入シロキサンイオンSi(CH3)2O)6を、内部質量較正のためにm/z445.120024にてシングルロック質量として使用した。
MSデータ分析(クロマチン画分)
取得した未加工MSデータファイルを、先に記載31のとおり加工した。結果のピークリストを、サーチエンジンMascot(v.2.3.02)およびPhenyx(v.2.5.14)を用いて、ヒトSwissProtデータベースバージョン20150601に対して検索した。
取得した未加工MSデータファイルを、先に記載31のとおり加工した。結果のピークリストを、サーチエンジンMascot(v.2.3.02)およびPhenyx(v.2.5.14)を用いて、ヒトSwissProtデータベースバージョン20150601に対して検索した。
TMT定量化のために、isobar Rパッケージを使用した32。定量化の第1ステップとして、レポーターイオン強度を、コンピュータ上で正規化して、それぞれのTMTレポーターチャンネルにおいて等しい中央値強度をもたらした。isobar統計モデリングでは2つのP値:生物学的反復の間で見られた存在量の変化に対する処理による存在量の変化を比較するP値のサンプル、および質量分析データ収集におけるノイズ/変動性をモデル化するP値比、を考慮した。P値比を、誤発見率(FDR)向けにさらに補正した。P値サンプルとFDR補正P値比の両方が0.05未満である場合、タンパク質の存在量が有意に変化したと見なした。
代謝学のための有核細胞抽出物の調製
核を、低浸透圧性溶解によって抽出した。簡単に言えば、(結果の項に示したように)処理した無傷細胞を、冷たいPBSで2回洗浄し、そして、低浸透圧性溶解バッファー(10mMのHEPES、pH7.9(1.5mMのMgCl2、10mMのKClおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル(cOmplete、Roche)を含有);バッファー−細胞体積比5:1)と共に氷上で10分間インキュベートした。インキュベーション中に、ペレットを3回、穏やかに再懸濁した。核を、遠心分離(420g×5分間)によって回収し、すぐに急冷した。
核を、低浸透圧性溶解によって抽出した。簡単に言えば、(結果の項に示したように)処理した無傷細胞を、冷たいPBSで2回洗浄し、そして、低浸透圧性溶解バッファー(10mMのHEPES、pH7.9(1.5mMのMgCl2、10mMのKClおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル(cOmplete、Roche)を含有);バッファー−細胞体積比5:1)と共に氷上で10分間インキュベートした。インキュベーション中に、ペレットを3回、穏やかに再懸濁した。核を、遠心分離(420g×5分間)によって回収し、すぐに急冷した。
メタボロミックアッセイとデータ分析を、Metabolomic Discoveries(http://www.metabolomicdiscoveries.com;Germany)によっておこなった。簡単に言えば、LC−QTOF/MSベースの非標的化代謝産物プロファイリングを、最高1〜2ppmの精度および質量/Δ質量=40.000の分解能で、50〜1700Daの範囲内の核内代謝産物の分析に使用した。LCで計測した代謝産物を、それらの精密質量とその後の和公式予測にしたがって注釈を付した。LC−MS分析法によって注釈されなかった代謝産物を、彼らの精密質量および保持時間に応じて列挙する。
代謝産物セット強化分析
代謝産物セット強化分析(MSEA)33を、オンラインツールMetaboAnalyst34(http://www.metaboanalyst.ca/)を使用しておこなった。簡単に言えば、それぞれのあらかじめ定義された官能基に関して、倍率変化を、観察された有意に変化する代謝産物(上方および下方調節の両方を考慮、p値<0.05を有するt−検定)の数およびランダムな予測、ならびに(フィッシャーの直接確率検定を使用した)対応するp値の間で計算する。
代謝産物セット強化分析(MSEA)33を、オンラインツールMetaboAnalyst34(http://www.metaboanalyst.ca/)を使用しておこなった。簡単に言えば、それぞれのあらかじめ定義された官能基に関して、倍率変化を、観察された有意に変化する代謝産物(上方および下方調節の両方を考慮、p値<0.05を有するt−検定)の数およびランダムな予測、ならびに(フィッシャーの直接確率検定を使用した)対応するp値の間で計算する。
葉酸抽出とLC MS/MS分析法
核およびサイトゾル画分内の葉酸を定量化するために、1条件あたり2000万個のHAP1細胞を、冷たいPBSで2回洗浄し、そして、280g、4℃にて5分間の遠心分離によって50mlのfalconチューブ内に回収した。細胞分解を、暗所内の氷上で、1:5の低浸透圧性溶解バッファーと共に細胞ペレットを10分間インキュベートすることによって実施した。核を、420g、4℃にて5分間の遠心分離によって回収した。上清(サイトゾル画分)もまた回収した。両方の画分を、すぐに急冷した。
核およびサイトゾル画分内の葉酸を定量化するために、1条件あたり2000万個のHAP1細胞を、冷たいPBSで2回洗浄し、そして、280g、4℃にて5分間の遠心分離によって50mlのfalconチューブ内に回収した。細胞分解を、暗所内の氷上で、1:5の低浸透圧性溶解バッファーと共に細胞ペレットを10分間インキュベートすることによって実施した。核を、420g、4℃にて5分間の遠心分離によって回収した。上清(サイトゾル画分)もまた回収した。両方の画分を、すぐに急冷した。
核サンプルに関して、10μLのISTD混合物を、1.5mLのエッペンドルフチューブ内の核ペレットに加え、続いて、145μLの氷冷した抽出溶媒(80%のメタノール中の10mg/mLのアスコルビン酸溶液、20%の水、V/V)を加えた。
サンプルを、10秒間ボルテックス処理し、その後、氷上で3分間インキュベートし、そして、再び10秒間ボルテックス処理した。遠心分離(14000rpm、10分間、4℃)後に、上清をHPLCバイアル内に回収した。抽出ステップを繰り返し、そして合わせた上清をLC−MS/MS分析法に使用した。
細胞質サンプルに関して、10μLのISTD混合物を、1.5mLのエッペンドルフチューブ内の75μLの細胞質に加え、続いて、215μLの氷冷した抽出溶媒/(80%のメタノール中の10mg/mLのアスコルビン酸溶液、20%の水、V/V)を加えた。サンプルを、10秒間ボルテックス処理し、その後、氷上で3分間インキュベートし、そして、再び10秒間ボルテックス処理した。遠心分離(14000rpm、10分間、4℃)後に、上清をHPLCバイアル内に回収し、LC−MS/MS分析法に使用した。
Xevo TQ−MS(Waters)三連四重極質量分析計と組み合わせたAcquity UHPLCシステム(Waters)を、定量的な代謝物分析に使用した。分離を、40℃にて、Acquity HSS T3 1.8μM Vanguardガードカラム(Waters)を備えたACQUITY HSS T3、1.8μm、2.1×100mmカラム(Waters)によりおこなった。分離を、移動相Aとしての水中の0.1%のギ酸(v/v)、および移動相Bとしてのメタノール中の0.1%のギ酸(v/v)を使用しておこなった。0.5mL/分の流量を用いたグラジエント溶出を、10分間の総分析時間でおこなった。オートサンプラ温度を4℃に設定した。検出のために、複数の反応モードを有する陽性電界蒸発イオン化モードのWaters Xevo TQ−MSを利用した。すべての代謝産物の定量化を、Waters製のMassLynx V4.1ソフトウェアを使用しておこなった。定量化のために、内部標準化と1/x秤量を用いて7点の線型検量線を構成した。
マウス異種移植片試験
