WO2020040186A1 - Ｈｓｐ４７の阻害物質を用いた、がん転移抑制 - Google Patents

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hsp47
cells
inhibitor
metastasis
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明弘 米田
保明 田村
則雄 武井
香織 澤田
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日東電工株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a medicament for suppressing cancer metastasis and a method thereof.
  • Patent Document 1 describes that tumor growth is suppressed by using a molecule targeting heat shock protein 47 (HSP47) to suppress tumor growth.
  • HSP47 heat shock protein 47
  • Triple-negative breast cancer has the negative expression of estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PgR), and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), and has high metastatic potential.
  • Breast cancer treatments chemotherapy, hormonal therapy, molecular targeted therapy
  • chemotherapy hormonal therapy, molecular targeted therapy
  • HER2 human epidermal growth factor receptor 2
  • chemotherapy hormonal therapy, molecular targeted therapy
  • HER2 human epidermal growth factor receptor 2
  • HER2 human epidermal growth factor receptor 2
  • HER2 human epidermal growth factor receptor 2
  • triple-negative breast cancer Since triple-negative breast cancer has a very high metastatic potential to distant tissues, it is desirable to carry out a treatment for suppressing metastasis in consideration of the remaining risk even after surgical treatment. However, in general, effective treatments for suppressing metastasis of cancer cells have not been established. As described above, the mechanism of obtaining high metastatic potential of breast cancer, particularly triple-negative breast cancer, has not yet been elucidated, and there is no treatment capable of controlling or suppressing metastasis.
  • An object of the present invention is to suppress the metastasis of cancer of high malignancy and high metastatic potential.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and found that in triple negative breast cancer, a part of the cell population is highly expressing HSP47, and that HSP47 positive triple negative breast cancer cells
  • the present inventors have found that the metastatic ability is high and that the metastatic ability can be suppressed by suppressing the expression of HSP47 in triple-negative human breast cancer, thereby completing the present invention.
  • the present inventors have newly found that the HSP47 protein binds to non-muscle myosin IIA; NMIIA (MYH9) which is an important factor in cell motility.
  • HSP47 binds to an important factor for cell motility and is involved in cell motility control, and HSP47 inhibitors are expected to suppress cell motility through inhibition of HSP47 expression.
  • MYH9 is expressed not only in triple-negative human breast cancer but also in other cancer cells other than breast cancer, cell motility regulation through HSP47 expression regulation is effective for cancer cells other than triple-negative human breast cancer. It is expected to be applicable.
  • the present invention relates to the following.
  • a cancer metastasis inhibitor comprising an inhibitor of HSP47.
  • the cancer metastasis inhibitor according to (1) wherein the cancer is breast cancer.
  • the cancer metastasis inhibitor according to (2) wherein the cancer is a hormone-negative and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) -negative triple negative breast cancer.
  • the cancer metastasis inhibitor according to (3) wherein the hormone receptor is an estrogen receptor and a progesterone receptor.
  • the inhibitor of HSP47 is an interfering nucleic acid, ribozyme, antisense nucleic acid, microRNA, short hairpin RNA for HSP47, a vector expressing these, or a cell transformed with these, The cancer metastasis inhibitor according to any one of 5).
  • a pharmaceutical composition comprising the cancer metastasis inhibitor according to any one of (1) to (6).
  • the pharmaceutical composition according to (7) for treating cancer.
  • a composition comprising an inhibitor of HSP47 for use in suppressing cancer metastasis.
  • the composition according to (12), wherein the cancer is triple negative breast cancer.
  • a method for suppressing metastasis of cancer which comprises administering an effective amount of an inhibitor of HSP47 to a cancer patient.
  • the cancer metastasis inhibitor of the present invention can suppress cancer metastasis by inhibiting the expression of HSP47 in cancer cells.
  • the method of the present invention can suppress cancer metastasis by administering an inhibitor of HSP47.
  • FIG. 1 shows the expression of HSP47 ⁇ mRNA (left panel) and HSP47 protein (right panel) in human breast cancer cells.
  • FIG. 2 shows the HSP47-positive cell ratio in triple negative human breast cancer cells derived from a tumor.
  • MDA-MB-231 Two types of triple negative human breast cancer cells (MDA-MB-231, MDA-MB-157) were implanted subcutaneously in Balb / c nu / nu mice at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / 50 ⁇ L PBS, and after tumor formation, Tumor cells were collected and subjected to flow cytometer analysis using an anti-HSP47 antibody (Enzo Life Sciences).
  • FIG. 3 shows the cell growth ability of triple negative human breast cancer cells forcibly expressing HSP47.
  • pCMV6-entry plasmid Mock
  • pCMV6-HSP47-Myc plasmid HSP47 forced expression triple negative human breast cancer cells created by gene transfer (MDA-MB-231, MDA-MB-157)
  • the cells were seeded on a 6-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells / well, and the cell proliferation ability was measured by cell counting for 5 days after the start of the culture.
  • FIG. 4 shows the cell motility of triple negative human breast cancer cells in which HSP47 is forcibly expressed.
  • FIG. 5 shows the metastasis of lung of triple negative human breast cancer cells forcibly expressing HSP47.
  • FIG. 6 shows the cell proliferation ability of triple negative human breast cancer cells due to suppression of HSP47 expression.
  • Control shRNA expression plasmid (shControl) or triple negative human breast cancer cells (HSP47 (+) MDA-MB-231, HSP47 (-) MDA-MB-231) created by transfecting shRNA expression plasmid (shHSP47).
  • the cells were seeded on a 6-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells / well, and the cell proliferation ability was measured by cell counting for 5 days after the start of the culture.
  • FIG. 7 shows the cell motility of triple negative human breast cancer cells due to suppression of HSP47 expression.
  • Control shRNA expression plasmid (shControl), or triple negative human breast cancer cells (HSP47 (+) MDA-MB-231, HSP47 (-) MDA-MB-231) created by transfecting the shRNA expression plasmid (shHSP47)
  • the cells were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells / well in a 35-mm dish, and 24 hours after the start of the culture, the cell motility was measured using a scratch assay.
  • FIG. 8 shows the lung metastatic potential of human triple negative breast cancer cells due to suppression of HSP47 expression.
  • Control shRNA expression plasmid (shControl) or triple negative human breast cancer cells (HSP47 (+) MDA-MB-231, HSP47 (-) MDA-MB-231) created by transfecting shRNA expression plasmid (shHSP47).
  • Tail vein administration was performed to Balb / c nu / nu mice at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / 50 ⁇ L PBS. Metastatic potential to the lung was determined 30 days after cell administration by collecting lung tissue and performing HE staining. I checked.
  • FIG. 9 shows the interaction between HSP47 and MYH9 in triple negative breast cancer cells.
  • the whole cell extract (WCL) and the components extracted using the anti-Myc antibody-bound carrier were subjected to SDS-PAGE, and the association between MYH9 and HSP47 was confirmed by Western blotting.
  • FIG. 10A shows MYH9 in non-triple negative breast cancer cell line MCF7, Mock cell, MYH9 expressing cell (Mock + MYH9-GFP), HSP47 knockout (KO) cell, and MYH9 expressing HSP47KO cell (HSP47 KO + MYH9-GFP). 2 shows expression of protein and HSP47 protein.
  • FIG. 10B shows the in vitro growth of Mock cells, MYH9 expressing cells (Mock + MYH9-GFP), HSP47 knockout (KO) cells, and MYH9 expressing HSP47 KO cells (HSP47 KO + MYH9-GFP). * P ⁇ 0.05. ns: not significant.
  • FIG. 10A shows MYH9 in non-triple negative breast cancer cell line MCF7, Mock cell, MYH9 expressing cell (Mock + MYH9-GFP), HSP47 knockout (KO) cell, and MYH9 expressing HSP47KO cell (HSP
  • FIG. 10C shows the results of examination of the invasion of Mock cells, MYH9-expressing cells (Mock + MYH9-GFP), HSP47 knockout (KO) cells, and MYH9-expressing HSP47 KO cells (HSP47 KO + MYH9-GFP) by a scratch assay. Show. A representative image of the infiltrated area (top) and a quantification graph (bottom) are shown. * P ⁇ 0.05. ns: not significant.
  • 10D shows the migration of Mock cells, MYH9-expressing cells (Mock + MYH9-GFP), HSP47 knockout (KO) cells, and MYH9-expressing HSP47 KO cells (HSP47 KO + MYH9-GFP) examined by a double chamber assay. The results are shown. A representative image of migrated cells (top) and a quantification graph (bottom) are shown. * P ⁇ 0.05. ns: not significant. FIG.
  • FIG. 10E shows that Mock cells, MYH9-expressing cells (Mock + MYH9-GFP), HSP47 knockout (KO) cells, and MYH9-expressing HSP47 KO cells (HSP47 KO + MYH9-GFP) were transformed into Balb / c nu / nu female mice.
  • 2 shows the results of examining the tumor-forming ability by transplantation into a mammary fat pad. * P ⁇ 0.05. ns: not significant.
  • FIG. 10F shows Balb / c nu / nu female transplanted with Mock cells, MYH9 expressing cells (Mock + MYH9-GFP), HSP47 knockout (KO) cells, and MYH9 expressing HSP47 KO cells (HSP47 KO + MYH9-GFP).
  • Fig. 3 shows the results of histological analysis of mouse lung tissue. Scale bar: 200 ⁇ m.
  • FIG. 11A shows the expression of MYH9 ⁇ mRNA in human breast cancer cells. The expression of MYH9 mRNA in two types of triple negative human breast cancer cells (MDA-MB-231, MDA-MB-468) was detected by Real-time-PCR.
  • FIG. 11B shows the ability of triple negative human breast cancer cells to proliferate due to suppression of MYH9 expression.
  • siControl, or MYH9 siRNA siMYH9-A, siMYH9-B, siMYH9-C
  • MDA-MB-231 and MDA-MB-4608 1 ⁇ 10 4 cells / The cells were seeded on a 6-well plate with a well, and the cell proliferation ability was measured by cell counting for 5 days after the start of culture.
  • FIG. 12A shows the cell motility of triple negative human breast cancer cells due to suppression of MYH9 expression.
  • SiControl or MYH9 siRNA (siMYH9-A, siMYH9-B, siMYH9-C) triple-negative human breast cancer cells (MDA-MB-231, MDA-MB-468) created by transfecting 1 ⁇ 10 5 cells / The cells were seeded on a 35-mm dish with a well, and 24 hours after the start of the culture, the cell motility was measured using a scratch assay.
  • FIG. 12B shows the lung metastatic potential of human triple-negative breast cancer cells due to suppression of HSP47 expression.
  • SiControl or MYH9 siRNA (siMYH9-A, siMYH9-B, siMYH9-C) transfected triple negative human breast cancer cells (MDA-MB-231, MDA-MB-468) 2 ⁇ 10 4 cells / Cultured in the Transwell chamber at the concentration of the insert. Twenty-four hours after the start of the culture, the cells that passed through the Transwell membrane were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with hematoxylin. The result of the number of cells per field is shown in FIG. 12B.
  • a cancer metastasis inhibitor comprising an HSP47 inhibitor, a pharmaceutical composition and a kit comprising the same, and a method for inhibiting cancer metastasis comprising administering an HSP47 inhibitor.
