ES2623711T3 - Antagonistas de hedgehog, procedimientos y usos relacionados con los mismos - Google Patents

Abstract

Uso de un antagonista de hedgehog para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la proliferación no deseada de células, por el que se determina que las células sobreexpresan un gen gli-1, Y por el que dicho antagonista provoca proliferación celular disminuida, en el que dicha proliferación celular no deseada es hiperplasia benigna de próstata o un cancer, y en el que dicho cancer se selecciona de cancer asociado con uno o mas de los tejidos de próstata, mama y vejiga, en el que el antagonista de hedgehog es un inhibidor de la ruta de señalización de hedgehog y se selecciona de: a) un anticuerpo contra hedgehog que se une a una proteina hedgehog, o b) un compuesto que tiene la estructura del compuesto B:**Fórmula**

Description

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DESCRIPCION

Antagonistas de hedgehog, procedimientos y usos relacionados con los mismos Antecedentes de la invencion

La formacion de patrones es la actividad que las celulas embrSonarias forman disposiciones espaciales ordenadas de tejidos diferenciados. La complejidad fisica de los organismos superiores surge durante la embriogenesis a traves de la interaccion de linaje intrinseco celular y serializacion extrinseca celular. Las interacciones inductivas son esenciales para la formacion de patrones embrionarios en el desarrollo de los vertebrados desde la primera definicion del plan corporal, hasta la formacidn de patrones de los sistemas organico, hasta la generacibn de diversos tipos de celulas durante la diferenciacion tisular (Davidson, E., (1990) Development 108: 365-389; Gurdon, J, B., (1992) Cell 68: 185-199; Jessell, T. M. et aL, (1992) Cell 68: 257-270). Los efectos de las interacciones celulares del desarrollo son variados. Tipicamente, las cblulas que responden se desvian desde una ruta de diferenciacion celular a otra induciendo que las celulas difieran tanto desde el estado no inducido como desde el estado inducido de las celulas que responden (inducciones). A veces las celulas inducen a sus vecinas para que se diferencien como ellas mismas (induccion homeogenetica); en otros casos una celula inhibe que sus vecinas se diferencien como ella misma. Las interacciones celulares en el desarrollo temprano pueden ser secuenciales, de tal manera que una induccion inicial entre dos tipos de celulas conduce a una amplificacion progresiva de la diversidad. Ademas, las interacciones inductivas se producen no solamente en embriones, sino tambien en celulas adultas, asi, y pueden actuar para establecer y mantener patrones morfogeneticos asi como para inducir la diferenciacion (JB. Gurdon (1992) Cell 68:185-199).

Los miembros de la familia de hedgehog de moleculas de serializacion median muchos procesos importantes de formacion de patrones de corto y largo alcance durante el desarrollo de invertebrados y vertebrados. En la mosca, un unico gen de hedgehog regula la formacion de patrones segmentarios y de discos imaginarios. Por el contrario, en los vertebrados, una familia de genes de hedgehog esta implicada en el control de la asimetria izquierda-derecha, la polaridad en el SNC, somitos y extremidades, organogenesis, condrogenesis y espermatogenesis.

El primer gen de hedgehog fue identificado mediante deteccion genetica en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (Nusslein-Volhard, C. y Wieschaus, E. (1980) Nature 287, 795-801). Esta deteccion identified varias mutaciones que afectaban al desarrollo embrionario y larval. En 1992 y 1993, se presento la naturaleza molecular del gen hedgehog de Drosophila (hh) (C.F., Lee et al. (1992) Cell 71, 33-50), y desde entonces, se han aislado varios homologos de hedgehog a partir de varias especies de vertebrados. Aunque se ha encontrado solamente un gen de hedgehog en Drosophila y otros invertebrados, hay multiples genes de Hedgehog presentes en los vertebrados.

La familia de genes de hedgehog en vertebrados incluye al menos cuatro miembros, por ejemplo, paralogos del unico gen de hedgehog de Drosophila. Dichas proteinas y genes hedgehog a modo de ejemplo se describen en las publicaciones PCT WO 95/18856 y WO 96/17924. Tres de estos miembros, denominados en el presente documento Desert hedgehog (Dhh), Sonic hedgehog (Shh) e India hedgehog (//?/?), aparentemente existen en todos los vertebrados. incluyendo peces, aves y mamiferos. Un cuarto miembro, denominado en el presente documento Tiggy-winkle hedgehog (THhf), aparece como especifico de peces. Desert hedgehog (Dhh) se expresa principalmente en los testiculos, tanto en el desarrollo embrionario en ratones como en roedores adultos y seres humanos; India hedgehog (Ihh) esta implicado en el desarrollo oseo durante la embriogenesis y la formacion osea en adultos; y Shh, que, como se describe anteriormente, estb implicado principalmente en las actividades morfogenica y neuroinductiva. Dados las funciones inductivas criticas de los polipeptidos de hedgehog en el desarrollo y mantenimiento de los organos de vertebrados, la identificacion de proteinas de interaccion de hedgehog es de suma importancia en contextos tanto clinicos como de investigacion.

Las diversas proteinas de Hedgehog consisten en un peptido serial, una region N-terminal altamente conservada y un dominio C-terminal mas divergente. Ademas de la escision de secuencia de senal en la ruta de secrecion (Lee, JJ. et al (1992) Cell 71:33-50; Tabata, T. et al (1992) Genes Dev. 2635-2645; Chang, D.E. et al (1994) Development 120: 3.339-3.353), las proteinas precursors de Hedgehog experimentan una escision autoproteolitica interna que depende de secuencias conservadas en la parte C-terminal (Lee et al. (1994) Science 266:1528-1537; Porter et al. (1995) Nature 374:363-366). Esta autoescision conduce a un peptido N-terminal de 19 kD y un peptido C-terminal de 26 a 28 kD (Lee et al. (1992) supra; Tabata et al. (1992) supra; Chang et al. (1994) supra; Lee et al. (1994) supra; Bumcrot, D.A., et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:2294-2303; Porter et al. (1995) supra; Ekker, S.C. et al (1995) Curr. Biol. 5:944-955; Lai, C.J. et al (1995) Development 121:2349-2360). El peptido N-terminal se mantiene estrechamente asociado a la superficie de las celulas en las que se sintetizo, mientras que el pdptido C-terminal puede difundir libremente tanto in vitro como in vivo (Porter et al. (1995) Nature 374:363; Lee et al. (1994) supra; Bumcrot et al. (1995) supra: Marti. E. et al (1995) Development 121:2537-2547; Roelink, H. et al (1995) Cell 81:445-455). Curiosamente, la retencion en la superficie celular del peptido N-terminal depende de la autoescision, ya que una forma truncada de HH codificada por un ARN que termina precisamente en la posicion normal de la escision interna puede difundir in vitro (Porter et al. (1995) supra) e in vivo (Porter, J.A. et al (1996) Cell 86, 21-34). Los estudios bioquimicos han demostrado que la escision autoproteolitica de la proteina precursora HH transcurre a traves de un intermedio tioester interno que posteriormente se escinde en una sustitucion nucleofila. Es probable que el nucleofilo sea una pequena molecula lipofila que queda ligada covalentemente al extremo C-terminal del N-peptido

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(Porter et al. (1996) supra), fijandolo a la superficie de la celula. Las implicaciones biologicas son profundas, Como resultado de la fijacion, se genera una alta concentracion local de peptido Hedgehog N-terminal sobre la superficie de las celulas productoras de Hedgehog. Este peptido N-terminal es tanto necesario como suficiente para actividades de senalizacion de Hedgehog de corta y largo alcance en Drosophila y vertebrados (Porter et al, (1995) supra; Ekker et al. (1995) supra; Lai et al. (1995) supra; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81:445-455; Porter et al. (1996) supra; Fietz. M J. et al. (1995) Curr. Biol. 5:643-651; Fan, C.-M. et al. (1995) Cell 81:457-465; Marti, E., et al. (1995) Nature 375:322-325; Lopez-Martinez et al. (1995) Curr._Biol 5:791-795: Ekker, S.C. et al. (1995) Development 121:2337-2347; Forbes, A.J. et al. (1996) Development 122:1125-1135).

HH se ha implicado en procesos de formacion de patrones de corto y largo alcance en diversos sitios durante el desarrollo de Drosophila. En la definition de polaridad de los segmentos en embriones tempranos, tiene efectos de corto alcance que parecen estar mediados directamente, mientras que en la formacion de patrones de los discos imaginarios, induce efectos de largo alcance a traves de la induccion de senales secundarias.

En vertebrados, varios genes de hedgehog se han clonado en los ultimos anos. De estos genes, Shh ha recibido la mayor parte de atencion experimental, ya que se expresa en diferentes centros organizadores, que son las fuentes de senales que forman los patrones de los tejidos vecinos. Las evidencias recientes indican que Shh esta implicado en estas interacciones.

La expresion de Shh se inicia poco despues del comienzo de la gastrulacion en el supuesto mesodermo de la linea media, el nodo en ratones (Chang et al. (1994) supra; Echelard, Y. et al. (1993) Cell 75:1417-1430), rata (Roelink, H. et al. (1994) Cell 76:761-775) y polios (Riddle, R.D. et al. (1993) Cell 75: 1401-1416), y en la cubierta protectora de pez cebra (Ekker et al. (1995) supra; Krauss, S. et al. (1993) Cell 75:1431-1444). En embriones de polio, el patron de expresion de Shh en el nodo desarrolla una asimetria izquierda-derecha, que parece ser responsable de la position izquierda-derecha del corazon (Levin, M. et al. (1995) Cell 82:803-814).

En el SNC, parece que Shh de la notocorda y placa ventral induce el destino de las celulas ventrales. Cuando se expresa de forma ectopica, Shh conduce a una ventralizacion de grandes regiones de mesencefalo y rombencefalo en ratones (Echelard et al. (1993) supra; Goodrich, L.V. et al. (1996) Genes Dev. 10:301-312). Xenopus (Roelink, H. et al. (1994) supra, Ruiz i Altaba, A. et al. (1995) Mol. Cell. Neurosci. 6:106-121), y pez cebra (Ekker et al. (1995) supra; Krauss et al. (1993) supra; Hammerschmidt, M., et al. (1996) Genes Dev. 10:647-658). En explantes de neuroectodermo intermedio a nivel de la medula espinal, la proteina Shh induce el desarrollo de la placa ventral y las neuronas motoras con umbrales de concentracion distintos, la placa ventral en concentracion elevada y las neuronas motoras en concentracion baja (Roelink et al. (1995) supra; Marti et al. (1995) supra; Tanabe, Y. et al. (1995) Curr. Biol. 5:651-658). Ademas, el bloqueo con anticuerpos sugiere que se requiere Shh producido por la notocorda para la induccion mediada por la notocorda de los destinos de las neuronas motoras (Marti et al. (1995) supra). Por lo tanto, concentraciones elevadas de Shh sobre la superficie de las celulas de la linea media productoras de Sff parecen explicar la induccion mediada por contacto de la placa ventral observada in vitro (Placzek, M. et al. (1993) Development 117: 205-218), y el posicionamiento en la linea media de la placa ventral justo por encima de la notocorda in vivo. Las concentraciones mas bajas de Shh liberadas desde la notocorda y la placa ventral presumiblemente inducen neuronas motoras en regiones ventrolaterales mas distantes en un proceso que se ha demostrado que es independiente del contacto in vitro (Yamada, T. et al. (1993) Cell 73:673-686). En explantes tornados a nivel del mesencefalo y prosencefalo, Shh tambien induce los tipos apropiados de celulas neuronales ventrolaterales, precursores dopaminergicos (Heynes, M. et al. (1995) Neuron 15:35-44; Wang, M.Z. et al. (1995) Nature Med. 1:1184-1188) y colinergicos (Ericson, J. et al. (1995) Cell 81; 747-756), respectivamente, lo que indica que Shh es un inductor comiin de la especificacion ventral sobre toda la longitud del SNC. Estas observaciones plantean una cuestion sobre el modo en el que la respuesta diferencial a Shh esta regulada en posiciones anteroposteriores particulares.

Shh de la linea media tambien forma los patrones de las regiones paraxiales del embrion en vertebrados, los somitos del tronco (Fan et al. (1995) supra) y el mesenquima cefalico rostral de los somitos (Hammerschmidt et al. (1996) supra). En explantes de mesodermo paraxial de polio y raton, Shh promueve la expresion de marcadores especificos de esclerotoma tales como Pax! y Twist, en detrimento del marcador del dermamiotoma Pax3. Ademas, los experimentos de barrera de filtro sugieren que Shh media la induccion del esclerotoma directamente en lugar de por la activation de un mecanismo de senalizacion secundario (Fan, C.-M. y Tessier-Lavigne, M. (1994) Cell 79, 1175-1186).

Shh tambien induce la expresion de genes del miotoma (Hammerschmidt et al. (1996) supra; Johnson, R.L. et al. (1994) Cell 79:1165-1173; MLinsterberg, A.E. et al. (1995) Genes Dev. 9:2911-2922; Weinberg, E.S. et al. (1996) Development 122: 271-280), aunque experimentos recientes indican que se requieren miembros de la familia WNT, homologos en vertebrados de Drosophila wingless, de manera conjunta (MLinsterberg et al. (1995) supra). Extranamente, la induccion del miotoma en polios requiere concentraciones de Shh mas elevadas que la induccion de marcadores del esclerotoma (MLinsterberg et al. (1995) supra), aunque el esclerotoma se origina a partir de celulas somiticas ubicadas mucho mas cerca de la notocorda. Se obtuvieron resultados similares en el pez cebra, en el que concentraciones elevadas de Hedgehog inducen la expresion de genes marcadores del miotoma y reprimen la del esclerotoma (Hammerschmidt et al. (1996) supra). En contraste con los amniotas, sin embargo, estas observaciones son coherentes con la arquitectura del embrion de pez, ya que en este caso, el miotoma es el componente

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En los primordios de las extremidades en vertebrados, un subconjunto de celulas mesenquimales posteriores, la "zona de actividad polarizante" (ZPA), regula la identidad de los digitos anteroposteriores (revisado en Honig, L.S. (1981) Nature 291:72-73). La expresion ectopica de Shh o la aplicacion de perlas empapadas en peptidos de Shh imita el efecto de injertos de ZPA anterior, generando una duplicacion de imagen especular de los digitos (Chang et al. (1994) supra; Lopez-Martinez et al. (1995) supra; Riddle et al. (1993) supra) (Fig. 2g). Por lo tanto, parece que la identidad de los digitos depende principalmente de la concentracion de Shh, aunque es posible que otras sehales puedan transmits esta informacion a traves de las distancias sustanciales que parece que se requiere para la formacion de patrones AP (100 a 150 pm). De manera similar a la interaccion de HH y DPP en los discos imaginarios de Drosophila, Shh en los primordios de las extremidades en vertebrados activa la expresion de Bmp2 (Francis, PH et al. (1994) Development 120:209-218), un homologo de dpp. Sin embargo, a diferencia de DPP en Drosophila. Bmp2 no logra imitar el efecto polarizante de Shh tras la aplicacion ectopica en el primordio de las extremidades de polio (Francis et al. (1994) supra). Ademas de la formacion de patrones anteroposteriores, Shh tambien parece estar implicado en la regulacion de la excrecencia proximodistal de las extremidades induciendo la sintesis del factor de crecimiento de fibroblastos FGF4 en el borde ectodermico apical posterior (Laufer, E. et al. (1994) Cell 79:993-1003; Niswander, L. et al. (1994) Nature 371:609-612).

Es probable que la estrecha relacion entre las proteinas Hedgehog y BMP se haya conservado en muchos, pero probablemente no todos, los sitios de expresion de Hedgehog de vertebrados. Por ejemplo, en el intestino posterior de polio, se ha demostrado que Shh induce la expresion de Bmp4, otro homologo de dpp de vertebrados (Roberts, DJ et al. (1995) Development 121:3163-3174). Ademas, Shh y Bmp2, 4, o 6 muestran una sorprendente correlacion en su expresion en celulas epiteliales y mesenquimales del estomago, el sistema urogenital, el pulmon, los primordios dentales y foliculos pilosos (Bitgood, MJ y McMahon, A.P. (1995) Dev. Biol. 172:126-138). Ademas, Ihh, uno de los otros dos genes Hedgehog de raton, se expresa adyacente a las celulas que expresan Bmp en el intestino y el cartilago en desarrollo (Bitgood y McMahon (1995) supra).

Las evidencias recientes sugieren un modelo en el que Ihh desempena una funcion crucial en la regulacion del desarrollo condrogenico (Roberts et al. (1995) supra). Durante la formacion del cartilago, los condrocitos provienen desde un estado proliferativo a traves de un estado intermedio e prehipertrofico hasta condrocitos hipertroficos diferenciados. Ihh se expresa en los condrocitos prehipertroficos e inicia una cascada de senalizacion que conduce al bloqueo de la diferenciacion de condrocitos. Su diana directa es el pericondrio que rodea al dominio de expresion IHH, que responde por la expresion de Gli y Patched (PTC), dianas transcripcionales conservadas de las sehales de Hedgehog (vease a continuacion). Muy probablemente, esto conduce a senalizacion secundaria que da como resultado la sintesis de la proteina relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP) en el pericondrio periarticular. PTHrP por si misma devuelve sehales a los condrocitos prehipertroficos, bloqueando su diferenciacion posterior. Al mismo tiempo, PTHrP reprime la expresion de Ihh, formando de este modo un bucle de retroalimentacion negativa que modula la tasa de diferenciacion de los condrocitos.

Patched se identified originalmente en Drosophila como un gen de polaridad de segmento, uno de un grupo de genes de desarrollo que afectan a la diferenciacion celular en los segmentos individuales que se producen en una serie homologa a lo largo del eje anterior-posterior del embrion. Vease Hooper, J.E. et al. (1989) Cell 59:751; y Nakano, Y. et al. (1989) Nature 341:508. Los patrones de expresion del homologo en vertebrados de patched sugieren su implicacion en el desarrollo del tubo neural, el esqueleto, las extremidades, la estructura craneofacial y la piel.

Estudios gendticos y funcionales demuestran que patched es parte de la cascada de senalizacion de hedgehog, una ruta evolutivo conservado que regula la expresion de varios genes posteriores. vease Perrimon, N. (1995) Cell 80:517; y Perrimon, N. (1996) Cell 86:513. Patched participa en la represion transcripcional constitutiva de los genes diana; su efecto se contrarresta por una glicoproteina segregada, codificada por hedgehog, o un homologo de vertebrado, que induce la activacion transcripcional. Los genes bajo el control de esta ruta incluyen miembros de las familias Wnt y TGF-beta.

Las proteinas de Patched poseen dos grandes dominios extracelulares, doce segmentos transmembrana y varios segmentos citoplasmaticos. Vease Hooper, supra: Nakano, supra; Johnson, R.L. et al. (1996) Science 272:1668; y Hahn, H. et al. (1996) Cell 85:841. La funcion bioquimica de patched en la ruta de senalizacion de hedgehog no esta clara. Sin embargo, se ha presentado la interaccion directa con la proteina hedgehog (Chen, Y. et al. (1996) Cell 87: 553), y patched puede participar en un complejo receptor de hedgehog, junto con otra proteina de transmembrana codificada por el gen smoothened. Vease Perrimon, supra; y Chen, supra.

El homologo humano de patched se ha clonado recientemente y se ha acotado en el cromosoma 9q22.3. Vease Johnson, supra; y Hahn, supra. Esta region se ha implicado en el sindrome del nevo basocelular (BCNS), que se caracteriza por anomalias de desarrollo, incluyendo alteraciones en costillas y craneofaciales, anomalias en las manos y los pies, y espina bifida.

Tumores esporadicos tambien demostraron una perdida de los dos alelos funcionales de patched. De doce tumores

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en los que se identificaron mutaciones en patched con un ensayo de deteccion de polimorfismo conformacional de hebra individual, nueve tenian delecion cromosomica del segundo alelo y los otros tres tenian mutaciones de inactivacion en ambos alelos (Gailani, supra). Las alteraciones no tuvieron lugar en el ADN correspondiente de la tinea germinal.

La mayoria de las mutaciones identificadas daba como resultado codones de parada prematuros o desplazamientos de la fase de lectura (Lench, NJ, et al., Hum. Genet. 1997 Oct; 100(5-6): 497-502). Sin embargo, varios eran mutaciones puntuales que condujeron a sustituciones de aminoacidos en dominios exlracelulares o citoplasmaticos. Estos sitios de mutacion pueden indicar la importancia funcional para la interaccion con proteinas extracelulares o con miembros citoplasmaticos de la ruta de sehalizacion posterior.

La implicacion de patched en la inhibition de la expresion genica y la aparicion de deleciones alelicas frecuentes de patched en BCC respaldan la funcion supresora tumoral de este gen. Su funcion en la regulation de las familias de genes que se sabe estan implicados en la sehalizacion celular y comunicacion intercelular proporciona un posible mecanismo de supresion tumoral.

Ademas, se ha demostrado que la sobre-expresion de Gli1, pero no de Gli3 o Sonic hedgehog en las celulas basales induce la formacion de BCC. V6ase Dahmane, N., et al. (1997) Nature 389:876-881.

Sumario de la invention

En ciertos aspectos, la presente divulgacion pone a disposicion procedimientos y reactivos para inhibir estados de crecimiento no deseados que se producen en celulas con una ruta de sehalizacion de hedgehog activa En un modo de realization, los presentes procedimientos se pueden usar para inhibir la proliferacion celular no deseada determinando si las celulas sobreexpresan un gen gli, y poniendo en contacto las celulas que sobreexpresan un gen gli con una cantidad eficaz de un antagonista de hedgehog. En modos de realizacion preferentes, la proliferacion celular no deseada es cancer o hiperplasia benigna de prostata

Otro aspecto de la presente divulgacion pone a disposicion procedimientos para determinar un protocolo de tratamiento que comprende obtener una muestra de tejido de un paciente, y determinar los niveles de expresion genica gli en dicha muestra, en el que la sobreexpresion genica de gli indica que el tratamiento con un antagonista de hedgehog es apropiado.

Un aspecto adicional de la divulgacion proporciona procedimientos para estimular la produccion de tensioactivo en una celula pulmonar que comprenden poner en contacto dicha celula con una cantidad de antagonista de hedgehog eficaz para estimular la produccion de tensioactivo. Otro aspecto de la divulgacion proporciona procedimientos para estimular la formacion de cuerpos lamelares en una celula pulmonar que comprende poner en contacto dicha celula con una cantidad de antagonista de hedgehog eficaz para estimular la formacion de cuerpos lamelares. En modos de realizacion preferentes, la celula pulmonar esta presente en el tejido pulmonar de un lactante prematuro.

Los antagonistas de hedgehog de la divulgacion se escogen a partir de una molecula pequena de menos de 2000 dalton, un anticuerpo contra hedgehog, un anticuerpo contra patched, un anticuerpo contra smoothened, una proteina hedgehog de mutante, un acido nucleico antisentido y una ribozima. En particular, el antagonista de hedgehog se escoge entre una de las formulas I a XXV. En particular, el antagonista de hedgehog se escoge entre ciclopamina, compuesto A, tomatidina, jervina, AV9944, triparanol, compuesto B y derivados funcionalmente eficaces de los mismos.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona procedimientos de determination de la probabilidad de que un cancer se desarrolle en un tejido, que comprenden obtener una muestra de tejido, y determinar los niveles de expresion genica gli en dicha muestra, en la que, la sobreexpresion genica de gli indica que el cancer es mas propenso a desarrollarse.

Breve description de los dibujos

La figura 1 representa las estructuras quimicas para AY9944, triparanol, jervina, ciclopamina, tomatidina y colesterol. La figura 2A representa la estructura quimica para el compuesto A.

La figura 2B muestra la estructura quimica para el compuesto B.

La figura 3 muestra la estructura quimica para el agonista Z.

La figura 4 representa la expresion genica de gli-1 en pulmon de raton embrionario y adulto.

La figura 5 muestra la relation inversa entre la expresion de gli-1 y la expresion de marcadores de maduracion pulmonar. Entre E13.5 y E16.5, la expresion de gli-1 disminuye mientras que la expresion del marcador de maduracion, el tensioactivo de tipo C (Sp-C), aumenta.

La figura 6 muestra el efecto del tratamiento con el compuesto B de pulmones de raton embrionario sobre la expresion de gli-1.

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La figura 7 muestra que el tratamiento con el compuesto B aumenta la production de tensioactivo de tipo C en pulmones de raton embrionario.

La figura 8 muestra que los neumocitos de tipo II de pulmones tratados con el compuesto B se diferencian de forma prematura, como queda evidenciado por la presencia de cuerpos lamelares que producen el tensioactivo.

La figura 9 muestra que el tratamiento de cultivos de pulmon embrionario con compuesto B disminuye la expresion de gli-1.

La figura 10 muestra que el tratamiento de cultivos de pulmon embrionario con el compuesto B aumenta la expresion del marcador de maduracion Sp-C. La induccion de Sp-C observada despues del tratamiento es comparable a la observada despues del tratamiento con el factor de maduracion pulmonar conocido hidrocortisona.

La figura 11 muestra que el tratamiento de cultivos de pulmon embrionario con agonistas de hedgehog tiene el efecto contrario. El tratamiento con sonic hedgehog o agonista 2 aumenta la expresion de gli-1 y disminuye la expresion de Sp-C.

La figura 12 ilustra la expresion de gli- 1 en tejido de cancer de mama como se visualiza por hibridacion in situ.

La figura 13 muestra la expresion de gli- 1 en cancer de pulmon visualizado por hibridacion in situ

La figura 14 ilustra la expresion de gli- 1 en cancer de prostata como se visualiza por hibridacion in situ

La figura 15 representa la expresion de gli- 1 en hiperplasia benigna de prostata como se visualiza por hibridacion in

situ

La figura 16 muestra: (A). La expresion del transgen de ptc-lacZ en epitelio de vejiga de raton ptc-1 (d11) lacZ recien nacido. La expresion de lacZ se puede detectar en las celulas uroteliales proliferativas y, mas debilmente, en las celulas mesenquimales adyacentes. (B). Expresion de gli-1 en epitelio de vejiga de raton adulto; la expresion de gli-1 se puede detectar en las celulas uroteliales proliferativas.

La figura 17 muestra la expresion de gli-1 y Shh en vejiga de adulto normal y en tumor de vejiga disponible comercialmente.

La figura 18 muestra la expresion de Shh y gli-1 en ocho lineas celulares de cancer de vejiga disponibles comercialmente. Las ocho lineas celulares examinadas expresan genes implicados en la serialization de hedgehog.

La figura 19 muestra la expresion de Shh, ptc-1, smo, gli-1, gli-2, y gli-3 en ocho lineas celulares de cancer de vejiga disponibles comercialmente, asi como en cerebro fetal.

La figura 20 muestra una representation esquematica del ensayo de gli-Luc.

La figura 21 muestra los resultados del ensayo de gli-Luc sobre co-cultivos de celulas de cancer de vejiga. El co-cultivo de celulas S12, con linea celular 5637 o con linea celular RT4, da como resultado la activacion del gen indicador que indica que estas lineas celulares pueden activar la sehalizacion de hedgehog.

La figura 22 muestra que el anticuerpo 5E1 de Shh inhibe la activacion del gen indicador en co-cultivos de RT-4/S12.

Las figuras 23 y 24 muestran que la administracion del anticuerpo 5E1 contra Shh inhibe el crecimiento tumoral in vivo en un modelo de cancer de vejiga en raton atimico.

La figura 25 muestra que la administracion del anticuerpo 5E1 contra Shh disminuye la expresion de gli-1 in vivo en un modelo de cancer de vejiga en raton atimico.

La figura 26 muestra que Shh se expresa en muestras de cancer de prostata como se visualiza por hibridacion in situ.

La figura 27 muestra por Q-RT-PCR la expresion de gli-1 en prostata de adulto normal y en adenocarcinoma de prostata.

La figura 28 muestra la expresion de Shh y gli-1 en tres lineas celulares de cancer de prostata en comparacion con la expresion en una linea celular de prostata normal.

La figura 29 muestra que las lineas celulares de cancer de prostata inducen la expresion de la luciferasa cuando se co-cultivan con celulas S12 en el ensayo in vitro de gli-Luc.

La figura 30 muestra que el anticuerpo 5E1 antagonista inhibe la induccion de luciferasa por las celulas de cancer de prostata en el ensayo in vitro de gli-Luc.

La figura 31 muestra la expresion de Shh en epitelio y estroma prostatico en muestras de HBP en humanos.

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La figura 32 muestra la expresion de gli-1 en el estroma prostatico de muestras de HBP en humanos como se mide por hibridacion radiactiva in situ.

La figura 33 muestra que Shh y patched-1 se expresan con un patron proximo-distal en tejido de prostata normal produciendose los niveles mas altos de expresion genica en la region proximal o central.

La figura 34 muestra la expresion de Shh y gli-1 en muestras de HBP, y se comparan los niveles de expresion genica con muestras de BCC.

La figura 35 muestra la expresion de Shh y gli-1 en lineas celulares de HBP, y se comparan los niveles de expresion genica con los de muestras de BCC, prostata normal y cancer de prostata.

La figura 36 muestra que el anticuerpo 5E1 de bloqueo de Shh disminuye el tamano del tumor cuando se administra a ratones a los que se ha inyectado la linea celular de cancer de colon HT-29 que expresa Shh.

La figura 37 muestra que la administracion del anticuerpo 5E1 de bloqueo de Shh despues de 10 dias de crecimiento del tumor disminuye la tasa de crecimiento tumoral y el tamano del tumor en ratones a los que se ha inyectado la linea celular de cancer de colon HT-29 que expresa Shh.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se define en las reivindicaciones.

I. Vision general

La presente divulgacion se refiere al descubrimiento de que las rutas de transduccion de sehal reguladas por hedgehog, patched (ptc), gli y/o smoothened se pueden inhibir, al menos en parte, por antagonistas de hedgehog. Sin pretender quedar ligado a teoria alguna, en el caso de antagonistas de moleculas pequehas, la modulacion de un receptor puede ser el mecanismo por el que actuan estos agentes. Por ejemplo, la capacidad de estos agentes de inhibir la proliferacion de celulas con pdrdida de funcion patched (ptclof) se puede deber a la capacidad de dichas moleculas de interactuar con hedgehog, patched o smoothened. o al menos de interferir con la capacidad de esas proteinas de activar una ruta de transduccion de senales mediada por hedgehog, ptc, y/o smoothened.

Estas moleculas pequehas que interfieren con aspectos de la actividad de transduccion de senales de hedgehog, ptc, o smoothened seran igualmente capaces de cambiar la funcion de una celula en el desarrollo tisular de la que, de lo contrario, se produciria. Tambien se contempla que la celula tiene una ruta de senalizacion de hedgehog de tipo sustancialmente natural. Tambien se contempla que los antagonistas de hedgehog son particularmente eficaces en el tratamiento de trastornos resultantes de la hiperactivacion del ruta de hedgehog como resultado de mutaciones. Por lo tanto, es deseable tener un procedimiento para identificar aquellas celulas en las que la ruta de hedgehog es hiperactiva de manera que el tratamiento con antagonista se puede dirigir de manera eficaz.

En ciertas partes de la divulgacion, los antagonistas en cuestion son moleculas organicas que tienen un peso molecular de menos de 2500 uma, mas preferentemente menos de 1500 uma, y aun mas preferentemente menos de 750 uma, y son capaces de inhibir al menos algunas de las actividades biologicas de proteinas hedgehog, preferentemente en las celulas diana de forma especifica.

Por lo tanto, los procedimientos de la presente divulgacion incluyen el uso de moleculas pequehas que agonizan la inhibition de ptc de la senalizacion de hedgehog en la regulacion de la reparacion y/o el rendimiento funcional de una amplia gama de celulas, tejidos y organos que tienen el fenotipo de ganancia de funcion de hedgehog y tejidos con actividad de hedgehog de tipo natural. Por ejemplo, el presente procedimiento tiene aplicaciones terapeuticas y cosmeticas que varian desde la regulacion de los tejidos neurales, la formation y reparacion osea y cartilaginosa, la regulacion de la espermatogenesis, la regulacion del musculo liso, la regulacion del pulmon, el higado y el tejido de otros organos derivados del intestino primitivo, la regulacion de la funcion hematopoyetica, la regulacion del crecimiento de la piel y el pelo, etc. Ademas, los procedimientos en cuestion se pueden llevar a cabo sobre celulas que se proporcionan en cultivo {in vitro), o en celulas en un animal completo (in vivo). Veanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 95/18856 y WO 96/17924

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona preparaciones farmaceuticas que comprenden, como principio activo, un antagonista de hedgehog o un agonista de ptc tal como se describe en el presente documento, formulado en una cantidad suficiente para inhibir, in vivo, la proliferacion u otras consecuencias biologicas de la ganancia de funcion de hedgehog.

Los tratamientos en cuestion que usan antagonistas de hedgehog pueden ser eficaces para sujetos humanos y sujetos animales. Los sujetos animales a los cuales es aplicable la divulgacion se extienden tanto a animales domesticos como a ganado, criados como animales domesticos o con fines comerciales. Son ejemplos perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos y cabras.

II. Definiciones

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Por motivos de conveniencia, determinados terminos empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas se recogen a continuation.

La expresion "modification aberrante o mutation" de un gen se refiere a lesiones geneticas tales como, por ejemplo, deleciones, sustitucion o adicion de nucleotidos en un gen, asi como reordenamientos cromosomicos grandes del gen y/o metilacion anomala del gen. Del mismo modo, expresidn erronea de un gen se refiere a niveles aberrantes de transcription del gen en relation con esos niveles en una celula normal en condiciones similares, asi como corte y empalme de tipo no natural ARNm transcrito a partir del gen.

El termino "adenocarcinoma” tal como se usa en el presente documento se refiere a un tumor maligno que se origina en el epitelio glandular.

El termino "angiogenesis", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a la formation de vasos sanguineos. Especificamente, la angiogenesis es un proceso de multiples etapas en el que las celulas endoteliales se degradan focalmente e invaden a traves de su propia membrana basal, migran a traves del estroma intersticial hacia un estimulo angiogenico, proliferan en forma proximal a la punta de migration, se organizan para dar lugar a vasos sanguineos, y se vuelven a adherir a la membrana basal recien sintetizada (vease Folkman et al., Adv. Cancer Res., Vol. 43, pag. 175-203 (1985)).

Los "carcinomas basocelulares" existen en una variedad de formas clinicas e histologicas tales como nodular-ulcerosa, superficial, pigmentada, de tipo morfea, fibroepitelioma y sindrome nevoide. Los carcinomas basocelulares son las neoplasias cutaneas mas comunes que se encuentran en los seres humanos. La mayoria de los nuevos casos de cancer de piel que no son de tipo melanoma pertenecen a esta categoria.

"La hiperplasia benigna de prostata", o HBP, es un agrandamiento benigno de la glandula prostatica que normalmente comienza despues de los 50 anos de edad, probablemente como consecuencia de los efectos de las hormonas masculinas. Si se produce un agrandamiento significativo, se puede estrangular la uretra haciendo que la miction resulte dificil o imposible.

"Heridas de quemadura" se refiere a casos en los que grandes areas superficiales de la piel se han eliminado o perdido en un individuo debido al calor y/o agentes quimicos.

El termino "carcinoma" se refiere a un nuevo crecimiento maligno compuesto de celulas epiteliales que tienden a infiltrarse en los tejidos adyacentes y da lugar a metastasis. Los carcinomas a modo de ejemplo incluyen: "carcinoma basocelular", que es un tumor epitelial de la piel que, si bien raramente produce metastasis, tiene potencial de invasion y destruction a nivel local; "carcinoma escamoso celular", que se refiere a carcinomas que surgen de epitelio escamoso y tienen celulas cuboides; "carcinosarcoma", que incluyen tumores malignos compuestos de tejidos tumorales y sarcomatoso; "carcinoma adenoquistico", carcinoma marcado por cilindros o bandas de estroma hialino o mucinoso separados o rodeados por nidos o cordones de pequefias celulas epiteliales, que se producen en las glandulas mamarias y salivares y las glandulas mucosas de las vias respiratorias; "carcinoma epidermoide", que se refiere a celulas cancerigenas que tienden a diferenciarse de la misma manera que las de la epidermis; es decir, que tienden a formar celulas espinosas y experimentan queratinizacion; "carcinoma nasofaringeo", que pertenece a un tumor maligno que surge en el revestimiento epitelial del espacio posterior de la nariz; y "carcinoma de celulas renales", que pertenece al carcinoma del parenquima renal compuesto de celulas tubulares en configuraciones variables. Otras proliferaciones epiteliales carcinomatosas son los "papilomas", que se refiere a tumores benignos derivados de epitelio y que tienen un virus de papiloma como agente causante; y "epidermoidomas", que se refiere a un tumor cerebral o meningeo formado por inclusion de elementos ectodermicos en el momento de cierre del surco neural.

El "corion" o "dermis" se refiere a la capa de la piel debajo de la epidermis, que consiste en un (echo denso de tejido conjuntivo vascular y que contiene los nervios y los organos terminates sensoriales. Las raices capilares y las glandulas sebaceas y sudoriparas son estructuras de la epidermis que estan profundamente integradas en la dermis.

"Tejido dental" se refiere al tejido de la boca que es similar al tejido epitelial, por ejemplo el tejido de las encias. El procedimiento de la presente divulgation podria ser util para el tratamiento de enfermedades periodontales.

"Ulceras cutaneas dermicas" se refiere a lesiones de la piel causadas por la perdida superficial de tejido, normalmente con inflamacion. Las ulceras cutaneas dermicas divulgadas comprenden ulceras de decubito, ulceras diabeticas, ulceras por estasis venosa y ulceras arteriales. Las heridas de decubito se refieren a ulceras cronicas que resultan de la presion aplicada a las areas de la piel durante largos periodos de tiempo. Las heridas de este tipo a menudo se llaman ulceras de decubito o ulceras de presion. Las ulceras por estasis venosa son el resultado del estancamiento de la sangre u otros fluidos procedentes de venas defectuosas. Las ulceras arteriales se refieren a la piel necrotica de la zona de alrededor de las arterias que tienen escaso flujo sanguineo.

El termino "ED50" significa la dosis de un farmaco que produce un 50 % de respuesta o efecto maximo.

Una "cantidad eficaz" de, por ejemplo, un antagonista de hedgehog, con respecto al procedimiento objeto de tratamiento, se refiere a una cantidad del antagonista en una preparation que, cuando se aplica como parte de una

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Los terminos "epitelios", "epitelial" y "epitelio" se refieren al revestimiento celular de las superficies interna y externa del cuerpo (cutanea, mucosa y serosa), incluyendo las glandulas y otras estructuras derivadas de las mismas, por ejemplo, las celulas epiteliales de la cornea, esofagicas, epidbrmicas y del foliculo piloso. Otro tejido epitelial a modo de ejemplo incluye: epitelio olfativo, que es el epitelio seudoestratificado que reviste la region olfativa de la cavidad nasal, y que contiene los receptores del sentido del olfato; el epitelio glandular, que se refiere al epitelio compuesto de celulas secretoras; epitelio escamoso, que se refiere al epitelio compuesto de celulas de tipo placa aplanada. El termino epitelio tambien puede referirse a epitelio transicional, como el que se encuentra caracteristicamente revistiendo organos huecos que estan sujetos a grandes cambios mecanicos debidos a contraction y distension, por ejemplo, el tejido que representa una transition entre epitelio escamoso estratificado y epitelio columnar.

El termino "epitelizacion" se refiere a la cicatrization mediante el crecimiento de tejido epitelial sobre una superficie desnuda.

La expresion "glandula epidermica" se refiere a una agregacion de celulas asociadas a la epidermis y especializadas para segregar o excretar materiales no relacionados con sus necesidades metabolicas normales. Por ejemplo, las "glandulas sebaceas" son glandulas holocrinas en el corion que segregan una sustancia oleosa y sebo. La expresion "glandulas sudoriparas" se refiere a glandulas que segregan sudor, situadas en el corion o tejido subcutaneo, abiertas por medio de un conducto en la superficie del cuerpo.

El termino "epidermis" se refiere a la capa mas externa y no vascular de la piel, derivada del ectodermo embrionario, que varia en cuanto a espesor de 0,07 a 1,4 mm. Las superficies palmar y plantar comprenden, de dentro a fuera, cinco capas: la capa basal compuesta por celulas columnares dispuestas perpendicularmente; la capa espinosa o de celulas espinosas compuesta por celulas poliedricas aplanadas con extensiones o espinas cortas; la capa granular compuesta por celulas granulares aplanadas; la capa clara compuesta por varias capas de celulas claras y transparentes en la que los nucleos estan indefinidos o ausentes; y la capa cornea compuesta por celulas aplanadas, queratinizadas y no nucleadas. En la epidermis de la superficie corporal general, la capa clara normalmente esta ausente.

Las "heridas de escision" incluyen las laceraciones, abrasiones, codes, perforaciones o desgarros en la capa epitelial de la piel y pueden extenderse a la capa dermica e incluso a la grasa subcutanea y mas alia. Las heridas por escision pueden ser el resultado de procedimientos quirurgicos o de una penetration accidental de la piel.

El "estado de crecimiento" de una celula se refiere a la tasa de proliferacion de la celula y/o estado de diferenciacion de la celula. Un "estado de crecimiento alterado" es un estado de crecimiento caracterizado por una tasa de proliferacion anomala, por ejemplo, una celula que presenta un aumento o disminucion de la tasa de proliferacion con respecto a una celula normal.

El termino "pelo" se refiere a una estructura filiforme, especialmente la estructura epidermica especializada compuesta por queratina y que se desarrolla a partir de una papila hundida en el corion, producida solamente por los mamiferos y caracteristico de ese grupo de animales. Ademas, el "pelo" puede referirse al conjunto de dichos pelos. Un "foliculo piloso" se refiere a una de las invaginaciones tubulares de la epidermis que encierra los pelos, y partir de la cual crecen los pelos. Las "celulas epiteliales del foliculo piloso" se refiere a celulas epiteliales que rodean la papila dermica en el foliculo piloso, por ejemplo, celulas madre, celulas de la vaina raticular externa, celulas de la matriz, y celulas de la vaina radicular interna. Dichas celulas pueden ser celulas no malignas normales, o celulas transformadas/inmortalizadas.

El termino "hedgehog' se utiliza para referirse genericamente a cualquier miembro de la familia hedgehog, incluyendo sonic, indian, desert y tiggy winkle. El termino puede ser usarse para indicar la proteina o el gen.

Las expresiones "ruta de serialization hedgehog", "ruta de hedgehog" y "ruta de transduccion de sehales de hedgehocf' se usan para referirse a la cadena de eventos normalmente mediados por hedgehog, smoothened, ptc, y gli, entre otros, y que tienen como resultado un cambio en la expresion genica y otros cambios fenotipicos tipicos de la actividad de hedgehog. La ruta de hedgehog se puede activar incluso en ausencia de una proteina hedgehog mediante la activation de un componente posterior. Por ejemplo, la sobreexpresion de smoothened activara la ruta en ausencia de hedgehog, la expresion genica de gli y ptc son indicadores de ruta activa de senalizacion de hedgehog.

