JP2022525293A

JP2022525293A - 貧血の処置におけるムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプ４アンタゴニスト

Info

Publication number: JP2022525293A
Application number: JP2021553300A
Authority: JP
Inventors: アベド，ユーセフアル; リンボジャン，
Original assignee: コールドスプリングハーバーラボラトリー; ザファインスタインインスティチューツフォーメディカルリサーチ
Priority date: 2019-03-25
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2022-05-12
Also published as: SG11202109857UA; KR20210144697A; EP3946321A1; WO2020198054A1; BR112021019189A2; MX2021011588A; US20220185821A1; CA3132381A1; IL286617A; AU2020247812A1; CN113613650A; EP3946321A4

Abstract

本開示は、貧血の処置に一般に関する。より詳細には、本開示は、赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ－Ｅ）細胞の自己複製を促進して貧血を処置する、ムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプ４アンタゴニスト、例えば、低分子化合物の使用に関する。別の態様では、本開示は、ムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプ４（Ｍ４）活性から生じる疾患または状態の被験体における処置することであって、方法は、薬学的有効量のＭ４特異的アンタゴニストを被験体に投与するステップを含み、このＭ４特異的アンタゴニストが、上記のＭ４特異的アンタゴニスト化合物のいずれか１つである、ことを対象とする。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月２５日に出願された米国特許仮出願第６２／８２３，２１４号の利益を主張し、この内容のすべてを参照により本明細書に組み込む。

連邦支援による研究に関する記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により付与されたＨＬ１２７５２２の下、政府支援によりなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

本開示の分野
本開示は、ムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプ４（Ｍ４）活性から生じる疾患および状態の処置に一般に関する。より詳細には、本開示は、赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ－Ｅ）細胞の自己複製を促進して貧血を処置する、低分子Ｍ４アンタゴニスト化合物の使用に関する。

背景技術
多くの成体系列の幹細胞および前駆細胞は、組織恒常性、維持および再生の重大な側面である自己複製を経る（North T.E. et al., Nature 447:1007-1011 (2007)；He S. et al., Annu Rev Cell Dev Biol 25:377-406 (2009)；Simons B.D. et al., Cell 145:851-862 (2011)；Seita J. et al., Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med 2:640-653 (2010)；Xu Y. et al., Nature 453:338-344 (2008)；Sun J. et al., Nature 514:322-347 (2014)；Sharpless N.E. et al., Nat Rev Mol Cell Biol 8:703-713 (2007)；Rossi D.J. et al., Cell 132:681-696 (2008)）。造血系では、赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ－Ｅ）は、第１の系列判定赤芽球前駆細胞であり、自己複製を経て数千の赤血球を生成する実質的可能性を有する。ＢＦＵ－Ｅは、分化を経て、後期赤芽球前駆細胞であるコロニー形成単位赤芽球（ＣＦＵ－Ｅ）の形成を生じ、このＣＦＵ－Ｅは、３～４個に限られた細胞分裂を経た後に赤血球を形成する（Zhang L. et al., Genes Dev 25:119-124 (2011)）。ＣＦＵ－Ｅの生存および分化は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）により主に調節されており、ＢＦＵ－Ｅの自己複製および分化の制御は、あまり解明されていない。ＥＰＯは、慢性腎臓疾患に見られるような、ＥＰＯ産生の異常により生じる貧血の処置に主に使用される。しかし、多くの貧血患者は、ＥＰＯ処置に対する応答に十分なＢＦＵ－Ｅ、および引き続いて十分なＣＦＵ－Ｅを有しない（Flygare J. et al., Blood 117:3435-3444 (2011)；Zhang L. et al., Nature 499:92-96 (2013)；Sankaran V.G. et al., Nat Med 21:221-230 (2015)；Bauer et al., Genes Dev 13:2996-3002 (1999)；Komrokji R.S. et al., Curr Hematol Malig Rep 6:145-153 (2011)；Kotla V. et al., J Hematol Onco. 2:36 (2009)）。このようなＥＰＯ抵抗性貧血を処置するために、ＢＦＵ－Ｅ自己複製の根底にある分子機構のより良い理解が必要とされている。これまでの報告では、化合物ＰＤ１０２８０７が、ムスカリン性アセチルコリン受容体ファミリーの他のメンバーよりもＣＨＲＭ４を選択的に阻害することが示されている（C. H. Croy et al., Characterization of PCS1055, a novel muscarinic M4 receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol 782, 70-76, 2016；T. M. Boehme et al., Synthesis and pharmacology of benzoxazines as highly selective antagonists at M(4) muscarinic receptors. J Med. Chem 45, 3094-3102, 2002）。

North T.E. et al., Nature 447:1007-1011 (2007) He S. et al., Annu Rev Cell Dev Biol 25:377-406 (2009) Simons B.D. et al., Cell 145:851-862 (2011) Seita J. et al., Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med 2:640-653 (2010) Xu Y. et al., Nature 453:338-344 (2008) Sun J. et al., Nature 514:322-347 (2014) Sharpless N.E. et al., Nat Rev Mol Cell Biol 8:703-713 (2007) Rossi D.J. et al., Cell 132:681-696 (2008) Zhang L. et al., Genes Dev 25:119-124 (2011) Flygare J. et al., Blood 117:3435-3444 (2011) Zhang L. et al., Nature 499:92-96 (2013) Sankaran V.G. et al., Nat Med 21:221-230 (2015) Bauer et al., Genes Dev 13:2996-3002 (1999) Komrokji R.S. et al., Curr Hematol Malig Rep 6:145-153 (2011) Kotla V. et al., J Hematol Onco. 2:36 (2009) C. H. Croy et al., Characterization of PCS1055, a novel muscarinic M4 receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol 782, 70-76, 2016 T. M. Boehme et al., Synthesis and pharmacology of benzoxazines as highly selective antagonists at M(4) muscarinic receptors. J Med. Chem 45, 3094-3102, 2002

本開示の概要
一態様では、本開示は、ムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプ４（Ｍ４）アンタゴニストとして機能する化合物を対象とする。Ｍ４アンタゴニスト化合物は、他のムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプ（例えば、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３および／またはＭ５）と比較してＭ４に対して、少なくともある程度、好ましくは、選択的（すなわち、特異的）である。Ｍ４特異的アンタゴニストの有効性は、Ｍ４のオルソステリックポケットに結合する能力のおかげで生じると考えられている。また、Ｍ４アンタゴニスト化合物では、当技術分野の他のＭ４アンタゴニスト化合物、例えば、ＰＤ１０２８０７と比較して、血液脳関門への浸透が、好ましくは、低下する。
実施形態の第１のセットでは、Ｍ４アンタゴニスト化合物は、次の構造：

を有し、式中、Ｒ^１は、ＨまたはＣＨ_３であり、Ｒ^２は、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨ、ＳＣＨ_３および次の構造（１－１）：

から独立的に選択されるが、ただし、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５の１つまたは２つは、式（１－１）の構造であり、Ｒ^６は、ＨまたはＣＨ_３であり、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９は、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択され、式（１）の化合物は、式（１）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む。

特定の実施形態では、式（１）の化合物は、次の構造：

を有し、式中、上に示す式におけるＲ基は、上または下に定義するものであり、提供する特定の選択のいずれかを含む。

また、式（１）の化合物は、次の構造：

を有するメチル化塩であってもよく、式中、Ｒ^１は、ＨまたはＣＨ_３であり、Ｒ^２は、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨ、ＳＣＨ_３および次の構造（１－２）：

から独立的に選択されるが、ただし、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５の１つまたは２つは、式（１－２）の構造であり、Ｒ^６は、ＨまたはＣＨ_３であり、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９は、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択され、Ｘ^－は、化合物の正荷電部分を均衡させるアニオンであり、式（１ｃ）の化合物は、式（１ｃ）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む。

特定の実施形態では、式（１ｃ）のメチル化塩化合物は、次の構造：

のいずれかを有し、式中、上に示す式におけるＲ基およびＸ^－は、上または下に定義するものであり、提供する特定の選択のいずれかを含む。

実施形態の第２のセットでは、Ｍ４アンタゴニスト化合物は、次の構造：

を有し、式中、Ｒ^２は、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９は、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択され、式（２）の化合物は、式（２）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む。

特定の実施形態では、式（２）の化合物は、次の構造：

を有し、式中、Ｒ^２は、上または下に定義するものであり、提供する特定の選択のいずれかを含む。

実施形態の第３のセットでは、Ｍ４アンタゴニスト化合物は、次の構造：

を有し、式中、Ｒ^１は、ＨまたはＣＨ_３であり、Ｒ^２は、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９は、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択され、式（２ｂ）の化合物は、式（２ｂ）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む。

特定の実施形態では、式（２ｂ）の化合物は、次の構造：

を有し、式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＸ^－は、上または下に定義するものであり、提供する特定の選択のいずれかを含む。

別の態様では、本開示は、ムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプ４（Ｍ４）活性から生じる疾患または状態の被験体における処置することであって、方法は、薬学的有効量のＭ４特異的アンタゴニストを被験体に投与するステップを含み、このＭ４特異的アンタゴニストが、上記のＭ４特異的アンタゴニスト化合物のいずれか１つである、ことを対象とする。特定の実施形態では、処置する疾患または状態は、貧血である。一部の実施形態では、貧血は、溶血、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、老化、外科手術、化学療法または放射線療法と関連する。一部の実施形態では、Ｍ４アンタゴニストは、被験体に経口的に投与される。本開示の他の態様は、上記のＭ４特異的アンタゴニストのいずれかの１つまたは１つより多くを含む医薬組成物、ならびにＭ４活性から生じる疾患または状態、例えば、貧血を被験体において処置するための医薬の調製における、このようなＭ４特異的アンタゴニストのいずれか１つまたは１つより多くの使用を対象とする。

別の態様では、本開示は、赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ－Ｅ）細胞の自己複製を促進するための方法であって、方法が、ＢＦＵ－Ｅ細胞をＭ４特異的アンタゴニストと接触させるステップを含む、方法を対象とする。ＢＦＵ－Ｅ細胞は、例えば、Ｍ４特異的アンタゴニストと接触させるときに、生体（例えば、ヒト）被験体内に存在し得るか、またはＢＦＵ－Ｅ細胞は、被験体から採取されて、Ｍ４特異的アンタゴニストとｅｘｖｉｖｏで接触させられ得る。Ｍ４特異的アンタゴニストは、本明細書に記載するＭ４特異的アンタゴニストのいずれかを含み得る。特定の実施形態では、ＢＦＵ－Ｅ細胞の自己複製の増加を利用して、被験体における貧血を処置する。

図１Ａ～１Ｅ。ムスカリン性アセチルコリン受容体アンタゴニストにより、ＢＦＵ－Ｅ自己複製の制御によって赤血球の産生が増加する。１Ａ、臭化オキシフェノニウム（ＯＢ）の化学構造を示す模式図。１Ｂ、１００μＭの臭化オキシフェノニウムの有無によりマウスＢＦＵ－Ｅを培養し、培養系における細胞数を計数した；非処理よりもＯＢで処理した培養物において細胞増殖倍率が有意に高かった。３回の反復の平均および標準偏差（ＳＴＤＥＶ）を示す。１Ｃ、１４日目の培養細胞を抗Ｔｅｒ１１９抗体で染色し、フローサイトメトリーにより解析した。３回の反復のＴｅｒ１１９＋細胞のパーセンテージの平均およびＳＴＤＥＶを示す；ＯＢで処理または非処理の培養物におけるＴｅｒ１１９＋細胞のパーセンテージの差は存在しなかった。１Ｄ、６日目の培養細胞をメチルセルロース培地上に播種した。播種から９日後にＢＦＵ－Ｅコロニーを計数した。３回の反復の平均およびＳＴＤＥＶを示す；非処理よりもＯＢで処理した培養物から有意により多くのＢＦＵ－Ｅコロニーが生じた。１Ｅ、ヒトＣＤ３４＋細胞を、臭化オキシフェノニウム（２００μＭ）の有無により培養し、培養系における細胞数を計数した。３回の反復の平均およびＳＴＤＥＶを示す；非処理よりもＯＢにより処理した培養物において増殖倍率が有意に高かった。「ＮＳ」は統計学的有意差なしを表し、「^＊」はｔ検定によるｐ＜０．０５を表し、「^＊＊」はｔ検定によるｐ＜０．０１を表す。

図２Ａ～２Ｄ。ＣＨＲＭ４によりＢＦＵ－Ｅ自己複製が負に制御される。図２Ａ：Ｃｈｒｍ１、Ｃｈｒｍ２、Ｃｈｒｍ３、Ｃｈｒｍ４およびＣｈｒｍ５を含むムスカリン性アセチルコリン受容体ファミリーメンバーの、ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｅおよび赤芽球の段階における発現レベルをＲＮＡ－Ｓｅｑを使用して測定した。ＲＰＫＭ値を示す。図２Ｂ：対照ウイルスまたはＣｈｒｍ４を標的とするｓｈＲＮＡをコードするウイルスのいずれかをＢＦＵ－Ｅに感染させた。０日目～９日目に培養系におけるＧＦＰ＋細胞数を計数した。３回の反復の平均および標準偏差（ＳＴＤＥＶ）を示す；ＧＦＰ＋対照ウイルスｓｈＲＮＡ感染細胞よりもＧＦＰ＋Ｃｈｒｍ４ウイルスｓｈＲＮＡ感染細胞において細胞増殖倍率が有意に高かった。図２Ｃ：培養から３日目に、対照ウイルスまたはＣｈｒｍ４を標的とするｓｈＲＮＡをコードするウイルスのいずれかを感染させたＢＦＵ－ＥにおけるＣｈｒｍ４の発現レベルを、ウエスタンブロットを使用して測定した。３回の反復の平均および標準偏差（ＳＴＤＥＶ）を示す；Ｃｈｒｍ４の発現は、Ｃｈｒｍ４を標的とするｓｈＲＮＡによる処理後に有意に減少する。図２Ｄ：対照ウイルスまたはＣｈｒｍ４を標的とするｓｈＲＮＡをコードするウイルスのいずれかをＢＦＵ－Ｅに感染させた。ＧＦＰ＋細胞を分類してＢＦＵ－Ｅコロニー形成アッセイを行った。４回の反復の平均およびＳＴＤＥＶを示す；ＧＦＰ＋対照ウイルスｓｈＲＮＡ感染細胞よりもＧＦＰ＋Ｃｈｒｍ４ウイルスｓｈＲＮＡ感染細胞においてＢＦＵ－Ｅコロニー形成倍率が有意に高かった。「^＊」はｔ検定によるｐ＜０．０５を表し、「^＊＊」はｐ＜０．０１を表し、「^＊＊＊」はｔ検定によるｐ＜０．００１を表す。