  • the cancer metastasis inhibitor, the pharmaceutical composition, the kit and the method of the present invention may be a nucleic acid molecule (for example, a HSP47 transcript RNA (including pre-mRNA and mRNA), such as a HSP47 mRNA exemplified by SEQ ID NO: 1; Using short interfering nucleic acids (siNA), short interfering RNAs (siRNAs), double-stranded RNAs (dsRNAs), micro RNAs (miRNAs) or short hairpin RNAs (shRNAs), or The HSP47 gene is knocked out using a genome editing technique.
  • a HSP47 transcript RNA including pre-mRNA and mRNA
  • dsRNAs double-stranded RNAs
  • miRNAs micro
  • Cancer metastasis inhibitor of the present invention relates to a cancer metastasis inhibitor comprising an inhibitor of HSP47, for example, a cancer metastasis inhibitor comprising an inhibitor of HSP47 expression.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of the HSP47 gene are known in the art, and in the present invention, the mRNA sequence of HSP47 is represented by SEQ ID NO: 1.
  • the transcript RNA of HSP47 is, for example, a human-derived base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a base sequence containing deletion, substitution, addition or insertion of one or several nucleotides in each base sequence.
  • the term "several” refers to a base number of 2 to 10, preferably 2 to 5, and more preferably 2 to 3.
  • sequence identity can be determined using a known algorithm such as BLAST.
  • the HSP47 expression inhibitor may be a component that inhibits the expression of HSP47 or a component that inhibits the function of the HSP47 protein.
  • siRNA having RNA interference (RNAi) activity or siRNA thereof It includes a vector containing DNA encoding siRNA for precursor RNA (for example, shRNA) or modified RNA thereof, or RNA for transcript RNA of HSP47 gene.
  • the HSP47 expression inhibitor may be, for example, a short interfering nucleic acid (siNA), a ribozyme, a shRNA, a microRNA, or the like.
  • the vector may include antisense RNA or antisense DNA, DNA encoding the antisense RNA, or the antisense DNA.
  • the inhibitor of HSP47 expression is preferably, for example, shRNA or a plasmid vector containing shRNA.
  • shRNAs can be purchased from Origen.
  • the HSP47 gene is knocked out using a genome editing technique using a plasmid encoding a gRNA sequence (eg, 5'-CAAGATGCGAGACGAGTTATAGG-3 '(SEQ ID NO: 8)) as an inhibitor of HSP47 expression. You can also.
  • the siRNA is an antisense RNA comprising 18 to 25 nucleotides, preferably 20 to 24 nucleotides, more preferably 21 to 23 nucleotides, which is substantially complementary to a part of the transcript RNA of the HSP47 gene. It may be a double-stranded RNA comprising sense RNA and antisense RNA, which has an RNAi (RNA interference) action.
  • RNAi RNA interference
  • "complementary" means that the nucleic acid can form hydrogen bonds with other nucleic acid sequences by the classic Watson-Crick type or other non-classical types.
  • the term "substantially complementary” means not only the case where all consecutive residues of a nucleic acid sequence form hydrogen bonds with the same number of consecutive residues in another nucleic acid sequence, Of the residues of all nucleic acid sequences, for example, 70%, 80%, and 90% of the residues form hydrogen bonds with residues of other nucleic acid sequences. Therefore, in the present invention, the siRNA may have an antisense RNA containing a nucleotide that is changed by several bases from a nucleotide that is 100% complementary to a part of the transcript RNA of the HSP47 gene.
  • each of the sense RNA and the antisense RNA may have a protruding end of 2 to 5 nucleotides, preferably 2 nucleotides.
  • the siRNA may be a modified siRNA.
  • the siRNA is a combination of 5′-CUACGACGACGAGAAGGAAtt-3 ′ of the sense strand (SEQ ID NO: 2) and 5′-UUCCUUCUCGUCGUCGUAGta-3 ′ of the antisense strand (SEQ ID NO: 3) (siHSP47-A) (Ambion ), A combination of 5′-AGCCCUCUUCUGACACUAAtt-3 ′ (SEQ ID NO: 4) of the sense strand and 5′-UUAGUGUCAGAAGAGGGCUgg-3 ′ (SEQ ID NO: 5) of the antisense strand (siHSP47-B) (Ambion), 5 ′ of the sense strand -A combination (siHSP47-C) of GGACAGGCCUCUACAACUAtt-3 '(SEQ ID NO: 6) and the antisense strand 5'-UAGUUGUAGAGGCCUGUCCtt-3' (SEQ ID NO: 7) (prepared by
  • the cancer metastasis inhibitor is an inhibitor of MYH9 (for example, Accession No. NM_002473 (SEQ ID NO: 15)), in addition to an inhibitor of HSP47, for example, a plasmid encoding a gRNA sequence or a sense.
  • MYH9 for example, Accession No. NM_002473 (SEQ ID NO: 15)
  • HSP47 for example, a plasmid encoding a gRNA sequence or a sense.
  • the introduction of an inhibitor of HSP47 or MYH9 into cells may be performed by any known introduction method, such as, but not limited to, lipofectamine method, lipofection method, calcium phosphate method, ultrasonic introduction method, electroporation method, particle gun method, A method using a virus vector (for example, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a retrovirus vector, or the like), a microinjection method, or the like can be used.
  • a virus vector for example, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a retrovirus vector, or the like
  • a microinjection method or the like
  • the titer of the virus is 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 15 p. f. u. (Plaque-forming unit), preferably 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 13 , more preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 11 , even more preferably 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 10 . be
  • the nucleic acid molecule may be used as a naked nucleic acid or may be used by incorporating it into various nucleic acid constructs or vectors.
  • any known vector such as a plasmid vector, a phage vector, a phagemid vector, a cosmid vector, and a virus vector can be used.
  • the nucleic acid construct or vector preferably contains at least appropriate transcription or translation control sequences derived from, for example, mammalian, microbial, viral, or insect genes.
  • control sequences include sequences having a regulatory role in gene expression, such as transcription promoters or enhancers, operator sequences for regulating transcription, sequences encoding ribosome binding sites within messenger RNA, and transcription, translation initiation.
  • a suitable sequence for regulating the termination of transcription is included.
  • composition of the present invention also relates to a pharmaceutical composition containing the above-mentioned cancer metastasis inhibitor.
  • the above-mentioned cancer metastasis inhibitor is useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition because it can reduce the motility of cancer cells and suppress cancer metastasis.
  • a pharmaceutical composition of the invention may comprise an inhibitor of HSP47 as described above and one or more pharmaceutically acceptable surfactants, carriers, diluents and / or excipients.
  • Pharmaceutically acceptable carriers, diluents and the like are well known in the pharmaceutical art, for example, see Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990), which is incorporated by reference in its entirety. ).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can significantly suppress the motility of cancer cells and metastasis of cancer, for example, the cell motility measured by a scratch assay is, for example, 2 minutes. To 1/3 or less.
  • the pharmaceutical composition of the present invention for example, has a 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, %, 70%, 80%, 90%, or more than 90% can reduce the area of metastasis of the cancer.
  • the cancer targeted by the pharmaceutical composition of the present invention is not limited as long as the transcript RNA of HSP47 is expressed, and examples thereof include fibrosarcoma, malignant fibrous histiocytoma, liposarcoma, rhabdomyosarcoma, and leiomyosarcoma.
  • Sarcomas hemangiosarcomas, Kaposi's sarcomas, lymphatic sarcomas, synovial sarcomas, chondrosarcomas, osteosarcomas, and other sarcomas, brain tumors, head and neck cancer, breast cancer, lung cancer, esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, appendix cancer, colon cancer, Rectal cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, anal cancer, renal cancer, ureteral cancer, bladder cancer, prostate cancer, penis cancer, testicular cancer, uterine cancer, ovarian cancer, vulvar cancer, vaginal cancer, Examples include carcinomas such as skin cancer, leukemias and malignant lymphomas.
  • solid cancers are preferable, pancreatic cancer, colon cancer, and breast cancer are more preferable, and breast cancers such as triple negative breast cancer are particularly preferable.
  • triple-negative breast cancer has a higher expression of MYH9 protein and has higher motility than non-triple-negative breast cancer.
  • the present invention relates to a cancer type having higher motility, such as triple-negative breast cancer. It can be particularly suitably applied to
  • the metastatic cancer targeted by the pharmaceutical composition of the present invention includes, for example, metastatic lung cancer.
  • Whether or not cancer cells express HSP47 can be determined by detecting the expression of HSP47 transcript RNA at the gene level. Specifically, at the gene level, for example, any known gene expression analysis methods such as Northern blotting, RNase protection assay, PCR such as RT-PCR, real-time PCR, in situ hybridization, in vitro transcription, and the like. Can be detected. Whether or not the cancer cells express HSP47 can be determined by detecting the expression of HSP47 at the protein level.
  • immunoprecipitation method EIA (enzyme-immunoassay) (for example, ELISA (enzyme-linked-immunosorbent-assay), etc.), RIA (radio-immuno-assay) (for example, IRMA (immunoradiometric-assay), RAST (radioallergosorbent-test) , RIST (radioimmunosorbent test), Western blotting, immunohistochemistry, immunocytochemistry, and flow cytometry.
  • EIA enzyme-immunoassay
  • ELISA enzyme-linked-immunosorbent-assay
  • RIA radio-immuno-assay
  • IRMA immunoradiometric-assay
  • RAST radioallergosorbent-test
  • RIST radioimmunosorbent test
  • the cells to which the pharmaceutical composition of the present invention is administered are cells in which a transcript RNA of HSP47 is expressed. Normal cells generally do not substantially express HSP47 transcript RNA except for fibroblasts and myofibroblasts.
  • the cells to which the pharmaceutical composition of the present invention is administered are preferably cancer cells expressing the HSP47 protein, and more preferably cells expressing the MYH9 protein in addition to the HSP47 protein. HSP47 positive triple negative breast cancer also expresses MYH9 protein. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention may contain an inhibitor of MYH9 in addition to the inhibitor of HSP47.
  • the cells to which the pharmaceutical composition of the present invention is administered are hormone receptor (eg, estrogen receptor and progesterone receptor) negative and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) negative.
  • hormone receptor eg, estrogen receptor and progesterone receptor
  • HER2 human epidermal growth factor receptor 2
  • Triple negative human breast cancer cells Diagnosis of triple negative breast cancer requires pathological examination (mainly immunohistochemical staining) and gene expression analysis of tumor tissue obtained by biopsy. Pathological examination and gene expression analysis of two hormone receptors (estrogen receptor, progesterone receptor) and HER2 are performed, and if all of these are negative, it is diagnosed as triple negative breast cancer. As shown in FIG. 1, triple-negative breast cancer cultured in cells is weakly positive for HSP47 expression. However, as shown in FIG.
  • triple negative breast cancer cells have high expression of HSP47 when placed in an in vivo environment.
  • Triple-negative breast cancer which is a problem in cancer pathology, has increased expression of HSP47 in vivo, and such HSP47-positive triple-negative breast cancer has a high metastatic potential.
  • composition of the present invention may further comprise other chemotherapeutic agents useful for treating the disease of interest.
