KR102078946B1

KR102078946B1 - Notch 경로 신호전달 억제제 화합물

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Publication number: KR102078946B1
Application number: KR1020187000149A
Authority: KR
Inventors: 줄리아 마리아 클레이; 앨버트 엣지; 필립 아서 힙스카인드; 존 씨. 길; 바빈 쿠마 파텔; 헬무쓰 헨드리쿠스 게라두스 반 에스; 애론 디. 우로블레스키; 가잉 차오
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니; 오디온 테라퓨틱스
Priority date: 2015-07-07
Filing date: 2016-07-01
Publication date: 2020-02-19
Also published as: JO3491B1; UA120539C2; TN2017000495A1; LT3319967T; EA201792478A1; ME03495B; JP6571214B2; ZA201707858B; KR20180011314A; PE20180412A1; MY197519A; EA032634B1; CL2018000007A1; HUE044666T2; CR20170598A; DK3319967T3; RS59115B1; WO2017007702A1; TW201712016A; PT3319967T

Abstract

본 발명은 명명된 암, 청각 유모 세포 손실에 의해 유발된 감각신경성 청각 상실의 치료, 및 청각 유모 세포 생성의 유도를 위한 Notch 경로 신호전달 억제제로서 유용한 하기 화합물:

또는 그의 제약상 허용되는 염 및 상기 화합물을 함유하는 제약 조성물을 제공한다.

Description

NOTCH 경로 신호전달 억제제 화합물

노화, 소음에의 노출, 화학적 작용제에의 노출, 약물, 질환, 및 유전 장애를 통한 내이에서의 감각 유모 세포의 손실은 매년 많은 사람들에서 청각 장애를 유발한다. 병인과 상관없이, 와우의 코르티 기관 내에 위치한 기계감각 유모 세포의 사멸 또는 기능장애는 감각신경성 청각 상실 (SNHL)의 주요 원인이다. 청각 상실을 억제하는 예방적 조치는 주로 말초 보호, 예컨대 귀마개 또는 소음 감소 또는 상쇄 헤드폰으로 제한된다. SNHL을 위한 현행 치료는 주로 보청기를 사용하는 전자 기술 예컨대 소리의 증폭 또는 인공 와우를 사용하여 생존한 나선 신경절 뉴런의 전기 자극을 통해 유모 세포를 우회하는 것에 기반한다. 전신 요법 또는 고실내 요법을 제공하는 스테로이드 투여가 또한 갑작스러운 감각신경성 청각 상실을 위해 제안된 바 있다.

와우 감각 상피는 유모 세포의 정단 표면에서의 부동섬모에 의해 전기 임펄스로 전달되고 제VIII 뇌 신경을 통해 뇌로 전송되는 소리 진동의 검출에 적합한 유모 세포를 함유한다. 발생 동안에 생성된 청각 유모 세포는 유사분열후이고 손실 후 또는 포유동물에서의 정상 세포 전환의 일부로서 대체되지 않는다. 그 결과, 청각 유모 세포 손실로 인한 SNHL은 비가역적이다. 배아 기간 동안의 청각 유모 세포 발생은 전구감각 상피 세포가 Notch 신호전달에 의해 매개되는 측면 억제의 과정을 통해 유모 세포 또는 지지 세포인 상이한 운명을 획득하는 분화를 포함한다. 전구감각 상피 세포는 인접한 유모 세포 상의 리간드에 의해 자극되는 활성 Notch 신호전달에 의해 유모 세포로 분화하는 것이 방지된다. 이들 세포는 지지 세포가 된다.

Notch 신호전달은 포유동물에서의 발생 및 조직 항상성에서 필수적인 역할을 하는 진화적으로 보존된 경로이다. Notch 수용체 및 리간드는 단일-통과 막횡단 도메인을 함유하고, 세포 표면 상에서 발현되고, 이러한 이유로, Notch 신호전달은 수용체 및 리간드를 발현하는 인접한 세포 사이의 소통을 매개하는 데 특히 중요하다. Notch 1 내지 Notch 4로 칭해지는, 설치류 및 인간에서 발견되는 4종의 공지된 Notch 수용체가 있다. Notch 수용체는 초기에 단일 폴리펩티드로서 합성된 세포외 및 세포내 도메인으로 구성된 이종이량체 단백질이다. 수용체-리간드 상호작용은 γ-세크레타제 활성이 수반되는 Notch 수용체 폴리펩티드의 일련의 단백질분해적 절단을 촉발한다. γ-세크레타제 활성은 형질 막의 내측으로부터 Notch 세포내 도메인을 절단하며 이는 핵으로 전위하여 전사 인자 복합체를 형성한다. Notch 세포내 도메인 (NICD)은 단백질의 활성 형태이다. 다양한 Notch 신호전달 기능은 증식, 분화, 아폽토시스, 혈관신생, 이동 및 자가재생을 포함한다. 정상 조직의 발생 및 유지 동안의 Notch 신호전달의 이 다양한 역할은 암의 상이한 형태에서 비정상적으로 활성화될 수 있다. Notch 신호전달의 종양원성 기능은 아폽토시스의 억제 및 세포 증식의 촉진을 포함한다.

γ-세크레타제는 Notch 활성화 캐스케이드에서 중추적 역할을 한다. 그 결과, γ-세크레타제의 억제제가 암의 치료를 위해 Notch 수용체 활성화를 차단하는 그의 잠재력에 대해 활발하게 조사되어 왔다. 임상 시험이 계속되지만 상업용 Notch 억제제 화학요법 약물은 나타나지 않았다.

Notch 신호전달 경로를 통한 γ-세크레타제는 또한 전구감각 세포 분화에 중추적 역할을 한다. 그 결과, γ-세크레타제의 억제제가 SNHL의 치료를 위해 Notch 수용체 활성화를 차단하는 그의 잠재력에 대해 활발하게 조사되어 왔다. 체순환 내로의 진입을 위한 다양한 방법론에 의해 Notch 억제제를 투여하여 어토널 호몰로그(atonal homolog 1) (Atoh1 또는 Math1) 발현을 비정상적으로 상승된 수준에서 및 연장된 기간 동안 유도하기 보다는, Atoh1 발현을 와우 환경에서, 보다 표적화된 발현 수준 및 기간에서 유도하는 것이 유용하고 바람직할 것이다. Atoh1을 조정하는 불능은 청각 유모 세포 및 청각 유모 세포 재생을 위한 치료제의 개발에서의 연구에 대한 장애물로 남아있다. 연구가 계속되지만 (예컨대 WO 2014/039781), 청각 유모 세포 손실에 의해 유발된 감각신경성 청각 상실을 치료하기 위한 상업용 Notch 억제제는 나타나지 않았다.

Notch 경로 신호전달 억제 활성을 갖는 화합물을 찾을 필요가 있다. γ-세크레타제 억제 활성에 의해 Notch 경로 신호전달을 억제하는 화합물을 찾을 추가의 필요가 있다. 또한 Notch 경로 신호전달 및 γ-세크레타제 억제 활성에 기여할 수 있는 뚜렷한 구조적 특색을 보유하는 화합물을 찾을 필요가 있다. 추가의 필요는 Notch 경로 신호전달을 억제함으로써 Atoh1 발현을 유도하는 화합물을 찾는 것이다. 바람직한 흡수, 분포, 대사 및 배설 특성을 입증하는 화합물을 찾을 추가의 필요가 있다.

본 발명의 한 측면은 4,4,4-트리플루오로-N-((2S)-1-((9-메톡시-3,3-디메틸-5-옥소-2,3,5,6-테트라히드로-1H-벤조[f]피롤로[1,2-a]아제핀-6-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)부탄아미드인 하기 구조:

화합물 1

의 화합물, 또는 그의 실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수한 이성질체 또는 상기 임의의 것의 제약상 허용되는 염을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 측면은 N-((2S)-1-((8,8-디메틸-6-옥소-6,8,9,10-테트라히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-5-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-4,4,4-트리플루오로부탄아미드인 하기 구조:

화합물 2

의 화합물, 또는 그의 실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수한 이성질체 또는 상기 임의의 것의 제약상 허용되는 염이다.

본 발명의 또 다른 측면은 화합물 1, 또는 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체; 또는 화합물 2, 또는 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체; 또는 상기 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 T-세포 급성 림프모구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 적백혈병, 삼중 음성 유방암, 유방암, 난소암, 흑색종, 폐암, 비소세포 폐암, 췌장암, 교모세포종, 결장직장암, 두경부암, 자궁경부암, 전립선암, 간암, 경구 편평 세포 암종, 피부암, 수모세포종, 혈관육종, 횡문근육종, 지방육종, 악성 섬유성 조직구종, 간세포성 암종, 간내 및 간외 담관암종, 및 선양 낭성 암종인 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 상기 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가 측면은 폐암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 폐암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 청각 유모 세포 손실에 의해 유발된 감각신경성 청각 상실의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 청각 유모 세포 손실에 의해 유발된 감각신경성 청각 상실을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가 측면은 청각 유모 세포 생성의 유도를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 청각 유모 세포 생성을 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 요법에 사용하기 위한 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가 측면은 T-세포 급성 림프모구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 적백혈병, 삼중 음성 유방암, 유방암, 난소암, 흑색종, 폐암, 비소세포 폐암, 췌장암, 교모세포종, 결장직장암, 두경부암, 자궁경부암, 전립선암, 간암, 경구 편평 세포 암종, 피부암, 수모세포종, 혈관육종, 횡문근육종, 지방육종, 악성 섬유성 조직구종, 간세포성 암종, 간내 또는 간외 담관암종, 또는 선양 낭성 암종의 치료에 사용하기 위한 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가 측면은 폐암의 치료에 사용하기 위한 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가 측면은 청각 유모 세포 손실에 의해 유발된 감각신경성 청각 상실의 치료에 사용하기 위한 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가 측면은 청각 유모 세포 생성을 유도하는 데 사용하기 위한 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 T-세포 급성 림프모구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 적백혈병, 삼중 음성 유방암, 유방암, 난소암, 흑색종, 폐암, 비소세포 폐암, 췌장암, 교모세포종, 결장직장암, 두경부암, 자궁경부암, 전립선암, 간암, 경구 편평 세포 암종, 피부암, 수모세포종, 혈관육종, 횡문근육종, 지방육종, 악성 섬유성 조직구종, 간세포성 암종, 간내 또는 간외 담관암종, 또는 선양 낭성 암종의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가 측면은 폐암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 청각 유모 세포 손실에 의해 유발된 감각신경성 청각 상실의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가 측면은 청각 유모 세포 생성을 유도하기 위한 의약의 제조를 위한 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가 측면은 반려견 동물에게 치료 유효량의 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 반려견 동물에서 청각 유모 세포 손실에 의해 유발된 감각신경성 청각 상실을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 청각 유모 세포 생성의 유도를 필요로 하는 반려견 동물에게 치료 유효량의 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 반려견 동물에서 청각 유모 세포 생성을 유도하는 방법을 제공한다.

어구 "화합물 1, 그의 부분입체이성질체"는 4,4,4-트리플루오로-N-((2S)-1-((9-메톡시-3,3-디메틸-5-옥소-2,3,5,6-테트라히드로-1H-벤조[f]피롤로[1,2-a]아제핀-6-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)부탄아미드; 또는 부분입체이성질체 4,4,4-트리플루오로-N-((S)-1-(((S)-9-메톡시-3,3-디메틸-5-옥소-2,3,5,6-테트라히드로-1H-벤조[f]피롤로[1,2-a]아제핀-6-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)부탄아미드 또는 4,4,4-트리플루오로-N-((S)-1-(((R)-9-메톡시-3,3-디메틸-5-옥소-2,3,5,6-테트라히드로-1H-벤조[f]피롤로[1,2-a]아제핀-6-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)부탄아미드를 의미한다. 유사하게, 어구 "화합물 2, 그의 부분입체이성질체"는 N-((2S)-1-((8,8-디메틸-6-옥소-6,8,9,10-테트라히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-5-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-4,4,4-트리플루오로부탄아미드; 또는 부분입체이성질체 N-((S)-1-(((S)-8,8-디메틸-6-옥소-6,8,9,10-테트라히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-5-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-4,4,4-트리플루오로부탄아미드 또는 N-((S)-1-(((R)-8,8-디메틸-6-옥소-6,8,9,10-테트라히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-5-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-4,4,4-트리플루오로부탄아미드를 의미한다.

용어 "환자"는 포유동물을 의미하고 "포유동물"은 출생후 기간 후의 인간을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 인간에서의 출생후 기간은 출산 후 즉시 시작하고 30일 동안 연장된 기간이다.

"치료 유효량" 또는 "유효량"은 암 환자에서 Notch 신호전달을 억제하고, 환자에서 표적 암 세포를 파괴하거나 또는 암의 진행을 저속화시키거나 또는 정지시키는 데 필요한, 화합물 1, 이성질체 1 또는 이성질체 2인 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 이성질체 1 또는 이성질체 2인 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 상기 임의의 것을 함유하는 제약 조성물의 투여량을 의미한다. 유사하게, "치료 유효량" 또는 "유효량"은 청각 유모 세포 손실 또는 손상에 의해 유발된 감각신경성 청각 상실 환자에서 Notch 신호전달을 억제하거나, 또는 청각 유모 세포 생성을 유도하는 데 필요한, 화합물 1, 이성질체 1 또는 이성질체 2인 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 이성질체 1 또는 이성질체 2인 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 유효한 염, 또는 상기 임의의 것을 함유하는 제약 조성물의 투여량을 의미한다.

"화합물 1, 또는 화합물 2의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체"는 다른 이성질체가 실질적으로 없는 이성질체 1 또는 이성질체 2를 의미한다. 화합물 1의 6-위치 또는 화합물 2의 5-위치에서의 이성질체 순도가 90% 초과의 거울상이성질체 과잉률인 경우에, 화합물 1 또는 화합물 2는 "실질적으로 부분입체이성질체적으로 순수"하다. 또 다른 실시양태에서, 이성질체 순도는 화합물 1의 6-위치 또는 화합물 2의 5-위치에서 95% 초과의 거울상이성질체 과잉률이다. 또 다른 실시양태에서, 이성질체 순도는 화합물 1의 6-위치 또는 화합물 2의 5-위치에서 98% 초과의 거울상이성질체 과잉률이다. 또 다른 실시양태에서, 이성질체 순도는 화합물 1의 6-위치 또는 화합물 2의 5-위치에서 99% 초과의 거울상이성질체 과잉률이다. 화합물 1 또는 화합물 2의 부분입체이성질체 혼합물을 포함하는 모든 입체이성질체가 본 발명 내에서 고려된다.

