NO328523B1 - Faktor VIIa-inhibitorer, fremgangsmate for fremstilling av slike og farmasoytisk preparat omfattende slike, samt anvendelse av inhibitorene for fremstilling av farmasoytisk preparat. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse gjelder nye forbindelser, fremstilling av disse, anvendelse av dem og farmasøytiske preparater som inneholder forbindelsene, som har kraftig antitrombotisk virkning via reversibel inhibering av aktivert blodkoagulasjonsfaktor Vila (FVIIa).

Oppfinnelsens bakgrunn

Trombedannelse er normalt et resultat av vevsskader som utløser koagulasjonskaskaden og har som virkning å redusere eller forhindre blodstrømmen under sårhelingen. Andre faktorer som ikke er direkte forbundet med vevsskade, for eksempel aterosklerose og inflammasjon, kan også utløse koagulasjonskaskaden og kan ha patologiske følger.

Blodkoagulasjonen er en komplisert prosess som omfatter en stadig mer amplifisert serie av enzymaktiveringsreaksjoner i hvilke plasmazymogener aktiveres etter hverandre ved begrenset proteolyse. Mekanistisk har blodkoagulasjonskaskaden blitt inndelt i den intrinsike og den ekstrinsike reaksjonsvei, som konvergerer ved aktivering av faktor X, påfølgende dannelse av trombin forløper via en enkelt, felles reaksjonsvei (se reaksjonsskjema 1).

Foreliggende bevismateriale tyder på at den intrinsiske reaksjonsvei spiller en viktig rolle for opprettholdelse og vekst av fibrindannelse, mens den ekstrinsiske reaksjonsvei er avgjørende for den innledende fase av blodkoagulasjonen (H. Cole, Aust. J. Med. Sei. 16 (1995) 87, G.J. Broze, Blood Coagulation and Fibrinolysis 6, Suppl. 1 (1995) S7-S13). Det er generelt akseptert at blodkoagulasjonen initieres fysisk ved dannelse av et vevsfaktor (TF)/faktor Vlla-kompleks. Når dette kompleks først er dannet, utløser det hurtig koagulasjonen ved å aktivere faktorene IX og X. Den nydannede, aktiverte faktor X, dvs faktor Xa, danner så et en-til-en-kompleks med faktor Va og fosfolipider slik at det dannes et protrombinasekompleks, som er ansvarlig for overføring av løselig fibrinogen til uløselig fibrin via aktivering av trombin fra forløperen protrombin. Med tiden undertrykkes aktiviteten av faktor Vlla/vevsfaktorkomplekset (den ekstrinsike reaksjonsvei) av et proteaseinhibitorprotein av Kunitz-type, TFPI, som ved kompleks-binding til faktor Xa direkte kan inhibere den proteolytiske aktivitet av faktor Vlla/vevsfaktor. For å opprettholde koagulasjonsprosessen i nærvær av et inhibert ekstrinsisk system produseres ytterligere faktor Xa via den trombinformidlede aktivitet av den intrinsiske reaksjonsvei. Således spiller trombin en autokatalytisk dobbeltrolle, idet proteinet formidler sin egen produksjon og overføringen av fibrinogen til fibrin.

Den autokatalytiske natur av trombindannelsen er en viktig sikring mot ukontrollert blødning og sikrer at når først et gitt terskelnivå av protrombinase foreligger vil blodkoagulasjonen forløpe til fullstendighet. Evnen til å danne blodkoagler er avgjørende for overlevelse. I visse sykdomstilstander er imidlertid dannelse av blodkoagler i sirkula-sjonssystemet i seg selv en sykdomskilde. Det er likevel ikke ønskelig ved slike sykdomstilstander å fullstendig inhibere koagulasjonssystemet, siden livstruende blødning kunne oppstå. Det er således mest ønskelig å utvikle midler som inhiberer koagulasjonen ved å inhibere faktor Vila uten direkte å inhibere trombin.

I mange kliniske anvendelser er det et stort behov for å forhindre dannelse av intra-vaskulære blodkoagler eller for en form for antikoagulasjonsbehandling. De medikamenter som er tilgjengelige i dag er ikke tilfredsstillende for mange spesifikke kliniske anvendelser. For eksempel utvikler nesten 50 % av pasienter som har gjennomgått fullstendig hofteerstatning dyp venetrombose (DVT). De behandlings-former som er anerkjente i dag er en fast dose av lavmolekylært heparin (LMWH) og en variabel heparindose. Selv med disse medikamentbehandlingsskjemaene utvikler 10 % til 20 % av pasientene DVT, og 5 % til 10 % utvikler blødningskomplikasjoner.

En annen klinisk situasjon hvor det er behov for bedre antikoagulanter gjelder individer som gjennomgår transluminal koronarangioplastikk og individer utsatt for myokard-infarkt eller som lider crescendo angina. Dagens konvensjonelt aksepterte behandlings-form, som består av tilførsel av heparin og aspirin, er forbundet med 6 % til 8 % abrupt karlukningsfrekvens innen 24 timer etter behandlingen. Frekvensen av blødnings-komplikasjoner som krever transfusjonsbehandling grunnet anvendelse av heparin er også tilnærmet 7 %. Selv om forsinkede karlukninger er signifikante er videre tilførsel av heparin etter avsluttet behandling av liten verdi, og kan være skadelig.

De hyppigst anvendte blodkoagulasjonsinhibitorene er heparin og de beslektede sulfaterte polysakkaridene LMWH og heparinsulfat. Disse molekyler utøver sin anti-koagulasjonsvirkning ved å fremme binding av en naturlig regulator av koagulasjonsprosessen, antitrombin III, til trombin og faktor Xa. Den inhiberende aktivitet av heparin er i første rekke rettet mot trombin, som inaktiveres tilnærmet 100 ganger raskere enn faktor Xa. Hirudin og hirulog er ytterligere to trombinspesifikke antikoagulanter som for tiden gjennomgår klinisk utprøvning. Disse antikoagulanter, som inhiberer trombin, er imidlertid også forbundet med blødningskomplikasjoner. Prekliniske undersøkelser i bavianer og hunder har vist at målenzymer som deltar i de tidlige stadier av koagulasjonskaskaden, for eksempel faktor Xa eller faktor Vila, forhindrer koageldannelse uten å gi blødningsbivirkningene som observeres med direkte trombininhibitorer (T. Yokoyama, A.B. Kelly, U.M. Marzec, S.R. Hanson, S. Kunitada, L.A. Harker, Circulation 92 (1995) 485-491; L.A. Harker, S.R. Hanson, A.B. Kelly, Thromb. Hemostas. 74 (1995) 464-472; CR. Benedict, J. Ryan, J. Todd, K. Kuwabara, P. Tyburg, Jr., J. Cartwright, D. Stern, Blood 81 (1993) 2059-2066).

Spesifikk inhibering av det katalytiske faktor VIIa/TF-kompleks ved anvendelse av monoklonalt antistoff (internasjonal patentsøknad nr. WO92/06711) og et protein som klormetylketoninaktivert FVIIa (internasjonal patentsøknad nr. WO96/12800 og W097/47651) er en ekstremt effektiv måte for kontroll av trombedannelse grunnet akutt arterieskade eller trombotiske komplikasjoner forbundet med bakteriell septikemi. Det foreligger også eksperimentelt bevismateriale som tyder på at inhibering av faktor VIIa/TF-aktiviteten hindrer restenose etter ballongangioplasti (L.A.Harker, S.R. Hanson, J.N. Wilcox, A.B. Kelly, Haemostasis 26 (1996) S 1:76-82). Blødningsunder-søkelser har blitt utført i bavianer og viser at inhibering av faktor VIIa/TF-komplekset har det bredeste sikkerhetsvindu når det gjelder terapeutisk effektivitet og blødningsfare av alle analyserte antikoagulasjonsbehandlinger, innbefattet inhibering av trombin, blodplater og faktor Xa (LA. Harker, S.R. Hanson, A.B. Kelly, Thromb. Hemostas 74

(1995) 464-472).

En spesifikk inhibitor av faktor Vila ville ha vesentlig praktisk verdi innen medisinen. Nærmere bestemt ville en faktor Vlla-inhibitor være effektiv under omstendigheter hvor dagens foretrukne medikamenter, heparin og beslektede sulfaterte polysakkarider, er ineffektive eller kun har marginal effektivitet. Det foreligger således et behov for en lavmolekylær faktor Vlla-spesifik blodkoagulasjonsinhibitor som er effektiv, men som ikke gir uønskede bivirkninger. Foreliggende oppfinnelse tilfredsstiller dette behov ved å tilveiebringe faktor Vlla-aktivitetsinhiberende derivater med formel I og ved å tilveiebringe ytterligere, beslektede fordeler.

Forbindelsene med formel I er inhibitorer av blodkoagulasjonsenzymet faktor Vila. Oppfinnelsen gjelder også fremgangsmåter for fremstilling av forbindelsene med formel I, og anvendelse av forbindelsene med formel I for fremstilling av et preparat for behandling og profylakse av sykdommer som kan kureres eller forhindres ved inhibering av faktor Vlla-aktiviteten, for eksempel tromboemboliske sykdommer, innbefattet trombose, restenose, infarkt og angina. Oppfinnelsen gjelder videre preparater som inneholder en forbindelse med formel I i en blanding eller på annet vis forbundet med et inert bærestoff, nærmere bestemt farmasøytiske preparater som inneholder en forbindelse med formel I sammen med farmasøytisk aksepterbare bærestoffer eller eksipienser, og/eller ytterligere substanser eller tilsetningsstoffer.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer forbindelser som spesifikt inhiberer faktor Vlla-aktiviteten. Nærmere bestemt er en gjenstand for foreliggende oppfinnelse forbindelser med formel I

hvori

RI er allyloksykarbonyl eller allylaminokarbonyl,

A er en (L)-4-amidinofenylalaninrest,

B er en (L)-glutaminsyrerest eller et farmasøytisk aksepterbart salt eller en ester av (L)-glutaminsyre,

D er en rest utvalgt fra gruppen som består av Arg, Dap, Dab, Orn, Lys, Dap[-C(=NH)-NH2], Dab[-C(=NH)-NH2], Lys[-C(=NH)-NH2], Lys[-C(=NH)-CH3], Orn[-C(=NH)-CH3], Dab[-C(=NH)-CH3], Dap[-C(=NH)-CH3], Dab(Alloc), Asn, Gin, Met, Ser, Thr, Ser(Bzl), Thr(Bzl), Cys(Me), Cys(Bzl), Cys(Acm), Arg(N02), His, Trp, Phg, Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Phe(4-N02), Phe(4-NH-C(=NH)-NH2), 2-Abu, Ala(3-CN), Ala[3-C(=NH)-NH2], 2-Abu(4-CN) og 2-Abu[4-C(=NH)-NH2],

n er null eller en,

E er en rest utvalgt fra gruppen som består av Cha, Chg og Phe[4-C(-S-CH2-CH2-S-)-Ph],

R2 er NHR22,

R22 er hydrogen eller en rest utvalgt fra gruppen som består av benzyl, naftylmetyl,

pyridylmetyl, fenyletyl, naftyletyl, pyridyletyl, fenylpropyl, naftylpropyl, pyridylpropyl, fluorenyl, difenylmetyl, difenyletyl og difenylpropyl, som enten er ikke-substituerte eller substituert med substituenter utvalgt fra gruppen som består av F, Cl, Br, hydroksy, metoksy, metylendioksy, nitro, cyano, di(Ci-C6)-alkylamino, (Ci-C6)-alkylsulfonyl aminosulfonyl og trifluormetyl,

i alle dens stereoisomere former eller en blanding av disse i ethvert forhold, eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer peptider med formelen I

hvori RI, R2, A, B, D, E og n er definert som ovenfor, som er forbindelser som inhiberer faktor Vlla-aktiviteten, men som ikke i vesentlig grad inhiberer aktiviteten av andre proteaser som inngår blodkoagulasjonsreaksjonsveien. I forbindelsene med formel I inngår strukturelle enheter, for eksempel i gruppene A, B, D eller E eller i gruppen RI dersom RI står for en, to eller tre aminosyrer, som er aminosyrer, amino-syrederivater, aminosyreanaloger eller strukturer som etterligner aminosyrer, og som er koblet på peptidmåte til nabogrupper via amidbindinger (C(O)-N dannet mellom en karboksygruppe i en slik aminosyre eller lignende og en aminogruppe i en annen aminosyre eller lignende. Som vanlig innen peptidkjemien erholdes en divalent rest av en

aminosyre eller av en gruppe som A, B, D eller E som disse foreligger i formel I fra den tilsvarende aminosyre ved formell fjerning av et hydrogenatom fra en aminogruppe og en hydroksygruppe fra en karboksygruppe.

