KR20230055443A - 방사선 치료 민감성 진단용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 방사선 치료 민감성 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에서는 암 세포에서 HDAC5와 p53이 방사선 조사에 의해 상호 작용하고, p53을 매개로 엑소좀 방출이 증가되며, 엑소좀 내 miR-151a-3p의 mRNA 발현이 감소하는 것을 확인하였고, miR-151a-3p의 억제가 방사선 비 조사 암 세포의 세포 사멸을 촉진하여 방사선 치료의 민감성을 높이는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명에 따른 miR-151a-3p는 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단 또는 방사선 치료 예후 예측을 위한 바이오마커로서 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

방사선 치료 민감성 진단용 바이오마커 및 이의 용도 {Biomarker for diagnosing sensitivity to radiotheraphy and use thereof}

본 발명은 방사선 치료 민감성 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리나라의 경우, 질병 사망원인 중 제 1위의 질병으로서 연간 약 10만 명 이상이 진단되고, 약 6만 명 이상이 사망하고 있다.

암 치료를 위한 일반적인 항암 치료법으로는 외과적 수술, 화학 치료, 방사선 치료 등이 있는데, 이 중 수술이나 방사선 치료가 용이하지 않은 환자(전체 암 사례의 약 50 %)와, 이미 암이 전이된 환자들은 주로 화학 요법으로 치료한다. 그러나 약물 내성 및 재발, 전이 및 후유증 등으로 인해 최근에는 부작용을 최소화할 수 있는 암 치료 기술의 개발이 중요한 실정이다.

방사선 치료(radiotherapy, RT)는 암세포의 증식을 억제할 수 있는 가장 일반적으로 사용되는 치료 방법 중 하나이다. 그러나 RT에 대한 민감성을 감소시키고 방사선에 내성을 가지는 몇 가지 부작용이 있을 수 있어, 최근 RT의 목표는 방사선 치료의 부작용을 줄여 환자 삶의 질을 향상시키는 것이다. 특히 간세포 암종(hepatocellular carcinoma, HCC)에서 RT는 암의 진행을 예방하고 외과적 치료를 돕는 핵심 치료법이 되었다. RT는 잠재적으로 간 절제 또는 이식이 필요한 환자의 국소 종양 전이에 가장 효과적인 치료법이다.

엑소좀은 세포 외부로 방출되는 30~150 nm 크기의 세포밖 소포로 구조적으로 인지질 이중층 막을 구성하므로 체내의 다양한 효소에 의해 분해될 가능성이 없다. 암세포는 정상 세포보다 10 배 더 많은 엑소좀을 분비하며, 성장 인자, 케모카인, 마이크로RNA(miRNA) 등을 엑소좀 내부에 포함하여 암 주변의 미세 환경을 조절하고 암세포의 성장과 소통을 촉진한다. 최근 엑소좀에 포함된 miRNA에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

종양 유래 엑소좀 miRNA는 방출 후 종양 유래 엑소좀 내에서 세포-세포 상호 작용을 통해 종양 성장, 침입, 전이 및 치료 저항성을 유지하는 것과 같은 기능을 조절한다. 따라서, 엑소좀 내 miRNA는 종양 진행을 매개하는 필수 기능을 가지고 있으며, 암 진단 및 예측에 유망한 바이오마커로 적용될 수 있다.

p53은 암에서 매우 중요하며 다양한 외부 스트레스에 대한 반응으로 세포주기 조절, 노화, 세포 사멸 및 게놈 안정성을 조절하는 종양 억제제이다. 최근 연구에 따르면 p53 변형은 히스톤 데아세틸라제 5(histone deacetylase 5, HDAC5)에 의해 일시적으로 조절되고, p53의 다양한 번역 후 변형은 다양한 표적 유전자 세트에 대한 p53 프로모터 특이성을 결정하는데 중요한 역할을 한다고 보고되었다. 번역 후 변형 동안, DNA 결합 도메인의 리신(lysine) 120에서 p53의 아세틸화는 p53 매개 세포 사멸과 관련이 있다. 또한, p53의 이펙터 TSAP6 다운스트림(downstream)을 통해 스트레스에 의해 p53 반응이 일어나는 세포에서 엑소좀의 분비가 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 엑소좀은 p53 반응에 의해 조절될 수 있다.

히스톤 아세틸화/탈아세틸화는 유전자 발현 조절에 중요한 역할을 한다. 특히, 클래스 II HDAC 중 하나인 HDAC5는 다양한 전사 보조 인자와의 상호 작용에 의한 세포 신호를 조절하는데 관여하고 있으며 유전자 발현에 대한 반응성을 부여한다. 이전 연구에 따르면 종양 억제제 p53은 유전 독성을 유발하는 DNA 손상에 의해 활성화되며 일시적인 조절자로서 HDAC5는 스트레스의 초기 단계에서 p53과 상호 작용하여 p53을 탈 아세틸화한다. p53에 의해 조절되는 pro-apoptotic 표적 유전자는 HDAC5에 의한 p53의 k120 탈아세틸화에 의해 트랜스활성화되며, 이는 p53 변형의 조절자로서 세포의 운명을 결정한다. 그러나 종양에서 방사선 요법에 대한 반응에서 HDAC5의 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

본 발명자들은 HDAC5와 p53이 방사선 조사에 의해 상호 작용하고, 이로 인해 엑소좀 방출을 증가시키고 엑소좀 내 miRNA의 구성을 변화시키는 것을 확인하였는 바, 종양 증식에 영향을 미치는 종양 유래 엑소좀 내 miRNA 중 방사선 조사에 의해 발현이 변화하는 miRNA의 작용을 확인함으로써 종양 치료제 및 RT 민감성에 대한 바이오마커 및 RT 민감성 증진을 위한 물질의 개발에 활용하고자 하였다.

J Clin Transl Hepatol. 2019 Jun 28; 7(2):183-190.

본 발명자들은 암세포에서 방사선 조사에 의해 HDAC5와 p53이 상호 작용하고, 이로 인해 엑소좀 방출이 증가되고, 엑소좀 내 miRNA 중 miR-151a-3p의 발현이 방사선 조사에 의해 감소하는 것을 확인하였으며, miR-151a-3p의 억제가 방사선 비 조사 종양 세포의 세포 사멸을 촉진하여 RT의 민감성을 높이는 것을 확인하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단용 조성물/키트; 또는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 miR-151a-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 증진용 조성물; 또는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단을 위한 정보제공방법; 또는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 제제는 암세포 유래 엑소좀 내 miR-151a-3p의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 암세포는 p53^+/+ 암 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 엑소좀은 방사선 조사 시 히스톤 탈아세틸화효소 5(HDAC5) 및 p53의 상호작용을 통해 p53을 매개로 암세포에서 방출될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 암은 간암, 신경교종, 육종, 대장암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 폐암, 두경부암, 난소암, 방광암, 위암, 식도암, 담관암, 췌장암, 자궁경부암, 피부암, 림프종, 갑상선암, 골수암, 자궁내막암, 신장암, 직장암, 및 뇌종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 miR-151a-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 증진용 조성물로서,

상기 암 환자는 방사선 치료가 필요한 암 환자인 것을 특징으로 하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-151a-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,

상기 조성물은 방사선 치료가 필요한 암 환자에 투여되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 miR-151a-3p 억제제는 암세포 유래 엑소좀 내 miR-151a-3p의 mRNA에 상보적으로 결합하는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 방사선 치료 시 방사선이 직접 조사되지 않은 주변 암세포에 대해 방관자 효과(bystander effect)를 나타낼 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 방사선 치료 후의 암 환자로부터 분리된 시료에서 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준이 방사선 치료 전에 비해 감소한 경우 암 환자의 방사선 치료 민감성이 높은 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 방사선 치료 후의 암 환자로부터 분리된 시료에서 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준이 방사선 치료 전에 비해 감소한 경우 암 환자의 방사선 치료 예후가 좋은 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단 또는 방사선 치료 예후 예측 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-151a-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 증진 방법; 또는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-151a-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의, 암 환자의 방사선 치료 민감성 증진 용도; 또는 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-151a-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의, 암 환자의 방사선 치료 민감성 증진용 약제의 제조를 위한 용도; 또는 암 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 방사선 치료 후의 암 환자로부터 분리된 시료에서 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 방사선 치료 후의 암 환자로부터 분리된 시료에서 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 예후 예측 방법을 제공한다.