マウス異種移植片試験を、先に記載35したようにおこなった。マトリゲル中に1:1に希釈した2×106個のA549細胞を、NOD SCIDガンママウスに皮下移植した。
マウス異種移植片試験を、先に記載35したようにおこなった。マトリゲル中に1:1に希釈した2×106個のA549細胞を、NOD SCIDガンママウスに皮下移植した。
処置(週5回の腹腔内注射による30mg/kgの(S)−JQ1および週2回の腹腔内注射による25mg/kgのMTX)を、腫瘍が樹立された移植後19日目に開始した。腫瘍体積を、カリパスで2つの直交する直径を計測することによって、週2回、評価した。腫瘍体積を、以下の方程式:(幅*幅*長さ)/2、を使用して計算した。処置を、Bundesministerium fur Wissenschaft und Forschung(BMWF−66.009/0280II/3b/2012)によって承認された動物ライセンスプロトコールにしたがって実施した。43日目に、マウスを屠殺し、そして、腫瘍を摘出し、計量した。
BRD4経路遺伝子に関する遺伝子の機能喪失型スクリーン
有効なGT遺伝子スクリーニングのための前提条件は、単一対立遺伝子性の破壊的なGT組み込みが遺伝子ノックアウト(KO)をもたらすハプロイドシステムである。そのため、KBM7細胞(ニアハプロイド核型を有する慢性骨髄性白血病細胞株)が、先に記載15のとおりBRD4レポーター細胞株の作出のために選ばれた。強力な阻害剤(S)−JQ1を用いたBRD4の阻害は、REDSにおけるレポーター遺伝子である赤色蛍光タンパク質(RFP)の急激かつ恒常的な発現につながり、そしてそれは、FACSによって容易に検出できた(図6Aを参照)。ヨウ化プロピジウム(PI)取り込みおよびFACS分析を、GTベースの遺伝子スクリーニングに好適なハプロイドクローンを選択するために、いくつかのREDSクローンの細胞サイクルプロファイルをアッセイするために使用した。驚いたことに、元々選択されたクローンの大部分は、増強された、有望な二倍体の、DNA含量を示した。REDS1は、同様に中期分散によって確認された、ハプロイド核型(図6Bを参照)を有する唯一のクローン細胞株であった(図6Cを参照)。この知見は、BRD4阻害剤を用いた処理がこの特定の細胞株において二倍体様の表現型を誘導できることを示した。この複相化の動態を試験するために、WT(野性型)−KBM7細胞を、1週間にわたり、DMSO、(S)−JQ1またはその不活性な鏡像異性体(R)−JQ1のいずれかで一晩処理し、そして、PI取り込みおよびFACSによって細胞サイクルプロファイルを評価した。(S)−JQ1処理だけがWT−KBM7複相化を引き起こし(図6Dを参照)、そのため、染色体数に対するBRD4阻害媒介型効果に関する仮説を確認が、染色体不安定性、染色体分離の欠陥、または増強された内部複製を通じて可能である。
有効なGT遺伝子スクリーニングのための前提条件は、単一対立遺伝子性の破壊的なGT組み込みが遺伝子ノックアウト(KO)をもたらすハプロイドシステムである。そのため、KBM7細胞(ニアハプロイド核型を有する慢性骨髄性白血病細胞株)が、先に記載15のとおりBRD4レポーター細胞株の作出のために選ばれた。強力な阻害剤(S)−JQ1を用いたBRD4の阻害は、REDSにおけるレポーター遺伝子である赤色蛍光タンパク質(RFP)の急激かつ恒常的な発現につながり、そしてそれは、FACSによって容易に検出できた(図6Aを参照)。ヨウ化プロピジウム(PI)取り込みおよびFACS分析を、GTベースの遺伝子スクリーニングに好適なハプロイドクローンを選択するために、いくつかのREDSクローンの細胞サイクルプロファイルをアッセイするために使用した。驚いたことに、元々選択されたクローンの大部分は、増強された、有望な二倍体の、DNA含量を示した。REDS1は、同様に中期分散によって確認された、ハプロイド核型(図6Bを参照)を有する唯一のクローン細胞株であった(図6Cを参照)。この知見は、BRD4阻害剤を用いた処理がこの特定の細胞株において二倍体様の表現型を誘導できることを示した。この複相化の動態を試験するために、WT(野性型)−KBM7細胞を、1週間にわたり、DMSO、(S)−JQ1またはその不活性な鏡像異性体(R)−JQ1のいずれかで一晩処理し、そして、PI取り込みおよびFACSによって細胞サイクルプロファイルを評価した。(S)−JQ1処理だけがWT−KBM7複相化を引き起こし(図6Dを参照)、そのため、染色体数に対するBRD4阻害媒介型効果に関する仮説を確認が、染色体不安定性、染色体分離の欠陥、または増強された内部複製を通じて可能である。
次いで、GTベースの遺伝子スクリーニングのためのREDS1クローンの適合性を、さらに実証した。クローンは、蛍光in situハイブリダイゼーションによって決定されるように、シングルゲノムRFP組み込みを担持している(図7Aを参照)。1μM(S)−JQ1で24時間処理したREDS1細胞は、RFPを強力に発現し(図7Bを参照)、そしてそれは、RFPは生細胞イメージングによって検出できた。(S)−JQ1は、他のBET(ブロモドメインおよび特異的末端ドメイン)タンパク質を強力に阻害するので、BRD1、BRD2、BRD3、BRDTおよびBRD4に対するショートヘアピンRNA(shRNA)を、それらがRFP発現を誘発できるか試験した。すべてのヘアピンが、それらのそれぞれのmRNAの>70%の下方制御を引き起こした(図7Cを参照)。生細胞イメージングから定量化したRFP発現は、BRD4の下方制御だけがこのパラメーターの明白な増大を引き起こしたことを示した(図7Dを参照)。最後に、配列決定アプローチを使用して、RFP組み込み部位を、第6染色体上のCDKAL1遺伝子の第一イントロン内に配置した(図7Eを参照)。
実証されたREDS1クローンを用いて、GT媒介性遺伝子スクリーニングを、BRD4の新しい機能的なパートナーを同定するためにおこなった(図1Aを参照)。スクリーニングシステムの高い特異性は、BRD4阻害様のパターンにおいてクロマチンのリモデリングを明確に示す直接的な読み出し(RFPシグナル)に依存する。そのため、特異的遺伝子KOによるRFPの発現は、斯かる遺伝子が、BRD4が依存する遺伝子座におけるクロマチンのリモデリングに関与することを示す。緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子を担持するGTウイルスを用いたREDS1細胞の感染に続いて、この細胞集団が特異的遺伝子KOによりBRD4阻害を表現型模写するので、二重陽性細胞(RFP+/GFP+)をソートした(図1Bを参照)。この集団からのゲノムDNAの抽出に続いて、GT組み込み部位を、増幅し、配列し、そしてゲノム上にマッピングした。データを、任意抽出の対照集団と比較した独立した組み込み数、およびGTベクターの破壊的なセンス組み込み対アンチセンス組み込みの分布について分析した。3つの際立ったヒット、長い非コーディングRNA AC113189.5、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ1(MTHFD1)およびDNA損傷チェックポイント1(MDC1)のメディエーター(図1C、8Aおよび11を参照)がこの分析から浮上した。これらの3つの遺伝子に関して、DNA修復にかかわる遺伝子であるMDC1だけが、DNA損傷シグナル伝達中のDNAインシュレーターとしてBRD4の短いアイソフォームの役割を通してBRD4生物学に間接的に以前につながりがあった。BRD4の遺伝子相互作用因子としてのMTHFD1を実証するために、REDS1細胞を、3つの様々なshRNAで処理し、そして、MTHFD1の44〜92%のノックダウンがもたらされた(図1Dを参照)。3個のヘアピンすべてが、レポーターRFP発現を誘発し、エフェクトサイズはそれらのノックダウン効率と相関した(図1Eおよび1Fを参照)。クローン効果を除外するために、同じ実験を二倍体REDS3細胞で繰り返し、そして類似の結果を得た(図8B、8Cおよび8Dを参照)。