  • Chemotherapeutic agents include, but are not limited to, for example, alkylating agents, antimetabolites, antitumor antibiotics, alkaloids, hormonal therapies, platinum complexes, angiogenesis inhibitors, topoisomerase inhibitors, and microtubule agonists And the like.
  • HSP47 inhibitors When used in combination with other chemotherapeutic agents in the pharmaceutical compositions of the present invention, they may be included in a single composition or may be included separately in multiple compositions and the They may be used separately or in combination.
  • the above-described pharmaceutical composition can be used by being supported on various drug delivery carriers.
  • Such carriers include, but are not limited to, for example, polymer nanoparticles, polymer micelles, dendrimers, liposomes, virus nanoparticles, carbon nanotubes, and the like (Cho K. et al., Clin Cancer Res. 2008 Mar 1; 14) (5): see 1310-6).
  • compositions of the present invention can be administered by a variety of routes, including both oral and parenteral, including, but not limited to, oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, rectal, intratumoral, intraarterial, portal vein It may be administered by intramuscular, intramedullary, intrapulp, sublingual, intraoral, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary, intrauterine, etc. routes suitable for each administration route It may be formulated in a dosage form.
  • any known one can be appropriately adopted (for example, see Standard Pharmacology, edited by Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003, Remington's Pharmaceutical Sciences, etc.).
  • dosage forms suitable for oral administration include, without limitation, powders, granules, tablets, capsules, solutions, suspensions, emulsions, gels, syrups, and the like, and for parenteral administration.
  • Suitable dosage forms include injections such as solution injections, suspension injections, emulsion injections, and ready-to-use injections.
  • Formulations for parenteral administration may be in the form of aqueous or non-aqueous isotonic sterile solutions or suspensions.
  • Kit of the invention provides a cancer metastasis inhibitor or an active ingredient (eg, an inhibitor of HSP47) which can be contained in a pharmaceutical composition, alone or in combination, comprising one or more containers.
  • the present invention relates to a kit for preparing a pharmaceutical composition, and also a necessary component of a cancer metastasis inhibitor or a pharmaceutical composition provided in the form of such a kit.
  • the kit of the present invention contains, in addition to the above, instructions describing the method for preparing or administering the cancer metastasis inhibitor or the pharmaceutical composition of the present invention, for example, instructions, and an electronic recording medium such as a CD or DVD. You may go out.
  • One embodiment of the present invention relates to a method for suppressing metastasis of cancer, which comprises administering an inhibitor of HSP47.
  • the motility of the cancer cells is, for example, one half or three minutes as measured by the scratch assay. It has decreased to 1 or less.
  • the present method as a result of suppressing the motility of cancer cells, for example, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, The area of metastasis of the cancer can be reduced by 70%, 80%, 90% or 90% or more.
  • the administered patient is typically a patient in need of cancer treatment.
  • Such patients include, but are not limited to, for example, those suffering from, diagnosed with, or at high risk of developing these cancers associated with HSP47 expression.
  • the method of the present invention comprises the step of identifying a patient in need of treatment with a cancer metastasis inhibitor or a pharmaceutical composition comprising an inhibitor of HSP47 of the present invention, for example, whether the breast cancer patient is a triple negative breast cancer patient May be further included.
  • the step of confirming whether a breast cancer patient is a triple negative breast cancer patient is a step of performing pathological examination (mainly immunohistochemical staining) and gene expression analysis of tumor tissue obtained by biopsy, and more specifically, two steps. Pathological examination and gene expression analysis of hormone receptors (estrogen receptor, progesterone receptor) and HER2, and when all of these are negative, it is determined to have triple negative breast cancer.
  • pathological examination mainly immunohistochemical staining
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with another agent or a treatment method useful for treating a target cancer.
  • the method of the present invention can be used in combination with physical therapy such as radiation therapy and particle beam therapy, surgical therapy such as surgery, chemotherapy, and molecular targeted therapy as treatment methods.
  • chemotherapeutic agents such as those described above can be used in combination as other active substances, for example, alkylating agents, antimetabolites, antitumor antibiotics, alkaloids, hormonal therapeutic agents, platinum complexes , Angiogenesis inhibitors, topoisomerase inhibitors, and microtubule acting drugs.
  • the method of the present invention employs such a configuration to suppress cancer metastasis together with these treatments while performing general treatments such as removal of cancer cells, induction of cell death, or suppression of cell growth. Can be. Therefore, according to the method of the present invention, cancer can be treated in various aspects, and the effect of cancer treatment can be improved.
  • the effective amount in the method for inhibiting metastasis of cancer of the present invention is, for example, an amount that reduces the motility of cancer cells or an amount that reduces the area of cancer metastasis. Also preferred is an amount that does not cause adverse effects beyond the benefit of administration. Such an amount can be appropriately determined by an in vitro test using cultured cells or the like, or a test in a model animal such as mouse, rat, dog or pig, and such a test method is well known to those skilled in the art. .
  • the dose of the drug used in the treatment method of the present invention is known to those skilled in the art, or can be appropriately determined by the above-described test and the like.
  • the specific dose of the active ingredient (eg, an inhibitor of HSP47) to be administered in the methods of the invention described herein will depend on various conditions associated with the subject requiring treatment, such as the severity of the condition, The determination can be made in consideration of general health condition, age, body weight, gender of the subject, diet, timing and frequency of administration, concomitant medication, responsiveness to treatment, dosage form, compliance with treatment, and the like.
  • the dose of the active ingredient used in the method of the present invention is preferably, for humans, for example, 0.1 mg to 1,000 mg in terms of siRNA molecules per once and per kg of adult body weight.
  • Administration routes include various routes including both oral and parenteral, such as oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, intratumoral, rectal, intraarterial, intraportal, intramedullary, intrapulp, Sublingual, intraoral, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary, intrauterine and other routes are included.
  • oral and parenteral such as oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, intratumoral, rectal, intraarterial, intraportal, intramedullary, intrapulp, Sublingual, intraoral, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary, intrauterine and other routes are included.
  • the frequency of administration varies depending on the properties of the agent or composition used and the conditions of the subject including the above, but for example, many times a day (that is, 2, 3, 4, or 5 or more times a day), 1 time a day Times, every few days (ie, every 2, 3, 4, 5, 6, 7 days, etc.), every week, every few weeks (ie, every 2, 3, 4 weeks, etc.).
  • the term “patient” refers to any living individual, but is, for example, an animal, mammal, or human individual.
  • patient refers to a subject that typically has, or is at risk of having, cancer.
  • treatment encompasses all types of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions, such as for the cure, temporary remission or prevention of disease. Shall be.
  • treatment encompasses medically acceptable interventions for a variety of purposes, including slowing or stopping the progression of a disease, regressing or eliminating lesions, preventing the onset or preventing recurrence, and the like.
  • the present inventors have proposed that the cancer metastasis inhibitor or the pharmaceutical composition of the present invention suppresses the expression of HSP47 (SEQ ID NO: 1), thereby suppressing the cell motility of triple-negative breast cancer.
  • HSP47 SEQ ID NO: 1
  • the present invention also provides a cancer metastasis inhibitor and a pharmaceutical composition for providing the above-mentioned effect, which comprises an inhibitor of HSP47, a use in the manufacture of a medicament for providing the above-mentioned effect, and the use of an inhibitor of HSP47. It also relates to the use for providing the above effects.
  • Example 1 Obtaining and culturing a cell line All human breast cancer cell lines used herein (MDA-MB-468, MDA-MB-231, MDA-MB-157, MCF7, BT474) were purchased from the American Type Culture Collection. These cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Invitrogen Life Technologies).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS Invitrogen Life Technologies
  • Example 2 Expression of HSP47 mRNA and HSP47 protein in human breast cancer cells
  • Real-time expression of HSP47 mRNA and HSP47 protein in three types of triple negative human breast cancer cells MDA-MB-468, MDA-MB-231, MDA-MB-157) and two types of non-triple negative human breast cancer cells (MCF7, BT474) Detection was performed by time-PCR and Western blotting. The results are shown in FIG.
  • the expression of mRNA in three types of triple negative human breast cancer cells was significantly lower than the expression of mRNA in two types of non-triple negative human breast cancer cells.
  • the expression of HSP47 protein in three types of triple negative human breast cancer cells was significantly lower than the expression of HSP47 protein in two types of non-triple negative human breast cancer cells.
  • Example 3 HSP47 positive cell ratio in triple negative human breast cancer cells
  • MDA-MB-231 Two types of triple negative human breast cancer cells (MDA-MB-231, MDA-MB-157) were implanted subcutaneously in Balb / c nu / nu mice at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / 50 ⁇ L PBS, and after tumor formation, Tumor cells were collected and subjected to flow cytometer analysis using an anti-HSP47 antibody (Enzo Life Sciences). The results are shown in FIG. 19.7% of MDA-MB-231 cells expressed HSP47, and 16.7% of MDA-MB-157 cells expressed HSP47. Therefore, as shown in FIG. 1, the expression of HSP47 was weakly positive in triple negative breast cancer cultured in cells. However, as shown in FIG. 2, HSP47 expression was high in the triple negative breast cancer cells when placed in an in vivo environment.
  • Example 4 HSP47 forced expression triple-negative human breast cancer cell growth ability, motility and lung metastasis ability
  • the pCMV6-entry plasmid (Mock) was obtained from Origene.
  • the pCMV6-HSP47-Myc plasmid (HSP47: Myc) was obtained from Origene.
  • the pCMV6-entry plasmid (Mock) or the pCMV6-HSP47-Myc plasmid (HSP47: Myc) was transfected to prepare HSP47 forced expression triple negative human breast cancer cells (MDA-MB-231, MDA-MB-157).
  • the cell motility of the HSP47: Myc group was increased about 3 to 4 times as compared with the Mock group and the WT group.
  • the cell motility in the HSP47: Myc group was about twice as high as in the Mock group and the WT group.
  • these cells were administered to Balb / c nu / nu mice at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / 50 ⁇ L PBS in the tail vein, and the metastatic potential to the lung was determined by collecting lung tissue 30 days after cell administration. Then, it was examined by HE staining. The results are shown in FIG. In the HSP47: Myc group of MDA-MB-231 cells, remarkably higher lung metastasis was observed as compared to the Mock group (stained portion at the center in the right figure).
  • Example 5 Cell proliferation, exercise and lung metastasis of triple negative human breast cancer cells by suppression of HSP47 expression Control shRNA expression plasmid (shControl) was obtained from Origene.
  • the HSP47 shRNA expression plasmid (shHSP47) was obtained from Origene.
  • FIG. 6 shows the results.
  • the cell proliferation ability was significantly reduced in the shHSP47 group compared to the shControl group. Further, these cells were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells / well in a 35-mm dish, and 24 hours after the start of the culture, the cell motility was measured using a scratch assay.
  • FIG. 7 shows the results. Regarding the MDA-MB-231 cells, the cell motility was significantly reduced to about a quarter in the shHSP47 group compared to the shControl group.
  • FIG. 8 shows the results.
  • MDA-MB-231 cells lung metastasis was observed in the shControl group (left side in the lower left figure), but almost no lung metastasis was observed in the shHSP47 group (lower right figure). Therefore, it was suggested that suppression of HSP47 expression in cancer cells is effective in suppressing metastasis of cancer.
