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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zur Behandlung
und Vorbeugung von Krankheiten, die auf eine Öffnung von Kaliumkanälen ansprechen,
Peptide mit Kaliumkanal öffnenden
Aktivitäten,
und solche Peptide umfassende pharmazeutische Zubereitungen und
Kits.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Kalium
(K+)-Kanäle
sind wichtige Regulatoren zahlreicher biologischer Prozesse, einschließlich sekretorischer
Prozesse, der Muskelkontraktion und des post-ischämischen
Schutzes des Herzens. Elektrophysiologische Untersuchungen zeigten
das Vorliegen von Kaliumkanälen
in fast allen Zelltypen. Gopalakrishnan et al., Drug Dev. Res. 28:95–127 (1993).
Solche Kanäle
liegen in verschiedenen Formen vor, die im Allgemeinen über ihre
jeweiligen strukturellen, biophysikalischen und pharmakologischen
Eigenschaften unterscheidbar sind. Id. Es ist allgemein bekannt,
dass die Öffnung
von Kaliumkanälen
in elektrisch erregbaren Zellen mit solchen Kanälen zu einem gesteigerten Fluss
von Kaliumionen aus dem Inneren der Zelle zur Außenseite der Zelle führt. Dieser
Fluss von Kaliumionen verursacht eine messbare Änderung des Ruhepotentials
der Zelle und führt
zu einer Membranhyperpolarisierung und zur Relaxation der Zelle.
Eine Aktivierung von Kaliumkanälen
stabilisiert das Zellmembranpotential und verringert im Allgemeinen
die Erregbarkeit der Zelle.
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Kaliumkanäle wurden
mit vielen Krankheiten, einschließlich kardiovaskulären Krankheiten,
Asthma, Hypertension, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit,
Diabetes, Epilepsie, hohem Blutdruck und Ernährungs- und Appetitstörungen in
Verbindung gebracht. Man nimmt allgemein an, dass die Fehlfunktion
dieser Kaliumkanäle
oder das Vorliegen von Regulationsdefekten in Prozessen, welche
solche Kaliumkanäle
aktivieren, eine wichtige Rolle bei der Pathogenese solcher Krankheiten
und Krankheitszuständen
spielt. Folglich können
Verbindungen, die zur Öffnung
von Kaliumkanälen
und somit zur Modulation des elektrophysiologischen Arbeitens der
Zellen beitragen, ein wichtiges therapeutisches und prophylaktisches
Potential für
die Behandlung oder Linderung solcher Zustände, haben.
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Kaliumkanal öffnende
Verbindungen weisen vielfältige
biologische und pharmakologische Wirkungen auf. Gegenwärtig bekannte
Kaliumkanal öffnende
Verbindungen umfassen Cromakalim, Pinacidil (US-Patent Nr. 4,057,636)
und Nicorandil (US-Patent Nr. 4,200,640). Man nimmt an, dass diese
Verbindungen ihre Wirkungen vorwiegend über die ATP-sensitiven Kaliumkanäle ausüben. Sie
weisen eine hohe Affinität
für glatte Gefäßmuskelzellen
auf und sind durch ihre Fähigkeit
charakterisiert, glatte Gefäßmuskeln
erschlaffen zu lassen. Escande et al., Trends in Pharm. Sci. 23:
269–727
(1992). Beispielsweise wurde festgestellt, dass Cromakalim die Hyperpolarisierung
glatter Gefäßmuskelgewebe
induziert, die Erschlaffung von Gefäßen bewirkt, und die Wirkungen von
ischämischem
Schaden auf das Myokard verringert. Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 257:
156–162
(1991). Cromakalim scheint auch ein wirksamer chemotherapeutischer
Wirkstoff für
Herzrhythmusstörungen
und Reizdarm zu sein, die beide mit einer Kaliumkanalaktivierung
in Zusammenhang stehen. Zusätzlich
wurde festgestellt, dass Cromakalim vorzeitige Uterus-Kontraktionen
inhibiert, wenn es in Kombination mit Östrogen und Relaxin verwendet
wird. Downing et al., J. Endocrinol. 135: 29 (1992). Von Pinacidil
wurde gezeigt, dass es präkapillare
Gefäße erweitert
und glatten Muskel erschlaffen lässt.
Nielsen-Kudsk et al., Europ. J. Pharmac. 157: 221–226 (1988).
Es wurde gezeigt, dass Cromakalim und Pinacidi das Ausmaß ischämischer
Verletzung des Myokards verringern. Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 251:
98–104
(1989). Es wurde beobachtet, dass bestimmte Kaliumkanal öffnende
Substanzen, einschließlich
Cromakalim, auf tracheale glatte Muskelzellen wirken und anti-asthmatische
Wirkungen hervorrufen. Dilly, „Cromakalim/Lemakalim,
Experience in Hypertension and Nocturnal Asthma" in Conference Documentation, Potassium
Channels '90, The
Royal College of Physicians, 6.–7.
Dec. 1990. Siehe auch Small et al., Braz. J. Med. Biol. Res. 25(10):
983–998.
Diese Wirkung steht in Zusammenhang mit einer Membranhyperpolarisierung
in Richtung des Kaliumgleichgewichtspotentials und mit der Steigerung
des Ausströmens
von Kaliumionen aus den Muskelzellen. Id. Weiterhin wurde gezeigt,
dass einige Kaliumkanal öffnende
Substanzen neuronale Zellen hyperpolarisieren und anti-epileptische
und antikonvulsive Wirkungen besitzen. Siehe z.B. Gandolfo et al.,
Europ. J. Pharmac. 167: 181–83
(1989); Abele et al., Neuroscience Letters 115: 195–200 (1990).
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Unglücklicherweise
rufen die gegenwärtig
bekannten Kaliumkanal öffnenden
Substanzen typischerweise ernsthafte Nebenwirkungen (einschließlich schwerer
Kopfschmerzen, Flüssigkeitsretention
und Reflextachykardie) bei den Individuen hervor, denen sie verabreicht
werden. Darüber
hinaus sind viele der bekannten Kaliumkanal öffnenden Substanzen instabil,
und deren pharmakologische Wirkungen unterliegen Schwankungen und
sind schwierig zu reproduzieren. Kidney et al., Thorax 48: 130–133 (1993).
Folglich ist die therapeutische und prophylaktische Brauchbarkeit
gegenwärtig
bekannter Kaliumkanal öffnender
Substanzen begrenzt.
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Es
besteht ein Bedarf für
Verbindungen mit Kaliumkanal öffnender
Aktivität,
die ihre jeweiligen therapeutischen und prophylaktischen Wirkungen
mit geringen oder ohne toxische Nebenwirkungen ausüben. Die vorliegende
Erfindung befriedigt dieses und weitere Bedürfnisse.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die prophylaktische oder
therapeutische Behandlung von Krankheiten bereit, die auf die Öffnung von
Kaliumkanälen
in Individuen ansprechen, welche einer solchen Behandlung bedürfen. Diese
Verfahren umfassen die Verabreichung einer wirksamen Menge eines
erfindungsgemäßen Peptids
an ein Individuum, das einer solchen Behandlung bedarf. Die erfindungsgemäßen Peptide umfassen
L-Glycyl-L-Glutaminsäure
(L-Gly-L-Glu), L-Valin-L-Threonin (L-Val-L-Thr), Polymere von L-Gly-L-Glu
und L-Val-L-Thr, welche nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassen und Kombinationen
davon, und pharmazeutisch annehmbare Salze davon. Die bevorzugten
erfindungsgemäßen Peptide
umfassen L-Gly-L-Glu und L-Val-L-Thr. Die erfindungsgemäßen Verfahren
sind brauchbar für
die prophylaktische oder therapeutische Behandlung einer Vielzahl
von Krankheiten, die auf Kaliumkanal aktivierende Eigenschaften ansprechen
und gegenüber
solchen Eigenschaften sensitiv sind.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung stellt Verfahren für die prophylaktische oder
therapeutische Behandlung kardiovaskulärer Krankheiten für Individuen
bereit, die einer solchen Behandlung bedürfen. Solche Verfahren umfassen
die Verabreichung einer wirksamen Menge eines oben beschriebenen,
erfindungsgemäßen Peptids
an ein Individuum.
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Die
Erfindung stellt auch Verfahren zur Induktion der Erschlaffung glatter
Muskeln bei Patienten bereit, die einer solchen Erschlaffung bedürfen. Diese
Verfahren umfassen die Verabreichung einer wirksamen Menge eines
erfindungsgemäßen Peptids
wie oben beschrieben an das Individuum.
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Ein
weiterer Aspekt stellt Verfahren zur Induktion der Erschlaffung
von Skelettmuskelns bei Patienten bereit, die einer solchen Erschlaffung
bedürfen.
Diese Verfahren umfassen die Verabreichung einer wirksamen Menge
eines erfindungsgemäßen Peptids
wie oben beschrieben an das Individuum.
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Die
Erfindung stellt weiterhin pharmazeutische Zubereitungen in Einheitsdosisform
bereit, welche pro Einheitsdosis einen pharmazeutisch annehmbaren
Träger
und einen Bereich von etwa 0,01 mg bis etwa 1000 mg L-Gly-L-Glu
oder L-Val-L-Thr oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon
umfassen. Ein bevorzugter Aspekt der Erfindung stellt pharmazeutische
Zubereitungen in Einheitsdosisform bereit, welche pro Einheitsdosis
einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und einen Bereich von etwa
1 mg bis etwa 100 mg L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr oder eines pharmazeutisch
annehmbaren Salzes davon umfassen.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung stellt Peptidpolymere bereit, welche
wenigstens zwei Dipeptide umfassen, worin jedes der Dipeptide des
Polymers L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr ist.
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Ein
noch weiterer Aspekt der Erfindung stellt Verfahren zur Konservierung
lebender Gewebe oder Organe bereit. Diese Verfahren umfassen das
Inkontaktbringen des Gewebes oder Organs mit einer Zubereitung,
welche einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine wirksame Menge
eines Peptids umfasst, worin das Peptid L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
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Die
Erfindung stellt weiterhin Kits zur Konservierung lebender Gewebe
oder Organe bereit. Solche Kits umfassen eine wirksame Menge eines
Peptids, worin das Peptid L-Gly-L- Glu oder L-Val-L-Thr oder ein pharmazeutisch
annehmbares Salz davon ist, und einen Behälter für das lebende Gewebe.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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I. DEFINITIONEN
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Soweit
nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen
und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, die vom Durchschnittsfachmann
auf dem Fachgebiet, zu welchem diese Erfindung gehört, üblicherweise
unterstellt wird. Die folgenden Literaturnachweise liefern dem Fachmann
eine allgemeine Definition vieler Begriffe, die in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY
AND MOLECULAR BIOLOGY (2. Aufl. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY
OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Hrsg.: Walker, 1988); und Hale & Marham, THE HARPER
COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991). Die folgenden Begriffe haben
hier, soweit nicht anders bestimmt, die ihnen zugewiesene Bedeutung.
Wenngleich beliebige Verfahren und Materialien, die den hier beschriebenen ähnlich oder gleichwertig
sind, bei der Durchführung
oder dem Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden
die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe nachfolgend
definiert.
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Die
Begriffe „Kaliumkanal öffnende
Substanz" und „Kaliumkanal öffnende
Aktivität" beziehen sich im Allgemeinen
auf einen erhöhten
Strom von Kaliumionen aus dem Inneren einer elektrisch erregbaren
Zelle zum Äußeren der
Zelle über
eine Membran der Zelle, welche wenigstens einen Kaliumkanal aufweist.
Kaliumkanal öffnende
Aktivität
kann beobachtet werden, indem ein Anstieg des Stroms von Kaliumionen
aus dem Inneren der Zelle zur Außenseite der Zelle über einen
Kaliumkanal in der Zellmembran gemessen wird.
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Der
Begriff „kardiovaskuläre Krankheit" bedeutet im Allgemeinen
Krankheiten und pathologische Zustände, die sich auf das Herz
oder auf Blutgefäße beziehen
oder das Herz oder Blutgefäße einbeziehen.
Beispiele kardiovaskulärer
Krankheiten umfassen alle Formen ischämischer Herzerkrankungen, Herzdysrhythmien
und Herzrhythmusstörungen,
kongestiver Herzinsuffizienz und hypertensiver Krankheit, die in
International Classification of Diseases, Bd. 9, Clinical Modification,
Easy Coder (1997) („ICD
9 CM") aufgeführt sind,
ebenso wie alle kardiovaskulären
Krankheiten, die auf eine Erweiterung der Blutgefäße ansprechen
oder dafür
sensitiv sind, und alle kardiovaskulären Erkrankungen, die in E.
Braunwald, HEART DISEASE. A TEXTBOOK OF CARDIOVASCULAR MEDICINE
(3. Aufl. 1988) beschrieben sind.
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Der
Begriff "pharmazeutisch
annehmbares Salz" bezieht
sich auf nicht-toxische Säureadditionssalze, einschließlich mit
anorganischen Säuren
gebildete Salze, wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und
Perchlorsäure,
und mit organischen Säuren
gebildete Salze, wie beispielsweise Essigsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Citronensäure, Bernsteinsäure oder Malonsäure. Weitere
pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen anorganisches Nitrat, Sulfat,
Acetat, Malat, Formiat, Lactat, Tartrat, Succinat, Citrat, p-Toluolsulfonat,
und dergleichen, einschließlich,
ohne darauf beschränkt
zu sein, Kationen auf der Grundlage der Alkali- und Erdalkalimetalle,
wie beispielsweise Natrium, Lithium, Kalium, Kalzium, Magnesium
und dergleichen, ebenso wie nicht-toxische Ammonium-, quaternäre Ammonium-
und Aminkationen, einschließlich,
ohne darauf beschränkt
zu sein, Ammonium, Tetramethylammonium, Tetraethylammonium, Methylamin,
Dimethylamin, Trimethylamin, Triethylamin, Ethylamin und dergleichen.