図３Ａ～３Ｄ。ＣＨＲＭ４経路により、ＢＦＵ－Ｅの前駆状態の維持に重要な遺伝子が制御されることを示す図である。図３Ａ：１００μＭのフォルスコリンの非存在または存在下でマウスＢＦＵ－Ｅを培養した。１０日目に、培養系における細胞の全数を計数した。３回の反復の細胞増殖倍率の平均およびＳＴＤＥＶを示す；非処理よりもｃＡＭＰ活性化物質であるフォルスコリンで処理した培養物において細胞増殖倍率が有意に高かった。図３Ｂ：マウスＢＦＵ－Ｅを指示化合物（３ｎＭのＰＤ１０２８０７および５μＭのＫＴ５７２０）とともに培養した。９日目に、培養系における細胞の全数を計数した。３回の反復の細胞増殖倍率の平均およびＳＴＤＥＶを示す；非処理よりもＰＫＡ阻害物質であるＫＴ５７２０で処理した培養物において細胞増殖倍率が有意に低下した。図３Ｃ：ｘ軸は、ｌｏｇ２比として算出した、ＣＦＵ－ＥのＢＦＵ－Ｅに対する各遺伝子発現の比率を表す。ｙ軸は、累積率を表し、相対発現（ｘ軸）の関数としてプロットする。「ＣＲＥＢ標的」は、ＣｈＩＰ－Ｓｅｑにより同定されたＢＦＵ－ＥにおけるＣＲＥＢの直接標的遺伝子を表す。「ＺＦＰ３６Ｌ２標的」は、これまでに報告されているように（Zhang L. et al., Nature 499:92-96 (2013)）ＲＩＰ－ＣｈＩＰにより同定されたＢＦＵ－ＥにおけるＺＦＰ３６Ｌ２の直接標的遺伝子を表す。「すべての遺伝子」は、これまでに報告されているように（Zhang L. et al.、上記参照）ＢＦＵ－Ｅにおいて発現する遺伝子のすべてを表す。Ｐ値は、コルモゴロフ・スミルノフ検定を使用して算出した。図３Ｄ：１００μＭの臭化オキシフェノニウムの非存在または存在下でマウスＢＦＵ－Ｅを培養し、培養３日目の細胞に対してＲＮＡ－Ｓｅｑを実施した。１００μＭの臭化オキシフェノニウムによる４５分間の培養後にＢＦＵ－Ｅに対してＣＲＥＢＣｈＩＰ－Ｓｅｑを実施した。ＲＮＡ－Ｓｅｑ結果およびＣＲＥＢＣｈＩＰ－Ｓｅｑ結果を複合させてＢＥＴＡ解析を行った（Wang S. et al., Nat Protoc 8:2502-2515 (2013)）。「^＊」はｐ＜０．０５を表し、「^＊＊」はｔ検定によるｐ＜０．０１を表す。

図４Ａ～４Ｅ。化合物ＰＤ１０２８０７によりＢＦＵ－Ｅ自己複製が促進され、ｉｎｖｉｖｏにおいて貧血が矯正される。図４Ａ：ＰＤ１０２８０７の化学構造。図４Ｂ：３ｎＭのＰＤ１０２８０７の有無によりマウスＢＦＵ－Ｅを培養し、培養系における細胞数を計数した。９回の反復の平均および標準偏差（ＳＴＤＥＶ）を示す；非処理よりもＯＢで処理した培養物においてＢＦＵ－Ｅの増殖倍率が有意に高かった。「^＊＊＊」はｐ＜０．００１を表す。図４Ｃ：ＤＭＳＯまたは１００ｍｇ／ｋｇのＰＤ１０２８０７を経口送達により１日１回マウスに処置した。マウスにＰＨＺを注射して、溶血性貧血を誘導した。６日目にＣＢＣを実施した。ＨＣＴの平均およびＳＴＤＥＶを示す；ＰＨＺにより誘導された貧血は、ＤＭＳＯ対照よりもＰＤ１０２８０７を処置したマウスにおいて有意に改善した。図４Ｄ：ＲＢＣの平均およびＳＴＤＥＶを示す；ＰＨＺにより誘導された貧血が、ＤＭＳＯ対照よりもＰＤ１０２８０７を処置したマウスにおいて有意に改善した。「^＊＊」はｐ＜０．０１を表す。図４Ｅ：１×１０^－９Ｍ、１×１０^－８Ｍ、１×１０^－７Ｍ、１×１０^－６Ｍおよび１×１０^－５Ｍの濃度のＰＤ１０２８０７を、放射性リガンドおよび受容体を有する細胞膜を用いた標準的結合アッセイにおいて試験した。化合物の結合は、各標的に特異的な放射活性標識リガンドの結合の阻害パーセントとして算出し、Ｋｉ値を決定した。ＰＤ１０２８０７は、Ｍ４受容体の指示する選択性／特異性をＭ１、Ｍ２、Ｍ３またはＭ５受容体に対して有する。

図５。化合物Ａ～Ｋと名付けた一連のＭ４アンタゴニスト化合物の構造。

図６。受容体ＣＨＲＭ１～５（Ｍ１～Ｍ５）に対するＰＤ１０２８０７および化合物Ａ～Ｋについての受容体結合アッセイの結果を示す。

図７および図８。初代マウスＢＦＵ－Ｅ培養アッセイの結果。図７は、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、ＨおよびＩについての結果を示し、図８は、化合物Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＪおよびＫについての結果を示す。マウス初代細胞ＢＦＵ－Ｅ培養アッセイの結果は、化合物Ａ～Ｋが、ＢＦＵ－Ｅ増殖の刺激においてＰＤとほぼ同等に強力であることを示す；すべての化合物が、低ナノモル濃度範囲において有効であり、化合物ＢおよびＦにおいて、有効性が他よりもわずかに劣った。図７および図８。初代マウスＢＦＵ－Ｅ培養アッセイの結果。図７は、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、ＨおよびＩについての結果を示し、一方で図８は、化合物Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＪおよびＫについての結果を示す。マウス初代細胞ＢＦＵ－Ｅ培養アッセイの結果は、化合物Ａ～Ｋが、ＢＦＵ－Ｅ増殖の刺激においてＰＤとほぼ同等に強力であることを示す；すべての化合物が、低ナノモル濃度範囲において有効であり、化合物ＢおよびＦにおいて、有効性が他よりもわずかに劣った。

図９。ＰＤ１０２８０７ならびに化合物ＡおよびＢの薬物動態プロファイル（血漿）および脳浸透アッセイ。濃度は、上パネルに示し、濃度比（血漿／脳）は、下パネルに示す。

図１０。化合物Ａ（上パネル）および化合物Ｂ（下パネル）についてのｉｎｖｉｖｏでの貧血動物モデル有効性アッセイにおける化合物の結果。

図１１。を化合物Ｂ（上パネル）および化合物Ｉ（下パネル）についてのｉｎｖｉｖｏでの貧血動物モデル有効性アッセイにおける化合物の結果。

図１２。化合物Ｇの薬物動態プロファイル（血漿）および脳浸透アッセイ。濃度のプロットは、上パネルに示し、濃度比（血漿／脳）のプロットは、下パネルに示す。

詳細な説明
ムスカリン性アセチルコリン受容体ＣＨＲＭ４経路がＢＦＵ－Ｅ自己複製の重要な制御因子であることが、本発明に従って本明細書において見出された。ムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプ４アンタゴニストにより、ＢＦＵ－Ｅの自己複製および増殖が促進され、溶血、ＭＤＳおよび老化マウスモデルにおいて貧血が改善されることが本明細書において実証された。したがって、貧血の処置のための治療法におけるＭ４特異的アンタゴニストの使用を本明細書において提供する。

ムスカリン性アセチルコリン受容体

ムスカリン性アセチルコリン受容体は、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーのメンバーであり、すなわち、このような受容体は、リガンド（アセチルコリン）の結合時に細胞膜においてＧタンパク質受容体複合体を形成し、これにより下流のシグナル伝達が引き起こされる。ムスカリン性受容体の５つのサブタイプが同定されており、Ｍ１～Ｍ５と名付けられている（例えば、Felder et al., FASEB J.: Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 9, 619-625 (1995)を参照）。Ｍ１、Ｍ３およびＭ５受容体はＧｑ／Ｇ１１型Ｇタンパク質に主に共役し、Ｇタンパク質受容体複合体のこの形成によりジアシルグリセロールの形成が生じ、これによりプロテインキナーゼＣが活性化されてイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の放出が増加し、遊離の細胞内Ｃａ２＋の放出が生じる。Ｍ２およびＭ４受容体はＧｉ／Ｇｏ型Ｇタンパク質に主に共役し、ｃＡＭＰ産生において阻害的役割を果たす（Felder et al. (1995)、上記参照）。

ムスカリン性アセチルコリン受容体は、細胞内および細胞外ループが交互に入れ替わることにより結合する７つの膜貫通ドメインを含む。Ｍ１～Ｍ５受容体サブタイプは、高度な配列同一性を相互間で呈するが、研究では、オルソステリックポケットの形状における構造的差異（Bonner et al., Science 237: 527-532 (1987)；Caulfield et al., Pharmacol. Rev. 50: 279-290 (1998)；およびHulme et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 30: 633-673 (1990)）ならびにアゴニストまたはアンタゴニストの結合における薬理学的差異（Bohme et al., J. Med. Chem. 45: 3094-3102 (2002)；およびCroy et al., Europ. J. Pharmacol 782: 70-76 (2016)）が明らかとなっている。このような構造的および薬理学的差異と一致して、サブタイプ特異的アンタゴニストが開発および立証されている。

Ｍ４特異的アンタゴニスト

ムスカリン性アセチルコリン受容体の「アンタゴニスト」という用語は、本明細書において使用する場合、ムスカリン性アセチルコリン受容体に結合し得るが、下流のシグナル伝達（例えば、Ｇタンパク質の共役および／または活性化）を引き起こさない化合物を指す。したがって、ムスカリン性アセチルコリン受容体のアンタゴニストは、受容体への結合において天然リガンドであるアセチルコリンと競合することにより、受容体へのアセチルコリンの結合に対して干渉、遮断またはさもなければ予防して、ムスカリン性アセチルコリン受容体の生物学的活性を阻害する。一部の実施形態では、ムスカリン性アセチルコリン受容体の生物学的活性の阻害は、Ｇタンパク質活性化の阻害に反映される。Ｇタンパク質活性化は、例えば、Croy et al., Eur. J. Pharmacol. 782: 70-76 (2016)により記載されるように、Ｇαサブユニットに結合する非加水分解性ＧＴＰ－γ－［^３５Ｓ］の量によって測定することができる。

「Ｍ４特異的」アンタゴニストという用語は、他のムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプ、すなわち、Ｍ１～Ｍ３およびＭ５よりも、Ｍ４への結合に対する優先性を呈するアンタゴニストを指す。一部の実施形態では、Ｍ４への結合における優先性は、他の受容体サブタイプよりも高い、Ｍ４への親和性に反映される。特定の実施形態では、Ｍ４特異的アンタゴニストは、他の受容体サブタイプ（例えば、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３および／またはＭ５）の１つまたは１つより多くへの親和性よりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％高い、Ｍ４への親和性を有し、この場合、「１００％高い」は、比較する親和性よりも１倍より高いか、またはこの２倍であることに等しい。一部の実施形態では、Ｍ４特異的アンタゴニストは、他の受容体サブタイプの１つまたは１つより多くへの親和性よりも少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００倍またはこれより高いＭ４への親和性を有する。

「選択性」という用語は、本明細書において使用する場合、一方の受容体サブタイプに対する、他方の受容体サブタイプよりも高いアンタゴニストの親和性を指す。選択性は、比較する受容体の結合親和性の比率に基づいて判定することができる。例えば、Ｍ４およびＭ２の間のアンタゴニストの選択性は、Ｍ４への結合親和性の、Ｍ２への結合親和性に対する比率により測定する。別の例として、Ｍ４およびＭ３の間のアンタゴニストの選択性は、Ｍ４への結合親和性の、Ｍ３への結合親和性に対する比率により測定する。また、Ｋｉが結合親和性と逆相関するため、選択性は、Ｍ２またはＭ３のＫｉの、Ｍ４のＫｉに対する比率に基づいて判定することができ、この場合、比率が１を超えると、Ｍ２またはＭ３よりも、Ｍ４に対して優先性を有することを意味する。特定の実施形態では、Ｍ４特異的アンタゴニストの選択性は、他の受容体サブタイプの１つまたは１つより多くに対して少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍である。

ムスカリン性アセチルコリン受容体に対する化合物の結合親和性を測定するための方法は、例えば、トランスフェクトＣＨＯ細胞由来の膜を使用する［３Ｈ］ＮＭＳ結合により当技術分野において考証されている。Bohme et al.（J. Med. Chem 2002, 45: 3094-3192）、Dorje et al.（J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991, 256: 727-733）およびBuckley et al.（Mol. Pharmacol. 1989, 35: 469-476）を参照されたい。試験化合物のＫｉ値（すなわち、平衡解離定数）は、Ｃｈｅｎｇ－Ｐｒｕｓｏｆｆの式、Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｌ／Ｋｄ）を使用してＩＣ５０値から得る。Ｋｉ値が低いほど親和性は高くなる。対照的に、ｐＫｉはＫｉの負の対数であるため、ｐＫｉ値が高いほど親和性は高くなる。

一部の実施形態では、Ｍ４特異的アンタゴニストは、Ｍ４への結合について６．０、６．２５、６．５、６．７５、７．０、７．２５、７．５、７．７５、８．０、８．２５、８．５、８．７５、９．０またはこれより高いｐＫｉ値を有する。一部の実施形態では、Ｍ４特異的アンタゴニストは、Ｍ４について、６．０、６．２５、６．５、６．７５、７．０、７．２５、７．５、７．７５、８．０、８．２５、８．５、８．７５、９．０またはこれより高いｐＫｉ値、および少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍の選択性を、他の受容体サブタイプの１つまたは１つより多くに対して有する。

実施形態の１セットでは、Ｍ４アンタゴニスト化合物は、次の構造：

を有する。

上記の式（１）では、変数Ｒ^１およびＲ^６は、水素原子（Ｈ）およびメチル（ＣＨ_３）から独立的に選択され（すなわち、それぞれは、ＨまたはＣＨ_３のいずれか）、変数Ｒ^２は、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり（例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ビニルまたはプロペン－２－イル）、変数Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、水素原子、ハロゲン原子（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨ、ＳＣＨ_３および次の構造（１－１）：

から独立的に選択されるが、ただし、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５の１つまたは２つは、式（１－１）の構造である。一部の実施形態では、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうちの１つは、式（１－１）の構造である。他の実施形態では、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうちの２つ（例えば、Ｒ^３およびＲ^４、またはＲ^３およびＲ^５、またはＲ^４およびＲ^５）は、式（１－１）の構造である。式（１－１）における変数Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９は、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択される。Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうちの２つが式（１－１）の構造である場合、式（１－１）におけるＲ^７、Ｒ^８およびＲ^９は、式（１－１）の２つの場合の間で同一であるか、または異なり得る（すなわち、独立的に選択される）。また、式（１）は、式（１）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む。