  • Example 6 Interaction between HSP47 and MYH9 in triple negative breast cancer cells MDA-MB-231 cells (Mock) and MDA-MB-231 cells expressing HSP47: Myc were washed with ice-cold PBS, lysis buffer (50 mM Tris, 250 mM Tris, 250 mM Tris, supplemented with Roche Diagnostics). mM NaCl, 25 mM EDTA, 1% NP-40). Immunoprecipitation of HSP47 from cell lysates was performed using anti-Myc immobilized magnetic microbeads (Medical & Biological Laboratories) at 4 ° C. for 16 hours, and the beads were washed with a lysis buffer over a magnetic field.
  • lysis buffer 50 mM Tris, 250 mM Tris, 250 mM Tris, supplemented with Roche Diagnostics.
  • mM NaCl 25 mM EDTA, 1% NP-40
  • Protein was eluted from the beads using 50 mM glycine-HCl buffer (pH 3.5) containing SDS-PAGE sample buffer. After elution with a 0.1 M glycine buffer (pH 2.8), the sample was applied to SDS-PAGE and transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (Millipore, Billerica, MA). After blocking with 5% skim milk in PBS containing 0.05% Tween-20, the membrane was probed with the following primary antibodies: mouse anti-HSP47 monoclonal antibody (Enzo Life Sciences) and mouse anti-MYH9 monoclonal antibody (Elabscience).
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP horseradish peroxidase
  • Example 7 Both HSP47 and MYH9 enhance metastatic potential of non-triple negative breast cancer Induction of MYH9 expression enhances metastatic potential of non-triple negative breast cancer cells (MCF7) expressing HSP47 but not MYH9
  • MCF7 non-triple negative breast cancer cells
  • a non-triple negative breast cancer cell line (Mock + MYH9-GFP) stably expressing MYH9 was produced (FIG. 10A), and the metastatic ability of Mock + MYH9-GFP cells was investigated.
  • a plasmid expressing MYH9 also known as NMIIA
  • a pCMV-NMIIA-GFP plasmid Origene
  • Mock + MYH9-GFP cells Under in vitro culture conditions, the growth rate of Mock + MYH9-GFP cells was slightly higher than the corresponding Mock cells without the introduction of this plasmid (FIG. 10B). In contrast, the tumorigenicity of Mock + MYH9-GFP cells was completely different from Mock cells (FIG. 10E). The ability of Mock + MYH9-GFP cells to infiltrate and migrate was significantly higher than the corresponding Mock cells (FIGS. 10C and 10D). Furthermore, histological analysis showed that the ability of Mock + MYH9-GFP cells to metastasize to the lung was significantly higher than that of Mock cells (FIG. 10F). Histological analysis was performed as in Example 5.
  • HSP47 expression knockout (KO) MCF7 cells were prepared as follows (FIG. 10A).
  • HSP47 KO cells were prepared using a pCG: SapI plasmid containing a cloning site for Cas9 sequence and gRNA sequence, which was provided by Dr. Sakurai of Shinshu University (Sakurai, T. et al. (2014) BMC Biotechnol. 14 , 69, and Sakurai, T. et al. (2016) Sci. Rep. 6, 20011).
  • the gRNA sequence designed for exon 5 of the human HSP47 genome (5'-CAAGATGCGAGACGAGTTATAGG-3 '(SEQ ID NO: 8)) was inserted into the pCG: SapI plasmid.
  • the pP2A-mCherry-N1 plasmid (Addgege) was used to amplify a DNA fragment of the P2A-mCherry cDNA.
  • the constructed targeting vector and pcDNA3.1 (+) (Promega) were co-transfected into MCF7 cell line using Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific).
  • the treated cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and G418 (1000 ⁇ g / mL, Thermo Fisher Scientific) to select cell clones.
  • DNA sequencing of HSP47 genomic DNA extracted from cell clones was performed to confirm insertion of the P2A-mCherry gene into the downstream site of the HSP47 gene.
  • Single cell clones were evaluated by DNA sequence analysis to detect insertions and deletions in the target allele. When the growth rate was confirmed, it was found that the growth rate of HSP47 KO cells was significantly lower than that of Mock cells and Mock + MYH9-GFP cells (FIG. 10B). The decrease in the growth rate of HSP47 KO cells was not restored by expressing MYH9 (FIG. 10B).
  • HSP47 deletion also reduced the tumorigenicity of MCF7 cells, regardless of MYH9 expression by the plasmid expressing MYH9 (FIG. 10E).
  • the enhancement of the motility ability of MCF7 cells by the induction of MYH9 was significantly suppressed by the deletion of HSP47 expression (FIGS. 10C and 10D).
  • the ability of MYH9-GFP cells to metastasize to the lung was also completely suppressed by the loss of HSP47 expression (FIG. 10F). Histological analysis was performed as in Example 5. These results suggested that both HSP47 and MYH9 expression were responsible for the metastatic potential of non-triple negative cells.
  • Example 8 In Vitro Propagation of Triple Negative Cells Transfected with MYH9 siRNA Human triple negative breast cancer cells (MDA-MB-231 and MDA-MB-468) were transformed using Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Life Technologies) as follows: The cells were transfected with the siRNA and cultured at 37 ° C. in the air for 5 hours.
  • Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen Life Technologies
  • Control siRNA siControl, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
  • MYH9-A siRNA siMYH9-A, sense strand: 5'-GGGUAUCAAUGUGACCGAUtt-3 '(SEQ ID NO: 9); antisense strand: 5'-AUCGGUCACAUUGAUACCCaa-3' (SEQ ID NO: 10)
  • MYH9-B siRNA siMYH9-B, sense strand: 5'-CCACCAACCUCACAGAAGAGAtt-3 '(SEQ ID NO: 11); antisense strand: 5'-UCUUCUGUGAGGUUGGUGGtg-3' (SEQ ID NO: 12)
  • MYH9-C siRNA siMYH9-C, sense strand: 5'-CGGCAAGGUGGAUUACAAAtt-3 '(SEQ ID NO: 13); antisense strand: 5'-UUUGUAAUCCACCUUGCCGgc-3' (SEQ ID NO: 13
  • MYH9 protein in triple negative human breast cancer cells MDA-MB-231 and MDA-MB-4608 was detected by Real time-PCR.
  • FIG. 11A The expression of MYH9 mRNA in the test groups (siMYH9-A, siMYH9-B, siMYH9-C) was significantly lower than the expression of MYH9 mRNA in the siControl group.
  • test groups siMYH9-A, siMYH9-B, siMYH9-C
  • siMYH9-C had a cell motility that was one-fifth that of the siControl group. It was significantly reduced to about one third.
  • these cells were cultured in a Transwell chamber at a concentration of 2 ⁇ 10 4 cells / insert. Twenty-four hours after the start of the culture, the cells that passed through the Transwell membrane were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with hematoxylin. The result of the number of cells per field is shown in FIG. 12B.
  • the test group siMYH9-A, siMYH9-B, siMYH9-C
  • siMYH9-C had a cell invasive ability that was one-fourth that of the siControl group. It was significantly reduced by about 3 (FIG. 12B). Therefore, it was suggested that suppression of MYH9 expression in cancer cells is effective in suppressing metastasis of cancer.

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Abstract

本明細書において、ＨＳＰ４７の阻害物質を含む、癌転移抑制剤が提供される。

Description

ＨＳＰ４７の阻害物質を用いた、がん転移抑制