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Der
Begriff „pharmazeutische
Zubereitung" bedeutet
eine Zubereitung, die für
eine pharmazeutische Anwendung bei einem Individuum, einschließlich eines
Tieres oder eines Menschen, geeignet ist. Eine pharmazeutische Zubereitung
umfasst im Allgemeinen eine wirksame Menge eines aktiven Wirkstoffes
und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
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Der
Begriff „pharmazeutisch
annehmbarer Träger" umfasst jeden der üblichen
pharmazeutischen Träger,
Puffer und Exzipienten, einschließlich phosphatgepufferter Kochsalzlösung, Wasser,
und Emulsionen (wie beispielsweise Öl/Wasser- oder Wasser/Öl-Emulsion), und verschiedene
Arten von Benetzungsmitteln und/oder Adjuvantien. Geeignete pharmazeutische
Träger
und deren Formulierungen sind beschrieben in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL
SCIENCES (Mack Publishing Co., Easton, 19. Aufl. 1995). Bevorzugte pharmazeutische
Träger
hängen
von der beabsichtigten Verabreichungsart des aktiven Wirkstoffs
ab. Typische Verabreichungsarten sind unten beschrieben.
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Der
Begriff „wirksame
Menge" bedeutet
eine Dosierung, welche ausreichend ist, um ein gewünschtes Ergebnis
hervorzurufen. Das gewünschte
Ergebnis kann eine subjektive oder objektive Verbesserung bei dem Empfänger der
Dosierung umfassen.
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Eine „prophylaktische
Behandlung" ist
eine Behandlung, die einem Individuum verabreicht wird, das keine
oder nur frühe
Zeichen einer Krankheit zeigt, wobei die Behandlung zum Zwecke der
Verringerung des Risikos für
die Entwicklung eines pathologischen Zustands durchgeführt wird.
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Eine „therapeutische
Behandlung" ist
eine Behandlung, die einem Individuum verabreicht wird, das pathologische
Zeichen zeigt, wobei die Behandlung zum Zwecke der Verringerung
oder Beseitigung dieser pathologischen Zeichen durchgeführt wird.
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Der
Begriff „Organ" bedeutet Körpersysteme,
wie beispielsweise das Herz, die Leber, die Lunge, die Niere, das
Gehirn, das adrenale System, das vaskulär-endotheliale System, das
Immunsystem, und dergleichen.
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Der
Begriff „Individuum" soll ein Tier, beispielsweise
ein Säugetier,
einschließlich
des Menschen, bedeuten. Nicht-menschliche, tierische Individuen
für die
Behandlung umfassen beispielsweise Fische, Vögel, und Säugetiere, wie beispielsweise
Kühe, Schafe,
Schweine, Pferde, Hunde und Katzen.
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Der
Begriff „Krankheit,
die auf Öffnung
von Kaliumkanälen
anspricht" bedeutet
einen pathologischen Zustand, eine Krankheit oder eine Störung, die
prophylaktisch oder therapeutisch auf die Aktivierung oder Öffnung von
Kaliumkanälen
in Zellen des Zielgewebes anspricht, dafür sensitiv ist oder damit assoziiert
ist.
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Der
Begriff „Hypoxie" bezieht sich auf
einen pathologischen Zustand, der auf einem Mangel in der Körpergewebe
erreichenden Sauerstoffmenge beruht.
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Der
Begriff „Anoxie" bezieht sich auf
einen pathologischen Zustand, der auf dem Fehlen von Sauerstoff beruht.
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II. ERFINDUNGSGEMÄSSE PEPTIDE
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A. Allgemeine Eigenschaften
und Verwendungen
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine neue Klasse regulatorischer
Peptide, die sich durch ihre Fähigkeit
zur Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten auszeichnen, welche
auf die Öffnung
von Kaliumkanälen
ansprechen oder dafür
sensitiv sind, oder mit der Kaliumkanalaktivierung assoziiert sind.
Wie oben angemerkt, liegen Kaliumkanäle in fast allen Zelltypen
vor, einschließlich
myokardialer Zellen, glatter Muskelzellen, Skelettmuskelzellen,
beta-Zellen des Pankreas, sekretorischer Zellen, neuraler Zellen
und Gehirnzellen, und dergleichen, und sind am korrekten Arbeiten
der meisten Zellen beteiligt. Man nimmt an, dass der Wirkungsmechanismus
der erfindungsgemäßen Peptide
die Aktivierung der in den Membranen solcher Zellen befindlichen
Kaliumkanäle
beinhaltet.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
zeigen im Allgemeinen die biologischen und pharmakologischen Aktivitäten bekannter
Kaliumkanal öffnender
Verbindungen und sind somit brauchbar bei der Behandlung von Krankheiten,
die häufig
mit bekannten Kaliumkanal öffnenden
Substanzen behandelt werden. Beispielsweise weisen die erfindungsgemäßen Peptide
die gemeinsame Eigenschaft der Induktion der Erschlaffung glatter Muskeln
auf, eine charakteristische Eigenschaft bekannter Kaliumkanal öffnender
Substanzen. Diese Peptide verringern und inhibieren die Kontraktionsaktivität einer
Reihe glatter Muskelgewebe, einschließlich intestinaler, vaskulärer, trachealer,
bronchialer glatter Muskeln und glatter Muskeln des Uterus. Aus
diesem Grund sind die erfindungsgemäßen Peptide brauchbar für die Behandlung
und Vorbeugung von Störungen,
deren Linderung oder Vorbeugung durch die Erschlaffung glatter Muskeln
möglich
ist. Da die erfindungsgemäßen Peptide intestinale
glatte Muskeln erschlaffen lassen, sind sie beispielsweise für die Behandlung
und Vorbeugung hyperreaktiver Störungen
des Darms, beispielsweise Reizdarm, brauchbar.
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Da
sie eine Erschlaffung intestinaler glatter Muskeln bewirken, induzieren
die erfindungsgemäßen Peptide
wie auch bekannte Kaliumkanal öffnende
Verbindungen weiterhin eine Erweiterung von Blutgefäßen. Siehe
z.B. Guermonprez et al., Eur. Heart J.: 14 (Suppl. B): 30–34 (1993).
Die Erweiterung von Blutgefäßen ruft
typischerweise eine Erhöhung
des Blutvolumens hervor, das durch ein Gefäß fließt und/oder eine Verringerung
des Blutdrucks in dem Gefäß. Durch
ihre Blutgefäß erweiternden
Wirkungen sind die erfindungsgemäßen Peptide
brauchbar bei der prophylaktischen und therapeutischen Behandlung
von Krankheiten, die auf eine Erweiterung von Blutgefäßen ansprechen
oder dafür
sensitiv sind, beispielweise solchen Krankheiten, die durch Verringerung
des Blutdrucks in Gefäßen oder
Steigerung des durch Gefäße fließenden Blutvolumens behandelt
werden können.
Die erfindungsgemäßen Peptide
sind beispielsweise brauchbar für
die Behandlung und Vorbeugung von Hypertension, die durch abnormal
hohen, arteriellen Blutdruck gekennzeichnet ist, weil sie eine Erweiterung
von Blutgefäßen fördern und
den Blutdruck senken. Da sie den Blutstrom verbessern, sind die
erfindungsgemäßen Peptide
in ähnlicher
Weise brauchbar für
die Behandlung und Vorbeugung von Angina pectoris, einem schweren
paroxysmalen Schmerz in der Brust, der mit einer unzureichenden
Blutversorgung des Herzens assoziiert ist.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
weisen weiterhin anti-ischämische
und Herz schützende
Eigenschaften auf, welche typischerweise bei bekannten Kaliumkanal öffnenden
Substanzen zu beobachten sind, und sind folglich brauchbar als anti-ischämische und
Herz schützende
Wirkstoffe. Es ist allgemein bekannt, dass Kaliumkanäle in Herzzellen
vorliegen und dass die Aktivierung solcher Kanäle zu einer Membranhyperpolarisierung
und einer Verkürzung
der Dauer von Aktionspotentialen führt. Siehe z.B. Gopalakrishnan
et al., supra; Grover et al., Europ. J. Pharmac. 191: 11–18 (1990);
Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 251: 98–104 (1989);
Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 257:
156–162
(1991). Für
bekannte Kaliumkanal öffnende
Substanzen wurde gezeigt, dass sie myokardiale Ischämie verringern
und gegen Ischämie schützen (d.h.
Herz schützende
Wirkungen ausüben).
Siehe z.B. Guermonprez, supra. Man nimmt an, dass die Aktivierung
von Kaliumkanälen
in Herzgewebe durch Kaliumkanal öffnende
Substanzen, die durch Ischämie
induzierte Depolarisierung und den Reperfusionsschaden verringert
oder umkehrt, möglicherweise über Membranhyperpolarisierung
(d.h. Erhöhung
des Ruhepotentials von Zellen hin zu prä-ischämischen Graden) und eine Verringerung
des zellulären
Kalziumioneneinstroms. Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 251:
98–104
(1989); Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 257: 156–162 (1991).
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In
der vorliegenden Erfindung verringern die erfindungsgemäßen Peptide
signifikant die Wirkungen von ischämischem Schaden in myokardialem
Gewebe, stellen die Kontraktilität
des Herzmuskels nach Ischämie
wieder her und sichern und schützen
das myokardiale Gewebe vor weiterem Schaden durch Ischämie. Die
erfindungsgemäßen Peptide
wirken auch als Wirkstoffe gegen Rhythmusstörungen. Angesichts dieser Aktivitäten, die
bei bekannten Kaliumkanal öffnenden
Substanzen beobachtet werden, sind die erfindungsgemäßen Peptide
brauchbar bei der Behandlung und Vorbeugung einer Vielzahl kardiovaskulärer Krankheiten,
die auf eine Aktivierung von Kaliumkanälen ansprechen, einschließlich ischämischer
Herzerkrankung, Herzrhythmusstörungen,
kongestiver Herzinsuffizienz, Schlaganfall und Angina pectoris.
Siehe z.B. Guermonprez, supra.
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Sowie
es auch bekannte Kaliumkanal öffnende
Wirkstoffe tun, führen
die erfindungsgemäßen Peptide weiterhin
zur Erschlaffung glatter Muskeln der Atemwege (z.B. trachealer glatter
Muskeln) und weisen bronchodilatorische Wirkungen auf (d.h. erhöhen den
Durchmesser des Bronchus oder der Bronchialröhre). Folglich sind sie nützlich für die Behandlung
oder Linderung bestimmter trachealer und bronchialer Störungen,
einschließlich
Bronchialasthma, bronchospastischer Störungen und bronchospastischen
Syndroms. Siehe z.B. Small et al., Braz. J. Med. Biol. Res. 25(10):
983–998.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
sind weiterhin nützlich
bei der Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten des Gehirns, die
mit einer Kaliumkanalaktivierung assoziiert sind. Es wurde gefunden,
dass bekannte Kaliumkanal öffnende
Substanzen Kaliumkanäle
in Gehirnzellen aktivieren, wodurch sie die neuronale Erregbarkeit
dieser Zellen verringern und zu antikonvulsiven Wirkungen auf solche
Zellen führen.
Dementsprechend wird angenommen, dass die erfindungsgemäßen Peptide
für die
Behandlung und Vorbeugung neurodegenerativer Erkrankungen brauchbar
sind, welche mit einer Kaliumkanalaktivierung assoziiert sind oder
darauf ansprechen und/oder zelluläre Erregbarkeit oder Depolarisierung
und daraus entstehenden Schaden beinhalten. Solche neurodegenerativen
Erkrankungen umfassen beispielsweise Epilepsie, Anoxie (die durch
anfängliche,
kurze Hyperpolarisation und anschließende anhaltende Depolarisierung
von Zellen charakterisiert sein kann), Hypoxie, Krämpfe, Parkinson-Krankheit,
Alzheimer-Krankheit, und verschiedene Formen zerebraler Ischämie, einschließlich Schlaganfall
und Trauma. Siehe z.B. Gopalakrishnan et al., supra; Ben-Ari et
al., Neuroscience 37: 55–60
(1990); Gandolfo et al., supra; Ashford et al., Nature 370: 456–59 (August
11, 1994).
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Weitere
Krankheiten und Störungen,
die einer Behandlung durch die erfindungsgemäßen Peptide und Verfahren zur
Verwendung dieser Peptide zugänglich
sind, sind unten beschrieben.
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B. Repräsentative,
erfindungsgemäße Peptide
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Zunächst wurden
bestimmte erfindungsgemäße Peptide
aus einem als „Cardialin" bezeichneten myokardialen
Extrakt isoliert. Das Cardialin-Extrakt ist in der USSR Nr. 1,417,242
(1988) beschrieben. Es wurde gezeigt, dass dieser Extrakt chemisch
induzierter Kardiomyopathie vorbeugt (siehe USSR Nr. 2,007,157 (1992)),
von Infarkten herrührenden
Gewebeschaden verringert (Khavinson et al., Archive Pathologoy (USSR) 9:
27–31
(1989)) und die Erzeugung von Milchsäure in Herzmuskelschnitten
durch Verringerung der Succinatdehydrogenase-Aktivität verringert
(Khavinson et al., USSR Nr. 1,807,399 (1993)). Weiterhin wurde gezeigt, dass
Cardialin (alternativ auch als „Cordialin" bezeichnet) den Energiemetabolismus
myokardialer Zellen während
einer Hypoxie oder Ischämie
positiv beeinflusst. Pavlenko et al., Bull. Eksp. Biol. Med. (USSR)
112(7): 24–27
(1991); Pavlenko et al., Patol. Fiziol. Eksp. Ter. (Russia) 2: 20–24 (1992).
Cardialin-Extrakt kann auch die ATP-sensitiven Kaliumkanäle in Kardiomyocyten beeinflussen.
Babenko et al., Bull. Eksp. Biol. Med. (Russia) 114(7): 54–56 (1992).
In früheren
Untersuchungen war es jedoch nicht möglich zu bestimmen, ob diese Wirkungen
von Cardialin das Ergebnis eines spezifischen Wirkstoffs oder eines
nicht-spezifischen Insults waren.