본 발명에서는 암 세포에서 HDAC5와 p53이 방사선 조사에 의해 상호 작용하고, p53을 매개로 엑소좀 방출이 증가되며, 엑소좀 내 miR-151a-3p의 mRNA 발현이 감소하는 것을 확인하였고, miR-151a-3p의 억제가 방사선 비 조사 암 세포의 세포 사멸을 촉진하여 방사선 치료의 민감성을 높이는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명에 따른 miR-151a-3p는 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단 또는 방사선 치료 예후 예측을 위한 바이오마커로서 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

도 1a는 본 발명의 일 구현예에 따른 HepG2 세포에 2 gy 및 4 gy로 방사선을 조사할 경우 HDAC5 및 p53 단백질 발현량을 시간별로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1b는 본 발명의 일 구현예에 따른 SK-Hep1 세포에 2 gy 및 4 gy로 방사선을 조사할 경우 HDAC5 및 p53 단백질 발현량을 시간별로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1c는 본 발명의 일 구현예에 따른 Hep3B 세포에 2 gy 및 4 gy로 방사선을 조사할 경우 HDAC5 및 p53 단백질 발현량을 시간별로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1d는 본 발명의 일 구현예에 따른 p53^-/- 세포의 제조 과정 및 결과를 나타낸 도면이다.
도 1e는 본 발명의 일 구현예에 따른 p53^+/+ 및 p53^-/- 세포에 방사선을 조사할 경우 HDAC5, p53, p21, 및 Puma 단백질 발현량을 시간별로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1f는 본 발명의 일 구현예에 따른 p53^+/+ 및 p53^-/- 세포에서 방사선 조사에 의한 세포주기 변화를 확인한 도면이다.
도 1g는 본 발명의 일 구현예에 따른 p53^+/+ 및 p53^-/- 세포에서 방사선 조사에 의한 세포 사멸을 확인한 도면이다.
도 2a는 본 발명의 일 구현예에 따른 방사선 조사에 의한 p53과 HDAC5 간의 상호 작용을 확인한 도면이다.
도 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 p53^+/+ 및 p53^-/- 세포에 방사선을 조사할 경우 TSAP6 단백질 발현량을 확인한 도면이다.
도 2c는 본 발명의 일 구현예에 따른 HepG2 세포에서 분비되는 엑소좀을 전자 현미경으로 관찰한 도면이다.
도 2d는 본 발명의 일 구현예에 따른 p53^+/+ 및 p53^-/- 세포에 방사선을 조사할 경우 세포 용해물(좌측 도면) 및 엑소좀(우측 도면)에서 엑소좀 마커의 발현량을 확인한 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일 구현예에 따른 p53^+/+ 및 p53^-/- 세포에서 방사선 조사에 따라 분비되는 엑소좀의 크기 분포를 확인한 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일 구현예에 따른 p53^+/+ 및 p53^-/- 세포에서 방사선 조사에 따라 분비되는 전체 소포의 양을 확인한 도면이다.
도 3c는 본 발명의 일 구현예에 따른 p53^+/+ 및 p53^-/- 세포에서 방사선 조사에 따라 분비되는 소포의 양을 크기별로 나누어 확인한 도면이다.
도 3d는 본 발명의 일 구현예에 따른 방사선 조사 후 p53 유무에 따른 소포의 분비량을 확인한 도면이다.
도 4a는 본 발명의 일 구현예에 따른 방사선 조사 후 변화된 엑소좀 내 miRNA를 히트맵을 통해 확인한 도면이다.
도 4b는 본 발명의 일 구현예에 따른 방사선 조사 후 변화된 엑소좀 내의 각 miRNA에서 유전자 온톨로지(ontology) 용어를 사용하여 다양한 세포 기능 범주로 분류 및 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4c는 본 발명의 일 구현예에 따른 방사선 조사 전후의 엑소좀 내 miRNA를 fold change 값으로 배열하여 그래프 및 벤다이어그램으로 나타낸 도면이다.
도 4d는 본 발명의 일 구현예에 따른 간세포 암종 GEO 데이터 세트(스페인, GSE74618; 및 일본, GSE147889)를 사용하여 간세포 암종의 진행과 관련된 엑소좀 내 miRNA를 식별하여 볼케이노 플롯 및 평균 차이 플롯으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4e는 본 발명의 일 구현예에 따른 간세포 암종 miRNA GEO 데이터 세트(스페인, GSE74618)를 사용하여 정상 및 종양 조직의 엑소좀 내 miRNA 발현을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4f는 본 발명의 일 구현예에 따른 간세포 암종 GEO 데이터 세트(일본, GSE147889)를 사용하여 엑소좀 내 miRNA의 발현 정도를 주변 조직과 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4g는 본 발명의 일 구현예에 따른 간세포 암종에서 발현이 증가된 4개의 miRNA(miR-151a-3p, miR-106b-5p, miR-183-5p, miR-452-5p)와 간암 환자의 생존율 사이의 관계를 확인한 도면이다.
도 4h는 본 발명의 일 구현예에 따른 간세포 암종에서 방사선 조사 후 세포 및 엑소좀 내 miR-151a-3p의 발현을 확인한 도면이다.
도 5a는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-151a-3p 형질 감염 세포에서 p53, P21, Puma, 및 BCL-2의 발현 변화를 확인한 도면이다.
도 5b는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-151a-3p 형질 감염 세포에서 세포 주기 변화를 확인한 도면이다.
도 5c는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-151a-3p 형질 감염 세포에서 방사선 조사에 의해 유도되는 세포 사멸 조절 효과를 확인한 도면이다.
도 6a는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-151a-3p 형질 감염 세포에서 상피 중간엽 전이(EMT) 마커의 발현을 확인한 도면이다.
도 6b는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-151a-3p 형질 감염 세포에서 miR-151a-3p의 농도별 세포 증식 증가 효과를 확인한 도면이다.
도 6c는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-151a-3p 형질 감염 세포에서 miR-151a-3p의 농도별 세포 이동 및 침입 증가 효과를 확인한 도면이다.
도 7a는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-151a-3p 과발현 마우스에서 종양 크기 및 무게를 확인한 도면이다.
도 7b는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-151a-3p 과발현 마우스에서 시간에 따른 종양 크기를 확인한 도면이다.
도 7c는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-151a-3p 과발현 마우스의 종양 조직에서 p53, P21 및 Puma α/β의 발현을 확인한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 암세포에서 방사선 조사에 의한 HDAC5와 p53의 상호작용 결과 분비되는 엑소좀 내 miR-151a-3p의 발현이 감소되어 암의 진행을 억제하는 기작을 도식화하여 나타낸 도면이다.

본 발명의 일 실험예에서는, 단백질 p53 및 HDAC5가 간세포 암종(HCC)에서 방사선에 의해 조절되는지 관찰한 결과, HDAC5 및 p53의 발현이 방사선 조사에 의해 조절되는 것을 확인하였다(실험예 1 참조).

본 발명의 다른 실험예에서는, 방사선 조사에 의한 p53 및 HDAC5 간의 상호 작용에 따라 엑소좀 조절 단백질로서 p53에 의해 제어되는 TSAP6의 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 엑소좀을 통해 의존적으로 p53에 의해 방출되는 단백질인 마스핀의 발현이 p53^+/+ 세포 유래 엑소좀 내부에서 방사선에 의해 증가하는 것을 확인하였다(실험예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는, p53^+/+ 세포에서 p53^-/- 세포와 비교하여 방사선 조사 후 분비되는 소포의 양이 증가하고 시간이 지남에 따라 소포의 변화는 크기가 증가하는 방향으로 변화하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 방사선 조사에 의해 유도된 p53의 발현이 TSAP6 경로를 통해 엑소좀 분비를 증가시킨다는 것을 알 수 있었다(실험예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는, HCC에서 방사선 조사에 의한 엑소좀 miRNA의 발현 변화를 확인한 결과, miR-151a-3p가 HCC의 낮은 생존율과 유의한 관계가 있었으며, HCC 세포주인 hepG2에서 방사선 조사 후 세포 및 엑소좀 내에서 miR-151a-3p의 발현이 유의하게 감소한 것을 확인하였다(실험예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는, 방사선에 의해 유발될 수 있는 세포 사멸 및 세포주기 정지와 관련된 단백질이 miR-151a-3p에 의해 감소하는 것을 확인함으로써 miR-151a-3p가 방사선 조사로 인한 세포 사멸을 억제하는 것을 알 수 있었다. 이에 더하여, miR-151a-3p가 암세포의 이동, 전이, 및 세포 증식을 증가시키고 종양에서 표적 단백질의 발현을 감소시키며, 결과적으로 종양 진행을 촉진하는 것을 확인하였다(실험예 5 참조).

이에, 본 발명은 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, “방사선”이란 예를 들면, 수은등의 휘선 스펙트럼, 엑시머 레이저로 대표되는 원자외선, 극자외선(EUV광), X선, 전자선, 이온빔 등의 입자선 등을 의미한다.

본 발명에 있어서, “방사선 치료 민감성”이란 방사선 치료에 의해 암세포가 쉽게 영향을 받고, 방사선에 노출 시 세포 복구 또는 증식에 변화를 보이는 상태를 말하며, 직접 방사선이 조사된 암세포 외에 방사선이 직접 조사되지 않은 주변 암세포에도 방사선에 의한 영향이 생겨 변화를 보이는 상태를 의미한다.

본 발명에 있어서, “바이오마커”란 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료반응을 예측할 수 있고 객관적으로 측정이 가능한 표지자를 의미하며, 본 발명에 따른 miR-151a-3p는 방사선 조사에 의한 p53 및 HDAC5 간의 상호 작용에 따라 p53 의존적으로 방출되는 엑소좀 내에서 mRNA의 발현이 유의적으로 감소하였으며, 이로 인해 종양이 억제되는 것을 확인하였는 바, miR-151a-3p는 방사선 치료 민감성 진단 또는 방사선 치료 예후 예측을 위한 바이오마커로 이용될 수 있다.