　本発明は、癌の転移を抑制するための医薬およびその方法に関する。 
　癌治療においては、癌細胞死の誘導による治療、癌細胞の増殖抑制による治療および癌組織の除去による治療が主流であるが、これらの治療と組み合わせて、癌細胞の転移抑制の治療を行うことは、癌の進行や癌の再発防止の観点で重要である。しかし、癌細胞の転移を抑制するための有効な治療が実現化されていない。そのため、癌治療において、癌細胞の転移を抑制する手法の確立が望まれている。癌治療の手法としては、特許文献１には、heat shock protein 47（ＨＳＰ４７）を標的化する分子を用いて、腫瘍の増殖を抑制することで、腫瘍を治療することが記載されている。 
　トリプルネガティブ乳癌は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）、およびヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）の発現が陰性であり、高転移能を有していることから、従来の乳癌治療法（化学療法、ホルモン療法、分子標的治療）の効果がほとんど発揮されず、現状、それに対する解決策は皆無である。例えば、近年、乳癌治療の分子標的薬としてＨＥＲ２を標的とする抗体医薬が使用されているが、トリプルネガティブ乳癌はＨＥＲ２が陰性であるため、このような分子標的薬によって、細胞死や増殖抑制を誘導することが困難である。また、トリプルネガティブ乳癌には、ホルモン療法が奏効しない。トリプルネガティブ乳癌を外科的に除去する治療が可能であるが、外科的に癌組織を除去したとしても、癌細胞の一部が体内から除去しきれない場合がある。トリプルネガティブ乳癌は遠隔組織への転移能が非常に高いため、外科的な処置を施したとしても、残存するリスクを考慮して、転移を抑制する治療を併せて行うことが望ましい。しかしながら、一般的に、癌細胞の転移を抑制するための有効な治療は確立されていない。このように、乳癌、特にトリプルネガティブ乳癌についても高転移能の獲得機序は未解明であり、転移の制御・抑制を行える治療法も無い。 
米国特許出願公開第2017/0218365号公報
　本発明は、高悪性度かつ高転移能の癌の転移を抑制することを課題とする。 
　本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねる中で、トリプルネガティブ乳癌において、その一部の細胞集団がＨＳＰ４７を高発現していること、ＨＳＰ４７陽性トリプルネガティブ乳癌細胞は非常に転移能が高いこと、そして、トリプルネガティブヒト乳癌において、ＨＳＰ４７の発現を抑制することにより、その転移能を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。 
　さらに、本発明者らは、HSP４７タンパク質が、細胞運動の重要な因子であるnon-muscle myosin IIA; NMIIA (MYH9)に結合することを新たに見出している。HSP47は、細胞運動に重要な因子に結合して、細胞運動制御に関与しており、HSP47の阻害物質は、HSP47の発現阻害を介して、細胞運動を抑制することが予想される。MYH9は、トリプルネガティブヒト乳癌に限らず、乳癌以外の他の癌細胞においても発現しているため、HSP47の発現調節を介した細胞運動調節は、トリプルネガティブヒト乳癌以外の癌細胞に対しても適用できると予測される。
　すなわち、本発明は、以下に関するものである。 
（１）ＨＳＰ４７の阻害物質を含む、癌転移抑制剤。 
（２）癌が乳癌である、（１）に記載の癌転移抑制剤。 
（３）癌が、ホルモン受容体陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブ乳癌である、（２）に記載の癌転移抑制剤。 
（４）ホルモン受容体が、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体である、（３）に記載の癌転移抑制剤。 
（５）癌細胞が、ＨＳＰ４７に加えて、ＭＹＨ９を発現するトリプルネガティブ乳癌細胞である、（３）または（４）に記載の癌転移抑制剤。
（６）ＨＳＰ４７の阻害物質が、ＨＳＰ４７に対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、マイクロＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、これらを発現するベクター、またはこれらで形質転換された細胞である、（１）～（５）のいずれかに記載の癌転移抑制剤。 
（７）（１）～（６）のいずれかに記載の癌転移抑制剤を含む医薬組成物。 
（８）癌を処置するための、（７）に記載の医薬組成物。 
（９）転移性肺癌を処置するための、（８）に記載の医薬組成物。 
（１０）癌の転移を抑制するための医薬の製造における、ＨＳＰ４７の阻害物質の使用。 
（１１）癌がトリプルネガティブ乳癌である、（１０）に記載の使用。 
（１２）癌の転移の抑制における使用のための、ＨＳＰ４７の阻害物質を含む組成物。 
（１３）癌がトリプルネガティブ乳癌である、（１２）に記載の組成物。 
（１４）有効量のＨＳＰ４７の阻害物質を癌患者に投与することを特徴とする、癌の転移抑制方法。 
（１５）前記癌患者が乳癌患者であって、前記有効量のＨＳＰ４７の阻害物質の投与前に、乳癌患者がトリプルネガティブ乳癌患者であるか否かを確認する工程を含む、（１４）に記載の癌の転移抑制方法。 
（１６）前記有効量のＨＳＰ４７の阻害物質の投与前に、前記癌患者の癌組織がＨＳＰ４７に加えて、ＭＹＨ９を発現しているか否かを確認する工程を含む、（１４）または（１５）に記載の癌の転移抑制方法。
（１７）外科的治療、放射線治療、粒子線治療、化学療法、及び分子標的治療からなる群より選択される治療と共に行われる、（１４）～（１６）のいずれかに記載の癌の転移抑制方法。 
（１８）癌患者由来の癌細胞を、有効量のＨＳＰ４７の阻害物質を用いてインビトロで処置することを含む、インビトロで癌の転移を抑制する方法。 
　本発明の癌転移抑制剤は、癌細胞におけるＨＳＰ４７の発現を阻害することにより、癌の転移を抑制することができる。本発明の方法は、ＨＳＰ４７の阻害物質を投与することにより、癌の転移を抑制することができる。 
図１は、ヒト乳癌細胞におけるＨＳＰ４７　ｍＲＮＡ（左図）とＨＳＰ４７タンパク質（右図）の発現を示す。トリプルネガティブヒト乳癌細胞3種類(MDA-MB-468, MDA-MB-231, MDA-MB-157)および非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類(MCF7, BT474)におけるＨＳＰ４７　ｍＲＮＡおよびＨＳＰ４７タンパク質の発現をReal time-PCRとウエスタンブロット法にて検出した。 図２は、腫瘍由来トリプルネガティブヒト乳癌細胞におけるHSP47陽性細胞率を示す。トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類(MDA-MB-231, MDA-MB-157)を1×106 cells/50 μL PBSの濃度でBalb/c nu/nuマウスに皮下移植を行い、腫瘍形成後、腫瘍細胞を採取して、抗ＨＳＰ４７抗体（Enzo Life Sciences）を用いて、フローサイトメーター解析を行った。
図３は、ＨＳＰ４７強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞増殖能を示す。pCMV6-entryプラスミド(Mock)、もしくはpCMV6-HSP47-Mycプラスミド(HSP47:Myc)を遺伝子導入して作成したＨＳＰ４７強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞(MDA-MB-231、MDA-MB-157)を、1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。 図４は、ＨＳＰ４７強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞運動能を示す。pCMV6-entryプラスミド(Mock)、もしくはpCMV6-HSP47-Mycプラスミド(HSP47:Myc)を遺伝子導入して作成したＨＳＰ４７強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞(MDA-MB-231、MDA-MB-157)を1×104 cells/wellでdouble chamberに播種し、培養開始後24時間目に、ヘマトキシリン染色を行い、細胞カウントにより細胞運動能を測定した。 図５は、ＨＳＰ４７強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞の肺転移能を示す。pCMV6-entryプラスミド(Mock)、もしくはpCMV6-HSP47-Mycプラスミド(HSP47:Myc)を遺伝子導入して作成したHSP47強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞(MDA-MB-231)を1×106 cells/50 μL PBSの濃度でBalb/c nu/nuマウスに尾静脈投与を施し、肺への転移能は、細胞投与後30日目に肺組織を採取して、ＨＥ染色にて調べた。
図６は、ＨＳＰ４７発現抑制によるトリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞増殖能を示す。Control shRNA発現プラスミド(shControl)、もしくはＨＳＰ４７　ｓｈＲＮＡ発現プラスミド(shHSP47)を遺伝子導入して作成したトリプルネガティブヒト乳癌細胞(HSP47(+)MDA-MB-231, HSP47(-)MDA-MB-231)を1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。 図７は、ＨＳＰ４７発現抑制によるトリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞運動能を示す。Control shRNA発現プラスミド(shControl)、もしくはHSP47 shRNA発現プラスミド(shHSP47)を遺伝子導入して作成したトリプルネガティブヒト乳癌細胞(HSP47(+)MDA-MB-231, HSP47(-)MDA-MB-231)を1×105 cells/wellで35-mm dishに播種し、培養開始後24時間目に、スクラッチアッセイを用いて細胞運動能を測定した。 図８は、ＨＳＰ４７発現抑制によるヒトトリプルネガティブ乳癌細胞の肺転移能を示す。Control shRNA発現プラスミド(shControl)、もしくはＨＳＰ４７　ｓｈＲＮＡ発現プラスミド(shHSP47)を遺伝子導入して作成したトリプルネガティブヒト乳癌細胞(HSP47(+)MDA-MB-231, HSP47(-)MDA-MB-231)を1×106 cells/50 μL PBSの濃度でBalb/c nu/nuマウスに尾静脈投与を施し、肺への転移能は、細胞投与後30日目に肺組織を採取して、ＨＥ染色にて調べた。 図９は、トリプルネガティブ乳癌細胞におけるＨＳＰ４７とＭＹＨ９との相互作用を示す。全細胞抽出液（WCL）と、抗Myc抗体結合担体を用いて抽出された成分とを、SDS-PAGEに供試し、ウエスタンブロッティングにてＭＹＨ９とＨＳＰ４７との会合を確認した。
図１０Ａは、非トリプルネガティブ乳癌細胞株MCF7であるMock細胞、MYH9発現細胞（Mock+MYH9-GFP）、HSP47ノックアウト（KO）細胞、および、MYH9発現HSP47KO細胞（HSP47 KO+MYH9-GFP）におけるMYH9タンパク質およびHSP47タンパク質の発現を示す。 図１０Ｂは、Mock細胞、MYH9発現細胞（Mock+MYH9-GFP）、HSP47ノックアウト（KO）細胞、および、MYH9発現HSP47 KO細胞（HSP47 KO+MYH9-GFP）のインビトロ増殖を示す。*P<0.05。 n.s: 有意でない。 図１０Ｃは、Mock細胞、MYH9発現細胞（Mock+MYH9-GFP）、HSP47ノックアウト（KO）細胞、および、MYH9発現HSP47 KO細胞（HSP47 KO+MYH9-GFP）の浸潤をスクラッチアッセイによって調査した結果を示す。浸潤した領域の代表的な画像（上図）および定量化グラフ（下図）を示す。*P<0.05。 n.s: 有意でない。 図１０Ｄは、Mock細胞、MYH9発現細胞（Mock+MYH9-GFP）、HSP47ノックアウト（KO）細胞、および、MYH9発現HSP47 KO細胞（HSP47 KO+MYH9-GFP）の遊走を、ダブルチャンバーアッセイによって調査した結果を示す。遊走した細胞の代表的な画像（上図）および定量化グラフ（下図）を示す。*P<0.05。 n.s: 有意でない。 図１０Ｅは、Mock細胞、MYH9発現細胞（Mock+MYH9-GFP）、HSP47ノックアウト（KO）細胞、および、MYH9発現HSP47 KO細胞（HSP47 KO+MYH9-GFP）を、Balb/c nu/nu雌性マウスの乳房脂肪パッドに移植し、腫瘍形成能を調査した結果を示す。*P<0.05。 n.s: 有意でない。 図１０Ｆは、Mock細胞、MYH9発現細胞（Mock+MYH9-GFP）、HSP47ノックアウト（KO）細胞、および、MYH9発現HSP47 KO細胞（HSP47 KO+MYH9-GFP）を移植したBalb/c nu/nu雌性マウスの肺組織の組織学的分析の結果を示す。スケールバー：２００μｍ。 図１１Ａは、ヒト乳癌細胞におけるＭＹＨ９　ｍＲＮＡの発現を示す。トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類(MDA-MB-231, MDA-MB-468)におけるＭＹＨ９　ｍＲＮＡの発現をReal time-PCRにて検出した。 図１１Ｂは、MYH9発現抑制によるトリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞増殖能を示す。siControl、もしくはMYH9 siRNA(siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C)を遺伝子導入して作成したトリプルネガティブヒト乳癌細胞(MDA-MB-231およびMDA-MB-468)を1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。 図１２Ａは、ＭＹＨ９発現抑制によるトリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞運動能を示す。siControl、もしくはMYH9 siRNA(siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C)を遺伝子導入して作成したトリプルネガティブヒト乳癌細胞(MDA-MB-231, MDA-MB-468)を1×105 cells/wellで35-mm dishに播種し、培養開始後24時間目に、スクラッチアッセイを用いて細胞運動能を測定した。図１２Ｂは、ＨＳＰ４７発現抑制によるヒトトリプルネガティブ乳癌細胞の肺転移能を示す。siControl、もしくはMYH9 siRNA(siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C)を遺伝子導入して作成したトリプルネガティブヒト乳癌細胞(MDA-MB-231, MDA-MB-468)を2×104 cells/インサートの濃度で、トランズウェルチャンバー中で培養した。培養開始から２４時間後、トランズウェルメンブレンを通過した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンを用いて染色した。フィールド当たりの細胞数の結果を図１２Ｂに示す。