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In
der vorliegenden Erfindung wurde Cardialin-Extrakt über Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)
fraktioniert, wobei die Aktivierung der Adenylatcyclase-Aktivität von Kardiomyocyten
als Screeningassay für
die Suche nach biologisch aktiven Fraktionen (wie unten in Beispiel
1 beschrieben) verwendet wurde. Isolierte, biologisch aktive Fraktionen
wurden auf ihren Peptidgehalt analysiert, wobei der Edman-Abbau
für die
Bestimmung der jeweiligen Aminosäuresequenzen
von Peptidfragmenten in den Fraktionen verwendet wurde. Anhand der
durch diese Verfahren erhaltenen Ergebnisse wurden synthetische
Kandidatenpeptide hergestellt und auf ihre jeweilige Fähigkeit
getestet, unter Verwendung von Radioimmunoassays die Kardiomyocyten-Adenylatcyclase-Aktivität bei isolierten
Kardiomyocyten zu stimulieren. Die synthetischen Peptide wurden
dann zusätzlich
auf pharmakologische Aktivität
(wie in den Beispielen 2 bis 9 unten ausgeführt) getestet.
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Vier
Peptide wurden über
diese Verfahren identifiziert. Diese Peptide umfassen die Dipeptide L-Gly-L-Glu
und L-Val-L-Thr, und die Tetrapeptide L-Gly-L-Glu-L-Gly-L-Glu und
L-Val-L-Thr-L-Val-L-Thr.
Man nimmt an, dass diese Peptide Kaliumkanäle in Zellmembranen, die Kaliumkanäle aufweisen,
aktivieren und öffnen.
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Gemäß einem
Aspekt der Erfindung sind die Peptide charakterisiert durch ihre
Fähigkeit
zur Aktivierung oder Öffnung
von Kaliumkanälen
in Zellen, die Kaliumkanäle
in ihren Zellmembranen aufweisen. Erfindungsgemäße Peptide bestehen im Allgemeinen
aus einer seriellen Anordnung von 16 oder weniger natürlich auftretenden
(nicht-derivatisierten) L-Aminosäureresten,
die über
Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Ein erfindungsgemäßes Peptid
besteht bevorzugt aus weniger als etwa 9 bis etwa 6 Aminosäureresten.
Noch bevorzugter besteht das Peptid aus nicht mehr als 5 Aminosäureresten.
Die Peptide weisen typischerweise ein Molekulargewicht von weniger
als etwa 4000 Dalton auf. Noch bevorzugter weisen diese Peptide
ein Molekulargewicht von weniger als etwa 2000 Dalton und besonders
bevorzugt von weniger als etwa 1000 Dalton auf.
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In
einem weiteren Aspekt umfassen die erfindungsgemäßen Peptide L-Gly-LGlu, L-Val-L-Thr, L-Gly-LGlu-L-Gly-L-Glu,
L-Val-L-Thr-L-Val-L-Thr, nicht mehr als 16 Aminosäurereste
umfassende Polymere von L-Gly-L-Glu, nicht mehr als 16 Aminosäurereste
umfassende Polymere von L-Val-L-Thr, und pharmazeutisch annehmbare
Salze davon. Gemäß den IUPAC-IUB-Empfehlungen,
die in Arch. Biochem. Biphys. 115: 1–12 (1966) veröffentlicht
wurden, werden L-Gly-L-Glu und L-Val-L-Thr durch GE bzw. VT dargestellt.
Diese Dipeptide können
von der Sigma Chemical Company (P.O. Box 14508, St. Louis, Missouri
63178-9916) bezogen werden.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung stellt Peptidpolymere bereit, welche
eine serielle Anordnung von 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 Dipeptiden von
L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr, oder jede Kombination davon enthalten,
oder pharmazeutisch annehmbare Salze solcher Polymere, wobei die
Dipeptide über
Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Die Polymere können wenigstens
zwei Dipeptide umfassen, worin jedes Dipeptid des Polymers L-Gly-L-Glu
oder L-Val-L-Thr
ist. Beispielsweise umfassen die erfindungsgemäßen Polymere die Tetrapeptide L-Gly-L-Glu-L-Gly-L-Glu,
L-Val-L-Thr-L-Val-L-Thr, L-Gly-L-Glu-L-Val-L-Thr und L-Val-L-Thr-L-Gly-L-Glu.
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Im
Blut oder in lebenden Geweben oder lebenden Organen werden Polymere
erfindungsgemäßer Peptide,
einschließlich
nicht mehr als 16 Aminosäurereste
umfassender Polymere von L-Gly-L-Glu, nicht mehr als 16 Aminosäurereste
umfassender Polymere von L-Val-L-Thr,
und von Polymeren, die L-Val-L-Thr und L-Gly-L-Glu umfassen und
nicht mehr als 16 Aminosäurereste
aufweisen, und Kombinationen davon, typischerweise enzymatisch in
ihre jeweiligen Dipeptide und Tetrapeptide verdaut. Man nimmt an,
dass die Dipeptide und Tetrapeptide, die aus solchen Polymeren durch
enzymatischen Verdau freigesetzt werden, die gleichen prophylaktischen
und therapeutischen Wirkungen ausüben wie die erfindungsgemäßen Dipeptide
und Tetrapeptide, einschließlich
der Dipeptide L-Gly-L-Glu und L-Val-L-Thr und aus Kombinationen
von L-Gly-L-Glu und L-Val-L-Thr gebildeter Tetrapeptide.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt sind die erfindungsgemäßen Peptide charakterisiert
durch Extrahierbarkeit aus dem Myokard bei einem sauren pH, der
einen Bereich von etwa 2 bis etwa 3,5 einschließt, und Isolierbarkeit daraus
in einem darin enthaltenen Volumen eines G-25 Superfein-Chromatographieharzes, durch
fehlende Wirkung auf eine durch eine hohe Kaliumchloridkonzentration
induzierte tonische Kontraktion einer Probe glatten Muskels, und
durch eine Molekülgröße von weniger
als etwa 15000 Dalton und ganz besonders bevorzugt weniger als etwa
5000 Dalton. Ein solches Peptid kann als ein „myokardiales Peptid" bezeichnet werden,
da es aus dem Myokard isoliert wird. Alternativ können die
erfindungsgemäßen Peptide
aus natürlich
vorkommenden Aminosäuren
synthetisiert werden und eine serielle Anordnung aus nicht mehr
als 16 L-Aminosäureresten
umfassen.
-
Obwohl
die erfindungsgemäßen Peptide
hauptsächlich
unter Verwendung der Begriffe „Peptid" oder „Peptide" beschrieben werden,
ist es für
den Fachmann nach Lesen der vorliegenden Beschreibung ersichtlich,
dass diese Begriffe auch Strukturanaloga und Derivate der oben beschriebenen
Peptide umfassen. Beispielsweise werden zusätzlich zu den oben beschriebenen
Peptiden, welche natürlich
vorkommende Aminosäuren
umfassen können,
auch Peptidomimetika der erfindungsgemäßen Peptide bereitgestellt.
Peptidanaloga werden üblicherweise
in der pharmazeutischen Industrie als Nicht-Peptidwirkstoffe benutzt,
die Eigenschaften aufweisen, welche analog sind zu denen der Template-Peptide.
Diese Arten von Nicht-Peptidverbindungen werden als „Peptidmimetika" oder als „Peptidomimetika" bezeichnet und normalerweise
mit Hilfe von computergestütztem
Molecular Modeling entwickelt. Fauchere, J., Adv. Drug Res. 15:29
(1986); Veber and Freidinger, TINS 392 (1985); und Evans et al.,
J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Peptidmimetika, die strukturell therapeutisch
oder prophylaktisch brauchbaren Peptiden ähneln, können verwendet werden, um eine
gleichwertige therapeutische oder prophylaktische Wirkung hervorzurufen.
Im Allgemeinen ähneln
Peptidomimetika strukturell einem Muster-Peptid (d.h. einem Peptid,
das eine biologische oder pharmakologische Aktivität aufweist),
beispielsweise einem natürlich
vorkommenden Peptid mit Kaliumkanal öffnender Aktivität, weisen
aber eine oder mehrere Peptidverknüpfungen auf, die gegebenenfalls
ersetzt sind durch eine Verknüpfung,
die ausgewählt
ist unter: -CH
2NH-, -CH
2S-,
-CH
2-CH
2-, -CH=CH-
(cis und trans), -COCH
2-, -CH(OH)CH
2-, und -CH
2SO-.
Solche Peptidomimetika können über dem
Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden und sind weiterhin
beschrieben in den folgenden Literaturstellen: Spatola, A.F. in
CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES, AND PROTEINS
267 (B. Weinstein, Hrsg., 1983), Spatola, A.F., Vega Data Bd. 1,
Ausgabe 3, „Peptide
Backbond Modifikations) (allgemeiner Übersichtsartikel); Morley,
J.S., Trends Pharm. Sci., Seiten 463–468 (1980) (allgemeiner Übersichtsartikel);
Hudson, D. et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 14: 177–185 (1979)
(-CH
2NH-, CH
2CH
2-); Spatola, A.F. et al., Life Sci. 38:
1243–1249
(1986) (-CH
2-S); Hann, M., J. Chem. Soc.
Perkin Trans. I 307-314 (1982) (-CH-CH-, cis und trans); Almquist,
R.G et al., J. Med. Chem. (1980) 23: 1392–1398 (-COCH
2);
Jennings-White, C. et al., Tetrahedron Lett. 23:2533 (1982) (-COCH
2-); Szelke, M. et al., Europäische Patentanmeldung
EP 45665 (1982) CA: 97:39405
(1982) (-CH(OH)CH
2-); Holladay, M.W. et
al., Tetrahedron Lett. 24: 4401–4404
(1983) (-C(OH)CH
2-); und Hruby, V.J. Life
Sci. 31: 189–199
(1982 (-CH
2-S-).
-
Peptidmimetika
können
gegenüber
Peptid-Ausführungsformen
wesentliche Vorteile aufweisen, einschließlich beispielsweise: wirtschaftlichere
Herstellung; höhere
chemische Stabilität;
bessere pharmakologische Eigenschaften (Halbwertszeit, Absorption,
Stärke,
Wirksamkeit, usw.); veränderte
Spezifität
(z.B. ein breites Spektrum biologischer Aktivitäten); verringerte Antigenizität; und andere
Vorteile.
-
Bei
einigen Anwendungen kann es auch wünschenswert sein, die erfindungsgemäßen Peptide
als markierte Einheiten bereitzustellen, d.h. kovalent angehängt an oder
verknüpft
mit einer nachweisbaren Gruppe, um die Identifizierung, den Nachweis
und die Quantifizierung des Peptids unter den jeweiligen Umständen zu
erleichtern. Diese nachweisbaren Gruppen können eine nachweisbare Proteingruppe
umfassen, z.B. ein Enzym, das in einem Assay nachgewiesen werden
kann, oder ein Antikörperepitop,
wie obenstehend in der Diskussion über Fusionsproteine beschrieben.
Alternativ kann die nachweisbare Gruppe aus einer Vielzahl weiterer
nachweisbarer Gruppen oder Markierungen ausgewählt werden, beispielsweise
Radiomarkierungen (z.B. 125I, 32P
oder 35S) oder einer chemilumineszenten
oder fluoreszenten Gruppe. In ähnlicher
Weise kann die nachweisbare Gruppe ein Substrat, ein Cofaktor, ein
Inhibitor oder ein Affinitätsligand
sein. Die Derivatisierung (z.B. das Markieren) von Peptidomimetika
sollte die gewünschte
biologische oder pharmakologische Aktivität des Peptidomimetikums nicht
wesentlich beeinflussen. Im Allgemeinen wird angenommen, dass Peptidomimetika
von erfindungsgemäßen Peptiden
eine nachweisbare biologische Aktivität aufweisen (z.B. die Fähigkeit, Kaliumkanäle zu aktivieren
und zu öffnen).
-
Ein
pharmazeutisch annehmbares Salz eines erfindungsgemäßen Peptids
kann über übliche Verfahren
aus einem Peptid (oder dessen Analogon) einfach hergestellt werden.
Beispielsweise kann ein solches Salz hergestellt werden, indem man
das Peptid mit einer wässrigen
Lösung
des gewünschten,
pharmazeutisch annehmbaren Metallhydroxids oder einer anderen metallischen
Base behandelt und die erhaltene Lösung dann bis zur Trockne verdampft,
vorzugsweise unter verringertem Druck in einer Stickstoffatmosphäre. Alternativ
kann eine Lösung
eines Peptids mit einem Alkoxid des gewünschten Metalls gemischt und
die Lösung anschließend bis
zur Trockne verdampft werden. Die pharmazeutisch annehmbaren Hydroxide,
Basen und Alkoxide umfassen für
diesem Zweck solche mit Kationen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein,
Kalium, Natrium, Ammonium, Kalzium und Magnesium. Weitere beispielhafte,
pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen Hydrochlorid, Hydrobromid,
Sulfat, Bisulfat, Acetat, Oxalat, Valerat, Oleat, Laurat, Borat,
Benzoat, Lactat, Phosphat, Tosylat, Citrat, Maleat, Fumarat, Succinat,
Tartrat und dergleichen.
-
Es
kann wünschenswert
sein, die erfindungsgemäßen Peptide
und deren Analoga oder Derivate zu stabilisieren, um deren Lagerfähigkeit
und pharmakokinetische Halbwertszeit zu erhöhen. Die Lagerfähigkeitsstabilität wird verbessert
durch Zugabe von Exzipienten wie beispielsweise: a) hydrophoben
Mitteln (z.B. Glycerin); b) Zuckern (z.B. Saccharose, Mannose, Sorbitol,
Rhamnose oder Xylose); c) komplexen Kohlenhydraten (z.B. Lactose);
und/oder d) bakteriostatischen Mitteln. Die pharmakokinetische Halbwertszeit
der erfindungsgemäßen Peptide
kann durch Kopplung an Trägerpeptide,
-polypeptide und -kohlenhydrate unter Verwendung chemischer Derivatisierung
(z.B. durch Kopplung von Seitenketten oder N- oder C-terminalen
Resten) modifiziert werden, oder durch chemische Veränderung
einer Aminosäure
des erfindungsgemäßen Peptids.