La expresion "antagonista de hedgehocf’ se refiere a un agente que potencia o recapitula la bioactividad de patched, tales como para reprimir la transcripcion de genes diana. Los antagonistas de hedgehog preferidos se pueden usar para superar una perdida de funcion de ptc y/o una ganancia de funcion de smoothened, denominandose estos ultimos tambien antagonistas de smoothened. La expresion "antagonista de hedgehog ', tal como se usa en el presente documento, se refiere no solo a cualquier agente que pueda actuar inhibiendo directamente la funcion normal de la proteina hedgehog, sino tambien a cualquier agente que inhiba la ruta de senalizacion de hedgehog, y por lo tanto recapitule la funcion de ptc. Un antagonista de hedgehog puede ser una molecula pequena, un anticuerpo (incluyendo pero no sin estar restringido a: un diacuerpo, anticuerpo de cadena sencilla, anticuerpo monoclonal, IgG,

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IgM, IgA, IgD, IgE, o un fragmento de anticuerpo que comprende al menos un par de regiones variables), un acido nucleico de antisentido, PNA o ribozima, o una proteina hedgehog mutanle que puede interrumpir o inhibir la serialization de hedgehog. Un anticuerpo puede estar dirigido a una proteina codificada por cualquiera de los genes en la ruta de hedgehog, incluyendo hedgehog sonic, Indian o desert, smoothened, ptc-1, ptc-2, gli-1, gli-2, gli-3, etc, . En la mayoria de los casos, el anticuerpo podria inhibir la actividad de la proteina diana, pero en el caso de patched, dicho anticuerpo es un activador de patched, Un acido nucleico de antisentido disminuye igualmente la production de una proteina codificada por cualquiera de los genes en la ruta de hedgehog, con la exception de los genes patched u otros que codifican reguladores negativos de la ruta de senalizacion de hedgehog.

La expresion "ganancia de funcion de hedgehocf se refiere a una modification aberrante o mutacion de un gen ptc, un gen de hedgehog, o un gen de smoothened, o una disminucion (o perdida) en el nivel de expresion de dicho gen, que tiene como resultado un fenotipo que se parece a la puesta en contacto de una celula con una proteina hedgehog, por ejemplo, la activacion aberrante de una ruta de hedgehog. La ganancia de funcion puede incluir una perdida de la capacidad del producto genico ptc para regular el nivel de expresion de genes Ci, por ejemplo, Gli 1, Gli2 y Gli3. La expresion "ganancia de funcion de hedgehocf' tambien se usa en el presente documento para referirse a cualquier fenotipo celular similar (por ejemplo, que exhibe el exceso de proliferacion) que se produce debido a una alteration en cualquier punto de la ruta de transduction de serial de hedgehog, incluyendo, pero sin estar restringido a, una modificacion o mutacion del propio hedgehog. Por ejemplo, una celula tumoral con una tasa de proliferacion anomalamente elevada debido a la activacion de la ruta de senalizacion de hedgehog tendria un fenotipo de ganancia de funcion de hedgehog, incluso si hedgehog no presenta mutacion en esa celula.

Tal y como se usa en el presente documento, "celulas inmortalizadas" se refiere a celulas que han sido alteradas por medios quimicos y/o recombinantes de forma que las celulas tengan la capacidad de crecer a traves de un numero indefinido de divisiones en cultivo.

"Tejido epitelial interno" se refiere a tejido interior del cuerpo que tiene caracteristicas similares a la capa epidermica de la piel. Los ejemplos incluyen el revestimiento del intestino. Por ejemplo, para promover la cicatrization de ciertas heridas intemas, como por ejemplo las heridas resultantes de la cirugia.

El termino "queratosis" se refiere a un trastorno proliferativo cutaneo caracterizado por hiperplasia de la capa cornea de la epidermis. Los trastornos queratoticos a modo de ejemplo incluyen queratosis folicular, queratosis palmar y plantar, queratosis faringea, queratosis pilar, y queratosis actinica.

"Cuerpos lamelares" se refiere a una estructura subcelular que se encuentra en las celulas pulmonares que producen los tensioactivos. Se cree que los cuerpos lamelares son el sitio de la biosintesis de tensioactivo pulmonar. Los cuerpos tienen un aspecto membranoso de capas multiples en microfotografia electronica.

El termino "LD 50"'1 significa la dosis de un farmaco que es letal en el 50 % de los sujetos de prueba.

El termino "una" se refiere a la placa cutanea cornea en la superficie dorsal del extremo distal de un dedo de la mano o del pie.

El termino "sobreexpresion", tal como se usa en referencia a los niveles de expresion genica, significa cualquier nivel de la expresion genica en celulas de un tejido que sea mayor que el nivel normal de expresion de ese tejido. El nivel normal de expresion de un tejido se puede evaluar por medio de medicion de la expresion genica en una parte sana de ese tejido.

La expresion "perdida de funcion patched" se refiere a una modificacion aberrante o mutacion de un gen de ptc, o una disminucion del nivel de expresion del gen, que tiene como resultado un fenotipo que se parece a la puesta en contacto de una celula con una proteina hedgehog, por ejemplo, activacion aberrante activacion de una ruta de hedgehog. La perdida de funcion puede incluir una perdida de la capacidad del producto genico de ptc para regular el nivel de expresion de los genes Ci, por ejemplo, Gli 1, Gli2 y Gli3.

Un "paciente" o "sujeto" objeto de tratamiento por medio del presente procedimiento puede significar un ser humano o animal no humano.

El termino "profarmaco" pretende abarcar compuestos que, en condiciones fisiologicas, se convierten en los agentes terapeuticamente activos. Un procedimiento comun para preparar un profarmaco consiste en incluir restos escogidos que se hidrolizan en condiciones fisiologicas para revelar la molecula deseada. El profarmaco tambien puede se puede convertir mediante actividad enzimatica del animal hospedador.

Tal y como se usa en el presente documento, "proliferar" y "proliferacion" se refieren a celulas que experimentan mitosis.

A lo largo de esta solicitud, la expresion "trastorno proliferativo cutaneo" se refiere a cualquier enfermedad/trastorno cutaneo caracterizado por la proliferacion no deseada o aberrante de tejido cutaneo. Estas afecciones se caracterizan tipicamente por la proliferacion de celulas epidermicas o la diferenciacion celular incompleta, e incluyen. por ejemplo, ictiosis ligada al cromosoma X, soriasis, dermatitis atopica, dermatitis alergica por contacto, hiperqueratosis

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epidermolitica y dermatitis seborreica. Por ejemplo, la epidermodisplasia es una forma de desarrollo defectuoso de la epidermis. Otro ejemplo es la "epidermolisis", que se refiere a un estado debilitado de la epidermis con formacion de ampollas y bullas espontaneamente o en el sitio del traumatismo.

Tal y como se usa en el presente documento, el termino "soriasis" se refiere a un trastorno cutaneo hiperproliferativo que altera los mecanismos reguladores cutaneos. En particular, se forman lesiones que implican alteraciones primarias y secundarias de la proliferation epidermica, respuestas inflamatorias de la piel y una expresion de moleculas reguladoras tales como linfocinas y factores inflamatorios. La piel soriasica se caracteriza morfologicamente por un aumento de la renovacion de las celulas epidermicas, epidermis engrosada, queratinizacion anomala, infiltrados de celulas inflamatorias en la capa de la dermis e infiltracion de leucocitos polimorfonucleares en la capa de epidermis, lo cual tiene como resultado un aumento en el ciclo celular basal. Ademas, las celulas hiperqueratosicas y paraqueratosicas se encuentran presentes.

El termino "pier se refiere al revestimiento protector externo del cuerpo, que consiste en el corion y la epidermis, y se entiende que incluye las glandulas sudoriparas y sebaceas, asi como las estructuras del foliculo piloso. A lo largo de la presente solicitud, el adjetivo "cutaneo" se puede usar, y debe entenderse que se refiere en general a atributos de la piel, segun sea apropiado para el contexto en el que se utiliza.

La expresion "carcinoma microcitico" se refiere a un tipo de neoplasia maligna, comunmente del bronquio. Las celulas tumorales tienen caracteristicas de tipo endocrino y pueden segregar una o mas de una amplia variedad de hormonas, especialmente peptidos reguladores como la bombesina.

La expresion "ganancia de funcidn de smoothened" se refiere a una modificacion aberrante o mutacion de un gen de smo, o un aumento del nivel de expresidn del gen, que tiene como resultado un fenotipo que se parece a la puesta en contacto de una celula con una proteina hedgehog, por ejemplo, activacion aberrante de una ruta de hedgehog. Sin pretender quedar ligado a teoria particular alguna, se observa que ptc puede no transmitir sefiales directamente en la celula, sino mas bien interactuar con smoothened, otra proteina ligada a membrana ubicada despues de ptc en la serialization de hedgehog (Mango et al., (1996 ) Nature 384: 177-179). El gen smo es un gen de polaridad de segmento necesario para la correcta formacion de patrones de todos los segmentos en Drosophila (Alcedo et al, (1996) Cell 86.: 221-232). Se han identificado homologos humanos de smo. Veanse, por ejemplo, Stone et al. (1996) Nature 384:129-134, y acceso a GenBank U84401. El gen smoothened codifica una proteina integral de membrana con caracteristicas de los receptores acoplados a la proteina G heterotrimerica; es decir, las regiones de 7 dominios transmembrana. Esta proteina muestra homologia con la proteina de Drosophila Frizzled (Fz), un miembro de la ruta wingless. En un principio se penso que smo codificaba un receptor de la serial Hh. Sin embargo, esta sugerencia fue refutada posteriormente. como queda evidenciado por el hecho de que se obtuvo ptc que es el receptor de Hh. Las celulas que expresan Smo no lograr unirse a Hh, lo que indica que smo no interactua directamente con Hh (Nusse, (1996) Nature 384: 119-120). Mas bien, se piensa que la union de Sonic hedgehog (SHH) a su receptor, PTCR, evita la inhibition normal por parte de PTCR de smoothened (SMO), una proteina de siete dominios transmembrana.

Recientemente, se ha informado de que la activacion de mutaciones de smoothened se produce en carcinoma basocelular esporadico, Xie et al. (1998) Nature 391: 90-2, y tumores neuroectodermicos primitivos del sistema nervioso central, Reifenberger et al. (1998) Cancer Res 58: 1798-803.

La expresion "indice terapeutico" se refiere al indice terapeutico de un farmaco definido como LD50/ED50.

Tal como se usa en el presente documento, "celulas transformadas" se refiere a celulas que han convertido espontaneamente a un estado de crecimiento no restringido, es decir, que han adquirido la capacidad de crecer a traves de un numero indefinido de divisiones en cultivo. Las celulas transformadas se pueden caracterizar por terminos tales como neoplasicas. anaplasicas y/o hiperplasicas, con respecto a su perdida del control del crecimiento.

"Urogenital" se refiere a los organos y tejidos del tracto urogenital, que incluye entre otros tejidos, la prostata, el ureter, el rinon y la vejiga. Un "cancer urogenital" es un cancer de un tejido urogenital.

El termino "acilamino" se reconoce en la tecnica y se refiere a un resto que puede representarse por la formula general:

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en la que R9 es como se ha definido anteriormente, y R 11 representa un hidrogeno, alquilo, alquenilo o -(CH2)m-R8, en la que m y R8 son como se ha definido con anterioridad.

En el presente documento, la expresion "grupo alifatico" se refiere a un grupo de hidrocarburo alifatico ciclico de

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cadena lineal o ramificada o un grupo hidrocarburo alifatico ciclico e incluye grupos alifaticos saturados e insaturados, tales como un grupo alquilo, grupo alquenilo, y grupo alquinilo.

Los terminos "alquenilo" y "alquinilo" se refieren a grupos alifaticos insaturados analogos en longitud y posible sustitucion a los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un doble o triple enlace respectivamente.

Los terminos "alcoxi" o "alcoxi" tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, que tiene un radical oxtgeno unido al mismo. Los grupos alcoxilo representatives incluyen metoxi, etoxi, propiloxi, terc-butoxi y similares. Un "eter" es dos hidrocarburos unidos covalentemente por un oxigeno. En consecuencia, el sustituyente de un alquilo que convierte ese alquilo en bter es o se parece a un alcoxilo, tal como se puede representar por uno de -O-alquilo, -O-alquenilo, -O-alquinilo, -0-(CH2)m-R8, en el que m y R8 se han descrito con anterioridad.

El termino "alquilo" se refiere al radical de grupos alifaticos saturados, incluyendo grupos alquilo de cadena lineal, grupos alquilo de cadena ramificada, grupos cicloalquilo (aliciclicos), grupos cicloalquilo con sustitucion de alquilo, y grupos alquilo sustituidos con cicloalquilo. Un alquilo de cadena lineal o ramificada puede tener 30 o menos atomos de carbono en su cadena principal (por ejemplo, C1-C30 para cadenas lineales, C3- C30 para cadenas ramificadas), y mas preferentemente 20 o menos. Del mismo modo, los cicloalquilos preferidos tienen de 3-10 atomos de carbono en su estructura de anillo, y mas preferentemente tienen 5, 6 o 7 carbonos en la estructura de anillo.

Ademas, el termino "alquilo" (o "alquilo inferior") como se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones pretende incluir tanto "alquilos no sustituidos" como "alquilos sustituidos", refiriendose el ultimo de los mismos a restos alquilo que tienen sustituyentes que reemplazan un hidrogeno de uno o mas carbonos de la cadena principal de hidrocarburo. Dichos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, un halogeno, un hidroxilo, un carbonilo (tal como un carboxilo, alcoxicarbonilo, formilo, o acilo), tiocarbonilo (tal como tioester, tioacetato o tioformiato), alcoxilo, fosforilo, fosfato, fosfonato, fosfmato, amino, amido, amidina, imina, ciano, nitro, azido, sulfhidrilo, alquiltio, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, sulfonilo, heterociclilo, aralquilo, o un resto aromatico o heteroaromatico. Se entendera por parte de los expertos en la tecnica que los restos sustituidos en la cadena de hidrocarburo pueden estar sustituidos en si mismos, si resulta apropiado. Por ejemplo, los sustituyentes de un alquilo sustituido pueden incluir formas sustituidas y no sustituidas de amino, azido, imino, amido, fosforilo (incluyendo fosfonato y fosfinato), sulfonilo (incluyendo sulfato, sulfonamido, sulfamoilo y sulfonato), y grupos sililo, asi como tambien eteres, alquiltios, carbonilos (incluyendo cetonas, aldehidos, carboxilatos, y esteres), -CF3, -CN y similares. Los alquilos sustituidos a modo de ejemplo se describen a continuacion. Los cicloalquilos pueden estar ademas sustituidos con alquilos, alquenilos, alcoxis, alquiltios, aminoalquilos, alquilos con sustitucion de carbonilo, -CF3, -CN, y similares.

A menos que el numero de carbonos se especifique de otro modo, "alquilo inferior" tal como se usa en el presente documento significa un grupo alquilo, como se definio anteriormente, pero que tiene de uno a diez atomos de carbono, mas preferentemente de uno a seis atomos de carbono en su estructura de cadena principal. Del mismo modo, "alquenilo inferior" y "alquinilo inferior" tienen longitudes de cadena similares. A lo largo de la solicitud, los grupos alquilo preferidos son alquilos inferiores. Un sustituyente denominado alquilo en el presente documento puede ser un alquilo inferior.

El termino "alquiltio" se refiere a un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, que tiene un radical de azufre unido al mismo. El resto "alquiltio" se puede representarse por medio de uno de -S-alquilo, -S-alquenilo, -S-alquinilo y -S-(CH2)m-R8, en el que m y R8 se han definido anteriormente. Los grupos alquiltio representatives incluyen metiltio, etiltio, y similares.

Los terminos "amina" y "amino" se reconocen en la tecnica y se refieren a aminas tanto no sustituidas como sustituidas, por ejemplo, un resto que puede representarse por medio de la formula general:

N

^ ^10

R I'

— N-

\ 0

1

9

R

10

^10

9

en la que R 9, R10 y R'10 representan cada uno independientemente un hidrogeno, alquilo, alquenilo, -S-(CH2)m-R8 o R9 y R10 tornados junto con el atomo de N al que estan unidos completan un heterociclo que tiene de 4 a 8 atomos en la estructura del anillo; Rg representa un arilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterociclo o policiclo; y m es cero o un numero entero en el intervalo de 1-8. Se divulga que solo uno de R9 o R10 puede ser un carbonilo, por ejemplo, R9, R10 y el nitrogeno juntos no forman una imida. Tambien se divulga que R9 y R10 (y opcionalmente R'10) representan cada uno independientemente un hidrogeno, alquilo, alquenilo, o -(CH2)m-R8. Por lo tanto, el termino "alquilamina" tal y como se usa en el presente documento significa un grupo amina, como se ha definido anteriormente, que tiene un alquilo sustituido o no sustituido unido al mismo, es decir, al menos uno de R9 y R10 es un grupo alquilo.

El termino "amido" se reconoce en la tecnica como un carbonilo sustituido con amino e incluye un resto que puede representarse por medio de la formula general:

0

imagen2

en la que R9, R10 son como se ha definido con anterioridad. Se divulga que la amida no incluye imidas, que pueden 5 ser inestable.

El termino "alquilo", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo (por ejemplo, un grupo aromatico o heteroaromatico).

El termino "arilo", tal y como se usa en el presente documento, incluye grupos aromaticos de un unico anillo de 5, 6, y 7 miembros que pueden incluir de cero a cuatro heteroatomos, por ejemplo, benceno, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, 10 oxazol, tiazol, triazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina y pirimidina, y similares. Esos grupos arilo que tienen heteroatomos en la estructura del anillo tambien pueden denominarse "heterociclos de arilo" o "heteroaromaticos". El anillo aromatico puede estar sustituido en una o mas posiciones del anillo con dichos sustituyentes como se describio anteriormente, por ejemplo, halogeno, azida, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, alcoxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato, fosfmato, carbonilo, carboxilo, sililo, eter, alquiltio, sulfonilo, 15 sulfonamido, cetona, aldehido, ester, heterociclilo, restos aromaticos o heteroaromaticos, -CF3, -CN, o similares. El termino "arilo" tambien incluye sistemas de anillo policiclicos que tienen dos o m£s anillos ciclicos en los que dos o mas carbonos son comunes a dos anillos adyacentes (los anillos son "anillos condensados") en el que al menos uno de los anillos es aromatico, por ejemplo, los otros anillos ciclicos pueden ser cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos y/o heterociclilos.

20 El termino "carbociclo", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a un anillo aromatico o no aromatico en el que cada atomo del anillo es carbono.

El termino "carbonilo" se reconoce en la tecnica e incluye restos tales como se pueden representar por medio de la formula general:

0 0

imagen3

25 en la que X es un enlace o representa un oxigeno o un azufre, y R11 representa un hidrogeno, un alquilo, un alquenilo, -(CH2)m-R8 o una sal farmaceuticamente aceptable, R '11 representa un hidrogeno, alquilo, alquenilo o -(CH2)m-R8, donde m y Rg son como se ha definido con anterioridad. Cuando X es un oxigeno y R11 o R'11 no es hidrogeno, la formula representa un "6ster". Cuando X es un oxigeno, y R11 es como se ha definido anteriormente, el resto se denomina en este caso como un grupo carboxilo, y particularmente cuando R' 11 es un hidrogeno, la formula 30 representa un "acido carboxilico". Cuando X es un oxigeno y R'11 es hidrogeno, la formula representa un "formiato". En general, cuando el atomo de oxigeno de la formula anterior se reemplaza por azufre, la formula representa un grupo "tiocarbonilo". Cuando X es un azufre y R11 o R'11 no es hidrogeno, la formula representa un "tioester". Cuando X es un azufre y R11 es hidrogeno, la formula representa un "acido tiocarboxilico." Cuando X es un azufre y R11 es hidrogeno, la formula representa un "tiolformiato." Por otra parte, cuando X es un enlace y R11 no es 35 hidrogeno, la formula anterior representa un grupo "cetona". Cuando X es un enlace y R11 es hidrogeno, la formula anterior representa un grupo "aldehido".

El termino "heteroatomo", tal y como se usa en el presente documento, significa un atomo de cualquier elemento distinto de carbono o hidrogeno. Los heteroatomos preferidos son boro, nitrogeno, oxigeno, fosforo, azufre y selenio.

Los terminos "heterociclilo" o "grupo heterociclico" se refieren a estructuras de anillo de 3 a 10 miembros, mas 40 preferentemente anillos de 3 a 7 miembros, cuyas estructuras de anillo incluyen de uno a cuatro heteroatomos. Los heterociclos tambien pueden ser policictos. Los grupos heterociclilo incluyen, por ejemplo, tiofeno, tiantreno, furano, pirano, isobenzofurano, cromeno, xanteno, fenoxatiina, pirrol, imidazol, pirazol, isotiazol, isoxazol, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindol, indol, indazol, purina , quinolizina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftiridina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, pteridina, carbazol, carbolina, fenantridina, acridina, pirimidina, 45 fenantrolina, fenazina, fenarsazina, fenotiazina, furazano, fenoxazina, pirrolidina, oxolano, tiolano, oxazol, piperidina , piperazina, morfolina, lactonas, lactamas tales como azetidinonas y pirrolidinonas, sultamas, sultonas, y similares. El anillo heterociclico puede estar sustituido en una o mas posiciones con sustituyentes tales como los descritos anteriormente, como por ejemplo, halogeno, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato, fosfmato, carbonilo, carboxilo, sililo, eter, alquiltio, sulfonilo, cetona,

5

10

15

20

25

30

35

40

aldehido, ester, heterociclilo, un resto aromatico o heteroaromatico, -CF 3, -CN, o similares.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "nitro" significa -N02; el termino "halogeno" designa -F, -Cl, -Br o -I; el termino "sulfhidrilo" significa -SH; el termino "hidroxilo" significa -OH; y el termino "sulfonilo" significa -SO 2 -,

Los terminos "policiclilo" o "grupo policiclico" se refieren a dos o mas anillos (por ejemplo, cicloalquilos, cicloalquenilos, cicloalquinilos, arilos y/o heterociclilos) en los que dos o mas carbonos son comunes a dos anillos adyacentes, por ejemplo, los anillos son " anillos condensados Los anillos que estan unidos a traves de atomos no adyacentes se denominan anillos "con puente". Cada uno de los anillos del policiclo puede estar sustituido con sustituyentes tales como se describe anteriormente, como por ejemplo, halogeno, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato, fosfmato , carbonilo, carboxilo, sililo, eter, alquiltio, sulfonilo, cetona, aldehido, bster, un heterociclilo, un resto aromatico o heteroaromatico, -CF 3, -CN, o similares.

La expresion "grupo protector", como se usa en el presente documento significa sustituyentes temporales que protegen un grupo funcional potencialmente reactivo frente a transformaciones quimicas no deseadas. Ejemplos de tales grupos protectores incluyen esteres de acidos carboxilicos, eteres sililicos de alcoholes y acetales y cetales de aldehidos y cetonas, respectivamente. Se ha revisado el campo de la quimica de grupos protectores (Greene, TW; Wuts, PGM Protective Groups in Organic Synthesis, 2a ed.; Wiley; New York, 1991).

Un "selenoalquilo" se refiere a un grupo alquilo que tiene un grupo seleno sustituido unido al mismo. Los ejemplos de "selenoeteres" que pueden estar sustituidos en el alquilo se escogen entre uno de -Se-alquilo, -Se-alquenilo, -Se-alquinilo, y -Se-(CH2)m-R8, habiendose definido m y R 8 con anterioridad.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "sustituido" incluye todos los sustituyentes permisibles de compuestos organicos. En un aspecto amplio, los sustituyentes permisibles incluyen sustituyentes aciclicos y ciclicos, ramificados y no ramificados, carbociclicos y heterociclicos, aromaticos y no aromaticos de compuestos organicos. Los sustituyentes ilustrativos incluyen, por ejemplo, los descritos anteriormente en el presente documento. Los sustituyentes permisibles pueden ser uno o mas y el mismo o diferentes para compuestos organicos apropiados. Para los fines de la presente divulgacion, los heteroatomos tales como nitrogeno pueden tener sustituyentes de hidrogeno y/o cualesquiera sustituyentes permisibles de compuestos organicos descritos en el presente documento que satisfagan las valencias de los heteroatomos.

Se entendera que "sustitucion" o "sustituido con" incluye la condicion implicita de que tal sustitucion esta de acuerdo con la Valencia permitida del atomo sustituido y el sustituyente, y que la sustitucion tiene como resultado un compuesto estable, por ejemplo, que no experimenta de forma espontanea una transformation tal como mediante reordenamiento, ciclacion, elimination, etc.

El termino "sulfamoilo" se reconoce en la tecnica e incluye un resto que puede representarse por medio de la formula general:

imagen4

imagen5

10

9

En la que R9 y R10 son como se ha definido con anterioridad.

El termino "sulfato" se reconoce en la tecnica e incluye un resto que puede representarse por medio de la formula general:

O

II

—o-s-or41

0

en la que R41 es como se ha definido anteriormente.

El termino "sulfonamido" se reconoce en la tecnica e incluye un resto que puede representarse por medio de la formula general:

O

5

10

15

20

25

30

35

40

45

en la que R9 y R'11 son como se ha definido con anterioridad.

El termino "sulfonato" se reconoce en la tecnica e incluye un resto que puede representarse por medio de la fbrmula general:

0

II

— s-or41

II

0

en la que R41 es un par de electrones, hidrogeno, alquilo, cicloalquilo, o arilo.

Los terminos "sulfoxido" o "sulfinilo", como se usan en el presente documento, se refieren a un resto que puede representarse por medio de la formula general:

O

-!U,

4

en la que R44 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, aralquilo, o arilo,

Se pueden hacer sustituciones analogas en grupos alquenilo y alquinilo para producir, por ejemplo, aminoalquenilos, aminoalquinilos, amidoalquenilos, amidoalquinilos, iminoalquenilos, iminoalquinilos, tioalquenilos, tioalquinilos, alquenilos o alquinilos con sustitucion de carbonilo,

Tal y como se usa en el presente documento, la definicion de cada expresion, por ejemplo, alquilo, m, n, etc., cuando se produce mas de una vez en cualquier estructura, pretende ser independiente de su definicion en cualquier otro punto en la misma estructura .

Los terminos triflilo, tosilo, mesilo y nonaflilo se reconocen en la tecnica y se refieren a trifluorometanosulfonilo, p-toluensulfonilo, metanosulfonilo, y grupos nonafluorobutanosulfonilo, respectivamente. Los terminos triflato, tosilato, mesilato y nonaflato se reconocen en la tecnica y se refieren a grupos funcionales de ester de trifluorometanosulfonato, ester de p-toluensulfonato, ester de metanosulfonato y ester de nonafluorobutanosulfonate y moleculas que contienen dichos grupos, respectivamente.

Las abreviaturas Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts, Ms representan metilo, etilo, fenilo, trifluorometanosulfonilo, nonafluorobutanosulfonilo, p-toluensulfonilo y metanosulfonilo, respectivamente. Una lista mas completa de las abreviaturas utilizadas por los quimicos organicos expertos en la tecnica aparece en el primer numero de cada volumen de Journal of Organic Chemistry, presentandose tipicamente este listado en una tabla titulada Lista Estandar de Abreviaturas.

Ciertos compuestos de la presente divulgacion pueden existir, en particular, en formas geometricas o estereoisomericas. La presente divulgacion contempla todos estos compuestos, incluyendo isomeros cis- y trans, enantiomeros R y S, diastereomeros, isomeros (D), isomero (L), sus mezclas racemicas y otras mezclas de los mismos. Los atomos de carbono asimetrico adicional tambien pueden estar presentes en un sustituyente tal como un grupo alquilo. Se pretende que todos estos isomeros, asi como sus mezclas, esten incluidos en la presente divulgacion.

Si, por ejemplo, se desea un enantiomero particular de un compuesto de la presente divulgacion, se puede preparar mediante sintesis asimetrica, o mediante derivacion con una sustancia auxiliar quiral, donde se separa la mezcla diastereomerica resultante y el grupo auxiliar se escinde para proporcionar los enantiomeros puros deseados. Alternativamente, cuando la molecula contiene un grupo funcional basico, tal como amino, o un grupo funcional acido, tal como carboxilo, se pueden formar sales diastereomericas con un acido o base opticamente activos apropiados, seguido de resolucion de los diastereomeros formados de este modo por medio de cristalizacion fraccionada o cromatografia, bien conocidas en la tecnica, y posterior recuperacion de los enantiomeros puros.

Los equivalentes contemplados de los compuestos descritos anteriormente incluyen compuestos que de otro modo corresponden a los mismos, y que tienen sus mismas propiedades generales (por ejemplo, la capacidad de inhibir la serialization de hedgehog), en donde se hacen una o mas variaciones simples de sustituyentes que no afectan negativamente a la eficacia del compuesto. En general, los compuestos de la presente divulgacion se pueden preparar por medio de los procedimientos ilustrados en los esquemas de reaccion generales como, por ejemplo, se describe a continuation, o mediante sus modificaciones, utilizando materias primas facilmente disponibles, reactivos y procedimientos convencionales de sintesis. En estas reacciones, tambien es posible hacer uso de variantes que se conocen por si mismas, pero no se mencionan aqui.

Para los propositos de la presente divulgacion, se identifican los elementos quimicos de acuerdo con la Tabla

5

10

15

20

25

30

Periodica de los Elementos, version CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 67a edicion, 1986-87, cubierta interior. Tambien para los propositos de la presente divulgacion, se contempla que el termino "hidrocarburo" incluye todos los compuestos permisibles que tengan al menos un hidrogeno y un atomo de carbono. En un aspecto amplio, los hidrocarburos permisibles incluyen compuestos organicos aciclicos y ciclicos, ramificados y no ramificados, carbociclicos y heterociclicos, aromaticos y no aromaticos, que pueden estar sustituidos o no sustituidos.

III. Los compuestos a modo de ejemplo y su slntesis

Los antagonistas de hedgehog de la divulgacion puede ser esencialmente cualquier composicion que inhiba la actividad de la ruta de senalizacion de hedgehog, en otras palabras, que imite el efecto de la actividad de patched. Los antagonistas de hedgehog pueden ser moleculas pequehas (organicas o inorganicas), nucleotidos de antisentido y PNAs, anticuerpos y proteinas hedgehog alteradas.

Antagonistas de moleculas pequenas:

Los compuestos antagonistas de hedgehog se describen en las siguientes formulas y los procedimientos de preparacion de las composiciones se describen con detalle en los siguientes numeros de patente de Estados Unidos 6.545.005, 6.552.016, y 7,098,196. Los compuestos a modo de ejemplo se dividen en cinco partes. Para cada una de las partes, los grupos de variables y numeros (por ejemplo, R1, L, Z2) se definen de forma individual e inconfundible, y son internamente coherentes pero no necesariamente coherentes parte a parte.

Compuestos a modo de ejemplo parte 1:

Como se describe con mas detalle a continuacion, se contempla que los presentes procedimientos pueden llevarse a cabo usando cualquiera de una variedad de diferentes alcaloides esteroideos que se pueden identificar facilmente, por ejemplo por medio de ensayos de detection de farmacos como se describe en el presente documento. Los alcaloides esteroideos tienen un nucleo que contiene nitrogeno bastante complejo. Dos clases de alcaloides esteroideos a modo de ejemplo para su uso en los procedimientos en cuestion son el tipo Solanum y el tipo Veratrum. Tambien se divulga el uso de compuestos que tienen un sistema de anillo de alcaloide esteroideo de ciclopamina.

Existen mas de 50 alcaloides de veratrum de origen natural incluyendo veratramina, ciclopamina, cicloposina, jervina y muldamine que aparecen en plantas de la Veratrum spp. El Zigadenus spp., camas de la muerte, tambien produce varios alcaloides esteroideos de tipo veratrum incluyendo cigacina. En general, muchos de los alcaloides de veratrum (por ejemplo, jervina, ciclopamina y cicloposina) consisten en una cadena principal de esteroide modiftcada unida mediante espiro a una furanopiperidina. Un alcaloide de tipo veratrum tipico puede representarse por:

imagen6

Un ejemplo del tipo de Solanum es solanidina. Este alcaloide esteroideo es el nucleo (es decir, aglicona) para dos importantes glicoalcaloides solanina, y chaconina, que se encuentran en las patatas. Otras plantas de la familia de Solanum que incluyen varias belladonas, cerezas de Jerusalen, y tomates tambien contienen glicoalcaloides de tipo solanum. Los glicoalcaloides son glucosidos de alcaloides. Un alcaloide de tipo solanum tipico puede representarse por:

5

10

15

20

25

30

R20

imagen7

Basandose en estas estructuras, y la posibilidad de que ciertos efectos secundarios no deseados puedan reducirse por medio de cierta manipulacion de la estructura, se contempla una amplia gama de alcaloides esteroideos como antagonistas potenciales de smoothened para su uso en el presente procedimiento. Por ejemplo, los compuestos utiles en los procedimientos en cuestion incluyen alcaloides esteroideos representados en las formulas generales (I), o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

R6 R7

imagen8

Formula I

en la que, cuando la Valencia y la estabilidad lo permiten,

R2, R3, R4 y R5, representan una o mas sustituciones en el anillo al que estan unidos cada uno de ellos, para cada aparicion, representan independientemente hidrogeno, halogenos, alquilos, alquenilos, alquinilos, arilos, hidroxilo, =0, =S, alcoxilo, sililoxi, amino, nitro. tiol, aminas, iminas, amidas, fosforilos, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, carboxamidas, anhidridos, sililos, eteres, tioeteres, alquilsulfonilos, arilsulfonilos, selenoeteres, cetonas, aldehidos, esteres , azucar (por ejemplo, monosacarido, disacarido, polisacarido, etc ), carbamato (por ejemplo, unido al esteroide en el oxigeno), carbonato, o -(CH2)m-R8;

R6, R7, y R'7, estan ausentes o representan, independientemente, halogenos, alquilos, alquenilos, alquinilos, arilos, hidroxilo, =0, =S, alcoxilo, sililoxi, amino, nitro, tiol, aminas, iminas, amidas, fosforilos, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, carboxamidas, anhidridos, sililos, eteres, tioeteres, alquilsulfonilos, arilsulfonilos, selenoeteres, cetonas, aldehidos, esteres o -(CH2)m-R8 o

R6 y R7, o R7 y R'7, tornados juntos forman un anillo o un anillo policiclico, por ejemplo, que esta sustituido o no sustituido, con la condicion de que al menos uno de R6, R7, o R'7 este presente e incluya una amina, por ejemplo, como uno de los atomos que constituyen el anillo;

R8 representa un arilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterociclo, o policiclo; y m es un numero entero dentro del intervalo de 0 a 8, arnbos incluidos.

Tambien R2 representa =0, azucar (por ejemplo, monosacarido, disacarido, polisacarido, etc ), carbamato (por ejemplo, unido al esteroide en el oxigeno), ester (por ejemplo, unido al esteroide en el oxigeno), carbonato o alcoxi. Los sustituyentes tales como carbamato, ester, carbonato y alcoxi pueden estar sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, pueden incluir grupos funcionales adicionales, tales como arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, amida, acilamino, carbonilo, ester, carbamato, urea, cetona, sulfonamida, etcetera.

Tambien se divulga que la amina de R6, R7, o R'7 es una amina terciaria.

Tambien se divulga que R3, para cada aparicion, es un, alquilo, -OH, -alquilo, O-alquilo, -C(0)-alquilo o -C(0)-R 8. Tambien se divulga que R4, para cada aparicion, se encuentra ausente, o representa -OH, =0, alquilo, -O-alquilo, -C

5

10

15

20

25

(0) -alquilo, o -C (0) -R 8..

Tambien se divulga que dos de R6, R7, y R’7 tornados juntos forman un anillo que contiene nitrogeno, tal como un furanopiperidina, tal como perhidrofuro[3,2-b]piridina, piranopiperidina, quinolina, indol, piranopirrol, naftiridina, tiofuranopiperidina o tiopiranopiperidina.

Tambien se divulga que el anillo que contiene nitrogeno comprende una amina terciaria, por ejemplo, que tiene un sustituyente extra-anular en el atomo de nitrogeno, por ejemplo, un alquilo sustituido con, por ejemplo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, amida, acilamino, carbonilo, ester, carbamato, urea, cetona, sulfonamida, etc. En ciertos modos de realizacion, el sustituyente extra-anular de la amina terciaria es un sustituyente hidrofobo. Tambien se divulga que el sustituyente extra-anular hidrofobo incluye un arilo, heteroarilo, carbociclilo, heterociclilo, o grupo policiclilo, tal como biotina, un complejo zwiterionico de boro, un policiclo esteroideo, etc. Tambien se divulga que el sustituyente hidrofobo puede consistir esencialmente en una combinacion de alquilo, amido, acilamino, cetona, ester, eter, halogeno, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, urea, o grupos funcionales similares, incluyendo entre 5 y 40 atomos que no son hidrogeno, mas preferentemente entre 5 y 20 atomos que no son hidrogeno.

Tambien se divulga que R8 representa un arilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterociclo o policiclo, y preferentemente R8 es una piperidina, pirrolidina, piridina, pirimidina, morfolina, tiomorfolina, piridazina, etc.

Tambien se divulga que las definiciones descritas anteriormente se aplican, y los compuestos en cuestion estan representados por medio de la formula general la o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados.

R6 R7

imagen9

imagen10

Formula la

Tambien se divulga que el alcaloide esteroideo se representa en la formula general (II), o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor u homo-derivados.

imagen11

Formula II

en la que R2, R3, R4, R5, R6, R7, y R'7 son como se has definido anteriormente, y X representa 0 o S, aunque preferentemente 0.

Tambien se divulga que R2 representa =0. azucar (por ejemplo, monosacarido, disacarido, polisacarido, etc.), carbamato (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), ester (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), carbonato, o alcoxi. Los sustituyentes tales como carbamato, ester, carbonato y alcoxi pueden estar sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, pueden incluir grupos funcionales adicionales, tales como arilo, aralquilo, heteroarilo, 5 heteroaralquilo, amida, acilamino, carbonilo, ester, carbamato, urea, cetona, sulfonamida, etcetera.

Tambibn se desvela que la amina de R6, R7, o R'7 es una amina terciaria, por ejemplo, sustituida con un alquilo sustituido o no sustituido. Tambien se divulga que la amina es parte de un sistema de anillo biciclico formado a partir de R7 y R'7, por ejemplo, un sistema de furanopiperidina, y el tercer sustituyente es un alquilo sustituido con, por ejemplo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, amida , acilamino, carbonilo, ester, carbamato, urea, cetona, 10 sulfonamida, etc. Tambien se divulga que el sustituyente extra-anular de la amina terciaria es un sustituyente hidrofobo. En ciertos modos de realization, el sustituyente extra-anular hidrofobo incluye un grupo arilo, heteroarilo, carbociclilo, heterociclilo o policiclilo, tal como biotina, un complejo zwiterionico de boro, un policiclo esteroideo, etc. Tambien se divulga que el sustituyente hidrofobo puede consistir esencialmente en una combination de grupos funcionales alquilo, amido, acilamino, cetona, ester, eter, halogeno, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, urea, o grupos 15 funcionales similares, incluyendo entre 5 y 40 atomos que no son hidrogeno, mas preferentemente entre 5 y 20 atomos que no son hidrogeno.

Tambien se divulga que las definiciones descritas anteriormente se aplican, y los compuestos en cuestion estan representados por la formula general I la o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados.

imagen12

20

Formula I la

Tambien se divulga que el alcaloide esteroideo se representa en la formula general (III), sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

imagen13

imagen14

25 en la que

en las que R2, R3, R4, R5 y R8 son como se ha deftnido con anterioridad;

5

10

15

20

25

30

A y B representan grupos monociclicos o policiclicos;

T representa un grupo alquilo, aminoalquilo, carboxilo, ester, amida, enlace eter o amina de longitud de enlace 1-10;

T' esta ausente o representa un alquilo, aminoalquilo, carboxilo, ester, amida, enlace eter o amina de longitud de enlace 1-3, en el que si T y T' estan presentes juntos, entonces T y T' tornados junto con el anillo a o B forman un anillo cerrado covalentemente de 5-8 atomos de anillo;

R9 representa una o mas sustituciones en el anillo A o B, que para cada aparicion, representan independientemente halogenos, alquilos, alquenilos, alquinilos, arilos, hidroxilo, =0, =S, alcoxilo, sililoxi, amino, nitro, tiol, aminas, iminas, amidas, fosforilos, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, carboxamidas, anhidridos, sililos, eteres, tioeteres, alquilsulfonilos, arilsulfonilos, selenoeteres, cetonas, aldehidos, esteres o -(CH2)m-R8; y

n y m son independientemente, cero, 1 o 2;

con la condition de que A, o T, T, y B, tornados juntos, incluyan al menos una amina.

Tambien se divulga que R2 representa =0, azucar (por ejemplo, monosacarido, disacarido, polisacarido, etc.), carbamato (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), ester (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), carbonato, o alcoxi. Los sustituyentes tales como carbamato, ester, carbonato y alcoxi pueden estar sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, pueden incluir grupos funcionales adicionales, tales como arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, amida, acilamino, carbonilo, ester, carbamato, urea, cetona, sulfonamida, etcetera.

Tambien se divulga que la amina de A, o T, T' y B, es una amina terciaria, por ejemplo, sustituida con un alquilo sustituido o no sustituido, por ejemplo, sustituida con arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, amida, acilamino, carbonilo, ester, carbamato, urea, cetona, sulfonamida, etc. Tambien se divulga que el sustituyente extra-anular de la amina terciaria es un sustituyente hidrofobo. Tambien se divulga que el sustituyente extra-anular hidrofobo incluye un arilo, heteroarilo, carbociclilo, heterociclilo, o grupo policiclilo, tal como biotina, un complejo zwiterionico de boro, un policiclo esteroideo, etc. Tambien se divulga que el sustituyente hidrofobo puede consistir esencialmente en una combinacion de grupos funcionales alquilo, amido, acilamino, cetona, ester, eter, halogeno, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, urea, o grupos funcionales similares, incluyendo entre 5 y 40 atomos que no son hidrogeno, mas preferentemente entre 5 y 20 atomos que no son hidrogeno.

Tambien se divulga que las definiciones descritas anteriormente se aplican, y los compuestos en cuestion estan representados por la formula general Ilia o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

imagen15

Formula Ilia

Por ejemplo, los procedimientos en cuestion pueden usar antagonistas de smoothened basados en alcaloides esteroideos de tipo veratrum de jervina, ciclopamina, cicloposina, muquiamina o veratramina, por ejemplo, que se pueden representar en la formula general (IV), o sus formas insaturadas y/o sus seco -, nor- u homo-derivados:

imagen16

imagen17

Formula IV

en la que

en las que R2, R3, R4, R5, R6 y R9 son como se ha definido anteriormente.

R22 esta ausente o representa un alquilo, un alcoxilo o -OH.

Tambien se divulga que R2 representa =0, azucar (por ejemplo, monosacarido, disacarido, polisacarido, etc), carbamato (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), ester (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), carbonato, o alcoxi. Los sustituyentes tales como carbamato, ester, carbonato y alcoxi pueden estar sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, pueden incluir grupos funcionales adicionales, tales como arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, amida, acilamino, carbonilo, 6ster, carbamato, urea, cetona, sulfonamida, etcetera.

Tambien se divulga que R9 incluye un sustituyente en el nitrogeno, por ejemplo, un alquilo sustituido o no sustituido, por ejemplo, sustituido con, por ejemplo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, amida, acilamino, carbonilo, ester, carbamato, urea, cetona, sulfonamida, etc. En ciertos modos de realizacion, el sustituyente extra-anular (por ejemplo, R9) de la amina terciaria es un sustituyente hidrofobo. En ciertos modos de realizacion, el sustituyente extra-anular hidrofobo incluye un grupo arilo, heteroarilo, carbociclilo, heterociclilo o policiclilo, tal como biotina, un complejo zwiterionico de boro, un policiclo esteroideo, etc. En ciertos modos de realizacion. el sustituyente hidrofobo puede consistir esencialmente en una combination de alquilo, amido, acilamino, cetona, ester, eter, halogeno, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, urea, o grupos funcionales similares, incluyendo entre 5 y 40 atomos que no son hidrogeno, mas preferentemente entre 5 y 20 atomos que no son hidrogeno.