　本明細書において、ＨＳＰ４７の阻害物質を含む癌転移抑制剤、これを含む医薬組成物およびキット、ならびにＨＳＰ４７の阻害物質を投与することを含む癌の転移を抑制するための方法が提供される。 
　本発明の癌転移抑制剤、医薬組成物、キットおよび方法は、ＨＳＰ４７の転写体ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、例えば配列番号１によって例示されるＨＳＰ４７のｍＲＮＡに結合する核酸分子（例えば短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖（double-stranded）ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））を使用すること、あるいは、ＨＳＰ４７遺伝子をゲノム編集技術を使用してノックアウトすることを特徴とする。 
１．本発明の癌転移抑制剤 
　本発明の一側面は、ＨＳＰ４７の阻害物質を含む癌転移抑制剤、例えば、ＨＳＰ４７の発現の阻害剤を含む、癌転移抑制剤に関する。 
　ＨＳＰ４７遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列は、当該技術分野で公知であり、本発明において、ＨＳＰ４７のｍＲＮＡ配列は、配列番号１によって示される。 
　本発明において、ＨＳＰ４７の転写体ＲＮＡは、例えば、ヒト由来であり、配列番号１で示される塩基配列またはこの各塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入を含む塩基配列、或いは、上記の各塩基配列と７０％以上、８０％以上又は９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上もしくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であってもよい。 
　本明細書において、「数個」とは、２～１０個、好ましくは２～５個、より好ましくは２～３個の塩基数をいう。また、配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴなどの公知のアルゴリズムを使用して決定することができる。 
　本発明において、ＨＳＰ４７の発現の阻害剤は、ＨＳＰ４７の発現を阻害する成分、又は、ＨＳＰ４７タンパク質の機能を阻害する成分であってもよく、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有する、ｓｉＲＮＡ若しくはその前駆体ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）、又はそれらの修飾ＲＮＡ、或いは、ＨＳＰ４７遺伝子の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを包含する。また、本発明において、ＨＳＰ４７の発現の阻害剤は、例えば、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡなどであってもよい。ベクターは、アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ、該アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ若しくは該アンチセンスＤＮＡを含んでいてもよい。本発明において、ＨＳＰ４７の発現の阻害剤は、例えば、ｓｈＲＮＡ、または、ｓｈＲＮＡを含むプラスミドベクターが好ましい。かかるｓｈＲＮＡは、Ｏｒｉｇｅｎ社から購入することができる。あるいは、本発明において、ＨＳＰ４７の発現の阻害剤として、ｇＲＮＡ配列(例えば、5’-CAAGATGCGAGACGAGTTATAGG-3’（配列番号８）)をコードするプラスミドを使用するゲノム編集技術を使用してＨＳＰ４７遺伝子をノックアウトすることもできる。
　本発明において、ｓｉＲＮＡは、ＨＳＰ４７遺伝子の転写体ＲＮＡの一部に実質的に相補的な１８～２５ヌクレオチド、好ましくは２０～２４ヌクレオチド、さらに好ましくは、２１～２３ヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡ、を有し、かつＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）作用を有する、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡであってもよい。 
　本発明において、「相補的」とは、核酸が、他の核酸配列と、古典的なワトソン－クリック型か、または他の非古典的なタイプにより水素結合を形成できることを意味する。 
　また、本発明において、「実質的に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、他の核酸配列における同じ数の連続する残基と水素結合を形成する場合のみならず、核酸配列の全ての残基のうち、例えば、７０％、８０％、および９０％の残基が、他の核酸配列の残基と水素結合を形成する場合も含む。 
　したがって、本発明において、ｓｉＲＮＡは、ＨＳＰ４７遺伝子の転写体ＲＮＡの一部に１００％相補的なヌクレオチドから数塩基変更されているヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡを有していてもよい。 
　また、本発明において、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの各３'末端には、２～５ヌクレオチド、好ましくは２ヌクレオチドの突出末端を有していてもよい。また、本発明において、ｓｉＲＮＡは、修飾ｓｉＲＮＡであってもよい。 
　例えば、本発明において、ｓｉＲＮＡは、センス鎖の5’- CUACGACGACGAGAAGGAAtt -3’（配列番号２）とアンチセンス鎖の5’- UUCCUUCUCGUCGUCGUAGta -3’（配列番号３）の組合せ（siHSP47-A）(Ambion)、センス鎖の5’- AGCCCUCUUCUGACACUAAtt -3’（配列番号４）とアンチセンス鎖の5’- UUAGUGUCAGAAGAGGGCUgg -3’（配列番号５）の組合せ（siHSP47-B）(Ambion)、センス鎖の5’- GGACAGGCCUCUACAACUAtt -3’（配列番号６）とアンチセンス鎖の5’- UAGUUGUAGAGGCCUGUCCtt -3’（配列番号７）の組合せ（siHSP47-C）（日東電工において作成）であってもよい。
　また、本発明において、癌転移抑制剤は、ＨＳＰ４７の阻害物質に加えて、ＭＹＨ９（例えば、Accession No. NM_002473（配列番号１５））の阻害物質、例えば、ｇＲＮＡ配列をコードするプラスミド、あるいは、センス鎖の5’- GGGUAUCAAUGUGACCGAUtt -3’（配列番号９）とアンチセンス鎖の5’- AUCGGUCACAUUGAUACCCaa -3’（配列番号１０）の組合せ（siMYH9-A）、センス鎖の5’- CCACCAACCUCACAGAAGAtt -3’（配列番号１１）とアンチセンス鎖の5’- UCUUCUGUGAGGUUGGUGGtg -3’（配列番号１２）の組合せ（siMYH9-B）、センス鎖の5’- CGGCAAGGUGGAUUACAAAtt -3’（配列番号１３）とアンチセンス鎖の5’- UUUGUAAUCCACCUUGCCGgc -3’（配列番号１４）の組合せ（siMYH9-C）（日東電工において作成）などのＭＹＨ９　ｓｉＲＮＡを含んでいてもよい。 
　ＨＳＰ４７またはＭＹＨ９の阻害物質の細胞への導入は、任意の既知の導入手法、例えば、限定されずに、リポフェクタミン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、超音波導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなど）を利用する方法、またはマイクロインジェクション法などを用いることができる。 
　ウイルスベクターを使用する場合、ウイルスの力価としては１×１０３～１×１０１５ｐ．ｆ．ｕ．（プラーク形成単位）であってもよく、好ましくは１×１０５～１×１０１３、より好ましくは１×１０７～１×１０１１、さらに好ましくは１×１０８～１×１０１０で用いることができる。 
　上記核酸分子は、裸の核酸として使用しても、種々の核酸構築物またはベクターに組み込んで使用してもよい。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のものを利用することができる。核酸構築物またはベクターは、例えば哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子から誘導される適当な転写または翻訳制御配列を少なくとも含んでいることが好ましい。かかる制御配列は、遺伝子発現において調節的役割を有する配列、例えば転写プロモーターまたはエンハンサー、転写を調節するためのオペレーター配列、メッセンジャーＲＮＡ内部のリボゾーム結合部位をコードしている配列、ならびに、転写、翻訳開始または転写終了を調節する適切な配列を包含する。 
２．本発明の医薬組成物 
　本発明はまた、上記の癌転移抑制剤を含む医薬組成物に関する。上記の癌転移抑制剤は、癌細胞の運動能の低減、および、癌の転移の抑制が可能であるため、医薬組成物の有効成分として有用である。本発明の医薬組成物は、上記のＨＳＰ４７の阻害物質と、１または２以上の薬学的に許容し得る界面活性剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容し得る担体、希釈剤等は医薬分野でよく知られており、例えば、その全体を本明細書に援用するRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などに記載されている。 
　本発明の一態様において、本発明の医薬組成物は、癌細胞の運動能および癌の転移を顕著に抑制することができ、例えば、スクラッチアッセイによって測定される細胞運動能が、例えば、２分の１、３分の１以下まで顕著に抑制される。本発明の医薬組成物は、癌細胞の運動能を抑制する結果として、ＨＳＰ４７の阻害物質を投与しない場合と比較して、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％以上、癌の転移の領域を減少させることができる。 
　本発明の医薬組成物が対象とする癌としては、ＨＳＰ４７の転写体ＲＮＡが発現している限り限定されないが、例えば、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫などの肉腫、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、肝癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、皮膚癌などの癌腫、さらには白血病や悪性リンパ腫などが挙げられ、これらの中でも、固形癌の癌が好ましく、膵癌、大腸癌、乳癌がより好ましく、トリプルネガティブ乳癌などの乳癌が特に好ましい。特にトリプルネガティブ乳癌は、MYH9タンパク質の発現も高く、非トリプルネガティブ乳癌よりも運動能が高い癌種となっており、本発明は、トリプルネガティブ乳癌のように、運動能の高くなっている癌種に特に好適に適用できる。また、本発明の医薬組成物が対象とする転移性癌としては、例えば、転移性肺癌が挙げられる。 
　癌細胞がＨＳＰ４７を発現しているか否かは、ＨＳＰ４７の転写体ＲＮＡの発現を、遺伝子レベルで検出することにより判断できる。具体的には、遺伝子レベルでは、例えば、ノーザンブロッティング法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等のＰＣＲ法、in situハイブリダイゼーション法、in vitro転写法等の任意の公知の遺伝子発現解析法により検出することができる。また、癌細胞がＨＳＰ４７を発現しているか否かは、ＨＳＰ４７の発現を、タンパク質レベルで検出することにより判断できる。具体的には、例えば、免疫沈降法、ＥＩＡ（enzyme immunoassay）（例えば、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）など）、ＲＩＡ（radio immuno assay）（例えば、ＩＲＭＡ（immunoradiometric assay）、RAST（radioallergosorbent test）、RIST（radioimmunosorbent test）など）、ウエスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメトリー法により検出することができる。 
　本発明の一態様において、本発明の医薬組成物の投与対象となる細胞は、ＨＳＰ４７の転写体ＲＮＡが発現している細胞である。正常細胞では、一般的に、線維芽細胞や筋線維芽細胞を除き、ＨＳＰ４７の転写体ＲＮＡは実質的に発現していない。本発明の医薬組成物の投与対象となる細胞は、ＨＳＰ４７のタンパク質を発現している癌細胞が好ましく、ＨＳＰ４７のタンパク質に加えて、ＭＹＨ９タンパク質を発現している細胞がより好ましい。ＨＳＰ４７陽性トリプルネガティブ乳癌は、ＭＹＨ９タンパク質も発現している。従って、本発明の医薬組成物は、ＨＳＰ４７の阻害物質に加えて、ＭＹＨ９の阻害物質を含んでいてもよい。
　本発明の別の態様において、本発明の医薬組成物の投与対象となる細胞は、ホルモン受容体（例えば、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体）陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブヒト乳癌細胞である。トリプルネガティブ乳癌の診断は、生検により採取した腫瘍組織の病理検査（主に免疫組織染色）および遺伝子発現解析を必要とする。2つのホルモン受容体（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体）、およびＨＥＲ２の病理検査と遺伝子発現解析を行い、これら全てにおいて陰性の場合、トリプルネガティブ乳癌であると診断する。図１に示すように、細胞培養されているトリプルネガティブ乳癌は、ＨＳＰ４７の発現が弱陽性である。しかしながら、図２に示すように、トリプルネガティブ乳癌細胞は、生体内の環境におかれるとＨＳＰ４７の発現が高くなる。癌病態で問題となるトリプルネガティブ乳癌は、生体内でＨＳＰ４７の発現が増加しており、このようなＨＳＰ４７陽性トリプルネガティブ乳癌は、転移能が高い。 
　本発明の医薬組成物は、対象とする疾患を処置するのに有用な他の化学療法剤をさらに含んでもよい。化学療法剤としては、限定されずに、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、アルカロイド、ホルモン療法剤、白金錯体、血管新生阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および微小管作用薬などが挙げられる。 