본 발명에 있어서, miR-151a-3p는 5'-cuagacugaagcuccuugagg-3'(서열번호 1)의 염기서열을 포함하거나 상기 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “진단”은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 암 환자의 방사선 치료 민감성 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에 있어서, “측정”이란 목적하는 물질의 존재(발현) 여부를 검출 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준)의 변화를 검출 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 상기 측정은 정성적인 방법(분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 상기 miR-151a-3p의 mRNA의 존재 여부 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다.

본 발명에 있어서, 상기 제제는 암세포 유래 엑소좀 내 miR-151a-3p의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 암세포는 p53^+/+ 암 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “세포밖 소포”는 세포 간 정보교환을 위해 모든 세포들이 외부 환경으로 분비하는 나노 크기의 소포를 의미하며, 세포밖 소포는 단백질, 지질, 핵산, 대사 물질 등 생물학적 활성을 보이는 다양한 물질들을 포함하고 있다. 세포밖 소포는 기원과 분비 기작, 크기 등을 기준으로 엑소좀(exosome), 마이크로베지클(microvesicle), 엑토좀(ectosome), 마이크로파티클(microparticle), 막 소포체(membrane vesicle), 나노베지클(nanovesicle), 외막 소포체(outer membrane vesicle) 등으로 나눌 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 엑소좀은 직경이 30 내지 150 nm인 세포밖 소포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “프라이머(primer)”란 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 mRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 따라서 본 발명에서 상기 mRNA의 cDNA 또는 genomic DNA의 염기서열을 참조하여 프라이머 쌍을 용이하게 디자인할 수 있다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다.

본 발명에 있어서, “프로브(probe)”는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA), DNA 등에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 프로브는 대립형질(또는 대립유전자, allele)을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출 방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다.

본 발명에서, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출하고자 하는 표적이 되는 폴리뉴클레오티드와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머 또는 프로브는 miR-151a-3p의 mRNA 발현을 측정할 수 있는 것이라면 특정 서열로 한정되지 않는다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단용 조성물을 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, “키트”는 상기 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함함으로써, 암 환자의 방사선 치료 민감성을 진단할 수 있도록 하는 도구를 의미한다. 본 발명의 키트에는 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제 외에도 이들의 검출 방법에 통상적으로 필요한 다른 구성성분, 조성물, 용액, 장치 등이 포함될 수 있다. 이때, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 1회 이상 횟수에 제한 없이 작용시킬 수 있으며, 각 제제를 적용하는 선후에는 제한이 없고, 각 제제의 적용은 동시에 진행될 수도 있고 미시에 진행될 수도 있다. 본 발명에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 컨테이너; 지시서; 및 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다. 상기 컨테이너는 상기 제제를 포장하는 역할을 할 수 있고, 보관 및 고정하는 역할을 할 수도 있다. 상기 컨테이너의 재질은 예컨대, 플라스틱, 유리병 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, "암 환자의 방사선 치료 예후 예측"이란, 방사선 치료 후, 치료 전과 비교하여 발현 차이를 보이는 miR-151a-3p를 통해 방사선 치료에 민감성이 높은 암 환자를 예측하는 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 엑소좀은 방사선 조사 시 히스톤 탈아세틸화효소 5(HDAC5) 및 p53의 상호작용을 통해 p53을 매개로 암세포에서 방출될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 방사선은 0.1 내지 10 Gy, 0.1 내지 8 Gy, 0.1 내지 6 Gy, 1 내지 10 Gy, 1 내지 8 Gy, 1 내지 6 Gy, 1 내지 5 Gy, 1 내지 3 Gy, 2 내지 10 Gy, 2 내지 8 Gy, 2 내지 6 Gy, 3 내지 5 Gy, 2 Gy, 또는 4 Gy로 조사할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, "그레이(Gy)"는 대표적인 생물학 조직 1kg에서 1J을 방출하는 방사선의 양이다.

본 발명에 있어서, “암(cancer)”이란 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성, 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 상기 암은 예컨대, 간암, 신경교종, 육종, 대장암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 폐암, 두경부암, 난소암, 방광암, 위암, 식도암, 담관암, 췌장암, 자궁경부암, 피부암, 림프종, 갑상선암, 골수암, 자궁내막암, 신장암, 직장암, 및 뇌종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예 또는 실험예에 따르면 간암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 miR-151a-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 증진용 조성물로서, 상기 암 환자는 방사선 치료가 필요한 암 환자인 것을 특징으로 하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 miR-151a-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 조성물은 방사선 치료가 필요한 암 환자에 투여되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-151a-3p 억제제는 암세포 유래 엑소좀 내 miR-151a-3p의 mRNA에 상보적으로 결합하는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, miR-151a-3p의 mRNA에 상보적으로 결합하여 miR-151a-3p의 발현을 억제할 수 있는 것이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 방사선 치료 시 방사선이 직접 조사되지 않은 주변 암세포에 대해 방관자 효과(bystander effect)를 나타낼 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “방관자 효과(bystander effect)”란 직접 방사선 조사를 받은 세포뿐만 아니라, 조사받지 않은 세포에도 방사선에 의한 영향이 생기는 효과를 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 방사선 치료 후의 암 환자로부터 분리된 시료에서 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준이 방사선 치료 전에 비해 감소한 경우 암 환자의 방사선 치료 민감성이 높은 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 방사선 치료 후의 암 환자로부터 분리된 시료에서 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준이 방사선 치료 전에 비해 감소한 경우 암 환자의 방사선 치료 예후가 좋은 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “발현”은 폴리펩티드(polypeptide)가 구조 유전자로부터 생산되는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 유전자의 mRNA로의 전사, 및 이러한 mRNA의 폴리펩티드(들)로의 해독을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준을 검출하기 위한 방법으로는, 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예컨대 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR, quantitative PCR, quantitative real-time PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “시료”는 방사선 치료 민감성을 진단하거나 방사선 치료 예후를 예측하고자 하는 암 환자로부터 채취된 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 본 발명의 일 실시예 또는 실험예에 따르면 상기 시료는 암 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단 또는 방사선 치료 예후 예측 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 miR-151a-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 증진 방법; 또는 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 miR-151a-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의, 암 환자의 방사선 치료 민감성 증진 용도; 또는 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 miR-151a-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의, 암 환자의 방사선 치료 민감성 증진용 약제의 제조를 위한 용도; 또는 암 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 방사선 치료 후의 암 환자로부터 분리된 시료에서 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 방사선 치료 후의 암 환자로부터 분리된 시료에서 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 예후 예측 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, “포함하는” 이라는 용어가 사용될 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 세포 배양 및 X-방사선 처리

간암 세포주 HepG2 및 SK-Hep1은 American Type Culture Collection(Rockville, MD)(ATCC HTB-177)에서 구입하였으며, Hep3B는 한국 세포주 은행(대한민국 서울)에서 구입하였다. 10 % 소태아혈청(FBS), 4.5 g/L 글루코스(glucose), L-글루타민(L-glutamine), 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), 100 U/ml의 페니실린 및 스트렙토마이신이 함유된 DMEM(Corning) 배지에서 배양하고, 5 % CO₂가 함유되어 있는 가습 챔버에서 37 ℃로 유지시켰다. 방사선은 X-RAD320(320 KV, 12.5 mA, 50 cm SSD(HVL

4 mm Cu)에서 1 Gray/분) 장비를 사용하여 2 Gray, 4 Gray로 노출되었다.

실시예 2. 엑소좀 정제

방사선 및 비방사선 엑소좀은 초 원심 분리 방법을 사용하여 정제되었다.

먼저, 1 x 10⁶개의 세포를 100 mm 접시에 분주(seed)하고 하룻밤 동안 회복시켰다. 이어서, 예열된 PBS로 세포를 2회 세척하고, 배양 배지를 5 % 엑소좀-고갈된 FBS(SBI)로 보충된 엑소좀이 없는 배지로 교체하였다. 상기 방사선 엑소좀은 X-RAD 320(320 KV, 12.5 mA, 50 cm SSD(HVL

4 mm Cu)에서 1 Gray/분) 장비를 사용하여 4 Gray 방사선이 처리된 것이다. 상기 배지를 모아서 구배 원심 분리를 수행하였다. 즉, 상기 배지를 먼저 1000 g에서 10분, 3000 g에서 30분 동안 원심 분리한 다음, Beckman Coulter Optima™ L-XP Ultracentrifuge System에서 100,000 g_avg, 4 ℃ 조건으로 90분 동안 SW 28 Swinging-Bucket Rotor(k-인자: 71)로 원심 분리하여 엑소좀 펠렛(pellet)을 제조하였다. 그리고 나서, 상등액을 조심스럽게 제거하고, 미가공 엑소좀 함유 펠렛을 1 mL의 빙냉 PBS에 재현탁하고 모았다. 그런 다음, 2차 초 원심 분리[SW 28 Swinging-Bucket Rotor(k-인자: 71)로 90분 동안 4 ℃에서 100,000 g_avg]를 수행하고, 생성된 엑소좀 펠렛을 500 μl의 PBS에 재현탁 시켰다.