Tambien se divulga que las definiciones descritas anteriormente se aplican, y los compuestos en cuestion estan representados por la formula general IVa o sus formas insaturadas y/o sus seco, nor- u homo-derivados:

imagen18

R22

N

R2

R3

Formula IVa

Tambien se divulga que el alcaloide esteroideo se representa en la formula general (V) o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

imagen19

imagen20

Formula V

en las que R2, R3, R4, R6 y R9 son como se ha definido anteriormente.

Tambien se divulga que R2 representa =0, azucar (por ejemplo, monosacarido, disacarido, polisacarido, etc.), 5 carbamato (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), ester (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), carbonato, o alcoxi. Los sustituyentes tales como carbamato, ester, carbonato y alcoxi pueden estar sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, pueden incluir grupos funcionales adicionales, tales como arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, amida, acilamino, carbonilo, ester, carbamato, urea, cetona, sulfonamida, etcetera.

Tambien se divulga que R9 incluye un sustituyente en el nitrogeno, por ejemplo, un alquilo sustituido o no sustituido, 10 por ejemplo, sustituido con, por ejemplo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, amida. acilamino, carbonilo, ester, carbamato, urea, cetona, sulfonamida, etc.

Tambien se divulga que el sustituyente extra-anular de la amina terciaria (por ejemplo, R9) es un sustituyente hidrofobo. En ciertos modos de realizacion, el sustituyente extra-anular hidrofobo incluye un grupo arilo, heteroarilo, carbociclilo, heterociclilo o policiclilo, tal como biotina, un complejo zwiterionico de boro, un policiclo esteroideo, etc. 15 Tambien se divulga que el sustituyente hidrofobo puede consistir esencialmente en una combinacion de grupos funcionales alquilo, amido, acilamino, cetona, ester, eter, halogeno, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, urea, o grupos funcionales similares, incluyendo entre 5 y 40 atomos que no son hidrogeno, mas preferentemente entre 5 y 20 atomos que no son hidrogeno.

20

Tambien se divulga que las definiciones descritas anteriormente se aplican, y los compuestos en cuestion estan representados por la formula general Va o sus formas insaturadas y/o, sus seco, nor- u homo-derivados:

imagen21

imagen22

Formula Va

Otra clase de antagonistas de smoothened puede basarse en los alcaloides esteroideos de tipo veratrum que se parecen a verticina y cigacina, por ejemplo, de formula general (VI), o sus formas insaluradas y/o sus seco-, nor- u 5 homo-derivados:

imagen23

Formula VI

en las que R2, R3, R4, R5 y R9 son como se ha definido anteriormente.

Tambien se divulga que R2 representa =0, azucar (por ejemplo, monosacarido, disacarido, polisacarido, etc), 10 carbamato (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), ester (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), carbonato, o alcoxi. Los sustituyentes tales como carbamato, ester, carbonato y alcoxi pueden estar sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, pueden incluir grupos funcionales adicionales, tales como arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, amida, acilamino, carbonilo, ester, carbamato, urea, cetona, sulfonamida, etcetera.

Tambien se divulga que las deflniciones anteriores se aplican, 15 la formula general Via o sus formas insaturadas y/o sus seco-

y los compuestos en cuestion estan representados por nor- u homo-derivados:

imagen24

Formula Via

Tambien se divulga que el alcaloide esteroideo se representa en la formula general (VII) o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

R9

imagen25

R9

Formula VII

en las que R2, R3, R4, R5 y R9 son como se ha definido anteriormente.

10

Tambien se divulga que R2 representa =0, azucar (por ejemplo, monosacarido, disacarido, polisacarido, etc ), carbamato (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), ester (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), carbonato, o alcoxi. Los sustituyentes tales como carbamato, ester, carbonato, y alcoxi pueden estar sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, pueden incluir grupos funcionales adicionales, tales como arilo. aralquilo,

imagen26

Otra clase de antagonistas de smoothened puede basarse en los alcaloides esteroideos de tipo veratrum que se parecen a verticina y cigacina, por ejemplo, de formula general (VI), o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u 5 homo-derivados:

imagen27

Formula VI

en las que R2, R3, R4, R5 y R9 son como se ha definido anteriormente.

Tambien se divulga que r2 representa =0, azucar (por ejemplo, monosacarido, disacarido, polisacarido, etc.), 10 carbamato (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), ester (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), carbonato, o alcoxi. Los sustituyentes tales como carbamato, ester, carbonato y alcoxi pueden estar sustituldos o no sustituidos, por ejemplo, pueden incluir grupos funcionales adicionales, tales como arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, amida, acilamino, carbonilo, ester, carbamato, urea, cetona, sulfonamida, etcetera.

Tambien se divulga que las definiciones anteriores se aplican, y los compuestos en cuestion se representan por la

formula general Via o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

imagen28

R2

imagen29

o R3

Formula Via

Tambien se divulga que el alcaloide esteroideo se representa en la formula general (VII) o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados;

R9

imagen30

R9

Formula VII

10

15

en las que R2, R3, R4, R5 y R9 son como se ha definido anteriormente.

Tambien se divulga que R2 representa =0, azucar (por ejemplo, monosacarido, disacarido, polisacarido, etc), carbamato (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), ester (por ejemplo, ligado al esteroide en el oxigeno), carbonato, o alcoxi. Los sustituyentes tales como carbamato, ester, carbonato y alcoxi pueden estar sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, pueden incluir grupos funcionales adicionales, tales como arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, amida, acilamino, carbonilo, ester, carbamato, urea, cetona, sulfonamida, etcetera.

Tambien se divulga que las definiciones descritas anteriormente se aplican, y los compuestos en cuestion estan representados por la formula general Vila o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

R9 H

imagen31

""R9

Formula Vila

Tambien se divulga que los antagonistas en cuestion y los activadores se pueden elegir sobre la base de su selectividad para la ruta de smoothened. Esta selectividad puede ser para las rutas de smoothened frente a otras rutas mediadas por esteroides (tales como actividades mediadas por testosterona o estrogeno). asi como selectividad para determinadas rutas de hec/gehog/ptc/smoothened, por ejemplo, el isotipo especifico para ptc (por ejemplo, ptc-1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

, ptc-2) o hedgehog (por ejemplo, Shh, Ihh, Dhh, etc.). Por ejemplo, el presente procedimiento puede emplear alcaloides esteroideos que no interfieran sustancialmente con la actividad biolbgica de los esteroides tales como la aldosterona, androstano, androsteno, androstendiona, androsterona, colecalciferol, colestano, acido colico, corticosterona, cortisol, acetato de cortisol, cortisona, acetato de cortisona, desoxicorticosterona, digitoxigenina, ergocalciferol, ergosterol, estradiol-17-a, el estradiol-17-(B, estriol, estrano, estrona, hidrocortisona, lanosterol, acido litocolico, mestranol, |3-metasona, prednisona, pregnano, pregnenolona, progesterona, espironolactona , testosterona, triamcinolona y derivados de los mismos, al menos con tal de que dichas actividades no esten relacionadas con la sefializacion relativa a ptc.

Tambien se divulga que el alcaloide esteroideo en cuestion para su uso en el presente procedimiento tiene un kd para los miembros de la superfamilia de receptores nucleares honmonales de mas de 1 pM, y mas preferentemente mayor que 1 mM, por ejemplo, que no se une a estrogenos, receptores de testosterona o similares. Preferentemente, el antagonista de smoothened en cuestion no tiene actividad estrogenica a concentraciones fisiologicas (por ejemplo, en el intervalo de 1 ng -1 mg/kg).

De esta manera, se pueden reducir los efectos secundarios adversos que pueden asociarse a ciertos miembros de la clase de alcaloides esteroideos. Por ejemplo, usando los ensayos de deteccion de farmacos descritos en el presente documento, la aplicacion de tecnicas de quimica combinatoria y medica a los alcaloides esteroideos proporciona un medio para la reduction de estos efectos secundarios negativos no deseados que incluyen cambios de personalidad, esperanza de vida mas corta, enfermedades cardiovasculares y oclusibn vascular, toxicidad para organos, hiperglucemia y diabetes, caracteristicas Cushnoid, caquexia busulfanica, glaucoma esteroideo, hipertension, ulceras pepticas y mayor susceptibilidad a las infecciones. Para ciertos casos, resulta beneficioso reducir la actividad teratogenica en relacion con jervina, como por ejemplo, durante el uso del presente procedimiento para inhibir selectivamente la espermatogenesis.

En un modo de realizacion preferente, los antagonistas en cuestion son alcaloides esteroideos distintos de espirosolano, tomatidina, jervina, etc.

Tambien se divulga que el alcaloide esteroideo se escoge para su uso ya que es mas selectivo para una isoforma de patched con respecto a la siguiente, por ejemplo, 10 veces, y mas preferentemente al menos de 100 o incluso 1000 veces mas selectivo para una ruta de patched (ptc-1, ptc-2) con respecto a otro. Del mismo modo, el alcaloide esteroideo se puede escoger para su uso, ya que es mas selectivo para una isoforma de smoothened con respecto a la siguiente, por ejemplo, 10 veces, y mas preferentemente al menos de 100 o incluso 1000 veces mas selectivo para una proteina de smoothened de tipo natural (en caso de existir varias isoformas) o para los mutantes de smoothened activados, con respecto a smoothened de tipo natural. En ciertos modos de realizacion, el presente procedimiento puede llevarse a cabo conjuntamente con la administracion de factores de crecimiento y/o troficos, o composiciones que actuen tambien en otras partes de la ruta de hedgehog/smoothened. Por ejemplo, se contempla que los procedimientos en cuestion pueden incluir el tratamiento con un agente que modula los niveles de AMPc, por ejemplo, aumentando o disminuyendo los niveles intracelulares de AMPc.

Tambien se divulga que el presente procedimiento utiliza un antagonista de smoothened, y el agente conjunto eleva los niveles de AMPc con el fin de mejorar la eficacia del antagonista de smoothened.

Por ejemplo, compuestos que pueden activar la adenilato ciclasa incluyen forscolina (FK), toxina del colera (CT), toxina pertussis (PT), prostaglandinas (por ejemplo, PGE-1 y PGE-2), colforsina y agonistas de los receptores beta-adrenergicos. agonistas de los receptores (Tadrenergicos (a veces denominados en el presente documento "agonistas beta-adrenergicos") incluyen albuterol, bambuterol, bilolterol, carbuterol, clembuterol, clorprenalina, denopamina, dioxetedrina, dopexamina, efedrina, epinefrina, etafedrina, etilnorepinefrina, fenoterol, formoterol, hexoprenalina , ibopamina, isoetarina, isoproterenol, mabuterol, metaproterenol, metoxifenamina, norepinefrina, oxifedrina, pirbuterol, prenalterol, procaterol, propranolol, protoquilol, quinterenol, reproterol, rimiterol, ritodrina, salmefamol, soterenol, salmeterol, terbutalina, tretoquinol, tulobuterol y xamoterol.

Los compuestos que pueden inhibir la fosfodiesterasa de AMPc incluyen amrinona, milrinona, xantina, metilxantina, anagrelida, cilostamida, medorinona, indolidano, rolipram, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), queleritrina, cilostazol, glucocorticoides, acido griseolico, etazolato, cafeina, indometacina, papaverina, MDL 12330A, SQ 22536, GDPssS, clonidina, inhibidores de tipo III y tipo IV de fosfodiesterasa, metilxantinas como la pentoxifilina, teofilina, teobromina, pirrolidinonas y derivados de cicloalquen y cicloalcan fenilo (descritos en las publicaciones PCT Nos. WO 92/19594 y WO 92/10190), lisofinilna y fenoxamina.

Los analogos de AMPc que pueden ser utiles en el presente procedimiento incluyen dibutiril-AMPc (db-AMPc), (8-(4)-clorofeniltio) -AMPc (CPT-AMPc), 8-[(4-bromo-2,3-dioxobutil)tio]-AMPc, 2-[(4-bromo-2,3-dioxobutil)tio]-AMPc, 8-bromo-AMPc, dioctanoil-AMPc, 3’:5'-fosforotioato ciclico de Sp-adenosina, 8- piperidino-AMPc, N 6-fenil-AMPc-8-metilamino-AMPc, 8-(6-aminohexil)amino-AMPc, 2'-desoxi-AMPc, N6, 2’-0-dibutril-AMPc, N 6, 2'-0-disuccinil-AMPc, N6-monobutiril-AMPc, 2'-0-monobutiril-AMPc, 2’-0-monobutril-8-bromo-AMPc, N6 -monobutril-2'-desoxi-AMPc, y 2 'O-monosuccinil-AMPc.

Los compuestos que pueden reducir los niveles o la actividad de AMPc incluyen fosfato ciclico de prostaglandilinositol

5

10

15

20

25

30

35

(PIP ciclico), endotelinas (ET)-1 y -3, norepinepurina, K252a, didesoxiadenosina, dinorfinas, melatonina, toxina pertussis, estaurosporina, agonista Gi, MDL 123 30A, SQ 22536, GDPssS y clonidina, bloqueadores beta y ligandos de receptores acoplados a proteinas G. Los compuestos adicionales se divulgan en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5.891.875, 5.260.210, y 5.795.756.

Los compuestos listados anteriormente utiles en los procedimientos en cuestion se pueden modificar para aumentar la biodisponibilidad, actividad u otra propiedad farmacoiogicamente relevante del compuesto. Por ejemplo, forscolina tiene la formula:

imagen32

Las modificaciones de forscolina que se ha comprobado que aumentan el caracter hidrofilo de forscolina sin atenuar gravemente la actividad biologica deseada incluyen la acilacion de los hidroxilos en C6 y/o C7 (tras la retirada del grupo acetilo) con grupos acilo hidrofilos. En los compuestos en los que C6 se acila con un grupo acilo hidrbfilo, C7 opcionalmente puede experimentar desacetilacion. Los grupos acilo hidrofilos adecuados incluyen grupos que tienen la estructura-(CO)(CH2)nX, en la que X es OH o NR2; R es hidrogeno, un grupo alquilo C1-C4, o dos Rs tornados juntos fomnan un anillo que comprende 3-8 atomos, preferentemente 5-7 atomos, que puede incluir heteroatomos (por ejemplo, anillos de piperazina o morfolina); y n es un numero entero de 1-6, preferentemente de 1-4, incluso mas preferentemente de 1-2. Otros grupos acilo hidrofilos adecuados incluyen amino acidos hidrofilos o sus derivados, tales como acido aspartico, acido glutamico, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, etc., incluyendo aminoacidos que tienen una cadena lateral heterociclica. Se puede sintetizar facilmente forscolina, u otros compuestos listados anteriormente, modificada por otras cadenas laterales de acilo hidrofilo posibles, conocidos por los expertos en la tecnica, y se puede someter a ensayo para evaluar la actividad en el presente procedimiento.

Del mismo modo, variantes o derivados de cualquiera de los compuestos listados anteriormente pueden resultar eficaces como antagonistas de AMPc en el presente procedimiento, por ejemplo, con el fin de disminuir los niveles de AMPc y potenciar la actividad del activador de smoothened. Los expertos en la tecnica seran capaces de sintetizar de manera sencilla y someter a ensayo dichos derivados para evaluar su actividad adecuada.

Compuestos a modo de ejemplo parte II:

Los alcaloides esteroideos adicionales se contemplan como antagonistas de hedgehog potenciales para su uso en el presente procedimiento. Por ejemplo, los compuestos utiles en los presentes procedimientos incluyen alcaloides esteroideos representados en las formulas generales (VIII), o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

R6 R7

imagen33

en la que, cuando la Valencia y la estabilidad lo permiten,

R2, R3, R4 y R5, representan una o mas sustituciones en el anillo al que estan unidos cada uno de ellos, para cada aparicion, representan independientemente hidrogeno, halogenos, alquilos, alquenilos, alquinilos, arilos, hidroxilo,

=0, =S, alcoxilo, sililoxi, amino, nitro, tiol, aminas. iminas, amidas, fosforilos, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, carboxamidas, anhidridos, sililos, eteres, tioeteres, alquilsulfonilos, arilsulfonilos, selenoeteres, cetonas, aldehidos, esteres , azucar(por ejemplo, monosacarido, disacarido, polisacarido, etc ), carbamato (por ejemplo, unido al esteroide en el oxigeno), carbonato, o -(CH2)m-R8;

R6, R7, y R'7, estan ausentes o representan, independientemente, halogenos, alquilos, alquenilos, alquinilos, arilos, hidroxilo, =0, =S, alcoxilo, sililoxi, amino, nitro, tiol, aminas, iminas, amidas, fosforilos, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, carboxamidas, anhidridos, sililos, eteres, tioeteres, alquilsulfonilos, arilsulfonilos, selenoeteres, cetonas, aldehidos, esteres o -(CH2)m-R8. o

R 6y R 7, oR7y R'7, tornados juntos forman un anillo o un anillo policiclico, por ejemplo, que esta sustituido o no sustituido,

con la condicion de que al menos uno de R6, R7, o R'7 este presente e incluya una amina primaria o secundaria;

R8 representa un arilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterociclo, o policiclo; y m es un numero entero dentro del intervalo de 0 a 8, ambos incluidos.

En modos de realizacion especialmente preferidos:

R2 y R3, para cada aparicion, son un -OH, alquilo, -O-alquilo, -C(0)-alquilo, o -C(0)-R 8;

R4, para cada aparicion, esta ausente, o representa -OH, =0, alquilo, -O-alquilo, -C(0)-alquilo o -C(0)-R8;

R6, R7, y R'7 representan cada uno independientemente, hidrogeno, alquilos, alquenilos, alquinilos, aminas, iminas, amidas, carbonilos, carboxilos, carboxamidas. eteres, tioeteres, esteres, o-(CH2)m-R8, o

R7, y R'7 tornados juntos forman una furanopiperidina, tal como perhidrofuro[3,2-b]piridina, una piranopiperidina, quinolina, indol, piranoprrol, naftiridina, tiofuranopiperidina o tiopranopiperidina

con la condicion de que al menos uno de R6, R7, o R'7 este presente e incluya una amina primaria o secundaria;

R8 representa un arilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterociclo, o policiclo, y preferentemente R8 es una piperidina, pirimidina, morfolina, tiomorfolina, piridazina,

Tambien se divulga que las definiciones anteriores se aplican, y los compuestos en cuestion estan representados por la formula general Villa o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

R6

R7

R2

imagen34

R3

R3

Formula Villa

Tambien se divulga que los antagonistas de hedgehog se pueden representar por una de las siguientes formulas generates (IX) o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

R4 R6

R6

imagen35

imagen36

R7

R'

imagen37

R'

en la que R2, R3, R4, R5, R6, R7, y R'7 son como se ha definido anteriormente y X representa O o S, aunque preferentemente O.

Tambien se divulga que las definiciones descritas anteriormente se aplican, y los compuestos en cuestion estan representados por la formula general IXa o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

R4 R6

R6

R7

imagen38

imagen39

R6

imagen40

R7

"R1

10 Tambien se divulga que los antagonistas de hedgehog en cuestion estan representados por la formula general (X) o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

imagen41

R9

R4

imagen42

T

T*

imagen43

R9

B

5

10

15

20

25

Formula X

en la que

en las que R2, R3, R4, R5 y R8 son como se ha definido con anterioridad;

A y B representan grupos monociclicos o policiclicos;

T representa un grupo alquilo, aminoalquilo, carboxilo, ester, amida, enlace eter o amina de longitud de enlace 1-10;

T' esta ausente o representa un alquilo, aminoalquilo, carboxilo, ester, amida, enlace eter o amina de longitud de enlace 1-3, en el que si T y T' estan presentes juntos, entonces T y T' tornados junto con el anillo A o B forman un anillo cerrado covalentemente de 5-8 atomos de anillo;

R9 representa una o mas sustituciones en el anillo A o B, que para cada aparicion, representan independientemente halogenos, alquilos, alquenilos, alquinilos, arilos, hidroxilo, =0, =S, alcoxilo, sililoxi, amino, nitro, tiol, aminas, iminas, amidas, fosforilos, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, carboxamidas, anhidridos, sililos, eteres, tioeteres, alquillsulfonilos, arilsulfonilos, selenobteres, cetonas, aldehidos, esteres o -(CH2)m-R8; y

n y m son independientemente, cero, 1 o 2;

con la condicion de que A y R9, o T, T' B y R9, en conjunto incluyan al menos una amina primaria o secundaria.

En cierlos ejemplos las definiciones anteriormente descritas se aplican, y los compuestos en cuestion estan representados por la formula general Xa o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

imagen44

imagen45

Por ejemplo, los presentes procedimientos pueden usar antagonistas de hedgehog basados en alcaloides esteroideos de tipo veratrum de jervina, la ciclopamina, cicloposina, muquiamina o veratramina, por ejemplo, que se pueden representar por la formula general (XI) o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

imagen46

Formula XI:

en la que

en las que R2, R3, R4. R5, R6 y R9 son como se ha definido anteriormente.

R22 esta ausente o representa un alquilo, un alcoxilo o -OH.

Tambien se divulga que las definiciones descritas anteriormente se aplican, y los compuestos en cuestion estan representados por la formula general Xla o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

R2

imagen47

R9

R3

Formula Xla

Tambien se divulga que los antagonistas en cuestion se representan por las formulas (XII) o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

R2

imagen48

R9

Formula XII:

en las que R2, R3, R4, R6 y R9 son como se ha definido anteriormente.

Tambien se divulga que las definiciones descritas anteriormente se aplican, y los compuestos en cuestion estan representados por la formula general XIla o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

R2

imagen49

R9

imagen50

R9

Otra clase de antagonistas de hedgehog puede basarse en los alcaloides esteroideos de tipo veratrum que se parecen a verticina y cigacina, por ejemplo, representados por las fbrmulas generales (VI) o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

imagen51

imagen52

10

Formula XIII:

en las que R2, R3, R4, R5 y R9 son como se ha definido anteriormente.

Tambien se divulga que las definiciones descritas anteriormente se aplican, y los compuestos en cuestion estan representados por la formula general XII la o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

imagen53

Otra clase de antagonistas potenciales de hedgehog se basan en los alcaloides esteroideos de tipo solanum, por ejemplo, solanidina, que puede representarse por la formula general (XIV) o sus formas insaturadas y/o sus seco-, 5 nor- u homo-derivados:

R9

imagen54

Formula XIV:

en las que R2, R3, R4, R5 y R9 son como se ha definido anteriormente.

Tambien se divulga que las definiciones descritas anteriormente se aplican, y los compuestos en cuestion estan 10 representados por la formula general XlVa o sus formas insaturadas y/o sus seco-, nor- u homo-derivados:

R9 H

imagen55

Formula XlVa

15

Tambien se divulga que los antagonistas en cuestion pueden escogerse sobre la base de su selectividad para la ruta de hedgehog. Esta selectividad puede ser para la ruta de hedgehog frente a otras rutas mediadas por esteroides (tales como actividades mediadas por testosterona o estrogeno), asi como para rutas particulares de hedgehog, por ejemplo, el isotipo especifico para hedgehog (por ejemplo, Shh, Ihh, Dhh) o el receptor de patched (por ejemplo, ptc-1, ptc-2). Por ejemplo, el presente procedimiento puede emplear alcaloides esteroideos que no interfieran sustancialmente con la actividad biologica de los esteroides tales como la aldosterona, androstano, androsteno, androstendiona, androsterona, colecalciferol, colestano, acido colico, corlicosterona, cortisol, acetato de cortisol, cortisona, acetato de cortisona, desoxicorticosterona, digitoxigenina, ergocalciferol, ergosterol, estradiol-17-a, el estradiol-17-JB, estriol, estrano, estrona, hidrocortisona, lanosterol, acido litocdlico, mestranol, (5-metasona, prednisona, pregnano, pregnenolona, progesterona, espironolactona , testosterona, triamcinolona y derivados de los mismos, al menos con tal de que dichas actividades no esten relacionadas con la senalizacion relativa a ptc.

5

10

15

20

25

30

35

Tambien se divulga que el alcaloide esteroideo en cuestion para su uso en el presente procedimiento tiene un kd para los miembros de la superfamilia de receptores nucleares hormonales de mas de 1 pM, y mas preferentemente mayor que 1 mM, por ejemplo, que no se une a estrogenos, receptores de testosterona o similares. Preferentemente, el antagonista de hedgehog objeto no tiene actividad estrogenica a concentraciones fisiologicas (por ejemplo, en el intervalo de 1 ng -1 mg/kg).

De esta manera, se pueden reducir los efectos secundarios adversos que pueden asociarse a ciertos miembros de la clase de alcaloides esteroideos. Por ejemplo, usando los ensayos de deteccion de farmacos descritos en el presente documento, la aplicacion de tecnicas de quimica combinatoria y medica a los alcaloides esteroideos proporciona un medio para la reduccion de estos efectos secundarios negativos no deseados que incluyen cambios de personalidad, esperanza de vida mas corta, enfermedades cardiovasculares y oclusion vascular, toxicidad para organos, hiperglucemia y diabetes, caracteristicas Cushnoid, caquexia busulfanica, glaucoma esteroideo, hipertension, ulceras pepticas y mayor susceptibilidad a las infecciones. Para ciertos casos, resulta beneficioso reducir la actividad teratogenica en relacion con jervina, como por ejemplo, durante el uso del presente procedimiento para inhtbir selectivamente la espermatogenesis.

Tambien se divulga que los antagonistas en cuestion son alcaloides esteroideos distintos de spirosolane, tomatidina, jervina, etc.

Tambien se divulga que los inhibidores en cuestion inhiben la ruta de transduccion de serial de hedgehog con un ED50 de 1 mM o menos, mas preferentemente de 1 pM o menos, e incluso mas preferentemente de 1 nMo menos.

Tambien se divulga que los inhibidores en cuestion inhiben la ruta de transduccion de serial de hedgehog con un ED50 de 1 mM o menos, mas preferentemente 1 pM o menos, e incluso mas preferentemente 1 nMo menos.

Tambien se divulga que el alcaloide esteroideo se escoge para su uso, ya que es mas selectivo para una isoforma de patched con respecto a la siguiente, por ejemplo, 10 veces, y mas preferentemente al menos de 100 o incluso 1000 veces mas selectivo para una ruta de patched (ptc-1, ptc-2) con respecto a otro.

Los compuestos a modo de ejemplo de la parte III:

Como se describe con mas detalle a continuacion, se contempla que los procedimientos en cuestion pueden llevarse a cabo usando una variedad de diferentes moleculas pequenas que pueden identificarse facilmente, por ejemplo, por medio de ensayos de deteccion de farmacos como se describe en el presente documento. Por ejemplo, los compuestos utiles en los procedimientos en cuestion incluyen compuestos que se pueden representar por la formula general (XV):

Ri

imagen56

Formula XV

en la que, cuando la Valencia y la estabilidad lo permiten,

R1 y R2, independientemente para cada aparicion, representan H, alquilo inferior, arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), aralquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo, -(CH2)narilo), o heteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido) o heteroaralquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo, -(CH2)n heteroaralquil-);

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X1 y X2 se pueden escoger, independientemente entre -N(R8)-, -0-, -S-, -Se-, - N=N-, -ON=CH-, -(R8)N-N(R8)-, -ON(R8)-, un heterociclo, o un enlace directo entre Le Y1 o Y2, respectivamente;

Y1 e Y2 se pueden escoger, independientemente, entre -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=0)(0R2)-, un grupo heteroaromatico, un enlace directo entre X1 y Z1 o X2 y Z2, respectivamente;

Z1 y Z2 se pueden seleccionar, independientemente, entre -N(R8)-, -0-, -S-, -Se-, - N=N-( -ON=CH-, -R8N-NR8-, -ONR8-, un heterociclo o un enlace directo entre Y1 o Y2, respectivamente, y L;

R8, independientemente para cada aparicion, representa H, alquilo inferior,-(CH2)narilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), -(CH2)nheteroarilol (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o dos R8 tornados juntos pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con X1 y Z1 o X2 y Z1, anillo que puede incluir uno o mas carbonilos;

p representa, independientemente para cada aparicion, un numero entero de 0 a 10, preferentemente de 0 a 3; y

n, individualmente para cada aparicion, representa un numero entero de 0 a 10, preferentemente de 0 a 5.

En algunos casos R1 representa un grupo heteroarilo sustituido o no sustituido.

En ciertos casos, X1 y X2 se pueden escoger entre -N(R8)-, -0-, -S-, un enlace directo y un heterociclo, Y1 e Y2 se pueden escoger entre -C(=0)-, -C(=S)- y -S(02)-, y Z1 o Z2 se pueden escoger entre -N(R8)-, -0-, -S-, un enlace directo y un heterociclo.

En ciertos casos relacionados X1-Y1-Z1 o X2-Y2-Z2 en conjunto representan una urea (N-C(O)-N) o una amida (N-C(O) o C (O)-N).

En ciertos casos X1 o X2 representan un diazacarbociclo, tal como una piperazina.

En algunos casos R1 representa un sistema de cicloalquil-arilo o cicloalquil-heteroarilo condensado, por ejemplo:

imagen57

en el que W es un anillo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido condensado al anillo de cicloalquilo y m es un numero entero desde 1 hasta 4, incluidos, por ejemplo, 1-3, o 1-2. El sistema de condensado puede estar ligado a L desde cualquier carbono del sistema condensado, incluyendo la posicion mostrada con anterioridad. En algunos casos R1 puede representar un grupo tetrahidronaftilo, y preferentemente Y1-X 1-LR 1 tornados juntos representan un grupo tetrahidronaftilo amida, tal como:

O

imagen58

En los casos en los que Y1 y Z1 estan ausentes y X1 comprende una pirimidona, los compuestos utiles en la presente invencion se pueden representar por medio de la formula general (XVI);

o

imagen59

imagen60

r2

Formula XVI

en la que, cuando la Valencia y la estabilidad lo permiten,

R1 y R2, independientemente para cada aparicion, representan H, alquilo inferior, - -(CH2)narilo (por ejemplo, 5 sustituido o no sustituido), o -(CH2)nheteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido);

L, independientemente de cada aparicion, esta ausente o representa -(CH2)n-alquilo, -alquenil-, -alquinil-, -(CH2)nalquenil, -(CH2)nalquinil-, -(CH2)nO(CH2)p-, -(CH2)nNR2(CH2)p-, -(CH2)nS(CH2)p-,

-(CH2)nalquenil(CH2)p-, (CH2)nalquinil(CH2)p-, -0(CH2)n-, -NR2(CH2)n-, o -S(CH2)n-;

X puede escogerse entre -N(R8)-, -0-, -S-, -Se-, -N=N-, -ON=CH-, -(R8)N- N(R8)-, -ON(R8)-, un heterociclo, o un 10 enlace directo entre L e Y;

Y puede escogerse entre -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=0)(0R2)-, un grupo heteroaromatico, o un enlace directo entre X y Z;

Z puede escogerse entre -N(R8)-, -0-, -S-, -Se-, -N=N-, -ON=CH-, -R8N- NR8-, -ONR8-, un heterociclo, o un enlace directo entre Y y L;

15 R8, independientemente para cada aparicion, representa H, alquilo inferior,-(CH2)narilo (por ejemplo, sustituido o no

sustituido), -(CH2)nheteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o dos R8 tornados juntos pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con X y Z, anillo que puede incluir uno o mas carbonilos;

W representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido condensado al anillo de pirimidona;

p representa, independientemente para cada aparicion, un numero entero de 0 a 10, preferentemente de 0 a 3; y

20 n, individualmente para cada aparicion, representa un numero entero de 0 a 10, preferentemente de 0 a 5.

En los casos en los que Y1 y Z1 estan ausentes y X1 comprende una pirimidona, los compuestos utiles en la presente invencion se pueden representar por medio de la formula general (XVII):

5

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20

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35

O

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Formula XVII

en la que, cuando la Valencia y la estabilidad lo permiten,

R1 y R2, independientemente para cada aparicion, representan H, alquilo inferior, arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), aralquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo, -(CH2)narilo), o heteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido) o heteroaralquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo, -(CH2)n heteroaralquil-);

L, independientemente para cada aparicion, esta ausente o representa -(CH2)n-alquilo, -alquenil-, -alquinil-, -(CH2)nalquenii-, -(CH2)nalquinil-, -(CH2)nO(CH2)p-, -(CH2)nNR2(CH2)p-, -(CH2)nS(CH2)p-,

-(CH2)nalquenil(CH2)p-, (CH2)nalquinil(CH2)p-, -0(CH2)n-, -NR2(CH2)n-, o -S(CH2)n- que puede estar

opcionalmente sustituidos con un grupo seleccionado entre H, alquilo inferior sustituido o no sustituido, alquenilo, o alquinilo, cicloalquilalqutlo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo, -(CH2)ncicloalquilo), (por ejemplo, sustituido o no sustituido), arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), aralquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo. (CH2)narilo), o heteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o heteroaralquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo, (CH2)nheteroaralquil), preferentemente de H, alquilo inferior, (CH2)narilol (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o (CH2)nheteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido);

X puede escogerse entre -N(R8)-, -0-, -S-, -Se-, -N=N-, -ON=CH-, -(R8)N-N(R8)-, -ON(R8)-, un heterociclo o un enlace directo entre L e Y;

Y puede escogerse entre -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, - P(=0)(0R2)-, un grupo heteroaromatico un enlace directo entre X y Z;

Z puede escogerse entre -N(R8)-, -0-, -S-, -Se-, -N=N-. -ON=CH-, -R8N- NR8-, -ONR8-, un heterociclo, o un enlace directo entre Y y L;

R8, independientemente para cada aparicion, representa H, alquilo inferior, arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), aralquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo, -(CH2)narilo), o heteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o heteroaralquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido, por ejemplo, -(CH2)nheteroaralquil-), o dos R8 tornados juntos pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con X y Z, anillo que puede incluir uno o mas carbonilos;

W representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido condensado al anillo de pirimidona;

p representa, independientemente para cada aparicion, un numero entero de 0 a 10, preferentemente de 0 a 3; y

n, individualmente para cada aparicion, representa un numero entero de 0 a 10, preferentemente de 0 a 5.

En algunos casos R1 representa un grupo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido, por ejemplo, un anillo fenilo, un anillo piridina, etc. En ciertos casos en los que -LR1 representa un grupo arilo o heteroarilo sustituido, R1 no esta preferentemente sustituido con un grupo isopropoxi(Me2CHO-). En ciertos casos en los que -LR1 representa un grupo arilo o heteroarilo sustituido, R1 no esta preferentemente sustituido con un grupo eter. En ciertos casos los sustituyentes sobre R1 (por ejemplo, distintos de hidrogeno) se escogen entre halogeno, ciano, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, hidroxilo, (alquil-O- no ramificado), sililoxi, amino, nitro, tiol, amino, imino , amido, fosforilo, fosfonato, fosfina, carbonilo, carboxilo, carboxamida, anhidrido, sililo, tioeter, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, sulfoxido, selenoeter, cetona, aldehido, ester o -(CH2)m-R8-. En ciertos modos de realization, los sustituyentes que no son hidrogeno se

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escogen entre halogeno, ciano, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, nitro, tiol, imino, amido, carbonilo, carboxilo, anhidrido, tioeter, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, cetona, aldehido y ester. En ciertos casos los sustituyentes que no son hidrogeno se escogen entre halogeno, ciano, alquilo, alquenilo, alquinilo, nitro, amido, carboxilo, anhidrido, alquilsulfonilo, cetona, aldehido y ester.

En ciertos casos x puede escogerse entre -N(R8)-, -0-, -S-, un enlace directo y un heterociclo, Y puede escogerse entre -C(=0)-, -C(= S)- y - -S(02)- y Z puede escogerse entre -N(R8)-, -0-, -S-, un enlace directo y un heterociclo. En ciertas casos al menos uno de Z y X esta presente.

En ciertos casos relacionados X-Y-Z tornados juntos representan una urea (NC(O)N) o una amida (NC(O) o C(O)N). En algunos casos W es un anillo de benceno sustituido o no sustituido.

En ciertos casos X representa un diazacarbociclo, tal como una piperazina, por ejemplo, sustituido o no sustituido.

En ciertos casos X puede escogerse entre -N(R8)-, -0-, -S- y un enlace directo, Y se puede escogerse entre -C(=0)-, -C(=S)- y -S(02)- y Z puede escogerse entre-N(R8)-, -0-, -S- y un enlace directo, de tal manera que al menos uno de X y Z esta presente.

En ciertos casos R8 representa H, alquilo inferior, aralquilo, heteroaralquilo, arilo, o heteroarilo, por ejemplo, H o alquilo inferior.

En ciertos casos X representa -NH-.

En ciertos casos -LX- representa -(alquilo inferior no ramificado )-NH-, por ejemplo. -CH2-NH-, -CH2CH 2-NH-, etc.

En ciertos casos, los presentes antagonistas se pueden elegir sobre la base de su selectividad por la ruta de hedgehog. Esta selectividad puede ser para la ruta de hedgehog frente a otras rutas, o para la selectividad entre rutas de hedgehog particulars, por ejemplo, ptc-1 ,ptc-2. etc.

En ciertos casos preferidos los inhibidores en cuestion inhiben la transduccion de senales mediadas por hedgehog- con un ED50 de 1 mM o menos, mas preferentemente de 1 pM o menos, e incluso mas preferentemente de 1 nM o menos.

En casos particulars se escoge la molecula pequena para su uso, ya que es mas selectiva para una isoforma de patched con respecto a la siguiente por ejemplo, 10 veces, y mas preferentemente al menos 100 o incluso 1000 veces mas selectiva para una ruta de patched (ptc-1, ptc- 2) con respecto a otra.

En ciertos casos se escoge un compuesto que es un antagonista de la ruta de hedgehog para provocar la antagonizacion selectiva de la actividad de hedgehog sobre proteina quinasas distintas de PKA, tales como PKC, por ejemplo, el compuesto modula la actividad de la ruta de hedgehog al menos un orden de magnitud mas intenso que lo que modula la actividad de otra proteina quinasa, preferentemente al menos dos ordenes de magnitud mas intensos, incluso mas preferentemente al menos tres ordenes de magnitud mas intensos. Asi, por ejemplo, un inhibidor preferido de la ruta de hedgehog puede inhibir la actividad de hedgehog con un Ki de al menos un orden de magnitud menor que su Ki para la inhibicion de PKC, preferentemente al menos dos ordenes de magnitud menor, incluso mas preferentemente al menos tres ordenes de magnitud menor. En ciertos modos de realizacion, la Ki para la inhibicion de PKA es de menor de 10 nM, preferentemente menor de 1 nM, incluso mas preferentemente menor de 0,1 nM.

En algunos casos, los compuestos utiles de la presente invencion puede representarse por la formula general (IV):

en la que, cuando la Valencia y la estabilidad lo permiten,

R1 y R2, independientemente para cada aparicion, representan H, alquilo inferior sustituido o no sustituido, alquenilo, o alquinilo, -(CH2)ncicloalquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), -(CH2)narilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o (CH2)nheterociclilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido);

imagen62

imagen63

R,

Y-----Z

Formula XVIII

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X y Z, independientemente, se pueden escoger entre -CH-,-N(R8)-, -0-, -S-, o -Se-;

Y puede escogerse entre -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, o - P(=0)(0R2)-;

R8, independientemente para cada aparicion, representa H, alquilo inferior sustituido o no sustituido, -(CH2)ncicloalquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), -(CH2)narilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), -(CH2)nheterociclilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido) o dos R8 tornados juntos pueden formar un anillo de 4- a 8 miembros, por ejemplo, con X1 y Z1 o X2 y Z1, pudiendo incluir el anillo uno o mas carbonilos;

R3 y R4, representan, independientemente, de 1-4 sustituyentes en el anillo al que estbn unidos, y se escogen entre, independientemente para cada aparicion, hidrogeno, halogenos, alquilos, alquenilos, alquinilos, arilos, hidroxilo, =0, =S, alcoxilo, sililoxi, amino, nitro, tiol, aminas, iminas, amidas, fosforilos, fosfonatos, fosfinas, carbonilos, carboxilos, carboxamidas, anhidridos, sililos, eteres, tioeteres, alquilsulfonilos, arilsulfonilos, selenoeteres, cetonas, aldehidos, esteres o -(CH2)m-R8;

p representa, independientemente para cada aparicion, un numero entero de 0 a 10, preferentemente de 0 a 3; y

n, individualmente para cada aparicion, representa un numero entero de 0 a 10, preferentemente de 0 a 5.

En algunos casos R1 y R2 se escogen independientemente entre arilo sustituido o no sustituido, heterociclilo, alquilo ramificado o no ramificado o cicloalquilo. En modos de realizacion en las que R1 o R2 es arilo o heterociclilo, los sustituyentes se escogen preferentemente entre H, alquilo, acilo, carboxi, bster, amida, ciano, eter, tioeter, amino, halogeno, nitro y trihalometilo.

En ciertos casos R3 esta ausente o representa uno o dos sustituyentes escogidos entre alquilo, acilo, carboxi, bster, amida, ciano, eter, tioeter, amino, acilo, halogeno, nitro, y trihalometilo.

En ciertos casos, R4 esta ausente o representa uno o dos sustituyentes escogidos entre eter, amino, tiobter, alquilo, arilo, (= O) o carbonilo (por ejemplo, carboxi, ester, cetona, aldehido, etc.).

En ciertos casos L esta ausente para cada aparicion, o representa -CH2- o -CH2CH2-.

En ciertos casos X representa NR8. R8 representa preferentemente H_

En ciertos casos Z representa NR8. R8 representa preferentemente H.

En ciertos casos Y representa -C(=0)-, -C(=S) o S(02)-.

Compuestos a modo de ejemplo parte 4:

Como se describe con mas detalle a continuacion, se contempla que los procedimientos en cuestion pueden llevarse a cabo usando una variedad de diferentes moleculas pequehas que pueden identificarse facilmente, por ejemplo, por medio de ensayos de deteccion de farmacos como se describe en el presente documento. Por ejemplo, los compuestos utiles en los procedimientos en cuestion incluyen compuestos que se pueden representar por la formula general (XVIII):

Y

imagen64

LR,

Formula XVIII

en la que, cuando la Valencia y la estabilidad lo permiten,

R1, R2, R3, y R4, independientemente para cada aparicion, representan H, alquilo inferior, (CH2)narilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido) o (CH2)nheteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido);

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X y D, independientemente, pueden escogerse entre -N(R8)-, -0-, -S-, -(R8)N- N(R8)-, -ON(R8)-,o un enlace directo; Y y Z, independientemente, pueden escogerse entre O o S;

E representa O, S, o NR5, en el que R5 representa LR8 o -(C=0)LR8.

R8, independientemente para cada aparicion, representa H, alquilo inferior, -(CH2)narilo (porejemplo, sustituido o no sustituido), -(CH2)n heteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), o dos R8 tornados juntos pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros;

p representa, independientemente para cada aparicion, un numero entero de 0 a 10, preferentemente de 0 a 3; n, individualmente para cada aparicion, representa un numero entero de 0 a 10, preferentemente de 0 a 5; y q y r representan, independientemente para cada aparicion, un numero entero de 0-2.

En ciertos casos D no representa alquilo inferior-N. En ciertos modos de realization, D representa un amina con sustitucion de aralquilo o heteroaralquilo.

En ciertos casos R1 representa un grupo alquilo inferior, tal como un alquilo ramificado, cicloalquilo o cicloalquilalquilo, por ejemplo, ciclopropilo, ciclopropilmetilo, neopentilo, ciclobutilo, isobutilo, isopropilo, sec-butilo, ciclobutilmetilo, etc.

En ciertos casos Y y Z son O.

En ciertos casos, la suma de q y r es menor que 4, por ejemplo, es 2 o 3.

En ciertos casos XLR4, en conjunto, incluye una amina ciclica, tal como una piperazina, morfolina, piperidina, pirrolidina, etc.

En ciertos casos, al menos uno de R1, R2 y R3 incluye un grupo arilo o heteroarilo. En ciertos casos relacionados al menos dos de R1, R2 y R3 incluyen un grupo arilo o heteroarilo. En ciertos casos R1 es alquilo inferior.