　本発明の医薬組成物において、ＨＳＰ４７の阻害物質を、他の化学療法剤と組み合わせて用いる場合、これらを単一の組成物に含めてもよく、複数の組成物に別々に含ませ、それらを別々に用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。 
　本発明の種々の態様において、上記の医薬組成物は、種々の薬物送達担体に担持させて使用することもできる。かかる担体としては、限定されずに、例えば、ポリマーナノ粒子、ポリマーミセル、デンドリマー、リポソーム、ウイルスナノ粒子、カーボンナノチューブ等が挙げられる（Cho K. et al., Clin Cancer Res. 2008 Mar 1;14(5):1310-6など参照）。 
　本発明の医薬組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、たとえば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、腫瘍内、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（たとえば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年、上記Remington's Pharmaceutical Sciencesなどを参照）。 
　例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であり得る。 
３．本発明のキット 
　本発明は、本発明の癌転移抑制剤または医薬組成物に含まれ得る活性成分（例えば、ＨＳＰ４７の阻害物質）を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む転移抑制剤または医薬組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される癌転移抑制剤または医薬組成物の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の癌転移抑制剤または医薬組成物の調製方法や投与方法などが記載された指示、例えば説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。 
４．本発明の癌の転移抑制方法 
　本発明の一態様は、ＨＳＰ４７の阻害物質を投与することを特徴とする、癌の転移抑制方法に関する。本方法において、ＨＳＰ４７の阻害物質を投与しない場合とＨＳＰ４７の阻害物質を投与する場合とを比較すると、スクラッチアッセイによって測定する場合、癌細胞の運動能が、例えば、２分の１、３分の１以下まで低下している。また、本方法において、癌細胞の運動能を抑制する結果として、ＨＳＰ４７の阻害物質を投与しない場合と比較して、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％以上、癌の転移の領域を減少させることができる。 
　本発明の方法において、投与される患者は、典型的には、癌治療を必要とする患者である。かかる患者としては、限定されずに、例えば、上記のＨＳＰ４７の発現に関連する癌を患っているか、これらの癌を有すると診断されたか、これらの癌を発症するリスクが高い患者である。したがって、本発明の方法は、本発明のＨＳＰ４７の阻害物質を含む癌転移抑制剤または医薬組成物による処置を必要としている患者を同定する工程、例えば、乳癌患者がトリプルネガティブ乳癌患者であるか否かを確認する工程をさらに含んでもよい。乳癌患者がトリプルネガティブ乳癌患者であるか否かを確認する工程は、生検により採取した腫瘍組織の病理検査（主に免疫組織染色）および遺伝子発現解析を行う工程、より詳細には、2つのホルモン受容体（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体）、およびＨＥＲ２の病理検査と遺伝子発現解析を行い、これら全てにおいて陰性の場合、トリプルネガティブ乳癌を有すると決定する工程を含む。癌の具体例は、医薬組成物に関して上記したとおりである。 
　本発明の方法においては、本発明の医薬組成物を、対象とする癌を処置するのに有用な他の作用物質または処置方法と併用することもできる。本発明の方法は、処置方法として、放射線治療、粒子線治療などの物理療法、外科手術などの外科的治療、化学療法、及び分子標的治療などと併用することができる。本発明の方法は、他の作用物質として、上記のような化学療法剤を併用することができ、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、アルカロイド、ホルモン療法剤、白金錯体、血管新生阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および微小管作用薬などが挙げられる。本発明の方法は、このような構成を採用することにより、癌細胞除去、細胞死誘導、または細胞増殖抑制などの一般的な治療を行いながら、これらの治療と共に、癌の転移を抑制することができる。したがって、本発明の方法により、多面的に癌の治療を行うことができ、癌治療の効果を向上させることができる。 
　本発明の癌の転移抑制方法における有効量とは、例えば、癌細胞の運動能を低下させる量、または、癌の転移の領域を減少させる量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、本発明の処置方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。 
　本明細書に記載される本発明の方法において投与する活性成分（例えば、ＨＳＰ４７の阻害物質）の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。本発明の方法に用いる活性成分の用量は、好ましくは、ヒトの場合、１回あたり、かつ成人１ｋｇ体重あたりｓｉＲＮＡ分子に換算して例えば０．１ｍｇ～１，０００ｍｇである。 
　投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。 
　投与頻度は、用いる剤や組成物の性状や、上記のものを含む対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。 
　本明細書で用いる場合、用語「患者」は、任意の生物個体を意味するが、例えば、動物、哺乳動物、またはヒト個体である。本発明において、「患者」は、典型的には癌に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。 
　また、用語「処置」は、本明細書で用いる場合、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。 
　今回本発明者により、本発明の癌転移抑制剤または医薬組成物が、ＨＳＰ４７（配列番号１）の発現を抑制することにより、トリプルネガティブ乳癌の細胞運動能を抑制し、結果として、転移性肺癌を抑制できることが明らかになった。 
　したがって、本発明はまた、ＨＳＰ４７の阻害物質を含む、上記作用を提供するための癌転移抑制剤および医薬組成物、上記作用を提供するための医薬の製造における使用、ならびに、ＨＳＰ４７の阻害物質の上記作用を提供するための使用にも関する。 
　本発明を下記の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例に限定されないものとする。 
例１：細胞株の取得および培養 
　本願明細書中で使用した全てのヒト乳癌細胞株（MDA-MB-468, MDA-MB-231, MDA-MB-157, MCF7, BT474）は、American Type Culture Collectionから購入した。これらの細胞を、１０％胎児ウシ血清(FBS, Invitrogen Life Technologies)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で培養した。 
例２：ヒト乳癌細胞におけるＨＳＰ４７　ｍＲＮＡとＨＳＰ４７タンパク質の発現 
　トリプルネガティブヒト乳癌細胞3種類(MDA-MB-468, MDA-MB-231, MDA-MB-157)および非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類(MCF7, BT474)におけるＨＳＰ４７　ｍＲＮＡおよびＨＳＰ４７タンパク質の発現をReal time-PCRとウエスタンブロット法にて検出した。結果を図１に示す。 
　トリプルネガティブヒト乳癌細胞3種類におけるｍＲＮＡの発現は、非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類におけるｍＲＮＡの発現と比較して、顕著に低かった。同様に、トリプルネガティブヒト乳癌細胞3種類におけるＨＳＰ４７タンパク質の発現も、非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類におけるＨＳＰ４７タンパク質の発現と比較して、顕著に低かった。 
例３：トリプルネガティブヒト乳癌細胞におけるＨＳＰ４７陽性細胞率 
　トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類(MDA-MB-231, MDA-MB-157)を1×106 cells/50 μL PBSの濃度でBalb/c nu/nuマウスに皮下移植を行い、腫瘍形成後、腫瘍細胞を採取して、抗ＨＳＰ４７抗体（Enzo Life Sciences）を用いて、フローサイトメーター解析を行った。結果を図２に示す。MDA-MB-231細胞は、19.7%がＨＳＰ４７を発現し、MDA-MB-157細胞は、16.7%がＨＳＰ４７を発現していた。 
　したがって、図１に示すように、細胞培養されているトリプルネガティブ乳癌は、ＨＳＰ４７の発現が弱陽性であった。しかしながら、図２に示すように、トリプルネガティブ乳癌細胞は、生体内の環境におかれるとＨＳＰ４７の発現が高かった。 
例４：ＨＳＰ４７強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞増殖能、運動能および肺転移能 
　pCMV6-entryプラスミド(Mock)はOrigeneより入手した。pCMV6-HSP47-Mycプラスミド(HSP47:Myc)は、Origeneより入手した。pCMV6-entryプラスミド(Mock)もしくはpCMV6-HSP47-Mycプラスミド(HSP47:Myc)を遺伝子導入して、HSP47強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞(MDA-MB-231、MDA-MB-157)を作成した。 
　これらの細胞を、1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。結果を図３に示す。MDA-MB-231細胞については、HSP47:Myc群では、Mock群およびWT群と比較して、細胞増殖能が、有意ではないものの若干増加していた。MDA-MB-157細胞については、HSP47:Myc群では、Mock群およびWT群と比較して、細胞増殖能が有意に増加していた。 
　また、これらの細胞を1×104 cells/wellでdouble chamberに播種し、培養開始後24時間目に、ヘマトキシリン染色を行い、細胞カウントにより細胞運動能を測定した。結果を図４に示す。MDA-MB-231細胞については、HSP47:Myc群では、Mock群およびWT群と比較して、細胞運動能が３～４倍程度に増加していた。MDA-MB-157細胞については、HSP47:Myc群では、Mock群およびWT群と比較して、細胞運動能が２倍程度に増加していた。 
　さらに、これらの細胞を1×106 cells/50 μL PBSの濃度でBalb/c nu/nuマウスに尾静脈投与を施し、肺への転移能は、細胞投与後30日目に肺組織を採取して、HE染色にて調べた。結果を図５に示す。MDA-MB-231細胞のHSP47:Myc群では、Mock群と比較して、顕著に高い肺転移が見られた（右図の中央の染色部分）。 
例５：ＨＳＰ４７の発現抑制によるトリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞増殖能、運動能力能および肺転移能 
　Control shRNA発現プラスミド(shControl)はOrigeneより入手した。HSP47 shRNA発現プラスミド(shHSP47)は、Origeneより入手した。Control shRNA発現プラスミド(shControl)、もしくはHSP47 shRNA発現プラスミド(shHSP47)を遺伝子導入して、HSP47発現抑制トリプルネガティブヒト乳癌細胞(HSP47(+)MDA-MB-231, HSP47(-)MDA-MB-231)を作成した。 
　これらの細胞を1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。結果を図６に示す。MDA-MB-231細胞については、shHSP47群では、shControl群と比較して、細胞増殖能が、有意に減少していた。 
　また、これらの細胞を1×105 cells/wellで35-mm dishに播種し、培養開始後24時間目に、スクラッチアッセイを用いて細胞運動能を測定した。結果を図７に示す。MDA-MB-231細胞については、shHSP47群では、shControl群と比較して、細胞運動能が、４分の１程度に有意に減少していた。 
　さらに、これらの細胞を1×106 cells/50 μL PBSの濃度でBalb/c nu/nuマウスに尾静脈投与を施し、肺への転移能は、細胞投与後30日目に肺組織を採取して、ＨＥ染色にて調べた。結果を図８に示す。MDA-MB-231細胞については、shControl群では、肺転移が見られたが（左下図の左側）、shHSP47群では、肺転移がほとんど確認されなかった（右下図）。したがって、癌細胞におけるＨＳＰ４７発現の抑制が、癌の転移抑制に有効であることが示唆された。 
例６：トリプルネガティブ乳癌細胞におけるＨＳＰ４７とＭＹＨ９との相互作用 
　MDA-MB-231細胞(Mock)およびHSP47:Mycを発現するMDA-MB-231細胞を、氷冷したPBSで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤(Roche Diagnostics)を補充した溶解バッファー（50 mM Tris、250 mM NaCl、25 mM EDTA、1% NP-40）を用いて溶解した。細胞溶解液からのHSP47の免疫沈降を、４℃で１６時間、抗Myc固定磁気マイクロビーズ(Medical & Biological Laboratories)を使用して行い、ビーズを磁場上で溶解バッファーを用いて洗浄した。タンパク質を、SDS-PAGEサンプルバッファーを含有する50 mM グリシン-HClバッファー(pH 3.5)を用いて、ビーズから溶出した。0.1 Mグリシンバッファー(pH 2.8)を用いて溶出した後、サンプルをSDS-PAGEにアプライし、ポリビニリデンジフロライドメンブレン(Millipore, Billerica, MA)に転写した。0.05% Tween-20を含有するPBS中の5%スキムミルクでブロッキングした後、メンブレンを以下の一次抗体でプローブした：マウス抗HSP47モノクローナル抗体(Enzo Life Sciences)およびマウス抗MYH9モノクローナル抗体(Elabscience)。一次抗体で処理した後、メンブレンを以下の二次抗体と共にインキュベートした：西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗ウサギIgG(Cell Signaling Technology)およびHRP結合ヤギ抗マウスIgG(Cell Signaling Technology)。タンパク質を、ECL(GE Healthcare, Waukesha, WI)を使用する化学発光法によって検出した。 