MTHFD1は、BRD4との物理的相互作用によってクロマチンに動員される
BRD4介在性遺伝子調整におけるMTHFD1の役割を理解するために、これらの2つのタンパク質が物理的に相互作用するか否か試験した。そのため、HEK293T細胞を、GFP−MTHFD1をコードするプラスミドを用いて形質移入した。48時間後に、GFPプルダウン(PD)を実施し、BRD4が過剰発現した(OE)MTHFD1と共免疫沈降(co−IP)できることを示した(図9Aを参照)。同様に、HeLa細胞のBRD4 PDは、MTHFD1がこのブロモドメイン含有タンパク質の内因性形態と相互作用することを示した(図9Bを参照)。BRD4は白血病進行を駆動するその役割が広く試験されているので、不偏性プロテオミクスアプローチを、K562、MOLM−13、MV4−11およびMEG01細胞株におけるすべてのBRD4相互作用因子を同定するのに使用した(図2Aおよび9Cを参照)。13種類のタンパク質だけが、4種類の細胞株のすべてでBRD4と普通に相互作用した。このセットは、BRD3、LMNB1、およびSMC3のような数個のクロマチンタンパク質を含んだ。加えて、BRD4機能に必要とされる主要因として遺伝子スクリーニングで同定された葉酸経路酵素であるMTHFD1は、4種類の細胞株のすべてでBRD4の直接的な相互作用因子と同定された。MTHFD1とBRD4との相互作用はまた、プロテオミクスアプローチに使用されるK562、MOLM−13、MV4−11、およびMEG01細胞株で実施したプルダウン実験でも確認された(図14Aを参照)。
BRD4介在性遺伝子調整におけるMTHFD1の役割を理解するために、これらの2つのタンパク質が物理的に相互作用するか否か試験した。そのため、HEK293T細胞を、GFP−MTHFD1をコードするプラスミドを用いて形質移入した。48時間後に、GFPプルダウン(PD)を実施し、BRD4が過剰発現した(OE)MTHFD1と共免疫沈降(co−IP)できることを示した(図9Aを参照)。同様に、HeLa細胞のBRD4 PDは、MTHFD1がこのブロモドメイン含有タンパク質の内因性形態と相互作用することを示した(図9Bを参照)。BRD4は白血病進行を駆動するその役割が広く試験されているので、不偏性プロテオミクスアプローチを、K562、MOLM−13、MV4−11およびMEG01細胞株におけるすべてのBRD4相互作用因子を同定するのに使用した(図2Aおよび9Cを参照)。13種類のタンパク質だけが、4種類の細胞株のすべてでBRD4と普通に相互作用した。このセットは、BRD3、LMNB1、およびSMC3のような数個のクロマチンタンパク質を含んだ。加えて、BRD4機能に必要とされる主要因として遺伝子スクリーニングで同定された葉酸経路酵素であるMTHFD1は、4種類の細胞株のすべてでBRD4の直接的な相互作用因子と同定された。MTHFD1とBRD4との相互作用はまた、プロテオミクスアプローチに使用されるK562、MOLM−13、MV4−11、およびMEG01細胞株で実施したプルダウン実験でも確認された(図14Aを参照)。
BRD4は専ら核に局在化している一方で、葉酸生合成は、細胞質およびミトコンドリアの中で起こると考えられている。しかしながら、最近、葉酸経路酵素のSUMOylation依存性核インポートが記載された36-39。HAP1、KBM7およびHEK293T細胞の核対サイトゾル画分は、MTHFD1が、3種類の細胞株のすべてにおいて核内で検出されることを示した(図2B、上部パネルを参照)。別の葉酸経路酵素、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ1(SHMT1)とは対照的に、核内MTHFD1は、少しの分子量変化も示さず、SUMOylation以外の機構がその核局在化を駆動していることを示唆した。さらにこの知見を確認するために、HAP1細胞を、SUMOylationの低分子阻害剤であるギンコール酸(GA)で処理したが、それは、核と細胞質との間でMTHFD1の再分配を引き起こさなかった(図9Dを参照)。その細胞コンパートメントにおいて、BRD4とMTHFD1との相互作用が起こることを次に試験した。そのため、MTHFD1 PDを、HAP1、KBM7およびHEK293T細胞のサイトゾル画分と核画分で実施した。これらの実験は、BRD4との相互作用が核で専ら起こっていることを明らかにした(図2B、下部パネルを参照)。BRD4が、そのブロモドメインでアセチル化タンパク質、特にヒストンに結合することを前提として、発明者らは、結合のこの機構もまた、MTHFD1との相互作用を駆動しているかどうか理解することを目的とした。興味深いことに、プロテオーム研究によって、MTHFD1の表面の7つのリジンはアセチル化されることが知られている。そのため、合成アセチル化MTHFD1ペプチド(図9Eを参照)を、GST−BRD4へのそれらの結合に関するアルファLISAアッセイを実施するために使用した。意外なことに、アセチル化ペプチドのうちの一つであるMTHFD1(47−66)K56acは、高濃度で使用したときに、アルファLISAシグナルのほぼ5倍の増大を示した(図9Fを参照)。そのうえ、相互作用が用量応答性様式で起こり、MTHFD1−K56のアセチル化がBRD4への結合を促進したことを示唆した(図9Gを参照)。化学情報学的アプローチは、MTHFD1K56acペプチドが、アセチル化ヒストンペプチドと同程度にまたはより良好にBRD4ブロモドメインに結合すると予測した(図9Hを参照)。しかしながら、IP手順中のアセチル化MTHFD1ペプチドとHAP1細胞溶解物とのインキュベーションは、BRD4−MTHFD1相互作用を阻害することができず、相互作用の安定化が追加のドメインまたは他の因子に依存し得ることを示唆した。同様に、BRD4−MTHFD1相互作用は、BRD4((S)−JQ1)またはMTHFD1(メトトレキサート(MTX))の薬理学的阻害剤によって影響を受けなかった(図9Iを参照)。核がBRD4とMTHFD1との相互作用部位として確認されたことに関係して、発明者らは、BRD4−MTHFD1複合体が、クロマチンに結合しているか、むしろ可溶性の核内因子に状態で見出されるか否かを解明することを望んだ。細胞において、MTHFD1のK56のアセチル化がMTHFD1とBRD4との相互作用に関与したか試験するために、発明者らは、GFP−BRD4 WTと一緒に、FLAG−MTHFD1 WT、FLAG−MTHFD1(K56A)(無電荷でアセチル化状態を模倣する)、またはFLAG−MTHFD1(K56R)(変更アルギニンへの同じ残基の突然変異)のいずれかでHEK293−T細胞を同時形質移入した。MTHFD1(K56A)突然変異がBRD4との相互作用を増強したのに対して、MTHFD1(K56R)は相互作用を低減した。一貫して、彼らはまた、二重ブロモドメイン変異体GFP−BRD4 N140F/N433Fが、これらの2つの構築物がHEK293−T細胞で一緒に過剰発現されているときに、FLAG−MTHFD1への結合を大幅に低減することを示すことも照明した(図14Bを参照)。そのうえ、細胞プルダウンアッセイにおいて、すべてのBRD4アイソフォームが、完全長のMTHFD1と相互作用したが、デヒドロゲナーゼ/シクロヒドロラーゼまたはホルミルテトラヒドロ葉酸−シンターゼドメイン単独とは相互作用しなかった(図14Cを参照)。HAP1細胞からの密なDNA結合タンパク質を含むクロマチン抽出物を調製し、そしてBRD4およびMTHFD1の存在をWBによって確認した。両方のタンパク質は、クロマチン結合画分において明確に検出可能であった(図2Cを参照)。BRD4がクロマチンにMTHFD1を動員するか否か証明するために、HAP1細胞を、小分子デグロニミドdBET140およびdBET641で処理した。