式（１）の実施形態の第１のセットでは、Ｒ^１がＨであり、Ｒ^２が、メチル、エチル、ｎ－プロピルもしくはイソプロピルであるか、またはＲ^１がＨであり、Ｒ^２が、メチルもしくはエチルであるか、またはＲ^１がＨであり、Ｒ^２がエチルである。式（１）の実施形態の第２のセットでは、Ｒ^１がメチルであり、Ｒ^２が、メチル、エチル、ｎ－プロピルもしくはイソプロピルであるか、またはＲ^１がメチルであり、Ｒ^２が、メチルもしくはエチルであるか、またはＲ^１がメチルであり、Ｒ^２がエチルである。式（１）の実施形態の第３のセットでは、少なくともＲ^３もしくはＲ^３のみが、式（１－１）であり、Ｒ^４および／もしくはＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^３が式（１－１）であり、Ｒ^４および／もしくはＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３およびＣＦ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^３が式（１－１）であり、Ｒ^４およびＲ^５の１つもしくは両方が、水素原子である。式（１）の実施形態の第４のセットでは、少なくともＲ^４もしくはＲ^４のみが、式（１－１）であり、Ｒ^３および／もしくはＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^４が式（１－１）であり、Ｒ^３および／もしくはＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３およびＣＦ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^４が式（１－１）であり、Ｒ^３およびＲ^５の１つもしくは両方が、水素原子である。式（１）の実施形態の第５のセットでは、少なくともＲ^５もしくはＲ^５のみが、式（１－１）であり、Ｒ^３および／もしくはＲ^４が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^５が式（１－１）であり、Ｒ^３および／もしくはＲ^４が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３およびＣＦ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^５が式（１－１）であり、Ｒ^３およびＲ^４の１つもしくは両方が、水素原子である。一部の実施形態では、上に提供する第１または第２の実施形態のいずれかは、上に提供する第３、第４または第５の実施形態のいずれかと組み合わせる。実施形態の前述の組合せのいずれかでは、Ｒ^６は、ＨまたはＣＨ_３のいずれかとして選択され得る。実施形態の前述の組合せのいずれかでは、式（１－１）におけるＲ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択されるか、または式（１－１）におけるＲ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３およびＣＦ_３から独立的に選択されるか、または式（１－１）におけるＲ^７、Ｒ^８およびＲ^９の１つ、２つもしくはすべてが、水素原子である。

特定の実施形態では、式（１）の化合物は、少なくともＲ^３が式（１－１）の構造として選択される、次の構造：

を有する。

上記の式（１ａ）では、第１、第２および第３の実施形態のいずれかと、これらの相互の組合せならびにＲ^６、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９の特定の選択とのこれらの組合せとは、式（１）に従った上記のものであり得る。

特定の実施形態では、式（１ａ）の化合物は、次の構造：

を有する。

上記の式（１ｂ）では、第１および第２の実施形態のいずれかは、Ｒ^１およびＲ^２が式（１）に従った上記のものであり得る。

一部の実施形態では、式（１）の化合物は、次の構造：

を有するメチル化塩であり、式中、Ｒ^１は、ＨまたはＣＨ_３であり、Ｒ^２は、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨ、ＳＣＨ_３および次の構造（１－２）：

から独立的に選択されるが、ただし、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５の１つまたは２つは、式（１－２）の構造であり、Ｒ^６は、ＨまたはＣＨ_３であり、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９は、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択される。Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５のうちの２つが式（１－２）の構造である場合、式（１－２）におけるＲ^７、Ｒ^８およびＲ^９は、式（１－１）の２つの場合の間で同一であるか、または異なり得る（すなわち、独立的に選択される）。変数Ｘ^－は、化合物の正荷電部分を均衡させるアニオンである。また、式（１ｃ）は、式（１ｃ）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む。

式（１ｃ）の実施形態の第１のセットでは、Ｒ^１がＨであり、Ｒ^２が、メチル、エチル、ｎ－プロピルもしくはイソプロピルであるか、またはＲ^１がＨであり、Ｒ^２が、メチルもしくはエチルであるか、またはＲ^１がＨであり、Ｒ^２がエチルである。式（１ｃ）の実施形態の第２のセットでは、Ｒ^１がメチルであり、Ｒ^２が、メチル、エチル、ｎ－プロピルもしくはイソプロピルであるか、またはＲ^１がメチルであり、Ｒ^２が、メチルもしくはエチルであるか、またはＲ^１がメチルであり、Ｒ^２がエチルである。式（１ｃ）の実施形態の第３のセットでは、少なくともＲ^３もしくはＲ^３のみが、式（１－２）であり、Ｒ^４および／もしくはＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^３が式（１－２）であり、Ｒ^４および／もしくはＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３およびＣＦ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^３が式（１－２）であり、Ｒ^４およびＲ^５の１つもしくは両方が、水素原子である。式（１ｃ）の実施形態の第４のセットでは、少なくともＲ^４もしくはＲ^４のみが、式（１－２）であり、Ｒ^３および／もしくはＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^４が式（１－２）であり、Ｒ^３および／もしくはＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３およびＣＦ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^４が式（１－２）であり、Ｒ^３およびＲ^５の１つもしくは両方が、水素原子である。式（１ｃ）の実施形態の第５のセットでは、少なくともＲ^５もしくはＲ^５のみが、式（１－２）であり、Ｒ^３および／もしくはＲ^４が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^５が式（１－２）であり、Ｒ^３および／もしくはＲ^４が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３およびＣＦ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^５が式（１－２）であり、Ｒ^３およびＲ^４の１つもしくは両方が、水素原子である。一部の実施形態では、上に提供する第１または第２の実施形態のいずれかは、上に提供する第３、第４または第５の実施形態のいずれかと組み合わせる。実施形態の前述の組合せのいずれかでは、Ｒ^６は、ＨまたはＣＨ_３のいずれかとして選択され得る。実施形態の前述の組合せのいずれかでは、式（１－２）におけるＲ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択されるか、または式（１－２）におけるＲ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３およびＣＦ_３から独立的に選択されるか、または式（１－２）におけるＲ^７、Ｒ^８およびＲ^９の１つ、２つもしくはすべてが、水素原子である。

を有する。

上記の式（１ｄ）では、第１、第２および第３の実施形態のいずれかと、これらの相互の組合せならびにＲ^６、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９の特定の選択とのこれらの組合せとは、式（１ｃ）に従った上記のものであり得る。

特定の実施形態では、式（１ｃ）の化合物は、次の構造：

を有する。

上記の式（１ｅ）では、第１および第２の実施形態のいずれかは、Ｒ^１およびＲ^２が式（１ｃ）に従った上記のものであり得る。

他の実施形態では、式（１）化合物は、少なくともＲ^４が式（１－１）の構造として選択される、次の構造：

を有する。

上記の式（１ｆ）では、第１、第２および第４の実施形態のいずれかと、これらの相互の組合せならびにＲ^６、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９の特定の選択とのこれらの組合せとは、式（１）に従った上記のものであり得る。

特定の実施形態では、式（１ｆ）の化合物は、次の構造：

を有する。

上記の式（１ｇ）では、第１および第２の実施形態のいずれかは、Ｒ^１およびＲ^２が式（１）に従った上記のものであり得る。

他の実施形態では、式（１）の化合物は、少なくともＲ^４が式（１－１）の構造として選択される、次のメチル化塩構造：

を有する。

上記の式（１ｈ）では、第１、第２および第４の実施形態のいずれかと、これらの相互の組合せならびにＲ^６、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９の特定の選択とのこれらの組合せとは、式（１）に従った上記のものであり得る。

特定の実施形態では、式（１ｈ）の化合物は、次の構造：

を有する。

上記の式（１ｉ）では、第１および第２の実施形態のいずれかは、Ｒ^１およびＲ^２が式（１ｃ）に従った上記のものであり得る。

他の実施形態では、式（１）の化合物は、少なくともＲ^５が式（１－１）の構造として選択される、次の構造：

を有する。

上記の式（１ｊ）では、第１、第２および第５の実施形態のいずれかと、これらの相互の組合せならびにＲ^６、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９の特定の選択とのこれらの組合せとは、式（１）に従った上記のものであり得る。

特定の実施形態では、式（１ｊ）の化合物は、次の構造：

を有する。

上記の式（１ｋ）では、第１および第２の実施形態のいずれかは、Ｒ^１およびＲ^２が式（１）に従った上記のものであり得る。

他の実施形態では、式（１）の化合物は、少なくともＲ^５が式（１－１）の構造として選択される、次のメチル化塩構造：

を有する。

上記の式（１ｍ）では、第１、第２および第５の実施形態のいずれかと、これらの相互の組合せならびにＲ^６、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９の特定の選択とのこれらの組合せとは、式（１）に従った上記のものであり得る。

特定の実施形態では、式（１ｍ）の化合物は、次の構造：

を有する。

上記の式（１ｎ）では、第１および第２の実施形態のいずれかは、Ｒ^１およびＲ^２が式（１ｃ）に従った上記のものであり得る。

実施形態の別のセットでは、Ｍ４アンタゴニスト化合物は、次の構造：

を有する。

上記の式（２）では、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９は、上記の式（１）の下に定義するものである。また、式（２）は、式（２）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む。式（２）の実施形態の第１のセットでは、Ｒ^２が、メチル、エチル、ｎ－プロピルもしくはイソプロピルであるか、またはＲ^２が、メチルもしくはエチルであるか、またはＲ^２がエチルである。式（２）の実施形態の第２のセットでは、Ｒ^４およびＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^４およびＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３およびＣＦ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^４およびＲ^５の１つもしくは両方が、水素原子である。一部の実施形態では、上に提供する第１または第２の実施形態のいずれかを組み合わせる。実施形態の前述の組合せのいずれかでは、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３およびＣＦ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^７、Ｒ^８およびＲ^９の１つ、２つもしくはすべてが、水素原子である。

特定の実施形態では、式（２）の化合物は、次の構造：

を有する。

上記の式（２ａ）の特定の実施形態では、Ｒ^２が、メチル、エチル、ｎ－プロピルもしくはイソプロピルであるか、またはＲ^２が、メチルもしくはエチルであるか、またはＲ^２がエチルである。

を有する。

上記の式（２ｂ）では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９は、上記の式（１）の下に定義するものである。また、式（２ｂ）は、式（２ｂ）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む。一部の実施形態では、式（２ｂ）は、ラセミ混合物を表し、他の実施形態では、式（２ｂ）は、ＲもしくはＳ、または（＋）もしくは（－）光学形態と名付けられ得る、単一のエナンチオマーを表す。変数Ｘ^－は、化合物の正荷電部分を均衡させるアニオンである。

式（２ｂ）の実施形態の第１のセットでは、Ｒ^１がＨであり、Ｒ^２が、メチル、エチル、ｎ－プロピルもしくはイソプロピルであるか、またはＲ^１がＨであり、Ｒ^２が、メチルもしくはエチルであるか、またはＲ^１がＨであり、Ｒ^２がエチルである。式（２ｂ）の実施形態の第２のセットでは、Ｒ^１がメチルであり、Ｒ^２が、メチル、エチル、ｎ－プロピルもしくはイソプロピルであるか、またはＲ^１がメチルであり、Ｒ^２が、メチルもしくはエチルであるか、またはＲ^１がメチルであり、Ｒ^２がエチルである。式（２ｂ）の実施形態の第３のセットでは、Ｒ^４およびＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^４およびＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３およびＣＦ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^４およびＲ^５の１つもしくは両方が、水素原子である。一部の実施形態では、上に提供する第１または第２の実施形態のいずれかは、実施形態の第３のセットのいずれかと組み合わせる。実施形態の前述の組合せのいずれかでは、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３およびＣＦ_３から独立的に選択されるか、またはＲ^７、Ｒ^８およびＲ^９の１つ、２つもしくはすべてが、水素原子である。

特定の実施形態では、式（２ｂ）の化合物は、次の構造：

を有する。

上記の式（２ｃ）では、第１および第２の実施形態のいずれかは、Ｒ^１およびＲ^２が式（２ｂ）に従った上記のものであり得る。

一部の実施形態では、Ｍ４特異的アンタゴニストは、Ｍ４への結合について少なくとも６．０×１０^－６ＭのｐＫｉを有する。一部の実施形態では、Ｍ４特異的アンタゴニストは、Ｍ１／Ｍ４、Ｍ２／Ｍ４、Ｍ３／Ｍ４およびＭ５／Ｍ４のいずれか１つ、２つ、３つまたはすべてについて、少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍または２５倍の選択性を有する。

本明細書において記載する化合物は、薬学的に許容される塩として形成および／または使用し得る。薬学的に許容される塩は、求電子有機種または薬学的に許容される有機もしくは無機酸との中性化合物（すなわち、インドリルおよび／またはイソキノリニル環上に環窒素を有する）の反応から生じ得る。この方法では、インドリルおよび／またはイソキノリニル環窒素の１つまたは両方は、プロトン化またはアルキル化される。求電子有機種の一部の例としては、ハロゲン化アルキル、例えば、臭化メチル、臭化エチル、臭化ｎ－プロピルおよび臭化イソプロピルが挙げられる。有機酸の一部の例としては、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、リンゴ酸、クエン酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、フマル酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２－エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、３－フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、グルコン酸、グルタミン酸、サリチル酸、ヒドロキシナフトエ酸、ステアリン酸、ムコン酸等が挙げられる。無機酸の一部の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタリン酸等が挙げられる。アニオン（Ｘ^－）は、上記の酸もしくは求電子種と関連するアニオンのいずれかであり得るか、またはアニオンは、当技術分野の他の任意の薬学的に許容されるアニオンとのこの交換から生じ得る。

一部の実施形態では、薬学的に許容される塩は、Ｒ^６が水素原子である場合、Ｒ^６の脱プロトン化から生じ得る。脱プロトン化は、フェノールの脱プロトン化に適する強度の塩基（すなわち、－ＯＲ^６基）との中性化合物の反応により典型的に生じる。塩基は、例えば、アルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム）の水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウムまたはカルシウム）の水酸化物、またはアルミニウムの水酸化物であり得る。

また、上記の化合物のいずれかは、溶媒和物であり得る。当技術分野において公知のように、溶媒和物は、１つまたは１つより多くの溶媒分子の付加化合物である。本発明の目的では、溶媒分子は、薬学的に許容されるべきである。薬学的に許容される溶媒分子の一部の例としては、水、アルコール（例えば、エタノール）およびグリコール（例えば、エチレングリコールおよびプロピレングリコール）が挙げられる。溶媒分子が水の場合では、溶媒和物は、典型的に水和物と呼ぶ。また、化合物は、任意の多形形態、例えば、アモルファス、単結晶または多結晶形態であり得る。また、結晶形態は、例えば、結晶充填および結晶学的（対称性）空間群により決定される、いくつかの可能な結晶形態の１つであり得る。薬学的溶媒和物、水和物、多形および結晶形態は、例えば、A. M. Healy et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 117, 25-46, 2017およびS. L. Morissette et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 56, 275-300, 2004に記載されており、この内容は本明細書において、この全体を参照により組み込む。