Som anvendt heri anvendes begrepet "aminosyre" i sin bredeste betydning for å omfatte de tyve naturlig forekommende aminosyrene som translateres fra den genetiske kode og omfatter byggestenene i proteiner, innbefattet, dersom ikke annet er angitt, L-aminosyrer og D-aminosyrer såvel som kjemisk modifiserte aminosyrer som aminosyreanaloger, naturlig forekommende aminosyrer som vanligvis ikke innføres i proteiner, for eksempel norleucin, og kjemisk syntetiserte forbindelser med egenskaper som er kjente innen faget for å særprege aminosyrer. For eksempel omfattes analoger eller etterlignere av fenylalanin eller prolin som tillater den samme konformasjonsbegrens-ning i peptidforbindelsene som naturlig Phe eller Pro av definisjonen for "aminosyrer", og slike forbindelser er kjente innen faget. Slike analoger og etterlignere betegnes heri som "funksjonelle ekvivalenter" av en aminosyre. Andre eksempler på aminosyrer og aminosyreanaloger er sammenstilt av Roberts og Vellaccio (The Peptides; Analysis, Synthesis, Biology, red. Gross og Meienhofer, bind 5, s. 341, Academic Press, Inc, New York 1983). Forkortelser for aminosyrer, aminosyreanaloger og etterlignende strukturer, såvel som andre forkortelser som anvendes i søknaden, er oppstilt i tabell 1. Dersom ikke annet er angitt har aminosyrer forkortet som angitt ovenfor L-konfigurasjon. Aminosyrer med D-konfigurasjon betegnes med forstavelsen D- ved anvendelse av trebokstavkode (for eksempel D-Ala, D-Cys, D-Asp, D-Trp, D-pAph). Forkortelser som for eksempel Phe(4-CN) og Phe[4-C(-S-CH2CH2-S-)-Ph] angir resten av aminosyren fenylalanin som i 4-posisjon i fenylgruppen bærer en cyanosubstituent henholdsvis en 2-fenyl-l,3-ditiolan-2-yl-substituent. En forkortelse som for eksempel Dap[-C-(=NH)-NH2] angir resten av aminosyren 2,3-diaminopropionsyre i hvilken aminogruppen i sidekjeden, dvs aminogruppen i 3-posisjon, er substituert med en amidinogruppe -C/=NH)-NH2 (en karbamimidoylgruppe), hvorved resultatet er en guanidino-gruppe -NH-C(=NH)-NH2 koblet i 3-posisjon til propionsyreenheten. Forkortelser som for eksempel Orn[-C(=NH)-NH2] eller Cys(Me) angir resten av aminosyren ornitin i hvilken aminogruppen i sidekjeden bærer en amidinogruppe, henholdsvis resten av aminosyren cystein i hvilken merkaptogruppen bærer en metylgruppe.

Begrepene TOTU, HATU og BOP betyr 0-[cyan(etoksykarbonyl)metylenamino]-1,1,3,3 -tetrametyluroniumtetralfuorborat, 0-(7-azabenzotriazol-1 -yl)-1,1,3,3 -tetra-metyluroniumheksafluorfosfat, henholdsvis 1 -benztriazolyloksy-tris-(dimetylamino)-fosfoniumheksafluorfosfat.

Som benyttet heri betyr begrepet "spesifikk" ved anvendelse i forbindelse med inhibering av faktor Vlla-aktivitet at en forbindelse med formel I kan inhibere faktor Vlla-aktiviteten uten i vesentlig grad å inhibere aktiviteten av andre angitte proteaser, innbefattet plasmin og trombin (ved anvendelse av den samme inhibitorkonsentrasjon). Slike proteaser inngår i blodkoagulasjons- og fibrinolysekaskaden.

Som anvendt heri viser begrepet "substituent" til enhver av forskjellige kjemiske grupper som er substituert inn i peptidryggraden eller sidekjeden i et peptid, en peptidanalog, en peptidetterligner eller en organisk forbindelse som beskrevet heri. En substituent kan omfatte enhver av en rekke forskjellige grupper som er kjente blant fagfolk (se for eksempel Giannis og Kolter, Angew, Chem. Int. Ed. Engl. 32 (1993) 1244-1267).

Som anvendt heri benyttes begrepet "alkyl" i sin bredeste betydning for å vise til mettede eller umettede, lineære, forgrenede eller cykliske kjeder med fra tilnærmet 1 til 13 karbonatomer, hvor naturligvis en umetted alkylgruppe inneholder minst 2 karbonatomer og en cyklisk alkylgruppe minst 3 karbonatomer. En umettet gruppe kan inneholde en eller flere dobbeltbindinger og/eller trippelbindinger. Således omfatter begrepet "alkyl" for eksempel metyl-, etyl-, n-propyl-, isopropyl-, n-butyl-, isobutyl-, sec-butyl-, tert-butyl-, 1-metylbutyl-, 2,2-dimetylbutyl-, 2-metylpentyl-, 2,2-dimetyl-propyl-, n-pentyl- og n-heksylgrupper, alkylengrupper, cykliske kjeder av karbonatomer som cyklopropyl-, cyklobutyl-, cyklopentyl-, cykloheksyl- og cykloheptyl-grupper, såvel som kombinasjoner av uforgrenede eller forgrenede kjeder og cykliske kjeder av karbonatomer, for eksempel metylcykloheksyl-, cykloheksylmetyl-, 1-cykloheksyletyl-, 2-cykloheksyletyl-, cyklopentylmetyl-, 1-cyklopentyletyl-, 2-cyklopentyletyl-, cyklo-propylmetyl-, 1-cyklopropyletyl-, 2-cyklopropyletyl, eller cyklopropylmetylengruppen. Således omfatter alkyl også cykliske alkylgrupper som bærer en eller flere alkylsubsti-tuenter. Videre eksempler på alkyl er de nedenfor nevnte, spesifikt umettede gruppene. I tillegg bør det innses at en alkyl som definert heri kan være substituert med en eller flere identiske eller forskjellige substituenter, for eksempel en, to, tre eller fire substituenter, som kan foreligge i enhver ønsket og egnet posisjon.

Begrepet "alkyl" betyr fortrinnsvis mettede, lineære eller forgrenede kjeder med fra 1 til 6 karbonatomer, umettede, lineære eller forgrenede kjeder med fra 2 til 6 karbonatomer, eller cykliske alkylgrupper med fra 3 til 8 karbonatomer, mer foretrukket med fra 3 til 6 eller fra 4 til 6 ringkarbonatomer. Når det gjelder umettede alkylkjeder foretrekkes (C2-C6)-alkenyl og (C2-C6)-alkynyl. Eksempler på umettede alkylgrupper er alkenyl- og alkynylgrupper som vinyl, prop-l-enyl, prop-2-enyl (= allyl), but-2-enyl, buten-3-yl, 3-metylbut-2-enyl, etinyl, prop-2-ynyl, but-2-ynyl og lignende.

På tilsvarende måte benyttes begrepet "acyl" i sin bredeste betydning slik at det omfatter mettede eller umettede, uforgrenede, forgrenede eller cykliske kjeder med fra 1 til 13 karbonatomer, eller arylgrupper med fra 5 til 13 ringkarbonatomer som er koblet til en karbonylgruppe -C(O)- og bundet via denne. En acylgruppe kan betraktes som avledet fra den tilsvarende forbindelse inneholdende en karboksylgruppe C(0)-OH ved formell fjerning av hydroksygruppen. Således omfatter begrepet "acyl" for eksempel grupper som formyl, acetyl, benzoyl og lignende. En foretrukket gruppe av acylgrupper omfatter de ovenfor nevnte mettede eller umettede, uforgrenede, forgrenede eller cykliske kjedene med det foretrukne antall karbonatomer, som i tillegg inneholder en karbonylgruppe via hvilken de er bundet.

Begrepet "aryl" viser til aromatiske grupper som inneholder fra tilnærmet 5 til 13 ringkarbonatomer og minst en "ring"-gruppe med et konjugert pi-elektronsystem. Begrepet "aryl" viser fortrinnsvis til aromatiske grupper med fra 6 til 10 ringkarbonatomer. Eksempler på aryl omfatter for eksempel fenyl, naftyl som 1-naftyl og 2-naftyl, fluorenyl, bifenylyl og analoger og derivater av disse, som alle om ønskelig kan være substituert med en eller flere, for eksempel en, to, tre eller fire, identiske eller forskjellige substituenter som kan foreligge i enhver ønsket og egnet posisjon. Således kan for eksempel en monosubstituert fenylgruppe være substituert i 2-, 3- eller 4-posisjon, og en disubstituert fenylgruppe i 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- eller 3,5-posisjon. Begrepet "arylalkyl" viser til en alkyl som definert ovenfor, substituert med en eller flere, for eksempel en eller to, identiske eller forskjellige arylgrupper. Egnede arylalkylgrupper omfatter benzyl, fenyletyl som 1-fenyletyl og 2-fenyletyl, difenylmetyl, difenyletyl, som 1,2-difenyletyl og 2,2-difenyletyl, fenylpropyl som 1-fenylpropyl, 2-fenylpropyl og 3-fenylpropyl, difenylpropyl som 2,3-difenylpropyl og 3,3-difenylpropyl, naftylmetyl, naftyl etyl som 1-naftyletyl og 2-naftyletyl, naftylpropyl som 1-naftylpropyl, 2-naftylpropyl og 3-naftylpropyl, 1,2,3,4-tetrahydro-1-naftyl, 1,2,3,4-tetrahydro-2-naftyl og lignende, som alle om ønskelig kan være substituerte.

Begrepene "heteroalkyl", "heteroalkenyl", "heteroalkynyl", "heteroarylalkyl" og "heteroaryl" som de anvendes heri viser til en alkyl-, arylalkyl- henholdsvis arylgruppe hvori ett eller flere karbonatomer, for eksempel ett, to eller tre karbonatomer, er erstattet med identiske eller forskjellige heteroatomer som N, O eller S. I tillegg anvendes begrepet "heterocykloalkyl" for å vise til en cyklisk alkylgruppe i hvilken ett eller flere ringkarbonatomer er erstattet med heteroatomer. Begrepet "heterocykloalkyl" betyr fortrinnsvis en cyklisk alkylgruppe med fra 3 til 8 ringkarbonatomer, av hvilke 1, 2 eller 3 er erstattet med identiske eller forskjellige heteroatomer som N, O eller S. Alle disse grupper kan være bundet via enhver ønsket og egnet posisjon, innbefattet egnede ringnitrogenatomer når det gjelder nitrogenholdige heterocykliske forbindelser. Egnede heteroarylgrupper, heteroarylalkylgrupper, heteroalkylgrupper og heterocykloalkyl-grupper omfatter for eksempel 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl, 2-tienyl, 3-tienyl, indolyl, imidazolyl, furyl, piperonyl, 2-pyridylmetyl, 3-pyridylmetyl, 4-pyridylmetyl, l-(2-pyridyl)etyl, l-(3-pyridyl)etyl, 1-(4-pyridyl)etyl, 2-(2-pyridyl)etyl, 2-(3-pyridyl)etyl, 2-(4-pyridyl)etyl, picolyl, pyrrolidinyl, piperidinyl, tetrahydrofuryl, tetrahydrofuran-2-ylntetyl, morfolinyl, 4-morfolinyl, 2-(4-morfolinyl)etyl, piperazinyl, 2-(4-metylpipera-zin-l-yl)etyl, og lignende, som alle om ønskelig kan være substituerte med en eller flere, for eksempel en, to, tre eller fire, identiske eller forskjellige substituenter. Peptidene ifølge oppfinnelsen kan være modifisert i aminoenden og/eller karboksyenden ved reaksjon med egnede reagenser eller ved innføring av (eller nærvær av) en aminobeskyttende gruppe henholdsvis en karboksybeskyttende gruppe. Aminoenden av et peptid eller en pepetidanalog kan være kjemisk modifisert slik at den N-terminale aminogruppe er substituert, for eksempel med en acylgruppe (for eksempel acetyl, cyklopentylkarbonyl, isoquinolylkarbonyl, furoyl, tosyl, benzoyl, pyrazinkarbonyl eller andre slik grupper), ved reaksjon med et isocyanat, et klorformat, et alkyleringsmiddel eller ved innføring av en annen slik gruppe, som alle kan være substituerte med en substituent som beskrevet ovenfor. Det bør forstås at begrepet "aminogruppe" anvendes bredt heri for å vise til enhver fri aminogruppe, innbefattet en primær, sekundær eller tertiær aminogruppe, som foreligger i et peptid. Til sammenligning viser begrepet "N-terminal" til cc-aminogruppen i den første aminosyre som foreligger i et peptid skrevet på konvensjonell måte.