これらの化合物を用いた2時間の処理は、クロマチンからのBRD4のほぼ完全な除去をもたらした。これらの条件下、クロマチン結合BRD4量と相関するレベルを維持しながら、MTHFD1をクロマチンから喪失させた。そのため、これらのデータは、BRD4が、クロマチンにMTHFD1を動員する唯一の因子であることを強く示唆している。発明者らは、K562、MOLM−13、MV4−11およびMEG01細胞株をdBET6で処理したときに、類似の結果を得た(図14Dを参照)。唯一、別の代謝酵素(SHMT1)のクロマチン動員もまた、BRD4分解によって影響を受けたが、より弱い度合いであった。驚いたことに、葉酸代謝拮抗薬MTXは、クロマチン関連MTHFD1の類似の喪失を引き起こしたが、その一方で、それがBRD4レベルに影響を及ぼさなかったことが観察された。考えられる解釈は、この主要なアセチル化残基が推定上のMTX結合ポケット内にあるので、BRD4とMTHFD1−K56acとの間の結合に関する直接的な競合である可能性がある(図9Jを参照)。重要なことには、BRD4分解は、MTHFD1(またはSHMT1)の核局在化を損なわず、MTX処理でもそうであり(図2Cおよび2Dを参照)、核内への輸送それ自体が別の方法で媒介され、その一方で、BRD4との相互作用がクロマチンへのMTHFD1の動員の主な原因となることを示唆している。
MTHFD1は、BRD4結合部位の一部において規定のゲノム遺伝子座を占有する
MTHFD1のBRD4依存性クロマチン動員を特徴づけしたので、発明者らは、葉酸経路酵素のゲノム結合部位をマッピングすることを望んだ。そのため、ChIPmentation experiments17をHAP1細胞において実施した。MTHFD1が、異なったゲノム遺伝子座に結合することを見出し、ゲノムに沿って合計242個のMTHFD1ピークを観察した。MTHFD1結合部位とBRD4遺伝子座との間の重複を次に分析した。プロテオミクス実験と一致して、MTHFD1結合部位の大部分は、BRD4結合部位と重複した。MTHFD1結合部位は、BRD4ピーク付近で主に見つかった(図3Aを参照)。BRD4ピークとMTHFD1ピークとの間の共局在は、プロモーターとエンハンサー領域で主に起こり、そしてそこではまた、H3K27Acも豊富であり、転写を促進する葉酸経路酵素の基本的な役割を示唆している(図3B、12Aおよび12Bを参照)。そのうえ、MTHFD1は、わずかな量のBRD4しか存在しない遺伝子内領域でも見られる場合がある(図10A、10Bおよび10Cを参照)。この徴候は、MTHFD1が、転写過程のすべてにわたって必要とされており、その開始を促進するだけではないことを示唆する。そのうえ、遺伝子内的に蓄積したBRD4の最少量が、クロマチン上にMTHFD1を動員するために十分であり続ける。そのうえ、発明者らは、BRD4によって占有されたクロマチン遺伝子座上のMTHFD1の存在をさらに実証するために、ChIP−Seqアッセイを実施した。MTHFD1を異なったゲノム遺伝子座に結合させ、そして、結合は、dBET6を用いた処理の2時間後に喪失した(図15A、16Aおよび16Bを参照)。プロテオミクス実験と一致して、彼らは、MTHFD1結合部位の大部分は、プロモーターおよびエンハンサー領域のBRD4結合部位と重複し、そしてそこではまた、H3K27acも豊富であり(図15B、15C、15D、16Cおよび16Dを参照)、転写制御におけるMTHFD1の幅広い役割を示唆していることがわかった。発明者らはまたトランスクリプトーム分析も実施し、そして、HAP1細胞において、BRD4阻害剤、分解剤および葉酸代謝拮抗薬での処理の結果として起こる転写変化、ならびにBRD4およびMTHFD1のノックダウンの間に強い相関関係があることがわかった(図15Eおよび17Aを参照)。ChIP−Seqとトランスクリプトームデータの統合は、MTHFD1とBRD4の両方が、これらのタンパク質のいずれかのノックダウンに続いて下方制御される遺伝子のプロモーターで濃縮されることを示した(図15Fおよび17Bを参照)。最終的に、発明者らは、HAP1細胞で観察された、BET阻害剤の転写効果と葉酸代謝拮抗薬との間の強い相関関係、ならびにMTHFD1のノックダウンとBRD4との間の強い相関関係が、K−562およびA549細胞において保存され、細胞型独立性を示唆していることを示すことができた(図18Aおよび18Bを参照)。
MTHFD1のBRD4依存性クロマチン動員を特徴づけしたので、発明者らは、葉酸経路酵素のゲノム結合部位をマッピングすることを望んだ。そのため、ChIPmentation experiments17をHAP1細胞において実施した。MTHFD1が、異なったゲノム遺伝子座に結合することを見出し、ゲノムに沿って合計242個のMTHFD1ピークを観察した。MTHFD1結合部位とBRD4遺伝子座との間の重複を次に分析した。プロテオミクス実験と一致して、MTHFD1結合部位の大部分は、BRD4結合部位と重複した。MTHFD1結合部位は、BRD4ピーク付近で主に見つかった(図3Aを参照)。BRD4ピークとMTHFD1ピークとの間の共局在は、プロモーターとエンハンサー領域で主に起こり、そしてそこではまた、H3K27Acも豊富であり、転写を促進する葉酸経路酵素の基本的な役割を示唆している(図3B、12Aおよび12Bを参照)。そのうえ、MTHFD1は、わずかな量のBRD4しか存在しない遺伝子内領域でも見られる場合がある(図10A、10Bおよび10Cを参照)。この徴候は、MTHFD1が、転写過程のすべてにわたって必要とされており、その開始を促進するだけではないことを示唆する。そのうえ、遺伝子内的に蓄積したBRD4の最少量が、クロマチン上にMTHFD1を動員するために十分であり続ける。そのうえ、発明者らは、BRD4によって占有されたクロマチン遺伝子座上のMTHFD1の存在をさらに実証するために、ChIP−Seqアッセイを実施した。MTHFD1を異なったゲノム遺伝子座に結合させ、そして、結合は、dBET6を用いた処理の2時間後に喪失した(図15A、16Aおよび16Bを参照)。プロテオミクス実験と一致して、彼らは、MTHFD1結合部位の大部分は、プロモーターおよびエンハンサー領域のBRD4結合部位と重複し、そしてそこではまた、H3K27acも豊富であり(図15B、15C、15D、16Cおよび16Dを参照)、転写制御におけるMTHFD1の幅広い役割を示唆していることがわかった。発明者らはまたトランスクリプトーム分析も実施し、そして、HAP1細胞において、BRD4阻害剤、分解剤および葉酸代謝拮抗薬での処理の結果として起こる転写変化、ならびにBRD4およびMTHFD1のノックダウンの間に強い相関関係があることがわかった(図15Eおよび17Aを参照)。ChIP−Seqとトランスクリプトームデータの統合は、MTHFD1とBRD4の両方が、これらのタンパク質のいずれかのノックダウンに続いて下方制御される遺伝子のプロモーターで濃縮されることを示した(図15Fおよび17Bを参照)。最終的に、発明者らは、HAP1細胞で観察された、BET阻害剤の転写効果と葉酸代謝拮抗薬との間の強い相関関係、ならびにMTHFD1のノックダウンとBRD4との間の強い相関関係が、K−562およびA549細胞において保存され、細胞型独立性を示唆していることを示すことができた(図18Aおよび18Bを参照)。
MTHFD1およびBRD4は、核内代謝産物組成を制御する