Die pharmakokinetische Halbwertszeit und die Pharmakodynamik dieser
Peptide kann weiterhin modifiziert werden durch: a) Verkapselung
(z.B. in Liposomen); b) Kontrolle des Hydratationsgrads (z.B. durch
Kontrolle des Ausmaßes
und der Art der Glycosylierung des Peptids); und c) Kontrolle der
elektrostatischen Ladung und der Hydrophobizität des Peptids.
-
Es
gibt eine große
Vielzahl von Verfahren für
die Synthese von Peptiden, wobei die Festphasensynthese üblicherweise
das bevorzugte Verfahren darstellt. Bei diesem Verfahren wird eine
Aminosäure
an ein Harzpartikel gebunden, und das Peptid schrittweise durch
aufeinander folgendes Hinzufügen
geschützter
Aminosäuren
erzeugt, wodurch eine Kette von Aminosäuren hergestellt wird. Modifizierungen
der von Merrifield beschriebenen Technik werden allgemein verwendet.
Siehe z.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 96: 2989–93 (1964).
Bei einem automatisierten Festphasenverfahren werden Peptide synthetisiert,
indem mit der Carboxy-terminalen Aminosäure ein organischer Linker
(z.B. PAM, 4-Oxymethylphenylacetamidomethyl)
beladen wird, der kovalent an ein unlösliches Polystyrolharz angehängt ist,
das mit Divinylbenzol vernetzt ist. Das endständige Amin kann durch Blockierung
mit t-Butyloxycarbonyl geschützt
werden. Hydroxyl- und Carboxylgruppen werden üblicherweise durch Blockierung
mit O-Benzylgruppen geschützt.
Die Synthese wird in einem automatisierten Peptidsynthesizer durchgeführt, beispielsweise
einem von Applied Biosystems erhältlichen
Peptidsynthesizer. Siehe z.B. Model 430-A, Applied Biosystems, Forster
City, California.
-
Nach
der Synthese kann das Produkt von dem Harz entfernt werden. Die
blockierenden Gruppen werden unter Verwendung von Flusssäure oder
Trifluormethylsulfonsäure
nach gängigen
Verfahren entfernt. Siehe z.B. Bergot und Mc Curdy, Applied Biosystems
Bulletin (1987). Eine Routinesynthese kann 0,5 mmol Peptidharz erzeugen.
Nach Abspaltung und Aufreinigung ergibt sich typischerweise eine
Ausbeute von 60 bis 70 %. Die Aufreinigung des Peptidprodukts erfolgt
beispielsweise über
Kristallisation des Peptids aus einem organischen Lösungsmittel,
wie beispielsweise Methylbutylether, anschließendes Lösen in destilliertem Wasser und
Dialyse (wenn das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Peptids
höher ist
als 500 Dalton) oder reverse Hochdruckflüssigkeitschromatographie (z.B.
unter Verwendung einer C18-Säule mit
0,1 % Trifluoressigsäure
und Acetonitril als Lösungsmitteln),
falls das Molekulargewicht des Peptids weniger als 500 Dalton beträgt. Das
aufgereinigte Peptid kann lyophilisiert und bis zur Verwendung in
trockenem Zustand aufbewahrt werden.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
sind bei den niedrigen Konzentrationen, in denen sie üblicherweise verwendet
werden, wasserlöslich.
Solche Peptide werden bevorzugt in Form ihrer Säure- oder Alkalisalze verwendet,
die mit pharmazeutisch annehmbaren Agentien, wie beispielsweise
Essigsäure,
Citronensäure,
Maleinsäure
oder Bernsteinsäure,
gebildet werden. Leicht lösliche
Salze der erfindungsgemäßen Peptide
können auch
durch Modifikation mit einem geringfügig wasserlöslichen, pharmazeutisch annehmbaren
Salz (wie beispielsweise Tanninsäure
oder „palmoic
acid"), durch Einschluss
in einer Peptid-Retardformulierung
(beispielsweise durch kovalente Kopplung an ein größeres Trägerprotein
oder -peptid), oder durch Einschluss in eine Kapsel für Retardformulierung
und dergleichen auch in Salze mit geringer Löslichkeit in Körperflüssigkeiten überführt werden.
Im Allgemeinen sind die Säuresalze
der erfindungsgemäßen Peptide
biologisch und pharmakologisch den Peptiden selbst gleichwertig.
-
C. Pharmakologische Aktivitäten der
erfindungsgemäßen Peptide
-
Wie
oben ausgeführt,
zeigen die erfindungsgemäßen Peptide
ein weites Spektrum pharmakologischer und biologischer Aktivitäten, die
mit der Aktivierung oder Öffnung
von Kaliumkanälen
assoziiert sind. Gemäß einem
Aspekt weisen die erfindungsgemäßen Peptide
die Fähigkeit
auf, die funktionelle Aktivität
glatter Muskeln von Organen zu regulieren, so wie es bekannte Kaliumkanal öffnende
Substanzen tun. Die Kaliumkanal öffnenden
Aktivitäten
dieser Peptide können über Standardassays
zur Messung des gesteigerten Ausstroms von Kaliumionen aus dem Inneren
einer elektrisch erregbaren Testzelle mit einem Kaliumkanal in deren
Zellmembran gemessen werden, die dem Fachmann allgemein bekannt
sind. Solche Assays umfassen gewöhnliche
Patch-Clamp-Assays,
die dem Fachmann allgemein bekannt sind.
-
Die
erfindungsgemäßen Peptide
vermögen
insbesondere die Erschlaffung einer Vielzahl von Arten glatter Muskeln
zu induzieren und hervorzurufen. Wie bei gewöhnlichen Kaliumkanal öffnenden
Substanzen inhibieren die erfindungsgemäßen Peptide spontane Anspannungs-
und Kontraktionsantworten glatter Muskeln und senken die spontane
Kontraktionsaktivität
glatter Muskeln, während
sie keine oder minimale Wirkungen auf die durch Kalium induzierte
tonische Kontraktion glatter Muskeln ausüben. Die erfindungsgemäßen Peptide
zeigen auch Gefäß entspannende
Wirkungen, die beispielsweise durch deren Fähigkeit zur Verringerung der
Amplitude spontaner Gefäßmuskelkontraktionen
gezeigt wird.
-
Erfindungsgemäße Peptide
induzieren die Erschlaffung glatter Muskeln durch Unterdrückung der
Amplitude spontaner Kontraktionen glatter Muskeln in ähnlicher
Weise wie gewöhnliche
Kaliumkanal blockierende Substanzen (wie beispielsweise VerapamilTM). Man nimmt an, dass die Unterdrückung der
spontanen Kontraktion glatter Muskeln durch diese Peptide mit einem
oder mehreren Aktionsmechanismen assoziiert ist. Erstens kann eine
Verschiebung des Membranruhepotenzials der glatten Muskelzelle hin
zu einem negativeren Wert (d.h. Hyperpolarisierung) durch Öffnung von
Kaliumkanälen
in der Zellmembran hervorgerufen werden, wodurch ein gesteigerter
Ausstrom von Kaliumionen aus dem Inneren der Zelle aus der Zelle
heraus über
die Kaliumkanäle
während
der Phasen 3 und 4 eines Aktionspotentials bewirkt wird, wenn diese
Peptide einer glatten Muskelzelle verabreicht werden (oder diese
Peptide mit einer glatten Muskelzelle in Kontakt gebracht werden. Zweitens
können
diese Peptide die Repolarisierung einer Zelle beschleunigen, wobei
sie indirekt das Einströmen
von Kalziumionen über
spannungssensitive Kalziumkanäle
und letztlich die Freisetzung von Kalziumionen aus dem sarkoplasmatischen
Retikulum, welche für
die Kopplung von Erregung und Kontraktion wesentlich ist, beeinflussen.
Da die Erregbarkeit einer glatten Muskelzelle in hohem Maße vom Membranruhepotenzial
abhängt
und die Kontraktionsaktivität
glatter Muskelzellen von der intrazellulären Kalziumkonzentration abhängt, können Peptide,
die über
einen oder mehrere dieser zwei Mechanismen wirken, Kontraktionen
glatter Muskelzellen in Testassays inhibieren.
-
Es
ist wichtig zu erwähnen,
dass die erfindungsgemäßen Peptide
keine derartigen unterdrückenden Wirkungen
in Testassays haben, bei denen eine hohe Kaliumionenkonzentration
in der extrazellulären
Flüssigkeit
vorliegt. Dies wird allgemein als ein wichtiges Merkmal von Kaliumkanal öffnenden
Substanzen angesehen. Eine hohe extrazelluläre Kaliumionenkonzentration
verschiebt das Gleichgewichtsmembranpotenzial normalerweise zu einem
positiveren Wert hin, wodurch eine Kontraktion induziert wird. Unter solchen
Bedingungen kann ein Peptid mit Kaliumkanal öffnender Aktivität unter
Umständen
zu keiner Inhibierung der Kontraktionsaktivität einer Zelle führen. Unter
solchen Umständen
können
Kaliumionen in der Zelle nicht nach außen gegen den Konzentrationsgradienten
fließen,
obwohl die Kaliumkanäle
der Zellmembran aktiviert sind.
-
Die
Erschlaffung und Kontraktion glatter Muskeln kann über eine
Vielzahl allgemein bekannter Verfahren beobachtet werden. Beispielsweise
kann die Erschlaffung gastrointestinaler glatter Muskeln klinisch
durch Untersuchung des Unterleibs oder über verschiedene radiographische
Verfahren beobachtet werden, beispielsweise Kontrastmitteluntersuchungen,
Bariumeinläufe
und dergleichen, oder durch Messung der Verringerung der peristaltischen
Aktivität
(beispielsweise unter Verwendung eines Stethoskops zur Überwachung der
peristaltischen Aktivität).
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt zeigen die erfindungsgemäßen Peptide pharmakologische
Aktivitäten anti-ischämischer
Wirkstoffe, wie sie bestimmten bekannten Kaliumkanal öffnenden
Substanzen zu beobachten sind. Es ist wichtig zu erwähnen, dass
die erfindungsgemäßen Peptide
die inotrope Funktion des ischämischen
Myokards wiederherstellen, ohne Rhythmusstörungen zu induzieren. Die erfindungsgemäßen Peptide optimieren
die Kontraktionsarbeit des ischämischen
Muskels und stellen die Kontraktionsfunktion auf prä-ischämischem
Niveau wieder her, wie belegt wird durch ihre Fähigkeit: (i) differentielle
Herzdrücke
wiederherzustellen; (ii) vorzeitige Ventrikelkontraktionen (PVCs)
zu inhibieren; (iii) diastolische Drücke mit normalen Werten wiederherzustellen;
und (iv) den sich aufbauenden Druck und die Kontraktionskraft des
linken Ventrikels wiederherzustellen. Die erfindungsgemäßen Peptide
zeigen bei intraperitonealer oder intravenöser Injektion, oder bei Einbringung
in den Herzkreislauf (d.h. durch die Aorta) bei bestimmten Konzentrationen
(z.B. etwa 10–5 bis
10–7 M)
im ischämischen
Myokard eine positive inotrope Aktivität (d.h. sie steigern die Arbeitseffizienz des
Herzen, gemessen über
gesteigerten Herzausstoß ohne
gesteigerten Sauerstoffverbrauch, gesteigerte metabolische Rate,
oder Induktion von Rhythmusstörungen),
und schwach negative chronotrope Aktivität. Eine Steigerung der Effizienz
der Herzarbeit bedeutet hier die Fähigkeit, mehr Herzarbeit unter
geringerem Energieaufwand zu verrichten, was beispielsweise durch
Bestimmung des durch einen Herzschlag bei einer bestimmten Herzfrequenz über eine
definierte Zeitdauer ausgestoßenen
Blutvolumens gemessen werden kann. Weiterhin zeigen die erfindungsgemäßen Peptide
eine schwach negative oder keine chronotrope Aktivität (d.h. die
erfindungsgemäßen Peptide
steigern nicht die Herzfrequenz, sondern senken im Gegenteil die
Herzfrequenz oder haben keine Wirkung auf die Herzfrequenz). Der
Begriff „chronotrop" bedeutet die Beeinflussung der
Frequenz rhythmischer Bewegungen, wie beispielsweise die Frequenz
des Herzschlags oder von Herzkontraktionen. Der Begriff „positiv
chronotrop" bedeutet
eine Steigerung der Frequenz rhythmischer Bewegungen (z.B. eine
Steigerung der Frequenz des Herzschlags oder von Herzkontraktionen).
Der Begriff „negativ chronotrop" bedeutet eine Verringerung
der Frequenz rhythmischer Bewegungen (z.B. eine Verringerung der Frequenz
von Herzkontraktionen oder des Herzschlags).
-
Wie
nachfolgend ausführlicher
besprochen wird, verringern erfindungsgemäße Peptide das Ausmaß ischämischer
Myokardläsionen,
ohne inotrope Funktionen des Herzens nachteilig zu beeinflussen,
wie durch geringe Grade enzymatischer Aktivitäten bestimmter intrazellulärer, myokardialer
Enzyme im Blut nach Einsetzen von Ischämie belegt wird.