암을 치료하기 위한 화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염의 예상되는 투여량은 0.1 내지 100 mg/환자/일의 범위이다. 바람직한 투여량은 1.0 내지 75 mg/환자/일의 범위인 것으로 예상된다. 가장 바람직한 투여량은 2.0 내지 50 mg/환자/일의 범위인 것으로 예상된다. 청각 유모 세포 손실 또는 손상에 의해 유발된 감각신경성 청각 상실을 치료하거나, 또는 청각 유모 세포 생성을 유도하기 위한 화합물 1, 그의 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염의 예상되는 투여량은 0.01 내지 100 mg/환자/일의 범위이다. 바람직한 투여량은 0.1 내지 10 mg/환자/일의 범위인 것으로 예상된다. 가장 바람직한 투여량은 0.2 내지 1.0 mg/환자/일의 범위인 것으로 예상된다.

암, 감각신경성 청각 상실, 또는 청각 유모 세포 생성을 유도하는 것을 위해, 환자를 치료하는 데 요구되는 정확한 투여량 및 치료 시간의 길이는 질환의 단계 및 중증도뿐만 아니라 개별 환자의 특정한 필요 및 반응의 관점에서 의사에 의해 결정될 것이다. 1일 기준의 투여량으로서 표현되지만, 투여 요법은 환자에게 보다 최적의 치료 이익을 제공하고 임의의 약물 관련 독성을 관리하고 개선하도록 조정될 수 있다. 1일 투여에 더하여, 격일 (Q2D); 5일의 기간에 걸쳐 격일, 이어서 2일 휴약 (T.I.W.); 3일마다 (Q3D); 또는 21-일 투여 주기에 걸쳐 매주 1회 (Q.I.W.) 투여; 또는 다른 투여 요법이 적절할 수 있다.

용어 "치료", "치료하다", 및 "치료하는"은 암, 청각 유모 세포 손실 또는 손상에 의해 유발된 감각신경성 청각 상실, 또는 청각 유모 세포 생성의 유도를 위한 개입의 전체 스펙트럼, 예컨대 환자에서 하나 이상의 증상을 완화하거나, 저속화시키거나 또는 역전시키고 환자가 앓고 있는 암 또는 청각 유모 세포 손실 또는 손상의 진행을 지연시키거나, 또는 청각 유모 세포 생성을 유도하는 활성 화합물의 투여를 포함하는 것으로 의도된다.

"반려견 동물"은 애완, 서비스견, 구조견, 목축견 및 가축 보호견을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 가축 및 가정-사육 개를 의미한다.

인간에서의 "청각 상실," "감각신경성 청각 상실" 또는 "청각 상실"은 환자에서의 청력 역치 (특정한 주파수에서 들리는 가장 순음 (강도))가 경도의 경우 21 내지 40 dB; 중등도의 경우 41 내지 55 dB; 중등도-중증의 경우 56 내지 70 dB; 중증의 경우 71 내지 90 dB; 및 극심한 경우 91 dB 이상인 것을 의미한다. 시험된 강도는 전형적으로 0 dB 내지 120 dB 이하의 범위이다. 시험된 주파수는 전형적으로 250, 500, 1000, 2000, 4000 및 8000 Hz이다. 진단 청각 평가는 공지된 상용 시험에 의해 수행되고 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 사용되며 이는 순음 평균을 포함하는 순음 청력검사, 어음 수용 역치를 포함하는 어음 청력검사, 청성 뇌간 반응 평가 (ABR 또는 BAER), 경고실 전기와우도검사 (ECOG), 및 이음향 방사 시험 (OAE)을 포함한다. 소아 및 영아 평가가 또한 공지된 상용 시험에 의해 수행되고 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 사용되며 이는 시각 강화 청력검사, 놀이 청력검사, 이음향 방사 (OAE), 및 청성 뇌간 반응 평가를 포함한다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 제약상 허용되는 담체를 사용하여 제약 조성물로 제제화되고 다양한 경로에 의해 투여된다. 바람직하게는, 암을 치료하기 위해, 이러한 조성물은 경구 투여를 위한 것이다.

청각 유모 세포 손실 또는 손상에 의해 유발된 감각신경성 청각 상실을 치료하거나, 또는 청각 유모 세포 생성을 유도하기 위해 국부 또는 전신 요법을 제공하는 경구 또는 비경구 투여에 적합한 제약 조성물이 제제화되고 투여될 수 있다. 경구 조성물은 정제, 코팅된 정제, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 조성물은 피하 주사, 정맥내, 근육내, 복강내, 흉막내, 흉골내, 경고실, 미로내, 또는 와우내 주사, 또는 주입을 포함하는 투여를 가능하게 하도록 제제화될 수 있다. 제약 조성물은 본 발명의 화합물이 환자에게의 조성물의 투여 시 생체이용가능하게 하도록 제제화되거나, 또는 활성 제약 성분의 제어 또는 지속 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다. 중이강으로의 경고실 투여에 적합한 제약 조성물이 바람직하고, 중이의 원형창 함요로의 투여가 또한 바람직하다. 미로내 주사 및 와우내 주사가 또한 고려된다. 청각 상실 치료를 위한 바람직한 투여 경로는 국부 경고실 주사이지만, 이는 전신 전달을 제공하는 대안적 투여 경로에 적합한 제약 조성물을 배제하지 않고 국부 경고실 투여에 대한 대안적 또는 추가적 조성물 및 투여 요법을 포함할 수 있다. 국부 전달 조성물의 지속 방출이 또한 바람직하며 여기서 방출 간격은 화합물 1, 또는 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 제약상 허용되는 염이 연관된 전달 비히클, 또는 전달 비히클 작용제의 혼합물에 따라 삼 (3)일 내지 구십 (90)일의 범위일 수 있다.

제약 조성물, 제조 방법, 및 약물의 표적화 전달을 위한 전달 시스템은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al., eds., 19^th ed., Mack Publishing Co., 1995); Salt and Plontke, "Principles of Local Drug Delivery to the Inner Ear", Audiol Neurotol, 2009, (14); 350-360; Rhee, et al., "Sustained-Release Injectable Drug Delivery," Pharmaceutical Technology, Special Issue Drug Delivery, 01 Nov. 2010]을 참조한다. 제약 조성물은 보존제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 향미제, 삼투압 변동을 위한 염, 완충제, 차폐제, 또는 항산화제를 함유할 수 있다.

본 발명의 화합물은 다수의 무기 및 유기 산과 반응하여 제약상 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 이러한 제약상 허용되는 염 및 그를 제조하는 통상의 방법론은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts, " Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977]을 참조한다.

화합물 1, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염은 관련 기술분야에 공지된 다양한 절차뿐만 아니라 하기 기재된 것에 의해 제조될 수 있다. 특정한 합성 단계는 상이한 방식으로 조합되어 화합물 1, 그의 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 화합물 2, 그의 부분입체이성질체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제조할 수 있다.

화합물 1은: 4,4,4-트리플루오로-N-((2S)-1-((9-메톡시-3,3-디메틸-5-옥소-2,3,5,6-테트라히드로-1H-벤조[f]피롤로[1,2-a]아제핀-6-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)부탄아미드로 명명되고 또한 4,4,4-트리플루오로-N-{(1S)-2-[(9-메톡시-3,3-디메틸-5-옥소-2,3,5,6-테트라히드로-1H-피롤로[1,2-a][1]벤즈아제핀-6-일)아미노]-1-메틸-2-옥소에틸}부탄아미드로 명명될 수 있고; 또한: 부탄아미드, 4,4,4-트리플루오로-N-[(1S)-1-메틸-2-옥소-2-[(2,3,5,6-테트라히드로-9-메톡시-3,3-디메틸-5-옥소-1H-피롤로[1,2-a][1]벤즈아제핀-6-일)아미노]에틸]-로 명명될 수 있고; 다른 명칭이 분명하게 화합물 1을 확인하는 데 사용될 수 있다. 부분입체이성질체는 4,4,4-트리플루오로-N-((S)-1-(((S)-9-메톡시-3,3-디메틸-5-옥소-2,3,5,6-테트라히드로-1H-벤조[f]피롤로[1,2-a]아제핀-6-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)부탄아미드 및 4,4,4-트리플루오로-N-((S)-1-(((R)-9-메톡시-3,3-디메틸-5-옥소-2,3,5,6-테트라히드로-1H-벤조[f]피롤로[1,2-a]아제핀-6-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)부탄아미드로 명명된다. 다른 명칭이 분명하게 각각의 부분입체이성질체를 확인하는 데 사용될 수 있다.

화합물 2는: N-((2S)-1-((8,8-디메틸-6-옥소-6,8,9,10-테트라히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-5-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-4,4,4-트리플루오로부탄아미드로 명명되고 또한 N-{(1S)-2-[(8,8-디메틸-6-옥소-6,8,9,10-테트라히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-5-일)아미노]-1-메틸-2-옥소에틸}-4,4,4-트리플루오로부탄아미드로 명명될 수 있고; 또한: 부탄아미드, 4,4,4-트리플루오로-N-[(1S)-1-메틸-2-옥소-2-[(6,8,9,10-테트라히드로-8,8-디메틸-6-옥소-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-5-일)아미노]에틸]-로 명명될 수 있고; 다른 명칭이 분명하게 화합물 2를 확인하는 데 사용될 수 있다. 부분입체이성질체는 N-((S)-1-(((S)-8,8-디메틸-6-옥소-6,8,9,10-테트라히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-5-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-4,4,4-트리플루오로부탄아미드 및 N-((S)-1-(((R)-8,8-디메틸-6-옥소-6,8,9,10-테트라히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-5-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-4,4,4-트리플루오로부탄아미드로 명명된다. 다른 명칭이 분명하게 각각의 부분입체이성질체를 확인하는 데 사용될 수 있다.

화합물 1 및 화합물 2가 고정된 2개의 키랄 중심 중 1개로 도시된 것으로 이해될 것이다. 본원에서, (R)- 및 (S)-의 칸-인골드-프렐로그(Cahn-Ingold-Prelog) 명칭이 특정한 이성질체를 지칭하는 데 사용된다. 특정한 입체이성질체는 거울상이성질체적으로 순수한 또는 풍부한 출발 물질을 사용하는 입체특이적 합성에 의해 제조될 수 있다. 화합물 1 또는 화합물 2를 포함하는 출발 물질, 중간체, 또는 라세미 혼합물의 특정한 입체이성질체는 이러한 목적을 위해 형성된 부분입체이성질체, 예컨대 부분입체이성질체 염의 키랄 고정상에서의 크로마토그래피, 효소적 분해, 또는 분별 결정화 또는 크로마토그래피를 포함하는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술, 예컨대 문헌 [Stereochemistry of Organic Compounds, E. I. Eliel and S. H. Wilen (Wiley 1994) 및 Enantiomers , Racemates , and Resolutions, J., Jacques, A. Collet, and S. H. Wilen (Wiley 1991)]에서 밝혀진 것에 의해 분할될 수 있다. 키랄 화합물이 그의 이성질체로 단리되거나 또는 분할되지만, 절대 배위 또는 광회전은 결정되지 않은 경우에, 이성질체는 키랄 크로마토그래피로부터의 각각의 용리물 순서에 상응하도록 이성질체 1 및 이성질체 2로서 임의적으로 지정되고 키랄 크로마토그래피가 합성에서 초기에 개시되는 경우에, 동일한 명칭이 후속 중간체 및 실시예에 적용된다. 본 발명의 화합물을 함유하는 모든 혼합물이 본 발명 내에서 고려되지만, 바람직한 실시양태는 화합물 1, 이성질체 2, 또는 화합물 2, 이성질체 2이다.

본 발명의 화합물의 합성에서 초기 출발 물질로서 사용되는 화합물은 널리 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하지 않은 경우에는, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 흔히 사용되는 표준 절차에 의해 제공된 특정한 참조문헌을 사용하여 용이하게 합성되거나 또는 일반 참조 텍스트에서 발견된다.

공지된 절차 및 방법의 예는 일반 참조 텍스트 예컨대 문헌 [Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc, 1989; Compendium of Organic Synthetic Methods, Volumes 1-10, 1974-2002, Wiley Interscience; Advanced Organic Chemistry, Reactions Mechanisms, and Structure, 5^th Edition, Michael B. Smith and Jerry March, Wiley Interscience, 2001; Advanced Organic Chemistry, 4^th Edition, Part B, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey and Richard J. Sundberg, Kluwer Academic / Plenum Publishers, 2000] 등, 및 그에 인용된 참조문헌에 기재된 것을 포함한다.

본원에 사용된 하기 용어는 나타내어진 의미를 갖는다: "mAtoh1"은 뮤린 어토널 호몰로그 1 단백질을 지칭하고; "hAtoh 1"은 인간 어토널 호몰로그 1 단백질을 지칭하고; "Atoh1"은 인간 유전자 어토널 호몰로그 1을 지칭하고; "기본 배지"는 500ml DMEM/F12 배지 + 5ml N2 100X 스톡 및 10ml B27 50X 스톡 플러스 500μl 암피실린 스톡 (1000X, 50mg/ml) 및 1667μl 푼기존(Fungizone) (300X)을 지칭하고; "BFGF"는 염기성 섬유모세포 성장 인자를 지칭하고; "DMEM"은 둘베코 변형 이글 배지를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸술폭시드를 지칭하고; "EDTA"는 에틸렌디아민테트라아세트산을 지칭하고; "EGF"는 표피 성장 인자를 지칭하고; "EGTA"는 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라 아세트산을 지칭하고; ES/MS는 전기분무 질량 분광분석법을 지칭하고; "FBS"는 소 태아 혈청을 지칭하고; "GFP"는 녹색 형광 단백질을 지칭하고; "h"는 시간을 지칭하고; "HBSS"는 행크 평형 염 용액을 지칭하고; "HEK"는 인간 배아 신장을 지칭하고; "IC₅₀"은 작용제에 대해 가능한 최대 억제 반응의 50%를 생성하는 해당 작용제의 농도를 지칭하고; "IgG"는 이뮤노글로불린 G를 지칭하고; "Math1"은 인간 유전자 어토널 호몰로그 1을 지칭하고; "배지 A"는 각각 20, 10, 50, 및 50ng/ml에서의 200ml 기본 배지 + EGF bFGF + IGF-1 + 헤파란 술페이트를 지칭하고; "MEM"은 최소 필수 배지를 지칭하고; "min"은 분을 지칭하고; "MS"는 질량 분광분석법을 지칭하고; "N1ICD"는 Notch1 세포내 도메인을 지칭하고; "nGFP"는 핵 녹색 형광 단백질을 지칭하고; "OC"는 코르티 기관을 지칭하고; "PBS"는 포스페이트 완충 염수를 지칭하고; "PBST"는 포스페이트 완충 염수 + 트윈(Tween)®을 지칭하고; "qPCR"은 정량적 폴리머라제 연쇄 반응을 지칭하고; "qRT-PCR"은 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응을 지칭하고; "rpm"은 분당 회전수를 지칭하고; "RLT 완충제"는 RN이지(RNeasy) 용해 완충제를 지칭하고; "RT"는 실온을 지칭하고; "Tbp"는 TATA-결합 단백질을 지칭한다.