MTHFD1は、葉酸代謝における3つの酵素反応を触媒するC−1−テトラヒドロ葉酸シンターゼであり、テトラヒドロ葉酸(THF)と10−ホルミルテトラヒドロ葉酸(10−CHO−THF)と5,10−メテニルテトラヒドロ葉酸(5,10−CH=THF)と5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸(5,10−CH2−THF)の相互変換をもたらす。これらの葉酸は、一炭素代謝の重要中間体であり、プリン、ピリミジンおよびメチオニンの生合成のために活性化C1基を提供する。3種類のC1代謝生成物のすべてが、転写調節に貢献する可能性を有する。ピリミジンとプリンは核酸塩基に組み込まれ、そしてそれは、順にヌクレオチドに変換され、そしてそれは、複製機構および転写機構の基質になる。メチオニン代謝は、すべてのヒストンおよびDNA−メチルトランスフェラーゼのメチルドナーであるS−アデノシル−メチオニン(SAM)の生成をもたらす。C1代謝生成物の三つの主要なクラスであるプリン、ピリミジンおよびメチオニンの生合成は、哺乳動物細胞の細胞質とミトコンドリアの中で起こると考えられている。全生合成経路が核内で起こるか否かを試験するために、クロマチン関連タンパク質画分を、代謝酵素に関して分析した。チミジル酸シンターゼとプリン生合成経路のいくつかの酵素(GART、PAICS、ATIC)の両方が、HAP1細胞においてクロマチンに結合することがわかった(図4A型を参照)。対照的に、メチオニンとSAM代謝における酵素のいずれも検出されなかった。これらのデータは、潜在的に、プリンおよびピリミジン合成の全体もまた、クロマチン環境下で起こることを示唆する。発明者らは、K−562細胞株でも同じ実験を実施し、クロマチン画分におけるピリミジンおよびプリン生合成経路の酵素の存在を確認した(図19Aおよび20を参照)。そのため、発明者らは、BRD4またはMTHFD1の阻害が核内代謝産物組成を変更するか否か質問した。この目的のために、彼らは、BRD4またはMTHFD1のいずれかをノックダウンし、核を単離し、そして、非標的化対照ヘアピンに対して、標的化代謝学的アプローチでそれらの組成を分析した(図12Aを参照)。合計で2851種類の代謝産物を検出し、そのうち459種類が条件のうちの1つで有意に変化した(図4B、12Bおよび12Cを参照)。興味深いことに、驚くべき相関関係が、BRD4およびMTHFD1ノックダウン条件下の核内メタボロームの間で観察された(図4Cを参照;相関係数0.7)。相関関係は、核内葉酸代謝産物における分析に注目したとき、大幅に増大した(図4Dを参照、相関係数0.9)。興味深いことに、これらの代謝産物の間で、10−CHO−THFおよび5,10−CH2−THF(共にMTHFD1の直接的な産物)のレベルがMTHFD1およびBRD4ノックダウンにおいて同様に低減した。加えて、プリンおよびピリミジン代謝産物で有意な変化を検出したが、メチオニン誘導体では検出しなかった。両方のノックダウンによって、スクシニルアデノシン、N3−ヒドロキシエチルシトシンおよびチオグアノシン−5’−ジスルファートが低減したが、その一方で、イノシン、シトシン、アデノシン、AMP、CMP、ADP、イソペンテニルアデノシンのレベルは大きく増強された。これらの変化の一部は、shRNA実験における長い処理期間による代償であろう。さらに、発明者らは、BET阻害剤およびMTXが、他の細胞毒性化合物で観察されなかった核内葉酸プールに特異的な高度に相関性がある特徴的な変化を引き起こしたことを示した(図19Bを参照)。全体としては、葉酸生合成およびBRD4の阻害に関する一般的な核内代謝産物の特徴が明らかになった。
MTHFD1は、葉酸代謝における3つの酵素反応を触媒するC−1−テトラヒドロ葉酸シンターゼであり、テトラヒドロ葉酸(THF)と10−ホルミルテトラヒドロ葉酸(10−CHO−THF)と5,10−メテニルテトラヒドロ葉酸(5,10−CH=THF)と5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸(5,10−CH2−THF)の相互変換をもたらす。これらの葉酸は、一炭素代謝の重要中間体であり、プリン、ピリミジンおよびメチオニンの生合成のために活性化C1基を提供する。3種類のC1代謝生成物のすべてが、転写調節に貢献する可能性を有する。ピリミジンとプリンは核酸塩基に組み込まれ、そしてそれは、順にヌクレオチドに変換され、そしてそれは、複製機構および転写機構の基質になる。メチオニン代謝は、すべてのヒストンおよびDNA−メチルトランスフェラーゼのメチルドナーであるS−アデノシル−メチオニン(SAM)の生成をもたらす。C1代謝生成物の三つの主要なクラスであるプリン、ピリミジンおよびメチオニンの生合成は、哺乳動物細胞の細胞質とミトコンドリアの中で起こると考えられている。全生合成経路が核内で起こるか否かを試験するために、クロマチン関連タンパク質画分を、代謝酵素に関して分析した。チミジル酸シンターゼとプリン生合成経路のいくつかの酵素(GART、PAICS、ATIC)の両方が、HAP1細胞においてクロマチンに結合することがわかった(図4A型を参照)。対照的に、メチオニンとSAM代謝における酵素のいずれも検出されなかった。これらのデータは、潜在的に、プリンおよびピリミジン合成の全体もまた、クロマチン環境下で起こることを示唆する。発明者らは、K−562細胞株でも同じ実験を実施し、クロマチン画分におけるピリミジンおよびプリン生合成経路の酵素の存在を確認した(図19Aおよび20を参照)。そのため、発明者らは、BRD4またはMTHFD1の阻害が核内代謝産物組成を変更するか否か質問した。この目的のために、彼らは、BRD4またはMTHFD1のいずれかをノックダウンし、核を単離し、そして、非標的化対照ヘアピンに対して、標的化代謝学的アプローチでそれらの組成を分析した(図12Aを参照)。合計で2851種類の代謝産物を検出し、そのうち459種類が条件のうちの1つで有意に変化した(図4B、12Bおよび12Cを参照)。興味深いことに、驚くべき相関関係が、BRD4およびMTHFD1ノックダウン条件下の核内メタボロームの間で観察された(図4Cを参照;相関係数0.7)。相関関係は、核内葉酸代謝産物における分析に注目したとき、大幅に増大した(図4Dを参照、相関係数0.9)。興味深いことに、これらの代謝産物の間で、10−CHO−THFおよび5,10−CH2−THF(共にMTHFD1の直接的な産物)のレベルがMTHFD1およびBRD4ノックダウンにおいて同様に低減した。加えて、プリンおよびピリミジン代謝産物で有意な変化を検出したが、メチオニン誘導体では検出しなかった。両方のノックダウンによって、スクシニルアデノシン、N3−ヒドロキシエチルシトシンおよびチオグアノシン−5’−ジスルファートが低減したが、その一方で、イノシン、シトシン、アデノシン、AMP、CMP、ADP、イソペンテニルアデノシンのレベルは大きく増強された。これらの変化の一部は、shRNA実験における長い処理期間による代償であろう。さらに、発明者らは、BET阻害剤およびMTXが、他の細胞毒性化合物で観察されなかった核内葉酸プールに特異的な高度に相関性がある特徴的な変化を引き起こしたことを示した(図19Bを参照)。全体としては、葉酸生合成およびBRD4の阻害に関する一般的な核内代謝産物の特徴が明らかになった。
BRD4阻害剤は、さまざまな癌細胞株において葉酸代謝拮抗薬との相乗効果をもたらす