En ciertos casos L unido a R1 representa O, S, o NR8, tal como NH.

En ciertos casos E es NR8. En ciertos casos E representa una amina con sustitucion de aralquilo o heteroaralquilo, por ejemplo, incluyendo R8 policiclico.

En algunos casos x no es NH. En ciertos casos x esta incluido en un anillo, o, tornado junto con -C(=Y)-, representa una amida terciaria.

En algunos casos los compuestos utiles en la presente divulgation se pueden representar por la formula general

(XIX):

Y

imagen65

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LR,

Formula XIX

en la que, cuando la Valencia y la estabilidad lo permiten,

R1, R2, R3, R4, R8, L, X, Y, Z, n, p, q y r son como se definen anteriormente;

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30

s representa, independientemente para cada aparicion, un numero entero de 0-2.

En ciertos casos Y y Z son 0.

En ciertos casos R1 representa un grupo alquilo inferior, tal como un alquilo ramificado, cictoalquilo o cicloalquilalquilo, por ejemplo, ciclopropilo, ciclopropiimetilo, neopentilo, ciclobutilo, isobutilo, isopropilo, sec-butilo, ciclobutilmetilo, etc.

En ciertos casos, la suma de q, r, y s es menor de 5, por ejemplo, es 2, 3, o 4.

En ciertos casos XLR4, en conjunto, incluye una amina ciclica, tal como una piperazina, morfolina, piperidina, pirrolidina, etc.

En ciertos casos L unido a R1 representa O, S. o NR8, tal como NH.

En ciertos casos, al menos uno de R1, R2 y R3 incluye un grupo arilo o heteroarilo. En ciertos modos de realizacion relacionados, al menos dos de R1, R2 y R3 incluyen un grupo arilo o heteroarilo.

En ciertos casos M esta ausente.

En ciertos casos X no es NH. En ciertos modos de realizacion, X esta incluido en un anillo, o, tornado junto con -C(=Y)-, representa una amida terciaria.

En algunos casos los compuestos uliles en la presente invencion puede representarse por la formula general (XX):

imagen67

en la que, cuando la Valencia y la estabilidad lo permiten,

R1, R2, R3, R4, R8, L, M, X, Y, Z, n, p, q, y r son como se definio anteriormente.

En ciertos casos Y y Z son O.

En ciertos casos R1 representa un grupo alquilo inferior, preferentemente un alquilo ramificado, cicloalquilo o cicloalquilalquilo, por ejemplo, ciclopropilo, ciclopropiimetilo, neopentilo, ciclobutilo, isobutilo, isopropilo, sec-butilo, ciclobutilmetilo, etc.

En ciertos casos, la suma de q y r es menor que 4, por ejemplo, es 2 o 3.

En ciertos casos XLR4, en conjunto, incluye una amina ciclica, tal como una piperazina, morfolina, piperidina, pirrolidina, etc.

En ciertos casos, al menos uno de R1, R2 y R3 incluye un grupo arilo o heteroarilo. En ciertos casos relacionados al menos dos de R1, R2 y R3 incluyen un grupo arilo o heteroarilo. En ciertos casos R1 es alquilo inferior.

En ciertos casos L unido a R1 representa O, S, o NR8, tal como NH.

En ciertos casos M esta ausente.

En ciertos casos X no es NH. En ciertos casos X est£ incluido en un anillo, o, tornado junto con -C(=Y)-, representa una amida terciaria.

En algunos casos los compuestos utiles en la presente invencion se pueden representar por la formula general (XXI):

5

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20

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R4LX

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en la que, cuando la Valencia y la estabilidad lo permiten,

en la que R1, R2, R3, R4 y R8, L,M, X,nyp como se ha definido anteriormente.

En ciertos casos XLR4, en conjunto, incluye una amina ciclica, tal como una piperazina, morfolina, piperidina, pirrolidina. etc.

En ciertos casos R1 representa un grupo alquilo inferior, preferentemente un alquilo ramificado, cicloalquilo o cicloalquilalquilo, por ejemplo, ciclopropilo, ciclopropilmetilo, neopentilo, ciclobutilo, isobutilo, isopropilo, sec-butilo, ciclobutilmetilo, etc.

En ciertos casos, al menos uno de R1, R2 y R3 incluye un grupo arilo o heteroarilo. En ciertos casos relacionados al menos dos de R1, R2 y R3 incluyen un grupo arilo o heteroarilo. En ciertos casos R1 es alquilo inferior.

En ciertos casos L unido a R1 representa O, S, o NR8, tal como NH.

En ciertos casos M esta ausente.

En ciertos casos X no es NH. En ciertos casos X esta incluido en un anillo, o, tornado junto con -C(=Y)-, representa una amida terciaria.

En ciertos casos L representa un enlace directo para todas las apariciones.

En algunos casos los compuestos utiles en la presente invencion se pueden representar por la formula general (XXII):

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r7 VRS

Formula XXII

en la que, cuando la Valencia y la estabilidad lo permiten,

Y, n, p, q, y r son como se definen anteriormente;

Z' representa -C(=0)-, -C(=S)-, -C(=NH)-, SO 2, o SO, preferentemente -C(=0)-, -C(=S)-;

V esta ausente o representa 0, S, o NR8;

G esta ausente o representa -C(=0)- o -S02-;

J, independientemente para cada aparicion, representa H o alquilo inferior sustituido o no sustituido o alquileno, tal como metilo, etilo, metileno, etileno, etc., ligado a NC(=Y), de manera que ambas apariciones de N adyacente a J estan vinculadas a traves de al menos una aparicion de J, y

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una aparicion de J, tomadas junto a una aparicion de R 9, forman un anillo de 5 a 7 miembros, anillo que incluye una o dos apariciones de N;

R5 representa alquilo sustituido o no sustituido (por ejemplo, ramificado o no ramificado), alquenilo (por ejemplo, ramificado o no ramificado), alquinilo (por ejemplo, ramificado o no ramificado), cicloalquilo, o cicloalquilalquilo;

R6 representa arilo sustituido o no sustituido, aralquilo, heteroarilo, heteroaralquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, cicloalquilo o cicloalquilalquilo, incluyendo grupos policiclicos; y

R7 representa arilo sustituido o no sustituido, aralquilo, heteroarilo o heteroaralquilo.

En ciertos casos Y es O. En ciertos casos 2’ representa S02, -C(=0)- o -C(= )-.

En ciertos casos, la suma de q y r es menor que 4.

En ciertos casos NJ2N, tornado en conjunto, representa una diamina ciclica, tal como una piperazina, etc., que puede estar sustituida o no sustituida, por ejemplo, con uno o mas sustituyentes tales como oxo, alquilo inferior, eter de alquilo inferior, etc. En ciertos otros modos de realizacion, NJ2 o NJR9 tornados en conjunto representan un anillo heterociclico sustituido o no sustituido al que esta unido la otra aparicion de N. En ciertos modos de realizacidn, una o ambas apariciones de J estan sustituidas con uno o mas de alquilo inferior, eter de alquilo inferior, tioeter de alquilo inferior, amido, oxo, etc. En ciertos modos de realizacion, un anillo heterociclico que comprende una aparicion de J tiene de 5 a 8 miembros.

En ciertos casos R5 representa un alquilo ramificado, cicloalquilo, o cicloalquilalquilo.

En ciertos casos, R6 incluye al menos un anillo heterociclico, tal como un tiofeno, furano, oxazol, benzodioxano, benzodioxol, pirrol, indol, etc.

En algunos casos R7 representa un alquil fenilo, tal como un grupo bencilo, opcionalmente sustituido con halogeno, hidroxilo, alquilo inferior, nitro, ciano, eter de alquilo inferior (por ejemplo, opcionalmente sustituido, tal como CHF2CF20), o tioeter de alquilo inferior (por ejemplo, opcionalmente sustituido, tal como CF3S).

En algunos casos R8 cuando se produce en V. representa H o alquilo inferior, preferentemente H.

En algunos casos los compuestos utiles en la presente invencion se pueden representar por la formula general (XXIII):

imagen71

en la que, cuando la Valencia y la estabilidad lo permiten,

R5, R6, R7, R8, R9, R10, G, J, V, Y. Z\ n y p son como se define anteriormente.

En ciertos casos Y es O. En ciertos modos de realizacion, Z' representa S02, -C(=0)-, o -C(=S)-.

En ciertos casos NJ2N, tornado en conjunto, representa un anillo heterociclico, tal como una piperazina, etc., que puede estar sustituido o no sustituido, por ejemplo, con uno o mas sustituyentes tales como oxo, alquilo inferior, eter de alquilo inferior, etc. En ciertos otros modos de realizacion, NJ2 o NJR9 tornados en conjunto representan un anillo heterociclico sustituido o no sustituido al que esta unido la otra aparicion de N. En algunos casos, una o dos apariciones de J estan sustituidas con uno o mas de alquilo inferior, eter de alquilo inferior, tioeter de alquilo inferior, amido, oxo, etc. En ciertos modos de realizacion, un anillo heterociclico que comprende una aparicion de J tiene de 5 a 8 miembros.

En ciertos casos R5 representa un alquilo ramificado, cicloalquilo, o cicloalquilalquilo.

En ciertos casos, R6 incluye al menos un anillo heterociclico, tal como un tiofeno, furano, oxazol, benzodioxano, benzodioxol, pirrol, indol, etc.

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En algunos casos R7 representa un alquil fenilo, tal como un grupo bencilo, opcionalmente sustituido con halogeno, hidroxilo, alquilo inferior, nitro, ciano, eter de alquilo inferior (por ejemplo, opcionalmente sustituido, tal como CHF2CF20), o tioeter de alquilo inferior (por ejemplo, opcionalmente sustituido, tal como CF3S).

En algunos casos R8, cuando se produce en V, representa H o alquilo inferior, preferentemente H.

Compuestos a modo de ejemplo parte 5:

Como se describe con mas detalle a continuacion, se contempla que los procedimientos en cuestion pueden llevarse a cabo usando una variedad de diferentes moleculas pequerias que pueden identificarse facilmente, por ejemplo, por medio de ensayos de deteccion de farmacos como se describe en el presente documento. Por ejemplo, los compuestos utiles en los procedimientos en cuestion incluyen compuestos que se pueden representar por la formula general (XXIV):

imagen72

Z—J

\

Ri

Formula XXIV

en la que, cuando la Valencia y la estabilidad lo permiten,

X y Z, independientemente, representan -N(R7)-, -0-, -S-, -(R7)N-N(R7)-, -ON(R7)- o un enlace directo, preferentemente -N(R7)-, -0-, -S- o un enlace directo;

Y representa -C(=0)-, -C(=S)-,-C(=NR7)-, S02 o SO, preferentemente -C(=0)-, S02 o -C(=S)-;

A representa O, S o NR7, preferentemente O o NH, y lo mas preferentemente NH;

G representa un cicloalquilo, heterociclilo, arilo o anillo heteroarilo condensado al anillo al que esta unido, preferentemente un anillo arilo o heteroarilo.

Ar representa un anillo arilo o heteroarilo sustituido o no sustituido, tal como un anillo fenilo sustituido o no sustituido;

R1 representa H o alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo o cicloalquilo, incluyendo grupos policiclicos;

R2 representa de 0 a 4 sustituyentes en el anillo al que esta unido, tales como halogeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, grupo carbonilo (por ejemplo, ester, carboxilo o formilo), tiocarbonilo (por ejemplo, tioester, tiocarboxilato o tioformiato), cetona, aldehido, amino, acilamino, amido, amidino, ciano, nitro, azido, sulfonilo, sulfoxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, J-R8, J-OH, J-alquilo inferior, J-alquenilo inferior, J-R8, J-SH, J-NH2, formas protegidas de los anteriores o dos R2 cualesquiera, cuando aparecen mas de una vez en una estructura ciclica o policiclica, se pueden tomar conjuntamente formando un cicloalquilo, arilo o heteroarilo de 4 a 8 miembros;

R7, independientemente para cada aparicion, representa H, alquilo inferior (por ejemplo, sustituido o no sustituido), J-cicloalquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), J-heterociclilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), J-arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), J-heteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido);

R8, independientemente para cada aparicion, representa H, alquilo inferior (por ejemplo, sustituido o no sustituido), cicloalquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), heterociclilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido) o heteroarilo (por ejemplo. sustituido o no sustituido); y

J representa, independientemente para cada aparicion, una cadena que tiene 0-8 (preferentemente 0-4) unidades seleccionadas de CK2, NK, O y S, en el que K representa, independientemente para cada aparicion, H o alquilo inferior.

En ciertos casos, al menos uno de Z y X no es un enlace directo. En ciertos casos, X-Y-Z incluye una amida, urea o sulfonamida. En ciertos modos de realizacion, X se selecciona de -N(R8)-, -0-, -S- y preferentemente representa NH.

En ciertos casos, R1 incluye un anillo arilo o heteroarilo, opcionalmente sustituido con 1-5 sustituyentes, tales como nitro, halogeno, ciano, alquilo inferior, acilamino (por ejemplo, R8-C(=0)NH-), alcoxi, alquilamino, un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociclilo, arilo o heteroarilo condensado al anillo arilo o heteroarilo.

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En ciertos casos, X y el anillo que comprende A estan dispuestos en Ar en una relacion meta (es decir, 1,3).

En ciertos casos, G representa un anillo fenilo o piperidina.

En ciertos casos, J esta ausente.

En ciertos casos, R2 representa de 1 a 4 sustituyentes seleccionados de halogeno, ciano, nitro, alcoxi, amino, acilamino (por ejemplo, R8-C(=0)NH-), un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociclilo, arilo o heteroarilo condensado a G, y alquilo inferior sustituido o no sustituido.

En ciertos casos, los compuestos utiles en la presente divulgation se pueden representar por la formula general (XXV):

imagen73

2-----J

\

R,

Formula XXV

en la que, cuando la Valencia y la estabilidad lo permiten,

X y Z, independientemente, representan -N(R7)-, -0-, -S-, -(R7)N-N(R7)-, -ON(R7)- o un enlace directo, preferentemente -N(R7)-, -0-, -S- o un enlace directo;

Y representa -C(=0)-, -C(=S)-,-C(=NR7)-, S02 o SO, preferentemente -C(=0)-, S02 o -C(=S)-;

A representa O, S o NR7, preferentemente O o NH, y lo mas preferentemente NH;

G representa un cicloalquilo, heterociclilo, arilo o anillo heteroarilo condensado al anillo al que esta unido, preferentemente un anillo arilo o heteroarilo.

R1 representa H o alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo o cicloalquilo, incluyendo grupos policiclicos;

R2 representa de 0 a 4 sustituyentes en el anillo al que esta unido, tales como halbgeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, grupo carbonilo (por ejemplo, ester, carboxilo o fonmilo), tiocarbonilo (por ejemplo, tioester, tiocarboxilato o tioformiato), cetona, aldehido, amino, acilamino, amido, amidino, ciano, nitro, azido, sulfonilo, sulfoxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, J-R8, J-OH, J-alquilo inferior, J-alquenilo inferior, J-R8, J-SH, J-NH2, formas protegidas de los anteriores o dos R2 cualesquiera, cuando aparecen mas de una vez en una estructura ciclica o policiclica, se pueden tomar conjuntamente formando un cicloalquilo, arilo o heteroarilo de 4 a 8 miembros;

R3 representa de 0 a 4 sustituyentes en el anillo al que esta unido, tales como halogeno, hidroxilo, alcoxi, amino, alquilamino, ciano, nitro, alquilo inferior sustituido o no sustituido y acilo, preferentemente halogeno o alquilo inferior sustituido o no sustituido;

R7, independientemente para cada aparicion, representa H, alquilo inferior (por ejemplo, sustituido o no sustituido), J-cicloalquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), J-heterociclilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), J-arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), J-heteroarilo (por ejemplo. sustituido o no sustituido);

R8, independientemente para cada aparicion, representa H, alquilo inferior (por ejemplo, sustituido o no sustituido), cicloalquilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), heterociclilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido), arilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido) o heteroarilo (por ejemplo, sustituido o no sustituido); y

J representa, independientemente para cada aparicion, una cadena que tiene 0-8 (preferentemente 0-4) unidades seleccionadas de CK2, NK, O y S, en el que K representa, independientemente para cada aparicion, H o alquilo inferior.

En ciertos casos, al menos uno de Z y X no es un enlace directo. En ciertos modos de realizacion, X-Y-Z incluye una amida, urea o sulfonamida. En ciertos modos de realizacion, X se selecciona de -N(R8)-, -O-, -S- y preferentemente representa NH.

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En ciertos casos, G represenla un anillo fenilo o piperidina.

En ciertos casos, J esta ausente.

En ciertos casos, R2 representa de 1 a 4 sustituyentes seleccionados de halogeno, ciano, nitro, alcoxi, amino, acilamino (por ejemplo, R8-C(=0)NH-), un cicloalquilo sustituido o no sustituido, heterociclilo, arilo o heteroarilo condensado a G, y alquilo inferior sustituido o no sustituido.

En ciertos casos, R3 incluye un sustituyente, tal como un alquilo sustituido o no sustituido o un halogeno, en una posicion para con respecto a X o al anillo que incluye A.

En ciertos casos, los presentes antagonistas se pueden elegir sobre la base de su selectividad por la ruta de hedgehog. Esta selectividad puede ser por la ruta de hedgehog frente a otras rutas, o la selectividad entre rutas de hedgehog particulars, por ejemplo, ptc1-, ptc-2, etc.

En ciertos casos preferentes, los presentes inhibidores inhiben la transduccion de senates mediada por la perdida de funcion de ptc, la ganancia de funcion de hedgehog o la ganancia de funcion de smoothened con una DE50 de 1 mM o menos, mas preferentemente de 1 pM o menos, e incluso mas preferentemente de 1 nM o menos. Del mismo modo, en ciertos modos de realizacion preferentes, los presentes inhibidores inhiben la actividad de la ruta de hedgehog con una Ki menor de 10 nM, preferentemente menor de 1 nM, incluso mas preferentemente menor de 0,1 nM.

En casos particulars, se elige la molecula pequena para su uso porque es mas selectiva por una isoforma de patched sobre siguiente, por ejemplo, 10 veces y mas preferentemente al menos de 100 o incluso 1000 veces mas selectiva por una ruta de patched (ptc-1, ptc-2) sobre otra.

En ciertos casos, se elige un compuesto que es un antagonista de la ruta de hedgehog para antagonizar selectivamente la actividad de hedgehog sobre proteina cinasas distintas de PKA, tales como PKC, por ejemplo, el compuesto modula la actividad de la ruta de hedgehog con al menos un orden de magnitud mas de potencia de lo que modula la actividad de otra proteina cinasa, preferentemente con al menos dos ordenes de magnitud mas de potencia, incluso mas preferentemente con al menos tres ordenes de magnitud mas de potencia. Por lo tanto, por ejemplo, un inhibidor preferente de la ruta de hedgehog puede inhibir la actividad de hedgehog con una Ki al menos un orden de magnitud inferior que su Ki para la inhibicion de PKC, preferentemente al menos dos ordenes de magnitud inferior, incluso mas preferentemente al menos tres ordenes de magnitud inferior. En ciertos modos de realizacion, la Ki para la inhibicion de PKA es menor de 10 nM, preferentemente menor de 1 nM, incluso mas preferentemente menor de 0,1 nM.

En ciertos casos preferentes, los antagonistas de hedgehog incluyen AY9944, triparanol, jervina, ciclopamina y tomatidina (vease la figura 1), compuesto A (vease la figura 2) y compuesto B (vease la figura 3).

Mutantes de hedgehog antagonistas;

Se anticipa que ciertas formas mutantes de una proteina hedgehog pueden actuar como antagonistas de hedgehog. Sin pretender quedar ligado a teoria particular alguna, es bien sabido que las formas mutantes de factores de sehalizacion de proteinas son capaces de unirse al receptor apropiado y sin embargo no son capaces de activar el receptor. Dichas proteinas mutantes actuan como antagonistas desplazando las proteinas naturates y bloqueando la activacion del receptor normal. Las proteinas hedgehog mutantes se pueden comportar de manera similar. De forma alternativa. las proteinas hedgehog alteradas se pueden unir directamente e inhibir las formas naturales de hedgehog y asi actuar como antagonistas. Hay muchos procedimientos bien conocidos para obtener mutantes con una actividad deseada.

Las formas antagonistas de hedgehog se pueden identificar usando un sistema de cribado sensible a hedgehog. Por ejemplo, una linea celular transfectada con una estructura de gen indicador gli-1-lacZ se podrla controlar en cuanto a la actividad beta-galactosidasa. Gli-1 es un gen indicador para la activacion de la ruta de serialization de hedgehog y los mutantes de hedgehog que inhiben la expresion del gen indicador dirigida por gli-1-serian antagonistas de hedgehog. Se puede usar cualquiera de varios genes indicadores, incluyendo luciferasa, proteina fluorescente verde (y variantes incluyendo amarillo, rojo, azul y dan), GUS y otras proteinas fluorescentes o cromogenicas.

Los procedimientos para generar grandes combinaciones de proteinas mutantes son bien conocidos en la tecnica. Se divulga en el presente documento el uso de polipeptidos hedgehog generados por mutagenesis combinatoria. Dichos procedimientos, como se sabe en la tecnica, son apropiados para generar mutantes tanto puntuafes como de truncamiento, y pueden ser especialmente utiles para identificar secuencias de variantes potenciales (por ejemplo, homologos) que sean funcionales en la union a un receptor de proteinas hedgehog. El proposito del cribado de dichas bibliotecas combinatorias es generar, por ejemplo, novedosos homologos de hedgehog que puedan actuar como

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agonistas o antagonistas. Para ilustrarlo, los homologos de hedgehog se pueden disehar por el presente procedimiento para proporcionar una union mas eficaz a un receptor afin, tal como patched, aunque conservando al menos una parte de una actividad asociada a hedgehog. Por lo tanto, se pueden generar homologos derivados de forma combinatoria para que tengan una potencia aumentada con respecto a una forma de origen natural de la proteina. Del mismo modo, los homologos de hedgehog se pueden generar por la presente estrategia combinatoria para que actuen como antagonistas, porque son capaces de imitar, por ejemplo, la union a otros componentes de la matriz extracelular (tales como receptores), aunque sin inducir respuesta biologica alguna, inhibiendo de este modo la accion de hedgehog autentico o agonistas de hedgehog. Ademas, la manipulacion de ciertos dominios de hedgehog por el presente procedimiento puede proporcionar dominios mas adecuados para su uso en proteinas de fusion, tal como uno que incorpore partes de otras proteinas que procedan de la matriz extracelular y/o que se unan a componentes de la matriz extracelular.

Para ilustrar adicionalmente el estado de la tecnica de mutagenesis combinatoria, cabe senalar que el articulo de recapitulacion de Gallop et al. (1994) J Med Chem 37: 1233 describe el estado general de la tecnica de bibliotecas combinatorias desde los primeros anos de la decada de 1990. En particular, Gallop et al. afirman en la pagina 1239 "el cribado de las bibliotecas de analogos contribuye a determinar el tamano minimo de la secuencia activa y a identificar los restos criticos para la union e intolerantes de sustitucion". Ademas, Ladner et al. publicacion PCT W090/02809, Goeddel et al. patente de EE. UU. 5.223.408 y Markland et al. publicacion PCT W092/15679 ilustran tecnicas especificas que un experto en la tecnica podria utilizar para generar bibliotecas de variantes de hedgehog que se pueden cribar rapidamente para identificar variantes/fragmentos que conservan una actividad particular de los polipeptidos hedgehog. Estas tecnicas son ejemplares de la tecnica y demuestran que se pueden generar grandes bibliotecas de variantes/truncamientos relacionados y someterlas a ensayo para aislar variantes particulars sin experimentacion excesiva. Gustin et al. (1993) Virology 193:653 y Bass et al. (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics 8: 309-314 tambien describen otras tecnicas ejemplares de la tecnica que se puede adaptar como medio para generar variantes mutagenicas de polipeptidos hedgehog.

De hecho, es evidente a partir de la tecnica de mutagenesis combinatoria que la mutagenesis a gran escala de proteinas hedgehog, sin ninguna idea preconcebida de los restos que sean criticos para la funcion biologica, puede generar amplias gamas de variantes que tienen actividad biologica equivalente. De hecho, es la capacidad de las tecnicas combinatorias de cribar miles de millones de variantes diferentes por an£lisis de alto rendimiento que elimina cualquier requisito de compresion o conocimiento previo de los restos criticos.

Para ilustrarlo, las secuencias de aminoacidos para una poblacion de homologos de hedgehog u otras proteinas relacionadas se alinean, preferentemente para promover la mayor homologia posible. Dicha poblacion de variantes puede incluir, por ejemplo, homologos de hedgehog de una o mas especies. Los aminoacidos que aparecen en cada posicion de las secuencias alineadas se seleccionan para crear un conjunto degenerado de secuencias combinatorias. En un caso preferente, la biblioteca diversificada de variantes de hedgehog se genera por mutagenesis combinatoria a nivel de acido nucleico, y se codifica por una genoteca diversificada. Por ejemplo, se puede ligar enzimaticamente una mezcla de oligonucleotidos sinteticos en secuencias genicas de tal manera que el conjunto degenerado de secuencias potenciales de hedgehog se pueda expresar como polipeptidos individuales o, de forma alternativa, como un conjunto de proteinas de fusion mas grandes (por ejemplo, para la presentacion en fagos) que contiene el conjunto de secuencias de hedgehog en su interior.

Como se ilustra en la publicacion PCT WO 95/18856, para analizar las secuencias de una poblacion de variantes, las secuencias de aminoacidos de interes se pueden alinear con respecto a la homologia de secuencia. La presencia o ausencia de aminoacidos de una secuencia alineada de una variante particular esta relacionada con la longitud consenso elegida de una secuencia de referencia, que puede ser real o artificial.

En un ejemplo ilustrativo, la alineacion de los exones 1, 2 y una parte de las secuencias codificadas por el exon 3 (por ejemplo, aproximadamente 221 restos N-terminales de la proteina madura) de cada uno de los clones de Shh produce un conjunto degenerado de polipeptidos Shh representados por la formula general:

C-G-P-G-R-G-X(1)-G-X(2)-R-R-H-P-K-K-L-T-P-L-A-Y-K-Q-F-l-P-N-V-A-E-K-T-L-G-A-S-G-R-Y-E-G-K-l-X(3)-R-N-S-E- R-F-K-E-L-T-P-N~Y-N-P-D-I-I-F-K-D-E-E-N-T-G-A-D-R-L-M-T-Q-R-C-K-D-K-L-N-X(4)-L-A-I-S-V-M-N-X(5)-W-P-G-V-X (6)-L-R-V-T-E-G-W-D~E-D-G-H-H-X(7)-E-E-S-L-H-Y-E-G-R-A-V-D-l-T-T-S-D-R-D-X(8)-S-K-Y-G-X(9)-L-X(10)-R-L-A- V-E-A-G-F-D-W-V-Y-Y-E-S-K-A-H-LH-C-S-V-K-A-E-N-S-V-A-A-K-S-G-G-C-F-P-G-S-A-X(11 )-V-X(12)-L-X(13)-X(14)- G-G-X(15)-K-X-(16)-V-K-D-L-X(17)-P-G-D-X(18)-V-L-A-A-D-X(19)-X(20)-G-X(21)-L-X(22)-X(23)-S-D-F-X(24)-X(25)-F -X(26)-D-R (SEQ ID NO: 21)

en la que cada una de las posiciones degeneradas "X" puede ser un aminoacido que se produce en esa posicion en uno de los clones de Shh de ser humano, raton, polio o pez cebra o, para ampliar la biblioteca, cada X tambien se puede seleccionar entre restos de aminoacido que serian sustituciones conservatives de los aminoacidos que aparecen de forma natural en cada una de esas posiciones. Por ejemplo, Xaa(1) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Phe, Tyr o Trp; Xaa(2) representa Arg, His o Lys, Xaa(3) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser o Thr; Xaa(4) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser o Thr; Xaa(5) representa Lys, Arg, His, Asn o Gin; Xaa(6) representa Lys, Arg o His; Xaa(7) representa Ser, Thr, Tyr, Trp o Phe; Xaa(8) representa Lys, Arg o His; Xaa(9) representa Met, Cys, Ser o Thr; Xaa(10) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser o Thr; Xaa(11) representa Leu, Val, Met, Thr o Ser; Xaa(12)

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representa His, Phe, Tyr, Ser, Thr, Met o Cys; Xaa(13) representa Gin, Asn, Glu, o Asp; Xaa(14) representa His, Phe, Tyr, Thr, Gin, Asn, Glu o Asp; Xaa(15) representa Gin, Asn, Glu, Asp, Thr, Ser, Met o Cys; Xaa(16) representa Ala, Gly, Cys, Leu, Val o Met; Xaa(17) representa Arg, Lys, Met, lie, Asn, Asp, Glu, Gin, Ser, Thr o Cys; Xaa(18) representa Arg, Lys, Met o lie; Xaa(19) representa Ala, Gly, Cys, Asp, Glu, Gin, Asn, Ser, Thr o Met; Xaa(20) representa Ala, Gly. Cys, Asp, Asn, Glu o Gin; Xaa(21) representa Arg, Lys, Met, He. Asn, Asp, Glu o Gin; Xaa(22) representa Leu, Val, Met o He; Xaa(23) representa Phe, Tyr, Thr, His o Trp; Xaa(24) representa He, Val, Leu o Met; Xaa(25) representa Met, Cys, lie, Leu, Val, Thr o Ser; Xaa(26) representa Leu, Val, Met, Thr o Ser. En una biblioteca incluso mas amplia, cada X se puede seleccionar de cualquier aminoacido.

De manera similar, la alineacion de cada uno de los clones de hedgehog de ser humano, raton, polio y pez cebra puede proporcionar una secuencia polipeptidica degenerada representada por la formula general:

C-G-P-G-R-G-X(l)-X(2)-X(3)-R-R-X(4)-X(5)-X(6)-P-K-X(7)-L-X(8)-P-L-X(9)-Y-K-Q-F-X(10)-P-X(11 )-X(12)-X(13)-E-X(1 4)-T-L-G-A-S-G-X(15)-X(16)-E-G-X(17)-X(18)-X(19)-R-X(20)-S-E-R-F-X(21)-X(22)-L-T-P-N-Y-N-P-D-l-l-F-K-D-E-E-N- X(23)-G-A-D-R-L-M-T-X(24)-R-C-K-X(25)-X(26)-X(27)-N-X(28)-L-A-l-S-V-M-N-X(29)-W-P-G-V-X(30)-L-R-V-T-E-G-X( 31)-D-E-D-G-H-H-X(32)-X(33)-X(34)-S-L-H-Y-E-G~R-A-X(35)-D-I-T-T-S-D-R-D-X(36)-X(37)-K-Y-G-X(38)-L-X(39)-R-L -A-V-E-A~G-F-D-W-V-Y-Y-E-S-X(40)-X(41)-H-X(42)-H-X(43)-S-V-K-X(44)-X(45) (SEQ ID NO: 22)

en la que, como anteriormente, cada una de las posiciones degeneradas "X" puede ser un aminoacido que se produce en una posicion correspondiente en uno de los clones naturales, y tambien puede incluir restos de aminoacido que serian sustituciones conservatives, o cada X puede ser cualquier resto de aminoacido. En un ejemplo Xaa(1) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Pro, Phe o Tyr; Xaa(2) representa Gly, Ala, Val, Leu o Me; Xaa(3) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Lys, His o Arg; Xaa(4) representa Lys, Arg o His; Xaa(5) representa Phe, Trp, Tyr o un hueco de amino acido; Xaa(6) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie o un hueco de amino acido; Xaa(7) representa Asn, Gin, His, Arg o Lys; Xaa(8) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser o Thr; Xaa(9) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser o Thr; Xaa(10) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser o Thr; Xaa(11) representa Ser, Thr, Gin o Asn; Xaa(12) representa Met, Cys, Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser o Thr; Xaa(13) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie o Pro; Xaa(14) representa Arg, His o Lys; Xaa(15) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Pro, Arg, His o Lys; Xaa(16) representa Gly, Ala, Val, Leu, He, Phe o Tyr; Xaa(17) representa Arg, His o Lys; Xaa(18) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser o Thr; Xaa(19) representa Thr o Ser; Xaa(20) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Asn o Gin; Xaa(21) representa Arg, His o Lys; Xaa(22) representa Asp o Glu; Xaa(23) representa Sero Thr; Xaa(24) representa Glu, Asp, Gin o Asn; Xaa(25) representa Glu o Asp; Xaa(26) representa Arg, His o Lys; Xaa(27) representa Gly, Ala, Val, Leu o lie; Xaa(28) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Thr o Ser; Xaa(29) representa Met, Cys, Gin, Asn, Arg, Lys o His; Xaa(30) representa Arg, His o Lys; Xaa(31) representa Trp, Phe, Tyr, Arg, His o Lys; Xaa(32) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser, Thr, Tyr o Phe; Xaa(33) representa Gin, Asn, Asp o Glu; Xaa(34) representa Asp o Glu; Xaa(35) representa Gly, Ala, Val, Leu o He; Xaa(36) representa Arg, His o Lys; Xaa(37) representa Asn, Gin, Thr o Ser; Xaa(38) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser, Thr, Met o Cys; Xaa(39) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Thr o Ser; Xaa(40) representa Arg, His o Lys; Xaa(41) representa Asn, Gin, Gly, Ala, Val, Leu o lie; Xaa(42) representa Gly, Ala, Val, Leu o lie; Xaa(43) representa Gly, Ala, Val, Leu, He, Ser, Thr o Cys, Xaa(44) representa Gly, Ala, Val, Leu, lie, Thr o Ser; y Xaa(45) representa Asp o Glu.

Hay muchas maneras por las que la biblioteca de homologos potenciales de hedgehog se puede generar a partir de una secuencia oligonucleotidica degenerada. La sintesis quimica de una secuencia genica degenerada se puede llevar a cabo en un sintetizador automatizado de ADN, y los genes sinteticos se pueden ligar despues en un vector de expresion apropiado. El proposito de un conjunto degenerado de genes es proporcionar, en una mezcla, todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias potenciales de hedgehog. La sintesis de oligonucleotidos degenerados es bien conocida en la tecnica (vease, por ejemplo, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier peg. 273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477. Dichas tecnicas se han empleado en la evolucion dirigida de otras proteinas (vease, por ejemplo, Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378-6382; asi como las patentes de EE. UU. n.° 5.223.409, 5.198.346 y 5.096.815).

Se conoce en la tecnica una amplia gama de tecnicas para cribar productos genicos de bibliotecas combinatorias preparadas por mutaciones puntuales, y para detectar en bibliotecas de ADNc productos genicos que tengan una cierta propiedad. Dichas tecnicas seran, en general, adaptables para el cribado rapido de genotecas generadas por mutagenesis combinatoria de homologos de hedgehog. Las tecnicas mas ampliamente usadas para cribar genotecas grandes comprenden tipicamente la clonacion de la genoteca en vectores de expresion replicables, la transformacion de celulas apropiadas con la biblioteca resultante de vectores y la expresion de los genes combinatorios en condiciones en las que la deteccion de una actividad deseada facilita el aislamiento relativamente sencillo del vector que codifica el gen cuyo producto se detecto. Cada uno de los ensayos ilustrativos descritos a continuacion es susceptible a analisis de alto rendimiento, segun sea necesario, para cribar grandes cantidades de secuencias degeneradas de hedgehog creadas por tecnicas de mutagenesis combinatoria.

En otro ensayo mas de cribado, los productos genicos de hedgehog candidatos se presentan en la superficie de una celula o particula virica, y la capacidad de las celulas o las particulas viricas particulares de asociarse con un resto de union a hedgehog (tal como la proteina patched u otro receptor de hedgehog) a traves de este producto genico se

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detecta en un "ensayo de paneo". Dichas etapas de paneo se pueden llevar a cabo sobre celulas cultivadas a parlir de embriones. Por ejemplo, la genoteca se puede clonar en el gen de una proteina de superficie de membrana de una celula bacteriana, y la proteina de fusion resultante se puede detectar por paneo (Ladner et al., documento WO 88/06630; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1371; y Goward et al. (1992) TIBS 18:136-140). De manera similar, se pueden usar moleculas marcadas con de forma fluorescente que se unen a hedgehog para marcar homologos de hedgehog potencialmente funcionales. Las celulas se pueden inspeccionar visualmente y se pueden separar bajo un microscopio de fluorescencia o, cuando la morfologia de la celula lo permita, se pueden separar por un clasificador de celulas activadas por fluorescencia.

En un modo de realizacion alternativo, la genoteca se expresa como una proteina de fusion sobre la superficie de una particula virica. Por ejemplo, en el sistema de fagos filamentosos, las secuencias peptidicas exogenas se pueden expresar sobre la superficie del fago infeccioso, confiriendo de esta manera dos beneficios significativos. En primer lugar, como estos fagos se pueden aplicar a matrices de afinidad a concentraciones muy altas, se puede cribar un gran numero de fagos al mismo tiempo. En segundo lugar, como cada fago infeccioso presenta el producto genico combinatorio en su superficie, si un fago particular se recupera de una matriz de afinidad con bajo rendimiento, el fago se puede amplificar por otra ronda de infeccion. El grupo de fagos filamentosos de E. coli M13, fd y f1 casi identicos son los mas frecuentemente usados en las bibliotecas de presentacion en fagos, ya que cualquiera de las proteinas de cubierta gill o gVIll del fago se puede usar para generar proteinas de fusion sin alterar el empaquetado final de la particula virica (Ladner et al. publicacion PCT WO 90/02909; Garrard et al., publicacion PCT WO 92/09690; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:16007-16010; Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; y Barbas et al. (1992) PNAS 89:4457-4461).

En un modo de realizacion ilustrativo, el sistema de anticuerpo en fago recombinante (RPAS, numero de cat£logo de Pharmacia 27-9400-01) se puede modificar facilmente para su uso en la expresion y cribado de bibliotecas combinatorias de hedgehog. Por ejemplo, el fagemido pCANTAB 5 del kit RPAS contiene el gen que codifica la proteina de cubierta gill del fago. La genoteca combinatoria de hedgehog s puede clonar en el fagemido adyacente a la secuencia serial de gill de tal manera que se exprese como una proteina de fusion a gill. Despues del ligamienlo, el fagemido se usa para transformer celulas TG1 competentes de E. coli. Las celulas transformadas posteriormente se infectan con el fago auxiliar M13K07 para rescatar el fagemido y su inserto genico de hedgehog candidato. El fago recombinante resultante contiene el ADN del fagemido que codifica un hedgehog candidato especifico y muestra una o mas copias de la proteina de cubierta de fusion correspondiente. Las proteinas hedgehog candidatas presentadas en fago que son capaces de unirse a un receptor de hedgehog se seleccionan o enriquecen por paneo. Por ejemplo, la biblioteca de fagos se puede aplicar a celulas que expresan la proteina patched y el fago no unido se retira de las celulas por lavado. Despues se aisla el fago unido, y si el fago recombinante expresa al menos una copia de la proteina de cubierta gill natural, conservara su capacidad de infectar E. coli. Por lo tanto, las rondas sucesivas de reinfeccion de E. coli y el paneo enriqueceran en gran medida los homologos de hedgehog, que luego se pueden cribar por otras actividades biologicas para diferenciar los agonistas y los antagonistas.

La mutagenesis combinatoria tiene el potencial de generar bibliotecas muy grandes de proteinas mutantes, por ejemplo, del orden de 1026 moleculas. Las bibliotecas combinatorias de este tamaho pueden ser tecnicamente dificiles de cribar incluso con ensayos de cribado ultrarrapido tales como presentacion en fagos. Para superar este problema, se ha desarrollado recientemente una nueva tbcnica, la mutagenesis reiterada de conjunto (REM), que permite evitar la proportion muy alta de proteinas no funcionales en una biblioteca aleatoria y simplemente potencia la frecuencia de proteinas funcionales, reduciendo, por lo tanto, la complejidad requerida para conseguir un muestreo util del espacio de secuencia. REM es un algoritmo que potencia la frecuencia de mutantes funcionales en la biblioteca cuando se emplea un procedimiento apropiado de selection o cribado (Arkin y Yourvan, 1992, PNAS USA 89: 7811-7815; Yourvan et al., 1992, Paralell Problem Solving from Nature, 2, en Maennery Manderick, eds., Elsevier Publishing Co., Amsterdam, pag. 401-410; Delgrave et al., 1993, Protein Engineering 6(3):327-331).

Anticuerpos antagonistas:

Se anticipa que los anticuerpos pueden actuar como antagonistas de hedgehog. Los anticuerpos pueden tener afinidad y especificidad extraordinarias por epitopos particulares. Los anticuerpos que se unen a cualquier proteina en la ruta de serialization de hedgehog pueden tener la capacidad de actuar como antagonistas. Los anticuerpos que se unen a hedgehog, smoothened o gli-1 pueden actuar simplemente impidiendo estericamente las interacciones proteina-proteina apropiadas u ocupando sitios activos. Los anticuerpos que se unen a proteinas patched pueden actuar como antagonistas si provocan la hiperactivacion de la proteina patched, por ejemplo, estimulando la asociacion de patched con smoothened. Los anticuerpos suministrados de forma exogena se unen facilmente a proteinas con dominios extracelulares.

Los anticuerpos con actividad antagonista de hedgehog se pueden identificar en gran medida de la misma manera que otros antagonistas de hedgehog. Por ejemplo, se pueden administrar anticuerpos candidatos a celulas que expresan un gen indicador de hedgehog, y anticuerpos que provocan una expresion disminuida del gen indicador son antagonistas.

En una variation, los anticuerpos de la divulgation pueden ser anticuerpos de cadena sencilla (scFv), que comprende dominios variables de union a antigeno unidos por un engarce polipeptidico. Los anticuerpos de cadena sencilla se

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expresan como una unica cadena polipeptidica y se pueden expresar en bacterias y como parte de una biblioteca de presentation en fagos. De esta manera, los fagos que expresan los scFv apropiados tendran actividad antagonista de hedgehog. El acido nucleico que codifica el anticuerpo de cadena sencilla luego se puede recuperar del fago y se puede usar para producir grandes cantidades de scFv. La construccion y el cribado de bibliotecas de scFv se describen ampliamente en diversas publicaciones (patentes de EE. UU. 5.258.498; 5.482.858; 5.091.513; 4.946.778; 5.969.108; 5.871.907; 5.223.409; 5.225.539),

Tecnicas antisentido, de ribozimas y triple helice:

Otro aspecto de la divulgacion se refiere al uso del acido nucleico aislado en tratamiento '‘antisentido". Como se usa en el presente documento, tratamiento "antisentido" se refiere a la administracion o la generacion in situ de moleculas oligonucleotidicas o sus derivados que hibridan especificamente (por ejemplo, se unene) en condiciones celulares, con el ARNm celular y/o el ADN genomico que codifica una o mas proteinas de la presente ruta de hedgehog con el fin de inhibir la expresion de esa proteina, por ejemplo, inhibiendo la transcripcion y/o la traduccion. La union puede ser por complementariedad de pares de bases convencionales o, por ejemplo, en el caso de union a ADN bicatenarios, a traves de interacciones especificas en el surco mayor de la doble helice. En general, tratamiento "antisentido" se refiere a la gama de tecnicas empleadas, en general, en la tecnica, e incluye cualquier tratamiento que se este basado en la union especifica a secuencias oligonucleotidicas.