제조예 1

1-브로모-3-(2-브로모-4-메톡시-페닐)프로판-2-온

트리메틸실릴디아조메탄 (118.4 mL, 236.80 mmol, 헥산 중 2M)을 질소 하에 테트라히드로푸란 (197 mL) 및 아세토니트릴 (197 mL) 중 2-(2-브로모-4-메톡시-페닐)아세틸 클로라이드 (52 g, 197.3 mmol)의 교반된 0℃ 용액에 적가하였다. 15분 후 실온으로 가온되게 하고 2시간 동안 질소 하에 교반하였다. 농축시켜 농후한 적색 오일 (61 g)을 수득하였다. 브로민화수소 (36 mL, 197 mmol, 아세트산 중 33%)를 아세트산 중 이전 단계로부터의 2-(2-브로모-4-메톡시-페닐)아세틸 아지드의 교반된 5℃ 용액 (265 mL)에 적가하였다. 첨가한 후, 질소 하에 실온으로 가온되게 하였다. 45분 후, 얼음/물 (500 mL)로 켄칭하여, 갈색 침전물을 생성하였다. 고체를 여과하고 물 (100 mL) 및 헥산 (100 ml)으로 세척하고 45℃에서 2시간 동안 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 오렌지색 오일 (63.0 g, 99%)로서 수득하였다.

1H NMR (300 MHz, CDCl₃): 7.17-7.12 (m, 2H), 6.85 (dd, J= 2.5, 8.5 Hz, 1H), 4.03 (s, 2H), 3.97 (s, 2H), 3.79 (s, 3H).

제조예 2

(3Z)-1-(2-브로모-4-메톡시-페닐)-3-(3,3-디메틸피롤리딘-2-일리덴)프로판-2-온

3,3-디메틸피롤리딘-2-티온 (26.5 g, 205 mmol)을 실온에서 1 부분으로 테트라히드로푸란 (600 mL) 중 제조예 1에 의해 제공되는 중간체, 1-브로모-3-(2-브로모-4-메톡시-페닐)프로판-2-온 (60.00 g, 186 mmol), 및 아이오딘화칼륨 (31 g, 86 mmol)의 현탁액에 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. 메틸 tert-부틸 에테르 (200 mL)를 첨가하고, 고체를 여과하고 필터 케이크를 메틸-tert-부틸 에테르 (100 mL)로 헹구어 1-(2-브로모-4-메톡시-페닐)-3-[(4,4-디메틸-2,3-디히드로피롤-1-윰-5-일)술파닐]프로판-2-온 아이오다이드를 담황색 고체 (100 g)로서 수득하였다. 아세토니트릴 (1 L) 중 고체 (100 g, 201 mmol)의 현탁액에 트리에틸아민 (56 mL, 401 mmol) 및 트리페닐포스핀 (58 g, 221 mmol)을 첨가하고 65℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. 메틸 tert-부틸 에테르 (200 ml)를 첨가하고 고체를 여과하였다. 여과물을 증발시키고, 잔류물을 메틸 tert-부틸 에테르 (20 mL)로 연화처리하고 고체를 여과하였다 (2회). 합한 여과물을 증발시켜 50 g 조 물질을 수득하였다. 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 20-50% 에틸 아세테이트/헥산의 구배로 용리하여 정제하여 표제 화합물을 회백색 고체 (41 g, 70%)로서 수득하였다.

MS (m/z): 338.0/340.0 (M+/M+2).

제조예 3

9-메톡시-3,3-디메틸-2,3-디히드로-1H-피롤로[1,2-A][1]벤즈아제핀-5(6H)-온

제조예 2에 의해 제공되는 중간체, (3Z)-1-(2-브로모-4-메톡시-페닐)-3-(3,3-디메틸피롤리딘-2-일리덴)프로판-2-온 (40.0 g, 118 mmol), 아세트산팔라듐 (2.7 g, 12 mmol), 탄산세슘 (77 g, 237 mmol), 4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸크산텐 (13.7 g, 24 mmol), 및 N-메틸-2-피롤리돈 (1.2 L)의 혼합물을 질소 (x3)로 탈기/플러싱하였다. 현탁액을 150℃에서 4시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과 제거하고, 에틸 아세테이트로 세척하고 고체를 폐기하였다. 에틸 아세테이트 (1 L) 및 물 (500 mL)을 여과물에 첨가하고, 고체를 규조토를 통해 여과 제거하고 폐기하였다. 여과물 층을 분리하고, 수성물로부터 에틸 아세테이트 (2 x 20 mL)에 이어 디클로로메탄 (3 x 100 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 5% 수성 중탄산나트륨 용액으로 2회 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 100 mL 암갈색 오일을 수득하였다. 물질을 실리카 패드 상에서 디클로로메탄에 이어 1% 메탄올/디클로로메탄으로 용리하여 여과하고 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트와 5% 수성 중탄산나트륨 용액 사이에 분배하고, 수성물로부터 에틸 아세테이트로 역추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 조 생성물을 암갈색 발포체로서 수득하였다. 생성된 발포체를 에틸 아세테이트 (250 mL) 중에 용해시키고, 실리아본드 티올(SiliaBond Thiol)® (80 g)을 첨가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 고체를 여과하고, 필터 케이크를 에틸 아세테이트 및 디클로로메탄으로 세척하고, 여과물을 농축시켜 표제 화합물을 담갈색 고체 (19.6 g, 65%)로서 수득하였다.

MS (m/z): 258.0 (M+H).

제조예 4

6-히드록시이미노-9-메톡시-3,3-디메틸-2,3-디히드로-1H-피롤로[1,2-a][1]벤즈아제핀-5(6H)-온

포타슘 tert-부톡시드 (11 g, 98 mmol)를 여러 부분으로 테트라히드로푸란 (336 mL) 중 제조예 3에 의해 제공되는 중간체, 9-메톡시-3,3-디메틸-2,3-디히드로-1H-피롤로[1,2-A][1]벤즈아제핀-5(6H)-온 (16.8 g, 65 mmol)의 교반된 0℃ 용액에 첨가하고 15분 동안 교반하였다. 아밀 니트라이트 (12.2 mL, 91 mmol)를 적가하고 혼합물을 30분 동안 0℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음/물 (200 mL)에 붓고 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 x 200 mL)로 추출하였다. 결정화된 고체를 여과하고, 여과물로부터 디클로로메탄 (2 x 100 mL)으로 추출하였다. 합한 유기물을 염수 (100 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 담갈색 고체를 수득하였다. 고체를 1:1 메틸 tert-부틸 에테르/헥산으로 연화처리하고, 이전에 수집된 고체와 합하여 표제 화합물을 담황색 고체 (16.5 g, 88%)로서 수득하였다.

MS (m/z): 287.1 (M+H).

제조예 5

6-아미노-9-메톡시-3,3-디메틸-2,3-디히드로-1H-피롤로[1,2-a][1]벤즈아제핀-5(6H)-온

트리플루오로아세트산 (17 mL, 231 mmol)을 디클로로메탄 (248 mL) 중 제조예 4에 의해 제공되는 중간체, 6-히드록시이미노-9-메톡시-3,3-디메틸-2,3-디히드로-1H-피롤로[1,2-a][1]벤즈아제핀-5(6H)-온 (16.5 g, 58 mmol), 및 아연 분진 (11.3 g, 173 mmol)의 교반된 5℃-10℃ 현탁액에 10분에 걸쳐 적가하고 이어서 실온으로 가온되게 하였다. 혼합물을 규조토의 패드를 통해 여과하고, 여과물을 얼음 및 포화 수성 탄산나트륨의 혼합물 (1:1, 500 mL) 상에 부었다. 생성된 현탁액을 규조토를 통해 여과하고 필터 패드를 디클로로메탄으로 헹구었다. 수성 층으로부터 디클로로메탄 (100 mL)으로 추출하고, 합한 유기 층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 표제 화합물을 담갈색 발포체 (14.7 g, 94%)로서 수득하였다.

MS (m/z): 273.1 (M+H).

제조예 6

벤질 (2S)-2-(4,4,4-트리플루오로부타노일아미노)프로파노에이트

L-알라닌 벤질 에스테르 히드로클로라이드 (7 g, 32.5 mmol), 디이소프로필에틸아민 (28 mL, 162 mmol), 히드록시벤조트리아졸 수화물 (7.5 g, 49 mmol), 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (9.3 g, 49 mmol)를 디클로로메탄 (162 mL) 중 4,4,4-트리플루오로부티르산 (7.1 g, 49 mmol)의 교반된 용액에 첨가하고 실온에서 N₂ 하에 20시간 동안 교반하였다. 20% 수성 시트르산 용액 (150 mL)으로 켄칭하고, 혼합물을 5분 동안 교반하고, 층을 분리하고 수성 층으로부터 디클로로메탄 (100 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 포화 수성 중탄산나트륨 용액 (150 mL)으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 10.6 g 연황색 고체를 수득하였다. 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 25-50% 에틸 아세테이트/헥산의 구배로 용리하여 정제하여 표제 화합물을 백색 고체 (9.2 g, 94%)로서 수득하였다.

MS (m/z): 304.2 (M+H).

제조예 7

(2S)-2-(4,4,4-트리플루오로부타노일아미노)프로판산

팔라듐 (1.8 g, 0.8 mmol, C 상 5%)을 실온에서 메탄올 (88 mL) 중 제조예 6에 의해 제공되는 중간체, 벤질 (2S)-2-(4,4,4-트리플루오로부타노일아미노)프로파노에이트 (8.8 g, 29 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 혼합물을 탈기하고 수소 (풍선 분위기) 하에 5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 규조토 상에서 여과하고, 패드를 메탄올로 세척하고 여과물을 농축시켜 백색 고체를 수득하였다. 고체를 디클로로메탄으로 연화처리하고 밤새 실온에서 진공 하에 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (6.11 g, 99% 수율)로서 수득하였다.

MS (m/z): 214.1 (M+H).

제조예 8

메틸 3-(3,3-디메틸-2-티옥소피롤리딘-1-일)프로파노에이트

3,3-디메틸피롤리딘-2-티온 (15.7 g, 122 mmol) 및 메틸 아크릴레이트 (12 mL, 134 mmol)를 테트라히드로푸란 (100 mL) 중에 용해시키고 실온에서 질소 하에 교반하였다. 수산화나트륨 (0.8 g, 20 mmol)을 첨가하고 밤새 실온에서 질소 하에 교반하였다. 염수로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 층을 분리하고, 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 27.5 g 조 고체를 수득하였다. 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 20-50% 에틸 아세테이트/헥산의 구배로 용리하여 정제하여 표제 화합물을 백색 고체 (25.9 g, 99%)로서 수득하였다.

MS (m/z): 216.2 (M+H).

제조예 9

메틸 3-[(2Z)-2-(2-에톡시-2-옥소-에틸리덴)-3,3-디메틸-피롤리딘-1-일]프로파노에이트

테트라키스(아세테이토)디로듐(II) (3.74 g, 8.5 mmol)을 톨루엔 (156 mL) 중 제조예 8에 의해 제공되는 중간체, 메틸 3-(3,3-디메틸-2-티옥소피롤리딘-1-일)프로파노에이트 (41.4 g, 192 mmol)의 교반된 용액에 첨가하고 110℃로 질소 하에 가열하였다. 에틸디아조아세테이트 (89 mL, 844 mmol)를 대략 18시간에 걸쳐 적가하고 이어서 밤새 110℃에서 가열하였다. 농축시키고 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 30% 에틸 아세테이트/헥산으로 용리하여 정제하여 표제 화합물을 황색 오일 (34.5 g, 67%)로서 수득하였다.

MS (m/z): 270.2 (M+H).

제조예 10

에틸 (2Z)-2-(3,3-디메틸피롤리딘-2-일리덴)아세테이트

빙수조를 사용하여 온도를 <30℃로 유지하면서 포타슘 헥사메틸디실라지드 (301 mL, 톨루엔 중 0.5 M, 151 mmol)를 45분에 걸쳐 질소 하에 테트라히드로푸란 (430 mL) 중 제조예 9에 의해 제공되는 중간체, 메틸 3-[(2Z)-2-(2-에톡시-2-옥소-에틸리덴)-3,3-디메틸-피롤리딘-1-일]프로파노에이트 (33.8 g, 126 mmol)의 교반된 용액에 적가하였다. 첨가의 완료 후 40분 동안 교반하였다. 포화 수성 중탄산나트륨 용액 (250 mL)으로 켄칭하고 이어서 농축시켰다. 디에틸 에테르와 염수 용액 사이에 분배하고, 수성물로부터 에틸 아세테이트 (x 4)로 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 37 g 물질을 수득하였다. 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 10% 에틸 아세테이트/헥산으로 용리하여 정제하여 표제 화합물 (9.1 g, 40%)을 수득하였다.

MS (m/z): 184.2 (M+H).

제조예 11

에틸 (2Z)-2-[3,3-디메틸-1-(3-메틸-2-피리딜)피롤리딘-2-일리덴]아세테이트

반응 용기에서 2-브로모-3-메틸피리딘 (1.5 g, 8.7 mmol), 제조예 10에 의해 제공되는 중간체, 에틸 (2Z)-2-(3,3-디메틸피롤리딘-2-일리덴)아세테이트 (1.6 g, 8.7 mmol), 및 sym-디메틸에틸렌 디아민 (0.77 mL, 8.7 mmol)을 1,4-디옥산 (15 mL) 중에서 합하였다. 10분 동안 교반하면서 질소를 용액을 통해 버블링하였다. 탄산칼륨 (3.6 g, 26 mmol) 및 아이오딘화구리 (I) (0.83 g, 4.4 mmol)를 모두 한 번에 첨가하고, 밀봉하고 교반된 혼합물을 120℃에서 2일 동안 가열하였다. 디클로로메탄으로 희석하고, 규조토를 통해 여과하고 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 5-100% 에틸 아세테이트/헥산의 구배로 용리하여 정제하여 표제 화합물을 연황색 오일 (1.58 g, 66%)로서 수득하였다.

MS (m/z): 275.0 (M+H).

제조예 12

8,8-디메틸-9,10-디히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-6(8H)-온

반응 용기에서 시린지를 통해 소듐 비스(트리메틸실릴)아미드 (22 mL, 테트라히드로푸란 중 1M, 22 mmol)를 제조예 11에 의해 제공되는 중간체, 에틸 (2Z)-2-[3,3-디메틸-1-(3-메틸-2-피리딜)피롤리딘-2-일리덴]아세테이트 (2.88 g, 10.5 mmol), 및 테트라히드로푸란 (60 mL)의 교반된 용액에 첨가하였다. 용기를 밀봉하고 3일 동안 교반하면서 70℃에서 가열하였다. 실온으로 냉각시키고, 염수로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 갈색 오일을 수득하였다. 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 50-100% 에틸 아세테이트/헥산의 구배로 용리하여 정제하여 표제 화합물을 황색 고체 (1.70 g, 71%)로서 수득하였다.