MTHFD1およびBRD4の喪失の結果として起こる核内代謝産物組成の類似性に基づいて、葉酸代謝拮抗薬が、癌細胞においてBRD4阻害剤との相乗効果をもたらすであろうと推測した。この仮説を試験するために、BRD4阻害に対して応答性でないと記載された4種類の細胞株に加え、実験に日常的に使用されるKBM7およびHAP1を含めた6種類の細胞株のパネルを選択した(図13Aおよび13Bを参照)。用量反応曲線は、(S)−JQ1処理に対するこれらの細胞株の低い感受性およびMTXに対する中程度〜低い感受性、NOMO−1が最も感受性であることを確認した。両方の単独処理に対する低い反応性にもかかわらず、両剤の組み合わせは、少しも単剤活性のない濃度にて、試験した6種類の細胞株すべてで効果的に細胞生存率を低減した(図5Aを参照)。示差的値の計算(Bliss検定42)は、2つの処理の間の強い度合いの相乗作用を示し、細胞生存のために核内葉酸代謝産物濃度の決定的な役割に関する仮説を実証した。可能性があるMTXの的外れな効果を除外するために、発明者らは、最も強い薬物相乗作用を示す細胞株、A549を、MTHFD1のshRNAで処理し、そして、(S)−JQ1に対する増強された感受性を実証した(図21Aを参照)。次いで、彼らは、BETブロモドメイン阻害剤を、一般毒性を発揮することなく癌細胞増殖を特異的に阻害するために、インビボにおいて葉酸代謝拮抗薬と組み合わせることができることを証明した。発明者らが、A549異種移植マウスモデル35を、MTXおよび(S)−JQ1単独で、ならびに組み合わせて処理したとき、腫瘍増殖は、個々の化合物のいずれかによって低減することはなかったが、2種類の阻害剤を一緒に与えたときに、食い止められた(図21B、21Cおよび21Dを参照)。最終的に、2種類のレポーター細胞株、REDS1およびREDS3を使用することで、クロマチンの再配列のレベルにおいても同様に、相乗作用が示された。実際には、Rednessは、3日間のMTX処理後に、わずかに増強されただけであったが(図13Cを参照)、MTXおよび(S)−JQ1同時処理は、(S)−JQ1単独によって与えられた基礎Rednessシグナルを著しく増幅した(図5Bを参照)。この最後の徴候は、クロマチン再配列過程が、BRD4およびMTHFD1を一緒に阻害するときに、高められることができ、そして、後成的遺伝子調節における葉酸代謝産物の基本的な役割を際立たせることが明確に示された。
MTHFD1およびBRD4の喪失の結果として起こる核内代謝産物組成の類似性に基づいて、葉酸代謝拮抗薬が、癌細胞においてBRD4阻害剤との相乗効果をもたらすであろうと推測した。この仮説を試験するために、BRD4阻害に対して応答性でないと記載された4種類の細胞株に加え、実験に日常的に使用されるKBM7およびHAP1を含めた6種類の細胞株のパネルを選択した(図13Aおよび13Bを参照)。用量反応曲線は、(S)−JQ1処理に対するこれらの細胞株の低い感受性およびMTXに対する中程度〜低い感受性、NOMO−1が最も感受性であることを確認した。両方の単独処理に対する低い反応性にもかかわらず、両剤の組み合わせは、少しも単剤活性のない濃度にて、試験した6種類の細胞株すべてで効果的に細胞生存率を低減した(図5Aを参照)。示差的値の計算(Bliss検定42)は、2つの処理の間の強い度合いの相乗作用を示し、細胞生存のために核内葉酸代謝産物濃度の決定的な役割に関する仮説を実証した。可能性があるMTXの的外れな効果を除外するために、発明者らは、最も強い薬物相乗作用を示す細胞株、A549を、MTHFD1のshRNAで処理し、そして、(S)−JQ1に対する増強された感受性を実証した(図21Aを参照)。次いで、彼らは、BETブロモドメイン阻害剤を、一般毒性を発揮することなく癌細胞増殖を特異的に阻害するために、インビボにおいて葉酸代謝拮抗薬と組み合わせることができることを証明した。発明者らが、A549異種移植マウスモデル35を、MTXおよび(S)−JQ1単独で、ならびに組み合わせて処理したとき、腫瘍増殖は、個々の化合物のいずれかによって低減することはなかったが、2種類の阻害剤を一緒に与えたときに、食い止められた(図21B、21Cおよび21Dを参照)。最終的に、2種類のレポーター細胞株、REDS1およびREDS3を使用することで、クロマチンの再配列のレベルにおいても同様に、相乗作用が示された。実際には、Rednessは、3日間のMTX処理後に、わずかに増強されただけであったが(図13Cを参照)、MTXおよび(S)−JQ1同時処理は、(S)−JQ1単独によって与えられた基礎Rednessシグナルを著しく増幅した(図5Bを参照)。この最後の徴候は、クロマチン再配列過程が、BRD4およびMTHFD1を一緒に阻害するときに、高められることができ、そして、後成的遺伝子調節における葉酸代謝産物の基本的な役割を際立たせることが明確に示された。
参考文献
Claims (45)
- 癌の治療または予防において使用するためのBRD4阻害剤であって、前記BDR4阻害剤が葉酸代謝拮抗薬と組み合わせて投与される、前記BRD4阻害剤。
- 癌の治療または予防において使用するための葉酸代謝拮抗薬であって、BRD4阻害剤と組み合わせて投与される、前記葉酸代謝拮抗薬。
- 癌の治療または予防において使用するためのBRD4阻害剤と葉酸代謝拮抗薬との組み合わせ物。
- BRD4阻害剤、葉酸代謝拮抗薬、および医薬的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物。
- 癌の治療または予防において使用するための、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記癌がBRD4阻害剤抵抗性癌である、請求項1に記載の使用のためのBRD4阻害剤、請求項2に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項3に記載の使用のための組み合わせ物または請求項5に記載の使用のための医薬組成物。
- BRD4阻害剤を用いた治療に対して、BRD4阻害剤抵抗性癌を再感受性化する際の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
- 前記癌が、前立腺癌、乳癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、膀胱癌、頭頚部癌、神経膠芽腫、中皮腫、骨肉腫、絨毛癌、およびNUT正中線癌腫から選択される、請求項1または6に記載の使用のためのBRD4阻害剤、請求項2または6に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項3または6に記載の使用のための組み合わせ物、請求項5または6に記載の使用のための医薬組成物、あるいは請求項7に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
- 前記BRD4阻害剤が、(S)−JQ1、CeMMEC2、I−BET151、I−BET762、PF−1、ブロモスポリン、OTX−015、TEN−010、CPI−203、CPI−0610、RVX−208、BI2536、TG101348、LY294002、またはこれらの剤のうちのいずれかの医薬的に許容され得る塩もしくは溶媒和物である、請求項1、6または8に記載の使用のためのBRD4阻害剤、請求項2、6または8に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項3、6または8に記載の使用のための組み合わせ物、請求項4に記載の医薬組成物、請求項5、6または8に記載の使用のための医薬組成物、あるいは請求項7または8に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
- 前記BRD4阻害剤が(S)−JQ1である、請求項9に記載の使用のためのBRD4阻害剤、請求項9に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項9に記載の使用のための組み合わせ物、請求項9に記載の医薬組成物、請求項9に記載の使用のための医薬組成物、あるいは請求項9に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
- 前記葉酸代謝拮抗薬がMTHFD1阻害剤である、請求項1、6および8〜10のいずれか一項に記載の使用のためのBRD4阻害剤、請求項2、6および8〜10のいずれか一項に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項3、6および8〜10のいずれか一項に記載の使用のための組み合わせ物、請求項4、9または10のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項5、6および8〜10のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物、あるいは請求項7〜10のいずれか一項に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