Ｍ４特異的アンタゴニストを含む医薬組成物

典型的には、Ｍ４アンタゴニスト化合物を被験体に投与可能とするために、化合物は、医薬組成物の技術分野において周知のように、１つまたは１つより多くの薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤とともに製剤化する。本発明の医薬組成物は、固体または液体形態での投与のために特別に製剤化してもよく、次の投与：（１）経口投与、例えば、飲薬（水性または非水性溶液または懸濁液）、錠剤、例えば、頬側、舌下および全身性吸収を目的とするもの、ボーラス、粉剤、顆粒剤、舌への適用のための糊状剤、（２）非経口投与、例えば、滅菌溶液もしくは懸濁液として、例えば、皮下、筋肉内、静脈内もしくは硬膜外注射によるもの、または持続放出製剤、（３）局所適用、例えば、クリーム、軟膏もしくは調節放出パッチ、または皮膚に適用するスプレーとして、（４）舌下投与、（５）眼内投与、（６）経皮投与、あるいは（７）経鼻投与のために構成されたものを含む。

「薬学的に許容される」という句は、良識ある医学的判断の範囲内において、好ましくは、重要な毒性、刺激作用またはアレルギー応答がなく、生体または生体組織に侵入させるのに適する、このような化合物、物質、組成物、および／または剤形を指すために本明細書において使用する。「薬学的に許容される担体」という句は、本明細書において使用する場合、活性物質の体内への導入に有用な薬学的に許容される組成物、例えば、液体または固体のフィラー、希釈剤、製造補助剤（例えば、滑沢剤、タルクステアリン酸マグネシウム、カルシウムもしくは亜鉛、またはステアリン酸（steric acid））または溶媒封入物質を一般に指す。各担体は、製剤の他の成分と適合し、患者に対して有害でないという点において「許容され」なければならない。本発明の医薬組成物において利用し得る、適する水性および非水性担体の例としては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、植物油（例えば、オリーブ油）および注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）ならびにこれらの混合物が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング物質、例えば、レシチンの使用により、分散させる場合では、必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性物質の使用より、維持することができる。

薬学的に許容される担体として働き得る物質の他の例としては、（１）糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース、（２）デンプン、例えば、コーンスターチおよびジャガイモデンプン、（３）セルロースおよびこの誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース、（４）トラガント粉末、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐薬用ワックス、（９）油、例えば、ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油、（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール、（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール、（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質不含水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝溶液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物、ならびに（２２）医薬製剤に利用される他の非毒性適合物質が挙げられる。

錠剤は、必要に応じて、１つまたは１つより多くの補助成分とともに、圧縮または成型により製造され得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を使用して調製し得る。錠剤、および活性物質の他の固体剤形、例えば、カプセル、丸剤および顆粒剤は、必要に応じて、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶コーティングおよび医薬製剤技術において周知の他のコーティングを用いて印を付けるかまたは調製する。また、剤形は、この中の活性成分の徐放または調節放出をもたらすように製剤化してもよく、例えば、所望の放出プロファイルをもたらす種々の割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、リポソームおよび／またはミクロスフィアを使用する。あるいは、剤形は、速放のために製剤化し得る。

Ｍ４特異的アンタゴニストの使用

一実施形態では、Ｍ４特異的アンタゴニストは、ムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプ４（Ｍ４）活性から生じる疾患または状態、例えば、貧血を処置するために、被験体に投与する。用語「処置する（こと）（ｔｒｅａｔｉｎｇ）または処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書において使用する場合、寛解、増悪の減速、矯正、予防、または疾患もしくは状態の再発の遅延を含む。例えば、貧血の処置により、ヘモグロビン、ヘマトクリットおよび／または赤血球（ＲＢＣ）数のレベルの回復または維持により反映されるように、貧血と関連する１つまたは１つより多くの症候（例えば、疲労、息切れ）を含む貧血の重症度が低下し得る。

一部の実施形態では、貧血または他の疾患もしくは状態を処置する方法は、薬学的有効量のＭ４アンタゴニストを、それを必要とする被験体に投与することにより達成する。Ｍ４特異的アンタゴニストは、式（１）および（２）ならびにこれらの部分式の範囲内の構造のいずれかを含む、上記のＭ４アンタゴニスト化合物のいずれかであり得る。

この処置を必要とする被験体は、貧血またはＭ４活性から生じる他の疾患もしくは状態に罹患しているか、またはこのリスクを有する任意の被験体、特には、ヒト被験体を含む。一部の実施形態では、被験体は、Ｅｐｏの投与により所望の応答が生じないか、または所望の応答を生じることが予想されない貧血であるＥｐｏ抵抗性貧血に罹患している。被験体における貧血がＥｐｏ抵抗性か否かは、組換えヒトＥＰＯによる標準処置後の被験体におけるＨｂまたはヘマトクリットの評価により判定することができる。例えば、被験体における貧血は、組換えヒトＥＰＯによる標準処置を受けた後に被験体が、少なくとも１２ｇ／ｄＬのＨｂレベルに達することが不可能であるか、２ｇ／ｄＬを超えるＨｂレベルの上昇を達成不可能であるか、または少なくとも１０ｇ／ｄＬのＨｂ濃度の維持が不可能である場合、Ｅｐｏ抵抗性貧血であるとみなされる。別の例として、被験体における貧血は、組換えヒトＥＰＯによる標準処置を受けた後に被験体が、ヘマトクリットを少なくとも３０％、３２％、３４％、３６％または３８％に上昇させることが不可能である場合、Ｅｐｏ抵抗性貧血であるとみなされる。

被験体における貧血は、種々の原因から生じ得る。一部の実施形態では、被験体における貧血は、溶血と関連する（すなわち、溶血性貧血）。一部の実施形態では、被験体における貧血は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）と関連する。一部の実施形態では、被験体における貧血は、老化と関連する。したがって、一部の実施形態では、この処置は、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０または８５歳のヒト被験体に提供する。他の実施形態では、貧血は、例えば、外科手術、化学療法または放射線療法を受けることが予想される被験体におけるものであることが予想される。また、Ｍ４アンタゴニストは、貧血として専門的には認定されない可能性があるが、貧血様症候により特徴づけられる、状態または疾患を処置するために使用し得る。溶血モデルでは、化合物の一般的抗貧血活性をｉｎｖｉｖｏで確認することが可能である。

Ｍ４特異的アンタゴニストは、それを必要とする被験体に、治療有効量（すなわち、治療的に有効な投与量）で投与する。「治療有効量」または「治療的に有効な投与量」という用語は、本明細書において使用する場合、好ましくは、被験体に対する実質的な毒性作用がなく、上記の所望の治療作用のいずれかをもたらすのに有効な活性物質の量に相当する。特定の実施形態では、有効量は、所望のレベルへのＨｂ、ヘマトクリットもしくはＲＢＣ数における上昇、または所望の量によるＨｂ、ヘマトクリットもしくはＲＢＣ数の上昇、あるいはより詳細には、１つまたは１つより多くの貧血症候の減少を達成するのに十分な量である。有効とするための正確な量は、化合物の構造および薬理学的プロファイルに応じて異なり得る。例えば、培養下のＢＦＵ－Ｅの自己複製および増殖に対する作用、ならびに薬理学的特性（例えば、血漿における半減期）を評価することにより、Ｍ４特異的アンタゴニストを評価して、このようなアンタゴニストの有効量を決定することが有用であり得る。一部の実施形態では、Ｍ４特異的アンタゴニストは、単回用量で投与する。一部の実施形態では、Ｍ４特異的アンタゴニストは、複数回用量、例えば、１日に、１日置きに、毎週、隔週または毎月、２、３またはこれよりも多い回数で投与する。特に、全身的投与方法では、投与量は、例えば、１日に体重１ｋｇあたり約０．０１、０．１、０．５、１、５または１０ｍｇ～１日もしくは隔日に、または１日に２、３、４もしくはそれよりも多い回数、体重１キログラムあたり約２０、５０、１００、５００または１０００ｍｇの範囲であり得る。一般には、低分子化合物の有効量は、１日、１週間または１か月に、１回または複数回、１μｇ～５０００ｍｇ、１０μｇ～１０００ｍｇ、１０μｇ～１０ｍｇ、１００μｇ～５００μｇの範囲内であり得る。一部の実施形態では、用量は、約１、５、１０、２０、５０、１００μｇ／ｋｇ／日もしくは１、５、１０、１５、２０、５０、１００、１５０、２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、または規定用量間の値の範囲の任意の値に及び得る。

Ｍ４特異的アンタゴニストは、経口、経鼻、経皮、非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下または筋肉内）経路を含む標準経路により、被験体に投与することができる。特定の実施形態では、Ｍ４特異的アンタゴニストは、経口投与により被験体に与えられる。

Ｍ４特異的アンタゴニストは、適する投与のための薬学的に許容される担体とともに用意または混合することができる。上に考察するように、薬学的に許容される担体は、あらゆる溶媒、分散媒、等張剤等を含む。担体は、液体、半固体、例えば、糊状、または固体の担体であり得る。担体の例としては、油、水、食塩溶液、アルコール、糖、ゲル、脂質、リポソーム、樹脂、多孔性マトリクス、結合剤、フィラー、コーティング、保存剤等、またはこれらの組合せが挙げられる。

他の実施形態では、Ｍ４特異的アンタゴニストは、赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ－Ｅ）細胞の自己複製を、ＢＦＵ－Ｅ細胞をＭ４特異的アンタゴニストと接触させることにより促進させるために利用する。ＢＦＵ－Ｅ細胞は、例えば、Ｍ４特異的アンタゴニストと接触させるときに、生体（例えば、ヒト）被験体内に存在し得るか、またはＢＦＵ－Ｅ細胞は、被験体から採取して、Ｍ４特異的アンタゴニストとｅｘｖｉｖｏで接触させ得る。Ｍ４特異的アンタゴニストは、上記のＭ４特異的アンタゴニストのいずれかを含む、任意のＭ４特異的アンタゴニストであり得る。特定の実施形態では、ＢＦＵ－Ｅ細胞の自己複製の増加を利用して、被験体における貧血を処置する。一部の実施形態では、ＢＦＵ－Ｅ細胞の自己複製は、Ｍ４特異的アンタゴニストと接触させた結果として、少なくとも５０％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはこれよりも高く増加する。

実施例は、例示目的のため、および本発明のある特定の実施形態を記載するために以下に記載している。ただし、本発明の範囲は、本明細書に記載する実施例により、決して制限されるべきではない。引用するすべての参照の内容（本出願を通して引用する参考文献、発行された特許、および公開された特許出願を含む）は、本明細書によって、参照により明示的に組み込む。

（実施例１）
この実施例では、ＢＦＵ－Ｅ自己複製におけるムスカリン性アセチルコリン受容体ＣＨＲＭ４経路の役割、および低分子ムスカリン性アセチルコリン受容体阻害物質である臭化オキシフェノニウムの、マウスモデルにおける貧血に対する作用を検討するために行った実験を記載する。

結果

ＢＦＵ－Ｅの自己複製を制御するＧタンパク質共役受容体（「ＧＰＣＲ」）を同定するために、ＢＦＵ－Ｅにおいて豊富に発現するＧＰＣＲに焦点を合わせて、全ゲノム遺伝子発現プロファイルを解析した。ＢＦＵ－Ｅ自己複製の、分化に対する制御に機能的に重要である可能性が最も高いＧＰＣＲの候補リストをさらに絞り込むために、発明者らは、分化および自己複製が、おそらく対照的な遺伝子発現プロファイルを有する、対立する２つの細胞運命であるという概念を利用した。

調査した創薬可能なＧＰＣＲ３５８種の中でも、Ｐ２ｒｙ２、Ｇｐｒ１２４およびＣａｌｃｒｌを含む３つのＧＰＣＲが、ＢＦＵ－Ｅの分化において下方制御され、自己複製において上方制御されることを見出し、Ｃｈｒｍ４、Ｆｚｄ５およびＤａｒｃを含む３つのＧＰＣＲが、ＢＦＵ－Ｅの分化において上方制御され、自己複製において下方制御されることを見出した。ＢＦＵ－Ｅの自己複製において上方制御されたＧＰＣＲでは、このようなＧＰＣＲのアゴニストとして作用する低分子化合物を試験し、ＢＦＵ－Ｅの自己複製において下方制御されたＧＰＣＲでは、ＢＦＵ－Ｅの自己複製および増殖を促進するその能力について、アンタゴニストを試験した。試験したすべての低分子化合物の中でも、密接に関連する２つのムスカリン性アセチルコリン受容体アンタゴニストである臭化オキシフェノニウムおよびクエン酸オルフェナドリンにより、ＢＦＵ－Ｅの増殖が引き起こされた（図１Ａ～１Ｂ）。

１つのＢＦＵ－Ｅにより、赤血球が約５００個生成されることがこれまでに示されている。１００μＭの臭化オキシフェノニウムの存在下で培養すると、ＢＦＵ－Ｅは、長期の増殖を経て、さらに約１０倍の赤血球が産生された（図１Ａ～１Ｂ）。１２日の培養の後、大多数の培養細胞が最終分化を経ると、臭化オキシフェノニウムの有無による培養条件間でＴｅｒ１１９＋分化細胞のパーセンテージにおける差は存在せず、すべての細胞が、臭化オキシフェノニウムの有無による培養条件下で、Ｔｅｒ１１９＋分化赤血球系列細胞であることを示唆した（図１Ｃ）。図１Ｄに示すように、培養６日目のＢＦＵ－Ｅをメチルセルロース培地上に播種し、９日後、形成されたＢＦＵ－Ｅコロニー数を計数した。臭化オキシフェノニウムの存在により、約２倍のＢＦＵ－Ｅコロニー形成が引き起こされた。ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）培養系では、臭化オキシフェノニウムにより、赤血球細胞の増殖も約２倍～４倍促進された（図１Ｅ）。まとめると、これは、ムスカリン性アセチルコリン受容体アンタゴニストである臭化オキシフェノニウムにより、ＢＦＵ－Ｅ自己複製を促進させることによって赤血球の産生が増加することを示唆する。

Ｃｈｒｍ４が、ＢＦＵ－Ｅにおいて発現するムスカリン性アセチルコリン受容体ファミリーの最も豊富なメンバーであることを本明細書において示した（図２Ａ）。試験したすべての細胞型の中でも、Ｃｈｒｍ４の機能的役割が十分に確立されている網膜細胞のすぐ後に次いで、赤血球前駆細胞が、Ｃｈｒｍ４を２番目に最も豊富に発現することが見出された。Ｃｈｒｍ４は、ＢＦＵ－ＥからＣＦＵ－Ｅの段階への赤血球分化において上方制御され、自己複製において下方制御されることが見出された（図２Ａ）。図２Ｂ～２Ｄに示すように、Ｃｈｒｍ４を標的とする２つの独立的ｓｈＲＮＡを使用するＣｈｒｍ４のノックダウンにより、ＢＦＵ－Ｅの増殖が促進された。対照ｓｈＲＮＡをコードするウイルスを感染させた１つのＢＦＵ－Ｅにより、赤血球細胞が約１００個産生され、一方、Ｃｈｒｍ４を標的とするｓｈＲＮＡをコードするウイルスを感染させたＢＦＵ－Ｅにより、さらに約３～５倍の赤血球細胞が産生された。これにより、臭化オキシフェノニウムのＢＦＵ－Ｅ増殖に対する好ましい作用が再現される（図１Ｂ）。これと一致して、Ｃｈｒｍ４のノックダウンにより、自己複製マーカー、例えば、Ｚｆｐ３６ｌ２の発現も上方制御された（図２Ｅ）。