MS (m/z): 229.2 (M+H).

제조예 13

6-아지도-10-아자-3,3-디메틸-2,6-디히드로-1H-피롤로[1,2-a][1]벤즈아제핀-5-온

리튬 디이소프로필아미드 (7.0 mL, 10.5 mmol, 헥산 중 1.5 M)를 10분에 걸쳐 질소 하에 테트라히드로푸란 (50 mL) 중 제조예 12에 의해 제공되는 중간체, 8,8-디메틸-9,10-디히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-6(8H)-온 (1.85 g, 8.1 mmol)의 교반된 -78℃ 용액에 첨가하였다. 30분 후 아세트산 (2.3 mL, 41 mmol)을 시린지를 통해 첨가하고 이어서 질소 하에 실온으로 가온되게 하였다. 포화 수성 중탄산나트륨 용액으로 켄칭하였다. 혼합물을 염수와 에틸 아세테이트 사이에 분배하고, 층을 분리하고, 에틸 아세테이트 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 갈색 고체를 수득하였다. 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 5-60% 에틸 아세테이트/헥산의 구배로 용리하여 정제하여 표제 화합물 (1.2 g, 55%)을 수득하였다.

MS (m/z): 270.2 (M+H).

제조예 14

5-아미노-3,3-디메틸-9,10-디히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-6(8H)-온

아연 분진 (1.2 g, 18 mmol)에 이어 염화암모늄 (5 g, 66 mmol)을 실온에서 에탄올 (50 mL) 및 물 (15 mL) 중 제조예 13에 의해 제공되는 중간체, 6-아지도-10-아자-3,3-디메틸-2,6-디히드로-1H-피롤로[1,2-a][1]벤즈아제핀-5-온 (1.2 g, 4.5 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 1시간 후 에틸 아세테이트로 희석하고, 고체를 여과하고 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트와 염수 사이에 현탁시키고, 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 디클로로메탄 중 5-40% [10% 2M 암모니아 / 메탄올/디클로로메탄]의 구배로 용리하여 정제하여 표제 화합물을 황색 고체 (0.72 g, 67%)로서 수득하였다.

MS (m/z): 244.2 (M+H).

제조예 15

tert-부틸 N-[(1S)-2-[(10-아자-3,3-디메틸-5-옥소-2,6-디히드로-1H-피롤로[1,2-a][1]벤즈아제핀-6-일)아미노]-1-메틸-2-옥소-에틸] 카르바메이트

(2S)-2-(tert-부톡시카르보닐아미노)프로판산 (0.69 g, 3.6 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (0.55 g, 3.6 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (0.67 mL, 3.9 mmol)을 질소 하에 테트라히드로푸란 (10 mL) 중 제조예 14에 의해 제공되는 중간체, 5-아미노-3,3-디메틸-9,10-디히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-6(8H)-온 (0.72 g, 3.0 mmol)의 교반된 0℃ 용액에 첨가하였다. 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (0.68 g, 3.6 mmol)를 첨가하고 혼합물을 질소 하에 실온으로 가온되게 하였다. 2시간 후, 물로 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 50-100% 에틸 아세테이트/헥산의 구배로 용리하여 정제하여 표제 화합물을 황색 고체 (1.04 g, 84%)로서 수득하였다.

MS (m/z): 415.0 (M+H).

제조예 16

(2S)-2-아미노-N-(10-아자-3,3-디메틸-5-옥소-2,6-디히드로-1H-피롤로[1,2-a][1]벤즈아제핀-6-일)프로판아미드 히드로클로라이드

염화수소 (12.5 mL, 50 mmol, 디옥산 중 4M)를 1,4-디옥산 (40 mL) 중 제조예 15에 의해 제공되는 중간체, tert-부틸 N-[(1S)-2-[(10-아자-3,3-디메틸-5-옥소-2,6-디히드로-1H-피롤로[1,2-a][1]벤즈아제핀-6-일)아미노]-1-메틸-2-옥소-에틸] 카르바메이트 (1.04 g, 2.5 mmol)의 교반된 용액에 첨가하고 교반하면서 45℃로 가온하였다. LC/MS가 반응의 완료를 나타내는 경우에, 농축시켜 표제 화합물을 황색 고체 (0.93 g, 조 물질)로서 수득하였다.

MS (m/z): 315.2 (M+1).

실시예 1

4,4,4-트리플루오로-N-((2S)-1-((9-메톡시-3,3-디메틸-5-옥소-2,3,5,6-테트라히드로-1H-벤조[f]피롤로[1,2-a]아제핀-6-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)부탄아미드

파트 1

부분입체이성질체 4,4,4-트리플루오로-N-((2S)-1-((9-메톡시-3,3-디메틸-5-옥소-2,3,5,6-테트라히드로-1H-벤조[f]피롤로[1,2-a]아제핀-6-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)부탄아미드

1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (12.4 g, 65 mmol)를 실온에서 디클로로메탄 (294 mL) 중 제조예 5에 의해 제공되는 중간체, 6-아미노-9-메톡시-3,3-디메틸-2,3-디히드로-1H-피롤로[1,2-a][1]벤즈아제핀-5(6H)-온, 및 제조예 7에 의해 제공되는 중간체, (2S)-2-(4,4,4-트리플루오로부타노일아미노)프로판산 (10.9 g, 51 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 혼합물을 5℃로 냉각시키고, 1-히드록시벤조트리아졸 (8.75 g, 65 mmol)을 첨가하고 실온에서 10분 동안 교반을 계속하였다. 혼합물을 물 (3 x 100 mL)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켜 암색 고체를 수득하였다. 메틸 tert-부틸 에테르로 연화처리하여 표제 화합물 (부분입체이성질체의 혼합물)을 회백색 고체 (22.0 g, 87%)로서 수득하였다.

MS (m/z): 468.1 (M+H).

파트 2

4,4,4-트리플루오로-N-((2S)-1-((9-메톡시-3,3-디메틸-5-옥소-2,3,5,6-테트라히드로-1H-벤조[f]피롤로[1,2-a]아제핀-6-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)부탄아미드 이성질체 1 및 2

실시예 1, 파트 1로부터의 부분입체이성질체의 혼합물을 키랄팩 AD 칼럼 상에서 10% 아세토니트릴/에탄올 (0.2% 디메틸에틸아민)로 용리하여 분리하여 이성질체 1 화합물 (R_t=3.20분)을 백색 고체 (9.8 g, 38%)로서 및 이성질체 2 화합물 (Rt=7.37분)을 백색 고체 (9.0 g, 36%)로서 수득하였다.

MS (m/z): 이성질체 둘 다에 대해 468.2 (M+H).

실시예 2

N-((2S)-1-((8,8-디메틸-6-옥소-6,8,9,10-테트라히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-5-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-4,4,4-트리플루오로부탄아미드

파트 1

부분입체이성질체 N-{(1S)-2-[(8,8-디메틸-6-옥소-6,8,9,10-테트라히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-5-일)아미노]-1-메틸-2-옥소에틸}-4,4,4-트리플루오로부탄아미드

4,4,4-트리플루오로부탄산 (0.45 g, 3.2 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (0.49 g, 3.2 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (2.3 mL, 13.2 mmol)을 질소 하에 테트라히드로푸란 (50 mL) 중 제조예 16에 의해 제공되는 중간체, (2S)-2-아미노-N-(10-아자-3,3-디메틸-5-옥소-2,6-디히드로-1H-피롤로[1,2-a][1]벤즈아제핀-6-일)프로판아미드 히드로클로라이드 (0.93 g, 2.6 mmol)의 교반된 0℃ 용액에 첨가하였다. 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (0.61 g, 3.2 mmol)를 첨가하고 혼합물을 질소 하에 16시간 동안 실온으로 가온되게 하였다. 물로 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 잔류물을 실리카 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 통해 75-100% 에틸 아세테이트/헥산의 구배로 용리하여 정제하여 표제 화합물 (부분입체이성질체의 혼합물)을 회백색 고체 (0.82 g, 71%)로서 수득하였다.

MS (m/z): 439.2 (M+1).

파트 2

N-((2S)-1-((8,8-디메틸-6-옥소-6,8,9,10-테트라히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-5-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-4,4,4-트리플루오로부탄아미드 이성질체 1 및 2

실시예 2, Part 1로부터의 부분입체이성질체의 혼합물을 키랄팩 AD-H 칼럼 상에서 15% MeOH/CO_2(기체)로 용리하여 분리하여 이성질체 1 (R_t=1.60분)을 백색 고체 (194 mg, 24%, 32% DE (부분입체이성질체 과잉률)로 에피머화됨)로서 및 이성질체 2 (R_t=2.31분)를 백색 고체 (469 mg, 57%)로서 수득하였다.

MS (m/z): 이성질체 둘 다에 대해 439.0 (M+H).

암은, 질환의 개시 및 진행이 세포 및 조직 미세환경에서의 DNA 복구, 게놈 안정성, 세포 증식, 세포 사멸, 부착, 혈관신생, 침습, 및 전이를 조절하는 하나 이상의 유전자의 비정상적 기능에 의해 유도되는 질환의 불균질 집합으로서 점차로 인식된다. "암" 유전자의 변형된 또는 비정상적 기능은 자연 발생 DNA 다형성, 게놈 카피수에서의 변화 (증폭, 결실, 염색체 손실, 또는 복제를 통함), 유전자 및 염색체 구조에서의 변화 (염색체 전위, 역위, 또는 탈조절된 유전자 발현을 유도하는 다른 재배열을 통함), 및 점 돌연변이로부터 발생할 수 있다. 암성 신생물은 하나의 비정상적 유전자 기능에 의해 유도되고, 동일한 비정상적 유전자 기능에 의해 유지되거나, 또는 유지 및 진행이 추가의 비정상적 유전자 기능에 의해 악화될 수 있다.

상기 언급된 유전적 염색체 이상 이외에, 각각의 암은 또한 DNA 메틸화, 게놈 각인, 및 아세틸화, 메틸화, 또는 인산화에 의한 히스톤 변형을 포함하는 게놈의 후성적 변형을 포함할 수 있다. 후성적 변형은 악성종양의 유도 및/또는 유지에서 역할을 할 수 있다.

인간 암에서의 세포유전 이상의 광범위한 카탈로그는 컴파일링되었고 유지되고 정기적으로 온라인에 업데이트된다 (미국 국립 암연구소(US National Cancer Institute) (NCI) 캔서 게놈 애너토미 프로젝트(Cancer Genome Anatomy Project) (CGAP)에서의 [The Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer] 참조). 데이터베이스는 본 발명의 악성종양 중 적어도 일부에 대한 염색체 이상을 포함한다. 웰컴 트러스트 생어 인스티튜트 캔서 게놈 프로젝트(Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project)는 종양발생에 인과적으로 연결된 모든 인간 유전자의 상세한 온라인 "캔서 진 센서스(Cancer Gene Census)"뿐만 아니라 인간 암에서의 체세포 돌연변이의 COSMIC (암에서의 체세포 돌연변이의 카탈로그(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer)) 데이터베이스를 유지한다. 다양한 암에 인과적으로 연결된 세포유전 변화에 대한 풍부한 정보를 함유하는 추가의 공급원은 문헌 [Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology]이다.

생검, 면역표현형결정 및 다른 시험에 의한 암성 악성종양의 진단은 공지되어 있고 상용적으로 사용된다. 고해상도 염색체 밴딩 및 고급 염색체 영상화 기술에 더하여, 암이 의심되는 사례에서의 염색체 이상은 세포유전 분석 예컨대 형광 계내 혼성화 (FISH), 핵형분석, 스펙트럼 핵형결정 (SKY), 멀티플렉스 FISH (M-FISH), 비교 게놈 혼성화 (CGH), 단일 뉴클레오티드 다형성 어레이 (SNP 칩) 및 통상의 기술자에 의해 공지되고 사용되는 다른 진단 및 분석 시험을 통해 결정될 수 있다.

Notch의 종양원성 역할은 Notch1 세포내 도메인의 과다발현을 일으키는, Notch1 세포내 도메인의 T-세포 수용체-β 프로모터 영역으로의 전위를 수반하는 인간 T-세포 백혈병에서 처음 보고되었다 (Grabher et al. Nature Review Cancer, 2006(6):347-359; Weng et al. Science, 2004(306):269-271). 마우스의 조혈 전구 세포에서의 Notch1 세포내 도메인의 과다발현은 마우스가 인간과 유사한 T-세포 급성 림프모구성 백혈병을 발현하도록 하였다. T-세포 급성 림프모구성 백혈병에 더하여, Notch 신호가 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병 (Rosati et al., Blood, 2009(113): 856-865), 급성 골수 백혈병 (Sliwa et al. Int J Clin Exp Pathol, 2014(7(3)): 882-889), 만성 골수 백혈병 (Nakahara et al. Blood, 2010(115(14)): 2872-2881), 및 적백혈병 (Robert-Moreno et al., Leukemia, 2007(21): 1496-1503)을 포함하여, 다른 암에서 수용체 증폭 및 리간드 및/또는 수용체의 과다발현을 포함하는 다중 메카니즘을 통해 종양원성이라는 증가하는 증거가 있다. 리간드 및/또는 수용체의 돌연변이 또는 과다발현으로 인한 비정상적 구성적 Notch 신호전달은 또한 삼중 음성 유방암 (Stoeck et al., Cancer Discovery, 2014(4): 1154-1167), 유방암, 난소암 (Park et al. Cancer Research, 2006(66):6312-6318), 흑색종 (Gast et al. Genes, Chromosomes & Cancer, 2010(49):733-745), 폐암, 비소세포 폐암 (Westhoff et al. PNAS, 2009(106):22293-22298), 췌장암, 교모세포종, 결장직장암, 두경부암, 자궁경부암, 전립선암, 간암, 편평 세포 암종 (경구), 피부암 및 수모세포종 (Rangathan et al., Nature Review Cancer, 2011(11):338-351 and Supplementary information S1 (table))을 포함하는 다수의 고형 종양 악성종양에 연루된다. 리간드 및/또는 수용체의 돌연변이 또는 과다발현으로 인한 비정상적 구성적 Notch 신호전달은 또한 혈관육종 (Ravi et al., J Clin Oncol, 2007, (25(18S, June 20 Supplement)): Abstract 10030), 횡문근육종 (Belyea et al., Clin Cancer Res, 2011(17(23)): 7324-7336; Roma et al., Clin Cancer Res, 2011(17(3)): 505-513), 지방육종 (J Clin Oncol, 2009, (27(15S, Supplement)): Abstract 10526), 악성 섬유성 조직구종 (Wang et al., Cancer Res, 2012, (72): 1013-1022), 간세포성 암종 (Villanueva et al., Gastroenterology, 2012, (143): 1660-1669), 간내 및 간외 담관암종 (Wu et al., Int J Exp Pathol, 2014, (7(6)): 3272-3279; Sekiya et al., J Clin Invest, 2012, (122(11)): 3914-3918; Yoon et al., World J Gastroenterol, 2011, (17(35)): 4023-4030), 및 선양 낭성 암종 (Bell et al., Annals of Diagnostic Pathology, 2014, (18): 10-13; Stoeck et al., Cancer Discov, 2014, (4): 1154-1167)에 연루된다. Notch 신호전달의 억제는 치료 이익을 암 환자의 질환이 구성적 Notch 신호전달 경로의 비정상적 활성화에 의해 유도되는 암 환자에게 제공하는 매력적인 표적을 제시한다. 문헌 [Shih et al. Cancer Research, 2007(67)1879-1882].