Una construccion antisentido de la presente divulgacion se puede administrar, por ejemplo, como un plasmido de expresion que, cuando se transcribe en la celula, produce ARN que es complementario a al menos una parte unica del ARNm celular que codifica una proteina de serialization de hedgehog. De forma alternativa, la construccion antisentido es una sonda oligonucleotidica que se genera ex vivo y que, cuando se introduce en la celula provoca la inhibicion de la expresion hibridando con el ARNm y/o las secuencias genomicas de un gen de senalizacion de hedgehog. Tales sondas oligonucleotidicas son preferentemente oligonucleotidos modificados que son resistentes a nucleasas endogenas, por ejemplo, exonucleasas y/o endonucleasas y, por lo tanto, son estables in vivo. Las moleculas de acido nucleico ejemplares para su uso como oligonucleotidos antisentido son analogos fosforamidato, fosfotioato y metilfosfonato de ADN (veanse tambien las patentes de EE. UU. 5.176.996; 5.264.564 y 5.256.775). Adicionalmente, se han revisado las estrategias generales para construir oligomeros utiles en tratamiento antisentido, por ejemplo, por Van der Krol et al. (1988) BioTechniques 6:958-976; y Stein et al. (1988) Cancer Res 48:2659-2668. Con respecto al ADN antisentido, son preferentes oligodesoxirribonucleotidos derivados del sitio de inicio de la traduccion, por ejemplo, entre la regiones -10 y +10 de la secuencia de nucleotidos del gen de senalizacion hedgehog de interes.

Las estrategias antisentido implican el disefio de oligonucleotidos (de ADN o ARN) que son complementarios al ARNm que codifica una proteina de senalizacion hedgehog. Los oligonucleotidos antisentido se uniran a los transcritos de ARNm y evitaran la traduccion. Aunque es preferente la complementariedad absoluta, no se requiere. En el caso de acidos nucleicos antisentido bicatenarios, se puede someter a prueba una unica hebra del ADN bicatenario, o se puede someter a prueba la formation de triple helice. La capacidad de hibridar depende tanto del grado de complementariedad como de la longitud del acido nucleico antisentido. En general, cuanto mas largo es el acido nucleico de hibridacion, mas emparejamientos erroneos de bases con un ARN puede contener y aun formar un duplex estable (o triplex, como puede ser el caso). Un experto en la tecnica puede averiguar el grado tolerable de emparejamiento erroneo por el uso de procedimientos estandar para determinar el punto de fusion del complejo hibridado.

Los oligonucleotidos que son complementarios al extremo 5' del ARNm, por ejemplo, la secuencia no traducida 5‘ hasta e incluyendo el codon de inicio AUG, deben funcionar de la manera mas eficaz en la inhibicion de la traduccion. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que secuencias complementarias a las secuencias no traducidas 3' de ARNm tambien son eficaces en la inhibicion de la traduccion de los ARNm. (Wagner. R. 1994. Nature 372:333). Por lo tanto, los oligonucleotidos complementarios a cualquiera de las regiones no codificantes, no traducidas 5‘ o 3‘, de un gen se podrian usar en una estrategia antisentido para inhibir la traduccion de ese ARNm. Los oligonucleotidos complementarios a la region no traducida 5‘ del ARNm deben incluir el complemento del codon de inicio AUG. Los oligonucleotidos antisentido complementarios a regiones codificantes de ARNm son inhibidores menos eficaces de la traduccion, pero se podrian usar tambien de acuerdo con la divulgacion.

Sin importar si estan disenados para hibridar en la region 5‘, 3' o codificante del ARNm, los acidos nucleicos antisentido deben tener al menos seis nucleotidos de longitud y son preferentemente de menos de aproximadamente 100 y mas preferentemente de menos de aproximadamente 50, 25, 17 o 10 nucleotidos de longitud.

Independientemente de la election de la secuencia diana, lo preferente es que los estudios in vitro se lleven a cabo, en primer lugar, para cuantificar la capacidad del oligonucleotido antisentido de inhibir la expresion genica. Los preferente es que estos estudios utilicen controles que distinguen entre inhibicion de gen antisentido y efectos biologicos no especificos de los oligonucleotidos. Lo preferente es tambien que estos estudios comparen los niveles del ARN o proteina diana con los de un ARN o proteina de control interno. Adicionalmente, se preve que los resultados obtenidos usando el oligonucleotido antisentido se comparen con los obtenidos usando un oligonucleotido de control. Lo preferente es que el oligonucleotido de control sea de aproximadamente la misma longitud que el oligonucleotido de prueba y que la secuencia de nucleotidos del oligonucleotido difiera de la secuencia antisentido no

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mas de lo necesario para evitar la hibridacion especifica con la secuencia diana.

Los oligonucleotidos pueden ser ADN o ARN o mezclas quimericas o derivados o versiones modificadas de los mismos, monocatenarios o bicatenarios. El oligonucleotido se puede modificar en el resto de base, el resto de azucar o la cadena principal de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molecula, la hibridacion, etc. El oligonucleotido puede incluir otros grupos adjuntos tales como peptidos (por ejemplo, para dirigirse a receptores de celulas huesped) o agentes que facilitan el transporte a traves de la membrana celular (vease, por ejemplo, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; publicacion PCT n.° W088/09810, publicada el 15 de diciembre de 1988) o la barrera hematoencefalica (vease, por ejemplo, la publicacibn PCT n.° WO89/10134, publicada el 25 de abril de 1988), agentes de escision desencadenada por hibridacion, (cease, por ejemplo, Krol et al., 1988, BioTechniques 6:958-976) o agentes de intercalado (vease, por ejemplo, Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549). Con esta finalidad, el oligonucleotido se puede conjugar a otra molecula, por ejemplo, un peptido, agente de reticulacion desencadenada por hibridacion, agente de transporte, agente de escision desencadenada por hibridacion, etc.

El oligonucleotido antisentido puede comprender al menos un resto de base modificada que se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina,

4- acetilcitosina, 5-(carboxihidroxitrietil)uracilo, 5-carboximetilaminometiltiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina,

5- metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, acido uracil-5-oxiacetico (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ester metilico de acido uracil-5-oxiacetico, acido uracil-5-oxiacetico (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3) w y 2,6-diaminopurina.

El oligonucleotido antisentido tambien puede comprender al menos un resto de azucar modificado seleccionado del grupo que incluye, pero no se limita a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa y hexosa.

El oligonucleotido antisentido tambien puede contener una cadena principal de tipo peptidico neutra. Dichas moleculas se denominan oligomeros de acido peptidonucleico (PNA) y se describen, por ejemplo, en Perry-O’Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93:14670 y en Eglom et al. (1993) Nature 365:566. Una ventaja de los oligomeros de PNA es su capacidad de unirse a ADN complementario esencialmente de manera independiente de la fuerza ionica del medio debido a la cadena principal neutra del ADN. En otra modo de realizacion mas, el oligonucleotido antisentido comprende al menos una cadena principal de fosfato modificada seleccionada del grupo que consiste en un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosfordiamidato, un metilfosfonato, un fosfotriester de alquilo y un formacetal o analogo del mismo.

Aim en otro modo de realizacion, el oligonucleotido antisentido es un oligonucleotido anomerico. Un oligonucleotido anomerico forma hibridos bicatenarios especificos con ARN complementario en los que, contrariamente a las unidades habituales, las hebras discurren paralelas entre si (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641). El oligonucleotido es un 2’-0-metilribonucle6tido (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148) o un analogo de ARN-ADN quimerico (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330).

Los oligonucleotidos de la divulgacion se pueden sintetizar por procedimientos estandar conocidos en la tecnica, por ejemplo, por el uso de un sintetizador automatizado de ADN (tal como los disponibles comercialmente en Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, los oligonucleotidos fosforotioato se pueden sintetizar por el procedimiento de Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209), los oligonucleotidos metilfosfonato se pueden preparar por el uso de soporles polimericos de vidrio de poro controlado (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451), etc.

Aunque se pueden usar nucleotidos antisentido complementarios a la region codificante de una secuencia de ARNm, los complementarios a la region no traducida transcrita y a la region que comprende la metionina de inicio son lo mas preferente.

Las moleculas antisentido se pueden administrar a las celulas que expresan genes de serialization hedgehog in vivo. Se han desarrollado varios procedimientos para administrar ADN o ARN antisentido a las celulas; por ejemplo, se pueden inyectar moleculas antisentido directamente al sitio del tejido, o se pueden administrar sistematicamente moleculas antisentido modificadas, disenadas para dirigirse a las celulas deseadas (por ejemplo, molecula antisentido unida a peptidos o anticuerpos que se unen especificamente a receptores o antigenos expresados sobre la superficie de la celula diana).

Sin embargo, puede ser dificil lograr concentraciones intracelulares de la molecula antisentido suficientes para suprimir la traduction de los ARNm endogenos en cierlos casos. Por lo tanto, una estrategia preferente utiliza una construccion de ADN recombinante en la que el oligonucleotido antisentido esta colocado bajo el control de un promotor fuerle de pol III o pol II. El uso de dicha construccion para transfectar celulas diana en el paciente dara como resultado la transcription de cantidades suficientes de ARN monocatenarios que formaran pares de bases

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complementarias con los transcritos endogenos de senalizacion de hedgehog y de ese modo se evita la traduccion. Por ejemplo, se puede introducir un vector in vivo de forma que lo capte una celula y dirija la transcripcion de un ARN antisentido. Dicho vector puede permanecer episomico o quedar integrado cromosomicamente, siempre que se pueda transcribe para producir el ARN antisentido deseado. Dichos vectores se pueden generar por procedimientos de tecnologia de ADN recombinante estandar en la tecnica. Los vectores pueden ser plasmidicos, viricos u otros conocidos en la tecnica, usados para replicacion y expresion en celulas de mamifero. La expresion de la secuencia que codifica el ARN antisentido puede ser por cualquier promotor conocido en la tbcnica que actua en celulas de mamifero, preferentemente celulas humanas. Dichos promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Dichos promotores incluyen, pero no se limitan a: la region del promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), el promotor contenido en la repetition terminal larga 3‘ del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797), el promotor de timidina cinasa del herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneina (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42), etc. Se puede usar cualquier tipo de plasmido, cosmido, YAC o vector video para preparar la construccion de ADN recombinante que se puede introducir directamente en el sitio del tejido. De forma alternativa, se pueden usar vectores viricos que infectan selectivamente el tejido deseado, en cuyo caso, la administration se puede conseguir por otra ruta (por ejemplo, sistematicamente).

Tambien se pueden usar moleculas de ribozima, disehadas para escindir cataliticamente transcritos de ARNm de senalizacion de hedgehog, para evitar la traduccion del ARNm (vease, por ejemplo, la publication internacional PCT WO90/11364, publicada el 4 de octubre 1990; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222-1225 y la patente de EE. UU. n 0 5.093.246). Aunque se pueden usar ribozimas que escinden el ARNm en secuencias de reconocimiento especificas de sitio para destruir los ARNm particulares, es preferente el uso de ribozimas de cabeza de martillo. Las ribozimas de cabeza de martillo escinden los ARNm en localizaciones fijadas por las regiones flanqueantes que forman los pares de bases complementarias con el ARNm diana. El unico requisito es que el ARNm diana tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5’-UG-3’. La construccion y production de ribozimas de cabeza de martillo es bien conocida en la tecnica y se describe de manera mas completa en Haseloff y Gerlach, 1988, Nature, 334: 585-591.

Las ribozimas de la presente divulgacion tambien incluyen endorribonucleasas de ARN (a continuation en el presente documento "ribozinas de tipo Cech") tales como la que se produce de forma natural en Tetrahymena thermophila (conocida como el ADN IVS o L-19 IVS) y que se ha descrito ampliamente por Thomas Cech y colaboradores (Zaug, et al., 1984, Science, 224:574-578; Zaug y Cech, 1986, Science, 231:470-475; Zaug, et al., 1986, Nature, 324:429-433; solicitud de patente internacional publicada n.° W088/04300 por University Patents Inc.; Been y Cech, 1986, Cell, 47:207-216). Las ribozimas de tipo Cech tienen un sitio activo de ocho pares de bases que hibrida con una secuencia de ARN diana despues de que tenga lugar la escision del ARN diana. La divulgacion engloba las ribozimas de tipo Cech que estan dirigidas a secuencias de sitio activo de ocho pares de bases.

Como en la estrategia antisentido, las ribozimas pueden estar compuestas de oligonucleotidos modificados (por ejemplo, para mejorar la estabilidad, la direction, etc.) y deben administrarse a celulas que expresan genes de senalizacion hedgehog in vivo. Un procedimiento preferente de liberation implica usar una construccion de ADN "que codifica" la ribozima bajo el control de un promotor constitutive fuerte de pol III o pol II, de manera que las celulas transfectadas produciran cantidades suficientes de la ribozima para destruir mensajes especificos y para inhibir la traduccion. Debido a que las ribozimas son cataliticas, a diferencia de las moleculas antisentido, se requiere una concentration intracelular menor para su eficacia.

De forma alternativa, la expresion genica de senalizacion de hedgehog endogena se puede reducir dirigiendo secuencias de desoxirribonucleotidos complementarias a la region genica reguladora (es decir, el promotor y/o potenciadores) para formar estructuras helicoidales triples que evitan la transcripcion del gen en las celulas diana del cuerpo. (Vease, en general, Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des., 6(6):569-84; Helene, C., et al., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:27-36; y Maher, L.J., 1992, Bioassays 14(12):807-15).

Las moleculas de acido nucleico a usar en la formacion de la triple helice para la inhibition de la transcripcibn son preferentemente monocatenarias y compuestas por desoxirribonucleotidos. La composition de bases de estos oligonucleotidos debe promover la formacion de triple helice a traves de reglas de apareamiento de bases de Hoogsteen que, en general, requieren la presencia de tramos considerables de purinas o pirimidinas en una hebra de un duplex. Las secuencias de nuclebtidos pueden estar basadas en pirimidina, lo que dara como resultado tripletes TAT y CGC a lo largo de las tres hebras asociadas de la triple helice resultante. Las moleculas ricas en pirimidina proporcionan complementariedad de bases a una region rica en purina de una hebra individual del duplex en una orientation paralela a esa hebra. Ademas, las moleculas de acido nucleico se pueden elegir para que sean ricas en purina, por ejemplo, que contengan un tramo de restos de G. Estas moleculas formaran una triple helice con un duplex de ADN que es rico en pares GC, en el que la mayoria de los restos de purina estan localizados en una hebra individual del duplex especifico, lo que da como resultado tripletes CGC a lo largo de las tres hebras del triplex.

De forma alternativa, se pueden aumentar las secuencias potenciales que pueden actuar como dianas para la formacion de la triple helice creando una molecula de acido nucleico denominada "en zigzag". Las moleculas en zigzag se sintetizan de una manera alterna 5‘-3\ 3'-5', de manera que forman pares de bases con la primera cadena de un duplex y despues con la otra, eliminando la necesidad de que este presente un tramo considerable de purinas o pirimidinas en una hebra del duplex.

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Las moleculas de ARN y ADN antisentido, de ribozima y de triple helice de la divulgation se pueden preparar por cualquier procedimiento conocido en la tecnica para la sintesis de moleculas de ADN y ARN. Estos incluyen tecnicas para sintetizar quimicamente oligodesoxirribonucleotidos y oligorribonucleotidos, bien conocidas en la tecnica tal como, por ejemplo, sintesis quimica de fosforamidita en fase sblida. De forma altemativa, las moleculas de ARN se pueden generar por transcription in vitro e in vivo de secuencias de ADN que codifican la molecula de ARN antisentido. Dichas secuencias de ADN se pueden incorporar en una amplia diversidad de vectores que incorporan promotores adecuados de ARN polimerasa tales como los promotores de polimerasa T7 o SP6. De forma alternativa, las construcciones de ADNc antisentido que sintetizan ARN antisentido de forma constitutiva o inducible, dependiendo del promotor usado, se pueden introducir de forma estable en lineas celulares.

Ademas, se pueden introducir diversas modificaciones bien conocidas en las moleculas de acido nucleico, como medio para aumentar la estabilidad intracelular y la vida media. Las modificaciones posibles incluyen, pero no se limitan a, la adicion de secuencias flanqueantes de ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos en los extremos 5’ y/o 3‘ de la molecula o el uso de fosforotioato o 2'0-metilo en lugar de enlaces fosfodiesterasa dentro de la cadena principal del oligodesoxirribonucleotido.

En general, se preve que los procedimientos de disminucion de la presencia o la traduction de ARNm de hedgehog, smoothened o gli-1 actuaran como antagonistas de hedgehog, mientras que los procedimientos que disminuyen la production de patched tendran un efecto agonista.

En ciertos modos de realization, los presentes antagonistas se pueden elegir sobre la base de su selectividad por la ruta de hedgehog. Esta selectividad puede ser por la ruta de hedgehog frente a otras rutas, o la selectividad entre rutas de hedgehog particulars, por ejemplo, ptc-1, ptc-2, etc.

En ciertos modos de realization preferentes, los presentes inhibidores en cuestion inhiben la transduction de senales mediada por hedgehog con una DE50 de 1 mM o menos, mas preferentemente de 1 pM o menos, e incluso mas preferentemente de 1 nM o menos.

En modos de realization particulars, se elige la molecula pequena para su uso porque es mas selectiva por una isoforma de patched sobre la siguiente, por ejemplo, 10 veces y mas preferentemente al menos 100 o incluso 1000 veces mas selectiva por una ruta de patched (ptc-1, ptc-2) sobre otra.

En ciertos modos de realization, se elige un compuesto que es un antagonista de la ruta de hedgehog para antagonizar selectivamente la actividad de hedgehog sobre proteina cinasas distintas de PKA, tales como PKC, por ejemplo, el compuesto modula la actividad de la ruta de hedgehog con al menos un orden de magnitud mas de potencia de lo que modula la actividad de otra proteina cinasa, preferentemente con al menos dos ordenes de magnitud mas de potencia, incluso mas preferentemente con al menos tres ordenes de magnitud mas de potencia. Por lo tanto, por ejemplo, un inhibidor preferente de la ruta de hedgehog puede inhibir la actividad de hedgehog con una Ki al menos un orden de magnitud inferior que su Ki para la inhibition de PKC, preferentemente al menos dos ordenes de magnitud inferior, incluso mas preferentemente al menos tres ordenes de magnitud inferior. En ciertos modos de realization, la Ki para la inhibition de PKA es menor de 10 nM, preferentemente menor de 1 nM, incluso mas preferentemente menor de 0,1 nM.

IV. Aplicaciones ejemplares del procedimiento y composiciones

Otro aspecto de la presente divulgation se refiere a procedimientos de modulation de un estado diferenciado, la supervivencia y/o la proliferation de una celula.

Por ejemplo, se contempla que el presente procedimiento se podria usar para inhibir la angiogenesis. Se sabe que hedgehog estimula la angiogenesis. Los tapones de Matrigel impregnados con proteina hedgehog e insertados en ratones evidencian la neovascularization sustancial, mientras que los tapones de Matrigel que no llevan hedgehog muestran comparativamente poca vascularization. La proteina hedgehog tambibn es capaz de aumentar la vascularization de la cornea normalmente avascular de los ratones. El gen ptc-1 se expresa en tejidos vasculares normales, incluyendo las celulas endoteliales de la aorta, las celulas vasculares de musculo liso, los fibroblastos adventicios de la aorta, la vasculatura coronaria y los cardiomiocitos de las auriculas y los ventriculos. Estos tejidos son tambien sensibles a la proteina hedgehog. El tratamiento con hedgehog exogeno provoca la regulation por incremento de la expresion de ptc-1. Ademas, las proteinas hedgehog estimulan la proliferation de celulas vasculares de musculo liso in vivo. Las proteinas hedgehog tambien provocan que los fibroblastos aumenten la expresion de factores de crecimiento angiogenico tales como VEGF, bFGF, Ang-1 y Ang-2. Finalmente, se sabe que las proteinas hedgehog estimulan la recuperation de lesiones isquemicas y estimulan la formacion de vasos colaterales.

Dado que hedgehog promueve la angiogenesis, cabe esperar que los antagonistas de hedgehog actuen como inhibidores de la angiogenesis, particularmente en situaciones en las que es necesario un cierto nivel de serialization de hedgehog para la angiogenesis.

La angiogenesis es fundamental para muchos trastornos. Se produce angiogenesis persistente y no regulada en una gama de estados patologicos, metastasis tumorales y crecimientos anomalos por celulas endoteliales. La vasculatura creada como resultado de los procesos angiogenicos soporta el dano patologico observado en estas afecciones. Los

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diversos estados patologicos creados debido a la angiogenesis no regulada se han agrupado juntos como enfermedades dependientes de la angiogenesis o asociadas a la angiogenesis. Los tratamientos dirigidos a controlar los procesos angiogenicos podrian conducir a la supresion o mitigacion de estas enfermedades.

Las enfermedades provocadas, favorecidas o asociadas con la angiogenesis incluyen enfermedad ocular neovascular, degeneracion macular senil, retinopatia diabetica, retinopatia del prematuro, rechazo de injerto de cornea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolenticular, queratoconjuntivitis epidemica, deficiencia de vitamina A, uso excesivo de lentes de contacto, queratitis atopica, queratitis limbica superior, pterigion, queratitis seca, enfermedad de Sjogren, acne rosacea, filectenulosis, sifilis, infecciones por micobacterias, degeneracion de los lipidos, quemaduras quimicas, ulceras bacterianas, ulceras fungicas, infecciones por herpes simple, infecciones por herpes zoster, infecciones por protozoos, sarcoma de Kaposi, ulcera de Mooren, degeneracion marginal de Terrien, queratolisis marginal, artritis reumatoide, lupus sistemico, poliarteritis, traumatismo, sarcoidosis de Wegener, escleritis, enfermedad de Stevens Johnson, queratotomia radial perifigoide, rechazo de injertos de la cornea, artritis reumatoide, osteoartritis, inflamacion cronica (por ejemplo, colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn), hemangioma, enfermedad de Osler-Weber-Rendu y telangiectasia hemorragica hereditaria.

Ademas, la angiogenesis desempeha una funcion critica en el cancer. Un tumor no se puede expandir sin suministro sanguineo que proporcione nutrientes y elimine los desechos celulares. Los tumores en los que la angiogenesis es importante incluyen tumores solidos tales como rabdomiosarcomas, retinoblastoma, sarcoma de Ewing, neuroblastoma y osteosarcoma, y tumores benignos tales como neuroma acustico, neurofibroma, tracoma y granulomas piogenos. Se han encontrado factores angiogenicos asociados con varios tumores solidos. La prevencion de la angiogenesis podria detener el crecimiento de estos tumores y el dafio resultante al animal debido a la presencia del tumor. La angiogenesis tambien esta asociada con tumores hematicos tales como leucemias, cualquiera de diversas enfermedades neoplasicas agudas o cronicas de la medula osea en las que se produce proliferacion incontrolada de leucocitos, habitualmente acompanada de anemia, coagulacion alterada de la sangre y dilatacion de los ganglios linfaticos, el higado y el bazo. Se cree que la angiogenesis desempeha una funcion en las anomalias de la medula osea que dan lugar a los tumores de tipo leucemia.

Ademas del crecimiento tumoral, la angiogenesis es importante en la metastasis. Inicialmente, la angiogenesis es importante en la vascularizacion del tumor, que permite que las celulas cancerosas entren en el torrente sanguineo y circulen por todo el cuerpo. Despues de que las celulas tumorales hayan abandonado el sitio primario, y se hayan asentado en el sitio de metastasis secundario, se debe producir la angiogenesis antes de que el nuevo tumor pueda crecer y expandirse. Por lo tanto, la prevencion de la angiogenesis podria conducir a la prevencion de la metastasis de tumores y posiblemente a contener el crecimiento neoplasico en el sitio primario.

La angiogenesis tambien esta implicada en procesos fisiologicos normales tales como la reproduction y la cicatrizacion de heridas. La angiogenesis es una etapa importante en la ovulacion y tambien en la implantacion de la blastula despues de la fertilization. La prevencion de la angiogenesis se podria usar para inducir amenorrea, para bloquear la ovulacion o para evitar la implantacion de la blastula.

Se preve que la divulgation sera util para el tratamiento y/o prevencion del sindrome de dificultad respiratoria u otros trastornos resultantes de una tension de superficie pulmonar inapropiada. El sindrome de dificultad respiratoria es el resultado de tensioactivo insuficiente en el alveolos pulmonares. Los pulmones de los vertebrados contienen tensioactivo, una mezcla compleja de lipidos y proteinas que provoca que la tension de superficie aumente durante el inflado pulmonar y disminuya durante el desinflado pulmonar. Durante el desinflado pulmonar, el tensioactivo disminuye de tal forma que no hay fuerzas superficiales que de lo contrario favorecerian el colapso alveolar. Los alveolos oxigenados que no han colapsado durante la espiracion permiten el transporte continuo de oxigeno y dioxido de carbono entre la sangre y el gas alveolar y requieren mucho menos fuerza para inflarse durante la inspiracion siguiente. Durante el inflado, el tensioactivo pulmonar aumenta la tension de superficie a medida que aumenta el area superficial alveolar. El aumento de la tension de superficie en los alveolos en expansion se opone al exceso de inflado en esos espacios aereos y tiende a desviar el aire inspirado hacia alveolos que cuentan con menor aireacidn, facilitando de este modo una aireacion pulmonar uniforme.

El sindrome de dificultad respiratoria es particularmente frecuente en lactantes prematuros, El tensioactivo pulmonar normalmente se sintetiza a una tasa muy baja hasta las ultimas seis semanas de la vida del feto. Los lactantes humanos nacidos mas de seis semanas antes del termino normal de un embarazo tienen un alto riesgo de nacer con cantidades inadecuadas de tensioactivo pulmonar y tasas inapropiadas de sintesis de tensioactivo. Cuanto mas prematuramente nace el lactante, mas probabilidad hay de que la deficiencia de tensioactivo sea mas grave. La deficiencia grave de tensioactivo puede conducir a insuficiencia respiratoria a los pocos minutos u horas del nacimiento. La deficiencia de tensioactivo produce colapso progresivo de los alveolos (atelectasia) debido a la capacidad disminuida de los pulmones de expandirse, a pesar del esfuerzo maximo en la inspiracion. Como resultado, llegan cantidades inadecuadas de oxigeno a la sangre del lactante. Se puede producir RDS en adultos tambien, tipicamente como consecuencia de una insuficiencia en la biosintesis de tensioactivo.

El tejido pulmonar de los lactantes prematuros muestra una alta actividad de la ruta de serialization de hedgehog. La inhibition de esta ruta usando antagonistas de hedgehog aumenta la formation de cuerpos lamelares y aumenta la expresion de genes implicados en la biosintesis de tensioactivo. Los cuerpos lamelares son estructuras subcelulares

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asociadas con la biosintesis de tensioactivo. Por estas razones, el tratamiento de lactantes prematuros con un antagonista de hedgehog deberia estimular la biosintesis de tensioactivo y mejorar el RDS. En casos en los que el RDS en adultos esta asociado con activacion de la ruta de hedgehog, el tratamiento con antagonistas de hedgehog tambien deberia ser eficaz.

Se contempla, ademas, que el uso de antagonistas de hedgehog se puede dirigir especificamente a trastornos en los que el tejido y/o las celulas afectadas evidencian una elevada activacion de la ruta de hedgehog. La expresion de genes gli se activa por la ruta de senalizacion de hedgehog, incluyendo gli-1, gli-2 y gli-3. La expresion de gli-1 esta correlacionada de forma muy consistente con la actividad de senalizacion de hedgehog en una amplia gama de tejidos y trastornos, mientras que gli-3 algo menos. Los genes gli codifican factores de transcripcion que activan la expresion de muchos genes necesarios para provocar los efectos completos de la senalizacion de hedgehog. Sin embargo, el factor de transcripcion Gli-3 tambien puede actuar como represor de los genes efectores hedgehog y, por lo tanto, la expresion de gli-3 puede provocar un efecto disminuido de la ruta de senalizacion de hedgehog. Que Gli-3 actue como activador transcripcional o como represor depende de eventos postraduccionales y, por lo tanto, cabe esperar que los procedimientos para detectar la forma de activacion (frente a la forma de represion) de la proteina Gli-3 tambien sean una medida fiable de la activacion de la ruta de hedgehog. Se espera que la expresion genica de gli-2 proporcione un marcador fiable para la activacion de la ruta de hedgehog. El gen gli-1 se expresa intensamente en una amplia gama de canceres, hiperplasias y pulmones inmaduros, y sirve como marcador para la activacion relativa de la ruta de hedgehog. Ademas, tejidos tales como el pulmon inmaduro, que tienen elevada expresion genica de gli se ven fuertemente afectados por inhibidores de hedgehog. En consecuencia, se contempla que la deteccion de la expresion genica de gli se puede usar como una herramienta predictiva potente para identificar tejidos y trastornos que se beneficiaran particularmente del tratamiento con un antagonista de hedgehog.

En modos de realizacion preferentes, se detectan niveles de expresion de gli-1, por deteccion directa del transcrito o por deteccion de los niveles o actividad de las proteinas, Los transcritos se pueden detectar usando cualquiera de una amplia gama de tecnicas que dependen principalmente de la hibridacion de sondas con los transcritos de gli-1 o con los ADNc sintetizados a partir de los mismos. Las tbcnicas bien conocidas incluyen la transferencia de Northern, PCR con transcriptasa inversa y analisis por microserie de los niveles de transcritos. Los procedimientos para detectar los niveles de proteina Gli incluyen transferencia de Western, inmunoprecipitacion, electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional (2D SDS-PAGE) (preferentemente en comparacion con un estandar en el que se ha determinado la posicion de las proteinas Gli) y espectroscopia de masas. La espectroscopia de masas se puede acoplar con una serie de etapas de purificacion para permitir la identificacibn de alto rendimiento de muchos niveles diferentes de proteinas en una muestra particular. La espectroscopia de masas y la 2D SDS-PAGE tambien se pueden usar para identificar modificaciones postranscripcionales en las proteinas, incluyendo eventos proteoliticos, ubiquitinacion, fosforilacion, modificacion con lipidos, etc. La actividad de Gli tambien se puede evaluar analizando la union al ADN sustrato o la activacion transcripcional in vitro de los promotores diana. Los ensayos de desplazamiento en gel, los ensayos de huella de ADN y los ensayos de reticulacion de proteina-ADN son todos procedimientos que se pueden usar para evaluar la presencia de una proteina capaz de unirse a los sitios de union de Gli en el ADN. (J Mol Med 1999 Jun; 77(6):459-68; Cell 2000 Feb 18; 100(4) 423-34; Development 2000; 127(19):4293-4301).

En modos de realizacion preferentes, se miden los niveles de transcriplo de gli y los tejidos con enfermedad o trastomo que muestran niveles anomalamente altos de gli se tratan con un antagonista de hedgehog. El tejido pulmonar prematuro, los canceres de pulmon (por ejemplo, adenocarcinomas, adenocarcinomas broncoalveolares, carcinomas microciticos), los canceres de mama (por ejemplo, carcinomas ductales inferiores, carcinomas lobulares inferiores, carcinomas tubulares), los canceres de prbstata (por ejemplo, adenocarcinomas) y las hiperplasias benignas de prbstata muestran todos niveles de expresion de gli-1 intensamente elevados en ciertos casos. En consecuencia, los niveles de expresion de gli-1 son un dispositivo de diagnostico potente para determinar, de estos tejidos, los que deben tratarse con un antagonista de hedgehog. Ademas, hay evidencias correlativas sustanciales de que los canceres de celulas uroteliales (por ejemplo, cancer de vejiga, otros canceres urogenitales) tambien tienen niveles elevados de gli-1 en ciertos casos. Por ejemplo, se sabe que la perdida de la heterocigosidad en el cromosoma 9q22 es comun en los canceres de vejiga. El gen ptc-1 esta localizado en esta posicion y la perdida de funcion de ptc-1 es probablemente una causa parcial de hiperproliferacion, como en muchos otros tipos de cancer. En consecuencia, dichos canceres tambien muestran una elevada expresion de gli y serian particularmente susceplibles al tratamiento con un antagonista de hedgehog.

La expresion de ptc-1 y ptc-2 tambien se activa por la ruta de senalizacion de hedgehog, pero estos genes son inferiores a los genes gli como marcadores de la activacion de la ruta de hedgehog. En ciertos tejidos se expresa solamente uno de ptc-1 o ptc-2, aunque la ruta de hedgehog es altamente activa. Por ejemplo, en el desarrollo testicular, indian hedgehog desempena una funcion importante y se activa la ruta de hedgehog, pero solamente se expresa ptc-2. En consecuencia, estos genes no son fiables individualmente como marcadores para la activacion de la ruta de hedgehog, aunque se contempla la medicibn simultanea de ambos genes como un indicador util para los tejidos a tratarse con un antagonista de hedgehog.

Se preve que puede ser util cualquier grado de sobreexpresion de gli en la determinacion de que el antagonista de hedgehog sera un tratamiento eficaz. En modos de realizacion preferentes, gli debe expresarse a un nivel al menos el dos veces superior que el normal. En modos de realizacion particularmente preferentes, la expresion es cuatro, seis, ocho o diez veces superior que la normal.

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Por ejemplo, se contempla por la divulgacion que, a la luz de los hallazgos de una implicacion aparentemente amplia de hedgehog, ptc y smoothened en las disposiciones espaciales ordenadas de tejidos diferenciados en vertebrados, el presente procedimiento se podria usar como parte de un procedimiento para generar y/o mantener una serie de tejidos diferentes en vertebrados tanto in vitro como in vivo. El antagonista de hedgehog, ya sea inductivo o anti-inductivo con respecto a la proliferacion o diferenciacion de un tejido dado, puede ser, segun lo apropiado, cualquiera de las preparaciones descritas anteriormente.

Por ejemplo, el presente procedimiento es aplicable a tecnicas de cultivo celular en las que es deseable reducir el nivel de senalizacion de hedgehog. Se ha demostrado que los sistemas de cultivo neuronales in vitro son herramientas fundamentales e indispensables para el estudio del desarrollo neural, asi como para la identification de factores neurotroficos tales como el factor de crecimiento nervioso (NGF), los factores troficos ciliares (CNTF) y el factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF). Un uso del presente procedimiento puede ser en cultivos de celulas madre neuronales, tal como en el uso de dichos cultivos para la generacion de nuevas neuronas y la glia. En dichos modos de realizacidn del presente procedimiento, las celulas cultivadas se pueden poner en contacto con un antagonista de hedgehog de la presente divulgacion para alterar la tasa de proliferacion de celulas madre neuronales en el cultivo y/o alterar la tasa de diferenciacion, o para mantener la integridad de un cultivo de ciertas celulas neuronales diferenciadas de forma terminal. En un modo de realization ejemplar, el presente procedimiento se puede usar para cultivar, por ejemplo, neuronas sensoriales o, de forma alternativa, neuronas motoras. Dichos cultivos neuronales se pueden usar como sistemas de ensayo convenientes, asi como fuentes de celulas implantables para tratamientos terapeuticos.

Para ilustrar adicionalmente otros usos de los presentes antagonistas de hedgehog, cabe senalar que el injerto intracerebral ha surgido como una estrategia adicional a los tratamientos del sistema nervioso central. Por ejemplo, una estrategia para reparar tejidos cerebrales dahados implica el trasplante de celulas desde animales fetales o neonatos al cerebro adulto (Dunnett et al. (1987) J Exp Biol 123:265-289; y Freund et al. (1985) J Neurosci 5:603-616). Las neuronas fetales de una diversidad de regiones cerebrales se pueden incorporar satisfactoriamente en el cerebro adulto, y dichos injertos pueden aliviar los defectos del comportamiento. Por ejemplo, se puede prevenir el trastorno del movimiento inducido por lesiones de las proyecciones dopaminergicas a los ganglios basales por injertos de neuronas dopaminergicas embrionarias. Las funciones cognitivas complejas que quedan deterioradas despues de lesiones del neocortex tambien se pueden restaurar parcialmente por injertos de celulas corticales embrionarias. El presente procedimiento se puede usar para regular el estado de crecimiento en cultivo, o cuando se usa tejido fetal, especialmente celulas madre neuronales, se puede usar para regular la tasa de diferenciacion de las celulas madre.

Las celulas madre utiles en la presente divulgacion, en general, son conocidas. Por ejemplo, se han identificado varias celulas de la cresta neural, que son algunas de ellas multipotentes y probablemente representan celulas de la cresta neural no comprometidas, y otras de ellas pueden generar solamente un tipo de celula, tales como neuronas sensoriales, y probablemente representan celulas progenitoras comprometidas. La funcion de los antagonistas de hedgehog empleados en el presente procedimiento para cultivar dichas celulas madre puede ser regular la diferenciacion del progenitor no comprometido, o regular la restriction adicional del destino de desarrollo de una celula progenitora comprometida para convertirse en una celula neuronal diferenciada de forma terminal. Por ejemplo, el presente procedimiento se puede usar in vitro para regular la diferenciacion de celulas de la cresta neural en celulas gliales, celulas de Schwann, celulas de cromafina, neuronas colin6rgicas simpaticas o parasimpaticas, asi como neuronas peptidergicas y serotoninergicas. Los antagonistas de hedgehog se pueden usar en solitario, o se pueden usar en combination con otros factores neurotroficos que actuan potenciando mas particularmente un destino de diferenciacion particular de la celula progenitora neuronal.

Adem£s de la implantation de celulas cultivadas en presencia de los presentes antagonistas de hedgehog, otro aspecto mas de la presente divulgacion se refiere a la aplicacion terapeutica de un antagonista de hedgehog para regular el estado de crecimiento de las neuronas y otras celulas neuronales tanto en el sistema nervioso central como en el sistema nervioso periferico. La capacidad de ptc, hedgehog y smoothened de regular la diferenciacion neuronal durante el desarrollo del sistema nervioso y tambien presumiblemente en el estado adulto indica que, en ciertos casos, se puede esperar que los presentes antagonistas de hedgehog faciliten el control de las neuronas adultas con respecto al mantenimiento, rendimiento funcional y envejecimiento de las celulas normales; procesos de reparacion y regeneration de celulas lesionadas quimica o mecanicamente; y tratamiento de la degeneration en ciertas afecciones patologicas. A la luz de esta consideration, la presente invention contempla especificamente aplicaciones del presente procedimiento al protocolo de tratamiento de (prevention y/o reduction de la gravedad de) afecciones neurologicas derivadas de: (i) lesion aguda, subaguda o cronica del sistema nervioso, incluyendo lesion traumatica, lesion quimica, lesion vascular y deficiencias (tales como la isquemia resultante de apoplejia), junto con lesiones infecciosas/inflamatorias e inducidas por tumores; (ii) envejecimiento del sistema nervioso incluyendo enfermedad de Alzheimer; (iii) enfermedades neurodegenerativas cronicas del sistema nervioso, incluyendo enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrofica y similares, asi como degeneraciones espinocerebelosas; y (iv) enfermedades inmunologicas cronicas del sistema nervioso o que afectan al sistema nervioso, incluyendo esclerosis multiple.

Segun sea apropiado, el presente procedimiento tambien se puede usar en la generacion de protesis nerviosas para la reparacion de dafios en nervios centrales y perifericos. En particular, cuando un axon aplastado o cortado se intuba

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En otro modo de realizacibn, el presente procedimiento se puede usar en el tratamiento de transformaciones neoplasicas o hiperplasicas tales como las que se pueden producir en el sistema nervioso central. Por ejemplo, los antagonistas de hedgehog se pueden usar para provocar que dichas celulas transformadas se vuelvan postmitoticas o apoptoticas. El presente procedimiento se puede usar, por lo tanto, como parte de un tratamiento para, por ejemplo, gliomas malignos, meningiomas, meduloblastomas, tumores neuroectodermicos y ependimomas.

En un modo de realizacibn preferente, el presente procedimiento se puede usar como parte de un regimen de tratamiento para meduloblastoma maligno y otros tumores neuroectodermicos malignos primarios del SNC.

En ciertos modos de realizacibn, el presente procedimiento se usa como parte del programa de tratamiento para meduloblastoma. El meduloblastoma, un tumor cerebral primario, es el tumor cerebral mas comun en los ninos. Un meduloblastoma es un tumor neuroectodermico primitivo que surge en la fosa posterior. Representan aproximadamente el 25 % de todos los tumores cerebrales pediatricos (Miller). Histologicamente, son tumores de celulas pequerias y redondas comunmente dispuestos en verdaderas rosetas, pero pueden mostrar cierta diferenciacion en astrocitos, celulas ependimarias o neuronas (Rorke; Kleihues). Los PNET pueden surgir en otras areas del cerebro, incluyendo la glandula pineal (pineoblastoma) y el cerebro. Los que surgen en la region supratentorial, en general, estan en peores condiciones que sus equivalentes de PF.

Se sabe que los meduloblastomas/PNET se repiten en cualquier parte del SNC despues de la reseccion, e incluso pueden metastatizar al hueso. Por lo tanto, la evaluacion pretratamiento debe incluir un examen de la medula espinal para descartar la posibilidad de "metastasis aisladas". Las IRM mejoradas con gadolinio han sustituido en gran medida a la mielografia con esta finalidad, y se obtiene citologia de CSF de forma posoperatoria como un procedimiento de rutina.

En otros modos de realizacibn, el presente procedimiento se usa como parte del programa de tratamiento para ependimomas. Los ependimomas representan aproximadamente el 10% de los tumores cerebrales pediatricos en los ninos. Aproximadamente, son tumores que surgen del revestimiento ependimario de los ventriculos y microscopicamente forman rosetas, canales y rosetas perivasculares. En la serie de CHOP de 51 ninos que presentan ependimoma, 3/4 eran histologicamente benignos. Aproximadamente 2/3 surgieron de la region del cuarto ventriculo. Una tercera parte se presentaba en la region supratentorial. La edad de presentacion es maxima entre el nacimiento y los 4 anos, como lo demuestran los datos de SEER, asi como los datos de CHOP. La edad media es de aproximadamente 5 anos. Debido a que muchos ninos con esta enfermedad son bebes, a menudo requieren tratamiento multimodal.

Otro aspecto mas de la presente divulgacion se refiere a la observacion en la tecnica que ptc, hedgehog y/o smoothened estan implicados en las seriales morfogenicas implicadas en otras rutas organogenicas de vertebrados, ademas de la diferenciacion neuronal como se describe anteriormente, teniendo funciones evidentes en la formacion de otros patrones endodermicos, asi como en procesos de diferenciacion tanto mesodermicos como endodermicos. Por lo tanto, se contempla por la invention que las composiciones que comprenden antagonistas de hedgehog se pueden usar tambien tanto para el cultivo de celulas como para procedimientos terapeuticos que implican la generacion y mantenimiento de tejido no neuronal.

En un modo de realizacibn, la presente divulgacion hace uso del descubrimiento de que ptc, hedgehog y smoothened estan implicados aparentemente en el control del desarrollo de los celulas madre responsables de la formacion del tubo digestivo, el higado, los pulmones y otros organos que derivan del intestino primitivo. Shh sirve como serial inductiva del endodermo al mesodermo, que es critica para la morfogenesis del intestino. Por lo tanto, por ejemplo, los antagonistas de hedgehog del presente procedimiento se pueden emplear para regular el desarrollo y el mantenimiento de un higado artificial que puede tener multiples funciones metabolicas de un higado normal. En un modo de realizacibn ejemplar, el presente procedimiento se puede usar para regular la proiiferacion y la diferenciacion de las celulas madre del tubo digestivo para formar cultivos de hepatocitos que se pueden usar para poblar matrices extracelulares, o que se pueden encapsular en polimeros biocompatibles, para formar higados artificiales tanto implantables como extracorporales.

En otro modo de realizacibn, las composiciones terapeuticas de antagonistas de hedgehog se pueden utilizar conjuntamente con el trasplante de dichos higados artificiales, asi como estructuras de higado embrionario, para regular la captacion de la implantation intraperitoneal, la vascularizacion y la diferenciacion in vivo y el mantenimiento del tejido hepatico injertado.

En otro modo de realizacibn mas, el presente procedimiento se puede emplear terapbuticamente para regular dichos organos despues de lesion fisica, quimica o patologica. Por ejemplo, las composiciones terapeuticas que comprenden antagonistas de hedgehog se pueden utilizar en la reparacion hepatica posterior a hepatectomia parcial.