ムスカリン性アセチルコリンアンタゴニストにより、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させること、およびＣＲＥＢ転写プログラムを制御することによってＣＨＲＭ４経路が阻害されることが報告されている（Kruse et al., Nat Rev Drug Discov 13, 549-560 (2014)；Wess et al., Nat Rev Drug Discov 6, 721-733 (2007)；Shaywitz, Annu Rev Biochem 68, 821-861 (1999)）。これと一致して、アデニル酸シクラーゼ活性化物質であるフォルスコリンを用いたＢＦＵ－Ｅの培養物により、ＢＦＵ－Ｅの増殖が促進されることを本明細書において示した（図３Ａ）。加えて、リン酸化ＣＲＥＢは、臭化オキシフェノニウムによる処理時に核局在化の増加を呈した（図３Ｂ）。このような結果は、ＣＲＥＢが、高齢者において再生、ならびに幹細胞および前駆細胞枯渇矯正のための因子として役立ち得ることを示唆する。

ＣＲＥＢの直接標的遺伝子を同定するために、ＢＦＵ－Ｅに対してＣｈＩＰ－Ｓｅｑを実施した。ＲＮＡ結合タンパク質ＺＦＰ３６Ｌ２は、赤血球の分化において誘導される遺伝子のｍＲＮＡに優先的に結合して、これらの分解を引き起こし、次いで、自己複製に寄与することが報告されている。ＺＦＰ３６Ｌ２とは対照的に、ＣＲＥＢは、ＢＦＵ－Ｅにおいて高度に発現する遺伝子付近のゲノム遺伝子座に優先的に結合して（図３Ｃ）、このような遺伝子の上方制御を引き起こし（図３Ｄ）、これによりＣＲＥＢがＢＦＵ－Ｅの前駆状態の維持に寄与すると考えられることが見出された。このような遺伝子は、赤血球前駆細胞の増殖を誘導するのに十分な転写因子Ｇａｔａ２（図３Ｅ）（Tsai et al., Blood, 89, 3636-3643 (1997)）およびＢＦＵ－Ｅの前駆状態の維持に不可欠なＲＮＡ結合タンパク質Ｚｆｐ３６ｌ２（Zhang et al., Nature 499, 92-96 (2013)）を含む。まとめると、このような結果は、ＣＨＲＭ４－ＣＲＥＢ経路により、ＢＦＵ－Ｅの前駆状態の維持に重要な遺伝子の発現が上方制御されることによってＢＦＵ－Ｅの自己複製が促進されることを示す。

要約すると、上記の実験では、ムスカリン性アセチルコリン受容体ＣＨＲＭ４経路が、ＢＦＵ－Ｅ自己複製の重大な制御因子であり、ムスカリン性アセチルコリン受容体アンタゴニストである臭化オキシフェノニウムにより、ＢＦＵ－Ｅの自己複製および増殖が引き起こされることが示された。また、実験では、溶血、ＭＤＳおよび老化マウスモデルにおいて、ムスカリン性アセチルコリン受容体アンタゴニストにより、ｉｎｖｉｖｏにおいて貧血が矯正されることが示された。加えて、実験では、下流転写因子であるＣＲＥＢにより、ＢＦＵ－Ｅ自己複製の促進におけるムスカリン性アセチルコリン受容体の作用が媒介されることが示された。

材料および方法

初代マウスＢＦＵ－Ｅを胎生期１４．５日（Ｅ１４．５）のマウス胎仔肝臓から単離してＳｔｅｍＳｐａｎ無血清増殖培地中で培養し、形成された細胞数を培養下で計数した。対照ｓｈＲＮＡをコードするウイルスまたはＣｈｒｍ４を標的とするｓｈＲＮＡをコードするウイルスのいずれかをＢＦＵ－Ｅに感染させ、培養下で形成されたＧＦＰ＋細胞数を計数した。ＤＭＳＯまたは２５ｍｇ／ｋｇの臭化オキシフェノニウムを、溶血マウスモデル、Ｍｘ１－ｃｒｅＳｒｓｆ２Ｐ９５Ｈ／ＷＴＭＤＳマウスモデル、および老化マウスモデルに腹腔内注射した。化合物注射後に全血球計算（ＣＢＣ）を実施した。１００μＭの臭化オキシフェノニウムによる４５分間の培養後にＢＦＵ－Ｅに対してＣＲＥＢのＣｈＩＰ－Ｓｅｑを実施した。ＤＭＳＯまたは臭化オキシフェノニウムによる３日間の培養後にＢＦＵ－ＥにおいてＲＮＡ－Ｓｅｑを実施した。

ＢＦＵ－Ｅ単離および培養系

これまでに記載されている蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）法を使用して（Flygare et al., Blood 117, 3435-3444 (2011)）、ＢＦＵ－Ｅを胎生期１４．５日のマウス胎仔肝臓から単離した。ｒｍＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＥＰＯ（２Ｕ／ｍｌ）、ｒｍＩＧＦ－１（４０ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１ｎｍｏｌ／ｍｌまたは１０ｎｍｏｌ／ｍｌ）、臭化オキシフェノニウム（１００μｍｏｌ／ｍｌ）およびクエン酸オルフェナドリン（１μｍｏｌ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭＩＩ培地中で、ＢＦＵ－Ｅを培養した。

ＢＦＵ－Ｅコロニー形成、Ｔｅｒ１１９抗体染色およびレトロウイルス感染アッセイ

３日の培養後、培養細胞をメチルセルロース培地ＭｅｔｈｏｃｕｌｔＳＦＭ３４３６中に置き、９日後にＢＦＵ－Ｅコロニーを計数した。培養１４日目に、培養細胞をＴｅｒ１１９－ＡＰＣ抗体で染色し、Ｔｅｒ１１９＋細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより測定した。レトロウイルス感染では、対照ｓｈＲＮＡまたはＣｈｒｍ４を標的とするｓｈＲＮＡのいずれかをコードするウイルスを、ＢＦＵ－Ｅに感染させた。

ヒトＣＤ３４＋細胞培養、計数およびコロニー形成アッセイ

ｒｈＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＩＬ－３（５ｎｇ／ｍｌ）およびＥＰＯ（１Ｕ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ培地中で、種々の濃度のデキサメタゾンおよびオキシフェノニウムとともにヒトＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を培養した。細胞の総数は、フローサイトメトリーを使用して計数した。コロニー形成アッセイでは、８日目の培養細胞をメチルセルロース培地ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）Ｈ４０３４Ｏｐｔｉｍｕｍ中に置き、１３日後にＢＦＵ－Ｅコロニーを計数した。

ＰＨＺにより溶血性貧血マウスモデルが誘導された

４～６週齢のＣ５７ｂｌ／６マウスに、対照ＤＭＳＯまたは化合物のいずれかを３日間毎日腹腔内注射した。４日目に、マウスに６０ｍｇ／ｋｇのＰＨＺを腹腔内注射した。次いで、マウスに化合物または対照ＤＭＳＯのいずれかをさらに３日間毎日腹腔内注射した。末梢血試料を後眼窩からヘパリン処理毛細管チューブを使用してＫ２－ＥＤＴＡを有する血液採取チューブ内に採取した。Ｈｅｍａｖｅｔ（登録商標）９５０を使用してＣＢＣを実施した。

脾臓細胞のＢＦＵ－Ｅコロニー形成およびフローサイトメトリーアッセイ

４～６週齢のＣ５７ｂｌ／６マウスに、化合物または対照ＤＭＳＯのいずれかを３日間毎日腹腔内注射した。４日目に、マウスに６０ｍｇ／ｋｇのＰＨＺを腹腔内注射した。次いで、マウスに化合物または対照ＤＭＳＯのいずれかをさらに２日間毎日腹腔内注射した。マウスの脾臓を解剖して、単一細胞懸濁液となるようにホモジナイズした。赤血球は、細胞懸濁液を塩化アンモニウム溶液により氷上で５分間インキュベートすることにより溶解した。次いで、脾臓細胞をいずれもメチルセルロース培地ＭｅｔｈｏｃｕｌｔＳＦＭ３４３６中に置き、９日後にＢＦＵ－Ｅコロニーを計数するか、またはＴｅｒ１１９－ＡＰＣ抗体で染色した後にフローサイトメトリー解析を行った。

条件的ノックインＣｒｅ－Ｍｘ１Ｓｒｓｆ２Ｐ９５Ｈ／ＷＴＭＤＳマウスモデルおよび老化マウスモデル

ＭＤＳマウスモデルでは、これまでに記載されているように（Kim et al., Cancer Cell 27, 617-630 (2015)）、Ｍｘ１－ｃｒｅＳｒｓｆ２ｆｌ／ＷＴおよびＭｘ１－ＣｒｅＳｒｓｆ２Ｐ９５Ｈ／ＷＴマウスの新たに解剖した大腿骨および脛骨から骨髄細胞を回収した。Ｍｘ１－ｃｒｅＳｒｓｆ２ｆｌ／ＷＴまたはＭｘ１－ＣｒｅＳｒｓｆ２Ｐ９５Ｈ／ＷＴのいずれかのマウス由来の骨髄細胞１×１０^６個を、致死的に放射線を照射した（４５０ｃＧｙを２回）ＣＤ４５．１レシピエントマウスに尾静脈注射により移植した。移植から３週間後、ポリＩ：ポリＣ（ｐＩｐＣ）を注射してＭｘ１－ｃｒｅ発現を誘導した。ＭＤＳ疾患表現型の確認後、マウスに化合物または対照ＤＭＳＯのいずれかを４５日間毎日腹腔内注射した。末梢血試料を後眼窩から採取して、Ｈｅｍａｖｅｔ９５０を使用するＣＢＣを行った。

老化マウスモデルでは、６～８週齢または１８～２１か月齢のＣ５７ｂｌ／６マウスに対してＣＢＣを実施した。１８～２１か月齢のマウスに、化合物または対照ＤＭＳＯのいずれかを毎日腹腔内注射した。７日目に血液試料を採取してＣＢＣを行った。

ＲＮＡシーケンシング

ＲＮＡ単離では、ＳＣＦ（１００ｎｇｍｌ－１）、ＥＰＯ（２Ｕｍｌ－１）、ＩＧＦ－１（４０ｎｇｍｌ－１）およびデキサメタゾン（１ｎＭ）を含むＳＦＥＭＩＩ中３７℃で、オキシフェノニウム（１００μＭ）またはＤＭＳＯ対照のいずれかとともにＢＦＵ－Ｅを培養した。３日目に細胞を採取し、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用してＲＮＡを単離した。ＲＮＡ－Ｓｅｑ試料調製キットｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を使用してシーケンシングライブラリーを生成し、ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）によりシーケンシングした。ＳＴＡＲｍａｐｐｅｒを使用して、バックシーケンスリードをマウスゲノムにマッピングした（ＧＲＣｍ３８、ｍｍ１０）。リードは、これらのアダプターに従って逆多重化し、マッピング後の種々の解析に使用した。

クロマチン免疫沈降シーケンシング（ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ）

ＣｈＩＰ－ＩＴＨｉｇｈＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙキット（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ社）を使用してＣｈＩＰ－Ｓｅｑを実施した。Ｅ１４．５のマウス胎仔肝臓からＢＦＵ－Ｅ５×１０^６個を単離した。ＳＣＦ（１００ｎｇｍｌ^－１）、ＥＰＯ（２Ｕｍｌ^－１）およびＩＧＦ－１（４０ｎｇｍｌ^－１）を含むＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭＩＩ培地中３７℃でＢＦＵ－Ｅを培養した。細胞をオキシフェノニウム（１００μＭ）で４５分間処理した。処理後、細胞を１％のホルムアルデヒド溶液を用いて１５分間室温で穏やかに振盪させることにより架橋させた。架橋は、新たに調製した２．５Ｍのグリシン溶液を５分間室温で使用してクエンチした。核溶解緩衝液を使用して細胞を溶解し、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（登録商標）２０００（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ社）を使用してＯＮ３０秒およびＯＦＦ３０秒による３×１０分サイクルで３０分間超音波処理した。少量の試料を採取し（３０μｌ）、プロテイナーゼＫおよびＲＮａｓｅＡを使用して逆架橋させ、２％のアガロースゲル上で実行して超音波処理断片サイズを確認した。次いで、超音波処理ＤＮＡを、ＩｇＧ対照（１０μｇ、ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社、１７－６００）またはＣＲＥＢ抗体（１０μｇ、ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社、１７－６００）のいずれかとともにチューブローテーター上に４℃で一晩置いた。ＤＮＡ溶液は、アガロースＧビーズにより４℃で４時間インキュベートし、ＤＮＡ溶出および精製カラム（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ社）を使用して、免疫沈降ＤＮＡの溶出および精製を実施した。

ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を使用してシーケンシングライブラリーを生成した。簡潔には、末端修復後、アダプターをライゲーションし、Ｓｉｚｅ－ｓｅｌｅｃｔ２％アガロースゲル電気泳動系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して２５０～３００ｂｐのＤＮＡ断片を採取することにより、アダプターを有するＤＮＡ試料を精製した。精製したＤＮＡライブラリーは、ＰＣＲ増幅キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を使用して１８サイクルについて増幅し、ＡＭＰｕｒｅＸＰ磁気ビーズ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社）を使用して精製した。シーケンシングライブラリーのサイズは、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（商標）２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ社）の高感度ＤＮＡチップを使用して検証した。シーケンスリードを、Ｂｏｗｔｉｅ２を使用してマウスゲノムにアラインメントし（ＧＲＣｍ３８、ｍｍ１０）、これらのアダプター配列に従って逆多重化した。ＭＡＣＳプラットフォームを使用してピーク抽出を行った。これまでに記載されているように（Wang et al., Nat Protoc 8, 2502-2515 (2013)）、結合および発現標的解析（ＢＥＴＡ）を実施した。

ＲＴ－ＰＣＲ

ＲＴ－ＰＣＲでは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して逆転写を実施した。ＰＣＲは、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＰＣＲマスターミックス（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）および７９００ＨＴ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して実施した。プライマー配列は、Ｇａｐｄｈ、フォワードプライマー、ＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＡ（配列番号１）、リバースプライマー、ＧＣＧＧＣＡＣＧＴＣＡＧＡＴＣＣＡ（配列番号２）；Ｃｈｒｍ４、フォワードプライマー、ＡＴＧＧＣＧＡＡＣＴＴＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣ（配列番号３）、リバースプライマー、ＣＴＧＴＣＧＣＡＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号４）；Ｃ－Ｋｉｔ、フォワードプライマー、ＧＧＣＣＴＣＡＣＧＡＧＴＴＣＴＡＴＴＴＡＣＧ（配列番号５）、リバースプライマー、ＧＧＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＡＴＣＡＣＡＣ（配列番号６）；Ｚｆｐ３６ｌ２、フォワードプライマー、ＡＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＴＣＡＡＣＴ（配列番号７）、リバースプライマー、ＣＧＡＡＡＧＣＧＡＡＧＧＣＧＴＴＧＴＴＡ（配列番号８）である。