실시예 3. 웨스턴 블롯 분석

세포를 수집하여 PBS로 세척하고, 프로테아제(protease) 억제제(GenDEPOT, 미국)를 함유하는 용해 완충액에 용해시켰다. 그런 다음, Bradford Protein Assay Reagent(Bio-Rad)로 단백질 농도를 측정한 후, 동일한 양의 단백질을 10 % SDS-PAGE에서 분리하고 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 막으로 전기적으로 전달하였으며, 5 % 스킴 밀크(skim milk) 및 5 % BSA로 차단하였다. 상기 막은 항-HDAC5(1 : 1000; Cell Signaling Technology, 미국), 항-p53(1 : 2000; Santacruz, 미국), 항-p21(1 : 2000; Cell Signaling Technology), 항-Puma(1 : 2000; Cell Signaling Technology), 항-STEAP3(1 : 1000; Proteintech, 미국), 항-Maspin(1 : 1000; Cell Signaling Technology), 항-CD63(1 : 1000; Santacruz), 항-CD81(1 : 1000; Santacruz), 항-HSP90(1 : 1000; BD bioscience), 항-BCL2(1 : 1000; Cell Signaling Technology), 항-E-cadherin(1 : 1000; Agilent Dako), 항-Twist1(1 : 1000; abcam), N-cadherin(1 : 1000; Cell Signaling Technology), Vimentin(1 : 1000; Calbiochem) 또는 항-beta-actin(1 : 1000; Santacruz) 1 차 항체를 4 ℃에서 밤새 진탕(shaking)하였다. 그리고 나서, 두 번 세척한 후, 상기 막을 서양고추냉이 과산화 효소(HRP)-접합된 항-토끼 및 항-마우스 2 차 항체(Jackson ImmunoResearch Inc., 미국)와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 상기 막을 WESTSAVE-UP 웨스턴 블롯팅 기질(영인 프론티어, 한국)과 함께 배양하고, 이미지를 ChemiDoc 이미징 시스템(Bio-Rad, 미국)을 사용하여 시각화하고 기록하였다.

실시예 4. DuoLink 근접 결찰 분석(proximity ligation assay, PLA)

DuoLink^® In Situ Red Starter Kit Mouse/Rabbit(DUO92101, Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)을 사용하여 상호 작용하는 표적 단백질을 검출하였다. 먼저, 세포를 8-웰 챔버 제거 가능한 슬라이드(ibidi GmbH Am Klopferspitz, 독일)에 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, HepG2 세포를 4 g의 방사선에 노출시키고, 12시간 후 상기 슬라이드를 차가운 1x PBS로 세척하고 4 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 30분 동안 고정시켰다. 그리고 나서, 슬라이드를 37 ℃에서 30분 동안 예열된 가습 챔버에서 듀오링크 차단 용액(Duolink Blocking Solution)으로 차단하였다. 이후 HDAC5 및 p53을 검출하기 위한 1 차 항체를 슬라이드에 추가하고, 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 그런 다음, 슬라이드를 1x 세척 완충액 A로 세척하고 이어서 2개의 PLA 프로브(항체 희석액에 1 : 5로 희석됨)로 1시간 동안 배양한 후, 예열된 가습 챔버에서 결찰(ligation)-연결 효소(ligase) 용액을 30분 동안, 증폭(amplification)-중합 효소(polymerase) 용액을 100분 동안 37 ℃에서 배양하였다. 이미징 전에 슬라이드를 1x 세척 버퍼 B로 세척하고, DAPI가 함유된 Duolink In Situ Mounting Medium을 사용하여 커버 슬립으로 마운팅하였다. 형광 이미지는 zeiss LSM 780 공초점 현미경을 사용하여 획득하였다.

실시예 5. 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy, TEM)

엑소좀을 촬영하기 위해, 0.1 M의 엑소좀 펠렛을 0.1 M 카코딜레이트(cacodylate) 용액(pH 7.0) 내 2.5 % 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에 1시간 동안 고정시킨 후 2 % 사산화 오스뮴(osmium tetroxide)에 4 ℃에서 1시간 더 고정시켰다. 단계적인 아세톤 시리즈를 사용하여 탈수한 후, Spurr의 배지(Electron Microscopy Sciences)를 통해 포매하였으며, 생성된 섹션 샘플을 울트라마이크로톰(ultramicrotome)(RMC MTXL, 미국)으로 60 nm에서 절단한 후, 2 % 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)를 20 분 동안, 시트레이트(citrate)를 10 분 동안 사용하여 이중 염색을 수행하였다. 준비된 섹션은 Hitachi H-7600 TEM(Hitachi, 일본) 장비를 사용하여 80 kV에서 촬영되었다.

실시예 6. 엑소좀 크기 분포 및 농도 측정

엑소좀 크기 분포 및 농도를 측정하기 위해 NanoSight(NS500) 장치(Malvern Instruments Ltd.)를 사용하여 나노 입자 추적 기반 분석을 수행하였다. 기기의 선형 범위 내에서 카운트를 제공하기 위해 샘플을 희석하였으며, 초당 30 프레임의 프레임 속도로 각 샘플에 대해 1분 길이의 비디오가 녹화되었다. 입자 이동은 제조업체의 프로토콜에 따라 NTA 소프트웨어(NTA 2.3; NanoSight Ltd.)로 분석되었으며, 상기 NTA 소프트웨어는 먼저 프레임 단위로 각 입자를 식별하고 추적하기 위해 최적화되었다.

실시예 7. small RNA 시퀀싱

7-1. RNA 분리

제조사의 지침에 따라 miRNeasy Mini Kit(Qiagen Korea Ltd.)를 이용하여 HepG2 유래 엑소좀 small RNA를 추출하였다. RNA 품질은 RNA 6000 Pico Chip(Agilent Technologies, Amstelveen, 네덜란드)을 사용하여 Agilent 2100 bioanalyzer에 의해 평가되었으며, RNA 정량화는 NanoDrop 2000 분광 광도계 시스템(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 미국)을 사용하여 수행되었다.

7-2. 라이브러리 준비 및 시퀀싱

제어 및 방사선 유도 HepG2 구동 엑소좀 small RNA에 대해, 제조사의 지침에 따라 NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep kit(New England BioLabs, Inc., 미국)를 사용하여 라이브러리를 구축하였다.

라이브러리 구축을 위해, 각 샘플로부터 유래된 총 RNA 1 μg가 어댑터를 결찰하기 위해 사용되었으며, 어댑터 특이적 프라이머와 함께 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 라이브러리 증폭을 위해 PCR을 수행하고, QIAquick PCR Purification Kit(Quaigen, Inc, 독일) 및 AMPure XP 비드(Beckmancoulter, Inc., 미국)를 사용하여 라이브러리를 정리하였다. 고감도 DNA 분석(Agilent Technologies, Inc., 미국)을 위해 Agilent 2100 Bioanalyzer 기기로 small RNA 라이브러리의 수율 및 크기 분포를 평가하였으며, 고속 처리(High-throughput) 시퀀스는 싱글-엔드(Single-end) 75 시퀀싱(Illumina, SanDiego, CA., 미국)의 방법으로 NextSeq500 시스템에 의해 평가되었다.

7-3. 데이터 분석

bam 파일을 얻기 위해 bowtie2 소프트웨어 도구로 시퀀스 리드(read)를 매핑하였다. 성숙한 miRNA 서열은 매핑을 위한 참조로 사용되었다. 성숙한 miRNA 시퀀스에 매핑된 리드 수는 bedtools v2.25.0(Quinlan AR, 2010) 및 R 통계 프로그래밍 언어를 사용하는 Bioconductor 20(R development Core Team, 2016)을 사용하여 정렬 파일로부터 추출되었다. miRNA의 발현 수준을 측정하기 위해 리드 수를 사용하였으며, 샘플 간의 비교를 위해 변위치(quantile) 정규화 방법이 사용되었고, miRNA 표적 연구를 위해 miRWalk 2.0 21이 수행되었다. 기능적 유전자 분류는 DIANA 22에 의해 수행되었으며, 엑소좀 small RNA 시퀀싱 어레이가 현지 공인 Illumina 어레이 서비스 제공 업체(Ebiogen, 한국)에서 준비, 혼성화되고 스캔되었다.

실시예 8. TCGA(The cancer genome atlas) 및 GEO(gene expression omnibus) 데이터베이스 분석

분석한 두 가지 유전자 발현 프로파일링 데이터 세트(GSE74618, GSE147889)는 NCBI GEO 데이터베이스에서 다운로드하였다.

상기 GSE74618 데이터베이스는 218개의 인간 HCC 종양 샘플, 10개의 인접한 간경변성 비 종양 조직 샘플 및 10개의 건강한 간 샘플로 구성되며, 인접한 간경변성 비 종양 조직 샘플 및 건강한 간 샘플을 대조군으로 사용하고 인간 간세포 암종(HCC) 종양 샘플과 비교하였다.