N-terminalen av et peptid ifølge oppfinnelsen kan være beskyttet ved at en amino-beskyttende gruppe er koblet til denne. Begrepet "aminobeskyttende gruppe" anvendes bredt heri for å vise til en kjemisk gruppe som kan reagere med en fri aminogruppe, innbefattet for eksempel a-aminogruppen som foreligger i aminoenden av et peptid ifølge oppfinnelsen. Ved at den reagerer med denne beskytter en amino-beskyttende gruppe den ellers reaktive aminogruppe mot uønskede reaksjoner som for eksempel kan forekomme under en syntesefremgangsmåte eller grunnet eksopeptidaseaktivitet på en sluttforbindelse. Modifisering av en aminogruppe kan også gi ytterligere fordeler, for eksempel økt løselighet eller aktivitet av forbindelse. Forskjellige aminobeskyttende grupper beskrives heri eller er kjente innen faget på annet vis, og omfatter for eksempel acylgrupper som acetyl-, tert-butyloksykarbonyl, allyloksykarbonyl-, benzyloksykarbo-nyl- eller benzoylgrupper, såvel som en aminoacylrest som selv kan være modifisert med en aminobeskyttende gruppe. Andre aminobeskyttende grupper beskrives for eksempel i The Peptides, red. Av Gross og Meienhofer, bind 3 (Academic Press, Inc., New York, 1981), og av Green og Wuts, i Protective Groups in Organic Synthesis, 2. utgave, s. 309-405 (John Wiley & Sons, New York, 1991), som begge inkorporeres heri ved referanse. Produktet av enhver slik modifisering av den N-terminale aminogruppe i et peptid eller en peptidanalog ifølge foreliggende oppfinnelse vises heri til som et "N-terminalt derivat".

På tilsvarende måte kan en karboksygruppe, for eksempel karboksygruppen som foreligger i karboksyenden av et peptid, modifiseres kjemisk ved anvendelse av en karboksybeskyttende gruppe. Begrepene "karboksygruppe" og "C-terminal" anvendes på en måte som er i samsvar med begrepene "aminogruppe" og "N-terminal" som definert ovenfor. En karboksygruppe som den som foreligger i C-terminalen av et peptid kan modifiseres ved reduksjon av den C-terminale karboksygruppe til en alkohol eller et aldehyd, eller ved dannelse av en oral ester eller ved substitusjon av karboksygruppen med en substituent som en tiazolylgruppe, en cykloheksylgruppe eller en annen gruppe. Orale estere er velkjente innen faget og omfatter for eksempel alkyloksymetyl-grupper som metoksymetyl, etoksymetyl, isopropoksymetyl og lignende, l-((Ci-C4)-alkyloksy)etyl-grupper som etoksyetyl, etoksyetyl, propoksyetyl, isopropoksyetyl og lignende, 2-okso-l,3-dioksolen-4-ylmetyl-grupper som 5-metyl-2-okso-l,3-dioksolen-4-ylmetyl, 5-fenyl-2-okso-l,3-dioksolen-4-ylmetyl og lignende, ((Ci-C3)-alkyltio)-metyl-grupper som metyltiometyl, etyltiometyl, isopropyltiometyl og lignende, acyl-oksymetylgrupper som pivaloyloksymetyl, acetoksymetyl og lignende, etoksykarbonyl-metylgruppen, 1-acyloksy-l-substituerte metyl grupper som 1 -acetoksyetyl, 3-ftalidyl-eller 5,6-dimetylftalidylgrupper l-(((Ci-C4)-alkyloksy)karbonyloksy)etylgrupper som 1-(etoksykarbonyloksy)etylgruppen, og en l-(((C|-C4)-alkylamino)karbonyloksy)-etylgruppe som l-(metylaminokarbonyloksy)-etylgruppen.

Et peptid ifølge oppfinnelsen kan være modifisert ved tilkobling av en karboksybeskyttende gruppe. Karboksybeskyttende grupper er velkjente innen faget og vil ved at de er bundet til et peptid beskytte en karboksygruppe mot uønskede reaksjoner (se for eksempel Greene og Wuts, supra, s. 224-276 (1991), som inkorporeres heri ved referanse). Den erfarne fagperson vil innse at modifikasjoner som dem beskrevet ovenfor, som kan utføres på den N-terminale aminogruppe eller den C-terminale karboksygruppe i et peptid, på tilsvarende måte kan utføres på enhver reaktiv aminogruppe eller karboksygruppe som for eksempel foreligger i en sidekjede i en aminosyre eller amino-syreanalog i et peptid ifølge oppfinnelsen. Fremgangsmåter for utførelse av slike modifikasjoner beskrives heri, eller de er på annet vis kjente innen faget.

Valget mellom å la en L- eller en D-aminosyre inngå i en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse kan til dels avhenge av peptidets ønskede egenskaper. For eksempel kan innføring av en eller flere D-aminosyrer i forbindelsen økt stabilitet in vitro eller in vivo. Innføring av en eller flere D-aminosyrer kan også forhøye eller redusere den farmakologiske aktivitet av forbindelsen. I noen tilfelle kan det være ønskelig å la forbindelsen være aktiv kun for et kort tidsrom. I slike tilfelle kan innføring av en eller flere L-aminosyrer i forbindelsen tillate at endogene peptidaser i et individ kløyver forbindelsen in vivo og således begrenser individets eksponering overfor den aktive forbindelse. Den erfarne fagperson kan bestemme de ønskede egenskaper som kreves av en forbindelse ifølge oppfinnelsen ved for eksempel å ta i betraktning individets alder og generelle helsetilstand. Generelt gjelder foreliggende oppfinnelse forbindelsene med formel I i alle deres stereoisomere fonner og blandinger av to eller flere stereoisomerer i alle forhold, for eksempel rene enantiomerer, rene diastereomerer, blandinger av to enantiomerer i alle forhold, innbefattet racemater, blandinger av diastereomerer, cis-isomerer, trans-isomerer, E-isomerer eller Z-isomerer. Oppfinnelsen gjelder også forbindelsene med formel I i alle deres tautomere former. Videre gjelder oppfinnelsen promedikamenter av forbindelsene med formel I, for eksempel estere, amider, aldehyder eller alkoholer som kan erholdes fra karboksygrupper, som allerede nevnt, eller acylderivater som (Ci-C6)-alkykarbonyl-, (Ci-C6)-alkyloksykarbonyl- eller aryl-(Cr C4)-alkyloksykarbonylderivater, som kan erholdes fra acylerbare grupper, innbefattet aminogrupper, iminogrupper, guanidinogrupper og amidinogrupper, og oppfinnelsen gjelder også aktive metabolitter av forbindelsene med formel I.

I forbindelsene med formel I inntar formel I gruppene valgt som følger:

Rl-A-B-D-En-R2 (1)

hvori

RI er allyloksykarbonyl eller allylaminokarbonyl,

A er en (L)-4-amidinofenylalaninrest,

B er en (L)-glutaminsyrerest eller et farmasøytisk aksepterbart salt eller en ester av

(L)-glutaminsyre,

D er en rest utvalgt fra gruppen som består av Arg, Dap, Dab, Orn, Lys, Dap[-C(=NH)-NH2], Dab[-C(=NH)-NH2], Lys[-C(=NH)-NH2], Lys[-C(=NH)-CH3], Orn[-C(=NH)-CH3], Dab[-C(=NH)-CH3], Dap[-C(=NH)-CH3], Dab(Alloc), Asn, Gin, Met, Ser, Thr, Ser(Bzl), Thr(Bzl), Cys(Me), Cys(Bzl), Cys(Acm), Arg(N02), His, Trp, Phg, Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Phe(4-N02), Phe(4-NH-C(=NH)-NH2), 2-Abu, Ala(3-CN), Ala[3-C(=NH)-NH2], 2-Abu(4-CN) og 2-Abu[4-C(=NH)-NH2],

n er null eller en,

E er en rest utvalgt fra gruppen som består av Cha, Chg og Phe[4-C(-S-CH2-CH2-S-)-Ph],

R2 er NHR22,

R22 er hydrogen eller en rest utvalgt fra gruppen som består av benzyl, naftylmetyl,

pyridylmetyl, fenyletyl, naftyletyl, pyridyletyl, fenylpropyl, naftylpropyl, pyridylpropyl, fluorenyl, difenylmetyl, difenyletyl og difenylpropyl, som enten er ikke-substituerte eller substituert med substituenter utvalgt fra gruppen som består av F, Cl, Br, hydroksy, metoksy, metylendioksy, nitro, cyano, di(C|-C6)-alkylamino, (Ci-C6)-alkylsulfonyl aminosulfonyl og trifluormetyl, i alle dens stereoisomere former eller en blanding av disse i ethvert forhold, eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav.

Spesifikke eksempler på forbindelsene ifølge oppfinnelsen omfatter Alloc-pAph-Glu-Arg-Cha-NH2,

Allylaminokarbonyl-pAph-Glu-Arg-Cha-NH2,

Alloc-pAph-Glu-Arg-Chg-NH2,

Alloc-pAph-Glu-Dap[-C(=NH)-NH2]-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Ala[3-C(=NH)-NH2]-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Asn-Cha-NH2,

Alloc-pAph-Glu-Dab-Cha-NH2,

Alloc-pAph-Glu-Dap[-C(=NH)-NH2]-NH2,

Alloc-pAph-Glu-Gly-Cha-NH2,

Alloc-pAph-Glu-Thr(Bzl)-NH-(CH2)2-CH(Ph)2, Alloc-pAph-Glu-Dab-NH-(CH2)2-Ph,

Alloc-pAph-Glu-Asn-NH-CH2-Chx,

Alloc-pAph-Glu-Dap[-C(=NH)-CH3]-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Dab[-C(=NH)-NH2]-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-2-Abu(4CN)-Cha-NH2,

Alloc-pAph-Glu-Ala(3CN)-Cha-NH2,

Alloc-pAph-Glu-Asn-1 -naftylmetylamid,

Alloc-p Aph-Glu-Asn-1 -(1 -naftyl)etylamid,

Alloc-pAph-Glu-Asn-2-naftylmetylamid,

Alloc-pAph-Glu-Asn-3,4-diklorbenzylamid,

Alloc-pAph-Glu-Asn-2-(3-klorfenyl)etylamid,

Alloc-pAph-Glu-Arg(N02)-Cha-NH2,

Alloc-pAph-Glu-Cys(Bzl)-Cha-NH2,

Alloc-pAph-Glu-Trp-Cha-NH2,

Alloc-pAph-Glu-Phg-Cha-NH2,

Alloc-pAph-Glu-Asn-9-fluorenylamid,

Alloc-pAph-Glu-Dap[-C(=NH)-NH2]-Phe[4-C(S-(CH2)2-S-)-Ph]-NH2, Alloc-pAph-Glu-Cys(Bzl)-Cha-NH2,

Alloc-pAph-Glu-Thr(Bzl)-Cha-NH2,

Alloc-pAph-Glu-Phe(4-N02)-Cha-NH2,

Alloc-pAph-Glu-Asn-3,4-metylendioksybenzylamid,

Alloc-pAph-Glu-Asn-2-(2-naftyl)etylamid,

Alloc-pAph-Glu-Asn-2-( 1 -naftyl)etylamid,

Alloc-pAph-Glu-Asn-2-(2-pyridyl)etylamid,

Alloc-pAph-Glu-Asn-2,2-difenyletylamid,

Alloc-pAph-Glu-Asn-2,4-difluorbenzylamid, eller

Alloc-pAph-Glu-Asn-4-dimetylaminobenzylamid,

samt deres farmasøytisk aksepterbare salter, amider og estere.

