JP2019089726A - がん遺伝子産物yap1/taz機能調節剤 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] バリノマイシン、ニゲリシン、バフィロマイシンA1及びB1、タプシガルギン、並びにJAK inhibitor I及びJAK3 inhibitor VIからなる群より選択される少なくとも1つを含む、がん遺伝子産物YAP1/TAZの機能調節剤。
[2] 前記機能調節剤が、バリノマイシン、ニゲリシン、バフィロマイシンA1及びB1並びにタプシガルギンからなる群より選択される少なくとも1つを含む、[1]に記載の剤。
[3] 前記機能調節剤が、YAP1/TAZの機能抑制剤である、[2]に記載の剤。
[4] 前記機能調節剤が、Birc5、CTGF又はCyr61の少なくとも1つの遺伝子の転写抑制剤である、[2]又は[3]に記載の剤。
[5] 前記機能調節剤が、細胞の増殖抑制剤である、[2]〜[4]のいずれか1つに記載の剤。
[6] 前記機能調節剤が、がんの予防剤又は治療剤である、[2]〜[5]のいずれか1つに記載の剤。
[7] 前記機能調節剤が、JAKinhibitor I又はJAK3 inhibitor VIの少なくとも1つを含む、[1]に記載の剤。
[8] 前記機能調節剤が、YAP1/TAZの機能亢進剤である、[7]に記載の剤。
[9] 前記機能調節剤が、Sphereの形成促進剤である、[7]又は[8]に記載の剤。
[10] 前記機能調節剤が、組織の再生において使用される、[7]又は[8]に記載の剤。
[11] 前記機能調節剤が、ES細胞の自己複製能の維持において使用される、[7]又は[8]に記載の剤。
[12] 前記機能調節剤が、iPS細胞の作製時のリプログラミング過程において使用される、[7]又は[8]に記載の剤。
[13] [9]に記載のSphereの形成促進剤を含む、がん幹細胞単離用キット。
また、本発明によれば、新しいYAP1/TAZの機能調節剤を提供し、該機能の調節が機能の亢進である場合、例えば、Sphereの形成促進剤としての利用が期待できる。
本発明において、YAP1/TAZの機能調節剤(以下、「機能調節剤」と記載する場合がある)とは、1)YAP1/TAZとTEAD等の転写因子との相互作用や、YAP/TAZ/TEAD複合体とYAP1/TAZの標的遺伝子(以下、「標的遺伝子」と記載する場合がある)の転写制御領域との結合に影響を及ぼし、YAP1/TAZの標的遺伝子の転写量を調節する(増減させる)ものであっても良く、2)YAP1/TAZを制御するHippo経路等に作用することで、YAP1/TAZの細胞内における存在量や核内に局在する量に影響を及ぼし、標的遺伝子の転写量を調節する(増減させる)ものであっても良いが、該機能調節剤の作用によってYAP1/TAZの標的遺伝子の転写量が増加又は減少する限り、該機能調節剤の作用機序は特定のものに限定されない。
本発明の機能抑制剤の作用機序としては、例えば、1)YAP1/TAZとTEAD等の転写因子との相互作用や、YAP/TAZ/TEAD複合体と標的遺伝子の転写制御領域との結合を阻害することにより、YAP1/TAZの標的遺伝子の転写量が低減される機序、及び2)Hippo経路のいずれかの分子に作用することにより、YAP1/TAZの細胞内における存在量や核内に局在する量が低減し、YAP1/TAZの標的遺伝子の転写量が低減する機序等が挙げられるが、YAP1/TAZの標的遺伝子の転写量を減少する限り、該機能調節剤の作用機序は特定のものに限定されない。YAP1/TAZの標的遺伝子の例としては、Birc5、CTGF、Cyr61、TGFβ、FGF、MCAT、PAX3及びWnt5a等が挙げられるが、これらに限定されない。
滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。
結合剤としては、例えば、結晶セルロース、ショ糖、D-マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等が挙げられる。
崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、L-ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。
溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、D-マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤;例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
等張化剤としては、例えば、ブドウ糖、D-ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトール等が挙げられる。
緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。
無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール等が挙げられる。
防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。
抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α-トコフェロール等が挙げられる。
本発明の機能亢進剤の作用機序としては、例えば、1)YAP1/TAZとTEAD等の転写因子との相互作用を促進することにより、YAP1/TAZの標的遺伝子の転写量が増加される機序、及び2)Hippo経路のいずれかの分子に作用することにより、YAP1/TAZの細胞内における存在量や核内に局在する量が増加し、YAP1/TAZの標的遺伝子の転写量が増加する機序等が挙げられるが、YAP1/TAZの標的遺伝子の転写量が増加する限り、該機能亢進剤の作用機序は特定のものに限定されない。
Hippo経路の破綻による発がんは、下流の転写共役因子YAP1/TAZの活性が亢進し、YAP1/TAZが結合する転写因子TEADの標的遺伝子の転写が亢進することによって引き起こされる。一方、YAP1/TAZの活性化は損傷組織の再生や、iPS細胞の誘導にも関与する。そこで、YAP1/TAZ活性を制御する薬剤をレポータースクリーニングにより選別した。
更に、細胞毒性及びホタル・ルシフェラーゼの活性変化の再確認を、蛍光顕微鏡下での細胞形態及びVenus蛍光強度でも行った。レポーター遺伝子導入細胞のルシフェラーゼ活性及びVenus強度を顕著に変化させ、細胞毒性を示さない阻害剤を、ヒット化合物とした。