La generacion de pancreas e intestino delgado a partir de intestino embrionario depende de la serializacibn intercelular entre las celulas endodermicas y mesodermicas del intestino. En particular, se ha sugerido que la

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diferenciacion del mesodermo intestinal en musculo liso depende de sefiales de las celulas endodermicas adyacentes. Un mediador candidato de las senales derivadas del endodermo en el intestino posterior embrionario es Sonic hedgehog, Vease, por ejemploI Apelqvist et al. (1997) Curr Biol 7:801-4. El gen Shh se expresa en todo el endodermo del intestino embrionario con la exception del endodermo del primordio pancreatico, que en lugar de expresar altos niveles de la proteina de homeodominio Ipfl/Pdxl (factor 1 promotor de insulina/homeobox 1 duodenal y pancreatica), un regulador esencial del desarrollo pancreatico temprano. Apelqvist et al., supra, han examinado si la expresion diferencial de Shh en el tubo intestinal embrionario controla la diferenciacion del mesodermo adyacente en derivados de mesodermo especializados del intestino delgado y el pancreas. Para someter esto a prueba, usaron el promotor del gen Ipfl/Pdxl para expresar selectivamente Shh en el epitelio pancreatico en desarrollo. En ratones transgenicos Ipfl/Pdxl-Shh, el mesodermo pancreatico se desarrolld en musculo liso y celulas intersticiales de Cajal, caracteristicas del intestino, en lugar de en mesenquima pancreatico y bazo. Ademas, explantes pancreaticos expuestos a Shh experimentaron un programa similar de diferenciacion intestinal. Estos resultados proporcionan evidencias de que la expresion diferencial de Shh derivado del endodermo controla el destino del mesodermo adyacente en diferentes regiones del tubo intestinal.

En el contexto de la presente divulgacidn, se contempla, por lo tanto, que los presentes antagonistas de hedgehog se pueden usar para controlar o regular la proliferacion y/o la diferenciacion de tejido pancreatico tanto in vivo como in vitro.

En otro modo de realizacion, los antagonistas de hedgehog se usan para generar tejido endodermico a partir de celulas madre no endodermicas, incluyendo celulas madre mesenquimales y celulas madre derivadas de tejidos mesodermicos. Lo tejidos mesodermicos ejemplares a partir de los que se pueden aislar las celulas madre incluyen el musculo esqueletico, el musculo cardiaco, el rinon, el hueso, el cartilago y la grasa.

Hay una amplia diversidad de afecciones patologicas de diferenciacion y proliferacion celular para las que los inhibidores de la presente divulgacion pueden proporcionar beneficios terapeuticos, siendo la estrategia general, por ejemplo, la correccion de la expresion de insulina aberrante, o la modulacion de la diferenciacion. Mas en general, sin embargo, la presente divulgacion se refiere a un procedimiento para inducir y/o mantener un estado diferenciado, potenciar la supervivencia y/o afectar a la proliferacion de las celulas pancreaticas, poiendo en contacto las celulas con los presentes inhibidores. Por ejemplo, se contempla por la divulgacion que, a la luz de la aparente implicacion de ptc, hedgehog y smoothened en la formacidn de disposiciones espaciales ordenadas de tejidos pancreaticos, el presente procedimiento se podria usar como parte de una tecnica para generar y/o mantener dicho tejido tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, la modulacion de la funcion de hedgehog se puede emplear tanto en cultivo celular como en procedimientos terapeuticos que impliquen la generacion y mantenimiento de celulas p y posiblemente tambien para tejido no pancreatico, tal como en el control del desarrollo y mantenimiento del tejido a partir del tubo digestivo, el bazo, los pulmones, los drganos urogenitales (por ejemplo, la vejiga) y otros organos que derivan del intestino primitivo.

En un modo de realizacion ejemplar, el presente procedimiento se puede usar en el tratamiento de trastornos hiperplasicos y neoplasicos que afectan al tejido pancreatico, particularmente los que se caracterizan por proliferacion aberrante de celulas pancreaticas. Por ejemplo, los canceres pancreaticos destacan por una proliferacion anomala de las celulas pancreaticas, que puede dar como resultado alteraciones de la capacidad secretora de insulina del pancreas. Por ejemplo, ciertas hiperplasias pancreaticas, tales como carcinomas pancreaticos, pueden dar como resultado hipoinsulinemia debido a la disfuncion de las celulas (3 o a la masa disminuida de celulas insulares.

Ademas, la manipulacion de las propiedades de serialization de hedgehog en diferentes puntos puede ser util como parte de una estrategia para la remodelacion/reparacion de tejido pancreatico tanto in vivo como in vitro. En un modo de realizacidn, la presente divulgacion hace uso de la aparente implicacion de ptc, hedgehog y smoothened en la regulation del desarrollo de tejido pancreatico. En general, el presente procedimiento se puede emplear terapeuticamente para regular el pancreas despues de lesion fisica, quimica o patoldgica. En otro modo de realizacion mas, el presente procedimiento se puede aplicar a tecnicas de cultivo celular y, en particular, se puede emplear para potenciar la generacion inicial de dispositivos protesicos de tejido pancreatico. La manipulacion de la proliferacion y la diferenciacion del tejido pancreatico, por ejemplo, alterando la actividad de hedgehog, puede proporcionar un medio para controlar mas cuidadosamente las caracteristicas de un tejido cultivado. En un modo de realizacion ejemplar, el presente procedimiento se puede usar para aumentar la production de dispositivos protesicos que requieren celulas beta insulares, tales como las que se pueden usar en los dispositivos de encapsulado descritos en, por ejemplo, Aebischer et al. patente de EE. UU. n.° 4.892.538, Aebischer et al. patente de EE. UU. n.° 5.106.627, Lim patente de EE. UU. n.° 4.391.909 y Sefton patente de EE. UU. n.° 4.353.888. Las celulas progenitoras tempranas para los islotes pancreaticos son multipotenciales y, aparentemente. coactivan todos los genes especificos de los islotes desde el momento en que aparecen por primera vez. A medida que avanza el desarrollo, la expresion de hormonas especificas de los islotes, tales como la insulina, queda restringida al patron de expresion caracteristico de celulas insulares maduras. El fenotipo de las celulas insulares maduras, sin embargo, no es estable en cultivo, ya que se puede observar reaparicion de rasgos embrionarios en celulas p maduras. Utilizando los presentes antagonistas de hedgehog, se puede regular la ruta de diferenciacion o el indice proliferativo de las celulas.

Ademas, la manipulacion del estado de diferenciacion del tejido pancreatico se puede utilizar conjuntamente con el trasplante de pancreas artificial. Por ejemplo, se puede utilizar la manipulacion de la funcion de hedgehog para

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afectar a la diferenciacion tisular como un medio para mantener la viabilidad del injerto.

Bellusci et al. (1997) Development 124:53 informan de que Sonic hedgehog regula la proliferacion in vivo de celulas mesenquimales de los pulmones. En consecuencia, el presente procedimiento se puede usar para regular la regeneracion del tejido pulmonar, por ejemplo, en el tratamiento de enfisema.

Fujita et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun 238:658 informaron de que Sonic hedgehog se expresa en celulas de carcinoma y adenocarcinoma escamoso de pulmon en seres humanos. La expresion de Sonic hedgehog tambien se detecto en los tejidos de carcinoma escamoso de pulmon en seres humanos, pero no en el tejido pulmonar normal del mismo paciente. Tambien observaron que Sonic hedgehog estimula la incorporacion de BrdU en las celulas de carcinoma y estimula su crecimiento celular, mientras que anti-Sfrfr-N inhibia su crecimiento celular. Estos resultados sugieren que ptc, hedgehog y/o smoothened esta implicado en el crecimiento de las celulas de dicho tejido pulmonar transformado y, por tanto, indica que el presente procedimiento se puede usar como parte de un tratamiento de carcinoma y adenocarcinomas de pulmon, y otros trastornos proliferativos que impliquen los epitelios pulmonares.

Muchos otros tumores pueden verse afectados, basandose en evidencias tales como la implicacion de la ruta de hedgehog en estos tumores, o en la expresion detectada de hedgehog o su receptor en estos tejidos durante el desarrollo, por el tratamiento con los presentes compuestos. Dichos tumores incluyen, pero no se limitan de ninguna manera a, tumores relacionados con el sindrome de Gorlin (por ejemplo, meduloblastoma, meningioma, etc ), tumores menifestados en ratones knock-out ptc (por ejemplo, hemangioma, rabdomiosarcoma, etc ), tumores resultantes de la amplificacion de gli-1 (por ejemplo, glioblastoma, sarcoma, etc.), tumores relacionados con TRC8, un homologo de ptc (por ejemplo, carcinoma renal, carcinoma de tiroides, etc ), tumores relacionados con Ext-1 (por ejemplo, cancer de huesos, etc. ), tumores inducidos por Shh (por ejemplo, cancer de pulmon, condrosarcomas, etc.) y otros tumores (por ejemplo, cancer de mama, cancer urogenital (por ejemplo, rinon, vejiga, ureter, prostata, etc.), cancer suprarrenal, cancer gastrointestinal (por ejemplo, estomago, intestino, etc ), etc ).

En aim otro modo de realizacion de la presente divulgacion, las composiciones que comprenden antagonistas de hedgehog se pueden usar en la generation in vitro de tejido esqueletico, tal como celulas madre esqueletogenas, asi como en el tratamiento in vivo de deficiencies de tejido esqueletico. La presente divulgacion contempla particulamnente el uso de los antagonistas de hedgehog para regular la tasa de condrogenesis y/u osteogenesis. Por "deficiencia del tejido esqueletico", se entiende una deficiencia en el hueso u otro tejido conjuntivo esqueletico en cualquier sitio en el que se desee restaurar el hueso o el tejido conjuntivo, sin importar el modo en el que se origino la deficiencia, por ejemplo, ya sea como resultado de una intervencidn quirurgica, la elimination del tumor, ulceration, implante, fractura u otras afecciones traumaticas o degenerativas.

Por ejemplo, el procedimiento de la presente divulgacion se puede usar como parte de un regimen para restaurar la funcion del cartllago en un tejido conjuntivo. Dichos procedimientos son utiles en, por ejemplo, la reparacion de defectos o lesiones en el tejido cartilaginoso que son el resultado del desgaste degenerativo, tal como el que resulta de artritis, asi como otros trastornos mecanicos que pueden estar provocados por traumatismo en el tejido, tal como un desplazamiento del tejido de menisco roto, meniscectomia, naturaleza laxa de una articulacion por un ligamento roto, tumoracion de las articulaciones, fracturas de huesos o por enfermedad hereditaria. El presente procedimiento de reparacion tambien es util para remodelar la matriz del cartilago, tal como en cirugia plastica o reconstructiva, asi como en cirugia periodontal. El presente procedimiento tambien se puede aplicar para mejorar un procedimiento de reparacion previo, por ejemplo, despues de la reparacion quirurgica de un menisco, ligamento o cartilago. Ademas, puede evitar la aparicion o exacerbation de una enfermedad degenerativa si se aplica sufrcientemente pronto despues de un traumatismo.

En un modo de realizacion de la presente divulgacion, el presente procedimiento comprende tratar el tejido conjuntivo afectado con una cantidad terapeuticamente suficiente de un antagonista de hedgehog, particularmente un antagonista selectivo por la transduction de senales de Indian hedgehog, para regular una respuesta de reparacion del cartilago en el tejido conjuntivo controlando la tasa de diferenciacion y/o proliferacion de los condrocitos incorporados en el tejido. Dichos tejidos conjuntivos como el cartilago articular, el cartilago interarticular (meniscos), el cartilago costal (que conecta las costillas verdaderas y el esternon), los ligamentos y los tendones son particularmente susceptibles al tratamiento en tratamientos de reconstruction y/o regeneracion usando el presente procedimiento. Como se usa en el presente documento, los tratamientos de regeneracion incluyen el tratamiento de estados degenerativos que han evolucionado hasta el punto de que el deterioro del tejido es obviamente manifesto, asi como los tratamientos preventivos de tejidos en los que la degeneracion esta en sus fases mas tempranas o es inminente.

En un modo de realizacion ilustrativo, el presente procedimiento se puede usar como parte de una intervention terapeutica en el tratamiento del cartilago de una articulacion diartroidal, tal como una rodilla, un tobillo, un codo, una cadera. una muneca, un nudillo de un dedo de la mano o del pie, o una articulacion temporomandibular. El tratamiento se puede dirigir al menisco de la articulacion, al cartilago articular de la articulacion, o a ambos. Para ilustrarlo adicionalmente, el presente procedimiento se puede usar para tratar un trastorno degenerativo de una rodilla, tal como el que podria ser el resultado de una lesion traumatica (por ejemplo, una lesion deportiva o un desgaste excesivo) u osteoartritis Los presentes antagonistas se pueden administrar como una inyeccion en la articulacion, por ejemplo, con una aguja artroscopica. En algunos casos, el agente inyectado puede estar en la forma

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de un hidrogel u otro vehiculo de liberacion lenla descrito anteriormente para permitir un contacto mas extenso y regular del agente con el tejido tratado.

La presente divulgacion contempla, ademas, el uso del presente procedimiento en el campo del trasplante de cartilago y de tratamientos con dispositivos protesicos. Sin embargo, surgen problemas, por ejemplo, porque las caracteristicas del cartilago y del fibrocartilago varian entre diferentes tejidos: tal como entre el cartilago articular, del menisco, los ligamentos y los tendones, entre los dos extremos del mismo ligamento o tendon, y entre las partes superficial y profunda del tejido. La disposition zonal de estos tejidos puede reflejar un cambio gradual en las propiedades mecanicas, y se producen fallos cuando el tejido implantado, que no se ha diferenciado en esas condiciones, carece de capacidad para responder de forma apropiada. Por ejemplo, cuando el cartilago del menisco se usa para reparar ligamentos cruzados anteriores, el tejido experimenta una metaplasia a tejido fibroso puro. Regulando la tasa de condrogenesis, el presente procedimiento se puede usar para hacer frente a este problema particularmente, ayudando a controlar adaptativamente las celulas implantadas en el nuevo entorno y a que se parezcan eficazmente a los condrocitos hipertroficos de un estado de desarrollo mas temprano del tejido.

De manera similar, el presente procedimiento se puede aplicar para potenciar tanto la generation de dispositivos protesicos de cartilago como para su implantation. La necesidad de un tratamiento mejorado ha motivado la investigation dirigida a crear nuevo cartilago que se basa en moldes de colageno-glucosaminoglicano (Stone et al. (1990) Clin Orthop Relat Red 252:129), condrocitos aislados (Grande et al. (1989) J Orthop Res 7:208; yTakigawa et al. (1987) Bone Miner 2:449), y condrocitos unidos a polimeros naturales o sinteticos (Walitani et al. (1989) J Bone Jt Surg 71B:74; Vacanti et al. (1991) Plast Reconstr Surg 88:753; von Schroeder et al. (1991) J Biomed Mater Res 25:329; Freed et al. (1993) J Biomed Mater Res 27:11; y Vacanti et al. patente de EE. UU. n.° 5.041.138). Por ejemplo, los condrocitos se pueden cultivar en cultivo sobre estructuras altamente porosas biodegradables y biocompatibles, formadas de polimeros tales como acido poliglicolico, acido polilactico, gel de agarosa u otros polimeros que se degradan con el tiempo en funcion de la hidrolisis de la cadena principal del polimero en monomeros inocuos. Las matrices estan disehadas para permitir el intercambio adecuado de nutrientes y gases con las celulas hasta que se produzca el injerto. Las celulas se pueden cultivar in vitro hasta que se hayan desarrollado el volumen celular y la densidad adecuados para las celulas a implantarse. Una ventaja de las matrices es que se pueden conformar o moldear con una forma deseada en una base individual, de modo que el producto final se parezca mucho a la oreja o nariz del propio paciente (a modo de ejemplo), o se pueden usar matrices flexibles que permitan la manipulation en el momento de la implantacion, como en una articulation.

En un modo de realizacibn del presente procedimiento, los implantes se ponen en contacto con un antagonista de hedgehog durante ciertas fases del procedimiento de cultivo para controlar la tasa de diferenciacion de los condrocitos y la formation de condrocitos hipertroficos en el cultivo.

En otro modo de realizacion, el dispositivo implantado se trata con un antagonista de hedgehog para remodelar activamente la matriz implantada y para hacer que sea mas adecuada para su funcion pretendida. Como se expone anteriormente con respecto a trasplantes de tejidos, los trasplantes artificiales tienen la misma deficiencia de no proceder de un entorno que sea comparable con el entorno mecanico real en el que se implanta la matriz. La capacidad de regular los condrocitos en la matriz por el presente procedimiento puede permitir que el implante adquiera caracteristicas similares al tejido que pretende sustituir.

En otro modo de realizacion, el presente procedimiento se usa para potenciar la unibn de dispositivos protesicos. Para ilustrarlo, el presente procedimiento se puede usar en la implantacion de una protesis periodontal, en la que el tratamiento del tejido conjuntivo adyacente estimula la formacion de ligamento periodontal alrededor de la protesis.

En otros modos de realizacion mas, el presente procedimiento se puede emplear como parte de un regimen para la generacion de hueso (osteogenesis) en un sitio en el animal en el que dicho tejido esqueletico esta defectuoso. Indian hedgehog esta asociado particularmente con los condrocitos hipertroficos que fmalmente se sustituyen por osteoblastos. Por ejemplo, se puede emplear la administration de un antagonista de hedgehog de la presente invencion como parte de un procedimiento para regular la tasa de disminucion de la masa osea en un sujeto. Por ejemplo, se pueden emplear preparaciones que comprenden antagonistas de hedgehog, por ejemplo, para controlar la osificacion endocondral en la formacion de un "modelo" para la osificacion.

En otro modo de realizacibn de la presente divulgacion, se puede usar un antagonista de hedgehog para regular la espermatogenesis. Se ha demostrado que las proteinas hedgehog, particularmente Dhh, estan implicadas en la diferenciacion y/o proliferacion y mantenimiento de las celulas germinales testiculares. La expresion de Dhh se inicia en precursores de celulas de Sertoli poco despues de la activacion de Sry (gen de determinacion testicular) y persiste en los testiculos en el adulto. Los sujetos masculinos son viables pero esteriles, debido a una ausencia completa de espermatozoides maduros. El examen de los testiculos en desarrollo en diferentes fondos geneticos sugiere que Dhh regula las fases tanto tempranas como tardias de la espermatogenesis. Bitgood et al. (1996) Curr Biol 6:298. En un modo de realizacibn preferente, el antagonista de hedgehog se puede usar como un anticonceptivo. De manera similar, los antagonistas de hedgehog del presente procedimiento son potencialmente utiles para modular la funcion ovarica normal.

El presente procedimiento tambien tiene un amplio campo de aplicacion para el tratamiento o proftlaxis de trastornos

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que afectan al tejido epitelial, asi como en usos cosmeticos. En general, el procedimiento se puede caracterizar por incluir una etapa de administracion, a un animal, de una cantidad de antagonista de hedgehog eficaz para alterar el estado de crecimiento de un tejido epitelial tratado. El modo de administracion y las pautas posologicas variaran dependiendo del tejido o tejidos epiteliales que se tienen que tratar. Por ejemplo, las formulaciones topicas seran preferentes cuando el tejido tratado sea tejido epidermico, tal como tejido dermico o de la mucosa.

Un procedimiento que "promueve la curacibn de una herida" da como resultado una curacibn de la herida, como resultado del tratamiento, mas rapidamente de lo que una herida similar se cura en ausencia del tratamiento. La "promocion de la curacion de heridas" tambien puede significar que el procedimiento regula la proliferacion y/o el crecimiento, inter alia, de queratinocitos, o que la herida se cure con menos cicatrices, menos contraccion de la herida, menos deposicion de colageno y mas extension superficial. En ciertos casos, la ’’promocion de la curacion de heridas" tambien puede significar que ciertos procedimientos de curacion de heridas tienen tasas mejoradas de exito (por ejemplo, las tasas de aceptacion de injertos de piel) cuando se usan junto con el procedimiento de la presente divulgacion.

A pesar de los importantes avances en las tecnicas quirurgicas de reconstruccion, la cicatrizacion puede ser un obstaculo importante en la recuperacion de la funcion normal y el aspecto de la piel que se ha curado. Esto es particularmente cierto cuando la cicatrizacion patologica tal como queloides o cicatrices hipertroficas de las manos o la cara provoca una discapacidad funcional o deformidad fisica. En las circunstancias mas graves, dicha cicatrizacion puede precipitar el sufrimiento psicosocial y una vida de carencias economicas. La curacion de heridas incluye las fases de hemostasia, inllamacion, proliferacion y remodelado. La fase proliferativa implica la multiplicacion de fibroblastos y celulas endoteliales y epiteliales. A traves del uso del presente procedimiento, se puede controlar la tasa de proliferacion de las celulas epiteliales en y proximales a la herida para acelerar el cierre de la herida y/o minimizar la formacion de tejido cicatricial.

El presente tratamiento tambien puede ser eficaz como parte de un regimen terapeutico para tratar ulceras orales y paraorales, por ejemplo, resultantes de radiacion y/o quimioterapia. Dichas ulceras se desarrollan comunmente en cuestion de dias despues de la quimioterapia o la radioterapia. Estas ulceras comienzan habitualmente como lesiones pequehas, dolorosas y con forma irregular, habitualmente cubiertas por una membrana nicrotica gris delicada y rodeadas por tejido inflamatorio. En muchos casos, la ausencia de tratamiento da como resultado la proliferacion de tejido alrededor de la periferia de la lesion sobre una base inflamatoria. Por ejemplo, el epitelio que delimita la ulcera nomnalmente demuestra actividad proliferativa, lo que da como resultado la perdida de continuidad del epitelio de la superficie. Estas lesiones, debido a su tamano y la perdida de integridad epitelial, predisponen el organismo a infecciones secundarias potenciales. La ingestion rutinaria de alimentos y agua se convierte en un acontecimiento muy doloroso y, si las ulceras proliferan por todo el tubo digestivo, generalmente aparece diarrea con todos sus factores de complicacion. De acuerdo con la presente divulgacion, un tratamiento para dichas ulceras que incluye la aplicacion de un antagonista de hedgehog puede reducir la proliferacion y diferenciacion anomala del epitelio afectado, ayudando a reducir la gravedad de los episodios inflamatorios posteriores.

El presente procedimiento y las composiciones tambien se pueden usar para tratar heridas resultantes de enfermedades dermatolbgicas, tales como lesiones resultantes de trastornos autoin mu nitarios tales como la soriasis. La dermatitis atopica se refiere a traumatismo de la piel resultante de alergias asociadas con una respuesta inmunitaria provocada por alergenos tales como polenes, alimentos, caspa, venenos de insectos y toxinas de plantas.

En otros modos de realizacion, se pueden usar preparaciones antiproliferativas de antagonistas de hedgehog para inhibir la proliferacion de celulas epiteliales en el cristalino para evitar las complicaciones posoperatorias de la extraccion extracapsular de cataratas. Las cataratas son una enfermedad intratable del ojo y se han hecho diversos estudios sobre el tratamiento de las cataratas. Pero en la actualidad, el tratamiento de las cataratas se logra por operaciones quirurgicas. La cirugia de cataratas se ha aplicado desde hace mucho tiempo y se han examinado diversos procedimientos operatorios. La extraccion extracapsular del cristalino se ha convertido en el procedimiento elegido para la eliminacion de cataratas. Las principales ventajas medicas de esta tecnica sobre la extraccion intracapsular son una menor incidencia de edema macular cistoide afbquico y de desprendimiento de la retina. Tambien se requiere extraccion extracapsular para la implantacion de lentes intraoculares de tipo camara posterior, que ahora se considera que son las lentes elegidas en la mayoria de los casos.

Sin embargo, una desventaja de la extraccion extracapsular de cataratas es la elevada incidencia de opacificacion de la capsula posterior del cristalino, a menudo llamada catarata secundaria, que se puede producir hasta en el 50 % de los casos en tres anos despues de la cirugia. La catarata secundaria esta provocada por la proliferacion de celulas epiteliales de la capsula ecuatorial y anterior del cristalino que permanecen despues de la extraccion extracapsular del cristalino. Estas celulas proliferan provocando anillos de Sommerling, y junto con los fibroblastos, que tambien se depositan y se producen en la capsula posterior, provocan la opacificacibn de la capsula posterior, lo que impide la vision. Seria preferente la prevencion de la catarata secundaria sobre el tratamiento. Para inhibir la formacion de la catarata secundaria, el presente procedimiento proporciona un medio para inhibir la proliferacion de las celulas epiteliales restantes del cristalino. Por ejemplo, se puede inducir que dichas celulas permanezcan en reposo instilando una solucion que contiene una preparacion de antagonista de hedgehog en la camara anterior del ojo despues de la retirada del cristalino. Ademas, la solucion se puede equilibrar osmoticamente para proporcionar la dosificacion eficaz minima cuando se instila en la camara anterior del ojo, inhibiendo de este modo el crecimiento

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epitelial subcapsular con cierta especificidad.

El presente procedimiento tambien se puede usar en el tratamiento de comeopatias caracterizadas por la proliferacion de celulas epiteliales de la cornea, como por ejemplo, en trastomos epiteliales oculares tales como deficiencia de crecimiento epitelial o carcinomas escamocelulares de la superficie ocular.

Levine et al. (1997) J Neurosci 17: 6277 muestran que las proteinas hedgehog pueden regular la mitogenesis y la diferenciacion de fotorreceptores en la retina de vertebrados, y Ihh es un factor candidato del epitelio pigmentado para promover la proliferacibn de progenitores de la retina y la diferenciacion de fotorreceptores. Del mismo modo, Jensen et al. (1997) Development 124: 363 demostraron que el tratamiento de cultivos de celulas perinatales de retina de raton con el fragment© amino-terminal de la proteina Sonic hedgehog da como resultado un aumento de la proporcibn de celulas que incorporan bromodesoxiuridina, en numeros totales de celulas, y en fotorreceptores de los bastones, celulas amacrinas y celulas gliales de Muller, lo que sugiere que Sonic hedgehog promueve la proliferacion de celulas precursors de la retina. Por lo tanto, el presente procedimiento se puede usar en el tratamiento de enfermedades proliferativas de celulas de la retina y para regular la diferenciacion de los fotorreceptores.

Otro aspecto mas de la presente divulgacion se refiere a la utilizacion del presente procedimiento para controlar el crecimiento del pelo. El pelo esta compuesto basicamente de queratina, una proteina resistente e insoluble; su principal fortaleza radica en su enlace disulfuro de cistina. Cada pelo individual comprende un eje cilindrico y una raiz, y esta contenido en un foliculo, una depresion de tipo matraz en la piel. La parte inferior del foliculo contiene una proyeccion similar a un dedo denominada la papila, que consiste en tejido conjuntivo desde el que crece el pelo y a traves del que los vasos sanguineos suministran alimento a las celulas. El eje es la parte que se extiende hacia fuera desde la superficie de la piel, mientras que la raiz se ha descrito como la parte oculta del pelo. La base de la raiz se expande en el interior del bulbo piloso, que descansa sobre la papila. Las celulas que producen el pelo crecen en el bulbo del foliculo; experimentan extrusion en forma de fibras a medida que las celulas proliferan en el foliculo. "Crecimiento" del pelo se refiere a la formacion y alargamiento de la fibra capilar por las celulas en division.

Como se sabe bien en la tecnica, el ciclo comun del pelo se divide en tres fases: anageno, catageno y telogeno. Durante la fase activa (anageno), las cblulas madre epidermicos de la papila dermica se dividen de forma rapida. Las celulas hijas se mueven hacia arriba y se diferencian para formar las capas concentricas del propio pelo. La etapa de transicion, catageno, se caracteriza por el cese de la mitosis de las celulas madre en el foliculo. La fase de reposo se conoce como telogeno, en la que el pelo se mantiene dentro del cuero cabelludo durante varias semanas antes de que un nuevo pelo emergente que se desarrolla por debajo desprenda el eje en la fase telogeno de su foliculo. A partir de este modelo ha quedado claro que cuanto mayor sea la combinacion de celulas madre en division que se diferencian en celulas capilares, mayor crecimiento capilar se produce. En consecuencia, los procedimientos para aumentar o reducir el crecimiento capilar se pueden llevar a cabo potenciando o inhibiendo, respectivamente, la proliferacion de estas celulas madre.

En ciertos modos de realizacion, el presente procedimiento se puede emplear como una forma de reduccibn del crecimiento del pelo humano en oposicion a su eliminacion convencional por code, afeitado o depilacion. Por ejemplo, el presente procedimiento se puede usar en el tratamiento de tricosis caracterizada por un crecimiento anomalamente rapido o denso del pelo, por ejemplo, hipertricosis. En un modo de realizacion ejemplar, se pueden usar antagonistas de hedgehog para tratar el hirsutismo, un trastorno caracterizado por vellosidad excesiva anomala. El presente procedimiento tambien puede proporcionar un procedimiento para prolongar la duracion de la depilacion.

Ademas, debido a que el antagonista de hedgehog a menudo sera citostatico para las celulas epiteliales, en lugar de citotoxico, dichos agentes se pueden usar para proteger las celulas del foliculo piloso de los agentes citotoxicos que requieren el avance a la fase S del ciclo celular para su eficacia, por ejemplo, muerte inducida por radiacion. El tratamiento por el presente procedimiento puede proporcionar proteccion provocando que las celulas del foliculo piloso se vuelvan quiescentes, por ejemplo, inhibiendo la entrada de las celulas en la fase S, y evitando de este modo que las celulas del foliculo experimenten catastrofe mitotica o muerte celular programada. Por ejemplo, se pueden usar antagonistas de hedgehog para pacientes sometidos a quimioterapia o radioterapia, que normalmente da como resultado la perdida de pelo. Inhibiendo la progresion del ciclo celular durante dichos tratamiento, el presente tratamiento puede proteger las celulas del foliculo piloso de la muerte que, de lo contrario, podria ser el resultado de la activacion de programas de muerte celular. Despues de que el tratamiento haya concluido, tambien se puede interrumpir el presente procedimiento con un alivio concomitante de la inhibicion de la proliferacion de las celulas del foliculo.

El presente procedimiento tambien se puede usar en el tratamiento de foliculitis, tales como foliculitis decalvante, foliculitis uleritematosa reticulada o foliculitis queloide. Por ejemplo, se puede aplicar una preparacion cosmetica de un antagonista de hedgehog de forma tbpica en el tratamiento de la pseudofoliculitis, un trastorno cronico que se produce con mayor frecuencia en la region submandibular del cuello y esta asociado con el afeitado, cuyas lesiones caracteristicas son papulas eritematosas y pustulas que contienen pelos enquistados.

En otro aspecto de la divulgacion, el presente procedimiento se puede usar para inducir la diferenciacion y/o para inhibir la proliferacion de tejido derivado del epitelio. Dichas formas de estas moleculas pueden proporcionar una base para el tratamiento de diferenciacion para el tratamiento de afecciones hiperplasicas y/o neoplasicas que implican

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tejido epitelial. Por ejemplo, dichas preparaciones se pueden usar para el tratamiento de enfermedades cutaneas en las que hay una proliferacion o crecimiento anomalo de celulas de la piel.

Por ejemplo, las preparaciones farmaceuticas de la divulgacion estan destinadas al tratamiento de enfermedades epidermicas hiperplasicas, tales como queratosis, ast como para el tratamiento de afecciones epidermicas neoplasicas tales como las caracterizadas por una alta tasa de proliferacion en diversos canceres de la piel, como por ejemplo, carcinoma escamocelular. El presente procedimiento tambien se puede usar en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias que afectan a la piel, en particular, de enfermedades dermatologicas que implican una proliferacion patologica y/o queratinizacion de la epidermis, como por ejemplo, las provocadas por soriasis o dermatosis atopicas.

Muchas enfermedades comunes de la piel, tales como soriasis, carcinoma escamocelular, queratoacantoma y la queratosis actinica se caracterizan por una proliferacion y crecimiento anomalos y localizados. Por ejemplo, en la soriasis, que se caracteriza por placas escamosas, rojas y elevadas en la piel, se sabe que los queratinocitos proliferan mucho mas rapidamente de lo normal y no se diferencian completamente.

En un modo de realizacion, las preparaciones de la presente divulgacion son adecuadas para el tratamiento de dolencias dermatologicas ligadas a trastornos de la queratinizacion que provocan la proliferacion anomala de celulas de la piel, que pueden ser trastornos caracterizados por componentes inflamatorios o no inflamatorios. Para ilustrarlo, se pueden usar preparaciones terapeuticas de un antagonista de hedgehog, por ejemplo, que promueven la quiescencia o la diferenciacion, para tratar formas variadas de soriasis, ya sean cutaneas, de la mucosa o ungueales. La soriasis, como se describe anteriormente, se caracteriza tipicamente por queratinocitos epidermicos que presentan una marcada activacion proliferativa y diferenciacion a lo largo de una ruta “regenerativa". Se puede usar el tratamiento con un modo de realizacion antiproliferativo del presente procedimiento para revertir la activacion epidermica patologica y poder proporcionar una base para una remision sostenida de la enfermedad.

Una diversidad de otras lesiones queratosicas son tambien candidatos para el tratamiento con el presente procedimiento. Las queratosis actinicas, por ejemplo, son tumores premalignos inflamatorios superficiales que surgen en la piel expuesta al sol y a la radiacion. Las lesiones son desde eritematosas hasta un color marron con descamacion variable. Los tratamientos actuales incluyen cirugia de escision y criocirugia. Sin embargo, estos tratamientos son dolorosos y a menudo producen cicatrizacion cosmeticamente inaceptable. En consecuencia, el tratamiento de la queratosis, tal como la queratosis actinica, puede incluir la aplicacion, preferentemente topica, de una composicion de antagonista de hedgehog en cantidades suficientes para inhibir la hiperproliferacion de las celulas epidermicas/epidermoides de la lesion.

El acne representa otra dolencia dermatologica que se puede tratar por el presente procedimiento. El acne vulgar, por ejemplo, es una enfermedad multifactorial que se produce con mayor frecuencia en adolescentes y adultos jovenes, y se caracteriza por la aparicion de lesiones inflamatorias y no inflamatorias en la cara y la parte superior del tronco. El defecto basico que da lugar al acne vulgar es la hiperqueratinizacion del conducto de una glandula sebacea hiperactiva. La hiperqueratinizacion bloquea la movilidad normal de la piel y los microorganismos del foliculo, y al hacerlo, estimula la liberacion de lipasas por las bacterias Propinobacterium acnes y Staphylococcus epidermidis y Pitrosporum ovale, una levadura. El tratamiento con un antagonista de hedgehog antiproliferativo, particularmente en preparaciones topicas, puede ser util para evitar las caracteristicas transitorias de los conductos, por ejemplo, la hiperqueratinizacion, que conduce a la formation de lesiones. El presente tratamiento puede incluir. ademas. por ejemplo, antibioticos, retinoides y antiandrogenos.

La presente divulgacion tambien proporciona un procedimiento para tratar diversas formas de dermatitis. La dermatitis es un termino descriptivo que se refiere a lesiones escasamente definidas que son pruriginosas, eritematosas, escamosas, bullosas, acuosas, fisuradas o costrosas. Estas lesiones surgen por cualquiera de una amplia diversidad de causas. Los tipos mas comunes de dermatitis son la dermatitis atopica, dermatitis de contacto y dermatitis del panal. Por ejemplo, la dermatitis seborreica es una dermatitis cronica, habitualmente pruriginosa con eritema, descamacion seca, humeda o grasa, y parches con costra amarilla en diversas areas, especialmente en el cuero cabelludo, con exfoliacibn de una cantidad excesiva de escamas secas. El presente procedimiento tambien se puede usar en el tratamiento de la dermatitis por estasis, una dermatitis a menudo cronica, normalmente eczematosa. La dermatitis actinica es dermatitis debida a la exposition a radiacion actinica tal como la del sol. las ondas ultravioleta, o radiacion x o gamma. De acuerdo con la presente divulgacion, el presente procedimiento se puede usar en el tratamiento y/o prevention de ciertos sintomas de la dermatitis causada por la proliferacion no deseada de celulas epiteliales. Dichos tratamientos para estas diversas formas de dermatitis tambien pueden incluir corticoesteroides topicos y sistemicos, antipruriticos y antibioticos.

Las dolencias que se pueden tratar por el presente procedimiento son trastornos especificos para animales no humanos, tales como la sarna.

En otro modo de realizacion mas, el presente procedimiento se puede usar en el tratamiento de canceres humanos, tales como tumores de tejidos epiteliales, tales como la piel. Por ejemplo, se pueden emplear antagonistas de hedgehog en el presente procedimiento como parte de un tratamiento para carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas y similares en seres humanos.

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En otro aspecto, la presente invencion proporciona preparaciones farmaceuticas que comprenden antagonistas de hedgehog. Los antagonistas de hedgehog para su uso en el presente procedimiento se pueden formular convenientemente para su administracion con un medio biologicamente aceptable, tal como agua, solucion salina tamponada, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol liquido y similares) o mezclas adecuadas de los mismos. La concentracion optima del principio o principios activos en el medio elegido se puede determinar empiricamente, de acuerdo con procedimientos bien conocidos por los quimicos de medicamentos. Como se usa en el presente documento, "medio biologicamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion y similares que pueden ser apropiados para la ruta de administracion deseada de la preparacion farmaceutica. El uso de dichos medios para sustancias farmaceuticamente activas es conocido en la tecnica. Salvo en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con la actividad del antagonista de hedgehog, se contempla su uso en la preparacion farmaceutica de la invencion. Se describen vehiculos adecuados y su formulacion incluyendo la de otras proteinas, por ejemplo, en el libro Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, Easton, Pa., EE. UU. 1985). Estos vehiculos incluyen "formulaciones de deposito" inyectables.

Las formulaciones farmaceuticas de la presente divulgacion tambien pueden incluir composiciones veterinarias, por ejemplo, preparaciones farmaceuticas de antagonistas de hedgehog adecuadas para usos veterinarios, por ejemplo, para el tratamiento de ganado o animales domesticos, por ejemplo, perros.

Los procedimientos de introduccion tambien se pueden proporcionar por dispositivos recargables o biodegradables. Se han desarrollado diversos dispositivos polimericos de liberacion lenta y se han sometido a prueba in vivo en los ultimos afios para el suministro controlado de farmacos, incluyendo productos biofarmaceuticos proteicos. Se puede usar una diversidad de polimeros biocompatibles (incluyendo hidrogeles), incluyendo polimeros tanto biodegradables como no degradables, para formar un implante para la liberacion sostenida de un antagonista de hedgehog en un sitio diana particular.

Las preparaciones de la presente invencion se pueden administrar por via oral, parenteral, topica o rectal. Por supuesto, se administran por formas adecuadas para cada ruta de administracion. Por ejemplo, se administran en forma de comprimidos o capsulas, por inyeccidn, inhalacion, locion ocular, pomada, supositorio, parche de liberacion controlada, etc., administracion por inyeccion, infusion o inhalacion; topica por locion o pomada; y rectal por supositorios. Son preferentes las administraciones orales y topicas.

Las expresiones "administracion parenteral" y "administrado parenteralmente", como se usan en el presente documento, significan modos de administracion distintos de la administracion enteral y topica, normalmente por inyeccidn, e incluyen, sin limitacion, inyeccidn e infusion intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermica , intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal y intraesternal.

Las expresiones "administracion sistemica", "administrado sistemicamente", "administracion periferica" y "administrado perifericamente", como se usan en el presente documento, significan la administracion de un compuesto, farmaco u otro material que no sea directamente al sistema nervioso central, de tal manera que entre en el sistema del paciente y, por lo tanto, esta sometida al metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, administracion subcutanea.

Estos compuestos se pueden administrar a seres humanos y otros animales para su tratamiento por cualquier ruta de administracion adecuada, incluyendo la ruta oral, nasal, como por, por ejemplo. un pulverizador, por ruta rectal, intravaginal, parenteral, intracisternal y topica, como por polvos, pomadas o gotas, incluyendo por ruta bucal y sublingual.

Independientemente de la ruta de administracion seleccionada, los compuestos de la invencion, que se pueden usar en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, se formulan en formas de dosificacion farmaceuticamente aceptables, tal como se describe a continuacion o por otros procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la tecnica.

Se pueden variar los niveles de dosificacion reales de los principios activos en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion con el fin de obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapeutica deseada para un paciente, una composicion y un modo de administracion particulares, sin que sea toxica para el paciente.

El nivel de dosificacion seleccionado dependera de una diversidad de factores incluyendo la actividad del compuesto particular de la presente invencion empleado, o el ester, sal o amida del mismo, la ruta de administracion, el tiempo de administracion, la tasa de excrecion del compuesto particular que se esta empleando, la duracion del tratamiento, otros farmacos, los compuestos y/o materiales usados en combinacion con el antagonista de hedgehog particular empleado, la edad, el genero, el peso, el estado, la salud general y el historial medico previo del paciente que se esta tratando, y factores similares bien conocidos en la tecnica.

Un medico o veterinario que sea experto en la tdcnica puede determinar y prescribir facilmente la cantidad eficaz de la composicion farmaceutica requerida. Por ejemplo, el medico o veterinario podria comenzar las dosis de los

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compuestos de la invencion empleados en la composicion farmaceutica a niveles mas bajos de lo que se requiere para oonseguir el efecto terapeutico deseado e incrementar gradualmente la dosificacion hasta que se consiga el efecto deseado.

En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de la invencion sera esa cantidad del compuesto que es la dosis mas baja eficaz para producir un efecto terapeutico. Dicha dosis eficaz dependera, en general, de los factores descritos anteriormente. En general, las dosis intravenosas, intracerebroventriculares y subcutaneas de los compuestos de la presente invencion para un paciente variaran de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal al dia.

Si se desea, la dosis diaria eficaz del compuesto activo se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas subdosis administradas por separado a intervalos apropiados durante todo el dia, opcionalmente, en formas de dosificacion unitarias.

Se pretende que el termino "tratamiento" englobe tambien profilaxis, tratamiento y cura.

El paciente que recibe este tratamiento es cualquier animal que lo necesite, incluyendo primates, en particular seres humanos, y otros mamiferos tales como equinos, vacas, cerdos y ovejas; y aves de corral y mascotas en general.

El compuesto de la invencion se puede administrar como tal o en mezclas con vehiculos farmaceuticamente aceptables y/o esteriles y tambien se puede administrar junto con otros agentes antimicrobianos tales como penicilinas, cefalosporinas, aminoglucosidos y glucopeptidos. El tratamiento conjunto, por lo tanto, incluye ta administracion secuencial, simultanea y separada del compuesto activo de tal manera que los efectos terapeuticos del primero que se administra no hayan desaparecido completamente cuando se administra el siguiente.

V. Farmacogenomica

La capacidad de evaluar rapidamente la expresion genica en pacientes resulta prometedora para cambiar radicalmente el medio por el que el medico selecciona una sustancia farmaceutica apropiada para tratar una enfermedad particular. Se pueden obtener perfiles de expresion genica de tejido enfermo y se pueden seleccionar las medidas terapeuticas basandose en el perfil de expresion genica. Esta metodologia es particularmente eficaz cuando se conoce el mecanismo molecular de action para una sustancia terapeutica dada. En otras palabras, si un agente antitumoral actua inhibiendo una oncoproteina particular, es deseable saber si un cancer particular expresa ese oncogen antes de intentar tratar el cancer con el agente antitumoral. A medida que el perfil de expresion se vuelve mas rapido, mas barato y mas fiable, dicha informacion puede llegar a ser una parte rutinaria de la selection del tratamiento, minimizando los protocolos de tratamiento infructuosos y permitiendo la aplicacion mas rapida de los tratamientos apropiados.