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse kjennetegnet ved at den omfatter: al) kobling av en forbindelse med formelen Fmoc-En-OH, hvori n er en, til en syresensitiv linker koblet til et resin, avspaltning av beskyttelsesgruppen Fmoc, kobling av en forbindelse med formelen Fmoc-Dl-D2-C(0)OH til den erholdte frie aminogruppe, og igjen avspaltning av beskyttelsesgruppen Fmoc,

eller for fremstilling av en forbindelse med formel I i hvilken n er null, kobling av en forbindelse med formel Fmoc-Dl-D2-C(0)OH til en syresensitiv linker koblet til et resin og avspaltning av beskyttelsesgruppen Fmoc,

a2) kobling av en forbindelse med formel Fmoc-Bl-B2-C(0)OH til den frie

aminogruppe erholdt i trinn al) og avspaltning av beskyttelsesgruppen Fmoc,

a3) kopling av en forbindelse med formel Rl-Al-A2-C(0)OH til den frie

aminogruppe erholdt i trinn a2), og

a4) spaltning av forbindelsen erholdt ifølge trinnene al) til a3) fra resinet ved hjelp av trifluoreddiksyre,

eller

bl) kobling av karboksylgruppen i sidekjeden i en forbindelse med formel Fmoc-Bl-CHR97-C(0)OPG, hvori R97 er 2-hydroksykarbonyletyl og PG er en beskyttelsesgruppe, til en syresensitiv linker av benzyl alkoholtype koblet til et aminofunksjonalisert resin,

b2) avspaltning av beskyttelsesgruppen PG,

b3) kobling av en forbindelse med formel H2N-D2-D3-En-R2, hvori n er null, en, to

eller tre, til den frie karboksylsyre erholdt i trinn b2),

b4) avspaltning av beskyttelsesgruppen Fmoc,

b5) kobling av en forbindelse med formelen RI - Al -A2-C(0)OH til den frie

aminogruppe erholdt i trinn b4), og

b6) avspaltning av forbindelsen erholdt ifølge trinnene bl) til b5) fra resinet ved hjelp

av trifluoreddiksyre,

eller

cl) kobling av beskyttede aminogrupper ved tradisjonelle medisinsk-kjemiske fremgangsmåter og avbeskyttelse av målmolekylet ved standard fremgangsmåter som er kjente innen faget,

hvori RI, R2, Al, A2, Bl, Bl, Dl, D2, D3 og E er som definert i kravene 1 til 2 og Fmoc er 9-fluorenylmetyloksykarbonyl

Resinet eller linkeren som anvendes i denne prosess kan være av en slik type at karboksygruppen i forbindelsen, som er koblet til resinet henholdsvis linkeren, over-føres til en amidgruppe C(0)-NH2, for eksempel et Knorr-linker eller et Rink-amidresin. Fremstilling av en forbindelse i hvilken tallet n er to eller tre kan også utføres ved trinn-vis oppbygning av enheten En som følger. I trinn al) kobles, i stedet for en forbindelse med formel Fmoc-En-OH hvori n er to eller tre, først en forbindelse med formel Fmoc-En-OH hvori n er en til en syresensitiv linker koblet til et resin, hvoretter beskyttelsesgruppen Fmoc avkløyves og en andre forbindelse med formel Fmoc-En-OH hvori n er en kobles til den erholdte frie aminogruppe. For fremstilling av en forbindelse i hvilken n er tre avkløyves beskyttelsesgruppen Fmoc og en tredje forbindelse med formel Fmoc-En-OH hvori n er en kobles til den erholdte frie aminogruppe. Endelig avkløyves beskyttelsesgruppen Fmoc og trinnene a2) til a4) følger.

En annen prosess for fremstilling av forbindelsene med formel I omfatter

bl) kobling av karboksylgruppen i sidekjeden i en forbindelse med formel Fmoc-Bl-CHR97-C(0)OPG, hvori R97 er 2-hydroksykarbonyletyl og PG er en beskyttelsesgruppe, til en syresensitiv linker av benzylalkoholtype koblet til et aminofunksjonalisert resin,

b2) avkløyving av beskyttelsesgruppen PG,

b3) kobling av en forbindelse med formel H2N-D2-D3-E„-R2, hvori n er null, en, to

eller tre, til den frie karboksylsyre erholdt i trinn b2),

b4) avkløyving av beskyttelsesgruppen Fmoc,

b5) kobling av en forbindelse med formelen R1 - Al - A2-C(0)OH til den frie

aminogruppe erholdt i trinn b4), og

b6) avkløyving av forbindelsen erholdt ifølge trinnene bl) til b5) fra resinet ved hjelp

av trifluoreddiksyre.

På tilsvarende måte som for modifikasjonen av den første prosess beskrevet ovenfor kan i denne prosess den strukturelle enhet H2N-D2-D3-En-R2 oppbygges trinnsvis på resinet. Ifølge ytterligere en prosess som ligner på denne prosess kan forbindelsene med formel I også fremstilles ved først å koble en karboksylsyregruppe som foreligger i en sidekjede i gruppen D2 i gruppen D, dvs som foreligger i en av gruppene R81 og R82, til en linker koblet til et resin. Analogt med forbindelsen ovenfor med formelen Fmoc-Bl-CHR97-C(0)OPG, kan en slik forbindelse for eksempel ha formelen Fmoc-NH-CR81R82-C(0)OPG, hvori R82 er som definert heri, med det forbehold at den inneholder en gruppe C(0)OH, og R81 er som definert heri. For eksempel kan R81 være hydrogen og R82 hydroksykarbonylmetyl, og forbindelsen med formel Fmoc-NH-CR81R82-C(0)OPG kan således være et beskyttet asparaginsyrederivat. Etter avbeskyttelse av gruppen C(0)OPG, hvis karbonylgruppe er gruppen D3 i formel I, kobles den erholdte frie karboksylsyregruppe til en forbindelse som H2N-E„-R2 eller H-R2. Etter fjerning av beskyttelsesgruppen Fmoc kobles den erholdte aminogruppe til en forbindelse med formel Fmoc-Bl-B2-C(0)OH,og produktet kobles etter avbeskyttelse av aminogruppen til en forbindelse med formel Rl-Al-A2-C(0)OH. Igjen kan resinet eller linkeren som anvendes være av en slik type at karboksygruppen i forbindelsen som er koblet til resinet eller linkeren omdannes til en amidgruppe C(0)-NH2. Ved for eksempel anvendelse av et amidresin kan en asparaginsyreenhet koblet til resinet omdannes til en asparaginenhet i den endelige forbindelse.

En forbindelse ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres kjemisk ved for eksempel anvendelse av et automatisert synteseinstrument (se eksempel I). Selektiv modifisering av en reaktiv gruppe, for eksempel en gruppe som foreligger i en aminosyresidekjede eller en N-terminal eller C-terminal reaktiv gruppe i et peptid, kan innføre ønskelige egenskaper som økt løselighet eller forhøyet inhibitorisk aktivitet i en forbindelse ifølge oppfinnelsen. Dersom syntesefremgangsmåter i fastfase anvendes kan den kjemiske sammen-setning av en forbindelse manipuleres mens det voksende peptid er koblet til resinet eller etter at peptidet er avkløyvet fra resinet, for erholdelse av for eksempel et N-terminalt derivat som en N-terminalt acylert, f.eks. acetylert, forbindelse. Lignende modifikasjoner kan også innføres i karboksygruppen i en forbindelse, innbefattet en C-terminal karboksygruppe, som for eksempel kan amideres.

Forbindelsene kan også fremstilles ved sammenkobling av beskyttede aminosyrer ifølge fremgangsmåtene innen tradisjonell medisinsk kjemi eller organisk kjemi i væskefase, og avbeskyttes til målmolekylene ved standard fremgangsmåter som er kjente innen faget. Generelt er egnede reaksjoner for syntese av forbindelsene med formel I ved fastfasefremgangsmåter eller væskefasefremgangsmåter, såvel som eksperimentelle detaljer som egnede koblingsmidler, for eksempel karbodiimider, TOTU eller HATU, eller løsemidler og reaksjonstemperaturer velkjente blant fagfolk, og disse kan også finnes i standard referansetekster, innbefattet referansene nevnt heri, og eksempler gis også heri.

En syntetisert forbindelse kan renses ved anvendelse av velkjente fremgangsmåter som reversfase-høyytelsesvæskekromatografi (RP-HPLC, se eksempel I) eller andre separa-sjonsfremgangsmåter basert på for eksempel forbindelsens størrelse, ladning eller hydrofobisitet. På tilsvarende måte kan velkjente fremgangsmåter som aminosyre-sekvensanalyse eller massespektrometri (MS) anvendes for å karakterisere strukturen av en forbindelse ifølge oppfinnelsen (se eksempel I).

Forskjellige forbindelser som inneholder forskjellige arrangementer av substituentene viser forskjellig grad av inhibitorisk aktivitet for faktor Vila. For eksempel påvirker valg av substituenter forbindelsenes bindingsaffinitet. Disse forbindelser ble syntetisert ifølge fremgangsmåtene beskrevet i eksemplene. Analyse av peptidene for inhibitorisk aktivitet ble oppnådd ved anvendelse av analysen beskrevet i eksempel 22. Ved anvendelse av slike fremgangsmåter kan en fagmann syntetisere en forbindelse som beskrevet heri, innbefattet en modifikasjon av denne, og bestemme forbindelsens faktor Vlla-inhiberende aktivitet. Et preparat ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilveiebringes som et homogent preparat eller som en blanding av forbindelser som omfatter forskjellige kombinasjoner av substituenter. Den fleksibilitet som tillates ved valg av substituenter tillater stor grad av kontroll over de biologiske og fysikalsk-kjemiske egenskaper til forbindelsene og preparatene ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen tilveiebringer forbindelser som spesifikt inhiberer faktor VII-aktiviteten. Slike forbindelser har fortrinnsvis Ki < 500 nM, mer foretrukket < 50 nM, for faktor Vlla-aktivitet og inhiberer ikke i vesentlig grad aktiviteten av andre proteaser som deltar i koagulasjons- og fibrinolysekaskaden, relativt til inhiberingen av faktor Vila (ved anvendelse av samme inhibitorkonsentrasjon). Slike andre proteaser omfatter for eksempel faktor Xa, trombin og plasmin.

Den påfølgende tabell 2 viser den faktor Vlla-inhiberende aktivitet (se eksempel 22 for fremgangsmåten for bestemmelse av Ki) av utvalgte forbindelser med formel I som også eksemplifiserer oppfinnelsen. Den trombininhiberende aktivitet av forbindelsene ovenfor kan uttrykkes i Ki-verdier som generelt er betraktelig høyere enn den ovenfor angitte faktor Vlla-inhiberende aktivitet, for eksempel tilnærmet 200 eller tilnærmet 500 eller tilnærmet 1000 ganger høyere enn den faktor Vlla-inhiberende aktivitet. Videre kan den faktor Xa-inhiberende aktivitet av forbindelsene ovenfor uttrykkes i Ki-verdier som generelt er betydelig høyere enn den ovenfor angitte faktor Vlla-inhiberende aktivitet, for eksempel tilnærmet 100 ganger høyere enn den faktor Vlla-inhiberende aktivitet.

Disse resultater viser at forbindelsene med formel I er anvendbare som inhibitorer av faktor Vila, men at de ikke i vesentlig grad inhiberer aktiviteten av faktor Xa eller serinproteaser som trombin, som deltar i blodkoagulasjons- og fibrinolyseprosessen.

Foreliggende oppfinnelse angår da også et farmasøytisk preparat kjennetegnet ved at det omfatter en effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav, og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff, og anvendelse av en forbindelse ifølge oppfinnelsen eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav som et farmasøytisk middel.

Spesielt angår oppfinnelsen anvendelse av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav for fremstilling av et preparat for inhibering eller reduksjon av blodkoagulasjon, en inflammatorisk respons, tromboemboliske sykdommer eller vaskulær restenose.

En forbindelse ifølge oppfinnelsen kan med fordel anvendes for fremstilling av et anti-koagulasjonsmiddel, som kan settes i forbindelse med en blodprøve for å forhindre koagulasjon. For eksempel kan en effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen settes i forbindelse med en nytappet blodprøve for å forhindre koagulasjon av blodprøven. Som anvendt heri betyr begrepet "effektiv mengde", anvendt ved henvis-ning til en forbindelse ifølge oppfinnelsen, en mengde av en forbindelse som inhiberer faktor Vlla-aktiviteten. Den erfarne fagperson vil innse at en effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen kan bestemmes ved å anvende fremgangsmåtene som beskrives heri (se eksempel 22) eller som på annet vis er kjent innen faget. I lys av den beskrevne anvendelse av en forbindelse ifølge oppfinnelsen vil den erfarne fagperson også innse at et middel som heparin kan erstattes med en forbindelse ifølge oppfinnelsen. Slik anvendelse av en forbindelse ifølge oppfinnelsen kan for eksempel i kostnadsreduksjoner sammenlignet med andre antikoagulasjonsmidler.