-
Die
erfindungsgemäßen Peptide
wirken als Wirkstoffe gegen Rhythmusstörungen, wobei sie das Auftreten
vorzeitiger Ventrikelkontraktionen oder von Episoden ventrikulärer Tachykardie
oder ventrikulärer
Fibrillation verringern. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die erfindungsgemäßen Peptide
die normale Herzfunktion nicht beeinflussen. Erfindungsgemäße Peptide üben auch
Herz schützende
Wirkungen aus, die vergleichbar sind mit denen, die bei bekannten
Kaliumkanal öffnenden
Substanzen im Allgemeinen zu beobachten sind. Solche Herz schützenden
Wirkungen umfassen: (1) Wiederherstellung der inotropen Funktion
des ischämischen
Myokards (die durch die Messung der ventrikulären systolischen und diastolischen
Drücke,
des sich aufbauenden ventrikulären
Drucks, und der maximalen ventrikulären Druckerhöhungs- und
-verringerungsraten beurteilt werden kann), wobei aber keine Rhythmusstörungen induziert
werden; (2) Förderung
anti-ischämischer
Wirkungen durch Verringerung des Ausmaßes von Ischämie in einem
Gewebe oder einem Organ oder Verringerung des Ausmaßes myokardialer
Läsionen
im Herzen nach Unterbrechung des Blutstroms zum Herzmuskel (wie
beispielsweise nach Koronarverschluss) ohne nachteilige Beeinflussung
der inotropen Funktionen des Herzens; (3) Verhinderung der Entwicklung
von Rhythmusstörungen
(oder Disrhythmien) bei Induktion von Rhythmusstörungen (oder Disrhythmien)
durch Chloroform oder Koronarverschluss, wiedergegeben durch eine
Verringerung der Anzahl vorzeitiger Ventrikelkontraktionen oder
durch eine Verringerung der Gesamtdauer von Episoden ventrikulärer Tachykardie
oder ventrikulärer
Fibrillation; (4) Hervorrufung Blutgefäß erweiternder Wirkungen, einschließlich koronardilatorischer
Aktivität
und hypotensiver Wirkungen; (5) minimale oder fehlende Wirkung auf
die inotrope Funktion des Myokards oder auf die Herzfrequenz eines
normalen Herzens; und (6) minimaler oder fehlender Einfluss auf
elektrophysiologische Parameter des normalen Herzens, beispielsweise
wiedergegeben durch normale Elektrokardiogrammmessungen des Myokards.
-
Testassays
zur Beurteilung von Herzfunktionen sind dem Fachmann ebenfalls allgemein
bekannt. Beispielsweise wird Überwachung über Elektrokardiogramm
(ECG) routinemäßig verwendet
zur Identifizierung und Messung vorzeitiger Ventrikelkontraktionen,
ventrikulärer
Tachykardie und ventrikulärer
Fibrillationen. Das Ausmaß von
Ischämie
in einem Gewebe oder Organ eines Individuums kann bestimmt werden
durch makroskopische pathologische Untersuchung, histologische Untersuchung
oder die Messung einer Organaktivität in vivo oder in vitro. Herzorganaktivität kann über verschiedene,
allgemein bekannte Verfahren bestimmt werden (beispielsweise die
Messung der Herzfrequenz, oder des diastolischen, systolischen,
differenziellen oder sich aufbauenden Drucks in den Herzkammern,
oder durch Messung der Konzentrationen von Herzmuskelenzymen, beispielsweise
von Creatininphosphokinase im Blut).
-
Wie
oben vermerkt, verringern die erfindungsgemäßen Peptide die spontane Kontraktionsaktivität glatter
Gefäßmuskeln.
Ein erwähnenswerter
Unterschied zu Kalziumblockern besteht jedoch darin, dass die erfindungsgemäßen Peptide
keine Wirkung auf die durch hohe Kaliumchloridkonzentrationen induzierte
tonische Kontraktion ausüben.
Die erfindungsgemäßen Peptide
zeigen Blutgefäß erweiternde
Aktivitäten
und vermögen
den durchschnittlichen arteriellen Blutdruck in Individuen zu verringern,
die einer solchen Behandlung bedürfen.
Diese Blutgefäß erweiternden
Aktivitäten
umfassen koronarerweiternde Aktivitäten (d.h. die Vergrößerung der
Querschnittsfläche
eines koronaren Blutgefäßes wie
beispielsweise in einer Koronararterie) und hypotensive Aktivitäten (d.h.
Blutdruck senkende Wirkungen).
-
Assays
zur Messung der Blutgefäß erweiternden
und gegen Rhythmusstörungen
gerichteten Wirkungen von Substanzen sind dem Fachmann allgemein
bekannt und umfassen die unten beispielhaft dargestellten Assays.
Wie oben angemerkt, kann eine Erweiterung der Blutgefäße das Blutvolumen,
das durch ein Gefäß fließt, erhöhen und/oder
den Blutdruck in dem Gefäß senken.
Eine Erweiterung von Blutgefäßen kann über eine
Vielzahl üblicher
klinischer Verfahren und Messungen nachgewiesen und gemessen werden.
Beispielsweise wird eine Erweiterung von Blutgefäßen angezeigt, wenn ein Individuum
eine Zunahme von Erythemen (z.B. eine Rötung der Haut aufgrund gesteigerten
Blutflusses zur Haut oder ein „Erröten"), einen Blutdruckabfall,
eine Wärmezunahme
in einem Zielgebiet der Haut oder eine Gefäßschwellung zeigt. Eine Gefäßschwellung,
die eine Erweiterung von Blutgefäßen anzeigt,
kann in oberflächlichen
Venen einfach beobachtet werden. Der Blutstrom kann über übliche Verfahren
gemessen werden, einschließlich
herkömmlicher
Druckmanschetten-Blutdruckmessungen und Messungen mit Druck übertragenden
Vorrichtungen. Veranschaulichende Assays zum Nachweis und zur Messung
der Erweiterung von Blutgefäßen werden
auch in den Beispielen unten vorgestellt.
-
Weiterhin
induzieren und bewirken die erfindungsgemäßen Peptide eine Erschlaffung
von Skelettmuskeln, wie durch deren Fähigkeit zur Verringerung der
Amplitude kalziuminduzierter Kontraktionen intestinaler glatter
Muskeln belegt wird. Man nimmt an, dass wie bei glattem Muskelgewebe
diese Peptide die Erschlaffung von Skelettmuskeln induzieren, indem
sie Kaliumkanäle
des Skelettmuskels aktivieren oder öffnen. Assays zur Messung der
Kontraktion und Erschlaffung von Skelettmuskeln sind dem Fachmann
allgemein bekannt und umfassen die oben beschriebenen Assays.
-
Angesichts
ihrer Aktivitäten
hinsichtlich der Erschlaffung glatter Muskeln ist weiterhin zu erwarten, dass
die erfindungsgemäßen Peptide
glatte Muskeln der Atemwege erschlaffen lassen (beispielsweise tracheale
glatte Muskeln) und bronchodilatorische Wirkungen auf bronchiale
glatte Muskeln ausüben.
Man nimmt an, dass diese bronchodilatorischen Wirkungen über einen
gemeinsamen Mechanismus vermittelt werden, welcher die Wiederherstellung
des normalen Musters der elektrophysiologischen Funktion in den
elektrisch erregbaren Zellen des pathologisch veränderten
Gewebes (z.B. pathologisch veränderter
bronchialer glatter Muskeln) beinhaltet. Testassays zur Messung
der Erschlaffung glatter Muskeln der Atemwege und bronchodilatorischer
Wirkungen, wie beispielsweise in ex vivo- oder in vivo-Lungenfunktionsassays,
sind dem Fachmann allgemein bekannt.
-
Aufgrund
ihrer die Erschlaffung glatter Muskeln hervorrufenden Wirkungen
ist weiterhin erwarten, dass die erfindungsgemäßen Peptide entspannende Wirkungen
auf das Myometrium während
der Schwangerschaft ausüben
und prämenstruelle
Krämpfe
und vorzeitige Gebärmutterkontraktionen
mildern. Solche Wirkungen können über dem
Fachmann allgemein bekannte Verfahren einfach gemessen werden.
-
Aufgrund
ihrer Kaliumkanal aktivierenden Aktivitäten nimmt man an, dass die
erfindungsgemäßen Peptide
die neuronale Erregbarkeit verringern und antikonvulsive Wirkungen
auf Gehirnzellen ausüben.
Die elektrische Aktivität
des Gehirns kann durch elektroenzephalographische Techniken, PET-Scan
und dergleichen gemessen werden.
-
Als
anti-ischämische
Wirkstoffe konservieren die erfindungsgemäßen Peptide Gewebe und Organe. Man
nimmt an, dass die konservierenden Wirkungen dieser Peptide mit
deren Kaliumkanal öffnenden
Eigenschaften und deren Fähigkeit
zur Regulierung von Kaliumkanälen
assoziiert sind. Testassays zur Beurteilung solcher konservierenden
Wirkungen sind dem Fachmann allgemein bekannt und umfassen die oben
beschriebenen Testassays.
-
Veranschaulichende
Assays für
den Nachweis und die Messung der pharmakologischen und biologischen
Aktivitäten
der erfindungsgemäßen Peptide
werden in den unten genannten Beispielen bereitgestellt.
-
III. PHARMAZEUTISCHE ZUBEREITUNGEN
-
Die
Erfindung stellt die erfindungsgemäßen Peptide umfassende pharmazeutische
Zubereitungen in Einheitsdosisform bereit. Wie oben beschrieben,
sind diese Peptide sind brauchbar für die Behandlung oder Vorbeugung
von auf die Öffnung
von Kaliumkanälen
ansprechenden Krankheiten in einem Individuum, das einer solchen
Behandlung bedarf. Die erfindungsgemäßen Peptide umfassenden pharmazeutische
Zubereitungen sind insbesondere brauchbar für die Behandlung oder Vorbeugung
kardiovaskulärer
Krankheiten, zur Induktion oder zum Bewirken der Erschlaffung glatter
Muskeln, und zur Induktion oder zum Bewirken der Erschlaffung von
Skelettmuskeln. Erfindungsgemäße pharmazeutische
Zubereitungen in Einheitsdosisform umfassen im Allgemeinen pro Einheitsdosis
einen Bereich von etwa 0,01 mg bis etwa 1000 mg L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr
oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, und einen pharmazeutisch
annehmbaren Träger.
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung umfasst die Zubereitung
pro Einheitsdosis einen Bereich von etwa 1 mg bis etwa 100 mg L-Gly-L-Glu,
L-Val-L-Thr oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon,
und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
-
Die
bevorzugte Form dieser pharmazeutischen Zubereitungen hängt von
der beabsichtigten Verabreichungsart und therapeutischen Anwendung
ab. Die Zubereitungen können
(in Abhängigkeit
von der gewünschten
Formulierung) pharmazeutisch annehmbare, nicht-toxische Träger oder
Verdünnungsmittel
umfassen, die definiert sind als Vehikel, die üblicherweise zur Formulierung
pharmazeutischer Zubereitungen für
die Verabreichung an Tiere oder Menschen verwendet werden.
-
IV. ANWENDUNGEN
-
A. Therapeutische und
prophylaktische Verfahren
-
Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur therapeutischen oder
prophylaktischen Behandlung von Krankheiten und Störungen bereit,
die auf die Öffnung
von Kaliumkanälen
in Individuen, die einer solchen Behandlung bedürfen, ansprechen, dafür sensitiv
sind oder damit assoziiert sind. Diese Individuen können Menschen
und Tiere umfassen, insbesondere säugetierartige Wirbeltiere.
Die vornehmlichen therapeutischen und prophylaktischen Anwendungsgebiete
für diese
Peptide umfassen Behandlungen, welche die folgenden Wirkungen erzielen
sollen: (1) Blutgefäß erweiternde
Wirkungen, einschließlich
Koronardilation und hypotensive Wirkungen (z.B. Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide
zur Behandlung von Individuen, die an Herzinsuffizienz leiden, oder
zur Vorbeugung von Herzinsuffizienz bei Individuen, die einer solchen
Vorbeugung bedürfen);
(2) anti-ischämische,
Herz schützende
Wirkungen, welche eine Verringerung des Ausmaßes ischämischer, myokardialer Läsionen ohne
nachteilige Beeinflussung inotroper Funktionen des Herzens umfassen (z.B.
Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide
zur Behandlung von Individuen nach Schlaganfall oder Herzattacke);
(3) bronchodilatorische Wirkungen (z.B. Verwendung der Peptide zur
Behandlung oder Vorbeugung von Asthma, bronchospastischen Störungen,
oder bronchospastischem Syndrom und/oder zur Induktion der Erschlaffung
bronchialer glatter Muskeln); (4) erschlaffende Wirkungen auf glatte
Muskeln (z.B. Verwendung der Peptide zur Behandlung abnormaler Schwangerschaften,
einschließlich
Zuständen,
welche vorzeitige Gebärmutterkontraktionen
und prämenstruelle
Krämpfe
beinhalten, und zur Entspannung des Myometriums von Individuen während der
Schwangerschaft); (5) Skelettmuskel-erschlaffende Wirkungen; (6)
antiepileptische und antikonvulsive Wirkungen; (7) Verringerung
der neuronalen Erregbarkeit; und (8) Regulation der Insulinsekretion.
Es ist wichtig zu erwähnen,
dass die erfindungsgemäßen Peptide
diese Wirkungen in niedrigen Dosierungskonzentrationen und ohne
toxische Nebenwirkungen hervorrufen.
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Ein
erfindungsgemäßer Aspekt
stellt Verfahren für
die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von Krankheiten
und Störungen
bereit, die durch die Öffnung
von Kaliumkanälen
in Zellmembranen von Individuen, die einer solchen Behandlung bedürfen, behandelbar
sind, darauf ansprechen oder dafür
sensitiv sind. Beispielhafte Krankheiten und Störungen werden unten besprochen.
Wie oben beschrieben, umfassen diese Verfahren die Verabreichung
einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Peptids an ein Individuum,
das einer solchen Verabreichung bedarf, einschließlich eines
Menschen. Im Allgemeinen umfasst das Peptid L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr,
ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste
umfassendes Polymer von L-Gly-L-Glu, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste
umfassendes Polymer von L-Val-L-Thr, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste
umfassendes Polymer von L-Val-L-Thr und L-Gly-L-Glu, oder ein pharmazeutisch
annehmbares Salz davon. Weiterhin kann das Peptid ein Polymer von
L-Val-L-Thr und
L-Gly-L-Glu umfassen, das nicht mehr als 16 Aminosäurereste
umfasst.