　その結果、免疫沈降したMock群ではバンドが見られなかったが、免疫沈降したHSP47:Myc群では、複合体の形成により、HSP47およびMYH9のそれぞれのバンドが見られた（図９）。従って、HSP47とMYH9は相互作用することが示された。 
例７：ＨＳＰ４７およびＭＹＨ９の両方が非トリプルネガティブ乳癌の転移能を増強する
　MYH9発現の誘導が、MYH9ではなくHSP47が発現される非トリプルネガティブ乳癌細胞（MCF7）の転移能を増強するか否かを決定するために、MYH9を安定して発現する非トリプルネガティブ乳癌細胞株(Mock+MYH9-GFP)を作製し（図１０Ａ）、Mock+MYH9-GFP細胞の転移能を調査した。MYH9（別名NMIIA）を発現するプラスミドとして、pCMV-NMIIA-GFPプラスミド（Origene）を入手し、これを使用した。インビトロ培養条件下で、Mock+MYH9-GFP細胞の増殖速度は、このプラスミドを導入していない、対応するMock細胞よりもわずかに高かった（図１０Ｂ）。これに対し、Mock+MYH9-GFP細胞の腫瘍形成能は、Mock細胞とは全く異なっていた（図１０Ｅ）。Mock+MYH9-GFP細胞の浸潤および遊走の能力は、対応するMock細胞よりも顕著に高かった（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。さらに、組織学的分析により、Mock+MYH9-GFP細胞の肺への転移能は、Mock細胞よりも顕著に高いことが示された（図１０Ｆ）。組織学的分析は、例５と同様にして行った。
　また、HSP47の発現をノックアウトした（KO）MCF7細胞（HSP47 KO）を以下のとおり作製した（図１０Ａ）。HSP47 KO細胞は、信州大学の桜井博士より譲り受けた、Cas9配列およびgRNA配列についてのクローニング部位を含むpCG:SapIプラスミドを使用して作製した（Sakurai, T. et al. (2014) BMC Biotechnol. 14, 69、および、Sakurai, T. et al. (2016) Sci. Rep. 6, 20011を参照）。ヒトHSP47ゲノムのエキソン５について設計されたgRNA配列(5’-CAAGATGCGAGACGAGTTATAGG-3’（配列番号８）)をpCG:SapIプラスミドに挿入した。pP2A-mCherry-N1プラスミド(Addgege)を使用して、P2A-mCherry cDNAのDNAフラグメントを増幅した。構築された標的化ベクターおよびpcDNA3.1(+)(Promega)をLipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)を使用してMCF7細胞株に同時トランスフェクトした。処理した細胞を10%FBSおよびG418(1000μg/mL, Thermo Fisher Scientific)を補充したDMEM中で培養し、細胞クローンを選択した。細胞クローンから抽出したHSP47ゲノムDNAのDNA配列決定を実施して、HSP47遺伝子の下流部位へのP2A-mCherry遺伝子の挿入を確認した。単一細胞クローンは、DNA配列分析によって評価して、標的アレルにおける挿入欠失を検出した。
　増殖速度を確認したところ、HSP47 KO細胞の増殖速度が、Mock細胞およびMock+MYH9-GFP細胞よりも顕著に低下していたことを見出した（図１０Ｂ）。HSP47 KO細胞の増殖速度の低下は、MYH9を発現しても回復しなかった（図１０Ｂ）。HSP47の欠失はまた、MYH9を発現するプラスミドによるMYH9の発現に関わらず、MCF7細胞の腫瘍形成能を低下させた（図１０Ｅ）。MYH9の誘導によるMCF7細胞の運動能力能の増強は、HSP47発現の欠失によって顕著に抑制された（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）。MYH9-GFP細胞の肺への転移能はまた、HSP47発現の欠失により完全に抑制された（図１０Ｆ）。組織学的分析は、例５と同様にして行った。
　これらの結果により、HSP47およびMYH9の両方の発現が、非トリプルネガティブ細胞の転移能を担っていることが示唆された。
例８：ＭＹＨ９　ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたトリプルネガティブ細胞のインビトロ増殖
　ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞（MDA-MB-231およびMDA-MB-468）細胞を、Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Life Technologies)を使用して、以下のsiRNAでトランスフェクトし、大気中３７℃で５時間培養した。
対照siRNA(siControl, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)、
MYH9-A siRNA (siMYH9-A, センス鎖: 5’-GGGUAUCAAUGUGACCGAUtt-3’（配列番号９）; アンチセンス鎖: 5’-AUCGGUCACAUUGAUACCCaa-3’（配列番号１０）)、
MYH9-B siRNA (siMYH9-B, センス鎖: 5’-CCACCAACCUCACAGAAGAtt-3’（配列番号１１）; アンチセンス鎖: 5’-UCUUCUGUGAGGUUGGUGGtg-3’（配列番号１２）)、または、
MYH9-C siRNA (siMYH9-C, センス鎖: 5’-CGGCAAGGUGGAUUACAAAtt-3’（配列番号１３）; アンチセンス鎖: 5’-UUUGUAAUCCACCUUGCCGgc-3’（配列番号１４）)
　siRNAでのトランスフェクションの５時間後、細胞を、１０％胎児ウシ血清(FBS, Invitrogen Life Technologies)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で培養した。
　例２と同様にして、トリプルネガティブヒト乳癌細胞（MDA-MB-231およびMDA-MB-468）におけるＭＹＨ９タンパク質の発現をReal time-PCRにて検出した。結果を図１１Ａに示す。試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）におけるＭＹＨ９　ｍＲＮＡの発現は、siControl群におけるＭＹＨ９　ｍＲＮＡの発現と比較して、顕著に低かった。
　また、例５と同様にして、これらの細胞を1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。結果を図１１Ｂに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）では、siControl群と比較して、細胞増殖能が、有意に減少していた。 
　また、これらの細胞を1×105 cells/wellで35-mm dishに播種し、培養開始後24時間目に、スクラッチアッセイを用いて細胞運動能を測定した。結果を図１２Ａに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）では、siControl群と比較して、細胞運動能が、５分の１～３分の１程度に有意に減少していた。
　さらに、これらの細胞を2×104 cells/インサートの濃度で、トランズウェルチャンバー中で培養した。培養開始から２４時間後、トランズウェルメンブレンを通過した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンを用いて染色した。フィールド当たりの細胞数の結果を図１２Ｂに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）では、siControl群と比較して、細胞浸潤能が、４分の１～３分の１程度に有意に減少していた（図１２Ｂ）。したがって、癌細胞におけるＭＹＨ９発現の抑制が、癌の転移抑制に有効であることが示唆された。

Claims (18)

  1. 　ＨＳＰ４７の阻害物質を含む、癌転移抑制剤。 
  2. 　癌が乳癌である、請求項１に記載の癌転移抑制剤。 
  3. 　癌が、ホルモン受容体陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブ乳癌である、請求項２に記載の癌転移抑制剤。 
  4. 　ホルモン受容体が、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体である、請求項３に記載の癌転移抑制剤。 
  5. 　癌細胞が、ＨＳＰ４７に加えて、ＭＹＨ９を発現するトリプルネガティブ乳癌細胞である、請求項３または４に記載の癌転移抑制剤。
  6. 　ＨＳＰ４７の阻害物質が、ＨＳＰ４７に対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、マイクロＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、これらを発現するベクター、またはこれらで形質転換された細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の癌転移抑制剤。 
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の癌転移抑制剤を含む医薬組成物。 
  8. 　癌を処置するための、請求項７に記載の医薬組成物。 
  9. 　転移性肺癌を処置するための、請求項８に記載の医薬組成物。 
  10. 　癌の転移を抑制するための医薬の製造における、ＨＳＰ４７の阻害物質の使用。 
  11. 　癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項１０に記載の使用。 
  12. 　癌の転移の抑制における使用のための、ＨＳＰ４７の阻害物質を含む組成物。 
  13. 　癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項１２に記載の組成物。
  14. 　有効量のＨＳＰ４７の阻害物質を癌患者に投与することを特徴とする、癌の転移抑制方法。 
  15. 　前記癌患者が乳癌患者であって、前記有効量のＨＳＰ４７の阻害物質の投与前に、乳癌患者がトリプルネガティブ乳癌患者であるか否かを確認する工程を含む、請求項１４に記載の癌の転移抑制方法。 
  16. 　前記有効量のＨＳＰ４７の阻害物質の投与前に、前記癌患者の癌組織がＨＳＰ４７に加えて、ＭＹＨ９を発現しているか否かを確認する工程を含む、請求項１４または１５に記載の癌の転移抑制方法。
  17. 　外科的治療、放射線治療、粒子線治療、化学療法、及び分子標的治療からなる群より選択される治療と共に行われる、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の癌の転移抑制方法。 
  18. 　癌患者由来の癌細胞を、有効量のＨＳＰ４７の阻害物質を用いてインビトロで処置することを含む、インビトロで癌の転移を抑制する方法。 
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170218365A1 (en) 2014-12-26 2017-08-03 Nitto Denko Corporation Methods for malignant tumors with rnai molecules targeted to hsp47

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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Remington's Pharmaceutical Sciences", 1990, MACK PUBLISHING CO.
"Standard Pharmaceutics", 2003, NANKODO
AKIHIRO YONEDA, NORIO TAKEI, KAORI SAWADA, MARINA KOSAKA, YASUAKI TAMURA: "P-2149: HSP47 augments a metastatic potential of triple negative breast cancer", CANCER SCIENCE, vol. 109, no. S2, December 2018 (2018-12-01), pages 914, XP009526666, ISSN: 1347-9032 *
CHO K. ET AL., CLIN CANCER RES, vol. 14, no. 5, 1 March 2008 (2008-03-01), pages 1310 - 6
SAKURAI, T. ET AL., BMC BIOTECHNOL, vol. 14, 2014, pages 69
SAKURAI, T. ET AL., SCI. REP., vol. 6, 2016, pages 20011
See also references of EP3851125A4
YAMAMOTO N. ET AL.: "Tumor-suppressive microRNA-29a inhibits cancer cell migration and invasion via targeting HSP47 in cervical squamous cell carcinoma", INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY, vol. 43, 2013, pages 1855 - 1863, XP055493959, DOI: 10.3892/ijo.2013.2145 *
YONEDA AKIHIRO: "Elucidation of the action mechanism of HSP47 in the metastatic potential of triple-negativebreast cancer", PROGRAMS AND ABSTRACTS OF THE 13TH MEETING OF THE BIOMEDICAL SOCIETY FOR STRESS RESPONSE; OCTOBER 26TH - 27TH, 2018, 1 December 2018 (2018-12-01), pages 29, XP009526665 *
ZHU J. ET AL.: "Chaperone Hsp47 drives malignant growth and invasion by modulating an ECM gene network", CANCER RES., vol. 75, no. 8, 2015, pages 1580 - 1591, XP055688644 *

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