I tillegg kan en forbindelse ifølge oppfinnelsen anvendes til fremstilling av preparater for behandling av en rekke kliniske tilstander, innbefattet for eksempel behandling av en hjerte-karforstyrrelse eller en komplikasjon forbundet med for eksempel infeksjon eller kirurgiske inngrep. Eksempler på hjerte-karforstyrrelser omfatter restenose etter angio-plastikk, "adult respiratory disstress syndrome", flerorgansvikt, slag og disseminert intravaskulær koagulasjon. Eksempler på beslektede komplikasjoner forbundet med kirurgiske inngrep omfatter for eksempel dyp venetrombose og proksimal venetrombose, noe som kan forekomme etter kirurgiske inngrep. Således er en forbindelse ifølge oppfinnelsen anvendbar som et medikament for å redusere eller inhibere uønsket koagulasjon i et individ.

Siden en forbindelse ifølge oppfinnelsen kan inhibere faktor Vlla-aktivitet kan en slik forbindelse generelt være anvendbar for fremstilling av preparater for å redusere eller inhibere blodkoagulasjon i et individ. Som anvendt heri betyr begrepet "individ" et virveldyr, innbefattet et pattedyr som for eksempel et menneske, i hvilket faktor Vila inngår i koagulasjonskaskaden.

Blodkoagulasjon i et individ kan reduseres eller inhiberes ved tilførsel til individet av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen. Som anvendt heri betyr begrepet "terapeutisk effektiv mengde" den dose av en forbindelse som må tilføres til et individ for å inhibere faktor Vlla-aktiviteten i individet. Nærmere bestemt inhiberer en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen den katalytiske aktivitet av faktor Vila, enten direkte i protrominasekomplekset eller som en løselig subenhet, eller indirekte ved å inhibere innføring av faktor Vila i protrombinase-komplekset. Foretrukne forbindelser kan inhibere faktor Vlla-aktiviteten med en Ki < 500 nM og mer foretrukne forbindelser med en Ki < 50 nM. En terapeutisk effektiv mengde kan bestemmes ved å anvende fremgangsmåtene beskrevet i for eksempel eksempel 22, eller på annet vis kjent innen faget.

Ved utførelse av et terapeutisk behandlingsregime ifølge oppfinnelsen vil den dose av et farmasøytisk preparat som må tilføres til individet for å oppnå en terapeutisk effektiv mengde avhenge av en rekke betraktninger, innbefattet for eksempel sykdommens natur og omfang, tilførselsskjemaet og individets alder og fysiske egenskaper. En passende dose kan fastsettes ved å anvende kliniske tilnærminger som er velkjente innen medisin. Således tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for spesifikk inhibering av faktor Vlla-aktiviteten ved å sette faktor Vila i forbindelse med en forbindelse med formelen Rl-A-B-DEn-R2.

En forbindelse ifølge oppfinnelsen vil generelt tilføres til et individ som et preparat som inneholder en eller flere forbindelser med formel 1 og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff. Begrepet "farmasøytisk aksepterbart bærestoff" viser til et medium eller preparat som er ikke-toksisk for et individ, eller som har aksepterbar toksisitet, bestemt av egnede regulerende myndigheter. Som anvendt heri omfatter begrepet farmasøytisk aksepterbart bærestoff ethvert av de vanligvis anvendte farmasøytiske bærestoffer, innbefattet faste bærestoffer som maisstivelse, laktose, fett, voks o.s.v. eller væsker som for eksempel fosfatbufret saltvann, vannemulsjoner som olje/vann- eller vann/olje-emulsjoner, og/eller vanlige tilsetningsstoffer, for eksempel ethvert av forskjellige typer fuktningsmidler. Egnede farmasøytiske bærestoffer og utforming av disse beskrives av Martin i Remington's Pharmaceutical Science, 15. Utgave (Mack Publishing Co-, Easton, 1975) som inkorporeres heri ved referanse. Slike preparater vil generelt inneholde en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen sammen med en egnet mengde bærestoff, slik at de omfatter en passende dose for tilførsel til et individ. Forbindelsene ifølge kravene kan således være anvendbare som medikamenter for inhibering av faktor Vlla-aktivitet og blodkoagulasjon i et individ.

De farmasøytiske preparater eller medikamenter ifølge oppfinnelsen kan tilføres oralt, for eksempel i form av piller, tabletter, lakkerte tabletter, belagte tabletter, granulater, kapsler av hard eller myk gelatin, løsninger, siruper, emulsjoner, suspensjoner eller aerosolblandinger. Tilførselen kan imidlertid også utføres rektalt, for eksempel i form av stikkpiller, eller parenteralt, for eksempel intravenøst, intramuskulært eller subkutant i form av injeksjonsløsninger eller infusjonsløsninger, mikrokapsler, implantater eller staver, eller perkutant eller topisk, for eksempel i form av salver, løsninger eller tinkturer, eller på andre måter, for eksempel i form av aerosoler eller nesesprayer. Mengden av den aktive bestanddel med formel 1 eller dens farmasøytisk aksepterbare salg eller derivat i en enhetsdose av et farmasøytisk preparat er vanligvis fira tilnærmet 0.5 mg til tilnærmet 1000 mg, fortrinnsvis fra tilnærmet 1 mg til tilnærmet 500 mg, men avhengig av typen farmasøytisk preparat kan mengden også være høyere. Den daglige dose av forbindelsene med formel I som skal tilføres kan være en enkelt daglig dose, eller den kan oppdeles i flere deltilførsler, for eksempel to, tre eller fire.

Farmasøytisk aksepterbare bærestoffer kan også omfatte for eksempel andre medier, forbindelser eller modifikasjoner av en faktor Vlla-inhibitorforbindelse med formel I som fremmer forbindelsens farmakologiske funksjon. Et farmasøytisk aksepterbart medium kan for eksempel omfatte et farmasøytisk aksepterbart salt. Et syreaddisjonssalt av en forbindelse med formel I kan for eksempel dannes med en uorganisk syre som saltsyre, hydrogenbromid, fosforsyre, svovelsyre eller perklorsyre, eller med en organisk karboksylsyre som eddiksyre, oksalsyre, maleinsyre, eplesyre, maursyre, melkesyre, vinsyre, sitronsyre, ravsyre eller malonsyre, eller en organisk sulfonsyre som metansulfonsyre eller p-toluensulfonsyre. En syregruppe i en forbindelse med formel I, for eksempel en karboksylsyregruppe, kan foreligge som et metallsalt hvis kation er basert på alkalimetaller eller alkaliske jordmetaller som natrium, litium, kalium, kalsium eller magnesium, eller også som et ikke-toksisk ammoniumsalt, innbefattet kvaternære ammoniumsalter og syreaddisjonssalter med aminer, for eksempel som et ammonium-, metylammonium-, dimetylammonium-, trimetylammonium-, tetrametylammonium-, etylammonium-, trietylammonium- eller tetraetylammoniumsalt.

Eksempler på modifikasjoner som fremmer den farmakologiske funksjon av forbindelsen omfatter for eksempel forestring, som dannelse av (Ci-C6)-alkylestere, fortrinnsvis (Ci-C4)-alkylestere, hvori alkylgruppen er en uforgrenet eller forgrenet kjede. Andre akseptable estere omfatter for eksempel (Cs-C7)-cykloalkylestere og arylalkylestere, for eksempel benzylestere. Slike estere kan fremstilles fra forbindelsene som beskrives heri ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter som er velkjente innen faget peptidkjemi.

Farmasøytisk aksepterbare modifikasjoner kan også for eksempel omfatte dannelse av peptidamider. Slike amidmodiifkasjoner som kan innføres i forbindelsene ifølge oppfinnelsen omfatter for eksempel modifikasjoner avledet fra ammoniakk, primære (Ci-C6)-alkylaminer og sekundære di-(Ci-C6)-alkylaminer, hvori alkylgruppene er uforgrenede eller forgrenede kjeder, eller arylaminer med forskjellige substitusjoner. Når det gjelder sekundære aminer kan aminet også foreligge i form av en heterocyklisk gruppe med 5 eller 6 medlemmer som kan inneholde et ikke substituert eller substituert nitrogenatom, et oksygenatom eller svovelatom i tillegg til amidnitrogenatomet. Fremgangsmåter for fremstilling av slike amider er velkjente innen faget.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes i en analyse for å påvise nærvær av faktor Vila eller for å isolere faktor Vila i det vesentlige renset form. Fortrinnsvis er forbindelsen ifølge oppfinnelsen merket med for eksempel en radioaktiv isotop, og den merkede forbindelse påvises ved anvendelse av en rutinemessig fremgangsmåte som er anvendbar for påvisning av den benyttede merking. I tillegg kan en forbindelse ifølge oppfinnelsen med fordel anvendes som en probe for å påvise lokalisering eller mengde av faktor Vlla-aktivitet in vivo, in vitro eller ex vivo.

Det bør forstås at modifikasjoner som ikke i vesentlig grad påvirker aktiviteten av de forskjellige utførelser av foreliggende oppfinnelse omfattes av den her beskrevne oppfinnelse. Følgelig er de påfølgende eksempler ment å illustrere oppfinnelsen, men ikke å begrense den.

Eksempel 1: Fremgangsmåter for peptidsyntese og generelle

syntesefremgangsmåter

Utgangsmaterialene anvendt i syntesen ble erholdt fra kjemiske leverandører som Aldrich, Sigma, Fluka, Nova Biochem og Advanced Chemtech. Under syntesen var de funksjonelle grupper i aminosyrederivatene som ble anvendt beskyttet med blokkerende grupper for å forhindre bireaksjoner under koblingstrinnene. Eksempler på egnede beskyttelsesgrupper og anvendelse av disse er beskrevet i The Peptides, supra, 1981 og i bind 9, Udenfriend og Meienhofer (red), 1987, som inkorporeres heri ved referanse.

Generell peptidsyntese i fastfase ble anvendt for fremstilling av forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Slike fremgangsmåter beskrives for eksempel av Steward og Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman & Co., San Francisco, 1969), som inkorporeres heri ved referanse.

Dersom ikke annet er angitt ble peptidene syntetisert på TentaGel S Nftø-resin (Rapp Polymere, Tiibingen, Tyskland). En syresensitiv linker, p-[(R,S)-a-[l-(9H-fluoren-9-yl)metoksyformamid]-2,4-dimetoksybenzyl]fenoksyeddiksyre (Knorr-linker), var koblet til det faste støttemiddel (Bernatowicz et al, Tetr. Lett. 30 (1989) 4645, som inkorporeres heri ved referanse). Alternativt ble peptidene syntetisert på polystyrenresin kryssbundet med 1 % divinylbenzen, modifisert med en syresensitiv linjer (Rink-resin)

(Rink, Tetr. Lett. 28 (1987) 3787; Sieber, Tetr. Lett. 28 (1987) 2107, som begge inkorporeres heri ved referanse). Dersom peptidene ble syntetisert ved først å koble karboksylgruppen i sidekjeden i en forbindelse med formel Fmoc-Bl-CHR97-C(0)OPG til resinet ble TentaGel S NH2-resin modifisert ved tilkobling av HMPA-linkeren anvendt. Koblingen ble utført ved anvendelse av N,N'-diisopropylkarbodiimid (DIC) i nærvær av en ekvivalent mengde HOBt, bortsett fra Alloc-pAph-OH, hvor 2 ekvivalenter (ekv.) av HOBt ble anvendt. Alle koblinger ble utført i enten N,N-dimetylformamid (DMF) eller DMF/DMSO (1/1 blanding) ved romtemperatur (RT). Forløpet av koblingen ble fulgt ved en ninhydrinanalyse. En andre (dobbel) kobling ble utført dersom koblingen i første omgang var ufullstendig.

Fjerning av Fmoc-gruppen ble oppnådd ved anvendelse av 50 % piperidin i DMF i 2+10 minutter. Mengden frigjort Fmoc ble målt ut fra absorbansen ved 300 nm av løsningen etter avbeskyttelse, volum av vaskeløsning og vekt av resin anvendt i syntesen.

Syklusen for hver kobling var som følger:

Etter fullført peptidoppbygging på resinet ble en avsluttende Fmoc-fjerning utført om nødvendig. Peptidresinet ble så vasket, først med DMF og så med DCM, og peptidet ble så avkløyvet og avbeskyttet med en blanding av TFA/tioanisol (95/5) i 1.5 timer, dersom ikke annet er angitt. Resinet ble vasket med DCM og DCM-vasken slått sammen med TFA-eluatet. Løsningen ble inndampet, produktet utfelt med vannfri dietyleter og det faste bunnfall isolert ved filtrering eller sentrifugering og tørket under vakuum over perler av fast KOH. Fast materiale ble løst i en blanding av vann og acetonitril og frysetørket.