免疫蛍光

新たに単離したＢＦＵ－Ｅを１時間血清飢餓培養し、ＤＭＳＯまたは１００μＭのオキシフェノニウムのいずれかで４５から６０分間処理した。サイトスピンを使用して、ポリＬ－リジンをコーティングしたスライド上に細胞１０^４個を採取した。２％のパラホルムアルデヒドにより１５分間、細胞を固定した後、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００を使用して１５分間透過処理し、２％のＢＳＡ溶液で３０分間ブロッキングした。２％のＢＳＡ中のリン酸化ＣＲＥＢ抗体（リン酸化Ｓ１３３、Ａｂｃａｍ社、ａｂ３２０９６、１：２５０）により１時間細胞をインキュベートし、次いで、２％のＢＳＡ溶液中のＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウス２次抗体（Ａｂｃａｍ社、ａｂ９７０２２、１：５００）およびＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ウサギ２次抗体（Ａｂｃａｍ社、ａｂ９７０５０、１：５００）により３０分間インキュベートした。次いで、ＤＡＰＩにより５分間細胞をインキュベートし、次いで、封入溶液により封入した。

プラスミド

次のオリゴをアニーリングし、ＢｂｓＩで消化したＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰベクターにクローニングした：Ｃｈｒｍ４ｓｈＲＮＡ１、ａａａａＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＧＡＣＡＴＴＡＡｇｔｃｇａｃＴＴＡＡＴＧＣＴＣＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＧＡ（配列番号９）；Ｃｈｒｍ４ｓｈＲＮＡ２、ａａａａＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＧｇｔｃｇａｃＣＡＡＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１０）。

（実施例２）
この実施例では、他の低分子Ｍ４アンタゴニスト、例えば、ＰＣＳ１０５５およびＰＤ１０２８０７により、ＢＦＵ－Ｅ自己複製が促進され、ｉｎｖｉｖｏにおいて貧血が矯正されるかどうかを検討するために行った実験を記載する。

結果

図４Ａは、ＰＤ１０２８０７の化学構造を示す。ＰＤ１０２８０７は、細胞培養下のＢＦＵ－Ｅ細胞の増殖を増加させることが見出された（図４Ｂ）。加えて、ＰＤ１０２８０７はまた、マウスに投与した場合（ＰＤ１０２８０７ではｉ．ｐ．または経口）、ＨＣＴおよびＲＢＣのレベルを上昇させることが見出された（それぞれ図４Ｃおよび４Ｄ）。図４Ｅは、放射性リガンド、および受容体を有する細胞膜を用いた標準的結合アッセイにおいて、１×１０^－９Ｍ、１×１０^－８Ｍ、１×１０^－７Ｍ、１×１０^－６Ｍおよび１×１０^－５Ｍの濃度のＰＤ１０２８０７を試験した結果を示す。

材料および方法

マウスＢＦＵ－Ｅ培養系

蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）法を使用してＢＦＵ－Ｅを胎生期１４．５日のマウス胎仔肝臓から単離した。ｒｍＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＥＰＯ（２Ｕ／ｍｌ）、ｒｍＩＧＦ－１（４０ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１ｎＭ）を含むＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭＩＩ培地中で、ＤＭＳＯ、ＰＣＳ１０５５（５ｎＭ）またはＰＤ１０２８０７（３ｎＭ）のいずれかとともにＢＦＵ－Ｅを培養した。形成された細胞数をｉｎｖｉｔｒｏでの培養下で計数した。

貧血マウスモデル

動物実験をＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＡｎｉｍａｌＳｈａｒｅｄＲｅｓｏｕｒｃｅにおいて、ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅにより認可された手順に従って行った。ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、化合物および対照処置群にランダムに割り振った４～６週齢のＣ５７ｂｌ／６マウスに、ＰＣＳ１０５５（５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ）を１日２回、またはＰＤ１０２８０７（５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、３日間毎日経口送達した。３日目に、マウスに６０ｍｇ／ｋｇのＰＨＺを腹腔内注射した。次いで、マウスにＰＤ１０２８０７（５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、２日間毎日経口送達した。６日目に、末梢血試料を後眼窩からヘパリン処理毛細管チューブを使用してＫ２－ＥＤＴＡを有する血液採取チューブ内に採取した。Ｈｅｍａｖｅｔ９５０を使用してＣＢＣを実施した。

Ｍ４アンタゴニスト化合物の合成および解析

化合物Ａ～Ｋと名付けた一連のＭ４アンタゴニスト化合物を合成および解析した。このような化合物の構造を図５に示す。

化合物Ａ～Ｋの合成

他に言及しない限り、すべての出発物質は、さらには精製せずに供給元からそのまま使用した。すべての反応は、炉乾燥したガラス器具においてシリンジおよびセプタムによる技術を使用して行い、ＮＭＲスペクトルは、５００または６００ＭＨｚの装置で採取した。化学シフトは、重水素化溶媒ピークまたは（δ０．００）における内部標準のテトラメチルシラン（ＴＭＳ）ピークに対して記録し、百万分率（ｐｐｍ）により報告する。選択された核の指定は、^１ＨＣＯＳＹにより決定した。最終化合物の純度は、ＨＰＬＣ解析により判定した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲルを０．２５ｍｍ厚でコーティングしたアルミニウム板上で行った。ＴＬＣプレートは、短および長波長のＵＶ光下で観察するか、またはヨウ素染色後に観察するか、またはモリブデン（ＶＩ）酸アンモニウム四水和物および硫酸セリウム（ＩＶ）四水和物の溶液への曝露時にプレートを加熱することにより可視化した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＦＣＣ）は、シリカゲル６０（２３０～４００メッシュ）を使用して実行し、ＴＬＣ移動度と相関する段階的溶媒極性勾配を利用した。

５－ヒドロキシ－２－メチルインドール－３－カルボン酸エチル（インドール１）

氷酢酸４５０ｍＬ中１，４－ベンゾキノン（２７ｇ、０．２５モル）の溶液に３－アミノクロトン酸エチル（１６．２ｇ、０．１２５モル）を少量ずつ、氷水浴を使用して反応温度を４５℃未満に調節することにより加えた。反応混合物を室温で５時間撹拌した。沈殿した固体を酢酸および水で洗浄して灰色の結晶性固体１７ｇ（６２％）を得、酢酸でさらに洗浄して５５％の収率で白色の固体を得た。¹HNMR (600 MHz, DMSOd₆) δ 11.51 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 7.31 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 8.52 Hz, 1H), 6.60 (dd, J = 2.4, 8.6 Hz, 1H), 4.24 (q, J = 7.08 Hz, 2H), 2.59 (s, 3H), 1.33 (t, J = 7.08 Hz, 3H); ¹³C NMR (150 MHz, DMSOd₆) δ 165.2, 152.2, 144.4, 128.9, 127.9, 111.4, 111.2, 105.2, 102.1, 58.4, 14.5, 13.8.

５－ヒドロキシ－１，２－ジメチル－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸エチル（インドール２）

無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）中インドール１（３．０ｇ、１３．７６ｍｍｏｌ）の溶液にイミダゾール（２．０ｇ、２８．９ｍｍｏｌ）およびＴＢＤＰＳ（３．７ｍＬ、１４．４５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をＲＴで１６時間撹拌した。ＴＬＣによる出発物質の消失後、反応混合物を５％のＨＣｌ溶液で処理した。有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて灰色の固体を得、これを次のステップにおいて、さらには精製せずにそのまま使用した。

無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の上記のシリル化誘導体（３．２ｇ、７．０ｍｍｏｌ）の溶液にＮａＨ（油中分散６０％）（４４０ｍｇ、１０．５ｍｍｏｌ）およびＭｅＩ（０．７ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０℃で撹拌し、室温（ＲＴ）まで１時間、徐々に温めて、ＴＬＣにより出発物質を完全に消費させた。次いで、反応混合物を氷冷水で処理してＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×４）で抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて粗製物質を得、これを精製せずに次のステップに移した。

無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の上記で調製したメチル化誘導体（３．０ｇ、６．４ｍｍｏｌ）の溶液に、１ＭのＴＢＡＦ（９．５ｍＬ、９．５５ｍｍｏｌ）溶液を加えた。反応混合物をＲＴで２時間または出発物質が消失するまで撹拌した。反応混合物を５％のＨＣｌ溶液と混合して水層をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×３）で抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。粗製物質は、フラッシュクロマトグラフィーを使用して精製し、３回のステップにわたって５５％の収率で白色の固体を得た。¹HNMR (600 MHz, アセトンd₆) δ 7.87 (s, 1H), 7.56 (d, J = 2.28 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 2.46, 8.7 Hz, 1H), 4.30 (q, J = 7.14 Hz, 1H), 3.71 (s, 3H), 2.72 (s, 3H), 1.38 (t, J = 7.14 Hz, 3H); ¹³C NMR (150 MHz, アセトンd₆) δ 166.3, 153.8, 146.2, 132.4, 128.7, 112.2, 112.1, 110.8, 107.0, 106.9, 103.7, 59.5, 15.1, 12.0.

５－メトキシ－２－メチル－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸エチル（インドール３）

無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）中インドール１（３．０ｇ、１３．７６ｍｍｏｌ）の溶液にイミダゾール（２．０ｇ、２８．９ｍｍｏｌ）およびＴＢＤＰＳ（３．７ｍＬ、１４．４５ｍｍｏｌ）を加えた。ＴＬＣによる出発物質の消失後、反応混合物をＲＴで１６時間撹拌した。次いで、反応混合物を５％のＨＣｌ溶液で処理した。有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて灰色の固体を得、これを次のステップにおいて、さらには精製せずにそのまま使用した。

無水ＴＨＦ（６０ｍＬ）中の上記のシリル化インドール（３．１ｇ、６．８ｍｍｏｌ）の溶液に二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（３．０ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（８５ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１時間、連続的に撹拌することにより５０℃まで加熱した。次いで、反応混合物を水と混合し、ＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィー後、Ｎ－Ｂｏｃ保護インドールを白色の固体として採取した（３．２２ｇ、８５％）。

無水ＴＨＦ（１５ｍＬ）中の上記で調製したＮ－ｂｏｃ保護インドール（３．０ｇ、５．４ｍｍｏｌ）の溶液に１ＭのＴＢＡＦ溶液（８．１ｍＬ、８．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をＲＴで２時間または出発物質が消失するまで撹拌した。反応混合物を５％のＨＣｌ溶液と混合して水層をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×３）で抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。粗製物質は、フラッシュクロマトグラフィーを使用して精製し、白色の固体を得た（１．４５ｇ、収率８４．２％）。

無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の上記の５－ヒドロキシインドール誘導体（１．０ｇ、３．１ｍｍｏｌ）の溶液にＮａＨ（油中分散６０％）（１９０ｍｇ、４．７ｍｍｏｌ）およびＭｅＩ（０．３ｍＬ、４．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０℃で撹拌し、ＲＴまで１時間にわたって徐々に温めて、ＴＬＣにより出発物質を完全に消費させた。次いで、反応混合物を氷冷水で処理してＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×４）で抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて粗製物質を得、これを、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して（９２２ｍｇ、収率８９％）を得た。

上記で調製した５－メトキシインドール誘導体（９００ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）をジオキサン（８ｍＬ）中４ＭのＨＣｌ溶液で処理し、１００℃まで２時間加熱した。真空下での揮発物の蒸発後、粗製物質を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィー精製に供して、白色の固体（３４０ｍｇ、５２％）を、または５回のステップにわたって３０％の収率で得た。¹HNMR (600 MHz, アセトンd₆) δ 10.61 (bs, 1H), 7.60 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.25 (d, J = 8.4, 1H), 6.77 (dd, J = 2.5, 8.7 Hz, 1H), 4.33 (q, J = 7.14 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 2.69 (s, 3H), 1.40 (t, J = 7.08 Hz, 3H); ¹³C NMR (150 MHz, アセトンd₆) δ 166.3, 156.4, 145.4, 131.0, 129.3, 112.4, 112.3, 104.7, 104.2, 59.6, 55.8, 15.0, 14.3.

５－メトキシ－１，２－ジメチル－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸エチル（インドール４）

無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中インドール１（４４０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液にＮａＨ（油中分散６０％）（１６０ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）およびＭｅＩ（５７０μＬ、１０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０℃で撹拌し、ＲＴまで３０分間徐々に温めて、ＴＬＣによる出発物質の完全な消費を観察した。次いで、反応混合物を氷冷水で処理してＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×４）で抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて粗製物質を得、これを、ＦＣＣおよびＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用して精製し、３８０ｍｇ、７７％のメチル化インドール４を得た。¹HNMR (600 MHz, アセトンd₆) δ 7.62 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 8.8, 1H), 6.82 (dd, J = 2.6, 8.9 Hz, 1H), 4.32 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 2.72 (s, 3H), 1.41 (t, J = 7.14 Hz, 3H); ¹³C NMR (150 MHz, アセトンd₆) δ 166.3, 156.6, 146.3, 132.7, 128.5, 112.0, 111.0, 104.5, 104.1, 59.6, 55.8, 15.0, 12.1.

５－ヒドロキシ－４－（（６－メトキシ－３，４－ジヒドロイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）メチル）－２－メチル－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸エチル（インドール誘導体５）

氷酢酸／水５：１の溶液（２５０μＬ）中インドール１（３０ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）の溶液に６－メトキシ－テトラヒドロイソキノリン（２０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）およびホルマリン３７％溶液（１２μＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を９０℃で３０分間撹拌して、ＴＬＣによる出発物質の完全な消費を観察し、次いで、反応混合物を真空下で蒸発させて酢酸を除去した。生じた粗製物質をＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）に溶解し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３およびブラインで洗浄した。有機層は、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、生じた粗製物を８０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するＦＣＣに供して、（２７ｍｇ、５８％）の表題の化合物を得た。¹HNMR (600 MHz, CDCl₃) δ 8.27 (bs, 1H), 7.09 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.5, 1H), 6.76 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.68 (dd, J = 2.6, 8.4 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 4.45 (s, 2H), 4.33 (q, J = 4.3 Hz, 2H), 3.75 (m, 5H), 2.91 (bs, 3H), 2.59 (s, 3H), 1.38 (t, J = 7.14 Hz, 3H); ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 166.6, 158.4, 154.7, 143.0, 135.1, 129.5, 127.8, 126.2, 126.1, 113.7, 113.4, 112.5, 111.8, 110.7, 105.7, 60.1, 58.2, 55.5, 54.9, 50.1, 29.9, 29.5, 15.4, 14.8, 14.3.