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Ein
weiterer erfindungsgemäßer Aspekt
stellt Verfahren bereit, die spezifisch auf die Behandlung und Vorbeugung
kardiovaskulärer
Krankheiten gerichtet sind, welche mit Kaliumkanälen assoziiert sind oder auf die Öffnung oder
Aktivierung von Kaliumkanälen
ansprechen. Solche kardiovaskulären
Krankheiten werden unten im Detail besprochen. Diese Verfahren umfassen
die Verabreichung einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Peptids,
wie oben beschrieben, an ein Individuum, einschließlich eines
Menschen, das dieser bedarf. Das Peptid umfasst normalerweise L-Gly-L-Glu,
L-Val-L-Thr, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassendes Polymer
von L-Gly-L-Glu, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassendes Polymer
von L-Val-L-Thr, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Das Peptid kann ein Polymer aus L-Val-L-Thr und L-Gly-L-Glu umfassen,
das nicht mehr als 16 Aminosäurereste
umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Verfahren zur Induktion
und zum Bewirken der Erschlaffung von Muskelzellen in Individuen,
die einer solchen Erschlaffung bedürfen. Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform
stellt Verfahren zur Induktion und zur Bewirkung der Erschlaffung
von Skelettmuskeln bei Individuen bereit, die einer solchen Erschlaffung
bedürfen.
Wie oben beschrieben umfassen diese beiden Verfahren die Verabreichung
einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Peptids an ein Individuum,
das ein Mensch sein kann. Gewöhnlich
umfasst das Peptid L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste
umfassendes Polymer aus L-Gly-L-Glu, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste
umfassendes Polymer aus L-Val-L-Thr, oder ein pharmazeutisch annehmbares
Salz davon. Das Peptid kann ein Polymer aus L-Val-L-Thr und L-Gly-L-Glu umfassen, das
nicht mehr als 16 Aminosäurereste
umfasst. Solche Verfahren können
verwendet werden, um die Erschlaffung verschiedener Arten glatter
Muskeln zu bewirken, einschließlich intestinaler,
bronchialer, trachealer glatter Muskeln, glatter Muskeln des Uterus,
der Blase, des Darms, des Vas deferens und glatter Gefäßmuskeln.
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B. Behandelbare Krankheiten
und Störungen
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Aufgrund
ihrer Fähigkeit
zur Aktivierung und Öffnung
von Kaliumkanälen
sind die erfindungsgemäßen Peptide
brauchbar zur Behandlung oder Vorbeugung eines weiten Spektrums
von Krankheiten und Störungen, die
ansprechen auf oder sensitiv sind für die Öffnung von Kaliumkanälen oder
mit Kaliumkanal öffnenden
Aktivitäten
assoziiert sind (einschließlich
solcher Krankheiten und Störungen,
bei denen die Zellmembranen von Geweben oder Organen des Individuums
teilweise depolarisiert sind, z.B. bei ischämischen Geweben oder Organen).
Erfindungsgemäße Peptide
sind wirksam bei der Behandlung und Linderung kardiovaskulärer Krankheiten,
die mit Kaliumkanälen
assoziiert sind oder auf eine Aktivierung von Kaliumkanälen ansprechen.
Die erfindungsgemäßen Peptide
sind insbesondere brauchbar für
die Behandlung und Vorbeugung aller hier beschriebenen Formen ischämischer
Herzerkrankungen (einschließlich
Myokardinfarkt, Angina pectoris, akute und chronische Koronarinsuffizienz,
und postmyokardiale Infarktkardiosklerose). Wie oben besprochen
wurde, wirken die erfindungsgemäßen Peptide
auch erfolgreich als anti-ischämische und
Herz schützende
Wirkstoffe, wobei sie das Ausmaß ischämischer
Läsionen
im Herzen verringern, ohne die jeweiligen inotropen Funktionen des
Herzens nachteilig zu beeinflussen. Nach dem Einsetzen von Ischämie und
der Inhibition der Bildung von Herzkontraktion stellen die erfindungsgemäßen Peptide
insbesondere die mechanische Herzfunktion wieder her und verbessern
diese. Die Herz schützenden
Wirkungen dieser Peptide sind zum Teil assoziiert mit deren Fähigkeit
zur Regulierung und Aktivierung von Kaliumkanälen in ischämischem Myokardgewebe (d.h.
die Fähigkeit,
Kaliumkanal aufweisende Zellen in ischämischem Gewebe zu hyperpolarisieren
oder eine weitere Depolarisierung zu inhibieren). Diese Peptide
helfen dabei, einen Schaden am Herz zu verhindern, der normalerweise
bei verschiedenen Zuständen
von Herzfehlfunktionen (z.B. akutem Myokardinfarkt) auftritt.
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Weiterhin
schützen
die erfindungsgemäßen Peptide
das Herz, indem sie es befähigen,
einem vorübergehenden
Sauerstoffentzug besser zu widerstehen. Ein Kennzeichen des Myokardzellschadens
bei Ischämie und
Hypoxie ist die Störung
der respiratorischen Funktion der Mitochondrien oder eine Unterbrechung
oder Blockierung der Sauerstoffversorgung der Myokardzellen. Die
Blutgefäß erweiternden
Wirkungen dieser Peptide können
zu einem erhöhten
Blut- und Sauerstoffstrom zum Herzen führen.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
sind weiterhin brauchbar für
die Behandlung oder Vorbeugung weiterer kardiovaskulärer Krankheiten,
die mit Kaliumkanälen
assoziiert sind oder auf die Aktivierung von Kaliumkanälen ansprechen.
Solche Krankheiten umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Herzdysrhythmien
(einschließlich
Rhythmus-Paroxysmaltachykardie
und weitere Formen der Tachykardie, beispielsweise ventrikuläre Tachykardie,
ventrikuläre
Fibrillation, supraventrikuläre
und ventrikuläre
Ektopie, und nicht-spezifische
vorzeitige Schläge),
Herzrhythmusstörungen,
Kardiomyopathie und Myokarddystrophie; alle Arten hypertensiver Krankheit;
kongestive Herzinsuffizienz; Hypoxie; von Kontakt mit chemischen
Toxinen herrührende
kardiovaskuläre
Krankheiten; Herzinsuffizienz; und mit Leitungsstörungen assoziierte
kardiovaskuläre
Krankheiten (d.h. AV-Blocks verschiedener Schweregrade). Siehe z.B.
Guermonprez et al., supra. Da die erfindungsgemäßen Peptide wirksame Wirkstoffe
gegen Rhythmusstörungen,
Blutgefäß erweiternde,
koronardilatorische oder hypotensive Wirkstoffe sind, können sie
weiterhin für
die Behandlung und Vorbeugung kardiovaskulärer Krankheiten (und verwandter
Störungen)
brauchbar sein, die von diesen Wirkungen profitieren können.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
sind weiterhin brauchbar für
die Induktion und Bewirkung der Erschlaffung glatter Muskeln und
für die
Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten, Störungen, und mit Kontraktionen
glatter Muskel assoziierter Störungen
und auf die Mäßigung der
Kontraktionsantwort der glatten Muskeln ansprechender Krankheiten.
Die erfindungsgemäßen Peptide
sind brauchbar für
die Entspannung glatter Gefäßmuskeln
und von Blutgefäßwänden, und
für die
Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten, Störungen und mit der Pathologie
glatter Gefäßmuskeln
assoziierter Störungen.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
sind weiterhin brauchbar für
die Entspannung nicht-vaskulärer glatter Muskeln
(wie beispielsweise solchen der Trachea, des Bronchus, der Harnblase,
des Darms, des Uterus, des Vas deferens) und für die Behandlung und Vorbeugung
von Störungen,
Zuständen
und Krankheiten nicht-vaskulärer
glatter Muskeln, einschließlich
hyperreaktiver Störungen
nicht-vaskulärer
glatter Muskeln (wie beispielsweise Asthma, Reizdarm, Reizblase),
hyperreaktiver Zustände
in der Lunge und im Gastrointestinaltrakt, und verschiedener allergischer
Zustände,
die mit abnormal erhöhter
Reaktivität
glatter Muskeln assoziiert sind (z.B. Asthma und bronchospastische
Störungen).
Angesichts ihrer die Erschlaffung glatter Muskeln bewirkenden Eigenschaften
sind die erfindungsgemäßen Peptide
brauchbar für
die Behandlung, Vorbeugung und Linderung prämenstrueller Krämpfe, vorzeitiger
Uteruskontraktionen, und/oder Komplikationen, die auf einem erhöhten Tonus
des Myometriums beruhen.
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Wie
oben vermerkt, nimmt man an, dass die erfindungsgemäßen Peptide
eine Erschlaffung der glatten Muskeln der Atemwege bewirken (z.B.
bronchialen glatten Muskelgewebes) und bronchodilatorische Wirkungen
ausüben,
wie es bekannte Kaliumkanal öffnende
Substanzen tun. Die erfindungsgemäßen Peptide sind erwartungsgemäß nützlich für die Behandlung,
Kontrolle und Vorbeugung von Störungen,
die mit Bronchialasthma assoziiert sind, einschließlich Bronchokonstriktion,
bronchospastischen Zuständen,
und bronchospastischem Syndrom und dergleichen. Bronchodilatation
wird durch verbesserte Respiration bei einem asthmatischen Patienten
angezeigt und kann über
eine Vielzahl üblicher
Lungenfunktionstests gemessen werden, beispielsweise den zum forcierten
Exspirationsvolumen (FEV1).
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Da
diese Peptide eine Erschlaffung glatter Muskeln bewirken und die
Kontraktion glatter Muskeln inhibieren, sind sie brauchbar für die Behandlung
und Vorbeugung von pathologischen Zuständen, von Zuständen oder
Krankheiten, die im Allgemeinen auf einer pathologischen Kontraktion
glatter Gefäßmuskeln
oder einer Überreaktivität glatter
Muskeln (z.B. Hypertension) beruhen oder eine solche beinhalten.
In ähnlicher
Weise sind die erfindungsgemäßen Peptide
brauchbar für
die Behandlung und Vorbeugung von peripheren Gefäßkrankheiten und Zuständen, bei
denen eine Verringerung der peristaltischen Aktivität erwünscht ist.
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Da
die erfindungsgemäßen Peptide
eine Erschlaffung glatter Gefäßmuskeln
bewirken und eine Erweiterung von Blutgefäßen induzieren, sind sie weiterhin
brauchbar bei der prophylaktischen und therapeutischen Behandlung
von Krankheiten oder Störungen,
die durch Vasodilatation behandelbar sind, darauf ansprechen oder
dafür sensitiv
sind. Beispielsweise sind sie nützlich
für die
Behandlung und Vorbeugung von Hypertension, hohem Blutdruck, peripherer
Gefäßkrankheit
und dergleichen. Es ist wichtig zu erwähnen, dass ein Erweiterung
von Blutgefäßen den
Blut-, Sauerstoff- und Nährstoffstrom
in geschädigte
Gewebe (beispielsweise ischämische
Gewebe) und Gewebe, denen Blut, Sauerstoff und Nährstoffe vorenthalten wurden
(beispielsweise Gewebe, die Bereiche mit Hypoxie aufweisen), steigert
und wiederherstellt, und der Zelltod kann somit verhindert, verlangsamt
oder verzögert
werden. Als Ergebnis davon sind die erfindungsgemäßen Peptide
mit ihren Blutgefäß erweiternden
Eigenschaften wirksam bei der Vorbeugung und Verlangsamung von Zelltod
in Geweben, denen Blut, Sauerstoff und Nährstoffe vorenthalten wurden,
und bei der Behandlung und Vorbeugung von Störungen, die von solchen Umständen herrühren (z.B.
Hypoxie, Anoxie, Ischämie).
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
sind weiterhin brauchbar für
die Induktion der Erschlaffung von Skelettmuskeln und für die Behandlung
und Vorbeugung von Krankheiten und Störungen, die mit der Kontraktion von
Skelettmuskeln assoziiert sind, und von Krankheiten, die auf eine
Mäßigung der
Kontraktionsantwort des Skelettmuskels ansprechen, einschließlich bestimmter
Skelettmuskelmyopathien und ischämischer
Skelettmuskelzustände.
Carmeliet, Eur. Heart J. 12 (Suppl. F): 30–37 (1991); McPherson, Gen.
Pharmac. 24(2): 275–81
(1993).
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Angesichts
ihrer die Erschlaffung glatter Muskeln bewirkender Eigenschaften
und Blutgefäß erweiternden
Wirkungen sind die erfindungsgemäßen Peptide
erwartungsgemäß brauchbar
sind für
die Behandlung und Vorbeugung von Leberzirrhose. Leberzirrhose ist
eine chronische Erkrankung der Leber, die gekennzeichnet ist durch
eine fortschreitende Zerstörung
und Regeneration von Leberzellen und zunehmende Bildung von Bindegewebe,
das letztlich zu einer Blockierung der Pfortader-Zirkulation, zu
Pfortader-Hypertension, Leberversagen und Tod führt. Durch Induktion der Erschlaffung
glatter Muskeln und Vasodilatation bewirken die erfindungsgemäßen Peptide
eine Abzweigung der Blutversorgung weg von der Pfortadervene und
inhibieren oder verlangsamen somit das Fortschreiten der Zirrhose.
Die Leberaktivität
kann im Allgemeinen durch Messung der Konzentrationen von Enzymen
(wie beispielsweise alkalische Phosphatase) in peripherem Blut gemessen
werden.
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Kaliumkanäle sind
in Gehirnzellen weit verbreitet und wurden mit verschiedenen Gehirnstörungen in Verbindung
gebracht, einschließlich
Epilepsie, Anoxie, verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten,
Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, und verschiedenen Formen
zerebraler Ischämie,
einschließlich Schlaganfall
und Trauma. Siehe z.B. Gopalakrishnan et al., supra; Ben-Ari et
al., Neuroscience 37: 55–60 (1990);
Gandolfo et al., supra; Ashford et al., Nature 370: 456–59 (11.