Det tørkede peptid ble renset ved HPLC ved anvendelse av en egnet gradient av 0.1 % TFA i vann og acetonitril (ACN). Etter oppsamling av toppen som inneholdt det påtenkte synteseprodukt ble peptidløsningen frysetørket og peptidet analysert ved en identifikasjonsprosess som omfattet elektrospray-massespektrum (MS) og/eller NMR og/eller aminosyreanalyse for å bekrefte at den korrekte forbindelse var syntetisert.

For HPLC-analyse ble et uttak av produktet analysert ved anvendelse av et Beckman HPLC-system (bestående av 126 Solvent Deliver System, 166 Programmable Detector Module 507e Autosampler, kontrollert av Data Station med Gold Nouveau programvare) og en YMC ODS-AM 4.6x250 mm kolonne ved 230 nm og en gjennomstrømm-ingshastighet på 1 ml /min.

For produktrensing ble et uttak av urent, frysetørket peptid løst i en blanding av 0.1 % vandig TFA tilsatt 10 % til 50 % ACN. Peptidløsningen ble vanligvis filtrert gjennom en sprøyte koblet til et 0.45 um "ACRODISC" 13 CR PTFE (Gelman Sciences; Ann Arbor MI) filter. Et passende volum av filtrert peptidløsning ble injisert inn i en semi-preparativ C18-kolonne (Vydac Protein and Peptide Cl8, 218TP1022 (22x250 mm), The Separation Group, Hesperia CA eller YMC ODS-A column (20x250 mm), YMC, Inc., Wilmington, NC). Gjennomstrømmingshastigheten av en gradient eller isokratisk blanding av 0.1 % TFA-buffer og aCN (HPLC-renhet) som elueringsmiddel ble opprett-holdt ved anvendelse av Beckman "SYSTEM GOLD" HPLC (Beckman, System Gold, Programmable Solvent Module 126 og Programmable Detector Module 166 kontrollert av "SYSTEM GOLD" programvare). Eluering av peptiden ble fulgt ved UV-deteksjon ved 230 nm. Etter identifisering av toppen som tilsvarte synteseforbindelsen ved anvendelse av MS ble forbindelsen oppsamlet, frysetørket og analysert biologisk. MS ble utført ved anvendelse av et VG Platform (Fisons Instruments) instrument i ES+-modus. For NMR ble prøvene typisk målt i DMSO-d6 (Aldrich) ved anvendelse av et Bruker Avance DPX 300 instrument.

Eksempel 2: Syntese av Alloc-pAph-OH

Den samme fremgangsmåte kan anvendes for Alloc-D-pAph-OH.

Alloc-Phe(4-CN)-OH

5.7 g (30 mmol) H-Phe(4-CN)-OH ble løst i 100 ml 1 M NaOH ved tilsetning av 2M

NaOH til pH=10 under isavkjøling. Under kraftig omrøring ble allylklorformat (7.5 ml) langsomt tilsatt (pH holdt ved 10 med 2M NaOH). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0°C i 15 minutter og ved RT i 30 minutter, surgjort med HC1 til pH = 2, ekstrahert med etylacetat (3 ganger), tørket med MgS04 og inndampet. Restmaterialet ble rekrystalli-sert fra etylacetat/heksan for erholdelse av et hvitt fast stoff. Utbytte: 7.0 g (85 %). Alloc-Phe[4-C(=S)-NH2]-OH

2.74 g Alloc-Phe(4-CN)-OH ble løst i en blanding av pyridin (50 ml) og trietylamin (20 ml) og H2S ble gjennomboblet i 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble inkubert over natten ved RT og inndampet. Tørking under høyvakuum ga 3.21 g av et fast skum av det urene tioamid, som overføres direkte til metyltioimidatet.

Alloc-Phe[4-C(=NH)-SCH3]-OH HI

1 g Alloc-Phe[4-C(=S).NH2]-OH ble løst i aceton (50 ml), og metyljodid (5 ml) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble inkubert over natten ved RT, flyktige løsemidler fjernet (hurtig, maksimalt 35°C) og restmaterialet behandlet med dietyleter. Etter 1 time ved 0°C ble eteren dekantert, produktet vasket med dietyleter og tørket under vakuum. Et gult, fast skum ble erholdt og direkte overført til amidinet.

Alloc-pAph-OH

Alt Alloc-Phe(4-C(=NH)-SCH3)-OH ■ HI fra trinnet ovenfor ble løst i 50 ml metanol tilsatt 300 ul eddiksyre, og 0.5 g ammoniumacetat ble tilsatt. Blandingen ble oppvarmet i 3 timer til 55°C og inndampet, og 10 ml aceton ble tilsatt. Etter 2 timer ved 0°C ble det faste produkt frafiltrert, vasket med litt kald aceton, litt kald metanol og dietyleter, og tørket under vakuum for erholdelse av et gulaktig fast stoff. Utbytte: 0.53 g.

Eksempel 3: Syntese av Alloc-pAph-Glu-Arg-Cha-NH2

1 g TentaGel S NH2-resin (substitusjonsgrad 0.26 mmol/g), ble tilkoblet Knorr amidlinker. Ifølge de generelle fremgangsmåter skissert i eksempel 1 ble følgende beskyttede aminosyrer tilkoblet: Fmoc-Cha-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH og Alloc-pAph. Peptidet ble avkløyvet og avbeskyttet med TFA/tioanisol (95/5) i 3 timer og viderebehandlet som beskrevet i eksempel 1. Råforbindelsen ble renset med HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 729.1, beregnet 729.4.

Eksempel 4: Syntese av allyl-NH-C(0)-pAph-Glu-Arg-Cha-NH2

0.5 g TentaGel S NH2-resin (substitusjonsgrad 0.26 mmol/g) ble tilkoblet Knorr amidlinker. Ifølge de generelle fremgangsmåter i eksempel 1 ble følgende beskyttede aminosyrer tilkoblet: Fmoc-Cha-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH og Fmoc-Phe(4-CN). Etter fjerning av den N-terminale Fmoc ble resinet behandlet med en løsning av 1 mmol allylisocyanat i 3 ml DMF i 2 timer. Resinet ble så vasket med DMF og trietylamin/pyridin (1/2) og behandlet med en mettet løsning av H2S over natten. Resinet ble vasket med aceton, og tioamidresinet fikk reagere med metyljodid (3 ml av en 10 % løsning av metyljodid i aceton) i 6 timer. Metyltioimidatresinet ble vasket med aceton og metanol og behandlet med en løsning av 0.2 g ammoniumacetat og 100 (al eddiksyre i 3 ml metanol ved 55°C i 3 timer. Resinet ble vasket med metanol, DMF og DCM, og peptidet ble avkløyvet av avbeskyttet med TFA/tioanisol (95/5) i 3 timer og viderebehandlet som beskrevet i eksempel 1. Råmaterialet ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 728.3, beregnet 728.4.

Eksempel 5: Syntese av Alloc-pAph-Glu-Arg-Chg-NH2

1 g TentaGel S NH2-resin (substitusjonsgrad 0.26 mmol/g) ble tilkoblet Knorr amidlinker. Ifølge de generelle fremgangsmåter i eksempel 1 ble følgende beskyttede aminosyrer tilkoblet: Fmoc-Chg-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH og Alloc-pAph. Peptidet ble avkløyvet og avbeskyttet med TFA/tioanisol (95/5) i 3 timer og viderebehandlet som beskrevet i eksempel 1. Råforbindelsen ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 715.8, beregnet 715.4.

Eksempel 6: Syntese av Alloc-D-pAph-Glu-Arg-Cha-NH2

1 g TentaGel S NH2-resin (substitusjonsgrad 0.26 mmol/g) ble tilkoblet Knorr amidlinker. Ifølge de generelle fremgangsmåter i eksempel 1 ble følgende beskyttede aminosyrer tilkoblet: Fmoc-Cha-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH og Alloc-D-pAph-OH (syntetisert ifølge fremgangsmåten benyttet for Alloc-pAph-OH i eksempel 2). Peptidet ble avkløyvet og avbeskyttet med TFA/tioanisol (95/5) i 3 timer og viderebehandlet som beskrevet i eksempel 1. Råforbindelsen ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 729.2, beregnet 729.4.

Eksempel 7: Syntese av Alloc-pAph-Glu-Phe(4-guanidino)-Cha-NH2

0.25 g TentaGel S NH2-resin (substitusjonsgrad 0.23 mmol/g) ble tilkoblet Knorr amidlinker. Ifølge de generelle fremgangsmåter i eksempel 1 ble følgende beskyttede aminosyrer tilkoblet: Fmoc-Cha-OH, Fmoc-Phe(4-NH-C(=NBoc)-NH-Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH og Alloc-pAph-OH. Peptiden ble avkløyvet og avbeskyttet med TFA/tioanisol (95/5) i 1 time og viderebehandlet som beskrevet i eksempel 1. Råforbindelsen ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 777.1, beregnet 777.4.

Eksempel 8: Syntese av Alloc-pAph-Glu-Dap[-C(=NH)-NH2]-Cha-NH2

0.25 g TentaGel S NH2-resin (substitusjonsgrad 0.23 mmol/g) ble tilkoblet Knorr amidlinker. Ifølge de generelle fremgangsmåter i eksempel 1 ble følgende beskyttede aminosyrer tilkoblet: Fmoc-Cha-OH, Fmoc-Dap[-C(=N-Boc)-NH-Boc]-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH og Alloc-pAph-OH. Peptidet ble avkløyvet og avbeskyttet med TFA/tioanisol (95/5) i 1 time og viderebehandlet som beskrevet i eksempel 1. Råforbindelsen ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 729.1, beregnet 729.4.

Eksempel 9: Syntese av Alloc-pAph-Glu-Dap[-C(=NH)-CH3]-Cha-NH2

0.25 g TentaGel S NH2-resin (substitusjonsgrad 0.26 mmol/g) ble tilkoblet Knorr amidlinker. Ifølge de generelle fremgangsmåter i eksempel 1 ble følgende beskyttede aminosyrer tilkoblet: Fmoc-Cha-OH, Fmoc-Dap(Alloc)-OH og Fmoc-Glu(OtBu)-OH. Med den N-terminale beskyttelsesgruppe Fmoc tilkoblet ble resinet vasket med en DMF/NMM/AcOH (5/0.5/1) blanding og Alloc-gruppen ble fjernet under konstant omrøring under en argonstrøm ved tilsetning av 100 mg Pd/P/Ph)3)4 over et tidsrom på 3 timer. Resinet ble vasket med DMF og behandlet med en løsning av 150 mg 2-metyl-naftylacetioimidat i 4 ml etanol/DMSO (3/1) i 1 time. Etter vask med DMF ble Fmoc-

gruppen fjernet (1+5 min) og den N-terminale Alloc-pAph-OH tilkoblet. Peptidet ble avkløyvet og avbeskyttet med TFA/tioanisol (95/5) i 1 time og viderebehandlet som beskrevet i eksempel 5. Råforbindelsen ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 700.1, beregnet 700.4.

Eksempel 10: Syntese av AHoc-pAph-Glu-Ala[3-C(=NH)-NH2]-Cha-NH2

0.25 g TentaGel S NH2-resin (substitusjonsgrad 0.26 mmol/g) ble tilkoblet Knorr amidlinker. Ifølge de generelle fremgangsmåter i eksempel 1 ble følgende beskyttede aminosyrer tilkoblet: Fmoc-Cha-OH, Fmoc-Ala(3-CN)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH og Alloc-Phe(4-CN)-OH. En blanding av pyridin og trietylamin (2/1) ble mettet med H2S (RT, 15-30 min), og denne løsning ble tilsatt til resinet som på forhånd var vasket med pyridin/trietylamin (2/1). Etter inkubering over natten ble resinet vasket med aceton og behandlet med en løsning av 20 % metyljodid i aceton over natten. Resinet ble så vasket med aceton og metanol. Resinbundet metyltioimidat ble så overført til amidinet ved oppvarming (vannbad, 55°C, 3 timer) av resinet med en løsning av 19 ekv. Ammoniumacetat i metanol tilsatt 5 % eddiksyre. Etter denne siste overføring ble resinet vasket medmetanol, DMF. DCM. Peptidet ble avkløyvet og avbeskyttet med TFA/tioanisol (95/5) i 1 time og viderebehandlet som beskrevet i eksempel 1. Råforbindelsen ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS.

(M+H)<+>: funnet 685.9, beregnet 686.4.