- 前記葉酸代謝拮抗薬が、メトトレキサート、ペメトレキセド、トリメトレキサート、エドトレキサート、レメトレキソール、5−フルオロウラシル、プララトレキサート、アミノプテリン、またはこれらの剤のうちのいずれかの医薬的に許容され得る塩もしくは溶媒和物である、請求項1、6および8〜11のいずれか一項に記載の使用のためのBRD4阻害剤、請求項2、6および8〜11のいずれか一項に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項3、6および8〜11のいずれか一項に記載の使用のための組み合わせ物、請求項4および9〜11のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項5、6および8〜11のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物、または請求項7〜11のいずれか一項に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
- 前記葉酸代謝拮抗薬が、メトトレキサート、医薬的に許容され得るその塩または溶媒和物である、請求項12に記載の使用のためのBRD4阻害剤、請求項12に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項12に記載の使用のための組み合わせ物、請求項12に記載の医薬組成物、請求項12に記載の使用のための医薬組成物または請求項12に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
- 前記BRD4阻害剤が(S)−JQ1であり、かつ、前記葉酸代謝拮抗薬が、メトトレキサート、医薬的に許容されその得る塩または溶媒和物である、請求項1、6または8に記載の使用のためのBRD4阻害剤、請求項2、6または8に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項3、6または8に記載の使用のための組み合わせ物、請求項4に記載の医薬組成物、請求項5、6または8に記載の使用のための医薬組成物、あるいは請求項7または8に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
- BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法であって(ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる)、該対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルおよび/またはMTHFD1の発現レベルを測定することを含む方法。
- BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法であって(ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる)、該対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルおよび/またはMTHFD1の発現レベルを測定するステップを含む方法(ここで、該対象からのサンプル中の核内葉酸のより低いレベルおよび/またはMTHFD1のより低い発現レベルは、その対象がBRD4阻害剤を用いた治療により感受性またはより応答性であることを示唆する)。
- BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法であって(ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる)、該対象から得られたサンプルの核内葉酸レベルを測定するステップを含む方法(ここで、該対象からのサンプル中の核内葉酸のより低いレベルは、BRD4阻害剤を用いた治療に対してその対象がより感受性であるかまたはより応答性であることを示唆する)。
- BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法であって(ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる)、該対象から得られたサンプルにおいてMTHFD1の発現レベルを測定するステップを含む方法(ここで、該対象からのサンプルにおけるMTHFD1のより低い発現レベルは、BRD4阻害剤を用いた治療に対してその対象がより感受性またはより応答性であることを示唆する)。
- 前記癌が、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、頭頚部癌、神経膠芽腫、中皮腫、骨肉腫、絨毛癌、およびNUT正中線癌腫から選択される、請求項15〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが癌組織生検サンプルである、請求項15〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、および多発性骨髄腫から選択される、請求項15〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが血液サンプルである、請求項21に記載の方法。
- 前記MTHFD1の発現レベルが、MTHFD1の翻訳レベルを測定することによって測定され、ここで、該翻訳レベルが、好ましくは、抗体ベースのアッセイ、質量分析法、ゲルベースのもしくはブロットベースのアッセイ、またはフローサイトメトリーを使用するか、より好ましくは、免疫組織化学法、酵素結合免疫吸着アッセイ、または放射免疫アッセイを使用して測定される、請求項15、16または18、あるいはそれらの従属請求項19〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記MTHFD1の発現レベルが、核内MTHFD1タンパク質のレベルを測定することによって測定され、ここで、該核内MTHFD1タンパク質のレベルが、好ましくは、抗体ベースのアッセイを使用するか、より好ましくは、蛍光抗体法または免疫組織化学法を使用して測定される、請求項15、16または18、あるいはそれらの従属請求項19〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記MTHFD1の発現レベルが、MTHFD1の転写レベルを測定することによって測定され、ここで、該転写レベルが、好ましくは、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応またはマイクロアレイを使用して測定される、請求項15、16または18、あるいはそれらの従属請求項19〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項15〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 対象における癌治療の際の使用のためのBRD4阻害剤であって、ここで、該対象が、BRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると、請求項15〜26のいずれか一項に記載の方法により同定される、BRD4阻害剤。
- BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法における、遺伝子MTHFD1の転写産物のための1組のプライマーの使用であって、ここで、該対象が、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる、使用。
- BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法における、遺伝子MTHFD1の転写産物のための核酸プローブの使用であって、ここで、該対象が、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる、使用。
- BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法における、遺伝子MTHFD1の転写産物のための核酸プローブを含むマイクロアレイの使用であって、ここで、該対象が、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる、使用。
- BRD4阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法における、タンパク質MTHFD1に対する抗体の使用であって、ここで、該対象が、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる、使用。
- 前記のBRD4阻害剤を用いた治療に対象の感受性または応答性を評価する方法が、請求項15、16または18、あるいはそれらの従属請求項19〜26のいずれか一項に記載の方法である、請求項28〜31のいずれか一項に記載の使用。
- 癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのBRD4阻害剤であって、該方法が:
−該対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルおよび/またはMTHFD1の発現レベルを測定し;
−該対象が、BRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低いレベルの核内葉酸および/またはより低い発現レベルのMTHFD1は、その対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であることを示唆し;そして
−該対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にBRD4阻害剤を投与すること、
を含む、BRD4阻害剤。 - 癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのBRD4阻害剤であって、該方法が:
−該対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルを測定し;
−該対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低いレベルの核内葉酸は、その対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であるを示唆し;そして
−該対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にBRD4阻害剤を投与すること、
を含む、BRD4阻害剤。 - 癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのBRD4阻害剤であって、該方法が:
−該対象から得られたサンプルにおいてMTHFD1の発現レベルを測定し;
−該対象が、BRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低い発現レベルのMTHFD1は、その対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であることを示唆し;そして
−該対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にBRD4阻害剤を投与すること、
を含む、BRD4阻害剤。 - 癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのBRD4阻害剤であって、該方法が:
−該対象から得られたサンプル中の核内MTHFD1タンパク質レベルを測定し;
−該対象が、BRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低いレベルの核内MTHFD1タンパク質は、その対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であることを示唆し;そして
−該対象がBRD4阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にBRD4阻害剤を投与すること、
を含む、BRD4阻害剤。 - 前記癌が、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、頭頚部癌、神経膠芽腫、中皮腫、骨肉腫、絨毛癌、およびNUT正中線癌腫から選択される、請求項33〜36のいずれか一項に記載の使用のためのBRD4阻害剤。
- 前記サンプルが癌組織生検サンプルである、請求項33〜37のいずれか一項に記載の使用のためのBRD4阻害剤。
- 前記癌が、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、および多発性骨髄腫から選択される、請求項33〜36のいずれか一項に記載の使用のためのBRD4阻害剤。
- 前記サンプルが血液サンプルである、請求項39に記載の使用のためのBRD4阻害剤。
- 前記MTHFD1の発現レベルが、MTHFD1の翻訳レベルを測定することによって測定され、ここで、該翻訳レベルが、好ましくは、抗体ベースのアッセイ、質量分析法、ゲルベースのもしくはブロットベースのアッセイ、またはフローサイトメトリーを使用するか、より好ましくは、免疫組織化学法、酵素結合免疫吸着アッセイ、または放射免疫アッセイを使用して測定される、請求項33または35、あるいはそれらの従属請求項37〜40のいずれか一項に記載の使用のためのBRD4阻害剤。
- 前記MTHFD1の発現レベルが、MTHFD1の転写レベルを測定することによって測定され、ここで、該転写レベルが、好ましくは、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応またはマイクロアレイを使用して測定される、請求項33または35、あるいはそれらの従属請求項37〜40のいずれか一項に記載の使用のためのBRD4阻害剤。
- 前記MTHFD1の発現レベルが、核内MTHFD1タンパク質のレベルを測定することによって測定され、ここで、該核内MTHFD1タンパク質のレベルが、好ましくは、抗体ベースのアッセイを使用するか、より好ましくは、蛍光抗体法または免疫組織化学法を使用して測定される、請求項33または35、あるいはそれらの従属請求項37〜40のいずれか一項に記載の使用のためのBRD4阻害剤。
- 前記対象がヒトである、請求項133〜43のいずれか一項に記載の使用のためのBRD4阻害剤。
- 前記BRD4阻害剤が、(S)−JQ1、CeMMEC2、I−BET151、I−BET762、PF−1、ブロモスポリン、OTX−015、TEN−010、CPI−203、CPI−0610、RVX−208、BI2536、TG101348、LY294002、またはこれらの剤のうちのいずれかの医薬的に許容され得る塩もしくは溶媒和物である、請求項15〜26のいずれか一項に記載の方法、請求項27に記載の使用のためのBRD4阻害剤、請求項28〜32のいずれか一項に記載の使用、または請求項33〜44のいずれか一項に記載の使用のためのBRD4阻害剤。
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