내이 유모 세포 발생에 대한 결정적 유전자 중 하나는 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 전사 인자 어토널-1 (Atoh1)의 포유동물 상동체이다. 와우 세포에서의 Atoh1의 발현은 청각 유모 세포 발생에 요구된다. Atoh1을 발현하는, 발생 중인 코르티 기관 내의 전구감각 상피 세포는 청각 유모 세포로 분화할 것이고 (Helms et al., Development 2000, (127(6)): 1185-1196), Atoh1은 청각 유모 세포 분화의 가장 초기의 마커 중 하나이다. 코르티 기관의 지지 세포는 섬모 형성 (Zheng et al., Nature Neuroscience, 2000,(3(6)): 580-586 ; Kawamoto et al., J Neurosci, 2003, (23(11)): 4395-4400; Izumikawa et al., Nat Med, 2005, (11(3)):271-276); 및 고유 유모 세포 기능 (Kawamoto et al., 2003)을 포함하는 유모 세포 특징을 발생시킬 가능성을 유지한다.

와우에서의 각각의 유모 세포는 유모 세포 및 신경절에게 영양 및 구조적 지지를 제공하고 간극 연접 세포간 소통을 통해 코르티 기관에서의 고유 이온 농도를 유지하는 데 필수적인 비-감각 지지 세포에 의해 둘러싸인다. 2가지 유형의 유모 세포가 있다: 내부 및 외부 유모 세포. 인간을 포함하는 포유동물에서의 와우 유모 세포는 내부 유모 세포의 1개의 열 및 외부 유모 세포의 3개의 열로 이루어진다. 내부 유모 세포는 실제 감각 수용체이고, 뇌로 돌출한 청신경의 섬유의 95%는 이 하위집단으로부터 발생한다. 외부 유모 세포 상의 말단은 거의 모두 뇌에서의 세포로부터 발생한 원심성 축삭으로부터의 것이고 이들 세포는 음향 사전-증폭기로서 기능한다. 지지 세포는 청각 유모 세포 손실 또는 손상 후 청각 유모 세포 생성에서 주요 역할을 한다. 발생 동안에, 유모 및 지지 세포는 공통 전구세포로부터 발생하고 유모 세포의 출현은 주변 세포로 신호전달하여 Notch 신호전달 경로에 의해 매개되는 접촉 억제를 통해 지지 세포로 발생한다 (Kelley, Nat Rev Neurosci, 2006, (11): 837-849).

그들의 공유된 발생 경로에 따라 청각 유모 세포로 전환분화하는 지지세포의 능력에 기초하여, 지지 세포가 유모 세포 전구세포로서 기능할 수 있다는 것이 상정되어 왔다 (Parker et al., Audiology and Neurootology, 2004, (9(2)): 72-80). 여러 연구는 지지 세포에서 세포 주기 억제를 우회하는 것이 포유동물에서 청각 유모 세포 생성을 일으킬 수 있다는 것을 입증한 바 있다 (Lowenheim et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1999, (96): 4084-4088; Torchinsky et al., J Neurocytol, 1999, (28(10-11)): 913-924; Minoda et al., Hear Res, 2007, (232): 44-51). 따라서 성체 포유동물 지지 세포는 그들이 세포 주기에 자유롭게 진입하면 청각 유모 세포로 전환분화하는 능력을 유지한다.

청각 유모 세포의 복원을 위한 약물 요법은 새로운 접근법이고 와우 내로의 실제 주사가 없는 중이액으로의, 바람직하게는 원형창 함요로의 고실내 투여는 치료 용량에서 및 적합한 시간의 길이 동안에 Atoh1 발현을 효과적으로 유도하여 와우에서의 지지 세포의 청각 유모 세포 전환분화를 유발할 수 있다. 문헌 [Mizutari et al., Neuron, 2013, (77(1)): 58-69]은 감마 세크레타제 억제제 (LY411575)의 중이 전달이 마우스에서 청각적 외상으로 손실된 청각 유모 세포를 재생시키는 데 사용될 수 있고 지지 세포로부터의 새로운 유모 세포의 이러한 생성이 유의하고, 측정가능한 청각 회복을 일으켰다는 것을 밝혀냈다. 이러한 작업은 마우스 모델에서의 청각 유모 세포 생성 및 청각의 복원에 대한 Notch 경로 신호전달 억제의 치료 효과의 개념적 증거를 제공하고, 생리학적 효과에 대한 기계론적 (청각 유모 세포로의 지지 세포 분화) 설명을 제공하였다. 용량 제한 독성이 LY411575의 전신 투여 동안에 나타났다.

하기 시험관내 및 생체내 연구는 특정한 암 세포주에 대한 화합물 1 및 2, 또는 그의 실질적으로 순수한 부분입체이성질체의 Notch 경로 신호전달 억제 활성 및 효능을 입증한다. 이들 검정은 일반적으로 인간 임상 화학요법 활성을 나타내는 것으로서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식된다. γ-세크레타제에 의한 Notch 세포내 도메인 절단의 억제는 각각의 Notch 1, Notch 2, Notch 3 및 Notch 4 수용체에 대해 효과적인 것으로 여겨진다. Notch 경로 신호전달 억제 활성 및 효능을 입증하는 검정을 실질적으로 하기와 같이 또는 유사한 데이터를 제공하는 유사한 검정에 의해 수행할 수 있다.

Notch1 N1ICD 핵 축적 세포 영상화 검정

HEK293ΔE12 세포 (HEK293 세포는 그의 N-말단에 23개의 아미노산 신호 펩티드 서열, MPRLLTPLLCLTLLPALAARGLR (서열식별번호: 2)을 갖는 아미노산 1703-2183, NP_032740.3 (전장 마우스 Notch 1 단백질 전구체: 서열식별번호: 1)을 코딩하는 마우스 Notch1 cDNA를 안정하게 발현하도록 조작됨)를 5000개 세포/웰로 96 웰 플레이트에 플레이팅하고, 5% 소 태아 혈청 (FBS)를 포함하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)-고 글루코스에서 37℃, 5 % CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 1000 nM 내지 0.05 nM의 범위에 걸친 1:3 희석의 10개 포인트에서 투여한 시험 화합물, 및 0.2%에서의 최종 디메틸 술폭시드 (DMSO) 농도로 처리한다. 24시간 처리 후, 세포 플레이트를 순차적으로 하기 단계를 통해 처리한다: 세포를 100μl/웰 프리퍼(PREFER)™ 고정제로 30분 동안 실온 (RT)에서 고정하는 단계; 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중 100μl/웰 0.1% 트리톤(TRITON)® X100으로 20분 동안 실온에서 투과시키는 단계; 각각 100μl/웰 PBS로 3회 세척하는 단계; 1 % 소 혈청 알부민을 포함하는 PBS 중 1:2000으로 50μl/웰 토끼 항-N1ICD (Notch1 세포내 도메인) 항체를 첨가하고, 1.5시간 동안 37℃에서 인큐베이션하는 단계; 각각 100μl/웰 PBS로 3회 세척하는 단계; 1 % 소 혈청 알부민을 포함하는 PBS 중 1:1000 희석으로 50μl/웰 염소 항-토끼 IgG (이뮤노글로불린 G) 알렉사(Alexa) 488과 함께 인큐베이션하고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하는 단계; 각각 100μl/웰 PBS로 3회 세척하고 50μg/ml RNAse를 포함하는 100μl/웰 15 μM 아이오딘화프로피듐을 30분 동안 첨가하여 핵을 염색하는 단계. 플레이트를 어큐멘 익스플로러(ACUMEN EXPLORER)™ 레이저-주사 형광 마이크로플레이트 세포측정기 (티티피 랩테크 리미티드(TTP LABTECH LTD))로 스캐닝하여 655nm-705nm에서의 형광 (DNA 결합된 아이오딘화프로피듐의 방출) 및 핵 영역에서 N1ICD에 결합한 항체의 505nm-530nm에서의 형광으로 총 세포 핵 수/웰 및 총 핵 면적/웰을 측정한다. 주요 검정 결과는 총 핵 면적에 대한 핵 N1ICD의 총 형광의 비인 정규화된 핵 N1ICD 신호이다. 상대 세포독성 프로파일링을 0.2% DMSO 대조군 세포에 대한 % 세포 수로서 수집하였다. 절단된 Notch1 또는 N1ICD를 인식하는 항체는 Val1744에서의 인간 Notch1의 아미노 말단 절단 부위에 상응하는 인간 펩티드로 증가된다. 비처리된 대조군 세포에서, Notch1로부터 생성된 N1ICD는 핵으로 전위하고 축적될 것이다. 세포가 Notch 1 절단 억제 화합물로 처리되는 경우에, 핵 N1ICD의 신호는 감소할 것이다. 농도 반응 및 IC₅₀을 핵 N1ICD 신호에 대해 4 파라미터 로지스틱에 피팅한 곡선에 의해 결정하는 한편, % 세포 수를 세포독성 프로파일링을 위해 동일한 그래프에 플롯팅한다. 본질적으로 상기 기재된 바와 같은 검정을 수행하면, 화합물 1, 이성질체 2에 대한 평균 IC₅₀은 0.37 nM (+/- 0.16; n=2)이고 화합물 2, 이성질체 2는 1.55 nM (+/- 1.12; n=2)이다. 화합물은 1000 nM 농도 이하의 세포 수에는 영향을 미치지 않는다. 이들 데이터는 화합물 1, 이성질체 2 및 화합물 2, 이성질체 2가 각각 Notch 1에 대한 친화도를 갖고 Notch 1 세포내 도메인 세포 신호전달 펩티드의 세포내 축적을 억제한다는 것을 입증한다.

생체내 표적 억제 연구

동물 연구

Notch 프로세싱 약역학 (PD)의 억제에 대한 화합물 1, 이성질체 2 및 화합물 2, 이성질체 2의 생체내 효과를 평가하기 위해, 동물 연구를 비-종양 보유 Balb/C 마우스 (찰스 리버)에서 수행하였다. 총 5마리의 마우스를 각각의 군에 사용한다. 마우스에게 정상 사료를 자유롭게 공급한다. 처리는 0.2 mL 부피에서 화합물 또는 비히클 (0.25% 트윈-80 중 1% Na-CMC)의 경구 투여 (위관영양)로 개시된다. 처리 후 지정된 시점 (투여 후 4 또는 8시간)에, 동물을 CO₂ 질식 및 경추 탈구에 의해 희생시킨다. 조직 (폐)을 분리하고 절단된 N1ICD에 의해 측정된 바와 같이 PD 반응 분석에 사용한다.

N1ICD 분석

폐에서의 N1ICD 수준을 평가하기 위해, 대략 75 mg을 동결된 조직으로부터 절단하고 균질화 전에 세절한다 (실제 질량을 기록함). 동결된 종양 샘플을 라이싱 매트릭스-D(Lysing Matrix-D)™ 튜브로 옮기고 1X 콤플리트 정제 (로슈 콤플리트(Roche Complete)™ No. 11697 498 001) 및 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) P8340)을 함유하는 빙냉 XY 용해 완충제 (25 mM 트리스 pH 7.5, 10 μg/ml 트립신/키모트립신 억제제, 10 μg/ml 아프로티닌, 60 mM 베타-글리세롤 포스페이트, 1% 트리톤® X-100, 10 mM NaF, 2.5 mM 피로포스페이트, 150 mM NaCl, 15 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) pH 8.0, 5 mM 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라 아세트산 (EGTA) pH 8.0, 1 mM Na 바나데이트, 10 μg/ml 류펩틴, 1 mM 디티오트레이톨, 1 μM 마이크로시스틴 LR, 10 μg/ml N-p-토실-L-페닐알라닌 클로로메틸 케톤 (TPCK), 2 mM Nα-p-토실-L-아르기닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드 (TAME), 15 mM 4-니트로페닐 포스페이트 디(트리스) 염 (PNPP), 0.1 mM 4-(2-아미노에틸) 벤젠술포닐 플루오라이드 히드로클로라이드 (AEBSF), 5 mM 벤즈아미딘, 1 μM 오카다산) 중에 75 mg/ml 완충제의 질량: 부피 비로 재현탁시킨다. 조직을 패스트 프렙(Fast Prep) FP120 균질화기 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 일리노이주 록포드)에서 6.0의 속도로 30초 동안 4℃에서 균질화하고, 이어서 얼음 상에서 15분 인큐베이션한다. 이를 균질화가 완료될 때까지 총 2-3 사이클 반복한다. 용해물을 4℃ 에펜도르프(eppendorf) 원심분리기에서 30,000 rpm으로 15분 동안 회전시켜 파편을 제거한다. 400 μl의 상청액을 분리하고 새로운 에펜도르프 튜브로 옮기고 냉동/해동 사이클에 적용한다. 샘플을 4℃ 에펜도르프 원심분리기에서 30,000 rpm으로 30분 동안 재회전시키고 120 μl의 상청액을 분석을 위해 수집한다. 총 단백질 농도를 써모맥스(Thermomax)™ 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 캘리포니아주 서니베일)를 사용하는 피어스 BCA 프로틴 어세이 키트(Pierce BCA Protein Assay Kit)™ (써모 사이언티픽, 일리노이주 록포드)를 사용하여 결정한다. N1ICD 수준을 통상의 N1ICD ELISA를 사용하여 결정한다. 분석물을 절단된 Notch1(Val1744)-특이적 맞춤형 토끼 모노클로날 항체를 사용하여 포획하고 C-말단 Notch1 술포-태그(SULFO-TAG)™ (메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery), 메릴랜드주 게이더스버그) 폴리클로날 양 항체 (알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미네소타주 미네아폴리스)를 사용하여 검출한다. 용해물을 1X 콤플리트 정제 (로슈 콤플리트™ 미니 No. 11 836 153 001) 및 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마-알드리치 P8340)을 함유하는 빙냉 ELISA 트리스 용해 완충제 (R6OTX) (메소 스케일 디스커버리, 메릴랜드주 게이더스버그) 중에 2 μg/μl로 희석하고, 25μl를 ELISA 플레이트에 첨가한다. 50 μg 단백질 용해물의 인큐베이션을 실온에서 1시간 동안 각각 수행하여 검출 항체를 사용하여 분석물을 포획한다. 플레이트를 섹터 이미저(Sector Imager) 6000™ (메소 스케일 디스커버리, 메릴랜드주 게이더스버그) 상에서 판독한다. 배경 공제된 N1ICD를 총 단백질에 대해 정규화하고 비히클-처리군에 대한 % 억제로서 제시한다. 화합물 1, 이성질체 2 또는 화합물 2, 이성질체 2에 대한 최종 투여 4시간 후 수거된 종양에서 던넷 방법에 의해 측정된 바와 같은 N1ICD % 억제 및 통계적 유의성 (p 값)을 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 분석하고 표 1에 요약한다.