상기 GSE1477889 데이터베이스는 97개의 HCC 종양 샘플 및 97개의 동일한 환자 주변 만성 간염 조직 샘플로 구성되며, 주변 만성 간염 조직을 대조군으로 사용하고 HCC 종양 샘플과 비교하였다. 두 개의 데이터 세트는 GEO2R 분석 도구를 사용하여 각각 볼케이노(volcano) 플롯(plot) 및 평균 차이 플롯으로 분석하였으며, TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터 분석은 oncomiR(WashU Pan-Cancer miRNome Atlas) 온라인 생물정보학 도구를 사용하여 수행하였다. 특히, TCGA 데이터 중 LIHC(Liver Hepatocellular Carcinoma) 데이터베이스(n=366)를 사용하여 분석을 수행하였으며, 간암 환자의 일(day)별 생존율 그래프를 나타내었다.

실시예 9. KEGG(Kyoto encyclopedia of gene and genomes) 경로 농축 분석

KEGG는 인간 게놈, 생물학적 세포 신호 전달 경로, 및 다양한 질병 및 화학 물질에 대한 유전 정보를 포함하는 데이터베이스이다. 엑소좀 miRNA의 KEGG 경로 분석은 DIANA-miRPath v3.0 분석 도구를 사용하여 분석하였다. DIANA-miRPath v3.0은 주요 miRNA 분석 도구인 DIANA-microT CDS 및 TargetScan v6.2 데이터베이스와 적극적으로 상호 작용하여 표적 경로를 분석하는 KEGG 기반 miRNA 경로 예측 도구이다.

실시예 10. miRNA 형질감염

형질감염 및 방사선 조사 전에 세포를 6-웰 플레이트에 1 × 10⁵ 세포/ml/웰로 분주하였다. 다음날 HepG2 세포를 X-RAD 320을 사용하여 4gy의 방사선에 노출시킨 후 세포가 약 80 % 융합에 도달했을 때 형질감염을 수행하였다. miRCURY LNA miR-151a-3p 모방체(mimic)(miRCURY LNA miRNA Mimic, MIMAT0000757)는 QiAGEN(Qiagen Korea Ltd.)에서 구입하였으며, 스크램블된 miRNA 대조군은 BIONEER(한국)에서 구입하였다. miRNA의 최종 농도는 50-100 nM이었다. 제조사의 지침에 따라 Lipofectamine 3000(Invitrogen)으로 형질감염을 수행하였다.

실시예 11. 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)

제조사의 프로토콜에 따라 miRNeasy Mini Kit(Qiagen Korea Ltd.)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 성숙한 세포 및 엑소좀 miRNA의 정량화를 위해, 추출된 총 RNA는 역전사 전에 폴리(A) 테일링 키트(Ambion, Austin, TX)로 폴리아데닐화(polyadenylated)하고, PrimeScript™ 역전사 효소(Takara Bio Inc.)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 상기 cDNA 샘플은 TB Green^® Premix Ex Taq™(Takara Bio Inc.) 및 CFX96 검출 시스템 실시간 PCR 기기를 사용하여 miR-151a-3p의 발현 수준을 측정하기 위해 정량적 RT-PCR 분석에 세 번 사용되었다.

실시예 12. 증식 분석

세포 증식 분석은 제조사의 지침에 따라 Chromo-CK 세포 생존율 분석 키트(monobio seoul, 한국)를 사용하여 수행하였다. 형질감염된 세포는 분주 후 지정된 시간에 수확하였다. 즉, 96-웰 플레이트의 각 웰에 세포를 함유하는 배지 100 μl에 시약(10 μl/웰)을 첨가하고 공기 중 가습된 5 % CO₂ 하에서 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 비색 분석을 위해, ELx800 흡광도 마이크로플레이트 리더(SpectraMax 340PC Microplate Reader, Molecular Devices, 미국)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 기록하였으며, 각 실험은 적어도 3회 반복되었다.

실시예 13. 이동 침입 분석

종양 세포 이동 및 침입은 8 μm 기공 크기의 폴리카보네이트(polycarbonate) 막 (BD, NJ, 미국)을 가진 24-웰 플레이트에서 분석하였다. 침입 분석을 위해, 상기 막을 매트릭스 장벽을 형성하기 위해 희석된 마트리겔(Matrigel)(BD, NJ, 미국)로 코팅하였으며, HepG2는 miR-151a-3p 또는 음성 대조군으로 형질감염 시켰다. 이동 및 침입 분석을 위해, 세포(이동의 경우 5 x 10⁴, 침입의 경우 1 x 10⁵)를 형질감염 후 24시간에 200 μl의 무 혈청 DMEM에 재현탁하고 챔버의 상부 구획에 추가하였으며, 하부 구획은 10 % FBS가 함유된 600 μl의 DMEM으로 채웠다(다른 기질이 그에 따라 추가됨). 37 ℃에서 10시간(이동) 또는 24시간(침입) 동안 배양한 후, 막 상부 표면에 남아있는 세포를 제거하였다. 그런 다음, 막 하부 표면의 세포를 고정한 후 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 광학 현미경으로 계수하였다. 각 실험은 적어도 3회 반복되었다.

실시예 14. 세포 주기 분석

형질감염된 세포를 수집하고 방사선 노출 후 재현탁시켰다. Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC) 및 propidium iodide(PI) 염색 분석을 실시하여 주어진 집단에서 세포 사멸(FITC 염색) 및 괴사(PI 염색) 세포의 백분율을 검출하였다. FACS canto flow cytometer(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, 미국)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 분석을 수행하였으며, 절차는 세 번 반복되었다.

실시예 15. 세포 사멸 분석

형질감염된 세포를 수집하고 방사선 노출 후 차가운 PBS로 재현탁시켰다. 그리고 볼텍싱(vortexing)하면서 세포 펠렛에 적가한 차가운 70 % 에탄올에 고정시키고, -20 ℃에서 밤새 보관하였다. 그리고 나서, 세포를 PBS로 실온에서 10분 동안 재수화 한 다음, 50 μg/ml PI(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, 미국), 100 μg/ml RNase A, DNase를 함유하고 프로테아제(protease)가 없는 PI 염색 용액(Thermo Scientific)으로 1x 결합 완충액(binding buffer)에서 세포를 염색하였다. 그런 다음, FACS canto flow cytometer(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, 미국)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 분석을 수행하였으며, 절차는 세 번 반복되었다.

실시예 16. 피하 종양 이종 이식 모델

BALB/c 누드 마우스(5 주령 수컷)는 Charles River Laboratories, Inc(Wilmington, Massachusetts)에서 구입하였으며, 사료는 일반 설치류 실험실 동물 사료로 공급하였다. 총 부피 100 μl의 5 x 10⁶ HepG2 세포를 마트리겔(corning 356234)과 1 : 1 비율로 5주령 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 주입하였다. 이식된 고형암의 평균 크기가 100 mm³ 이상까지 증가한 후, invivo-jetPEI/타겟 miRNA 복합체를 처리하였다. invivo-jetPEI는 miRNA 전달을 위한 효율적인 운반체로 사용하였으며, miRNA 10 μg/invivo-jetPEI 1.2 μl의 비율로 5 % 글루코스 용액과 혼합하여 총 100 μl 용량으로 처리하였다. invivo-jetPEI/타겟 miRNA 복합체는 종양 내 주사로 3일마다 3회 투여하였다. 종양 크기는 이식 후 3일마다 표준 ABS 디지매틱 캘리퍼(digimatic caliper)(CD-15AX)를 사용하여 측정하였으며, 종양 부피는 다음 공식을 사용하여 측정하였다: Π x 4/3 x 더 큰 직경 x 더 작은 직경 사각형. 실험군에서 이식된 누드 마우스의 가장 큰 종양의 부피가 1000 mm³를 초과할 때, 희생 후 종양을 분리하고, 종양의 무게를 측정하고, 암 조직에서 표적 단백질의 발현을 분석하였다.

실시예 17. 통계 분석

본 발명에서 각 실험은 세 번 반복되었다. 수학적 데이터는 평균 ± SD로 표시되며, 명시되지 않는 한, 두 그룹 간의 차이는 Student's t-테스트(two tailed)를 사용하여 분석되었다. 또한, 달리 명시되지 않는 한, 두 그룹 간의 유의한 수치적 차이는 Student's t-테스트(two tailed)를 사용하여 분석되었다. Kaplan-Meier 방법을 사용하여 전체 생존 곡선을 그래프로 표시하고 로그 순위 테스트를 통해 비교하였으며, 차이는 P<0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 평가되었다. 모든 통계 분석은 SPSS13.0 소프트웨어(SPSS, Chicago, IL, 미국)를 사용하여 수행되었다.