Ademas, si un grupo de pacientes que padecem un cierto tipo de trastorno se puede segregar en subgrupos basandose en los perfiles de expresion genica, se pueden volver a someter a prueba los farmacos para su capacidad de afectar a estos subgrupos definidos de pacientes. Por lo tanto, los farmacos que parecian ineficaces en el grupo de pacientes como un conjunto, ahora pueden resultar utiles para los subgrupos de pacientes. Este tipo de cribado puede permitir la recuperation de compueslos fallidos, la identificacion de nuevos compuestos y la identificacion de nuevos usos para compuestos bien conocidos.

La expresion de un gen particular se puede evaluar de muchas maneras. Se puede determinar el nivel de transcrito genico o el nivel de proteina codificada. La presencia de una proteina se puede determinar directamente, a traves de procedimientos tales como la union de anticuerpos, espectroscopia de masas y electroforesis en gel bidimensional, o indirectamente, detectando una actividad de la proteina, ya sea una actividad bioquimica o un efecto sobre los niveles de otra proteina o la expresion de uno o mas genes.

Los procedimientos para medir los niveles de transcritos genicos son bien conocidos en la tecnica y dependen, en su mayor parte, de la hibridacion de una sonda monocatenaria con el transcrito en cuestion (o un ADNc del mismo). Dichos procedimientos incluyen transferencia de Northern, que usa una sonda marcada, o amplificacion por PCR del ADNc (tambien conocido como RT-PCR). Los ARNm y ADNc se pueden marcar de acuerdo con diversos procedimientos y se pueden hibridar a una serie de oligonucleotidos. Dichas series pueden contener sondas ordenadas correspondientes a uno o mas genes, y en modos de realization preferentes, la serie contiene sondas correspondientes a todos los genes del genoma del organismo del que se obtuvo el ARN.

Actualmente se usan varias metodologias para la medicion de la expresion genica. La mas sensible de estas metodologias utiliza la tecnica de reaction en cadena de la polimerasa (PCR), cuyos detalles se proporcionan en la patente de EE. UU. n 0 4.683.195; patente de EE. UU. n 0 4.683.202 y patente de EE. UU. n.° 4.965.188, todas de Mullis et al. Los detalles de la tecnologia de PCR, por lo tanto, no se incluyen en el presente documento. Recientemente, se han descrito tecnologias adicionales para la amplificacion de acidos nucleicos, que se basan, la mayoria de ellos, en estrategias de amplificacion isotermica, al contrario que el termociclado requerido para PCR. Estas estrategias incluyen, por ejemplo, amplificacion por desplazamiento de hebra (SDA) (patentes de EE. UU. n.° 5.455.166 y 5.457.027 ambas de Walker; Walker et al. (1992) PNAS 89; 392) y amplificacion basada en secuencias de acidos nucleico (NASBA) (patente de EE. UU. n.° 5.130.238 de Malek et al.; patente europea 525.882 de Kievits et

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Hasta hace poco, la amplificacion de ARN requeria una etapa adicional, por separado y el uso de enzimas transcriptasa inversa no termoestables para generar un ADNc susceptible a amplificacion por una ADN polimerasa termoestable, tal como Taq. El descubrimiento de una enzima termoestable recombinante (rTth) capaz de acoplar la transcripcion inversa del ARN con la amplificacion de ADN en una unica enzima:unico procedimiento de reaccion simplified enormemente y potencio la amplificacion de ARN (vease, Myers y Gelfand (1991) Biochemistry 30: 7661-7666, patente de EE. UU. n.° 5.407.800 de Gelfand y Myers).

En el analisis de la expresion genica con microseries, una serie de oligonucleotidos de "sonda" se pone en contacto con una muestra de acido nucleico de interes, es decir, diana, tal como ARNm poliA de un tipo de tejido particular. El contacto se lleva a cabo en condiciones de hibridacion y despues se retira el acido nucleico no unido. El patron resultante de acido nucleico hibridado proporciona informacion sobre el perfil genetico de la muestra sometida a prueba. El analisis de expresion genica encuentra uso en una diversidad de aplicaciones, incluyendo: la identificacion de novedosas expresiones genicas, la correlacion de la expresion genica con un fenotipo particular, la deteccion de predisposicibn a una enfermedad, la identificacion del efecto de un agente particular sobre la expresion genica celular, tal como en pruebas de toxicidad; entre otras aplicaciones. Los procedimientos detallados para analizar los niveles de transcritos se describen en las siquientes patentes: patente de EE. UU. n.° 5.082.830 y documento WO 97/27317.

Otras referencias de interes incluyen: Schena et al., Science (1995) 467-470; Schena et al., P.N.A.S. U.S.A. (1996) 93: 10614-10616; Pietu et al., Genome Res. (junio de 1996) 6: 492-503; Zhao et al., Gene (abr. 24, 1995) 156: 207-213; Soares, Curr. Opin. Biotechnol. (octubre de 1997) 8: 542-546; Raval, J. Pharmacol Toxicol Methods (noviembre de 1994) 32: 125-127; Chalifour et al., Anal. Biochem (feb. 1, 1994) 216: 299-304; Stolz & Tuan, Mol. Biotechnol. (diciembre de 1996) 6: 225-230; Hong et al., Bioscience Reports (1982) 2: 907; y McGraw, Anal. Biochem. (1984) 143: 298.

VI. Composiciones farmaceuticas

Aunque es posible administrar un compuesto de la presente invencion en solitario, es preferente administrar el compuesto como una formulacion farmaceutica (composicion). Los antagonistas de hedgehog de acuerdo con la invencion se pueden formular para su administracion de cualquier manera conveniente para su uso en medicina veterinaria o de seres humanos. En ciertos modos de realization, el compuesto incluido en la preparation farmaceutica puede ser activo por si mismo, o puede ser un profarmaco, por ejemplo, susceptible a convertirse en un compuesto activo en un entorno fisiologico.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente invencion proporciona composiciones farmaceuticamente aceptables que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de uno o mas de los compuestos descritos anteriormente, formulados junto con uno o mas vehiculos (aditivos) y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables. Como se describe en detalle a continuacion, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se pueden formular especialmente para su administracion en forma solida o liquida, incluyendo las adaptadas para lo siguiente: (1) administracion oral, por ejemplo, pociones (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), comprimidos, bolos, polvos, granulos, pastas para aplicacion lingual; (2) administracion parenteral, por ejemplo, por inyeccion subcutanea, intramuscular o intravenosa como, por ejemplo, una solution o suspension esteril; (3) aplicacion topica, por ejemplo, como una crema, pomada o pulverizador aplicado a la piel; o (4) por ruta intravaginal o intrarrectal, por ejemplo, como un pesario, crema o espuma. Sin embargo, en ciertos modos de realizacion los presentes compuestos se pueden disolver o suspender simplemente en agua esteril. En ciertos modos de realizacion, la preparacion farmaceutica es no pirogena, es decir, no eleva la temperatura corporal del paciente.

La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, signifies la cantidad de un compuesto, material o composicion que comprende un compuesto de la presente invencion que es eficaz para producir algun efecto terapeutico deseado superando un fenotipo de ganancia de funcion de hedgehog en al menos una subpoblacion de celulas en un animal y bloqueando de ese modo las consecuencias biologicas de esa ruta en las celulas tratadas, en una relation beneficio/riesgo razonable y aplicable a cualquier tratamiento medico.

La frase "farmaceuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a los compuestos, materiales, composiciones, y/o formas de dosificacion que son, dentro del alcance del juicio medico formal, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animates sin excesiva toxicidad, irritation, respuesta alergica u otro problema o complication, acorde con una proportion de beneficio/riesgo razonable.

La expresion "vehiculo farmaceuticamente aceptable" como se usa en el presente documento. significa un material, composicion o vehiculo farmaceuticamente aceptable, tal como una carga liquida o solida, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulado, implicado en portar o transportar los presentes antagonistas desde un organo, o parte del cuerpo, hasta otro organo, o parte del cuerpo. Cada vehiculo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulacion y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de

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materiales que pueden servir como vehiculos farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) azucares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidon de maiz y almidon de patata; (3) celulosa, y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sodica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon, aceite de cartamo, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de maiz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) esteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tales como hidroxido de magnesio e hidroxido de aluminio; (15) acido alginico; (16) agua libre de pirogenos; (17) solucion salina isotonica; (18) solucion de Ringer; (19) alcohol etilico; (20) soluciones de tampon fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no toxicas empleadas en formulaciones farmaceuticas.

Como se expone anteriormente, ciertos modos de realizacion de los presentes antagonistas de hedgehog pueden contener un grupo funcional basico, tal como amino o alquilamino, y son, por lo tanto, capaces de formar sales farmaceuticamente aceptables con acidos farmaceuticamente aceptables. La expresion "sales farmaceuticamente aceptables" en este sentido, se refiere a las sales de adicion de acidos inorganicos y organicos, relativamente no toxicos, de compuestos de la presente invencion. Estas sales se pueden preparar in situ durante el aislamiento y purificacion finales de los compuestos de la invencion, o haciendo reaccionar por separado un compuesto purificado de la invencion en su forma de base libre con un acido organico o inorganico adecuado, y aislando la sal formada de este modo. Las sales representativas incluyen las sales bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato, y laurilsulfonato y similares. (Vease, por ejemplo, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19).

Las sales farmaceuticamente aceptables de los presentes compuestos incluyen las sales no toxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario de los compuestos, por ejemplo, de acidos organicos o inorganicos no toxicos. Por ejemplo, dichas sales no toxicas convencionales incluyen las que se derivan de acidos inorganicos tales como clorhidrico, bromhidrico, sulfurico, sulfamico, fosforico, nitrico y similares; y las sales preparadas a partir de acidos organicos tales como acetico, propionico, succinico, glicolico, estearico, lactico, malico, tartarico, citrico, ascorbico, palmitico, maleico, hidroximaleico, fenilacetico, glutamico, benzoico, salicilico, sulfanilico, 2-acetoxibenzoico, fumarico, toluenosulfonico, metanosulfonico, etano disulfonico, oxalico, isetionico y similares.

En otros casos, los compuestos de la presente invencion pueden contener uno o mas grupos funcionales acidos y, por lo tanto, son capaces de formar sales farmaceuticamente aceptables con bases farmaceuticamente aceptables. La expresion "sales farmaceuticamente aceptables" en estos casos, se refiere a sales de adicion de bases inorganicas y organicas, relativamente no toxicas, de compuestos de la presente invencion. Estas sales se pueden preparar in situ asimismo durante el aislamiento y purificacion finales de los compuestos, o haciendo reaccionar por separado el compuesto purificado en su forma de acido libre con una base adecuada, tal como el hidroxido, carbonato o bicarbonato de un cation metalico farmaceuticamente aceptable, con amoniaco, o con una amina primaria, secundaria o terciaria organica farmaceuticamente aceptable. Las sales alcalinas o alcalinoterreas representativas incluyen las sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio y similares. Las aminas organicas representativas utiles para la formacion de sales de adicion de bases incluyen etilamina, dietilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina y similares. (Vease, por ejemplo, Berge et al., supra)

Tambien pueden estar presentes agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, asi como agentes colorantes, agentes de liberation, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y agentes perfumantes, conservantes y antioxidantes en las composiciones.

Los ejemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como acido ascorbico, clorhidrato de cisteina, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceites, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como acido citrico, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico, acido fosforico y similares.

Las formulaciones de la presente invencion incluyen las adecuadas para administration oral, nasal, topica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en una forma de dosificacion unitaria y se pueden preparar por cualquier procedimiento bien conocido en la tecnica de farmacia. La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material de vehiculo para producir una forma de dosificacion individual variara dependiendo del huesped que se este tratando y el modo particular de administracion. La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material de vehiculo para producir una forma de dosificacion individual, en general, es esa cantidad del compuesto que produce un efecto terapeutico. En general, de un cien por ciento, esta cantidad variara de aproximadamente un 1 por ciento a aproximadamente un noventa y nueve por ciento de principio activo, preferentemente de aproximadamente un 5 por ciento a aproximadamente un 70 por ciento, lo mas preferentemente de aproximadamente un 10 por ciento a aproximadamente un 30 por ciento.

Los procedimientos de preparation de estas formulaciones o composiciones incluyen la etapa asociar un compuesto de la presente invencion con el vehiculo y, opcionalmente, uno o mas ingredientes accesorios. En general, las

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formulaciones se preparan asociando uniforme e intimamente un compuesto de la presente invencion con vehiculos liquidos, o vehiculos solidos finamente divididos, o ambos, y despues, si es necesario, conformando el producto.

Las formulaciones de la invencion adecuadas para administracion oral pueden estar en forma de capsulas, obleas, pastillas, comprimidos, pastillas para chupar (usando una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arabiga o tragacanto), polvos, granulos, o como una solucion o una suspension en un liquido acuoso o no acuoso, o como una emulsion liquida de aceite en agua o de agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como obleas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arabiga) y/o como enjuagues bucales y similares, conteniendo cada una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invencion como principio activo, Un compuesto de la presente invencion tambien se puede administrar como un bolo intravenoso, electuario o pasta.

En las formas de dosificacion solidas de la invencion para administracion oral (capsulas, comprimidos, pastillas, grageas, polvos, granulos y similares), el principio activo se mezcla con uno o mas vehiculos farmaceuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato de dicalcio, y/o cualquiera de los siguientes: (1) cargas o diluyentes, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o acido silicico; (2) aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma ar&biga; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidon de patata o tapioca, acido alginico, ciertos silicatos y carbonato de sodio; (5) agentes que retardan la disolucion, tales como parafina; (6) aceleradores de la absorcion, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetilico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolin y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles solidos, lauril sulfato de sodio y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de capsulas, comprimidos y pastillas, las composiciones farmaceuticas tambien pueden comprender agentes tamponantes. Tambien se pueden emplear composiciones solidas de un tipo similar como cargas en capsulas duras o blandas rellenas de gelatina usando excipientes tales como lactosa o azucares de la leche, asi como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

Un comprimido se puede preparar por compresion o moldeo, opcionalmente con uno o mas ingredientes accesorios. Los comprimidos de compresion se pueden preparar usando un aglutinante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante (por ejemplo, glicolato sodico de almidon o carboximetilcelulosa sodica reticulada), agente tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando, en una maquina adecuada, una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente liquido inerte.

Los comprimidos y otras formas de dosificacion solidas de las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, tales como grageas, capsulas, pastillas y granulos, opcionalmente se pueden marcar o preparar con recubrimientos y envueltas, tales como recubrimientos entericos y otros recubrimientos bien conocidos en la tecnica de formulacion de sustancias farmaceuticas. Tambien se pueden formular de manera que proporcionen una liberacibn lenta o controlada del principio activo usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberation deseado, otras matrices polimericas, liposomas y/o microesferas. Se pueden esterilizar, por ejemplo, por filtration a traves de un filtro de retention de bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones solidas esteriles que se pueden disolver en agua esteril, o algun otro medio inyectable esteril inmediatamente antes de su uso. Estas composiciones tambien pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composition tal que liberen el principio o principios activos sola, o preferentemente, en una cierta parte del tubo gastrointestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusion que se pueden usar incluyen sustancias polimericas y ceras. El principio activo tambien puede estar en forma microencapsulada, si es apropiado, con uno o mas de los excipientes descritos anteriormente.

Las formas de dosificacion liquidas para administracion oral de los compuestos de la invencion incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmaceuticamente aceptables. Ademas del principio activo, las formas de dosificacion liquidas pueden contener diluyentes inertes usados comunmente en la tecnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etilico, alcohol isopropilico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencilico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodon, cacahuete, maiz, germen, oliva, ricino y sesamo), glicerol. alcohol tetrahidrofurilico. polietilenglicoles y esteres de acidos grasos de sorbitan, y mezclas de los mismos.

Ademas de diluyentes inertes, las composiciones orales tambien pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspension, edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y agentes conservantes.

Las suspensiones, ademas de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspension como, por ejemplo, alcoholes isoestearilicos etoxilados, polioxietilen sorbitol y esteres de sorbitan, celulosa microcristalina, metahidroxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.

Se sabe que los esteroles, tales como el colesterol, forman complejos con ciclodextrinas. Por lo tanto, en modos de realization preferentes, cuando el inhibidor es un alcaloide esteroideo, se puede formular con ciclodextrinas, tales como a-, p- y y-ciclodextrina, dimetil-P-ciclodextrina y 2-hidroxipropil-P-ciclodextrina.

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Las formulaciones de las composiciones farmaceuticas de la invencion para administracion rectal o vaginal se pueden presentar como un supositorio, que se puede preparar mezclando uno o mas compuestos de la invencion con uno o mas excipientes o vehiculos no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, una cera de supositorio o un salicilato, y que es solido a temperatura ambiente, pero liquido a la temperatura corporal y, por lo tanto, se fundira en el recto o la cavidad vaginal y liberara el antagonista de hedgehog activo.

Las formulaciones de la presente invencion que son adecuadas para administracion vaginal tambien incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverizador que contienen vehiculos tal como los conocidos en la tecnica por ser apropiados.

Las formas de dosificacion para la administracion topica o transdermica de un compuesto de la presente invencion incluyen polvos, pulverizadores, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhaladores. El compuesto activo se puede mezclar en condiciones esteriles con un vehiculo farmaceuticamente aceptable, y con cualquier conservante, tampon o propelente que pueda ser necesario.

Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, ademas de un compuesto activo de la presente invencion, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidon, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, acido silicico, talco y oxido de zinc, o mezclas de los mismos.

Los polvos y pulverizadores pueden contener, ademas de un compuesto de la presente invencion, excipientes tales como lactosa, talco, acido silicico, hidrdxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los pulverizadores pueden contener adicionalmente propelentes habituales, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volatiles no sustituidos, tales como butano y propano.

Los parches transdermicos tienen la ventaja ariadida de proporcionar el suministro controlado de un compuesto de la presente invencion al cuerpo. Dichas formas de dosificacion se pueden preparar disolviendo o dispersando los antagonistas de hedgehog en el medio apropiado. Tambien se pueden usar potenciadores de la absorcion para aumentar el flujo de los antagonistas de hedgehog a traves de la piel. La tasa de dicho flujo se puede controlar proporcionando una membrana de control de la tasa o dispersando el compuesto en una matriz polimerica o gel.

Tambien se contemplan formulaciones oftalmicas, pomadas oculares, polvos, soluciones y similares.

Las composiciones farmacbuticas de la presente invencibn adecuadas para administracion parenteral comprenden uno o mas compuestos de la invencion en combinacion con una o mas soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas esteriles, isotonicas y farmaceuticamente aceptables, o polvos esteriles que se pueden reconstituir en soluciones o dispersiones inyectables esteriles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostaticos, solutos que hacen que la formulacibn sea isotonica con la sangre del destinatario pretendido o agentes de suspension o espesantes.

Los ejemplos de vehiculos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo. mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, manteniendo el tamario de particula necesario en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones tambien pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevencion de la accion de los microorganismos se puede garantizar por la inclusion de diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, acido sorbico y similares. Tambien puede ser deseable incluir agentes isotonicos, tales como azucares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Ademas, se puede conseguir la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable por la inclusion de agentes que retardan la absorcion, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

En algunos casos, para prolongar el efecto de un farmaco, es deseable ralentizar la absorcion del farmaco desde la inyeccion subcutanea o intramuscular. Esto se puede lograr por el uso de una suspension liquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua. La tasa de absorcion del farmaco depende entonces de su tasa de disolucion que, a su vez, puede depender del tamario de los cristales y la forma cristalina. De forma alternativa, la absorcibn retardada de una forma de farmaco administrado parenteralmente se logra disolviendo o suspendiendo el farmaco en un vehiculo oleoso.

Las formas inyectables de deposito se preparan formando matrices microencapsuladas de los presentes compuestos en polimeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la proporcion de farmaco a polimero, y de la naturaleza del polimero particular empleado, se puede controlar la tasa de liberacion del farmaco. Los ejemplos de otros polimeros biodegradables incluyen poli(ortoesteres) y poli(anhidridos). Las formulaciones inyectables de deposito tambien se preparan reteniendo el farmaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal.

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Cuando los compuestos de la presente invention se administran como productos farmaceuticos a seres humanos y animates, se pueden proportion como tal o como una composition famnaceutica que contiene, por ejemplo, de un 0,1 a un 99,5 % (mas preferentemente, de un 0,5 a un 90 %) del principio activo en combination con un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

La adicion del compuesto activo de la invencion al pienso para animales se realiza preferentemente preparando una premezcla apropiada de pienso que contiene el compuesto activo en una cantidad eficaz e incorporando la premezcla en la radon completa.

De forma alternativa, se puede mezclar en el pienso un concentrado intermedio o complemento para piensos que contiene el principio activo. La forma en la que dichas premezclas de pienso y raciones completas se pueden preparar y administrar se describen en los libros de referenda (tales como "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and CO., San Francisco, EE. UU., 1969 o "Livestock Feeds and Feeding" libros O y B, Corvallis, Ore., EE. UU., 1977).

Ejemplos:

La invencion que se esta describiendo ahora en general, se comprendera mas facilmente por referenda a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente con fines de ilustracion de ciertos aspectos y modos de realization de la presente invencion, y no se pretende que limiten la invencibn.

Ejemplo 1: Hedgehog, desarrollo pulmonar y production de tensioactivo

El sindrome de dificultad respiratoria es el resultado de tensioactivo insuficiente en el aiveolos pulmonares. Los pulmones de los vertebrados contienen tensioactivo, una mezcla compleja de lipidos y proteinas que provoca que la tension de superficie aumente durante el inflado pulmonar y disminuya durante el desinflado pulmonar. Durante el desinflado pulmonar, el tensioactivo disminuye de tal forma que no hay fuerzas superficiales que de lo contrario favorecerian el colapso alveolar. Los aiveolos oxigenados que no ban colapsado durante la espiracion permiten el transpose continuo de oxigeno y dioxido de carbono entre la sangre y el gas alveolar y requieren mucho menos fuerza para inflarse durante la inspiration siguiente. Durante el inflado, el tensioactivo pulmonar aumenta la tension de superficie a medida que aumenta el area superficial alveolar. El aumento de la tension de superficie en los aiveolos en expansion se opone al exceso de inflado en esos espacios aereos y tiende a desviar el aire inspirado hacia aiveolos que cuentan con menor aireacion, facilitando de este modo una aireacion pulmonar uniforme.

El sindrome de dificultad respiratoria es particularmente frecuente en lactantes prematuros. El tensioactivo pulmonar normalmente se sintetiza a una tasa muy baja hasta las ultimas seis semanas de la vida del feto. Los lactantes humanos nacidos mas de seis semanas antes del termino normal de un embarazo tienen un alto riesgo de nacer con cantidades inadecuadas de tensioactivo pulmonar y tasas inapropiadas de sintesis de tensioactivo. Cuanto mas prematuramente nace el lactante, mas probabilidad hay de que la deficiencia de tensioactivo sea mas grave. La deficiencia grave de tensioactivo puede conducir a insuficiencia respiratoria a los pocos minutos u horas del nacimiento. La deficiencia de tensioactivo produce colapso progresivo de los aiveolos (atelectasia) debido a la capacidad disminuida de los pulmones de expandirse, a pesar del esfuerzo maximo en la inspiracion. Como resultado, llegan cantidades inadecuadas de oxigeno a la sangre del lactante. Se puede producir RDS en adultos tambien, tipicamente como consecuencia de una insuficiencia en la biosintesis de tensioactivo.

Se investigo la funcion de la ruta de serialization de hedgehog en la maduracion de los pulmones y la produccion de tensioactivo, descubriendo que la inhibition de la ruta de sehalizacion de hedgehog estimula la produccion de tensioactivo.

Se evaluo la expresion de un gen regulado por hedgehog, Gli-1, en tejido pulmonar de raton embrionario. Gli-1 se expresaba intensamente en el pulmon embrionario. sin embargo, esta expresion disminuye durante la maduracion pulmonar (ftgura 4). Cabe senalar que la disminucion de la sehalizacion de hedgehog hacia el final de la embriogenesis se correlaciona con la maduracion del epitelio pulmonar distal en los neumocitos respiratorios. Gli-1, un factor de transcripcion indicativo de sehalizacion de hedgehog, continua expresandose en los conductos, pero no las vias respiratorias en el adulto.

PROCEDIMIENTOS: Secciones de tejido incrustado en parafina, fijado con paraformaldehido, se limpiaron, rehidrataron y digirieron con proteinasa K, se acetilaron y se hibridaron con sondas de ARN de sonic hedgehog y gli-1 marcadas con [33P] durante la noche, respectivamente. Despues de lavados de alta rigurosidad posteriores a la hibridacion, los portaobjetos se sumergieron en la fotoemulsion, se incubaron durante un maximo de tres semanas, se revelaron y se sometieron a formacion de imagenes usando iluminacion de campo oscuro. Las senales de campo oscuro se rellenaron con color artificial (rojo) y se superpusieron con las imagenes de campo brillante.

Para correlacionar adicionalmente la disminucion de la expresion de gli-1 con la maduracion de los pulmones, se comparo la expresion de gli-1 con la expresion del marcador de maduracion pulmonar, el tensioactivo tipo C (Sp-C) (figura 5). Este analisis demuestra que a medida que disminuye la expresion de gli-1 entre E13.5-E16.5, aumenta la expresion de Sp-C.

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cuantitativa en tiempo real (Q-RT-PCR). Brevemente, se aisla el acido ribonucleico (ARN) total del tejido y se somete a transcripcion inversa para generar ADN. Este ADN se amplifica en una reaccion en cadena de la polimerasa usando cebadores especificos de gen, as! como cebadores para el gen constitutive de GAPDH que se expresa de forma ubicua. Los dos conjuntos de cebadores se marcan con diferentes fluoroforos, lo que permite la cuantificacion de ambas senales en el mismo tubo de reaccion en una maquina de PCR en tiempo real (TaqMan). Cuando se calculan los niveles de expresion de gli-1 y Sp-C, la serial especifica se normaliza con respecto a la serial de GAPDH, que sirve como una medida del ADN total usado en la reaccion.

Como la expresion de Gli-1 es un marcador para la senalizacion de hedgehog, parece que la ruta de sefializacidn de hedgehog esta activa en tejido pulmonar inmaduro. En consecuencia, se plantea la hipotesis de que la inhibicion de la ruta de senalizacion de hedgehog permitiria una maduracion mas rapida de los pulmones y, en particular, estimularia la produccion de tensioactivo.

El tratamiento de los pulmones de raton embrionario con el compuesto B antagonista de hedgehog regula por disminucion la expresion de Gli-1 (figura 6). PROCEDIMIENTOS: Se diseccionaron pulmones de raton embrionario E13.5. Los explantes se cultivaron expuestos a la superficie de contacto aire-liquido en medio de explante de pulmon (basado en DMEM, aditivos optimizados para el cultivo de pulmones de raton) durante 67 boras. Despues se procesaron para PCR cuantitativa en tiempo real (Q-RT-PCR). Brevemente, se aisla el acido ribonucleico (ARN) total del tejido y se somete a transcripcion inversa para generar ADN. Este ADN se amplifica en una reaccion en cadena de la polimerasa usando cebadores especificos de gen, as! como cebadores para el gen constitutive de GAPDH que se expresa de forma ubicua. Los dos conjuntos de cebadores se marcan con diferentes fluoroforos, lo que permite la cuantificacion de ambas senales en el mismo tubo de reaccion en una maquina de PCR en tiempo real (TaqMan). Cuando se calcula el nivel de expresion de gli1, la serial especifica se normaliza con respecto a la serial de GAPDH, que sirve como una medida del ADN total usado en la reaccion.

El tratamiento con compuesto B aumenta la produccidn de tensioactivo de tipo C en pulmones de raton embrionario (figura 7). La produccion de tensioactivo es una medida de la madurez de los pulmones, y la incapacidad de producir tensioactivo es la causa principal del sindrome de dificultad respiratoria en adultos y lactantes. Se evaluo el aumento de la produccion de tensioactivo de tipo C midiendo la expresion de Sp-C, que codifica una proteina critica para la produccion de tensioactivo.

PROCEDIMIENTOS: Se diseccionaron pulmones de raton embrionario E13.5. Los explantes se cultivaron sumergidos en medio de explante pulmonar (basado en DMEM, aditivos optimizados para el cultivo de pulmones de raton) durante 50 boras. Despues se procesaron por Q-RT-PCR. Brevemente, se aisla el acido ribonucleico (ARN) total del tejido y se somete a transcripcion inversa para generar ADN. Este ADN se amplifica en una reaccion en cadena de la polimerasa usando cebadores especificos de gen, asi como cebadores para el gen constitutive de GAPDH que se expresa de forma ubicua. Los dos conjuntos de cebadores se marcan con diferentes fluoroforos, lo que permite la cuantificacion de ambas senales en el mismo tubo de reaccion en una maquina de PCR en tiempo real (TaqMan). Cuando se calcula el niveles de expresion de Sp-C, la serial especifica se normaliza con respecto a la serial de GAPDH, que sirve como una medida del ADN total usado en la reaccion.

Los cuerpos lamelares son estructuras subcelulares que se encuentran en celulas pulmonares que producen surfactina y se cree que son un sitio de produccion de surfactina. Los neumocitos de tipo II de pulmones tratados con el compuesto B se diferencian de forma prematura, como queda evidenciado por la presencia de cuerpos lamelares que producen tensioactivo. Ninguna de dichas estructuras podia observarse en los controles tratados con vehiculo (figura 8). PROCEDIMIENTOS: Se diseccionaron pulmones de raton embrionario E13.5. Los explantes se cultivaron expuestos a la superficie de contacto aire-liquido en medio de explante de pulmon (basado en DMEM, aditivos optimizados para el cultivo de pulmones de raton) durante 67 boras. Despues se procesaron por microscopia electronica de transmision y se fotografiaron con un aumento de 62.000.

Las figuras 9 y 10 muestran resultados similares a los obtenidos anteriormente tras el tratamiento de cultivos pulmonares embrionarios con el compuesto B (figura 9-10). El aumento de la expresion de Sp-C observado despues del tratamiento con el compuesto B es comparable con lo observado cuando se tratan explantes de pulmon embrionario con la hormona esteroide hidrocortisona. Los esteroides son conocidos por aumentar la maduracion pulmonar y la produccion de tensioactivo en animales, incluyendo seres humanos.

La especificidad de los efectos de los antagonistas de hedgehog en la maduracion pulmonar se demuestra examinando los efectos de los agonistas de la senalizacion de hedgehog sobre la maduracion pulmonar. El tratamiento de los cultivos de pulmon embrionario, con sonic hedgehog modificado con lipido o con un compuesto agonista de hedgehog da como resultado una expresion aumentada de gli-1 y una expresion disminuida de Sp-C (figura 11).

En resumen, estos resultados demuestran que los inhibidores de hedgehog pueden estimular la maduracion y la produccion de surfactina en tejido pulmonar inmaduro. La ruta de senalizacion de hedgehog esta activa en tejidos pulmonares inmaduros, en los que no se producen surfactinas en niveles sustanciales, mientras que la ruta de hedgehog esta relativamente inactiva en las vtas respiratorias del adulto, en las que se producen surfactinas. El tratamiento del tejido pulmonar inmaduro con antagonistas de la ruta de sebalizacion de hedgehog provoca la

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maduracion rapida y la presencia aumentada de marcadores moleculares y citologicos asociados con la produccion de surfactina. Los resultados opuestos obtenidos tras el tratamiento de explantes de pulmon con agonistas y antagonistas de hedgehog demuestran la especificidad de estos resultados.

Ejemplo 2: Expresion de gli-1 en tumores humanos

Activacion de la ruta de hedgehog en tumores humanos

La sehalizacion de hedgehog desempena una funcion causal en la generacion del carcinoma basocelular (BCC). Se analizo la sehalizacion de hedgehog para determinar si esta ruta esta activa en otros tumores humanos, mas especificamente en cancer de prostata, pulmon y mama, asi como hiperplasia benigna de prostata. Las proteinas hedgehog son agentes proliferates conocidos para una diversidad de tipos de celulas. Debido a que hedgehog tiene un efecto proliferate conocido sobre una diversidad de tipos de celulas, los antagonistas de hedgehog pueden ser agentes terapeuticos valiosos para canceres en los que esta presente la sehalizacion de hedgehog a alto nivel.

Se abordo la cuestion de la activacion de hedgehog en los tipos de tumores realizando experimentos de hidridacion radiactiva in situ con gli-1, un gen efector transcripcional conocido de la sehalizacion de hedgehog.

Brevemente, secciones de tejido incrustado en parafina y fijado con paraformaldehido se limpiaron, rehidrataron, digirieron con proteinasa K, se acetilaron y se hibridaron con sondas de ARN marcado con [33P] durante la noche. Despues de lavados de alta rigurosidad posteriores a la hibridacion, los portaobjetos se sumergieron en la fotoemulsion, se incubaron durante un maximo de tres semanas, se revelaron y se sometieron a formacion de imagenes usando iluminacion de campo oscuro. Las senales de campo oscuro se rellenaron con color artificial (rojo) y se superpusieron con las imagenes de campo brillante. Se califico la expresion de gli-1 en una escala de M-" hasta "+" a M++++,\ Se califico la expresion de gli-1 ,,-M cuando la expresibn no era mayor en las celulas hiperproliferativas que en otras celulas no proliferativas presentes en el portaobjetos. Las calificaciones de "+" a "++++" se otorgaron para niveles de expresion aumentados, considerbndose que cualquier celula calificada "++M o superior tiene una expresion de gli-1 sustancialmente aumentada. Cuando la serial no se podia interpretar, la muestra se indica como "ND".

Los datos de estos experimentos se resumen en la tabla 1-4 a continuation. En resumen, 8 de las 18 muestras de cancer de mama mostraron una expresion de gli-1 sustancialmente aumentada. 7 de las 11 muestras de cancer de pulmon, 11 de las 19 muestras de hipertrofia benigna de prostata (HBP) y 6 de las 15 muestras de cancer de prostata mostraron una intensa expresion de gli-1.

Tabla 1: Resultados de Gli-1 en hibridacion in situ en tejido de cancer de mama

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Tabla 2: Resultados de Gli-1 en hibridacion in situ en tejido de cancer de pulmon

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Tabla 4: Resultados de Gli-1 en hibridacion in situ en hiperplasia benigna de prostata

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En resumen, el alto nivel de expresion de Gli-1, es decir, la activacion de serialization de hedgehog, se puede observar en cancer de prostata e hiperplasia benigna de prostata, cancer de pulmon y cancer de mama en seres humanos (figuras 12-15). La activacion de la ruta de hedgehog en estos tipos de tumores nunca se habia descrito hasta ahora. La presencia de una ruta de hedgehog excepcionalmente activa en estas celulas en proliferation sugiere firmemente una relation causal entre la ruta de hedgehog y la hiperproliferacion en estos trastornos. Se espera que los antagonistas de hedgehog sean eficaces como agentes antiproliferativos en estos tipos de cancer.

Ejemplo 3: Antagonistas esteroideos de hedgehog

Se realizaron estudios para determinar el sitio de la ruta de serialization de hedgehog en el que interviene la ciclopamina (un antagonista alcaloide esteroideo de hedgehog) y, por lo tanto, comprender mejor el espectro de tumores provocados por lesiones que activan la ruta de Shh que se podrian tratar potencialmente con este compuesto. Estos estudios se presentan con mayor detalle en la solicitud de patente de EE. UU. de Beachy et al. titulada "Hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto" presentada el 10 de octubre de 2000, cuyos contenidos se incorporan en el presente documento por referenda.

Estos estudios implican el uso de fibroblastos embrionarios de raton (MEF) que se generaron por digestion con tripsina de embriones E8.5 de apareamientos pateched (ptc) +/-. El gen ptc de raton se interrumpio por recombination homologa en la que parte del exon 1 y todo el exon 2 se sustituyeron con el gen lacZ bacteriano (Goodrich et al., (1997) Science 277: 1109). Dado que la proteina Ptc suprime la serialization de Shh, una perdida de su funcion activa la ruta de senalizacion de Shh. La senalizacion de Shh, a traves de una cascada de eventos, esta mediada por los factores de transcription Gli. Uno de los genes diana de la senalizacion de Shh es ptc, a traves de sitios de union a Gli en la region promotora de ptc, y esto sirve como un mecanismo de retroalimentacion para la regulation por disminucion de la senalizacion. Por lo tanto, en estos embriones ptc la ruta de senalizacion de Shh se activa en muchos tejidos, y el producto genico de lacZ p-galactosidasa se expresa en todos esos tejidos como un indicador de la activacion de la ruta.

Se obtuvieron estos MEF para determinar si la ciclopamina actuaba sobre Ptc u otro componente de la cascada para inhibir la senalizacion de Shh. Si la diana de la ciclopamina es Ptc, entonces cabria esperar que, cuando se activa la ruta de Shh por la perdida de funcion de ptc, ya no se pueda inhibir por ciclopamina. La ruta de senalizacion de Shh se puede activar en estos fibroblastos en cultivo celular, y el nivel de la actividad p-galactosidasa refleja el grado de activacion de la ruta. La linea MEF 23-4 es heterocigotica para ptc-lacZ y, por lo tanto, contiene un alelo ptc funcional capaz de mantener un estado reprimido de la ruta, pero expresara lacZ cuando se active la ruta por la adicion de la proteina Shh.

Por el contrario, la actividad p-galactosidasa en MEF homocigoticos para ptc-lacZ (linea celular 23-1), esta notablemente elevada, porque en estas celulas la ruta se activa de forma constitutiva por la perdida de un alelo ptc funcional. Cuando se cultivan estas celulas con ciclopamina, se disminuye la actividad p-galactosidasa, lo que indica que cuando la ruta de senalizacion de Shh no esta regulada por la represion de Ptc, todavia es sensible a la inhibicion por ciclopamina. La reduccion de la actividad p-galactosidasa parece ser el resultado de la inhibicion especifica de la sehalizacidn de Shh, en lugar de la toxicidad celular porque la actividad enzimatica se normaliza con respecto al contenido total de proteinas de la muestra. Ademas, la reduccion de la actividad p-galactosidasa se puede obtener

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con exposicion a ciclopamina durante un periodo de tiempo mas corto que el ciclo celular normal y, de esta forma, no parece deberse unicamente a una inhibicion de la proliferacion celular.

Una indication final de que esto representa inhibicion especifica de la serialization de Shh es que no se puede lograr con un compuesto no inhibidor, pero relacionado estructuralmente, tomatidina.

Ejemplo 4: Descubrimiento de compuestos principales/ensayo de cribado ultrarrapido

Las metodologias descritas en el presente documento se pueden usar para identificar una amplia variedad de antagonistas de hedgehog de molecula pequeha.

Los compuestos a someter a prueba se disuelven en DMSO hasta una concentracion de 10 mM, y se almacenan a -20 °C. Para activar la ruta de Hedgehog en las celulas de ensayo, se usa una forma octilada (modificada con lipido) del fragmento N-terminal de la proteina Sonic Hedgehog (OCT-SHH). Este fragmento de SHH N-terminal se produce en bacterias.

Los compuestos se pueden someter a prueba en el ensayo "Gli-Luc" a continuation, usando la linea celular 10T (s12), en la que las celulas contienen una construction indicadora sensible a Hedgehog que utiliza luciferasa como gen indicador. De esta manera, la actividad de sehalizacion de la ruta de Hedgehog se puede medir a traves de la respuesta Gli-Luc.

Se siembran celulas 10T1/2 (s12) en una placa de microtitulacion de 96 pocillos (MTP) a 20.000 celulas/pocillo en medio completo [DMEM con un 10% de FBS], A continuacion, las placas se colocan en la incubadora para incubacion durante la noche (O/N), a 37 °C y un 5 % de C02. Despues de 24 h, el medio se sustituye por medio de ensayo de luciferasa (DMEM con un 0,5 % de FBS). Los compuestos se descongelan y se diluyen en medio de ensayo a 3:1000 (aproximadamente 300 veces) dando como resultado una concentracion de partida de aproximadamente 30 pM.

Posteriormente, se afiaden 150 pi de cada muestra 30 pM a los primeros pocillos (por triplicado). Las muestras de MTP despues se diluyen en diluciones de factor 3 para un total de siete pocillos, lo que finalmente da como resultado un regimiento de siete diluciones por triplicado, para cada compuesto. A continuacion, el ligando de proteina OCT -SHH se diluye en medio de ensayo de luciferasa y se ariade a cada pocillo a una concentracion final de 0,3 pg/ml. Despues las placas se devuelven a la incubadora para su posterior incubacion O/N, a 37 °C y un 5 % de C02. Despues de aproximadamente 24 h, las placas se retiran de la incubadora y el medio se aspira/desecha. Los pocillos se lavan una vez con tampon de ensayo [PBS + Mg2+ 1 mM y Ca2+ 1 mM]. A continuacion, se ariaden 50 pi de tampon de ensayo a cada pocillo. El reactivo de ensayo de luciferasa se prepara como se describe por el proveedor (kit LucLite de Packard), y se aladen 50 pi a cada pocillo. Las placas se incuban a temperatura ambiente (TA) durante aproximadamente 30 minutos, despues de ello se leen las seriales, de nuevo a TA, en un Topcount (Packard).

El descubrimiento de compuestos que inhiben la transcription de Gli inducida por Shh es un ejemplo de la utilidad de las reivindicaciones de la presente patente. Las actividades para estos compuestos se presentan en la tabla 1 a continuacion.

Tabla 1

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El raton n.° 456 es un heterocigoto P/c-knockout que recibio irradiacion UV durante 6 meses. El raton desarrollo muchas lesiones de BCC pequehas, que eran azules despues de tincion con X-gal. El raton se sacrifico y se escindib la piel con un punzon para piel de 2 mm. Esas perforaciones de piel despqes se cultivaron durante 6 dias. En comparacion con el vehiculo (DMSO), el compuesto A puede disminuir el numero y tamano de las lesiones de BCC (manchas azules en la imagen). Este experimento sugiere que el compuesto A es capaz de inhibir las lesiones de BCC murinas en el raton n.° 456.

En otro experimento mas, se recogieron pulmones ptc-1 (d 11) lacZ E.12.5 y se identificaron los embriones transgenicos por deteccion de lacZ usando las colas. Se cultivaron explantes de pulmon sumergidos en medio de explante de raton (basado en DMEM, aditivos optimizados para el cultivo de pulmones de raton) durante 48 horas, se fijaron en fijador de lacZ, se enjuagaron y se tineron para lacZ O/N a 37 °C. El tejido de control se dejo sin tratar, mientras que el tejido de prueba se trato con el compuesto A. Se puede observar expresion de lacZ intensa en mesenquima distal y proximal. El tratamiento con el compuesto A conduce a una expresion genica del indicador significativamente disminuida, como se evidencia especialmente por la senal debil que rodea las puntas de ramificacion distales del epitelio pulmonar en crecimiento.

Ejemplo 5: Cancer de vejiga

Datos citogeneticos y mutacionales sugieren que la activacion de hedgehog desempena una funcion causal en el cancer de vejiga

Las alteraciones citogeneticas y moleculares encontradas en cancer de vejiga son heterogeneas. Cuando se establecen las mutaciones especificas primarias en los canceres, a menudo es util examinar canceres casi diploides, que aun no tienen multiples cambios cromosomicos complejos, acompanados de hiperdiploidia. Gibas et al., encontraron monosomia del cromosoma 9 en 4 de los 9 casos de carcinoma de celulas transicionales de vejiga (Gibas et al. (1984) Cancer Research 44:1257-1264). En tres de estos, el cariotipo era casi diploide y, en uno, la monosomia 9 fue la unica anomalla observada. Por lo tanto, la monosomia del cromosoma 9 puede iniciar la transformacion maligna en un subgrupo de dichos canceres.