표 1.

표 1에서의 데이터는 마우스 폐 조직에서의 화합물 1, 이성질체 2 및 화합물 2, 이성질체 2에 의한 N1ICD 절단의 억제를 입증한다. 표 1에서의 데이터는 추가로 상기 기재된 기능적 활성 데이터에 대한 생체내 상관관계를 제공한다.

귀 구체에서의 mAtoh1 발현의 유도

일반적으로, 코르티 기관 세포 단리를 대체로 문헌 [Oshima et al., Methods Mol Biol ., 2009; 493: 141-162]에서의 방법에 의해 제0일에 수행한다. 세포 배양 및 증식을 3-4일 동안 수행한다. 세포 플레이팅 및 시험 화합물 처리는 제3일 또는 제4일에 일어난다. 부착 및 분화를 다음 7일에 걸쳐 일어나게 한다. 제10일 또는 제11일에, 세포 용해 및 RNA 단리를 수행한다. 택맨(TaqMan) qRT-PCR을 제12일에 수행하고 결과를 제13-15일에 Atoh1 및 Tbp1 발현에 대해 분석한다.

세포의 단리

측두골의 추체 부분으로부터의 주위 조직을 양쪽 성별의 1 내지 4일령의 출생후 마우스 (트랜스제닉 계통: mAtoh1-구동 nGFP; 문헌 [Lumpkin EA, et al., Gene Expr Patterns, 2003; (36): 389-95])로부터 제거한다. 소라형 와우를 겸자를 사용하여 전정계로부터 분리한다. 이 발생 단계에서, 골성미로는 완전히 석회화되지 않고 겸자를 사용하여 용이하게 절제된다. 조심스럽게 와우의 골성미로를 개방하고 와우축으로부터 선단 방향으로 풀어 나선인대 및 와우축의 나선을 따라 함께 감아진 부착된 코르티 기관을 분리한다. 기저에서 시작하여, 미세 겸자를 사용하여 코르티 기관으로부터 나선 인대를 분리한다.

절제된 코르티 기관 (OC)을 850 μl 빙냉 HBSS로 충전된 개별 1.5 ml 튜브 내로 옮긴다. 12개 이하의 OC 조직을 동일한 튜브 내로 옮긴다. OC 조직을 신속하게-스핀 다운시키고 HBSS를 제거한다. 세포를 100 μl 미리-가온된 트립엘이^TM 셀렉트(TrypLE^TM Select) (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))를 첨가함으로써 해리시키고 37℃에서 13분 동안 인큐베이션한다. 해리된 OC 조직을 신속하게 스핀 다운시킨다. 트립엘이™ 셀렉트를 제거한다. 100 μl의 배지 A (DMEM/F12, N2 보충물 (라이프 테크놀로지스), B27 보충물 (라이프 테크놀로지스), 암피실린 (50μg/ml) 및 푼기존 (라이프 테크놀로지스), EGF (20 ng/ml), bFGF (10 ng/ml), IGF-1 (50 ng/ml), 및 헤파란 술페이트 (50 ng/ml))를 첨가한다. 이어서 절제된 및 소화된 조직을 P200 피펫 팁으로 연화처리한다. 임의의 세포 응집체 및 파편을 제거하고; 세포 현탁액을 옮기고 미리-습윤된 70 μm 세포 스트레이너를 통해 세척하여 단일 새로운 배양 튜브에서 세포 현탁액을 풀링한다. 해리 튜브 및 세포 스트레이너를 충분한 배지 A로 헹구고 세포 현탁액으로 풀링한다. 세포 밀도를 혈구계 또는 카운테스(Countess)® (라이프 테크놀로지스)를 사용하여 계수한다. 새로운 배지 A를 세포 현탁액에 첨가하여 1.0E5개 세포/ml의 최종 플레이팅 밀도를 달성하고 초저 부착 컬쳐웨어, T-75 (그라이너(Greiner)) 내로 플레이팅한다.

OC 구체를 증식시키기 위한 현탁액에서의 배양

해리된, 단일 세포를 초저 부착 컬쳐웨어 (그라이너)에서 배지 A 중에서 3 내지 4일 동안 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 37℃에서 배양하여 부유 세포로부터 제1 세대 구체로 칭해지는 클론 성장 구체를 수득한다. 세포가 배양 기간 동안에 비-부착 접시에 점착되는 경우에 이들은 완만한 혼합에 의해 축출될 수 있다.

부착 배양 및 처리

구체를 3-4일 동안 배양한 후, 현미경에 의해 구체를 육안으로 계수하여 이 단계에 대해 ml당 귀 구체의 시딩 밀도를 표준화한다. 세포를 원심분리에 의해 수집하고 기본 배지에서 대략 ml당 2000개의 구체 농도로 구체를 재현탁시킨다. 구체를 세포 배양-처리된 96 웰 플레이트의 웰당 150 μl의 부피로 시딩하여 대략 웰당 300개의 구체를 수득한다. 구체를 기본 배지 (DMEM/F12, N2 보충물 (라이프 테크놀로지스) B27 보충물 (라이프 테크놀로지스), 암피실린 (50 μg/ml) 및 푼기존 (라이프 테크놀로지스)) 중에서 200 μl의 최종 부피에서 실험 작용제로 사중으로 처리한다. 처리된 구체를 7일 동안 가습 온도 조절된 인큐베이터에서 5% CO₂, 37℃에서 배양한다. 배지를 제거하고 RNA 추출을 진행한다.

RNA 추출

웰당 175 μl의 1% 베타-메르캅토에탄올로 보충된 완충제 RLT 플러스(RLT plus) (퀴아젠(Qiagen))를 첨가한다. 완충제 RLT 플러스 중에 희석된 2.5 μl의 4 ng/μl RNA 담체 (RN이지® 플러스 마이크로 키트; 퀴아젠)를 각각의 웰 내로 첨가한 후 RNA를 추출한다. 총 RNA를 제조업체의 지침에 따라 RN이지® 플러스 마이크로 키트 (퀴아젠)를 사용하여 추출한다.

cDNA 합성

cDNA 합성을 cDNA 합성을 위한 랜덤 육량체를 사용하여 슈퍼스크립트(SuperScript)® III 제1 가닥 합성 시스템 (라이프 테크놀로지스, 카탈로그 18080-051)을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 수행한다. cDNA를 50%로 21 μl의 초순수 뉴클레아제-무함유 물을 첨가함으로써 희석한다. 5 μl의 희석된 cDNA를 qPCR에 사용한다.

qPCR

처리된 구체 배양물로부터의 유모 세포 마커의 발현을 정량화하기 위해, 관심 mAtoh1의 유전자 및 내인성 대조군 유전자를 검출하는 프로브를 사용하는 qPCR을 단일, 2색 멀티플렉스 반응에서 수행한다. 택맨 유전자 발현 마스터 믹스 (라이프 테크놀로지스, 4369016) 및 관심 프로브 (Atoh1; Mm00476035_s1) 및 내인성 대조군 프로브 (Tbp1; Mm00446971_m1, 라이프 테크놀로지스)를 제조업체의 지침에 따라 사용한다. 조건을 각각의 프로브에 대해 일정하게 유지한다. 처리군 사이의 상대 유전자 발현을 ΔΔC_T 방법을 사용하여 분석하고 반복 측정의 평균을 구한다. 실험을 적어도 삼중으로 수행하고, 전체 평균으로서 보고한다.

표 2

표 2에서의 데이터는 3개의 농도 (10nM, 100nM 및 1μM)로 각각의 화합물 1, 이성질체 2 및 화합물 2, 이성질체 2로 처리된 귀 구체에서의 유모 세포 생성의 마커인 Atoh1 발현의 상대 정량화 값 (RQ)을 나타낸다. 데이터 (± 평균의 표준 오차, SEM)는 음성 대조군 (DMSO 담체)-처리된 샘플에 대한 유전자 발현 배수-유도를 나타낸다. (^*, 음성 대조군으로부터의 유의한 차이, p<0.05).

인간 종양 세포주에서의 hAtoh1 발현의 유도

hAtoh1 발현을 유도하는 화합물 1, 이성질체 2 및 2, 이성질체 2의 능력에 있어서 그의 효력을 평가하기 위해, 인간 종양 세포주를 이용한다. 이 세포주에 대한 내인성 Notch 신호전달 조절은 내이에서의 것과 유사하다. 일반적으로, 본 검정을 문헌 [Kazanjian et al., Gastroenterology, 2010, 139(3): 918-928 및 Supplementary Materials and Methods]에서의 원리에 따라 수행한다.

일반적으로, 표준 세포 배양 기술을 사용한다. 성장 배지 (MEM 10% FBS)에 유지된 낮은 계대 인간 결장직장 선암종 세포주 LS174T (ATCC CL-188)를 96-웰 조직 배양 처리된 플레이트 내로 웰당 100 μl 검정 배지 (MEM 1% FBS) 중에서 10,000개의 세포로 플레이팅한다.

다음날, 10 mM 스톡 시험 화합물의 반-로그 연속 희석 (100% DMSO 중에 희석됨)을 수행하여 11개의 감소하는 용량의 약물 화합물을 수득하였다. 최종 농도는 10 μM 내지 0.127 nM에 걸쳐야 한다. 3.16-배 연속 희석물을 사용하며 각각의 웰에서의 DMSO 농도는 100%이다. 초기 DMSO 희석물의 추가의 1:10 희석을 검정 배지에서 수행한다. 다시 또 다른 1:100의 희석을 검정 배지에서 수행한다.

100 μl의 시험 화합물 희석물을 세포 및 성장 배지를 함유하는 각각의 웰에 첨가하고 72시간 동안 37℃에서 5% CO₂에서 성장시킨다.

세포를 제4일에 플레이트로부터 수집하고, RNA를 추출하고 제조업체의 프로토콜에 따라 RN이지® 플러스 96 RNA (퀴아젠)를 사용하여 정제한다.

cDNA 합성을 cDNA 합성을 위한 랜덤 육량체를 사용하여 슈퍼스크립트® III 제1 가닥 합성 시스템 (라이프 테크놀로지스, 18080-051)을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 수행한다. cDNA를 50%로 21 μl의 초순수 뉴클레아제-무함유 물을 첨가함으로써 희석한다. 5 μl의 희석된 cDNA를 qPCR에 사용한다.

qPCR

처리된 구체 배양물로부터의 유모 세포 마커의 발현을 정량화하기 위해, hAtoh1 또는 TBP 발현을 검출하는 qPCR 프로브를 단일, 2색 멀티플렉스 반응에서 수행한다. 각각의 샘플에 대한 상대 유전자 발현을 측정하기 위해, 택맨 유전자 발현 마스터 믹스 (라이프 테크놀로지스, 4369016) 및 관심 프로브 (인간 Atoh1; 라이프 테크놀로지스 검정 Id Hs00944192_s1) 플러스 내인성 대조군 (인간 TBP; 라이프 테크놀로지스 검정 Id Hs00427620_m1)을 제조업체의 지침에 따라 사용한다. 조건을 각각의 프로브에 대해 일정하게 유지한다. 처리군 사이의 상대 유전자 발현을 ΔΔC_T 방법을 사용하여 분석하고 반복 측정의 평균을 구한다.

4개의 개별 검정을 수행하여 각각의 시험 화합물에 대한 IC₅₀ 값을 수득한다. IC₅₀ 값을 4.0E-11 내지 1.0E-6 M의 농도 범위에 걸친 12개의 용량에 대해 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)® 소프트웨어를 사용하여 농도 반응 데이터를 "로그(길항제) 대 반응 (3개의 파라미터)" 모델에 피팅함으로써 결정하며 각각의 화합물에 대해 108개의 총 지점이 분석된다. 화합물 1, 이성질체 2 및 2, 이성질체 2에 대한 IC₅₀ 값이 표 3에 제시된다.

표 3

표 3에서의 데이터는 본 검정에서 청각 유모 세포 생성의 마커인 hAtoh1의 상대 발현에 의해 계산된 바와 같은 화합물 1, 이성질체 2 및 화합물 2, 이성질체 2의 IC₅₀ 값을 나타낸다.

코르티 기관 체외이식편 검정에서의 화합물에 대한 반응

일반적으로, 코르티 기관 기관형 체외이식편 배양을 문헌 [Parker et al., Journal of Visualized Experiments, 2010, (36), e1685]에 기재된 방법에 따라 제0일에 수행한다. 체외이식편 배양을 배양이 qRT-PCR을 위한 세포 용해, 또는 면역조직화학을 위한 조직 고정을 위해 준비된 지점에서 4-7일 동안 수행한다.

코르티 기관 체외이식편의 단리 및 배양

측두골의 추체 부분으로부터의 기포 및 주위 조직을 양쪽 성별의 1 내지 4일령의 출생후 마우스 (트랜스제닉 계통: Atoh1-구동 nGFP; 문헌 [Lumpkin EA, et al., Gene Expr Patterns, 2003, (36):389-95])로부터 분리한다. 코르티 기관을 행크 용액 중에서 절제하고, 나선인대를 제거하고 체외이식편을 폴리-L-오르니틴 (0.01%, 시그마) 및 라미닌 (50 mg/ml, 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))으로 코팅된 커버 슬립 상에 두어 편평 와우 표면을 갖는 제제를 수득한다. 이어서 각각의 와우 체외이식편을 24 웰 플레이트 (팔콘(Falcon))의 단일 웰에 두고 5% 소 태아 혈청, 5% 말 혈청, 및 페니실린-스트렙토마이신 (라이프 테크놀로지스)을 포함하는 DMEM (인비트로젠(Invitrogen))에서 배양한다. 실험 화합물을 제0일에 배지와 함께 첨가하고 2-3일마다 교체한다. 모든 배양물을 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 37℃에서 유지한다.

qRT-PCR에 의한 유전자 발현 분석

RNA 추출은 체외이식편 조직을 웰당 350μl RLT 플러스 완충제 (퀴아젠)로 용해시킴으로써 수행하고, 총 RNA를 RN이지® 플러스 미니 키트 (퀴아젠)에 의해 정제한다. cDNA 합성을 랜덤 육량체를 사용하여 슈퍼스크립트® III 제1 가닥 합성 시스템 (라이프 테크놀로지스)으로 수행한다. 유모 세포 마커 발현의 유도를 정량화하기 위해, qPCR을 택맨 유전자 발현 마스터 믹스 (라이프 테크놀로지스, 4369016) 및 관심 유전자 (예를 들어 hAtoh1; 검정 ID Mm00476035_s1, Pou4f3; 검정 ID Mm04213795_s1 및 Myo7a; 검정 ID Mm01274015_m1, 라이프 테크놀로지스) 및 내인성 대조군 유전자인 Tbp (검정 ID Mm00446971_m1, 라이프 테크놀로지스)를 검출하는 프로브를 사용하여 수행한다. 처리군 사이의 상대 유전자 발현을 ΔΔC_T 방법을 사용하여 분석하고 반복 측정의 평균을 구한다. 실험을 적어도 삼중으로 수행하고, 전체 평균으로서 보고한다.