[실험예]

실험예 1. 방사선 치료에 의한 p53 및 HDAC5의 조절

단백질 p53 및 HDAC5가 HCC에서 방사선에 의해 조절되는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 방사선 양은 방사선 장비 X-RAD 320을 사용하여 2 gy 및 4 gy로 처리하여 세 가지 유형의 간암 세포에서 방사선을 처리했을 때 HDAC5 및 p53의 발현을 관찰하였다. DNA 손상에 의한 HDAC5와 p53의 상호 작용은 이전에 보고된 바 있으나, HCC에서 방사선에 의한 HDAC5와 p53의 상호 작용은 아직 알려진 바 없다. HepG2 및 SK-Hep1은 p53 야생형(p53^+/+)이고, Hep3B는 p53 결실 유형(p53^-/-)이다. 각 단백질의 발현량은 웨스턴 블롯을 통해 6시간, 12시간, 18시간, 및 24시간 순으로 측정되었다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, HepG2에서 HDAC5 및 p53의 발현은 2 gy 및 4 gy 방사선에 의해 대조군에 비해 6시간부터 유의하게 증가하였으며, 2 gy의 방사선 처리 시 나중에 HDAC5는 시간에 따라 다시 감소하였다. 그러나 HDAC5와 p53은 4 gy의 방사선 처리 시 시간에 관계없이 방사선 4gy에서 유의하게 증가하였다. 이는 HDAC5 및 p53의 발현 및 그 다운스트림(downstream)이 HepG2에서 방사선 조사에 의해 조절된다는 것을 보여준다.

또한, 도 1b에 나타낸 바와 같이, SK-Hep1은 2 gy 조사 24시간 후 HDAC5의 발현을 증가시켰다. 그러나 4 gy 조사 시 HDAC5의 발현은 대조군에 비해 감소하였다. p53 및 그 다운스트림은 방사선 조사에 의해 유의한 증가를 보였지만, HDAC5는 유의한 발현 패턴을 보이지 않았다.

마지막으로, 도 1c에 나타낸 바와 같이, Hep3B는 방사선 조사 후 p53없이 HDAC5 발현의 독립적인 증가를 보였다. 그 결과, p53과 HDAC5 중 방사선 조사에 의해 증가된 HDAC5가 독립적으로 단백질 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다.

후속 실험은 HepG2에 대해 수행되었으며, 이는 3 개의 간암 세포 중 방사선 조사에 의해 가장 유의적인 변화를 나타내었다. HDAC5 및 p53 사이의 관계를 확인하기 위해 CRISPER CAS9 시스템을 사용하여 p53^-/-인 HepG2 세포주를 제조하였으며, 인간 p53의 표적 부위: TGTAACAGTTCCTGCATGGG(서열번호 2)는 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing, NGS) 방법으로 조사되었다. 그 결과, 도 1d에 나타낸 바와 같이, 삽입/결실 빈도는 99.98 %(T 삽입: 19.9 %, CCTG 결실: 18.8 %, AT 삽입: 19.5 %)였으며, p53 유전자의 제거는 거의 완벽에 가까운 것으로 확인되었다.

방사선을 p53^+/+, p53^-/- 세포에 노출시키고 HDAC5 및 p53, p21, Puma의 단백질 발현을 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 그 결과, 도 1e에 나타낸 바와 같이, p53이 결실되었기 때문에 p53, p21의 발현은 거의 나타나지 않았으며, p53에 관계없이 HDAC5의 발현 증가가 확인되었다. 이에, 방사선 조사에 의해 가장 유의미한 발현을 보인 세포에서 p53의 발현에 관계없이 방사선 조사에 의한 HDAC5의 발현이 증가함을 확인하였으며, HDAC5와 p53의 관계를 확인하였다.

이에 더하여, FACS 장비를 이용하여 방사선 처리에 의해 p53^+/+, p53^-/- 세포에서 세포주기 정지 및 세포 사멸이 유도되는 것을 확인 하였다. 구체적으로, 도 1f에 나타낸 바와 같이, p53^+/+ 세포에서는 방사선 조사 후 6시간부터 G2/M 단계에서 강력한 세포주기 정지가 관찰되었으며, 시간이 지남에 따라 점차 G1 단계 세포주기 정지로 전환되었다. 유사한 세포주기 변화가 p53^-/- 세포에서 관찰되었으나, 효과가 p53^+/+ 세포보다 작다는 것이 확인되었다. 또한, 도 1g에 나타낸 바와 같이, p53^-/- 세포는 p53^+/+ 세포보다 방사선 조사 후 48시간에 세포 사멸이 유의하게 적었다.

이로부터 p53^-/- 세포에 비해 p53^+/+ 세포에서 더 강한 세포주기 정지 및 세포 사멸이 나타남을 알 수 있었다.

실험예 2. 방사선 조사에 의한 p53 및 HDAC5 간의 상호 작용에 따른 엑소좀 조절 단백질 TSAP6의 발현 증가 확인

p53과 HDAC5 간의 보다 정확한 상호 작용을 확인하기 위해, 듀오링크 PLA 분석을 사용하여 이를 조사하였다. 그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 세포가 방사선에 노출되지 않았을 때, 상호 작용하는 붉은 점은 발견되지 않았고, 4 gy의 방사선은 p53과 HDAC5 사이의 상호 작용인 여러 개의 붉은 점을 나타내었다. 이로부터, 방사선 노출이 세포에서 p53과 HDAC5의 상호 작용의 유의적 증가를 유도한다는 것이 입증되었다.

또한, 웨스턴 블롯을 사용하여 p53의 직접적인 다운스트림에서 엑소좀-조절된 단백질로서 p53에 의해 제어되는 TSAP6(Tumor Suppressor Activation Pathway 6)이 방사선 조사에 의해 증가되는지 여부를 검증하였다. TSAP6의 발현은 4 gy 방사선에 노출된 후 12시간 및 24 시간에 확인되었다. 그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, HDAC5와 p53 사이의 상호 작용이 방사선에 의해 향상되었으며 p53의 다운스트림 TSAP6도 크게 증가했음을 알 수 있었다.

이에 더하여, p53^+/+, p53^-/- 세포에서 유래한 엑소좀의 특성을 확인하기 위해, HepG2 세포에서 분비되는 엑소좀을 전자 현미경으로 관찰하여 도 2c에 나타내었으며, 도 2d에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블롯 분석은 p53^+/+, p53^-/- 세포에서 방출된 미세 소포가 엑소좀 마커 CD63, CD81 및 HSP90을 발현함을 보여주었다. 또한 방사선 노출로 엑소좀을 통해 의존적으로 p53에 의해 방출되는 단백질인 마스핀(mammary serine protease inhibitor, maspin)의 발현을 확인한 결과, p53^+/+ 세포 유래 엑소좀 내부에서는 방사선에 의해 마스핀의 발현이 증가하는 것으로 나타났으나, p53^-/- 세포 유래 엑소좀은 방사선 노출에 의한 마스핀 발현을 나타내지 않았다.

이로부터, 방사선 노출에 의해 유도된 엑소좀 내부의 마스핀 발현은 p53의 발현에 의해 조절되는 것을 알 수 있었다. p53은 마스핀 프로모터 활성화 및 마스핀 발현 유도를 통해 마스핀 프로모터에 존재하는 p53 유전자-일치 결합 부위에 직접 결합한다.

실험예 3. 방사선 조사에 의한 p53 의존적 방식에서의 엑소좀 분비 확인

방사선 조사 후, 엑소좀 분비가 시간이 지남에 따라 변함을 입증하기 위한 실험을 수행하였다. 배양된 p53^+/+ 세포 및 p53^-/- 세포의 수는 5 x 10⁶이었으며, 실험은 4 gy의 방사선에 노출된 후 6, 12, 24 및 48 시간 간격으로 수행하였고, 매시간 방출된 엑소좀은 초 원심 분리로 추출하였다. 분리된 엑소좀의 정성 및 정량 비교 및 분석은 Nanosight NT300 장비를 사용하여 수행하였다.

그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 엑소좀은 직경이 30-300 nm 이상인 이종 엑소좀 집단을 나타내었다. 이러한 결과는 분리된 엑소좀이 순도가 높고 세포에서 분비되는 소포의 크기, 밀도, 구조 및 특성을 만족함을 시사한다.

또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이, p53^+/+ 세포는 p53^-/- 세포와 비교하여 4 gy의 방사선에 노출되었을 때 전체 소포의 분비가 유의하게 증가하는 것으로 나타났다. 각 분비 시간별로 총 소포를 비교한 결과, 방사선에 노출되었을 때 분비 소포의 부피가 2배 이상 증가하는 것으로 나타났다. 특히, 방사선 조사 24시간 후 총 소포 분비량은 대조군의 3배 이상이었으며, 이때 가장 많은 소포 분비물이 나타난 것을 확인하였다. 반면, p53^-/- 세포는 방사선 조사 후 소포 분비량의 감소를 나타냈다. 6시간에서 48시간까지 모든 실험군에서 방출된 소포의 양은 대조군에 비해 현저하게 감소하였다.