９－メトキシ－２－メチル－３，６ａ，１１，１４－テトラヒドロ－１２Ｈ－インドロ［４’，５’：５，６］［１，３］オキサジノ［２，３－ａ］イソキノリン－１－カルボン酸エチル（誘導体６）

無水ＥｔＯＨ（１２．０ｍＬ）中のインドール誘導体５（２．２ｇ、５．６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥｔＯＨ２．０ｍＬに溶解した酢酸カリウム（６０２ｍｇ、６．１４ｍｍｏｌ）およびヨウ素（１．４２ｇ、５．６ｍｍｏｌ）を加えた。ヨウ素液を滴下により還流温度で加えた。添加が完了すると、反応混合物を同一温度でさらに３０分間撹拌し、ヨウ素の色が消失するまで飽和チオ硫酸ナトリウム溶液で処理することにより反応をクエンチした。次いで、反応混合物を５％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×４）で抽出した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３およびブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、生じた粗製物を５％のＭＥＯＨ／ＥｔＯＡｃを使用するＦＣＣに供して、１．４５ｇ（６％）の表題の化合物を得た。¹HNMR (600 MHz, DMSOd₆) δ 11.63 (s, 1H), 7.30 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.82 (dd, J = 2.6, 8.5, 1H), 6.76 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.64 (s, 1H), 4.70 (d J = 17.6 Hz, 1H), 4.24 (m, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.32 (m, 5H), 3.08-2.93 (m, 2H), 2.80-2.72 (m, 2H), 2.55 (s, 3H), 1.33 (t, J = 7.14 Hz, 3H); ¹³C NMR (150 MHz, DMSOd₆) δ 165.0, 159.1, 148.4, 143.4, 136.3, 129.6, 129.3, 126.3, 123.9, 112.7, 112.1, 112.0, 110.4, 110.1, 104.1, 85.0, 58.9, 55.0, 53.5, 43.6, 28.7, 14.4.

化合物ＡおよびＢ：１－（エトキシカルボニル）－９－メトキシ－２，１３－ジメチル－３，６ａ，１１，１２，１３，１４－ヘキサヒドロインドロ［４’，５’：５，６］［１，３］オキサジノ［２，３－ａ］イソキノリン－１３－イウムヨウ化物

工業グレードのアセトン（１０ｍＬ）中インドロ－オキサジノイソキノリン誘導体６（５８０ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）の溶液にＭｅＩ（４２０μＬ、７．４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物をＲＴで１６時間撹拌した。次いで、有機溶媒を真空下で完全に蒸発させ、粗製物質を１５％のＤＭＦおよび８５％のＣＨＣｌ_３を使用するＦＣＣに供して、２つのジアステレオマー（ＡおよびＢ）を２：１の比率で得た（全収率８５％中、極性のより低い物質は２６０ｍｇおよび極性のより高い物質は４０９ｍｇ。¹HNMR 極性のより低い誘導体について記載 (化合物A) (600 MHz, DMSOd₆) δ 12.16 (s, 1H), 7.64 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.07 (dd, J = 2.5, 8.7 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.51 (s, 1H), 5.28 (q, J = 16.3 Hz, 1H), 4.29-4.27 (m, 2H), 4.19 (dd, J = 6.0, 12.5 Hz, 1H), 4.04 (dt, J = 5.2, 12.8 Hz, 1H), 3.83 (s, 1H), 3.40-3.37 (m, 1H), 3.21 (dd, J = 5.3, 19.0 Hz, 1H), 2.87 (s, 3H), 2.64 (s, 3H), 1.39 (t, J = 7.14 Hz, 3H); ¹³C NMR 極性のより低いものについて記載 (150 MHz, DMSOd₆) δ 164.7, 160.1, 145.5, 145.2, 133.0, 131.5, 127.7, 123.2, 118.9, 114.1, 113.2, 112.9, 112.3, 105.7, 104.2, 89.4, 62.9, 59.6, 57.4, 55.4, 37.9, 23.0, 14.7, 14.3.

¹HNMR 極性誘導体について記載化合物B (600 MHz, DMSOd₆) δ 12.10 (s, 1H), 7.43 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.99-6.94 (m, 3H), 6.42 (s, 1H), 5.24 (q, J = 16.9 Hz, 1H), 4.30 (m, 2H), 3.90 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.32 (m, 2H), 3.23 (s, 3H), 2.61 (s, 3H), 1.36 (t, J = 7.14 Hz, 3H); ¹³C NMR 極性誘導体について記載 (150 MHz, DMSOd₆) δ 164.7, 160.8, 145.3, 143.1, 133.0, 131.3, 129.6, 122.7, 119.4, 113.8, 113.5, 112.9, 112.2, 104.9, 104.1, 87.7, 59.6, 55.4, 51.8, 47.6, 45.7, 23.0, 14.6, 14.3.

化合物Ｇ：２－（（３－（エトキシカルボニル）－５－メトキシ－１，２－ジメチル－１Ｈ－インドール－４－イル）メチル）－６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－２－イウムヨウ化物

無水ＤＭＦ（５．０ｍＬ）中インドール誘導体５（３９４ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液にＮａＨ（油中分散６０％）（１２０ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）およびＭｅＩ（２００μＬ、３．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０℃で撹拌し、ＲＴまで３０分間徐々に温めて、ＴＬＣによる出発物質の完全な消費を観察した。次いで、反応混合物を氷冷水で処理してＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×４）で抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて粗製物質を得、これを、ＦＣＣおよび２０％ＭｅＯＨ／１％Ｅｔ３Ｎ／ＤＣＭ溶液を使用して精製し、３３６．５ｍｇ、６０％のメチル化インドール８を得た。¹HNMR (600 MHz, アセトンd₆) δ 7.79 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 6.91 (m, 2H), 4.65 (ABq, J = 14.9 Hz, δ = 0.17, 2H), 4.13 (m, 2H), 3.94 (m, 4H), 3.87 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.34 (m, 2H), 3.04 (s, 3H), 2.81 (s, 2H), 2.78 (s, 3H), 1.41 (t, J = 7.14 Hz, 1H); ¹³C NMR (150 MHz, アセトンd₆) δ 167.6, 160.7, 156.9, 149.1, 134.0, 132.1, 129.6, 129.5, 120.5, 114.9, 114.7, 114.0, 108.6, 107.6, 105.5, 62.3, 61.3, 59.1, 57.2, 55.8, 30.9, 25.1, 14.8, 14.0.

化合物Ｄ：５－ヒドロキシ－４－（（６－メトキシ－３，４－ジヒドロイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）メチル）－１，２－ジメチル－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸エチル

氷酢酸／水５：１の溶液（１１ｍＬ）中インドール誘導体２（２．１ｇ、９．０ｍｍｏｌ）の溶液に６－メトキシ－テトラヒドロイソキノリン（１．８３ｇ、９．２３ｍｍｏｌ）およびホルマリン３７％溶液（７６６μＬ、９．４５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を９０℃で３０分間撹拌して、ＴＬＣによる出発物質の完全な消費を観察した。次いで、反応混合物を真空下で蒸発させて酢酸を除去した。生じた粗製物質をＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）に溶解し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３およびブラインで洗浄した。有機層は、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、生じた粗製物を８０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するＦＣＣに供して、２．２ｇ（６３％）の表題の化合物を得た。¹HNMR (600 MHz, アセトンd₆) δ 11.34 (bs, 1H), 7.21 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.71-6.68 (m, 3H), 4.34 (s, 2H), 4.30 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.75 (s, 3H), 5.70 (m, 5H), 2.90-2.84 (m, 5H), 2.60 (s, 3H), 1.36 (t, J = 7.14 Hz, 3H); ¹³C NMR (150 MHz, アセトンd₆) δ 167.0, 159.3, 155.2, 144.1, 135.8, 132.4, 128.4, 127.0, 126.1, 113.9, 113.4, 113.2, 112.0, 110.1, 105.6, 60.2, 58.8, 55.5, 55.4, 50.8, 15.0, 12.3.

化合物Ｃ：９－メトキシ－２，３－ジメチル－３，６ａ，１１，１４－テトラヒドロ－１２Ｈ－インドロ［４’，５’：５，６］［１，３］オキサジノ［２，３－ａ］イソキノリン－１－カルボン酸エチル

無水ＥｔＯＨ中の化合物Ｄの溶液に、ＥｔＯＨ２．０ｍＬに溶解した酢酸カリウムおよびヨウ素を加えた。ヨウ素液を滴下により還流温度で加えた。添加が完了すると、反応混合物を同一温度でさらに３０分間撹拌し、ヨウ素の色が消失するまで飽和チオ硫酸ナトリウム溶液で処理することにより反応をクエンチし、次いで、反応混合物を５％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（５ｍＬ×４）で抽出した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３およびブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。生じた粗製物を５％のＭＥＯＨ／ＥｔＯＡｃを使用するＦＣＣに供して、表題の化合物を得た。¹HNMR (600 MHz, DMSOd₆) δ 7.31 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.82 (dd, J = 2.6, 8.4, 1H), 6.75 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.68 (s, 1H), 4.40 (ABq , J = 17.5 Hz, δ =0.52, 2H), 4.27 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.76 (s, 3H), 3.66 (s, 3H), 3.03 (m, 1H), 2.95 (m, 1H), 2.79-2.70 (m, 2H), 2.60 (s, 3H), 1.33 (t, J = 7.14 Hz, 3H); ¹³C NMR (150 MHz, DMSOd₆) δ 165.2, 159.1, 148.7, 143.8, 136.3, 131.2, 129.4, 126.2, 123.1, 112.8, 112.0, 109.9, 109.3, 104.1, 85.1, 59.3, 55.1, 53.4, 43.5, 29.8, 28.7, 14.4, 12.1.

化合物ＨおよびＩ：１－（エトキシカルボニル）－９－メトキシ－２，３，１３－トリメチル－３，６ａ，１１，１２，１３，１４－ヘキサヒドロインドロ［４’，５’：５，６］［１，３］オキサジノ［２，３－ａ］イソキノリン－１３－イウムヨウ化物

工業グレードのアセトン中の化合物Ｃの溶液にＭｅＩを加え、反応混合物をＲＴで１６時間撹拌した。次いで、有機溶媒を真空下で完全に蒸発させ、粗製物質を１５％のＤＭＦおよび８５％のＣＨＣｌ_３を使用するＦＣＣに供して、２つのジアステレオマーを２：１の比率で得た。¹HNMR 極性のより低い誘導体について記載 (化合物H) (600 MHz, DMSOd₆) δ 7.68 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.07 (dd, J = 2.5, 8.6 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.23 (ABq, J = 16.1 Hz, Δδ = 0.13, 2H), 4.39-4.27 (m, 2H), 4.16 (dd, J = 5.9, 12.5 Hz, 1H), 4.03 (dt, J = 5.0, 12.7 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.41-3.32 (m, 1H), 3.20 (dd, J = 5.2, 18.4 Hz, 1H), 2.89 (s, 3H), 2.69 (s, 3H), 1.39 (t, J = 7.14 Hz, 3H); ¹³C NMR 極性のより低いものについて記載 (150 MHz, DMSOd₆) δ 164.7, 160.2, 146.0, 145.5, 133.1, 133.0, 127.8, 122.4, 118.9, 114.2, 113.2, 112.2, 111.9, 105.6, 104.1, 89.4, 62.8, 59.9, 57.5, 55.5, 37.9, 30.3, 23.0, 14.4, 12.4.

¹HNMR 極性誘導体について記載 (化合物I) (600 MHz, DMSOd₆) δ 7.60 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.44 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 2.6, 8.5 Hz, 1H), 6.44 (s, 1H), 5.19 (q, J = 16.8 Hz, 1H), 4.36-4.27 (m, 2H), 3.86 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.74 (s, 3H), 3.33 (m, 2H), 3.22 (s, 3H), 2.66 (s, 3H), 1.36 (t, J = 7.14 Hz, 3H); ¹³C NMR 極性誘導体について記載 (150 MHz, DMSOd₆) δ 164.7, 160.8, 145.8, 143.3, 133.0, 132.8, 129.7, 121.9, 119.4, 113.9, 113.6, 112.2, 111.9, 104.8, 104.0, 87.7, 59.8, 55.4, 47.6, 30.2, 23.1, 14.3, 12.3.

化合物Ｅ：５－メトキシ－４－（（６－メトキシ－３，４－ジヒドロイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）メチル）－２－メチル－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸エチル（２０１８０７０５－Ａ６８８Ｙ）

無水ＴＨＦ（６０ｍＬ）中の上記のシリル化インドール（３．１ｇ、６．８ｍｍｏｌ）の溶液に二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（３．０ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（８５ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間、連続的に撹拌することにより５０℃まで加熱した。次いで、反応混合物を水と混合し、ＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィー後、Ｎ－Ｂｏｃ保護インドールを白色の固体として採取した（３．２２ｇ、８５％）。

氷酢酸／水５：１の溶液（１．３３ｍＬ）中の前述のステップのインドール誘導体（３１９．０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液に６－メトキシ－テトラヒドロイソキノリンＨＣｌ塩（１９８ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびホルマリン３７％溶液（８１μＬ、１．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を９０℃で３０分間撹拌して、ＴＬＣによる出発物質の完全な消費を観察した。次いで、反応混合物を真空下で蒸発させて酢酸を除去した。生じた粗製物質をＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）に溶解し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３およびブラインで洗浄した。有機層は、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。生じた粗製物を８０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するＦＣＣに供して、３１６ｍｇ（６４％）を得た。

無水ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中の上記の生じた５－ヒドロキシインドール誘導体（１３５ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の溶液にＮａＨ（油中分散６０％、１１．０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）およびＭｅＩ（１７．５μＬ、０．２７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０℃で撹拌し、ＲＴまで１時間にわたって徐々に温めて、ＴＬＣによる出発物質の完全な消費を観察した。次いで、反応混合物を氷冷水で処理してＥｔＯＡｃ（５ｍＬ×４）で抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて粗製物質を得、これを、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して（９８ｍｇ、収率７１％）を得た。

上記で調製した５－メトキシインドール誘導体（８０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の溶液にジオキサン（４．０ｍＬ）中の４ＭのＨＣｌ溶液を加え、溶液を１００℃まで２時間加熱した。真空下での揮発物の蒸発後、粗製物質を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィー精製に供して白色の固体（４５ｍｇ、６９．０％）を得た。¹HNMR (600 MHz, アセトンd₆) δ 7.23 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.61 (dd, J = 2.6, 8.8 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 4.16 (s, 2H), 4.09 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.39 (s, 2H), 2.82 (s, 2H), 2.63 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.50 (m, 5H), 1.16 (t, J = 7.1 Hz, 3H); ¹³C NMR 極性誘導体について記載 (150 MHz, DMSOd₆) δ 166.5, 158.8, 154.3, 137.0, 132.4, 129.0, 128.0, 127.6, 113.8, 112.5, 111.0, 109.8, 109.1, 60.1, 58.2, 55.7, 55.4, 52.4, 50.5, 30.7, 14.8, 13.8.