August 1994). Man fand, dass bekannte Kaliumkanal öffnende
Substanzen die neuronale Erregbarkeit verringern und antikonvulsive
Wirkungen auf Gehirnzellen ausüben.
Die Wirkungen bekannter Kaliumkanäle auf Gehirnzellen können auf
verschiedenen Wirkungsmechanismen beruhen. Wie in anderen Geweben,
die Zellen mit Kaliumkanälen
aufweisen, scheint die direkte Aktivierung von Kaliumkanälen in Gehirnzellen
die Erregbarkeit dieser Zellen zu verringern und diese Zellen zu
schützen.
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Kaliumkanal öffnende
Substanzen können
Gehirngeweben auch über
deren Blutgefäß erweiternde
Eigenschaften nützen.
Einige neurodegenerative Krankheiten sind, wenigstens zum Teil,
durch einen Mangel an Sauerstoff und Nährstoffen in neuronalem Gewebe
gekennzeichnet. Es ist bekannt, dass ein fortschreitender Mangel
an Sauerstoff und Nährstoffen
in Gehirn- und neuronalen Geweben das Fortschreiten neurodegenerativer
Krankheiten fördert.
Durch Verbesserung des Transports von Sauerstoff und Nährstoffen
zum neuronalen Gewebe können
neurodegenerative Krankheiten verlangsamt und stabilisiert werden.
Eine Erweiterung von Blutgefäßen steigert
im Allgemeinen die Zirkulation und den Blutstrom und verbessert
den Transport von Sauerstoff und Nährstoffen in Körpergewebe.
Durch ihre Blutgefäße erweiternden
Wirkungen können
Kaliumkanal öffnende
Substanzen bei der Verzögerung
und Stabilisierung neurodegenerativer Krankheiten helfen, indem
sie den Strom von Sauerstoff und Nährstoffen zu Gehirngeweben
steigern, die Sauerstoffe und Nährstoffe benötigen.
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Angesichts
ihrer Blutgefäß erweiternden
Eigenschaften sind die erfindungsgemäßen Peptide erwartungsgemäß für die Behandlung
und Vorbeugung einer Vielzahl von Gehirnstörungen brauchbar, die beispielsweise
von übermäßiger oder
inkorrekter neuronaler Erregbarkeit herrühren. Es ist zu erwarten, dass
die erfindungsgemäßen Peptide
die neuronale Erregbarkeit verringern und anti-ischämische und
antikonvulsive Wirkungen auf Gehirnzellen mit Kaliumkanälen ausüben. Die
erfindungsgemäßen Peptide
sollten somit brauchbar sein für
die Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten, die mit neuronalem
Schaden und übermäßiger oder inkorrekter
Erregbarkeit assoziiert sind, einschließlich Epilepsie, Anoxie, Hypoxie,
Schlaganfall, Trauma, zerebraler Ischämie, Krämpfen und Alzheimer-Krankheit.
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Als
Blutgefäß erweiternde
Substanzen steigern die erfindungsgemäßen Peptide weiterhin den Blutstrom
und den Transport von Sauerstoff und Nährstoffen zu neuronalen Geweben,
und verbessern somit die Qualität
und Stabilität
neuronaler Gewebe, und verlangsamen erwartungsgemäß das Fortschreiten
neurodegenerativer Krankheiten. Die erfindungsgemäßen Peptide
sind somit nützlich
für die
Behandlung und Vorbeugung von Störungen,
die auf einem Mangel oder einem Entzug von Sauerstoff und Nährstoffen
in Geweben beruhen. Aus diesen Gründen sind die erfindungsgemäßen Peptide
brauchbar für
die Behandlung und Vorbeugung von Anoxie (z.B. kardialer Hypoxie
und neuronaler Hypoxie), Hypoxie (z.B. kardialer Hypoxie und neuronaler
Hypoxie), Parkinson-Krankheit und Alzheimer-Krankheit. Da Epilepsie
durch Sauerstoffmangel ausgelöst
werden kann und/oder von hypoxischen Zuständen herrühren kann, sind die erfindungsgemäßen Peptide
erwartungsgemäß weiterhin
brauchbar für
die Behandlung und Vorbeugung von Epilepsie und von damit in Zusammenhang
stehenden Störungen.
In ähnlicher
Weise sind die erfindungsgemäßen Peptide
weiterhin brauchbar für
die Behandlung und Vorbeugung von Herzischämie, da während der Herzischämie Myocyten einem
Sauerstoffentzug ausgesetzt sind und unter der Unterbrechung der
Perfusion leiden.
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Da
Kaliumkanäle
für die
Appetitregulierung einen Rückkopplungskreis
mit Betazellen der Bauchspeicheldrüse bilden können, sind die erfindungsgemäßen Peptide
erwartungsgemäß nützlich bei
der Behandlung und Vorbeugung von Appetit- und Ernährungsstörungen und
-krankheiten. Gopalakrishnan et al., supra. Da Kaliumkanäle weiterhin
mit Diabetes und damit in Zusammenhang stehenden Störungen assoziiert
sein können,
nimmt man an, dass die erfindungsgemäßen Peptide bei der Behandlung
und Vorbeugung von Diabetes brauchbar sind. Siehe z.B. Ashford et
al., supra.
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Erwartungsgemäß sind die
Peptide weiterhin nützlich
bei der Behandlung und Vorbeugung von Nierenerkrankungen. Die Nierenaktivität kann durch Überwachung
der Konzentration von Harnstoff-Stickstoff im Blut gemessen werden.
Erfindungsgemäße Peptide
sind auch nützlich
für die
Konservierung und den Erhalt lebender Gewebe und Organe ex vivo.
Beispielsweise können
diese Peptide für
die ex vivo-Konservierung eines lebenden Gewebes und Organs, beispielsweise
eines Herzens oder Blutgefäßes, vor
der Transplantation (oder Re-Implantation) in ein Individuum verwendet
werden.
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C. Dosierungen und Verabreichungsmethoden
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Bei
therapeutischen Anwendungen kann ein erfindungsgemäßes Peptid
einem bereits an einer unerwünschten
Krankheit oder einem unerwünschten
Zustand (z.B. ischämischer
Herzerkrankung) leidenden Individuum in einer Menge verabreicht
werden, die ausreicht, um das Fortschreiten der Krankheit und deren
Komplikationen zu behandeln, zu heilen, teilweise anzuhalten oder
nachweisbar zu verlangsamen. Eine für die Verwendung in therapeutischen
Anwendungen wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Peptids hängt von
der Schwere des Zustandes, dem allgemeinen Zustand des Individuums
und der Verabreichungsroute ab. Die wirksame Menge des Peptids bei
therapeutischen Anwendungen liegt pro Dosis im Allgemeinen in einem
Bereich von etwa 0,15 Mikrogramm pro Kilogramm (mg/kg) bis etwa
10 mg/kg des Peptids (oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes
davon). Die wirksame Menge des erfindungsgemäßen Peptids kann von etwa 0,01
mg/kg bis etwa 10 mg/kg pro Dosis reichen. Eine wirksame Menge L-Gly-L- Glu oder L-Val-L-Thr,
oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, für therapeutische
Anwendungen kann von etwa 0,15 mg/kg bis etwa 10 mg/kg des jeweiligen
Peptids (oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon) pro Dosis
reichen.
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Bei
prophylaktischen Anwendungen werden die erfindungsgemäßen Peptide
oder pharmazeutische Zubereitungen davon Individuen verabreicht,
die noch nicht an einer unerwünschten
Krankheit oder einem unerwünschten
Zustand leiden, aber mit einem Risiko dafür behaftet sind. Die zu verabreichende
wirksame Menge des Peptids hängt
vom Gesundheitszustand und dem allgemeinen Grad der Immunität des Individuums
ab. Die wirksame Menge des Peptids bei prophylaktischen Anwendungen
liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,15 Mikrogramm pro Kilogramm
(mcg/kg) bis etwa 10 mg/kg des Peptids pro Dosis. Die wirksame Menge
kann von etwa 0,01 mg/kg bis etwa 10 mg/kg aktiver Wirkstoff pro
Dosis reichen. Bei prophylaktischen Anwendungen kann eine wirksame
Menge von L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr, oder eines pharmazeutisch
annehmbaren Salzes davon, von etwa 0,15 mg/kg bis etwa 10 mg/kg
des jeweiligen Peptids (oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes
davon) pro Dosis reichen.
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Bei
Verfahren zur Induktion der Erschlaffung glatter Muskeln bei Individuen,
welche dieser bedürfen, und
bei Verfahren zur Induktion der Erschlaffung von Skelettmuskeln
bei Individuen, welche dieser bedürfen, liegt die wirksame Menge
des Peptids für
jedes dieser Verfahren pro Dosis im Allgemeinen innerhalb eines Bereichs
von etwa 0,15 Mikrogramm pro Kilogramm (mcg/kg) bis etwa 10 mg/kg
des Peptids. Die wirksame Menge des erfindungsgemäßen Peptids
kann von etwa 0,01 mg/kg bis etwa 10 mg/kg pro Dosis reichen. Bei Verfahren
zur Induktion der Erschlaffung von glatten Muskeln oder von Skelettmuskeln
kann eine wirksame Menge L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr, oder eines
pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, von etwa 0,15 mg/kg bis
etwa 10 mg/kg des jeweiligen Peptids pro Dosis reichen.
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Alternativ
können
pharmazeutische Zubereitungen in Einheitsdosisform bei den oben
genannten Anwendungen, einschließlich Protokollen zur prophylaktischen
Behandlung, verabreicht werden. In einer Ausführungsform umfassen diese pharmazeutischen
Zubereitungen pro Einheitsdosis eine wirksame Menge von etwa 0,01
mg bis etwa 1000 mg L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr (oder eines pharmazeutisch
annehmbaren Salzes davon) und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. In
einer weiteren Ausführungsform
können
solche Zubereitungen pro Einheitsdosis eine wirksame Menge von etwa
1 mg bis etwa 100 mg L-Gly-L-Glu bzw. L-Val-L-Thr (bzw. eines pharmazeutisch
annehmbaren Salzes davon), und einen pharmazeutisch annehmbaren
Träger
umfassen.
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Die
bevorzugte Form der erfindungsgemäßen Peptide für Inocula
und die Dosierung hängt
von der klinischen Indikation ab. Das Inoculum wird normalerweise
aus einem getrockneten Peptid (oder dessen Konjugat) hergestellt,
indem das Peptid in einem physiologisch annehmbaren Verdünnungsmittel,
wie beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung oder Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung
suspendiert wird. Eine gewisse Variation bei der Dosierung tritt
notwendigerweise in Abhängigkeit
vom Zustand des behandelten Individuums auf, und der Arzt bestimmt
die geeignete Dosis für
das jeweilige Individuum. Die wirksame Peptidmenge pro Einheitsdosis
hängt unter
anderem vom Körpergewicht
und der Physiologie des Individuums ab, und vom gewählten Inoculationsprotokoll.
Eine Einheitsdosis des Peptids bezieht sich auf das Gewicht des
Peptids ohne das Gewicht eines Trägers (falls ein Träger verwendet
wird). Bei einer pharmazeutischen Zubereitung in Einheitsdosisform
wird eine wirksame therapeutische oder prophylaktische Behandlung
normalerweise durch Verabreichung von Peptid (oder eines pharmazeutisch
annehmbaren Salzes davon) innerhalb eines Bereichs von etwa 0,01
mg bis etwa 1000 mg pro Dosis erzielt, wobei einzelne Dosiseinheiten
des Peptids von etwa 1 mg bis etwa 100 mg betragen. Die pharmakologisch
wirksame Menge von L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr (oder eines pharmazeutisch
akzeptablen Salzes davon) liegt im Allgemeinen in einem Bereich
von etwa 0,01 mg bis etwa 1000 mg des jeweiligen Peptids pro Einheitsdosis. Üblicherweise
liegt die pharmakologisch wirksame Menge von L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr
(oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon) innerhalb eines
Bereichs von etwa 1 mg bis etwa 100 mg pro Einheitsdosis.
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Der
Verabreichungsweg der erfindungsgemäßen Peptide und pharmazeutischen
Zubereitungen hängt von
der Krankheit oder der klinischen Indikation und von der Stelle
ab, an der eine Behandlung erforderlich ist. Für topische Anwendung kann es
wünschenswert
sein, das Peptid oder dessen Zubereitung an der lokalen Stelle zu
verabreichen (z.B. unter Verwendung eines Katheders, der während einer
Operation in die Koronararterie gelegt wird, oder durch Anlegen
eines mit dem Peptid imprägnierten
chirurgischen Verbandes auf das während der Herzoperation zu
behandelnde Myokardgewebe). Alternativ kann es bei fortgeschrittenen
Krankheiten erwünscht
sein, das Peptid oder die Zubereitung systemisch zu verabreichen.
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Für weitere
Indikationen können
die erfindungsgemäßen Peptide
und pharmazeutischen Zubereitungen über intravenöse, intraperitoneale,
intramuskuläre,
subkutane, intranasale und intradermale Injektion, ebenso wie über intrabronchiale
Instillation (z.B. unter Verwendung eines Verneblers), und transmukosale, systemische,
transdermale (z.B. über
einen fettlöslichen
Träger
in einem Hautpflaster), orale und gastrointestinale Verabreichung
(z.B. mit einer Kapsel oder Tablette) verabreicht werden. Während oder
nach einer kardiovaskulären
Operation (z.B. Herz-Bypass-Operation, Angioplastie und dergleichen)
können
Peptide und pharmazeutische Zubereitungen über eine intravenöse Bolusinjektion
(oder durch Perfusion) verabreicht werden.