Eksempel 11: Syntese av Alloc-pAph-Glu-Asn-Cha-NH2

0.125 g Rink-resin (substitusjonsgrad 0.78 mmol/g) ble etter fjerning av Fmoc tilkoblet følgende beskyttede aminosyrer ifølge de generelle fremgangsmåter beskrevet i eksempel 1: Fmoc-Cha-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH og Alloc-pAph-OH. Peptidet ble avkløyvet og avbeskyttet med TFA/tioanisol (95/5) i 1 time og viderebehandlet som beskrevet i eksempel 1. Råforbindelsen ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 686.9, beregnet 687.3.

Eksempel 12: Syntese av AIloc-pAph-Glu-Dab-Cha-NH2

0.25 g TentaGel S NH2-resin (substitusjonsgrad 0.26 mmol/g) ble tilkoblet Knorr amidlinker. Ifølge de generelle fremgangsmåter i eksempel 1 ble følgende beskyttede aminosyrer tilkoblet: Fmoc-Cha-OH, Fmoc-Dab(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH og Alloc-

pAph. Peptidet ble avkløyvet og avbeskyttet med TFA/tioanisol (95/5) i 1 time og viderebehandlet som beskrevet i eksempel 1. Råforbindelsen ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 673.2, beregnet 673.4.

Eksempel 13: Syntese av Alloc-pAph-Glu-Ala[3-C(=NH)-NH2]-NH2

0.25 g TentaGel S NH2-resin (substitusjonsgrad 0.26 mmol/g) ble tilkoblet Knorr amidlinker. Ifølge de generelle fremgangsmåter i eksempel 1 ble følgende beskyttede aminosyrer tilkoblet: Fmoc-Ala(3-CN)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH og Alloc-Phe(4-CN)-OH. En blanding av pyridin og trietylamin (2/1) ble mettet med H2S (RT, 15-30 min) og denne løsning ble tilsatt til resinet som på forhånd var vasket med pyridin/tiretylamin (2/1). Etter inkubering over natten ble resinet vasket med aceton og behandlet med en løsning av 20 % metyljodid i aceton over natten. Resinet ble så vasket med aceton og metanol. Resinbundet metyltioimidat ble så overført til amidinet ved oppvarming (55°C, vannbad, 3 timer) av resinet med en løsning av 10 ekv. ammoniumacetat i metanol tilsatt 5 % eddiksyre. Etter denne siste overføring ble resinet vasket med metanol, DMF, DCM. Peptidet ble avkløyvet og avbeskyttet med TFA/tioanisol (95/5) i 1 time og viderebehandlet som beskrevet i eksempel 1. Råforbindelsen ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 533.3, beregnet 533.2.

Eksempel 14: Syntese av Alloc-pAph-Glu-Gly-Cha-NH2

0.150 g Rink-resin (substitusjonsgrad 0.78 mmol/f) ble etter fjerning av Fmoc tilkoblet følgende beskyttede aminosyrer ifølge den generelle fremgangsmåte beskrevet i eksempel 1: Fmoc-Cha-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH og Alloc-pAph-OH. Peptidet ble avkløyvet og avbeskyttet med TFA/tioanisol (95/5) i 1 time og viderebehandlet som beskrevet i eksempel 1. Råforbindelsen ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 630.1, beregnet 630.3.

Eksempel 15: Syntese av Alloc-pAph-Glu-Asn-(Ph-CH2-CH2-)Gly-NH2

For N-substituerte glysiner ble fremgangsmåten til Zuckermann et al. (J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 10646, som inkorporeres heri ved referanse) anvendt. 0.1 g Rink-resin (substitusjonsgrad 0.78 mmol/g) ble etter fjerning av Fmoc tilkoblet bromeddiksyre via det symmetriske anhydrid i DCM/DMF. Etter 10 minutter ble resinet vasket med DCM og koblingen gjentatt en gang. Etter vask med DCM og DMF ble resinet behandlet med en 1 M løsning av 2-fenyletylamin i DMSO over natten. Etter vask med DMF fikk resinet, som nå bærer resten (Ph-CH2-CH2-)NH-CH2-C(0) koblet til linkeren, reagere med det symmetriske anhydrid av Fmoc-Asn/Trt)-OH i DCM/DMF. Etter fjerning av Fmoc ble følgende beskyttede aminosyrer tilkoblet ifølge de generelle fremgangsmåter i eksempel 1 :Fmoc-Glu(OtBu)-OH og Alloc-pAph-OH. Peptidet ble avkløyvet og avbeskyttet med TFA/tioanisol (95/5) i 1 time og viderebehandlet som beskrevet i eksempel 1. Råforbindelsen ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 694.9, beregnet 695.3.

Eksempel 16: Syntese av Alloc-pAph-Glu-Thr(Bzl)-NH-CH2-CH2-CH(Ph)2

H-Thr(Bzl)-NH-CH2-CH2-CH(Ph)2 HC1

0.62 g (2 mmol) Boc-Thr(Bzl)-OH ble løst i 10 ml DCM, 2 mmol trietylamin ble tilsatt og løsningen avkjølt til 0°C. Under omrøring ble 2 mmol isobutylklorformat langsomt tilsatt. Kjølebadet ble fjernet, løsningen omrørt i 15 minutter og 2.5 mmol 3,3-difenyl-propylamin i 2 ml DMF tilsatt, og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time. Løsningen ble inndampet, løst i etylacetat og ekstrahert med 0.5M KHSCvløsning, mettet NaHC03-løsning og saltlake, tørket med MgSCvt og inndampet. Det oljeaktige produkt ble løst i 10 ml DCM, og 10 ml av en 4M løsning av saltsyre i dioksan ble tilsatt. Etter 10 minutter ble løsemidlene avdampet og hydrokloridet av produktet utfelt med dietyleter, frafiltrert, vasket med dietyleter og tørket under vakuum for erholdelse av et hvitt fast stoff. MS-analyse: (M+H)<+>: funnet 403.1, beregnet 403.2.

Alloc-pAph-Glu-Thr(Bzl)-NH-CH2-CH2CH(Ph)2

0.5 g TentaGel S NH2-resin (substitusjonsgrad 0.26 mmol/g), 4-hydroksymetyl-fenoksyeddiksyre ble tilkoblet (3 ekv. aktivert med DIC/HOBt i 1.5 timer). Fmoc-Glu(OH)-0-allyl ble tilkoblet til resinet via sidekjeden ved anvendelse av DIC/HOBt/NMI i DMF over natten. Den beskyttende allylgruppe ble fjernet ved omrysting av resinet med Pd(PPh3)4 i DMF/AcOH/NMM (10/2/1) i 4 timer under argon. Den avbeskyttede karboksygruppe ble aktivert med en løsning av 0.5 mmol BOP, 0.5 mmol HOBt, 1.5 mmol DIEA og 0.5 mmol H-Thr(Bzl)-NH-CH2-CH2CH(Ph)2 HC1 i 1.5 mol DMF i 2 timer. Etter fjerning av Fmoc ble Alloc-pAph-OH tilkoblet ifølge den generelle fremgangsmåte i eksempel 1. Peptidet ble avkløyvet og avbeskyttet med

TFA/tioanisol (95/5) i 1.5 timer og viderebehandlet som beskrevet i eksempel 1. Råforbindelsen ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 805.0, beregnet 805.4.

Eksempel 17: Syntese av Alloc-pAph-Glu-Dab-NH-CH2-CH2-Ph

0.2 g TentaGel S NH2-resin (substitusjonsgrad 0.26 mmol/g), 4-hydroksymetyl-fenoksyedikksyre ble tilkoblet (2.5 ekv., aktivert med DIC/HOBt i 4 timer). Hydroksygruppen ble substituert med brom ved behandling av resinet med Cbr4 (5 ekv.)/PPh3 (5 ekv.) i DCM i 4 timer. Det bromderivatiserte resin ble behandlet med en 2M løsning av fenyletylamin i DCM over natten. Fmoc-Dab(Boc)-OH ble koblet til resinet ved anvendelse av TFFH/DIEA (acylfluorid dannet in situ). Ifølge den generelle fremgangsmåte i eksempel 1 ble følgende beskyttede aminosyrer tilkoblet:Fmoc-Glu(OtBu)-OH og Alloc-pAph-OH. Peptidet ble avkløyvet og avbeskyttet med TFA/triisopropylsilan (99/1) i 2 timer. TFA ble avdampet og peptidet løst i H20/ACN og frysetørket. Råmaterialet ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 624.2, beregnet 624.3.

Eksempel 18: Syntese av Alloc-pAph-Glu-NH-CH2-CH2-CN

0. 2 g TentaGel S NH2-resin (substitusjonsgrad 0.26 mmol/g), 4-hydroksymetyl-fenoksyedikksyre ble tilkoblet (3 ekv., aktivert med DIC/HOBt i 1.5 timer). Fmoc-Glu(OH)-0-allyl ble koblet til resinet via sidekjeden ved anvendelse av DIC/HOBt/NMI i DMF over natten. Den beskyttende allylgruppe ble fjernet ved omrysting av resinet med Pd(PPh3)4 i DMF/AcOH/NMM (10/21/1) i 4 timer under argon. Den avbeskyttede karboksygruppe ble aktivert med DIC (3 ekv.)/HOBt (e ekv.) i 10 min. og 2-cyanoetylamin (3 ekv.) i DMF ble tilsatt til resinet i 3 timer. Etter fjerning av Fmoc ble Alloc-pAph-OH tilkoblet ifølge den generelle fremgangsmåte i eksempel 1. Peptidet ble avkløyvet og avbeskyttet med TFA/triisopropylsilan (99/1) i 2 timer. TFA ble avdampet og peptidet løst i H20/ACN og frysetørket. Råmaterialet ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 473.1, beregnet 473.2.

Eksempel 19: Syntese av Alloc-pAph-Glu-Asn-NH-CH2-Chx

0.1 g TentaGel S NH2 (substitusjonsgrad 0.26 mmol(g) Knorr amidlinker ble tilkoblet. Fmoc-Asp(OH)-0-allyl ble koblet til linkeren via sidekjeden og den beskyttende allyl-

gruppe fjernet som i eksempel 18. Den avbeskyttede karboksygruppe ble aktivert med DIC (5 ekv.), og cykloheksylmetylamin (5 ekv.) i DMF ble tilsatt i 2.5 timer. Etter fjerning av Fmoc ble Fmoc-Glu(OtBu)-OH og Alloc-pAph-OH tilkoblet ifølge den generelle fremgangsmåte i eksempel 1. Peptidet ble avkløyvet og avbeskyttet med TFA/triisopropylsilan (99/1) i 2 timer. TFA ble avdampet og peptidet løst i H20/ACN og frysetørket. Råmaterialet ble renset ved anvendelse av HPLC som beskrevet i eksempel 1 og karakterisert ved MS. (M+H)<+>: funnet 629.9, beregnet 630.3.

Eksempel 20: Syntese av Alloc-pAph-Glu-Asn-NH-CH2-CH2-Ph

2-(S)-[2-(S)-Allyloksykarbonylamino-3-(4-karbamimidoyl-fenyl)-propionylamino]-pentandionsyre-5-tert-butylester-1 -metylester-hydroklorid.

2-(S)-allyloksykarbonylamino-3-(4-karbamimidoyl-fenyl)-propionsyre-hydroklorid (3.48 g, 10.6 mmol) og 2-(S)-amino-pentandionsyre-5-tert-butylester-l-metylester-hydroklorid (2.7 g, 10.6 mmol) i 20 ml DMF ble tilsatt TOTU (3.83 g, 11.67 mmol) og N-etylmorfolin (2.7 ml, 21.2 mmol) ved -15°C. Blandingen ble omrørt i 1 time og så

oppvarmet til romtemperatur. Etter inndamping ble etylacetat tilsatt til restmaterialet, og det organiske sjikt ble ekstrahert med vandig natriumhydrogenkarbonatløsning, kalium-hydrogensulfatløsning og vann. Det organiske sjikt ble inndampet. Utbytte: 2.8 g (50%). MS: m/z = 491.3 (M+H)<+>.

2-(S)-[2-(S)-AUyloksykarbonylamino-3-(4-karbamimidoyl-fenyl)-propionylamino]-pentandionsyre 5-tert-butylester.

2-(S)-[2-(S)-Allyloksykarbonylamino-3-(4-karbamimidoyl-fenyl)-propionylamino]-pentandionsyre 5-tert-butylester-l-metylester-hydroklorid (3.06 g, 5.8 mmol) i 100 ml vann og 30 ml THF ble tilsatt litiumhydroksid-hydrat (0.49 g, 11.6 mmol). Løsningen ble omrørt ved romtemperatur i 12 timer, inndampet og frysetørket. Restmaterialet ble renset ved kromatografi på Sephadex LH20 med n-butanol/iseddik/vann (17/1/2) som elueringsmiddel. Rene fraksjoner ble slått sammen. Løsemiddelet ble avdampet, restmaterialet løst i vann og den vandige løsning frysetørket. Utbytte: 2.7 g (97 %). MS: m/z = 477.4 (M+H)<+>.