이에 더하여, 분비된 세포밖 소포를 크기별로 30-150 nm, 150-300 nm 및 > 300 nm로 나누어 정성적으로 분석하였다. 그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 엑소좀 크기에 속하는 30-150 nm의 소포를 분비하는 p53^+/+ 세포는 방사선 조사 12시간 후 가장 유의하게 증가하였으며, 방사선에 노출된 후 시간이 지남에 따라 소포의 변화는 크기가 증가하는 방향으로 변화하였다. 방사선 조사 48시간 후의 소포에서는 엑소좀 크기의 소포가 눈에 띄게 감소되는 것을 확인하였다. 같은 방법으로 p53^-/- 세포 유래 엑소좀을 각 크기로 나누어 분석하였을 때, 방사선 조사 후 방출된 엑소좀 크기의 소포도 빠르게 감소하는 것을 확인하였다.

상기 방사선 조사 후 방출된 p53^+/+ 및 p53^-/- 세포의 엑소좀을 정성 및 정량적으로 분석하였으며, 이는 방사선 조사에 의해 엑소좀 크기의 소포를 포함한 세포밖 소포의 분비가 증가한다는 것을 증명하였다. 구체적으로, 도 3d에 나타낸 바와 같이, 30-150 nm 크기의 엑소좀은 p53 의존성에 의해 증가 또는 감소하는 것을 확인하였다.

이로부터, 방사선 조사에 의해 유도된 p53의 발현이 TSAP6 경로를 통해 엑소좀 분비를 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.

실험예 4. HCC에서 방사선 조사에 의한 엑소좀 miRNA의 발현 변화 확인

세포에서 방출된 엑소좀은 인접하거나 멀리 있는 세포에 의해 흡수되고, 종양 면역 및 미세 환경을 방해하는 등의 과정을 조절하는 엑소좀 내부에 포함된 miRNA는 종양 성장, 침입, 전이, 혈관 신생 및 약물 내성을 촉진할 수 있다. 따라서 엑소좀 miRNA는 종양 진행을 조절하는 데 중요한 기능을 한다.

방사선 조사 후 엑소좀 내부의 miRNA 구성 변화를 확인하기 위해, 엑소좀 miRNA 생물정보학(bioinformatics) 분석을 수행하였다. 방사선 노출 세포에서 분비되는 엑소 좀의 miRNA 및 방사선 노출 없이 분비된 엑소좀의 miRNA의 변이는 MeV 소프트웨어(미국 Dana-Farber Cancer Institute에서 개발한 small RNA 시퀀싱, miRNA-Seq 전용 분석 프로그램)를 활용하여 히트맵을 통해 분석하여 도 4a에 나타내었으며, 엑소좀 내부의 각 miRNA에서 방사선 조사 후 어떤 세포 내 기능이 변화되었는지 알아보기 위해 유전자 온톨로지(ontology) 용어를 사용하여 다양한 세포 기능 범주로 분류 및 분석하여 도 4b에 나타내었다. 분석된 miRNA의 fold change 값을 처리하고 그래프를 내림차순으로 구성하여 도 4c에 나타내었으며, 그 결과 33개의 miRNA가 엑소좀 내부에 있는 156개의 miRNA 중 방사선 조사로 인해 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.

발현이 감소된 miRNA 중 간세포 암종 GEO 데이터 세트(스페인, GSE74618; 및 일본, GSE147889)를 사용하여 간세포 암종의 진행과 관련된 miRNA를 식별하여 분석하였다. GEO 데이터 세트는 NCBI Gene Expression Omnibus에서 다운로드하고 GEO2R 분석 도구를 사용하여 볼케이노 플롯(volcano plot) 및 평균 차이 플롯(mean-difference plot)으로 분석하여 도 4d에 나타내었다. 도 4d에서 유의한 P 값 및 발현 수준을 갖는 데이터는 양의 값에 대해 붉은색으로, 음의 값에 대해 푸른색으로 표시하였다.

HCC miRNA GEO 데이터 세트(스페인, GSE74618)를 활용한 분석 결과, 도 4e에 나타낸 바와 같이, 4 개의 특정 miRNA(miR-151a-3p, miR-106b-5p, miR-183-5p, miR-452-5p)가 확인되었으며, 이들은 정상에 비해 종양 조직에서 유의하게 증가한 것을 알 수 있었다. HCC miRNA GEO 데이터 세트(스페인, GSE74618)는 도 4f에 나타낸 바와 같이 다른 HCC miRNA GEO 데이터 세트(일본, GSE147889)를 사용하여 재검증하였으며, 이를 통해 분석 결과의 정확성을 확인하였다.

HCC에서 발현이 증가된 4개의 miRNA(miR-151a-3p, miR-106b-5p, miR-183-5p, miR-452-5p)와 간암 환자의 생존율 사이의 관계를 확인하기 위해 OncomiR Cancer miRNome Atlas를 사용하여 분석한 결과, 도 4g에 나타낸 바와 같이, 간암 환자의 종양 조직에서 miR-151a-3p, miR-106b-5p, miR-183-5p, 및 miR-452-5p의 발현이 높을수록 생존율이 현저히 감소하는 것을 확인하였다.

또한, KEGG 경로 분석을 통해 간암 환자의 예후와 직접적으로 관련된 4 개의 miRNA가 어떤 분자 생물학적 과정을 통해 암에 영향을 미치는지 알아보았다. 그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 수행된 분석 결과 중 방사선 치료와 직접적으로 관련된 기전인 세포주기 및 본 발명의 중심 표적인 p53 신호 전달 경로가 중요한 신호 기전으로 확인되었다.

이에 더하여, 각 miRNA의 표적 단백질을 분석하기 위해 targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72/) 분석 도구를 사용하였다. miRNA의 표적 분석 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, miR-151a-3p가 p53 mRNA 표적 부위에 높은 확률로 결합할 수 있음을 확인하였다.

이와 마찬가지로, 이전 연구에서 miR-151a-3p는 p53의 표적 miRNA로 생물 정보학적으로 분석되어 p53 mRNA 표적 영역에 결합하여 세포에서 p53의 발현을 억제하는 것으로 보고된 바 있다(Bisio et al., 2013; Liu et al., 2019).

이에, miR-151a-3p에 대한 연구를 계속 진행한 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 miR-151a-3p가 다양한 암의 종양 형성과 깊은 관련이 있음을 확인하였다.

(BLCA: 방광 요로상피세포암종(bladder urothelial carcinoma), BRCA: 유방 침습암종(breast invasive carcinoma), COAD: 대장 선암(colon adenocarcinoma), ESCA: 식도암종(esophageal carcinoma), HNSC: 두경부 편평세포암종(head and neck squamous cell carcinoma), KICH: 신장 색소혐성(kidney chromophobe), KIRC: 신장 투명세포암종(kidney renal clear cell carcinoma), KIRP: 신장 유두상세포암종(kidney renal papillary cell carcinoma), LIHC: 간세포암종(liver hepatocellular carcinoma), LUAD: 폐 선암(lung adenocarcinoma), LUSC: 폐 편평세포암종(lung squamous cell carcinoma), PRAD: 전립선 선암(prostate adenocarcinoma), READ: 직장 선암(rectal adenocarcinoma), STAD: 위 선암(stomach adenocarcinoma), UCEC: 자궁 코퍼스 내막암종(uterine corpus endometrial carcinoma))

또한, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 환자 생존율이 miR-151a-3p와 유의하게 연관이 있는 세 가지 암 유형이 확인되었다.

(LGG: 뇌 저등급 신경교종(brain lower grade glioma), LIHC: 간세포암종(liver hepatocellular carcinoma), SARC: 육종(sarcoma))

예상대로 miR-151a-3p는 간암 환자의 예후와 높은 상관 관계가 있었다. 따라서 miR-151a-3p는 종양 형성 및 간세포 암종(LIHC)의 생존과 높은 상관 관계가 있음이 확인되었다. 실제로 miR-151a-3p가 세포 내 및 엑소좀에서 방사선 노출에 의해 감소되었음을 확인하였으며, 방사선 노출 후 세포 및 엑소좀에서 miR-151a-3p의 발현은 qRT-PCR을 사용하여 분석하였다. miR-151a-3p의 정량화는 miR-Let7a를 사용하여 정량화하였다(Kim et al., Cancer Lett. 2020 Apr 10; 475:2-13).

miR-151a-3p의 발현을 정량화한 결과, 도 4h에 나타낸 바와 같이 세포의 miR-151a-3p는 방사선 노출 후 1/2만큼 감소한 반면, 엑소좀의 miR-151a-3p는 방사선 노출 후 1/4 이상 감소한 것을 확인하였다.

결과적으로, miR-151a-3p는 HCC의 낮은 생존율과 유의한 관계가 있었으며, HCC 세포주인 hepG2에서 방사선 조사 후 세포 및 엑소좀 내에서 miR-151a-3p의 발현이 유의하게 감소하는 것으로 나타났다.