一方、YAP1/TAZの機能亢進剤として、JAKシグナル阻害剤であるJAK inhibitor I(Calbio Chem, product#420099, Lot. D00108243)及びJAK3 inhibitor VI(Calbio Chem, product#420126, Lot. D00006068)を得た。
実施例1で同定した剤と同一の化学構造を有する市販製品(バリノマイシン:Wako, product#228-01121, Lot. SAJ1611、ニゲリシンナトリウム:Wako, product#149-07261, Lot. CTH2376、バフィロマイシンA1:Toronto Research Chemicals Inc, product#B110000, Lot. 2-LXM-96-1、バフィロマイシンB1(バフィロマイシンA1の類似体):BioViotica, product#0004-c100, Lot. B2701091、タプシガルギン:Wako, product#209-17281, Lot.WDP4439、JAK inhibitor I:Calbio Chem, product#420099, Lot.2805595、JAK3 inhibitor VI:Calbio Chem, product#420126, Lot.2869738)を購入した。
バフィロマイシンA1及びB1、バリノマイシン、ニゲリシンナトリウム及びタプシガルギンについては、H1299-YRE及びMCF10A-YREのいずれの細胞を用いた場合でも、ネガティブコントロール(DMSO)と比べ、YAP1/TAZの転写機能を抑制した(図1〜3)。特に、タプシガルギンを、MCF10A-YREに投与した場合、DMSOを投与した場合に比べて10倍以上の抑制作用を示した(図3)。
JAK inhibitor I及びJAK3 inhibitor VIについては、H1299-YRE及びMCF10A-YREのいずれの細胞を用いた場合でも、ネガティブコントロール(DMSO)と比べ、YAP1/TAZの転写機能を亢進した(図4)。これらの薬剤については、いずれの細胞に投与した場合であっても、2μM投与した時の方が、400 nM投与した時に比べ、転写機能を亢進した(図4)。
実施例2と同様の条件で、レポーター遺伝子を導入していないMCF10A細胞及びH1299細胞を、バフィロマイシンA1、バリノマイシン、タプシガルギン、及びJAK inhibitor VIの薬剤で処理し、24時間培養を行った。RNAiso(タカラバイオ株式会社)を用いて、各細胞から全量RNAを抽出・精製し、1μgの全量RNAから、SuperScript(登録商標)III First-Strand Synthesis System cDNA合成キット(Invitrogen)を用いて逆転写反応を行った。表1に示すプライマー及びTHUNDERBIRD(登録商標) SYBR(登録商標) qPCR Mix(TOYOBO)を用いて、定量的RT-PCR解析を行い、YAP1/TAZの直接の標的遺伝子Birc5(baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5)、CTGF(connective tissue growth factor)及びCyr61(Cysteine-rich angiogenic inducer 61)の発現量を、GAPDHを標準化コントロールとして算出した。
バフィロマイシンA1、バリノマイシン及びタプシガルギンは、全ての標的遺伝子(Birc5、CTGF及びCyr61)の転写を抑制した(図5)。特に、タプシガルギンについては、H1299細胞において、全ての標的遺伝子の転写を強く抑制した(図5)。
一方、JAK inhibitor I及びJAK3 inhibitor VIは、全ての標的遺伝子の転写を促進した(図6)。
バフィロマイシンA1、バリノマイシン、タプシガルギンはYAP1/TAZの機能を抑制したことから、それらの細胞増殖に対する抑制効果について検討した。
その結果、ネガティブコントロール(DMSO)に比べて、バフィロマイシンA1、バリノマイシン及びタプシガルギンは、MCF10A又はH1299細胞の細胞増殖を顕著に阻害した。
がん幹細胞の特性の1つに、無血清条件下での高いSphere形成能が上げられ、がん幹細胞の自己複製能の1つの指標となる。YAP1/TAZ機能の亢進が乳がん幹細胞のSphere形成を促進することから(Cell (2011)147(4):759-772)、JAK inhibitor I処理のヒト乳腺上皮細胞株MCF10Aと肺癌細胞株H1299のSphere形成能への効果を検討した。
Claims (10)
- バリノマイシン、ニゲリシン、バフィロマイシンA1及びB1、タプシガルギン、並びにJAK inhibitor I及びJAK3 inhibitor VIからなる群より選択される少なくとも1つを含む、がん遺伝子産物YAP1/TAZの機能調節剤。
- 前記機能調節剤が、バリノマイシン、ニゲリシン、バフィロマイシンA1及びB1並びにタプシガルギンからなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項1に記載の剤。
- 前記機能調節剤が、YAP1/TAZの機能抑制剤である、請求項2に記載の剤。
- 前記機能調節剤が、Birc5、CTGF又はCyr61の少なくとも1つの遺伝子の転写抑制剤である、請求項2又は3に記載の剤。
- 前記機能調節剤が、細胞の増殖抑制剤である、請求項2〜4のいずれか1項に記載の剤。
- 前記機能調節剤が、がんの予防剤又は治療剤である、請求項2〜5のいずれか1項に記載の剤。
- 前記機能調節剤が、JAKinhibitor I又はJAK3 inhibitor VIの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の剤。
- 前記機能調節剤が、YAP1/TAZの機能亢進剤である、請求項7に記載の剤。
- 前記機能調節剤が、Sphereの形成促進剤である、請求項7又は8に記載の剤。
- 請求項9に記載のSphereの形成促進剤を含む、がん幹細胞単離用キット。
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JP2016088919A (ja) * | 2014-11-11 | 2016-05-23 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | イベルメクチン又はミルベマイシンdを有効成分として含む抗癌剤 |
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