4-(S)-[2-(S)-Allyloksykarbonylamino-3-(4-karbamimidoyl-fenyl)-propionylamino]-4-(2-karbamoyl-l-(S)-(2-fenyletylkarbamoyl)-etylkarbamoyl)-smørsyre-hydroklorid (Alloc-pAph-Glu-Asn-NH-CH2-CH2-Ph).

2-(S)-[2-(S)-allyloksykarbonylaminoO-(4-karbamimidoyl-fenyl)-propionylamin pentandionsyre-5-tert-butylester (49 mg, 0.1 mmol) og 2-(S)-amino-Nl-fenyletyl-suksinamid-hydroklorid (27 mg, 0.1 mmol) i 5 ml DMF ble tilsatt HATU (39 mg, 0.1 mmol) og kollidin (24.2 mg, 0.2 mmol) ved 0°C. Blandingen ble omrørt i 1 time og så oppvarmet til romtemperatur. Etter inndamping ble restmaterialet renset ved kromatografi på Sephadex LH20 med n-butanol/iseddik/vann (17/1/2) som elueringsmiddel. Rene fraksjoner ble slått sammen. Løsemiddelet ble inndampet, restmaterialet løst i vann og den vandige løsning frysetørket. Utbytte: 45 mg (66 %). MS: m/z = 638.4

(M+H)<+>.

Eksempel 21: Syntese av Alloc-pAph-Glu-Asn-NH-(3-klorbenzyl)

2-(S)-[2-(S)-allyloksykarbonylamino-3-(4-karbamimidoyl-fenyl)-propionylamino]-pentandionsyre-5-tert-butylester (50 mg, 0.105 mmol) og 2-(S)-amino-Nl-(3-klor-benzyl)suksinamid-trifluoracetat (61 mg, 0.16 mmol) i 5 ml DMF ble tilsatt TOTU (36 mg, 0.11 mmol) og N-etylmorfolin (57 ul, 0.4 mmol) ved 0°C. Blandingen ble omrørt i 1 time og så oppvarmet til romtemperatur. Etter inndamping ble restmaterialet renset ved kromatografi på Sephadex LH20 med n-butanol/iseddik/vann (17/1/2) som elueringsmiddel. Rene fraksjoner ble slått sammen. Løsemiddelet ble avdampet, restmaterialet løst i vann og den vandige løsning frysetørket. Utbytte av 4-(S)-[2-(S)-allyloksykarbonylamino-3-(4-karbamimidoyl-fenyl)-propionylamino]-4-(2-karbamoyl-l-(S)-(3-klorbenzylkarbamoyl)-etylkarbamoyl)-smørsyre (Alloc-pAph-Glu-Asn-NH-(3-klorbenzyl eller Alloc-pAph-Glu-Asn-3-klorbenzylamid): 28 mg (41 %). MS: m/z = 658.3 (M+H)<+>.

Videre eksemplariske forbindelser fremstilt på tilsvarende måte som i eksemplene ovenfor er angitt i tabell 2 ovenfor.

Eksempel 22: Bestemmelse av Ki for FVIIa-inhibering

Den inhiberende aktivitet (Ki) av hver forbindelse overfor faktor Vlla/vevsfaktor-aktiviteten ble bestemt ved anvendelse av en kromogen analyse, i det vesentlige som beskrevet tidligere (J.A. Ostrem, F. Al-Obeidi, P. Safar, A. Safarova, S.K. Stringer, M. Patek, M.T. Cross, J. Spoonamore, J.C. LoCascio, P.Kaireddy, D.S. Thorpe, N. Sepetov, M. Lebl, P. Wildgoose, P. Strop, Discovery of a novel, potent, and spesific family of factor Xa inhibitors via combinatorial chemistry. Biochemistry 37 (1998) 1053-1059). Kinetiske analyser ble utført ved 25°C i halve mikrotiterplater (Costar Corp., Cambridge. MA) ved anvendelse av en kinetisk plateleser (Molecular Devices Pectramax 250). En typisk analyse besto av 25 ul human faktor Vila og TF (5 nM hhv.

10 nM, sluttkonsentrasjon) sammenblandet med 40 fil av fortynninger av inhibitor i

10 % DMSO/TBS-PEG-buffer (50 mM Tris, 15 mM NaCl, 5 mM CaCl2; 0.05 % PEG 8k, pH 8.15). Etter 15 minutters preinkubering ble analysen startet ved tilsetning av 35 ul av det kromogene substrat S-2288 (D-Ile-Pro-Arg-pNA, Pharmacia Hepar Inc. 500 uM sluttkonsentrasjon). Tilsynelatende inhibisjonskonstanter ble beregnet fra helningsvinkelen til forløpskurvene under den linære del av tidforløpet, typisk mellom 1 og 5 minutter etter tilsetning av substrat til analysen. Sanne Ki-verdier ble deretter bestemt for hver forbindelse ved å korrigere for substratkonsentrajon (S) og Km ved anvendelse av formelen Ki=Ki app/(l + (S)/Km) ().H. Segal, Enzyme Kinetics, s. 100-125 (John Wiley og Sons, New York, 1975)).

v

Claims (6)

1. Forbindelse, karakterisert ved at den har formelen 1 hvori RI er allyloksykarbonyl eller allylaminokarbonyl, A er en (L)-4-amidinofenylalaninrest, B er en (L)-glutaminsyrerest eller et farmasøytisk aksepterbart salt eller en ester av (L)-glutaminsyre, D er en rest utvalgt fra gruppen som består av Arg, Dap, Dab, Orn, Lys, Dap[- C(=NH)-NH2], Dab[-C(=NH)-NH2], Lys[-C(=NH)-NH2], Lys[-C(=NH)-CH3], Orn[-C(=NH)-CH3], Dab[-C(=NH)-CH3], Dap[-C(=NH)-CH3], Dab(Alloc), Asn, Gin, Met, Ser, Thr, Ser(Bzl), Thr(Bzl), Cys(Me), Cys(Bzl), Cys(Acm), Arg(N02), His, Trp, Phg, Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Phe(4-N02), Phe(4-NH-C(=NH)-NH2), 2-Abu, Ala(3-CN), Ala[3-C(=NH)-NH2], 2-Abu(4-CN) og 2-Abu[4-C(=NH)-NH2], n er null eller en, E er en rest utvalgt fra gruppen som består av Cha, Chg og Phe[4-C(-S-CH2-CH2- S-)-Ph], R2 er NHR22, R22 er hydrogen eller en rest utvalgt fra gruppen som består av benzyl, naftylmetyl, pyridylmetyl, fenyletyl, naftyletyl, pyridyletyl, fenylpropyl, naftylpropyl, pyridylpropyl, fluorenyl, difenylmetyl, difenyletyl og difenylpropyl, som enten er ikke-substituerte eller substituert med substituenter utvalgt fra gruppen som består av F, Cl, Br, hydroksy, metoksy, metylendioksy, nitro, cyano, di(Ci-C6)-alkylamino, (Ci-C6)-alkylsulfonyl aminosulfonyl og trifluormetyl, i alle dens stereoisomere former eller en blanding av disse i ethvert forhold, eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav.

2. Forbindelse med formel I ifølge krav 1, karakterisert ved at den er Alloc-pAph-Glu-Arg-Cha-NH2, Allylaminokarbonyl-pAph-Glu-Arg-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Arg-Chg-NH2, Alloc-pAph-Glu-Dap[-C(=NH)-NH2]-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Ala[3-C(=NH)-NH2]-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Asn-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Dab-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Dap[-C(=NH)-NH2]-NH2, Alloc-pAph-Glu-Gly-Cha-NH2, AUoc-pAph-Glu-Thr(Bzl)-NH-(CH2)2-CH(Ph)2, Alloc-pAph-Glu-Dab-NH-(CH2)2-Ph, Alloc-pAph-Glu-Asn-NH-CH2-Chx, Alloc-pAph-Glu-Dap[-C(=NH)-CH3]-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Dab[-C(=NH)-NH2]-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-2-Abu(4CN)-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Ala(3CN)-Cha-NH2, Alloc-p Aph-Glu-Asn-1 -naftylmetylamid, Alloc-pAph-Glu-Asn-1 -(1 -naftyl)etylamid, Alloc-pAph-Glu-Asn-2-naftylmetylamid, Alloc-pAph-Glu-Asn-3,4-diklorbenzylamid, Alloc-pAph-Glu-Asn-2-(3-klorfenyl)etylamid, Alloc-p Aph-Glu-Arg(N 02)-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Cys(Bzl)-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Trp-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Phg-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Asn-9-fluorenylamid, Alloc-pAph-Glu-Dap[-C(=NH)-NH2]-Phe[4-C(S-(CH2)2-S-)-Ph]-NH2, Alloc-pAph-Glu-Cys(Bzl)-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Thr(Bzl)-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Phe(4-N02)-Cha-NH2, Alloc-pAph-Glu-Asn-3,4-metylendioksybenzylamid, Alloc-pAph-Glu-Asn-2-(2-naftyl)etylamid, Alloc-p Aph-Glu-Asn-2-( 1 -naftyl)etylamid, Alloc-pAph-Glu-Asn-2-(2-pyridyl)etylamid, Alloc-pAph-Glu-Asn-2,2-difenyletylamid, Alloc-p Aph-Glu-Asn-2,4-difluorbenzylamid, eller Alloc-pAph-Glu-Asn-4-dimetylaminobenzylamid, eller et farmasøytisk aksepterbart salt, amid eller en ester derav.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge krav 1 til 2, karakterisert ved at den omfatter: al) kobling av en forbindelse med formelen Fmoc-En-OH, hvori n er en, til en syresensitiv linker koblet til et resin, avspaltning av beskyttelsesgruppen Fmoc, kobling av en forbindelse med formelen Fmoc-Dl-D2-C(0)OH til den erholdte frie aminogruppe, og igjen avspaltning av beskyttelsesgruppen Fmoc, eller for fremstilling av en forbindelse med formel I i hvilken n er null, kobling av en forbindelse med formel Fmoc-Dl-D2-C(0)OH til en syresensitiv linker koblet til et resin og avspaltning av beskyttelsesgruppen Fmoc, a2) kobling av en forbindelse med formel Fmoc-B l-B2-C(0)OH til den frie aminogruppe erholdt i trinn al) og avspaltning av beskyttelsesgruppen Fmoc, a3) kopling av en forbindelse med formel Rl-Al-A2-C(0)OH til den frie aminogruppe erholdt i trinn a2), og a4) spaltning av forbindelsen erholdt ifølge trinnene al) til a3) fra resinet ved hjelp av trifluoreddiksyre, eller bl) kobling av karboksylgruppen i sidekjeden i en forbindelse med formel Fmoc-B 1 - CHR97-C(0)OPG, hvori R97 er 2-hydroksykarbonyletyl og PG er en beskyttelsesgruppe, til en syresensitiv linker av benzylalkoholtype koblet til et aminofunksjonalisert resin, v b2) avspaltning av beskyttelsesgruppen PG, b3) kobling av en forbindelse med formel H2N-D2-D3-En-R2, hvori n er null, en, to eller tre, til den frie karboksylsyre erholdt i trinn b2), b4) avspaltning av beskyttelsesgruppen Fmoc, b5) kobling av en forbindelse med formelen Rl-Al-A2-C(0)OH til den frie aminogruppe erholdt i trinn b4), og b6) avspaltning av forbindelsen erholdt ifølge trinnene bl) til b5) fra resinet ved hjelp av trifluoreddiksyre, eller cl) kobling av beskyttede aminogrupper ved tradisjonelle medisinsk-kjemiske fremgangsmåter og avbeskyttelse av målmolekylet ved standard fremgangsmåter som er kjente innen faget, hvori RI, R2, Al, A2, Bl, Bl, Dl, D2, D3 og E er som definert i kravene 1 til 2 og Fmoc er 9-fluorenylmetyloksykarbonyl

4. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 eller 2 eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav som et farmasøytisk middel.

5. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en effektiv mengde av en forbindelse ifølge ett eller flere av kravene 1 til 2, eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav, og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff.

6. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 eller 2, eller et farmasøytisk aksepterbart salt derav for fremstilling av et preparat for inhibering eller reduksjon av blodkoagulasjon, en inflammatorisk respons, tromboemboliske sykdommer eller vaskulær restenose.