실험예 5. 방사선 조사에 의한 엑소좀 내 miR-151a-3p 발현 감소 및 종양 억제 효과 확인

5-1. miR-151a-3p의 방사선 조사에 따른 세포 기능 장애 조절 확인

miR-151a-3p의 방사선 저항성을 조사하기 위해, 방사선에 의해 유발될 수 있는 세포 사멸 및 세포주기 정지와 관련된 단백질을 웨스턴 블롯을 통해 세포 내에서 음성 대조군(miR-NC)과 miR-151a-3p의 형질감염 24 시간 후에 확인하였다.

그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, miR-151a-3p 형질감염 후 암 억제 유전자 p53이 크게 감소하였으며, 세포주기를 멈추기 위해 사이클린 의존적 인산화를 억제하는 P21의 감소가 확인되었다. 미토콘드리아 외막 투과성을 증가시키는 채널을 생성하는, 미토콘드리아 외막 투과성 기공을 제어하는 BCL-2의 경우 증가되었으며, 세포사멸(apoptosis)과 관련된 Puma가 감소된 것을 확인하였다.

상기 도 5a의 결과를 바탕으로, 방사선 노출에 의해 유도된 세포 주기 정지에서 miR-151a-3p의 기능을 확인하기 위해 FACS를 사용하여 세포 주기 정지 분석 실험을 수행하였다. miR-151a-3p 형질감염 24 시간 후, 4Gy 방사선이 세포에 조사되었으며, 6 시간 후 각 실험군의 세포주기를 분석하였다. FACS를 사용한 세포 주기 정지 분석은 방사선 조사에 의해 유도된 세포 주기 정지가 miR-151a-3p에 의해 조절되는지 확인하기 위해 PI 염색으로 수행하였으며(도 5b의 좌측 도면), 세포 주기는 G1, S, G2/M기로 나누어 분석하였다(도 5b의 우측 도면). 그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이 대조군(N.C) 그룹과 4Gy 양성 그룹에서 G2/M기 정지가 증가되었고, miR-151a-3p 형질감염 그룹에서는 G2/M기 정지가 상대적으로 감소된 것을 확인하였다.

또한, 방사선 조사에 의해 유도된 세포 사멸이 miR-151a-3p에 의해 조절되는지 확인하기 위해 아넥신 V(Annexin v)(FITC) 및 PI 염색에 의한 FACS를 통해 분석하였다. 그 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이 miR-151a-3p 형질감염 그룹은 N.C 및 4Gy 양성 그룹에 비해 총 세포 사멸을 현저히 감소시키는 것을 확인하였는 바, miR-151a-3p는 방사선 조사로 인한 세포 사멸을 억제하는 기능이 있는 것을 알 수 있었다.

5-2. miR-151a-3p의 종양 형성 능력 확인

상피-중간엽 전이(Epithelial-mesenchymal transition, EMT) 마커 단백질의 발현은 음성 대조군 및 miR-151a-3p가 세포에 형질 감염된 후 24 시간 후에 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 대표적인 상피 표현형 마커인 E-cadherin은 miR-151a-3p 형질 감염 그룹에서 감소하였다. E-cadherin에 역으로 이동하는 중간엽 표현형 마커 비멘틴(vimentin) 및 N-cadherin의 유의한 증가가 있었고, p53 전이와 관련된 Twist1의 발현이 눈에 띄게 증가하였다.

또한, miR-151a-3p의 암 진행을 유도하는 기능 평가를 위해, 증식 분석, 트랜스웰(transwell) 이동(migration), 및 침입 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이 miR-151a-3p의 농도에 따라 miR-151a-3p 100 nM 그룹에서 증식의 현저한 증가를 확인하였다.

유사하게, 세포 이동 및 전이의 증가는 도 6c에 나타낸 바와 같이, 세포 이동(migration), 트랜스웰을 이용한 침입(invasion) 분석에서 miR-151a-3p의 농도에 따라 확인하였으며, 이동 및 전이된 세포를 염색하고 계수한 결과, miR-151a-3p의 농도 증가에 따라 이동 및 전이된 세포가 증가한 것을 확인하였다.

따라서, 상기 결과로부터 miR-151a-3p가 EMT 유사 표현형을 유도하고 세포 증식을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.

5-3. miR-151a-3p 과발현 마우스 모델에서 종양 진행 증가 확인

In vivo 상에서 miR-151a-3p의 종양 진행 능력을 확인하기 위해, 누드 마우스 피하 이종 이식 모델 실험을 수행하였다. HepG2 세포는 누드 마우스의 옆구리에 5x10⁶ 세포로 피하 주사하였다. 그 후, miR-NC 및 miR-151a-3p / in vivo jet-PEI 복합체는 확립된 in vivo jet-PEI 형질 감염 시약을 사용하여 3 일 간격으로 3 회 주입하여, 세포 내 miR-151a-3p의 발현을 증가시켰다. 이식 후 18일째에 마우스를 희생시키고 종양을 분리하여 크기 및 무게를 측정한 다음 플롯팅하였다.

상기와 같은 in vivo 실험 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이 종양의 크기(도 7a의 상단) 및 무게(도 7a의 하단)는 miR-NC에 비해 miR-151a-3p 과발현 마우스에서 크게 증가하였으며, 도 7b에 나타낸 바와 같이 종양의 성장 속도도 miR-151a-3p 과발현 마우스에서 더 빠른 것을 확인하였다.

또한, 도 7c에 나타낸 바와 같이, 종양 조직의 웨스턴 블롯 분석에서 miR-151a-3p는 p53, P21 및 Puma α/β의 발현을 유의하게 억제하는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터, miR-151a-3p의 과발현이 종양에서 표적 단백질의 발현을 감소시키고, 결과적으로 이종 이식 모델에서 종양 진행을 촉진했음을 확인하였으며, 방사선 조사에 의해 miR-151a-3p의 발현이 감소하여 종양을 억제하는 것을 알 수 있었다.

상기 실험예에서 확인한 결과를 바탕으로, 본 발명에 따른 암세포에서 방사선 조사에 의한 HDAC5와 p53의 상호작용 결과 분비되는 엑소좀 내 miR-151a-3p의 발현이 감소되어 암의 진행을 억제하는 것을 알 수 있었으며, 이의 기작을 도식화하여 도 8에 나타내었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Biomarker for diagnosing sensitivity to radiotheraphy and use thereof <130> MP21-064 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-151a-3p <400> 1 cuagacugaa gcuccuugag g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human p53 target region <400> 2 tgtaacagtt cctgcatggg 20

Claims (19)

1. miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 제제는 암세포 유래 엑소좀 내 miR-151a-3p의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 암세포는 p53^+/+ 암 세포인 것을 특징으로 하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단용 조성물.
   
4. 제2항에 있어서,
   상기 엑소좀은 방사선 조사 시 히스톤 탈아세틸화효소 5(HDAC5) 및 p53의 상호작용을 통해 p53을 매개로 암세포에서 방출되는 것을 특징으로 하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단용 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 암은 간암, 신경교종, 육종, 대장암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 폐암, 두경부암, 난소암, 방광암, 위암, 식도암, 담관암, 췌장암, 자궁경부암, 피부암, 림프종, 갑상선암, 골수암, 자궁내막암, 신장암, 직장암, 및 뇌종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단용 조성물.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단용 키트.
   
7. miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 제제는 암세포 유래 엑소좀 내 miR-151a-3p의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 조성물.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 암세포는 p53^+/+ 암 세포인 것을 특징으로 하는, 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 조성물.
   
10. miR-151a-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 증진용 조성물로서,
    상기 암 환자는 방사선 치료가 필요한 암 환자인 것을 특징으로 하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 증진용 조성물.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 miR-151a-3p 억제제는 암세포 유래 엑소좀 내 miR-151a-3p의 mRNA에 상보적으로 결합하는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 증진용 조성물.
    
12. 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 방사선 치료 시 방사선이 직접 조사되지 않은 주변 암세포에 대해 방관자 효과(bystander effect)를 나타내는 것을 특징으로 하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 증진용 조성물.
    
13. miR-151a-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 조성물은 방사선 치료가 필요한 암 환자에 투여되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
14. 제13항에 있어서,
    상기 miR-151a-3p 억제제는 암세포 유래 엑소좀 내 miR-151a-3p의 mRNA에 상보적으로 결합하는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
15. 제13항에 있어서,
    상기 조성물은 방사선 치료 시 방사선이 직접 조사되지 않은 주변 암세포에 대해 방관자 효과(bystander effect)를 나타내는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
16. 방사선 치료 후의 암 환자로부터 분리된 시료에서 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단을 위한 정보제공방법.
    
17. 제16항에 있어서,
    상기 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준이 방사선 치료 전에 비해 감소한 경우 암 환자의 방사선 치료 민감성이 높은 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 환자의 방사선 치료 민감성 진단을 위한 정보제공방법.
    
18. 방사선 치료 후의 암 환자로부터 분리된 시료에서 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 환자의 방사선 치료 예후 예측을 위한 정보제공방법.
    
19. 제18항에 있어서,
    상기 miR-151a-3p의 mRNA 발현 수준이 방사선 치료 전에 비해 감소한 경우 암 환자의 방사선 치료 예후가 좋은 것으로 예측하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 환자의 방사선 치료 예후 예측을 위한 정보제공방법.

Images