化合物ＦおよびＪ：

無水ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中の上記の生じた５－ヒドロキシインドール誘導体（４０．０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の溶液にＮａＨ（油中分散６０％、４．０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）およびＭｅＩ（１４．０μＬ、０．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０℃で撹拌し、ＲＴまで１時間にわたって徐々に温めて、ＴＬＣによる出発物質の完全な消費を観察した。次いで、反応混合物を氷冷水で処理してＥｔＯＡｃ（２．０ｍＬ×４）で抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて粗製物質を得、これを、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して１９．０ｍｇ（収率３７％）を得た。

化合物Ｋ：

化合物を次のように合成した。化合物Ｊの溶液にＮａＨ（油中分散６０％、１１．０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）およびＭｅＩ（１７．５μＬ、０．２７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０℃で撹拌し、ＲＴまで１時間にわたって徐々に温めて、ＴＬＣによる出発物質の完全な消費を観察した。次いで、反応混合物を氷冷水で処理してＥｔＯＡｃで抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて粗製物質を得、これを、ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。

結合アッセイの結果

図６は、ＰＤ１０２８０７および化合物Ａ～Ｋの、受容体ＣＨＲＭ１～５（Ｍ１～Ｍ５）に対する受容体結合アッセイの結果を示す。１×１０^－９Ｍ、１×１０^－８Ｍ、１×１０^－７Ｍ、１×１０^－６Ｍおよび１×１０^－５Ｍの濃度のＰＤ１０２８０７および化合物Ａ～Ｋを、放射性リガンド、および受容体を有する細胞膜を用いた標準的結合アッセイにおいて試験した。化合物の結合は、各標的に特異的な放射活性標識リガンドの結合の阻害パーセントとして算出し、Ｋｉ値を決定した。Ｋｉ値は、以下の表１に提示する。ＣＨＲＭ１では、［^３Ｈ］ピレンゼピン（２ｎＭ）を放射性リガンドとして、およびヒト組換えＣＨＲＭ１受容体を有するＣＨＯ細胞膜を使用して、結合アッセイを実施した。インキュベーション時間は、室温で６０分であった。ＣＨＲＭ２では、［^３Ｈ］ＡＦ－ＤＸ３８４（２ｎＭ）を放射性リガンドとして、およびヒト組換えＣＨＲＭ２受容体を有するＣＨＯ細胞膜を使用して、結合アッセイを実施した。インキュベーション時間は同様に、室温で６０分であった。ＣＨＲＭ３では、［^３Ｈ］４－ＤＡＭＰ（０．２ｎＭ）を放射性リガンドとして、およびヒト組換えＣＨＲＭ３受容体を有するＣＨＯ細胞膜を使用して、結合アッセイを実施した。インキュベーション時間は同様に、室温で６０分であった。ＣＨＲＭ４では、［^３Ｈ］４－ＤＡＭＰ（０．２ｎＭ）を放射性リガンドとして、およびヒト組換えＣＨＲＭ４受容体を有するＣＨＯ細胞膜を使用して、結合アッセイを実施した。インキュベーション時間は同様に、室温で６０分であった。ＣＨＲＭ５では、［^３Ｈ］４－ＤＡＭＰ（０．３ｎＭ）を放射性リガンドとして、およびヒト組換えＣＨＲＭ５受容体を有するＣＨＯ細胞膜を使用して、結合アッセイを実施した。インキュベーション時間は同様に、室温で６０分であった。

図７および８は、初代ＢＦＵ－Ｅ培養アッセイの結果を示す。図７は、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、ＨおよびＩの結果を示し、一方、図８は、化合物Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＪおよびＫの結果を示す。図７および８のデータは、ＰＤ１０２８０７および化合物Ａ～ＫによりＢＦＵ－Ｅ増殖が誘導されることを実証する。高度に精製したＢＦＵ－Ｅは、ｌｉｎ－Ｔｅｒ－１１９－ＣＤ１６／ＣＤ３２－Ｓｃａ－１－ＣＤ４１－ｃ－Ｋｉｔ＋ＣＤ７１／Ｃｄ２４ａ^{１０％ｌｏｗ}集団として、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）法を使用して単離した。ＢＦＵ－Ｅは、ｒｍＳＣＦ、ＥＰＯおよびｒｍＩＧＦ－１を含む培地中、指示濃度のＰＤ１０２８０７または化合物Ａ～Ｋの存在下で培養した。培養系における９日目の細胞数を示すと、非処理よりも化合物Ａ～Ｋで処理した培養物において細胞増殖倍率が有意に高かった。

図９は、ＰＤ１０２８０７ならびに化合物ＡおよびＢの薬物動態プロファイル（血漿）および脳浸透アッセイを示す。濃度（上パネル）および濃度比（血漿／脳）（下パネル）を図９に示す。図９のデータは、化合物ＡおよびＢが、ＰＤ１０２８０７と比較して脳浸透の低下を示すことを実証する。ＰＤ１０２８０７ならびに化合物ＡおよびＢは、マウスに腹腔内注射した。血液を各時点で採取し、これを移した抗凝固剤を含むチューブを遠心分離して血漿を得た。脳試料は、各時点で採取し、次いで、液体窒素中に急速冷凍して－７５±１５℃に維持した。脳試料をホモジナイズした。血漿および脳試料におけるＰＤ１０２８０７ならびに化合物ＡおよびＢの濃度は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法を使用して解析した。

図１０は、ｉｎｖｉｖｏでの貧血動物モデル有効性アッセイにおける化合物の結果を示し、化合物ＡおよびＢによりｉｎｖｉｖｏにおいて貧血が処置されることを実証する。Ｃ５７ｂｌ／６マウスに６０ｍｇ／ｋｇのフェニルヒドラジンを注射して溶血を誘導した。マウスに媒体対照または化合物ＡもしくはＢ（３０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを送達した。末梢血試料を後眼窩からヘパリン処理毛細管チューブを使用してＫ２－ＥＤＴＡを有する血液採取チューブ内に採取した。Ｈｅｍａｖｅｔ９５０を使用して全血球計算を実施した。ヘマトクリット（ＨＣＴ）、赤血球（ＲＢＣ）およびヘモグロビン（Ｈｂ）値を示す。

図１１は、ｉｎｖｉｖｏでの貧血動物モデル有効性アッセイにおける化合物の結果を示し、化合物ＢおよびＩによりｉｎｖｉｖｏにおいて貧血が処置されることを実証する。Ｃ５７ｂｌ／６マウスに６０ｍｇ／ｋｇのフェニルヒドラジンを注射して溶血を誘導した。マウスに媒体対照または化合物Ｂ（１．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ）またはＩ（０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを皮下注射により送達した。末梢血試料を後眼窩からヘパリン処理毛細管チューブを使用してＫ２－ＥＤＴＡを有する血液採取チューブ内に採取した。Ｈｅｍａｖｅｔ９５０を使用して全血球計算を実施した。ヘマトクリット（ＨＣＴ）、赤血球（ＲＢＣ）およびヘモグロビン（Ｈｂ）値を示す。

図１２は、化合物Ｇの薬物動態プロファイル（血漿）および脳浸透アッセイを示す。濃度（上パネル）および濃度比（血漿／脳）（下パネル）を図１２に示す。図１２のデータは、化合物Ｇが、ＰＤ１０２８０７と比較して脳浸透の低下を示すことを実証する。化合物Ｇは、マウスに腹腔内注射した。血液を各時点で採取し、これを移した抗凝固剤を含むチューブを遠心分離して血漿を得た。脳試料は、各時点で採取し、次いで、液体窒素中に急速冷凍して－７５±１５℃に維持した。脳試料をホモジナイズした。血漿および脳試料における化合物Ｇの濃度は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法を使用して解析した。

本発明の好ましい実施形態であると現在考えられるものを示し、記載しているが、当業者は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に留まる種々の変更および改変を行い得る。

Claims

式：

の化合物であって、式中、
Ｒ^１が、ＨまたはＣＨ_３であり、
Ｒ^２が、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり、
Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨ、ＳＣＨ_３および次の構造（１－１）：

から独立的に選択されるが、ただし、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５の１つまたは２つが、式（１－１）の構造であり、
Ｒ^６が、ＨまたはＣＨ_３であり、
Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択され、
そして前記式（１）の化合物が、前記式（１）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む、化合物。
前記化合物が、次の式：

を有する、請求項１に記載の化合物。
前記化合物が、次の式：

を有する、請求項１に記載の化合物。
Ｒ^１が水素原子である、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
Ｒ^１がメチルである、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
Ｒ^２がエチルである、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物。
Ｒ^１が水素原子であり、そしてＲ^２がエチルである、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
Ｒ^１がメチルであり、そしてＲ^２がエチルである、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
式：

の化合物であって、式中、
Ｒ^１が、ＨまたはＣＨ_３であり、
Ｒ^２が、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり、
Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨ、ＳＣＨ_３および次の構造（１－２）：

から独立的に選択されるが、ただし、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５の１つまたは２つが、式（１－２）の構造であり、
Ｒ^６が、ＨまたはＣＨ_３であり、
Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択され、
Ｘ^－が、前記化合物の正荷電部分を均衡させるアニオンであり、そして
前記式（１ｃ）の化合物が、前記式（１ｃ）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む、化合物。
前記化合物が、次の式：

を有する、請求項９に記載の化合物。
前記化合物が、次の式：

を有する、請求項９に記載の化合物。
Ｒ^１が水素原子である、請求項９から１１のいずれか一項に記載の化合物。
Ｒ^１がメチルである、請求項９から１１のいずれか一項に記載の化合物。
Ｒ^２がエチルである、請求項９から１３のいずれか一項に記載の化合物。
Ｒ^１が水素原子であり、そしてＲ^２がエチルである、請求項９から１１のいずれか一項に記載の化合物。
Ｒ^１がメチルであり、そしてＲ^２がエチルである、請求項９から１１のいずれか一項に記載の化合物。
式：

の化合物であって、
Ｒ^１が、ＨまたはＣＨ_３であり、
Ｒ^２が、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり、
Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択され、そして
前記式（２ｂ）の化合物が、前記式（２ｂ）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む、化合物。
Ｒ^２がエチルである、請求項１７に記載の化合物。
前記式（２ｂ）の化合物が、単一のエナンチオマーである、請求項１７および１８のいずれか一項に記載の化合物。
前記化合物が、次の式：

を有し、式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＸ^－が、請求項１７に定義するものである、請求項１７に記載の化合物。
ムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプ４（Ｍ４）活性から生じる疾患または状態を被験体において処置する方法であって、前記方法が、薬学的有効量のＭ４特異的アンタゴニストを前記被験体に投与するステップを含み、前記Ｍ４特異的アンタゴニストが、次の式：

を有する化合物であり、式中、
Ｒ^１が、ＨまたはＣＨ_３であり、
Ｒ^２が、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり、
Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨ、ＳＣＨ_３および次の構造（１－１）：

から独立的に選択されるが、ただし、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５の１つまたは２つが、式（１－１）の構造であり、
Ｒ^６が、ＨまたはＣＨ_３であり、
Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択され、
そして前記式（１）の化合物が、前記式（１）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む、方法。
前記化合物が、次の式：

を有する、請求項２１に記載の方法。
前記化合物が、次の式：

を有する、請求項２１に記載の方法。
Ｒ^１が水素原子である、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
Ｒ^１がメチルである、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
Ｒ^２がエチルである、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
Ｒ^１が水素原子であり、そしてＲ^２がエチルである、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
Ｒ^１がメチルであり、そしてＲ^２がエチルである、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
ムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプ４（Ｍ４）活性から生じる疾患または状態を被験体において処置する方法であって、前記方法が、薬学的有効量のＭ４特異的アンタゴニストを前記被験体に投与するステップを含み、前記Ｍ４特異的アンタゴニストが、次の式：

を有する化合物であり、式中、
Ｒ^１が、ＨまたはＣＨ_３であり、
Ｒ^２が、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり、
Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨ、ＳＣＨ_３および次の構造（１－２）：

から独立的に選択されるが、ただし、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５の１つまたは２つが、式（１－２）の構造であり、
Ｒ^６が、ＨまたはＣＨ_３であり、
Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択され、
Ｘ^－が、前記化合物の正荷電部分を均衡させるアニオンであり、そして
前記式（１ｃ）の化合物が、前記式（１ｃ）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む、方法。
前記化合物が、次の式：

を有する、請求項２９に記載の方法。
前記化合物が、次の式：

を有する、請求項２９に記載の方法。
Ｒ^１が水素原子である、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
Ｒ^１がメチルである、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
Ｒ^２がエチルである、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
Ｒ^１が水素原子であり、そしてＲ^２がエチルである、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
Ｒ^１がメチルであり、そしてＲ^２がエチルである、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
前記疾患または状態が、貧血である、請求項２１から３６のいずれか一項に記載の方法。
貧血を処置する方法であって、前記方法が、薬学的有効量のＭ４特異的アンタゴニストを被験体に投与するステップを含み、前記Ｍ４特異的アンタゴニストが、次の式：

を有する化合物であり、式中、
Ｒ^２が、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり、
Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択され、そして
前記式（２）の化合物が、前記式（２）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む、方法。
Ｒ^２がエチルである、請求項３８に記載の方法。
前記化合物が、次の式：

を有する、請求項３８に記載の方法。
Ｒ^２がエチルである、請求項４０に記載の方法。
ムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプ４（Ｍ４）活性から生じる疾患または状態を被験体において処置する方法であって、前記方法が、薬学的有効量のＭ４特異的アンタゴニストを前記被験体に投与するステップを含み、前記Ｍ４特異的アンタゴニストが、次の式：

を有する化合物であり、
Ｒ^１が、ＨまたはＣＨ_３であり、
Ｒ^２が、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり、
Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択され、そして
前記式（２ｂ）の化合物が、前記式（２ｂ）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む、方法。
Ｒ^２がエチルである、請求項４２に記載の方法。
前記式（２ｂ）の化合物が、単一のエナンチオマーである、請求項４２および４３のいずれか一項に記載の方法。
前記化合物が、次の式：

を有し、式中、Ｒ^１、Ｒ^２およびＸ^－が、請求項４６に定義するものである、請求項４２に記載の方法。
前記疾患または状態が、貧血である、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の方法。
赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ－Ｅ）細胞の自己複製を促進するための方法であって、前記ＢＦＵ－Ｅ細胞をＭ４特異的アンタゴニストと接触させるステップを含む、方法。
前記Ｍ４特異的アンタゴニストが、次の式：

を有する化合物であり、式中、
Ｒ^１が、ＨまたはＣＨ_３であり、
Ｒ^２が、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり、
Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨ、ＳＣＨ_３および次の構造（１－１）：

から独立的に選択されるが、ただし、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５の１つまたは２つが、式（１－１）の構造であり、
Ｒ^６が、ＨまたはＣＨ_３であり、
Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択され、
前記方法が、ＢＦＵ－Ｅ細胞の自己複製の増加を生じ、そして
前記式（１）の化合物が、前記式（１）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む、請求項４７に記載の方法。
前記Ｍ４特異的アンタゴニストが、次の式：

を有する化合物であり、式中、
Ｒ^２が、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり、
Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択され、
前記方法が、ＢＦＵ－Ｅ細胞の自己複製の増加を生じ、そして
前記式（２）の化合物が、前記式（２）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む、請求項４７に記載の方法。
前記Ｍ４特異的アンタゴニストが、次の式：

を有する化合物であり、
Ｒ^１が、ＨまたはＣＨ_３であり、
Ｒ^２が、炭素原子１～３個を有する炭化水素基であり、
Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^７、Ｒ^８およびＲ^９が、水素原子、ハロゲン原子、ＣＨ_３、ＣＦ_３、ＯＨ、ＯＣＨ_３、ＳＨおよびＳＣＨ_３から独立的に選択され、
前記方法が、ＢＦＵ－Ｅ細胞の自己複製の増加を生じ、そして
前記式（２ｂ）の化合物が、前記式（２ｂ）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、エナンチオマーおよび多形体を含む、請求項４７に記載の方法。
前記ＢＦＵ－Ｅ細胞の自己複製の増加を利用して貧血を処置する、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の方法。