표 4

표 4에서의 데이터는 1μM로 화합물 1, 이성질체 2 및 화합물 2, 이성질체 2로 처리된 코르티 기관 체외이식편에서의 유모 세포 생성 마커; Atoh1, Pou4f3, 및 Myo7a의 발현의 상대 정량화 값 (RQ)을 나타낸다. 데이터 (±SEM)는 음성 대조군-처리된 샘플에 대한 유전자 발현에서의 배수-유도를 나타낸다.

새로운 Atoh1-발현 유모 세포의 면역-염색

체외이식편 배양 후, 조직을 24 웰 플레이트에 200μl 시토픽스/시토펌 (BD)으로 30분 동안 고정시키고, 트리톤X100 (PBST)을 함유하는 PBS로 헹구고, 염소 항-GFP (1:2500; AbCAM, ab5450) 및 토끼 항-미오신VIIa (1:1000; 프로테우스 바이오사이언스(Proteus Bioscience) #25-6790)를 포함하는, PBST 중 4% 정상 당나귀 혈청으로 이루어진 200μl의 1차 항체 용액으로 1시간 동안 염색한다. 이어서 조직을 PBST로 완전히 세척하고 알렉사 플루오르 488 당나귀 항-염소 IgG (1:1000; 인비트로젠, A-11055) 및 알렉사 플루오르 568 당나귀 항-토끼 IgG (1:1000; 인비트로젠, A10042)로 이루어진 2차 항체 용액으로 1시간 동안 염색한다. 이어서 이들을 PBST로 완전히 세척하고 현미경 슬라이드 상에 탑재한다. 개별 유모 세포를 Atoh1-대용 마커 GFP (녹색) 및 미오신 VIIa (적색)의 발현에 의해 확인하고, 영상화하고, 이어서 비처리된 또는 음성 대조군 (생물학적 불활성 화합물)-처리된 샘플에서의 유모 세포 수와 대비하여 실험, 화합물-처리된 샘플에서의 신생 유모 세포의 형성을 검사하기 위해 중간-꼭대기 영역에서의 100 μM 길이 내에서 계수한다. 맹검 세포 수를 5개의 개별 실험에서 측정한다.

표 5

표 5에서의 데이터는 1 μM에서의 화합물 1, 이성질체 2 (n=13) 또는 화합물 2, 이성질체 2 (n=15)의 존재 하에 4일 동안 배양되고, GFP (대용 Atoh1 마커) 및 미오신 VIIa에 대해 면역염색된 코르티 기관 체외이식편에서의 외부 유모 세포 수를 나타낸다. 유모 세포에서의 퍼센트 증가는 음성 대조군-처리된 샘플 (n=18)에 대한 것이다.

내이신경독성 손상 후 유전자 발현 분석

다양한 코르티 기관 기관형 체외이식편 배양물을 내이신경독성 손상 후 후속 화합물 처리에 대해 반응하는 유모 세포 재생을 모델링하는 데 사용한다. 이 손상 모델을 중간-정단 유모 세포에서의 95% 감소가 보고된 경우에 문헌 [Korrapati et al., PLOSOne, 2013, 8(8), e73276]에 기재된 방법에 따라 수행한다. 제0일에, 코르티 기관 체외이식편 내에서 유모 세포를 손상시키고 선택적으로 사멸시키기 위해, 아미노글리코시드 처리 (겐타미신 (100 μM))를 18-24시간 동안 첨가한다. 제1일에, 겐타미신을 제거하고 5 μM로 화합물 1, 이성질체 2 및 화합물 2, 이성질체 2를 사용하는 처리를 시작한다. 체외이식편 배양을 배양물이 상기 기재된 qRT-PCR 프로토콜에 대해 준비된 지점에서 총 4일 동안 계속한다. 겐타미신-유도된 손상의 가시적 확인은 음성 대조군 화합물로 처리된 배양물 사이에서 용이하게 관찰된다. 그러나, qRT-PCR에 의해 수득된, 내이신경독성 손상 후 화합물 1, 이성질체 2 및 화합물 2, 이성질체 2 처리에 대한 반응에 대한 정량적 측정은 전구감각 유모 세포 마커 Atoh1 및 Pou4f3 및 유모 세포 마커 Myo7A에 대한 유전자 발현에서의 증가를 측정하였다.

표 6

표 6에서의 데이터는 겐타미신 (100 μM) 손상 후 5 μM로 화합물 1, 이성질체 2 및 화합물 2, 이성질체 2로 처리된 코르티 기관 체외이식편에서 유모 세포 생성 마커인 Atoh1, Pou4f3, 및 Myo7a의 qRT-PCR에 의한 유전자 발현에서의 상대 증가를 나타낸다. 데이터는 겐타미신-유도된 유모 세포 손상을 갖는 음성 대조군-처리된 샘플에 대한 유전자 발현에서의 퍼센트 증가를 나타낸다. (*, 음성 대조군으로부터의 유의한 차이, p < 0.05)

전체 미로골낭 배양에서의 유모 세포 마커 유도

와우 골성미로 및 전정계로 이루어진 미로골낭 (미로골낭 체외이식편)은 일반적으로 문헌 [Parker et al., Journal of Visualized Experiments, 2010, (36), e1685]에 기재된 방법에 따라 양쪽 성별의 1 내지 4일령의 출생후 마우스 (트랜스제닉 계통: Atoh 1-구동 nGFP; 문헌 [Lumpkin EA, et al., Gene Expr . Patterns, 2003, 3(4): 389-95])로부터 절제된다. 전체 미로골낭을 두정골로부터 단리하고 롤러 튜브 배양 시스템에서 최대 3일 동안 DMEM, 고 글루코스, 5% FBS, 5% 말 혈청, 1μg/ml 암피실린을 함유하는 배지에서 생체외 유지한다.

미로골낭 체외이식편을 사용하여 시험 화합물을 다양한 전달 비히클에서, 내이로의 침투도에 대해 평가한다. 시험을 다양한 전달 비히클 내의 화합물 1, 이성질체 2의 조성물 (7.2 mM)과 함께 수행한다. 작은 부피 (100-200 nl)를 와우의 원형창 함요로 직접 적용한다. 와우를 절제하고, 처리하고, 1-2시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 롤러 배양 내로 진입시킨다. 48시간 후 미로골낭 체외이식편을 개방하여 와우의 골성미로로부터 코르티 기관을 분리하고 RT-PCR에 의해 검정한다.

조성물을 1-2시간 동안 남아있게 하고 이어서 배양 배지로 세척한다. 이어서 미로골낭 체외이식편을 48시간 동안 비처리된 배지에서 배양한다. 와우를 개방하고 이어서 전체 코르티 기관을 절제하고 정량적 RT-PCR에 대해 준비하여 Atoh1 유모 세포 마커 발현 수준을 측정한다 (상기 코르티 기관 체외이식편 검정에 기재된 바와 같음). 표 7은 명시된 전달 비히클에서의 Atoh1 유도를 나타낸다. 모든 시험된 조성물에서의 화합물 1, 이성질체 2에 의한 Atoh1의 상향-조절 (2-3배, 12-17의 n)을 배양 48시간 후 비히클-단독 대조군-처리된 미로골낭 체외이식편과 비교하여 측정한다.

표 7: Atoh1 유전자 발현 (RT-PCR)

내이로의 생체내 외림프 시험 화합물 흡수

암컷 백색종 하틀리 기니 피그 (프랑스 찰스 리버)를 케타민/크실라진의 혼합물로 마취시킨 후에 전체 미로골낭 배양 검정에 대해 상기 기재된 바와 같은 조성물 중 70 μl의 화합물 1, 이성질체 2를 경고실 경로에 의해 주사하여 중이를 완전히 충전시킨다. 외림프 (내이액) 샘플을 주사후 0.5, 1, 6, 24 및 48시간에 추출하고 LCMS (5의 n)에 의해 시험 화합물의 농도에 대해 검정한다. 표 8은 시험 화합물이 이들 전달 비히클을 사용하는 중이로의 경고실 투여 후 내이 내로 흡수된다는 것을 나타낸다.

표 8: 생체내 외림프 수준

아미노산 서열

서열식별번호: 1 (마우스 Notch 1 단백질 전구체; 전장)

서열식별번호: 2 (신호 펩티드)

SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company Audion Therapeutics <120> NOTCH PATHWAY SIGNALING INHIBITOR COMPOUNDS <130> X20729 <150> 62/189,393 <151> 2015-07-07 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2531 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Pro Arg Leu Leu Thr Pro Leu Leu Cys Leu Thr Leu Leu Pro Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Gly Leu Arg Cys Ser Gln Pro Ser Gly Thr Cys Leu 20 25 30 Asn Gly Gly Arg Cys Glu Val Ala Asn Gly Thr Glu Ala Cys Val Cys 35 40 45 Ser Gly Ala Phe Val Gly Gln Arg Cys Gln Asp Ser Asn Pro Cys Leu 50 55 60 Ser Thr Pro Cys Lys Asn Ala Gly Thr Cys His Val Val Asp His Gly 65 70 75 80 Gly Thr Val Asp Tyr Ala Cys Ser Cys Pro Leu Gly Phe Ser Gly Pro 85 90 95 Leu Cys Leu Thr Pro Leu Asp Asn Ala Cys Leu Ala Asn Pro Cys Arg 100 105 110 Asn Gly Gly Thr Cys Asp Leu Leu Thr Leu Thr Glu Tyr Lys Cys Arg 115 120 125 Cys Pro Pro Gly Trp Ser Gly Lys Ser Cys Gln Gln Ala Asp Pro Cys 130 135 140 Ala Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln Cys Leu Pro Phe Glu Ser 145 150 155 160 Ser Tyr Ile Cys Arg Cys Pro Pro Gly Phe His Gly Pro Thr Cys Arg 165 170 175 Gln Asp Val Asn Glu Cys Ser Gln Asn Pro Gly Leu Cys Arg His Gly 180 185 190 Gly Thr Cys His Asn Glu Ile Gly Ser Tyr Arg Cys Ala Cys Arg Ala 195 200 205 Thr His Thr Gly Pro His Cys Glu Leu Pro Tyr Val Pro Cys Ser Pro 210 215 220 Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Arg Pro Thr Gly Asp Thr Thr 225 230 235 240 His Glu Cys Ala Cys Leu Pro Gly Phe Ala Gly Gln Asn Cys Glu Glu 245 250 255 Asn Val Asp Asp Cys Pro Gly Asn Asn Cys Lys Asn Gly Gly Ala Cys 260 265 270 Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Glu Trp Thr 275 280 285 Gly Gln Tyr Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Gln Leu Met Pro Asn 290 295 300 Ala Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys His Asn Thr His Gly Gly Tyr Asn 305 310 315 320 Cys Val Cys Val Asn Gly Trp Thr Gly Glu Asp Cys Ser Glu Asn Ile 325 330 335 Asp Asp Cys Ala Ser Ala Ala Cys Phe Gln Gly Ala Thr Cys His Asp 340 345 350 Arg Val Ala Ser Phe Tyr Cys Glu Cys Pro His Gly Arg Thr Gly Leu 355 360 365 Leu Cys His Leu Asn Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys Asn Glu Gly 370 375 380 Ser Asn Cys Asp Thr Asn Pro Val Asn Gly Lys Ala Ile Cys Thr Cys 385 390 395 400 Pro Ser Gly Tyr Thr Gly Pro Ala Cys Ser Gln Asp Val Asp Glu Cys 405 410 415 Ala Leu Gly Ala Asn Pro Cys Glu His Ala Gly Lys Cys Leu Asn Thr 420 425 430 Leu Gly Ser Phe Glu Cys Gln Cys Leu Gln Gly Tyr Thr Gly Pro Arg 435 440 445 Cys Glu Ile Asp Val Asn Glu Cys Ile Ser Asn Pro Cys Gln Asn Asp 450 455 460 Ala Thr Cys Leu Asp Gln Ile Gly Glu Phe Gln Cys Ile Cys Met Pro 465 470 475 480 Gly Tyr Glu Gly Val Tyr Cys Glu Ile Asn Thr Asp Glu Cys Ala Ser 485 490 495 Ser Pro Cys Leu His Asn Gly His Cys Met Asp Lys Ile Asn Glu Phe 500 505 510 Gln Cys Gln Cys Pro Lys Gly Phe Asn Gly His Leu Cys Gln Tyr Asp 515 520 525 Val Asp Glu Cys Ala Ser Thr Pro Cys Lys Asn Gly Ala Lys Cys Leu 530 535 540 Asp Gly Pro Asn Thr Tyr Thr Cys Val Cys Thr Glu Gly Tyr Thr Gly 545 550 555 560 Thr His Cys Glu Val Asp Ile Asp Glu Cys Asp Pro Asp Pro Cys His 565 570 575 Tyr Gly Ser Cys Lys Asp Gly Val Ala Thr Phe Thr Cys Leu Cys Gln 580 585 590 Pro Gly Tyr Thr Gly His His Cys Glu Thr Asn Ile Asn Glu Cys His 595 600 605 Ser Gln Pro Cys Arg His Gly Gly Thr Cys Gln Asp Arg Asp Asn Ser 610 615 620 Tyr Leu Cys Leu Cys Leu Lys Gly Thr Thr Gly Pro Asn Cys Glu Ile 625 630 635 640 Asn Leu Asp Asp Cys Ala Ser Asn Pro Cys Asp Ser Gly Thr Cys Leu 645 650 655 Asp Lys Ile Asp Gly Tyr Glu Cys Ala Cys Glu Pro Gly Tyr Thr Gly 660 665 670 Ser Met Cys Asn Val Asn Ile Asp Glu Cys Ala Gly Ser Pro Cys His 675 680 685 Asn Gly Gly Thr Cys Glu Asp Gly Ile Ala Gly Phe Thr Cys Arg Cys 690 695 700 Pro Glu Gly Tyr His Asp Pro Thr Cys Leu Ser Glu Val Asn Glu Cys 705 710 715 720 Asn Ser Asn Pro Cys Ile His Gly Ala Cys Arg Asp Gly Leu Asn Gly 725 730 735 Tyr Lys Cys Asp Cys Ala Pro Gly Trp Ser Gly Thr Asn Cys Asp Ile 740 745 750 Asn Asn Asn Glu Cys Glu Ser Asn Pro Cys Val Asn Gly Gly Thr Cys 755 760 765 Lys Asp Met Thr Ser Gly Tyr Val Cys Thr Cys Arg Glu Gly Phe Ser 770 775 780 Gly Pro Asn Cys Gln Thr Asn Ile Asn Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys 785 790 795 800 Leu Asn Gln Gly Thr Cys Ile Asp Asp Val Ala Gly Tyr Lys Cys Asn 805 810 815 Cys Pro Leu Pro Tyr Thr Gly Ala Thr Cys Glu Val Val Leu Ala Pro 820 825 830 Cys Ala Thr Ser Pro Cys Lys Asn Ser Gly Val Cys Lys Glu Ser Glu 835 840 845 Asp Tyr Glu Ser Phe Ser Cys Val Cys Pro Thr Gly Trp Gln Gly Gln 850 855 860 Thr Cys Glu Val Asp Ile Asn Glu Cys Val Lys Ser Pro Cys Arg His 865 870 875 880 Gly Ala Ser Cys Gln Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Arg Cys Leu Cys Gln 885 890 895 Ala Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Cys Glu Ser Asp Ile Asp Asp Cys Arg 900 905 910 Pro Asn Pro Cys His Asn Gly Gly Ser Cys Thr Asp Gly Ile Asn Thr 915 920 925 Ala Phe Cys Asp Cys Leu Pro Gly Phe Gln Gly Ala Phe Cys Glu Glu 930 935 940 Asp Ile Asn Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys Gln Asn Gly Ala Asn Cys 945 950 955 960 Thr Asp Cys Val Asp Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Pro Val Gly Phe Asn 965 970 975 Gly Ile His Cys Glu Asn Asn Thr Pro Asp Cys Thr Glu Ser Ser Cys 980 985 990 Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Ile Asn Ser Phe Thr Cys Leu 995 1000 1005 Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Ser Tyr Cys Gln Tyr Asp Val Asn 1010 1015 1020 Glu Cys Asp Ser Arg Pro Cys Leu His Gly Gly Thr Cys Gln Asp 1025 1030 1035 Ser Tyr Gly Thr Tyr Lys Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr Thr Gly 1040 1045 1050 Leu Asn Cys Gln Asn Leu Val Arg Trp Cys Asp Ser Ala Pro Cys 1055 1060 1065 Lys Asn Gly Gly Arg Cys Trp Gln Thr Asn Thr Gln Tyr His Cys 1070 1075 1080 Glu Cys Arg Ser Gly Trp Thr Gly Val Asn Cys Asp Val Leu Ser 1085 1090 1095 Val Ser Cys Glu Val Ala Ala Gln Lys Arg Gly Ile Asp Val Thr 1100 1105 1110 Leu Leu Cys Gln His Gly Gly Leu Cys Val Asp Glu Gly Asp Lys 1115 1120 1125 His Tyr Cys His Cys Gln Ala Gly Tyr Thr Gly Ser Tyr Cys Glu 1130 1135 1140 Asp Glu Val Asp Glu Cys Ser Pro Asn Pro Cys Gln Asn Gly Ala 1145 1150 1155 Thr Cys Thr Asp Tyr Leu Gly Gly Phe Ser Cys Lys Cys Val Ala 1160 1165 1170 Gly Tyr His Gly Ser Asn Cys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Cys Leu 1175 1180 1185 Ser Gln Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Ile Asp Leu Thr Asn 1190 1195 1200 Ser Tyr Lys Cys Ser Cys Pro Arg Gly Thr Gln Gly Val His Cys 1205 1210 1215 Glu Ile Asn Val Asp Asp Cys His Pro Pro Leu Asp Pro Ala Ser 1220 1225 1230 Arg Ser Pro Lys Cys Phe Asn Asn Gly Thr Cys Val Asp Gln Val 1235 1240 1245 Gly Gly Tyr Thr Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe Val Gly Glu Arg 1250 1255 1260 Cys Glu Gly Asp Val Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Asp Pro 1265 1270 1275 Arg Gly Thr Gln Asn Cys Val Gln Arg Val Asn Asp Phe His Cys 1280 1285 1290 Glu Cys Arg Ala Gly His Thr Gly Arg Arg Cys Glu Ser Val Ile 1295 1300 1305 Asn Gly Cys Arg Gly Lys Pro Cys Lys Asn Gly Gly Val Cys Ala 1310 1315 1320 Val Ala Ser Asn Thr Ala Arg Gly Phe Ile Cys Arg Cys Pro Ala 1325 1330 1335 Gly Phe Glu Gly Ala Thr Cys Glu Asn Asp Ala Arg Thr Cys Gly 1340 1345 1350 Ser Leu Arg Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ile Ser Gly Pro Arg 1355 1360 1365 Ser Pro Thr Cys Leu Cys Leu Gly Ser Phe Thr Gly Pro Glu Cys 1370 1375 1380 Gln Phe Pro Ala Ser Ser Pro Cys Val Gly Ser Asn Pro Cys Tyr 1385 1390 1395 Asn Gln Gly Thr Cys Glu Pro Thr Ser Glu Asn Pro Phe Tyr Arg 1400 1405 1410 Cys Leu Cys Pro Ala Lys Phe Asn Gly Leu Leu Cys His Ile Leu 1415 1420 1425 Asp Tyr Ser Phe Thr Gly Gly Ala Gly Arg Asp Ile Pro Pro Pro 1430 1435 1440 Gln Ile Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln Val Asp Ala 1445 1450 1455 Gly Asn Lys Val Cys Asn Leu Gln Cys Asn Asn His Ala Cys Gly 1460 1465 1470 Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp Pro Trp Lys 1475 1480 1485 Asn Cys Thr Gln Ser Leu Gln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser Asp Gly 1490 1495 1500 His Cys Asp Ser Gln Cys Asn Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp Gly 1505 1510 1515 Phe Asp Cys Gln Leu Thr Glu Gly Gln Cys Asn Pro Leu Tyr Asp 1520 1525 1530 Gln Tyr Cys Lys Asp His Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Gln Gly 1535 1540 1545 Cys Asn Ser Ala Glu Cys Glu Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala Glu 1550 1555 1560 His Val Pro Glu Arg Leu Ala Ala Gly Thr Leu Val Leu Val Val 1565 1570 1575 Leu Leu Pro Pro Asp Gln Leu Arg Asn Asn Ser Phe His Phe Leu 1580 1585 1590 Arg Glu Leu Ser His Val Leu His Thr Asn Val Val Phe Lys Arg 1595 1600 1605 Asp Ala Gln Gly Gln Gln Met Ile Phe Pro Tyr Tyr Gly His Glu 1610 1615 1620 Glu Glu Leu Arg Lys His Pro Ile Lys Arg Ser Thr Val Gly Trp 1625 1630 1635 Ala Thr Ser Ser Leu Leu Pro Gly Thr Ser Gly Gly Arg Gln Arg 1640 1645 1650 Arg Glu Leu Asp Pro Met Asp Ile Arg Gly Ser Ile Val Tyr Leu 1655 1660 1665 Glu Ile Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln Ser Ser Ser Gln Cys Phe 1670 1675 1680 Gln Ser Ala Thr Asp Val Ala Ala Phe Leu Gly Ala Leu Ala Ser 1685 1690 1695 Leu Gly Ser Leu Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Lys Ser 1700 1705 1710 Glu Pro Val Glu Pro Pro Leu Pro Ser Gln Leu His Leu Met Tyr 1715 1720 1725 Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly 1730 1735 1740 Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Gln His Gly Gln Leu Trp 1745 1750 1755 Phe Pro Glu Gly Phe Lys Val Ser Glu Ala Ser Lys Lys Lys Arg 1760 1765 1770 Arg Glu Pro Leu Gly Glu Asp Ser Val Gly Leu Lys Pro Leu Lys 1775 1780 1785 Asn Ala Ser Asp Gly Ala Leu Met Asp Asp Asn Gln Asn Glu Trp 1790 1795 1800 Gly Asp Glu Asp Leu Glu Thr Lys Lys Phe Arg Phe Glu Glu Pro 1805 1810 1815 Val Val Leu Pro Asp Leu Ser Asp Gln Thr Asp His Arg Gln Trp 1820 1825 1830 Thr Gln Gln His Leu Asp Ala Ala Asp Leu Arg Met Ser Ala Met 1835 1840 1845 Ala Pro Thr Pro Pro Gln Gly Glu Val Asp Ala Asp Cys Met Asp 1850 1855 1860 Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Phe Thr Pro Leu Met Ile Ala 1865 1870 1875 Ser Cys Ser Gly Gly Gly Leu Glu Thr Gly Asn Ser Glu Glu Glu 1880 1885 1890 Glu Asp Ala Pro Ala Val Ile Ser Asp Phe Ile Tyr Gln Gly Ala 1895 1900 1905 Ser Leu His Asn Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala Leu His 1910 1915 1920 Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu 1925 1930 1935 Glu Ala Ser Ala Asp Ala Asn Ile Gln Asp Asn Met Gly Arg Thr 1940 1945 1950 Pro Leu His Ala Ala Val Ser Ala Asp Ala Gln Gly Val Phe Gln 1955 1960 1965 Ile Leu Leu Arg Asn Arg Ala Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met His 1970 1975 1980 Asp Gly Thr Thr Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu 1985 1990 1995 Gly Met Leu Glu Asp Leu Ile Asn Ser His Ala Asp Val Asn Ala 2000 2005 2010 Val Asp Asp Leu Gly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val 2015 2020 2025 Asn Asn Val Asp Ala Ala Val Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asn 2030 2035 2040 Lys Asp Met Gln Asn Asn Lys Glu Glu Thr Pro Leu Phe Leu Ala 2045 2050 2055 Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Thr Ala Lys Val Leu Leu Asp His 2060 2065 2070 Phe Ala Asn Arg Asp Ile Thr Asp His Met Asp Arg Leu Pro Arg 2075 2080 2085 Asp Ile Ala Gln Glu Arg Met His His Asp Ile Val Arg Leu Leu 2090 2095 2100 Asp Glu Tyr Asn Leu Val Arg Ser Pro Gln Leu His Gly Thr Ala 2105 2110 2115 Leu Gly Gly Thr Pro Thr Leu Ser Pro Thr Leu Cys Ser Pro Asn 2120 2125 2130 Gly Tyr Leu Gly Asn Leu Lys Ser Ala Thr Gln Gly Lys Lys Ala 2135 2140 2145 Arg Lys Pro Ser Thr Lys Gly Leu Ala Cys Gly Ser Lys Glu Ala 2150 2155 2160 Lys Asp Leu Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ser Gln Asp Gly Lys Gly 2165 2170 2175 Cys Leu Leu Asp Ser Ser Ser Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu 2180 2185 2190 Glu Ser Pro His Gly Tyr Leu Ser Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu 2195 2200 2205 Leu Pro Ser Pro Phe Gln Gln Ser Pro Ser Met Pro Leu Ser His 2210 2215 2220 Leu Pro Gly Met Pro Asp Thr His Leu Gly Ile Ser His Leu Asn 2225 2230 2235 Val Ala Ala Lys Pro Glu Met Ala Ala Leu Ala Gly Gly Ser Arg 2240 2245 2250 Leu Ala Phe Glu Pro Pro Pro Pro Arg Leu Ser His Leu Pro Val 2255 2260 2265 Ala Ser Ser Ala Ser Thr Val Leu Ser Thr Asn Gly Thr Gly Ala 2270 2275 2280 Met Asn Phe Thr Val Gly Ala Pro Ala Ser Leu Asn Gly Gln Cys 2285 2290 2295 Glu Trp Leu Pro Arg Leu Gln Asn Gly Met Val Pro Ser Gln Tyr 2300 2305 2310 Asn Pro Leu Arg Pro Gly Val Thr Pro Gly Thr Leu Ser Thr Gln 2315 2320 2325 Ala Ala Gly Leu Gln His Ser Met Met Gly Pro Leu His Ser Ser 2330 2335 2340 Leu Ser Thr Asn Thr Leu Ser Pro Ile Ile Tyr Gln Gly Leu Pro 2345 2350 2355 Asn Thr Arg Leu Ala Thr Gln Pro His Leu Val Gln Thr Gln Gln 2360 2365 2370 Val Gln Pro Gln Asn Leu Gln Leu Gln Pro Gln Asn Leu Gln Pro 2375 2380 2385 Pro Ser Gln Pro His Leu Ser Val Ser Ser Ala Ala Asn Gly His 2390 2395 2400 Leu Gly Arg Ser Phe Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gln Ala Asp Val 2405 2410 2415 Gln Pro Leu Gly Pro Ser Ser Leu Pro Val His Thr Ile Leu Pro 2420 2425 2430 Gln Glu Ser Gln Ala Leu Pro Thr Ser Leu Pro Ser Ser Met Val 2435 2440 2445 Pro Pro Met Thr Thr Thr Gln Phe Leu Thr Pro Pro Ser Gln His 2450 2455 2460 Ser Tyr Ser Ser Ser Pro Val Asp Asn Thr Pro Ser His Gln Leu 2465 2470 2475 Gln Val Pro Glu His Pro Phe Leu Thr Pro Ser Pro Glu Ser Pro 2480 2485 2490 Asp Gln Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Asn Ile Ser Asp Trp 2495 2500 2505 Ser Glu Gly Ile Ser Ser Pro Pro Thr Thr Met Pro Ser Gln Ile 2510 2515 2520 Thr His Ile Pro Glu Ala Phe Lys 2525 2530 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Met Pro Arg Leu Leu Thr Pro Leu Leu Cys Leu Thr Leu Leu Pro Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Gly Leu Arg 20

Claims

4,4,4-트리플루오로-N-((2S)-1-((9-메톡시-3,3-디메틸-5-옥소-2,3,5,6-테트라히드로-1H-벤조[f]피롤로[1,2-a]아제핀-6-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)부탄아미드인 하기 구조:

의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염.
N-((2S)-1-((8,8-디메틸-6-옥소-6,8,9,10-테트라히드로-5H-피리도[3,2-f]피롤로[1,2-a]아제핀-5-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-4,4,4-트리플루오로부탄아미드인 하기 구조:

의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염.
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제1항 또는 제2항의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, T-세포 급성 림프모구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프모구성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 적백혈병, 삼중 음성 유방암, 유방암, 난소암, 흑색종, 폐암, 비소세포 폐암, 췌장암, 교모세포종, 결장직장암, 두경부암, 자궁경부암, 전립선암, 간암, 경구 편평 세포 암종, 피부암, 수모세포종, 혈관육종, 횡문근육종, 지방육종, 악성 섬유성 조직구종, 간세포성 암종, 간내 또는 간외 담관암종, 또는 선양 낭성 암종의 치료를 위한 제약 조성물.
제4항에 있어서, 폐암의 치료를 위한 제약 조성물.
제1항 또는 제2항의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 청각 유모 세포 손실에 의해 유발된 감각신경성 청각 상실의 치료를 위한 제약 조성물.
제1항 또는 제2항의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 청각 유모 세포 생성을 유도하기 위한 제약 조성물.
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