Se presentaron mas evidencias de que este cambio aparece como un evento temprano, por otros dos grupos que informaron de que las deleciones del cromosoma 9 son los unicos cambios geneticos que se presentan con frecuencia en tumores papilares superficiales (Dalbagni et al. (1993) Lancet 342: 469-471). De hecho, se estima que se producen deleciones 9q en aproximadamente el 60-70 por ciento de los tumores de vejiga (Cairns et al. (1992) Oncogene 8: 1083-1085; Dalbagni et al., supra). Un estudio informo de que la delecion de 9q22 se produce en el 35 % de los casos informativos (Simoneau et al. 1999). El componente patched-1 de la ruta de sehalizacion de hedgehog esta localizado en 9q22.

LOH del resto de cromosomas es infrecuente (menos de un 10%) en canceres no invasivos de grado bajo. Del mismo modo, la alteracion en oncogenes asociados a cancer de vejiga (ERB2, EGFR) tambien son poco frecuentes en tumores superficiales de grado bajo (Cairns et al., supra).

Sobre la base de estos hallazgos citogeneticos, se ha propuesto el siguiente modelo de carcinogenesis de vejiga: El comienzo se produce por delecion de genes supresores tumorales en el cromosoma 9, que conduce a tumores papilares superficiales u ocasionalmente pianos, algunos de los cuales pueden entonces adquirir mutaciones adicionales (por ejemplo, p53) y evolucionar hasta invasion.

Tres grupos observaron trisomia 7 en un bajo porcentaje de los canceres de vejiga (Sandberg, supra; Berger et al. supra; Smeets et al., supra). Shh, que de acuerdo con nuestros propios experimentos se sigue expresando en el epitelio de la vejiga durante la vida adulta, se localiza en el cromosoma 7. Berger et al. tambien observaron deleciones de 10q24, el locus de su(fu) (Berger et al. (1986) Cancer Genetics and Cytogenetics 23: 1-24). Del mismo modo, Smeets et al. sugirieron que la perdida de 10q puede ser un evento primario en el desarrollo de cancer de vejiga (Smeets et al. (1987) Cancer Genetics and Cytogenetics 29: 29-41).

Estos datos sugieren mecanismos por los que la expresion basal de sehalizacion de hedgehog presente en epitelio de vejiga en adultos se puede aumentar, lo que conduce, por lo tanto, a una proliferation aumentada de celulas uroteliales. Esta hipotesis esta apoyada por los datos citologicos, asi como por el hallazgo de McGarvey et al. que

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describieron la expresion de ptc-1, smo y gli-3 en urotelio humano normal y dos lineas de carcinoma de celulas transicionales (McGarvey et al. (1998) Oncogene 17: 1167-1172).

Se examino la serialization de hedgehog en la vejiga del raton, y se encontro que estaba presente en vejiga normal. En ratones recien nacidos transgenicos Ptc-lacZ (ptc-1 (d11) lacZ), la expresion de LacZ se puede detectar en las celulas uroteliales proliferativas del epitelio de la vejiga, y mas debilmente, en las celulas mesenquimales adyacentes (figura 16A). El analisis adicional de hibridacion in situ de vejiga de raton adulto indica la expresion de gli-1 en el epitelio de la vejiga, y especificamente en las celulas uroteliales en proliferation (figura 16B).

PROCEDIMIENTOS: Para la tincion de lacZ, se recogio vejiga ptc-1 (d11) de crias de raton recien nacidas transgencias identificadas detection de lacZ usando las colas. Se fijaron las vejigas en fijador de lacZ, se aclararon y se tineron para lacZ O/N a 37 °C, despues se procesaron para histologia estandar. Las secciones se tineron con contraste con eosina. Para la hibridacion in situ, secciones de tejido incrustado en parafina y fijado con paraformaldehido, se limpiaron, rehidrataron, digirieron con proteinasa K, se acetilaron y se hibridaron con sonda de ARN de gli-1 marcada con [33-P] durante la noche. Despues de lavados de alta rigurosidad posteriores a la hibridacion, los portaobjetos se sumergieron en la fotoemulsibn, se incubaron durante un maximo de tres semanas, se revelaron y se sometieron a formation de imagenes usando iluminacibn de campo oscuro. Las senales de campo oscuro se rellenaron con color artificial (rojo) y se superpusieron con las imagenes de campo brillante.

Senalizacion de hedgehog en cancer de vejiga

Se analizo la senalizacion de hedgehog y la expresion genica de ruta de hedgehog en un cancer de vejiga humano, y en varias lineas celulares de cancer de vejiga. Se midio la expresion genica en estos tejidos usando PCR cuantitativa en tiempo real (Q-RT-PCR). Estos resultados se resumen en las figuras 17-19, y demuestran que los genes de la ruta de hedgehog se expresan en lineas celulares de cancer de vejiga.

La figura 17 demuestra que la expresion de Shh esta aumentada 12 veces y la expresion de gli-1 esta aumentada 2,5 veces en una muestra de tumor de vejiga en compaction con vejiga normal adulta. La figura 18 examina la expresion de Shh y gli-1 en ocho lineas celulares de cancer de vejiga humano, y la figura 19 examina la expresion de Shh, ptc-1, smo, gli-1, gli-2 y gli-3 en las mismas ocho lineas celulares de cancer de vejiga humano Estos resultados indican que los componentes de la ruta de hedgehog se expresan en ocho de ocho lineas celulares examinadas.

PROCEDIMIENTOS: Experimento 1 (figura 17) - evaluation de la senalizacion de hedgehog en un tumor de vejiga.

Para los experimentos de reaction en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (Q-RT-PCR), se amplified ADNc disponible comercialmente (Clontech) usando el sistema de deteccion de secuencias ABl Prism 7700 (TaqMan) de Perkin Elmer y cebadores especificos de gen. Se usd el gen constitutive GAPDH para normalizar la concentracion de ARN y la eficacia de la PCR, y se anadieron cebadores de GAPDH a las mismas reacciones. Dado que las sondas para ambos genes estan marcadas con diferentes fluoroforos, la serial especifica y la de GAPDH se pueden detectar en el mismo tubo. Las intensidades de senal se calcularon usando los algoritmos proporcionados en Sequence Detector v1.7, el software proporcionado por el fabricante.

Experimento 2 (figuras 18-19) - senalizacion de hedgehog en ocho lineas celulares de cancer de vejiga.

Se adquirieron lineas celulares de cancer de vejiga en la ATCC (American Type Culture Collection) y se mantuvieron como se recomienda en la descripcion del producto. Al llegar a confluencia, las celulas se lavaron y cambiaron a un medio que contenla un 1 % de suero, un tratamiento que aumenta la senalizacion de hedgehog. Las cblulas despues se cultivaron 2 dias mas, se recogieron en Trizol (GIBCO-BRL) y se aislb el ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuacibn, el ARN se transcribio en ADNc de primera hebra de acuerdo con protocolos estandar, y se amplified usando un sistema de deteccidn de secuencias ABl Prism 7700 (TaqMan) de Perkin Elmer y cebadores especificos de gen. Se usd el gen constitutive GAPDH para normalizar la concentracion de ARN y la eficacia de la PCR, y se anadieron cebadores de GAPDH a las mismas reacciones. Dado que las sondas para ambos genes estan marcadas con diferentes fluoroforos, la senal especifica y la de GAPDH se pueden detectar en el mismo tubo. Las intensidades de senal se calcularon usando los algoritmos proporcionados en Sequence Detector v1.7, el software proporcionado por el fabricante.

Ensayo in vitro para examinar la senalizacion de hedgehog en lineas celulares de cancer de vejiga

La expresion examinada de los componentes de la ruta de senalizacion de hedgehog en ocho lineas celulares de cancer de vejiga sugirio que la senalizacion de hedgehog es activa en celulas de cancer de vejiga. Sin embargo, la expresion genica observada pueden no ser indicativa de senalizacion funcional. Para evaluar si se produce senalizacion de hedgehog funcional en lineas celulares de cancer de vejiga, se usd un ensayo de gli-Luc in vitro. Este ensayo se resume esquematicamente en la figura 20. Brevemente, los fibroblastos 10T 1/2 (S12) que expresan un gen indicador de luciferasa sensible a hedgehog sirven como indicador de la senalizacion de hedgehog. Cuando estas celulas se ponen en contacto con la proteina hedgehog funcional, la ruta de senalizacion de hedgehog se activa en las celulas S12, y se expresa la luciferasa. En los experimentos presentados en el presente documento, se cocultivan celulas S12 con celulas de cancer de vejiga. Si la linea celular de cancer de vejiga secreta la proteina hedgehog funcional, la expresion de luciferasa se activara en las celulas S12 adyacentes.

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La figura 21 muestra la induction de luciferasa en celulas S12 en solitario, y en celulas S12 cocultivadas con tres lineas celulares de cancer de vejiga. Dos de las tres lineas celulares examinadas indujeron la expresion de luciferasa en celulas S12, lo que indica que estas lineas celulares de cancer de vejiga secretan la proteina hedgehog funcional.

Para confirmar la especificidad de esta activation de la serialization de hedgehog por las lineas celulares de cancer de vejiga, se trataron los cocultivos S12/RT-4 con el anticuerpo de bloqueo de Shh (5E1). La figura 22 demuestra que el tratamiento con 5E1 de los cocultivos inhibe la expresion de luciferasa en celulas S12 con una CI50 de 85 ng/ml y una CI90 de 500 ng/ml. Hay que senalar que este modelo tambien proporciona un medio para evaluar la eficacia in vitro de otros antagonistas de hedgehog, incluyendo antagonistas de molecula pequefia y de polipeptido.

Serialization de hedgehog en un modelo in vivo de tumor de vejiga en ratones

La inyeccion de celulas tumorales de vejiga en ratones atimicos induce la formation de tumores. Basandose en la capacidad del anticuerpo 5E1 contra Shh de inhibir la serialization de hedgehog en el ensayo gli-Luc in vitro descrito en detalle anteriormente, se examino la capacidad de 5E1 de inhibir el crecimiento de celulas tumorales de vejiga in vivo. Brevemente, a ratones atimicos se les inyecto por via subcutanea 107 celulas RT-4. Los ratones se dividieron en dos grupos y se trataron con 5E1 o con un anticuerpo IgG de control. Las figuras 23 y 24 muestran que el tratamiento con 5E1 disminuyo significativamente el tarnaho del tumor en comparacion con el tratamiento con el control de IgG. Es importante senalar que, debido al procedimiento usado en este experimento en particular (inyeccion de celulas tumorales con Matrigel) los tumores comienzan con un tamano medio de 100 mm3 debido a la matriz de Matrigel (= 100 pi de volumen de inyeccion). Matrigel es llquido cuando se mantiene en hielo humedo, pero solidifica despues de la inyeccion. Por lo tanto, el tarnaho medio del tumor en el grupo de 5E1 al final del experimento es aproximadamente igual al del initio del tratamiento. Los resultados son estadisticamente muy significativos (prueba de la t de Student: p = 0,017). Hay que senalar que este modelo tambien proporciona un medio para evaluar la eficacia in vivo de otros antagonistas de hedgehog, incluyendo antagonistas de molecula pequeha y de polipeptido.

Ademas de evaluar el efecto del tratamiento con 5E1 sobre el tarnaho del tumor, tambien se evalud la expresion de gli-1, tanto en tumores RT-4 como en el tejido adyacente. El tratamiento con 5E1 disminuyo la expresion de gli-1 tanto en tumores RT-4 como en el tejido adyacente (figura 25). Este hallazgo es significativo porque los experimentos in vitro descritos anteriormente indican que estas celulas que expresan hedgehog pueden activar la serialization de hedgehog en la celula adyacente. Dada la naturaleza compleja de la progresion del cancer, es posible que la senalizacion de hedgehog influya en el cancer de forma tanto directa como indirecta. Los efectos indirectos pueden incluir la induction de factores proliferativos, factores angiogenicos o factores antiapoptoticos, por nombrar algunos. La induction de dichos factores se puede producir dentro de las propias celulas cancerosas o en celulas adyacentes. Por lo tanto, la demostracion de que un antagonista 5E1 de hedgehog puede inhibir la senalizacion de hedgehog tanto en celulas cancerosas como en celulas adyacentes tiene implicaciones significativas. PROCEDIMIENTOS: Cultivos RT-4 de crecimiento exponential se trataron con tripsina, se centrifugaron y se resuspendieron en un pequeho volumen de medio de cultivo. Se determino la proportion de celulas tumorales viables por exclusion de azul de tripano. Se resuspendieron 107 celulas/animal en 100 pi de Matrigel (una preparation disponible comercialmente de los componentes de la membrana basal) y se inyectaron por via subcutcinea en el lado derecho del costado de ratones atimicos nu/nu BALB/c macho de 6-8 semanas de edad. El tratamiento se initio el dia despues de la inyeccion de las celulas. Los ratones se dividieron en dos grupos que contenian 16 animales/grupo. Se inyectaron 10 mg/kg de anticuerpo, 3x/semana por via intraperitoneal en el grupo de control (anticuerpo de control IgG) y el grupo tratado con 5E1. Se midieron los tumores 2x/semana con el calibre en 2 dimensiones y las mediciones se convirtieron en masa tumoral usando la formula para un elipsoide alargado (axb2x/2). Como se senalo anteriormente, en este ejemplo particular, los tumores se inyectaron en combination con Matrigel. Por lo tanto, los tumores tienen un tarnaho inicial de 100 mm3 y la inhibition del tarnaho tumoral observado despues del tratamiento con 5E1 es casi una inhibition completa del crecimiento tumoral.

Se midio la expresion de gli-1 usando Q-RT-PCR como se describe a lo largo de toda la solicitud.

La inhibition del crecimiento tumoral por el antagonista 5E1 de hedgehog apoya la utilidad de la invention reivindicada. Se espera que el antagonismo de la senalizacion de hedgehog usando una gama de agentes tenga efectos similares en la disminucion del crecimiento del tumor, y la eficacia de cualquier compuesto candidato se podria evaluar facilmente usando los procedimientos in vivo e in vitro descritos anteriormente.

Ejemplo 6: Cancer de prostata

La senalizacion de hedgehog desempena una funcion importante en el desarrollo normal de la prostata. Se requiere sonic hedgehog para el crecimiento de la prostata, y la expresion de Shh esta fuertemente correlacionada con la ramification ductal de la prostata (Podlasek et al. (1999) Developmental Biology 209: 28-39). Evidencias recientes que apoyan la funcion esencial de Shh en la ramification apropiada de la prostata demuestran que el tratamiento de prostata embrionaria con el antagonista de hedgehog ciclopamina inhibe el crecimiento y la ramification (W. Bushman, resultado no publicado). Adicionalmente, el mantenimiento de niveles bajos de senalizacion de hedgehog en la prostata de raton adulto sugiere funciones adicionales para la senalizacion de hedgehog mas alia de esta funcion temprana en el crecimiento inicial y la ramification de la prostata embrionaria.

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Estudios recientes han examinado la correlation entre la expresion de los componentes de la ruta de hedgehog y el cancer de prostata. Estos resultados muestran una correlation entre la expresion aumentada de Shh y/o gli-1 y el cancer de prostata. Datos citologicos adicionales apoyan la idea de que la mala regulation de la ruta de hedgehog desempena una funcion en el cancer de prostata. Dos estudios han descrito deleciones de un fragmento del cromosoma 10 que contiene el locus Su(fu) en canceres de prostata (Carter et al. (1990) PNAS 87: 8751-8755; Li et al. (1997) Science 275. 1943-1947). Dadas las evidencias en la literatura que sugieren una funcion para la serialization de hedgehog en cancer de prbstata, se examino la serialization de hedgehog en varias lineas celulares de cancer de prostata. Adicionalmente, se demostro la capacidad de los antagonistas de hedgehog de disminuir la activation de la serialization de hedgehog en lineas celulares de tumor de prostata. Estos resultados sugieren que, al igual que en las celulas de cancer de vejiga, el antagonismo de la serialization de hedgehog tiene utilidad en la disminucion del crecimiento y la proliferacidn de las celulas de cancer de prostata.

Serialization de hedgehog en cancer de prostata

Se examino la expresion de Shh y gli-1 tanto en muestras de cancer de prostata humano como en lineas celulares de cancer de prostata disponibles comercialmente. La figura 26 muestra el analisis de hibridacion in situ de muestras de cancer de prostata humano, y demuestra la abundante expresion de Shh. Del mismo modo, la figura 27 demuestra niveles elevados de expresidn de gli-1 en celulas de cancer de prostata, medidos por Q-RT-PCR. Finalmente, la figura 28 examino la expresion tanto de Shh como de gli-1 por Q-RT-PCR en tres lineas celulares de cancer de prostata disponibles comercialmente. Estos resultados indican que se produce serialization de hedgehog en las tres lineas celulares disponibles comercialmente.

PROCEDIMIENTOS: Hibridacion in situ; Se criosecciona tejido fijado en paraformaldehido en secciones de 30 pm, se digiere con proteinasa K, se hibrida durante la noche con sonda de ARN marcada con digoxigenina. Despues de lavados de alta rigurosidad posteriores a la hibridacion, se incuban las secciones con un anticuerpo anti-digoxigenina, que esta marcado con fosfatasa alcalina. La serial se visualiza por adicion de BM purpura, una solution de cromogenica disponible comercialmente que reacciona con la fosfatasa alcalina para formar un precipitado de color purpura.

Se adquirieron lineas celulares de cancer de prostata en la ATCC (American Type Culture Collection) y se mantuvieron como se recomienda en la description del producto. Al llegar a confluencia, las celulas se lavaron y cambiaron a un medio que contenia un 1 % de suero, un tratamiento que aumenta la serialization de hedgehog. Las celulas despues se cultivaron 2 dias mas, se recogieron en Trizol (GIBCO-BRL) y se aislo el ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuation, el ARN se transcribio en ADNc de primera hebra de acuerdo con protocolos est£ndar, y se amplified usando un sistema de detection de secuencias ABI Prism 7700 (TaqMan) de Perkin Elmer y cebadores especificos de gen. Se usd el gen constitutive GAPDH para normalizar la concentration de ARN y la eficacia de la PCR, y se ahadieron cebadores de GAPDH a las mismas reacciones. Dado que las sondas para ambos genes estan marcadas con diferentes fluoroforos, la serial especifica y la de GAPDH se pueden detectar en el mismo tubo. Las intensidades de serial se calcularon usando los algoritmos proporcionados en Sequence Detector v1.7, el software proporcionado por el fabricante.

Ensayo in vitro para examinar la serialization de hedgehog en lineas celulares de cancer de prostata

La expresion de los componentes de la ruta de sehalizacion de hedgehog en muestras de cancer de prostata y lineas celulares sugiere que la serialization de hedgehog es activa en cancer de prostata. Sin embargo, la expresion genica observada pueden no ser indicativa de sehalizacion funcional. Para evaluar si se produce sehalizacion de hedgehog funcional en lineas celulares de cancer de prostata, se empleo el ensayo gli-Luc in vitro. Este ensayo se resumio anteriormente, y se representa esquematicamente en la figura 20. Brevemente, los fibroblastos 10T 1/2 (S12) que expresan un gen indicador de luciferasa sensible a hedgehog sirven como indicador de la sehalizacion de hedgehog. Cuando estas celulas se ponen en contacto con la proteina hedgehog funcional, la ruta de sehalizacion de hedgehog se activa en las celulas S12, y se expresa la luciferasa. En los experimentos presentados en el presente documento, se cocultivan celulas S12 con celulas de cancer de prostata. Si la linea celular de cancer de prostata secreta la proteina hedgehog funcional, la expresidn de luciferasa se activara en las celulas S12 adyacentes.

La figura 29 no muestra induction de luciferasa en celulas S12 cultivadas en solitario, o en celulas S12 cultivadas con celulas PZ-HPV-7 (normales). Sin embargo, se observa induction de la luciferasa cuando las celulas S12 se cultivan con cualquiera de las tres lineas celulares de cancer de prostata: 22Rv1, PC-3 o LNCaP. Este resultado indica que estas lineas celulares de cancer de prostata secretan proteina hedgehog funcional.

Para confirmar la especificidad de esta activation de la sehalizacion de hedgehog por las lineas celulares de cancer de prostata, se trataron los cocultivos S12/cancer de prostata con el anticuerpo de bloqueo de Shh (5E1). La figura 30 demuestra que el tratamiento con 5E1 de los cocultivos inhibe la expresion de luciferasa en celulas S12.

PROCEDIMIENTOS: Se realizaron cultivos y cocultivos de S12 y ensayos de luciferasa como se detalla anteriormente.

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Como se details anteriormente, la serialization de hedgehog parece tener tanto una funcion importante en la formacion temprana de patrones de prostata como una funcion en el mantenimiento de la prostata en adultos. Aunque el cancer de prostata es un efecto potencial de la mala regulacion de la senalizacion de hedgehog en la prostata de adultos, otra afeccion comun de la prostata que parece estar correlacionada con la expresion de hedgehog es la hiperplasia benigna de prostata (HBP).

La HBP es una enfermedad de la prostata central, y se caracteriza por el aumento de musculo liso alrededor de la uretra prostatica. Curiosamente, Shh se express en un gradiente en la prostata de adultos, con la expresion mas alta en la zona central de la prostata. Adicionalmente, Shh esta implicada en la diferenciacion del musculo liso en otros tejidos, incluyendo el intestino y el pulmon (Apelqvist et al. (1997) Current Biology 7: 801 - 804; Pepicelli et al. (1998) Current Biology 8: 1083-1086). Estas evidencias identificaron la senalizacion de hedgehog como un buen candidato para su implication en la etiologia de HBP. Finalmente, la transcription de Shh se incrementa por exposition a dihidrotestosterona (DHT) (Podlasek et al., supra). Esto es significativo porque la concentracion de 5-alfa-reductasa, una enzima que convierte la testosterona en DHT, es elevada en el estroma de HBP (Wilkin et al. (1980) Acta Endocrinology 94: 284-288). Estos datos sugieren que la mala regulacion de la senalizacion de hedgehog puede estar implicada en HBP y, por lo tanto, que la presente invention proporciona utilidad para el tratamiento de la HBP.

Senalizacion de hedgehog en HBP

Se examino la expresion de sonic hedgehog y la expresion de gli-1 en muestras humanas de HPB. Las figuras 31 y 32 muestran el analisis de hibridacion in situ de muestras humanas de HPB, y demuestran que tanto Shh como gli-1 se expresan abundantemente en HPB. Ademas, la figura 33 demuestra que Shh no se expresa de forma ubicua en toda la prostata, sino que esta presente en un gradiente con el nivel mas alto de transcritos tanto de hedgehog como de ptc-1 presentes en la zona central proximal de la prostata.

Adicionalmente, se analizo la expresion de Shh y gli-1 por Q-RT-PCR. La figura 34 muestra que tanto Shh como gli-1 se expresan en muestras de HPB. Se proporciona la expresion de Shh y gli-1 en muestras de carcinoma basocelular (BCC) para la comparacion. Estos resultados demuestran que gli-1 se expresa en muestras de HBP a un nivel similar al encontrado en un tipo de cancer conocido que esta provocado por una mutation de la ruta de hedgehog. Finalmente, la figura 35 muestra la expresion de Shh y gli-1 en lineas celulares de HBP, y compara la expresion con la observada en BCC, lineas celulares de cancer de prostata y fibroblastos normales de la prostata. Cabe senalar que gli-1 se expresa a niveles similares en tanto en lineas celulares de HBP como en muestras de BCC. Estos resultados son indicatives de una funcion para la senalizacion de hedgehog en HBP y sugiere, ademas, que el antagonismo de la senalizacion de hedgehog tiene una utilidad significativa en el tratamiento de HBP.

PROCEDIMIENTOS: Hibridacion in situ (figuras 31 y 33): Se criosecciona tejido fijado en paraformaldehido en secciones de 30 pm, se digiere con proteinasa K, se hibrida durante la noche con sonda de ARN marcada con digoxigenina. Despues de lavados de alta rigurosidad posteriores a la hibridacion, se incuban las secciones con un anticuerpo anti-digoxigenina, que esta marcado con fosfatasa alcalina. La serial se visualiza por adicion de BM purpura, una solution de cromogenica disponible comercialmente que reacciona con la fosfatasa alcalina para formar un precipitado de color purpura.

Hibridacion radiactiva in situ (figura 32): Brevemente, secciones de 7 mm de tejido incrustado en parafma y fijado en paraformaldehido, que contiene islas de celulas basales grandes, se limpian se rehidratan, se digieren con proteinasa K, se acetilan y se hibridan durante la noche con sondas de ARN marcadas con P33. Despues de lavados de alta rigurosida posteriores a la hibridacion, los portaobjetos se sumergieron en fotoemulsion y se incubaron en la oscuridad durante 14 dias a 4 °C. Despues del revelarlos, los portaobjetos se tineron con contraste con hematoxilina y eosina y se sometieron a formacion de imagenes usando iluminacion de campo oscuro. Las imagenes de campo oscuro se convirtieron al color artificial rojo y se superpusieron con imagenes de campo brillante. Q-RT-PCR: Las muestras se recogieron en Trizol (GIBCO-BRL) y se aisld el ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuation, el ARN se transcribio en ADNc de primera hebra de acuerdo con protocolos estandar, y se amplified usando un sistema de deteccion de secuencias ABI Prism 7700 (TaqMan) de Perkin Elmer y cebadores especificos de gen. Se usd el gen constitutive GAPDH para normalizar la concentracion de ARN y la eficacia de la PCR, y se anadieron cebadores de GAPDH a las mismas reacciones. Dado que las sondas para ambos genes estan marcadas con diferentes fluoroforos, la serial especifica y la de GAPDH se pueden detectar en el mismo tubo. Las intensidades de serial se calcularon usando los algoritmos proporcionados en Sequence Detector v1.7, el software proporcionado por el fabricante.

Ejemplo 8: Antagonismo de la senalizacion de hedgehog en cancer de colon

El crecimiento de los tumores es un proceso complejo que requiere proliferacion, angiogenesis, la inhibicion de la muerte celular y muchas otras interacciones complejas entre las celulas cancerosas y el tejido adyacente. Un mecanismo adicional por el que la senalizacion de hedgehog puede influir en el crecimiento del tumor y su progresion es a traves de la induccion de factores que potencian la proliferacion, la angiogdnesis y la inhibicion de la muerte celular. Por ejemplo, se ha demostrado que sonic hedgehog induce VEGF en fibroblastos. Por lo tanto, el uso de antagonistas de hedgehog puede evitar que la senalizacion de hedgehog induzca factores que promueven la formacion de tumores y, por lo tanto, puede inhibir la formacion o progresion de tumores.

5

10

15

20

25

30

35

Para ayudar a abordar este modelo, se investigo la capacldad del anticuerpo 5E1 antagonista de hedgehog de inhibir el crecimiento tumoral en ratones a los que se les habia inyectado una combinacion de celulas de cancer de colon que expresan hedgehog y fibroblastos. Se realizaron dos experimentos para evaluar los efectos del tratamiento con 5E1 sobre el tamano del tumor en ratones a los que se les habia inyectado celulas de cancer de colon que expresan hedgehog. En el primer experimento, el tratamiento con 5E1, o el control de PBS, se inicio el mismo dia de la inyeccion con las celulas tumorales. Los resultados se resumen en la figura 36, y demuestran que el tratamiento con 5E1 disminuye significativamente el tamano, el peso, y la tasa de crecimiento del tumor en comparacion con los de ratones tratados con PBS (figura 36). El experimento se realizo usando dos lineas celulares de cancer de colon por separado con efectos similares.

En el segundo experimento, el tratamiento con 5E1 se retraso hasta el undecimo dia de crecimiento del tumor. Los resultados se resumen en la figura 37, y demuestran que el tratamiento con 5E1 disminuye significativamente el tamano y la tasa de crecimiento del tumor en comparacion con los ratones de control (figura 37). El experimento se realizo usando dos lineas celulares de cancer de colon por separado con efectos similares.

Estos resultados demuestran la utilidad de los antagonistas de hedgehog en la inhibition de la proliferacion y el crecimiento de celulas cancerosas. Adicionalmente, este modelo proporciona un procedimiento in vivo para evaluar facilmente la eficacia de antagonistas de hedgehog candidatos.

PROCEDIMIENTOS: Experimento 1. A veinte ratones atimicos se les inyecto por via subcutanea una combinacion de 106 celulas HT-29 (una linea celular de cancer de colon que expresa Shh) y 106 celulas 10T 1/2 (una llnea celular de fibroblastos) en un volumen de 100 pi. Los ratones se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos. El grupo A se trato con PBS y el grupo B se trato con 5E1. Los tratamientos se iniciaron el mismo dia que la inyeccibn de las celulas tumorales. El tratamiento se administro IP, 3 veces/semana, durante un periodo de treinta dias, y a una dosis de 6 mg/kg. Adicionalmente, este experimento se llevo a cabo bajo un protocolo identico usando otra linea celular de cancer de colon que expresa Shh (Colo205) con resultados similares.

Experimento 2 - administration retardada. A veinte ratones atimicos se les inyecto por via subcutanea una combinacion de 106 celulas HT-29 (una linea celular de cbncer de colon que expresa Shh) y 106 celulas 10T 1/2 (una linea celular de fibroblastos) en un volumen de 100 pi. Los ratones se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos. El grupo A se trato con PBS y el grupo B se trato con 5E1. El tratamiento se inicio despues de que el tumor hubiera crecido hasta el dia 11. Dichos tumores tenian un volumen de aproximadamente 90 a 210 mm3. El tratamiento se administro IP, 3 veces/semana, durante un periodo de veintinueve dias (hasta el dia 40 de crecimiento total del tumor), y a una dosis de 6 mg/kg. Adicionalmente, este experimento se llevo a cabo bajo un protocolo identico usando otra linea celular de cancer de colon que expresa Shh (Colo205) con resultados similares.

Ejemplo 9: Seleccion de farmacos

Los ejemplos anteriores presentan modelos tanto in vitro como in vivo para examinar los efectos del antagonista de hedgehog sobre la proliferacion celular. Los modelos proporcionan ensayos para someter a prueba una gama de agentes antagonistas para su capacidad de inhibir el crecimiento y la proliferacion celular. Dichas selecciones se pueden usar en ensayos iniciales para identificar compuestos principales, y tambien se pueden usar para evaluar las eficacias relativas de los compuestos candidatos.

Claims (34)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   1. Uso de un antagonista de hedgehog para la preparation de una composition farmaceutica para inhibir la proliferation no deseada de celulas, por el que se determina que las celulas sobreexpresan un gen gli-1, y

   por el que dicho antagonista provoca proliferacion celular disminuida,

   en el que dicha proliferation celular no deseada es hiperplasia benigna de prostata o un cancer, y en el que dicho cancer se selecciona de cancer asociado con uno o mas de los tejidos de prostata, mama y vejiga,

   en el que el antagonista de hedgehog es un inhibidor de la ruta de serialization de hedgehog y se selecciona de:

   a) un anticuerpo contra hedgehog que se une a una proteina hedgehog, o

   b) un compuesto que tiene la estructura del compuesto B:

   imagen1
2. 2. Uso de la revindication 1, en el que dicho cancer est& asociado con tejidos de la vejiga.
3. 3. Uso de la revindication 1, en el que dicha forma de cancer asociado con tejido de mama se selecciona de

   carcinoma ductal inferior, carcinoma lobular inferior, carcinoma intraductal, carcinoma medular y carcinoma tubular.
4. 4. Uso de la revindication 1, en el que dicho cancer asociado con tejido de la prostata es adenocarcinoma.
5. 5. Uso de la revindication 1, en el que dicha proliferacion no deseada de celulas es hiperplasia benigna de prostata.
6. 6. Uso de la revindication 1, en el que dicho antagonista de hedgehog es el compuesto B.
7. 7. Uso de la revindication 1, en el que el antagonista de hedgehog es un anticuerpo contra hedgehog que se une

   a una proteina hedgehog e inhibe la serialization de hedgehog.
8. 8. El antagonista de hedgehog para su uso en el tratamiento de hiperplasia benigna de prostata o un cancer asociado con uno o mas tejidos de prostata, mama y vejiga, por el que se determina que las celulas sobreexpresan un gen gli-1, en el que el antagonista de hedgehog es un inhibidor de la ruta de serialization de hedgehog y se selecciona de:

   a) un anticuerpo contra hedgehog que se une a una proteina hedgehog, o

   b) un compuesto que tiene la estructura del compuesto B:

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   o

   imagen2
9. 9. Antagonists de hedgehog para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que dicho cancer esta asociado con tejidos de la vejiga.
10. 10. Antagonists de hedgehog para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que el cancer esta asociado con tejido de mama, y en el que dicho cancer asociado con tejido de mama se selecciona de carcinoma ductal inferior, carcinoma lobular inferior, carcinoma intraductal, carcinoma medular y carcinoma tubular.
11. 11. Antagonista de hedgehog para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que el cancer esta asociado con tejido de la prostata, y en el que dicho cancer asociado con tejido de la prostata es adenocarcinoma.
12. 12. Antagonista de hedgehog para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que dicho antagonista de hedgehog es el compuesto B.
13. 13. Antagonista de hedgehog para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que el antagonista de hedgehog es un anticuerpo contra hedgehog que se une a una proteina hedgehog e inhibe la senalizacion de hedgehog.
14. 14. Uso de la reivindicacion 2, en el que el antagonista de hedgehog es un anticuerpo contra hedgehog que se une a una proteina hedgehog e inhibe la senalizacion de hedgehog.
15. 15. Uso de la reivindicacion 3, en el que el antagonista de hedgehog es un anticuerpo contra hedgehog que se une a una proteina hedgehog e inhibe la senalizacion de hedgehog.
16. 16. Uso de la reivindicacion 4, en el que el antagonista de hedgehog es un anticuerpo contra hedgehog que se une a una proteina hedgehog e inhibe la senalizacion de hedgehog.
17. 17. Uso de la reivindicacion 5, en el que el antagonista de hedgehog es un anticuerpo contra hedgehog que se une a una proteina hedgehog e inhibe la senalizacion de hedgehog.
18. 18. Antagonista de hedgehog para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el antagonista de hedgehog es un anticuerpo contra hedgehog que se une a una proteina hedgehog e inhibe la senalizacion de hedgehog.
19. 
    19. Antagonista de hedgehog para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que el antagonista de

    
    hedgehog es un anticuerpo contra hedgehog que se une a una proteina hedgehog e inhibe la senalizacion de

    hedgehog.
20. 
    20. Antagonista de hedgehog para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que el antagonista de

    
    hedgehog es un anticuerpo contra hedgehog que se une a una proteina hedgehog e inhibe la senalizacion de

    hedgehog.

    imagen3

    COMPUESTO A

    N

    N

    MH

    CF.

    Fig. 2A

    COMPUESTO B

    N

    HN-

    imagen4

    ,N

    MeO

    Fig. 2B

    zx

    CN

    imagen5

    Fig. 3

    PROXIMAL DISTAL

    imagen6

    imagen7

    S‘>-v

    bronquio

    principal

    imagen8

    imagen9

    or-*,; :&r ---■ v. -

    'vT: ’?W:£- *.\3

    yU- /*„ • 4*.

    ,r~t; Epitelio de ?t

    respiracion ->v-, r%^r:';

    imagen10

    Y

    Fig. 4

    E12

    E15

    E18

    ADULTO

    imagen11

    EL COMPUESTO B REGULA POR DISMINUCION mGli-1 EN CULTIVOS DE EXPLANTE DE PULMON

    imagen12

    Fig. 6

    RATON gli-l/GAPDH

    EL TRATAMIENTO CON COMPUESTO B AUMENTA LA PRODUCCION DE TENSIOACTIVO DE

    TIPO C

    EN PULMONES DE RATON EMBRIONARIO (FIGURA7).

    16 1 141210.80.60.40.20-

    ♦

    5

    1

    CONTROL

    COMPUESTO B, 6

    GRUPOS DE TRATAMIENTO

    Fig. 7

    LOS NEUMOCITOS DE TIPO II EN CULTIVOS DE PULM6N TRATADOS CON EL COMPUESTO B SE DIFERENCIAN DE FORMA PREMATURA

    imagen13

    r

    CD

    GO

    imagen14

    imagen15
21. 3.5000-
22. 3.0000- 2.5000 - 2.0000 -

    1.5000-

    1.0000- 0.5000 -
23. 0.0000--------------

    Y

    Fig. 9

    0 Control

    H Compuesto B:

    imagen16

    Gli-l/GAPDH

    ■J

    E2) CONTROL

    51 4.543.532.521.51 - 0.50-

    !3

    □

    imagen17

    Sp-C/GAPDH

    Fig. 10

    COMPUESTO B, 2 HIDROCORTISONA, l[Xg/m\

    PROTEINA Shh Y AGONISTA Z DE HEDGEHOG

    gli-l/GAPDH SP-C/GAPDH

    E2 CONTROL

    imagen18

    CD

    O)

    r

    HIBRIDACION in situ DE Gli-1 EN CANCER DE MAMA-EXPRESION EPITELIAL

    P5 - DUCTAL DE INFILTRACI6N P10 - DUCTAL DE INFILTRACI6N P17 - CIS INTRADUCTAL

    imagen19

    ANTISENTIDO

    CON

    SENTIDO

    imagen20

    Fig^l2

    imagen21

    CD

    ■vl

    r

    HIBRIDACION in situ DE Gli-1 EN CANCER DE PULMON L4-ADENOCARCINOMA L17-CARCINOMA MICROCITICO L20-CARCINOMA MICROCITICO

    ISENTIDO

    imagen22

    H y E ANTISENTIDO C0N SENTIDO

    imagen23

    Fig. 14

    r

    BPH4 BPHU BPH17

    imagen24

    FigTl5

    ptc-lacZ, RECIEN NACIDO gli-1, ADULTO

    imagen25

    Fig'T6

    §11 VEJIGA NORMAL DE ADULTO

    imagen26

    V

    Fig. 17

    102

    SENALIZACION DE HH EN LINEAS CELULARES DE CANCER DE

    VEJIGA

    (IdenFBSal 10 %, 2 d en FBS al 1 %)

    □ HT1376 0 RT4 HTB-2

    0 SW780 HD HT 1197

    m J82 HTB-1 □ TCCSUP HTB-5

    B T24 HTB-4 □ 5637 HTB-9

    imagen27

    hShh/GAPDH h gli-l/GAPDH

    Shh p,c.i Smo

    imagen28

    imagen29

    LfNEAS CELULARES LINEAS CELULARES LINEAS CELULARES

    Fig. 19

    EFICACIA IN VITRO ENSAYO Gli-luc

    r

    LINEA CELULAR DE FIBROBLASTOS S12 CON INDICADOR DE LUCIFERASA

    imagen30

    Fig. 20

    B. Diagrama de flujo

    Dia 1

    Placa S12 + celulas cancerosas DMEM, FBS al 10%

    l

    Dia 2

    Cambio a FBS al 1 %

    Dejar crecer 2 d

    1

    Dia 4

    Leer actividad luciferasa en Topcount o

    Tratar con compuestos (leer al dia siguiente)

    105

    ENSAYO Gli-luc EN LINEAS CELULARES DE CANCER DE VEJIGA (COCULTIVOS DE S12 + CELULAS CANCEROSAS, 1 d EN FBS AL 10 %, 2 d EN FBS AL

    1 %)

    Ml

    12-

    10-

    8-

    6-

    4-

    2-

    □ SI 2

    7^1

    L-i'iAv

    MONOCAPA DE LINEA CELULAR

    LINEA CELULAR + S12

    * TOXICIDAD

    imagen31

    i®Sg

    imagen32

    Fig. 21

    106

    ENSAYO Gli-luc EN RT-4

    5E1, 24 hrs

    imagen33

    RT-4

    S12-RT4

    RT4-SOLO

    1E6, Ab de control

    Cl50 = 85ng/ml

    Clgo = 500 ng/ml

    Fig. 22

    107

    imagen34

    PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO

    Fig. 23

    Control de IgG

    PESO DEL TUMOR (mg)

    o

    oo

    PESOS DE TUMOR DEL EXPERIMENTO IN VIVO EN RT-4

    imagen35

    PESOS DE TUMOR INDIVIDUAL EN RT-4

    X

    0

    §

    *

    t

    j

    +

    Fig. 24

    j

    GRUPO

    GRUPOS

    EXPRESI6N DE Gli-1 DE RATON EN TUMORES RT-4 TRATADOS CON 5E1

    EXPRESION DE Gli-1 DE RATON EN TUMORES RT-4

    Gli-1 DE RATON EN COLONES RT-4

    imagen36

    imagen37

    V

    V

    Fig. 25

    j

    TRATAMIENTO

    estandar de intestino delgado raton = 0,06

    TRATAMIENTO

    estandar de intestino delgado raton = 0,1

    110

    Shh a/s

    Shh s

    imagen38

    V

    Fig. 26

    H377

    imagen39

    hGli-l/hGAPDH

    imagen40

    PROSTATA NORMAL DE ADULTO ADENOCARCINOMA DE PROSTATA

    imagen41
24. 0.6 i

    O

    O

    >

    "D

    0

    1
25. 0.5-
26. 0.4
27. 0.3
28. 0.2
29. 0.1

    0

    imagen42

    V.

    Fig. 27

    imagen43

    CONJUNTO COMBINADO

    CONJUNTO NO COMBINADO

    CONJUNTO COMBINADO 1

    J

    112

    SENALIZACION DE HH EN UNEAS CELULARES DE CANCER DE

    PROSTATA

    (IdenFBSal 10 %, 2 d en FBS al 1 %)

    hShh

    1.4 i 1.2- 1 -
30. 0.8- 0.6- 0.4- 0.2 - 0-
31. -0.2 -

    imagen44

    hGli-1

    imagen45

    ________J

    V

    Fig. 28

    113

    ENSAYO Gli-Luc EN LINE AS CELULARES DE CANCER DE PR6STATA (COCULTIVOS DE S12 + CELULAS CANCEROSAS, 1 d EN FBS AL 10 %, 2 d EN FBS AL

    1%)

    imagen46

    Fig. 29

    EFICACIA IN VITRO

    IN HI BICION DE LA SENALIZACION DE HEDGEHOG POR ANTAGONISTAS DE HEDGEHOG

    (Gli-Luc, 24 horas)

    5E1

    imagen47
32. 0.0001 0.001
33. 0.01
34. 0.1

    10

    Fig. 30

    Shh a/s Shh s

    H534 H552 H589 H609 H651 H670

    imagen48

    PACIENTE G PACIENTE H PACIENTE I

    Fio31

    116

    H y E

    ANTISENTIDO

    CON

    SENTIDO

    BPH4

    BPH11

    BPH17

    imagen49

    imagen50

    imagen51

    117

    GRADIENTE DE Shh PROXIMODISTAL EN PROSTATA NORMAL

    imagen52

    9

    8

    7

    6

    5

    4

    3

    2

    1

    0

    imagen53

    imagen54

    M hGli-l/GAPDH H hShh/GAPDH

    imagen55

    H381,

    BPH

    H409,

    BPH

    BCC1

    BCC2

    Fig. 34

    Shh/GAPDH

    V

    imagen56

    □ bcc

    [IlCEREBRO FETAL

    UA BRFF-55T (BPH)

    [H 267B (BPH)

    fl~PI FIBROBLASTOS PrSc

    Ej PC-3 (CANCER DE PROSTATA)

    Gli-1

    CD

    30

    O

    CO

    I— > on —I O

    on

    O

    m

    no

    30

    O

    on

    H

    >

    H

    >

    o

    30

    \| Q V

    s \

    o \ m\ 30 \

    O \

    on v H N > \

    V

    Fig. 35

    imagen57

    j

    2000

    1800

    1600

    1400

    1200

    1000

    800

    600

    400

    200

    0

    —PBS prom. Avg5El

    VALOR P<0,01

    imagen58

    DIAS

    Fig. 36

    TAMANO DEL TUMOR (mm3)

    2000 n 1800- 1600" 1400" 1200" 1000- 800- 600- 400- 200-

    0-

    0

    imagen59

    5 10 15 20 25 30 35 40

    DIAS

    Fig. 37