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Ein
oder mehrere erfindungsgemäße Peptide
können
in einer Kombinationstherapie verabreicht werden. Beispielsweise
können
ein oder mehrere erfindungsgemäße Peptide
in Kombination mit einem Antikoagulans (wie beispielsweise Streptokinase/Streptodornase,
Gewebe-Plasminogen-Aktivator oder Urokinase) einem Individuum verabreicht
werden, das einer solchen Behandlung bedarf, beispielsweise einem
Individuum, das zuvor eine Episode koronarer Thrombose durchlebt
hat.
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Die
Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von Peptiden der pharmazeutischen
Zusammensetzungen variieren in verschiedenen Individuen. Bei einem
akuten Fall kann es erwünscht
sein, eine therapeutische oder prophylaktische Konzentration des
Peptids in einem Organ, einer zu behandelnden Gewebestelle oder im
Blut des behandelten Individuums durch Verabreichung des Peptids
oder dessen Zubereitung an ein Individuum in einer Weise zu erreichen,
so dass die Konzentration des Peptids in dem Gewebe, Organ oder
im Blut schnell ansteigt. Beispielsweise kann die Konzentration
eines Peptids an einer bestimmten Stelle durch intravenöse Bolusinjektion
oder Infusion des Peptids oder einer pharmazeutischen Zubereitung
davon schnell gesteigert werden. Alternativ kann eine therapeutische
oder prophylaktische Konzentration des Peptids in einem Organ, an
einer zu behandelnden Gewebestelle oder im Blut des Individuums
erreicht werden, indem man eine ansteigende Menge oder Dosierung
des Peptids (oder einer pharmazeutischen Zubereitung davon) über einen
Zeitraum verabreicht, bis eine wirksame Menge des Peptids in dem
Organ, der Gewebestelle oder im Blut erreicht wird. Die anfängliche
Dosis für
diese Art von Protokoll hängt
von dem Verabreichungsweg ab. Um ein Beispiel zu nennen kann für eine intravenöse Verabreichung
einer pharmazeutischen Zubereitung, welche ein Peptid mit einem
Molekulargewicht von etwa 200 bis etwa 400 Dalton umfasst, eine
anfängliche
Dosierung von etwa 0,001 mg/kg bis etwa 10 mg/kg verabreicht werden.
Bei jeder nachfolgenden Verabreichung kann die Dosierung durch Erhöhung der
Peptidkonzentration um einen Faktor 10 erhöht werden.
-
Die
erfindungsgemäßen Peptide
können
allein oder in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren
Träger,
wie in den oben beschriebenen pharmazeutischen Zubereitungen, verabreicht
werden. Die Peptide können
als einzelne oder mehrfache Dosen verabreicht werden. Geeignete
pharmazeutische Träger umfassen
inerte, feste Verdünnungsmittel
oder Füllmittel,
sterile wässrige
Lösungen
und verschiedene nicht-toxische
organische Lösungsmittel.
Die durch Kombination eines erfindungsgemäßen Peptids mit einem pharmazeutisch
annehmbaren Träger
gebildeten pharmazeutischen Zubereitungen können in einer Vielzahl von
Dosierungsformen, wie beispielsweise Tabletten, Pastillen, Sirups,
injizierbaren Lösungen
und dergleichen einfach verabreicht werden. Falls gewünscht, können die
pharmazeutischen Träger
zusätzliche
Inhaltsstoffe enthalten, beispielsweise Geschmack gebende Mittel,
Bindemittel, Exzipienten und dergleichen.
-
Für orale
Verabreichung können
Tabletten, die verschiedene Exzipienten wie beispielsweise Natriumcitrat,
Kalziumcarbonat und Kalziumphosphat enthaltend, zusammen mit verschiedenen
Zerfallhilfsmitteln, wie beispielsweise Stärke, und bevorzugt Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, und
bestimmten komplexen Silikaten, zusammen mit Bindemitteln, wie beispielsweise
Polyvinylpyrrolidon, Saccharose, Gelatin und Acacia verwendet werden.
Für die
Tablettenherstellung werden auch Schmiermittel wie beispielsweise Magnesiumstereat,
Natriumlarylsulfat und Talkum zugegeben. Feste Zubereitungen ähnlicher
Art können
auch als Füllmittel in
salz- oder feststoffgefüllten
Gelatinkapseln verwendet werden. Für diesen Zweck bevorzugte Materialien umfassen
Laktose oder Milchzucker und Polyethylenglykole mit hohem Molekulargewicht.
Wenn wässrige Suspensionen
von Elixieren für
orale Verabreichung erwünscht
sind, kann der wesentliche, aktive Peptidinhaltsstoff darin mit
verschiedenen Süßungsmitteln
oder Geschmack gebenden Mitteln, farbigen Substanzen oder Farbstoffen,
und falls gewünscht,
emulgierenden oder suspendierenden Mitteln, zusammen mit Verdünnungsmitteln,
wie beispielsweise Wasser, Ethanol, Propylenglykol, Glycerin oder
Kombinationen davon, kombiniert werden.
-
Für parenterale
Verabreichung können
Lösungen
des Peptids (oder von dessen Analogon) in Sesam- oder Erdnussöl oder in
wässrigem
Polypropylenglykol verwendet werden, ebenso wie sterile wässrige Kochsalzlösungen der
entsprechenden wasserlöslichen,
pharmazeutisch annehmbaren Metallsalze, die zuvor beschrieben wurden.
Eine solche wässrige
Lösung
sollte erforderlichenfalls in geeigneter Weise gepuffert sein, und
das flüssige
Verdünnungsmittel
mit ausreichend Kochsalz oder Glucose zunächst isotonisch gemacht werden.
Diese besonderen wässrigen
Lösungen
sind insbesondere für
intravenöse,
intramuskuläre,
subkutane und intraperitoneale Injektion geeignet. Alle verwendeten
sterilen wässrigen
Medien sind über
dem Fachmann allgemein bekannte Standardverfahren einfach zu erhalten.
Darüber
hinaus können
die zuvor erwähnten
Verbindungen unter Verwendung einer für diesen besonderen Zweck geeigneten
Lösung
topisch verabreicht werden (beispielsweise durch einen gelegten
Katheder). Parenterale Lösungen
können
mit etwa 0,001–10
mg/ml Peptid in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren
Träger
in einer Lösung
aus steriler, physiologischer Kochsalzlösung formuliert werden und
zur Erzielung einer Dosis von etwa 0,1–10 mg/kg einem Individuum
verabreicht werden, das einer solchen Lösung bedarf.
-
V. VERFAHREN ZUR KONSERVIERUNG
LEBENDER GEWEBE UND ORGANE
-
Die
bereitgestellten erfindungsgemäßen Peptide
sind brauchbar, um lebende Gewebe oder Organe bei verschiedenen
Anwendungen ex vivo zu konservieren und zu lagern. Beispielsweise
sind diese Peptide brauchbar, um ein lebendes Gewebe oder Organ,
beispielsweise ein Herz oder ein Blutgefäß, vor der Transplantation
(oder Reimplantation) in ein Individuum ex vivo zu konservieren
und zu erhalten. Diese Peptide sind weiterhin brauchbar, um lebende
Gewebe und Organe unter ischämischen
Bedingungen zu konservieren und zu erhalten. Verfahren zur Konservierung
lebender Gewebe und Organe umfassen normalerweise das Inkontaktbringen
des Gewebes oder Organs mit einer Zubereitung, welche einen pharmazeutisch
annehmbaren Träger
und eine wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Peptids umfasst. Solche
Peptide umfassen L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste
umfassendes Polymer von L-Gly-L-Glu, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste
umfassendes Polymer von L-Val-L-Thr, oder eine Kombination davon,
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon. L-Gly-L-Glu und
L-Val-L-Thr und Polymere davon gehören zu den für die Verwendung
bei solchen Verfahren bevorzugten Peptiden. Für diese Verfahren ist die wirksame Menge
von L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr diejenige Menge, die ausreicht,
um eine Konzentration des Peptids von etwa 10–9 M
bis etwa 10–5 M
in dem zu behandelnden Gewebe oder zu behandelnden Organ zu erzeugen.
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VI. KITS ZUR KONSERVIERUNG
LEBENDER GEWEBE UND ORGANE
-
Die
Erfindung stellt auch für
die Konservierung lebender Gewebe oder Organe brauchbare Kits bereit. Diese
Kits umfassen eine wirksame Menge L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr oder
eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon und einen Behälter für das lebende
Gewebe. Die wirksame Menge von L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr liegt
im Allgemeinen innerhalb eines Bereichs von etwa 10–9 M
bis etwa 10–5 M.
Alternativ können solche
Kits ein Polymer von L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr, oder einer Kombination
davon umfassen, worin das Polymer nicht mehr als 16 Aminosäurereste
umfasst. Solche Kits umfassen einen Behälter für die Aufbewahrung des Peptids
und des Gewebes oder Organs.
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Die
vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die nachfolgenden Beispiele
veranschaulicht. Diese Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung
von Aspekten der vorliegenden Erfindung und sollen die Erfindung
nicht beschränken.
-
BEISPIELE
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BEISPIEL 1
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Isolierung, Aufreinigung
und Charakterisierung von Peptiden des Myokards, die Kaliumkanal öffnende
Aktivität aufweisen
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Die
erfindungsgemäßen Dipeptide,
GE und VT, und zwei Tetrapeptid-Polymere dieser Dipeptide wurden
folgendermaßen
identifiziert, isoliert und aufgereinigt.
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Für die Herstellung
eines als „Cardialin" bezeichneten Gewebeextrakts
stellte man etwa 0,5 Gramm (g) eines Extrakts mit niedrigem Molekulargewicht
aus Rinderherzgewebe bei einem pH von 2 bis 3 in Zinkchlorid (ZnCl)
her, wobei ein Verfahren angewendet wurde, das dem im UdSSR-Patent
Nr. 1,417,242 (1988) veröffentlichten
Verfahren ähnelt,
worauf hier für
alle Zwecke vollumfänglich
Bezug genommen wird. Man führte
mit etwa 100 Milligramm (mg) des erhaltenen Extrakts aus Rinderherzgewebe
eine Molekularsieb-Chromatographie
in präperativem
Maßstab
auf einer 2,6 × 88
Zentimeter (cm) Säule
mit G-25 Superfein-Harz (Pharmacia/LKB, Schweden) bei einer Fließgeschwindigkeit
von 1 Milliliter/Minute (ml/min) durch. Von dem Säuleneluat
wurden Fraktionen von 5 Milliliter gesammelt. Die Extinktion (optische
Dichte) jeder Fraktion wurde bei 214 bzw. 280 Nanometer (nm) gemessen.
Das erhaltene Chromatogramm war komplex.
-
Für die weitere
Analyse bildete man folgendermaßen
sieben Pools von Fraktionen: einen Leervolumen-Pool (Pool I); einen
Pool mit Zentrum enthaltendem Volumen (Pool II); einen Pool mit
Trailing enthaltendem Volumen (Pool III); und vier Trailing-Extinktions-Peaks enthaltende
Pools von Fraktionen (Pools IV, V, VI und VII). Die Bestandteile
der Pools I, II und III untersuchte man über Fast-Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC)
(Pharmacia/LKB, Schweden), wobei man das Gold-System
TM (Kodak)
und eine 5,0 × 30
Millimeter (mm)-Säule
mit G-25 Superfein-Harz (Pharmacia/LKB, Schweden) verwendete. Die
jeweiligen Bestandteile dieser Pools unterschied man voneinander
durch Vergleich der Elutionszeiten, der Peakflächen und der Messungen der
optischen Dichte bei ausgewählten
Wellenlängen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle A zusammengefasst.
- *Bestimmt aus den Daten der Extinktion unter
Annahme eines Extinktionskoeffizienten von ≈ 1,0 Molar–1 Zentimeter–1 (M–1cm–1).
- **Zwischen 199–214 nm oder 249–299 nm
beobachtete Extinktionspeaks.
-
Um
biologisch aktive Bestandteile in den Pools I bis VII aus der präperativen
Säule mit
G-25 Superfein-Harz zu identifizieren, screente man jeden Pool jeweils
unter Verwendung des in „Materialien
und Methoden für
den Screeningassay" beschriebenen
Radioimmunoassays (RIA) auf Aktivierung der Adenylatcyclase-Aktivität in Kulturen
isolierter Kardiomyozyten. Man fand, dass die Pools II und V die
Adenylatcyclase-Aktivität
in Kardiomyozyten signifikant erhöhten.
-
Dann
maß man
die optischen Dichten von Pool II und V zwischen 200 nm und 214
nm und bei 280 nm. Jeder Pool wies messbare optische Dichten bei
diesen Wellenlängen
auf. Da der Nachweis von optischen Dichten bei diesen Wellenlängen bei
Fraktionen, die von einer Molekularsieb-Säule gesammelt wurden, normalerweise
auf dem Vorliegen von Verbindungen mit aromatischen Resten und Peptidbindungen
beruht, legt dieser Nachweis von optischen Dichten bei den Pools
II und V nahe, dass diese Pools Verbindungen umfassen, welche aromatische
Reste und/oder Peptidbindungen aufweisen.
-
Um
sicherzustellen, dass die biologische Aktivität nicht auf einen anderen Bestandteil
zurückzuführen war,
der mit den bei zwischen 200 nm und 214 nm und bei 280 nm optische
Dichten aufweisenden Fraktionen coeluierte, beispielsweise einem
Lipid-Intermediat, führte
man mit Pool II zusätzlich
eine Molekularsieb-Chromatographie auf G-15 Superfein-Harz in Gegenwart
von organischen Lösungsmitteln
durch. Von dieser Säule gesammelte
Fraktionen wurden auf Aktivierung der Adenylatcyclase-Aktivität gescreent.
Zusätzlich
maß man die
optischen Dichten dieser Fraktionen bei den oben angegebenen Wellenlängen. Wie
zuvor hatten die Fraktionen, welche eine Aktivierung der Adenylatcyclase-Aktivität zeigten,
auch messbare optische Dichten bei den oben genannten Wellenlängen.
-
Pool
II wurde, wie oben, über
FPLC auf einer 5,0 × 30
cm Säule
mit G25 Superfein-Harz
weiter aufgereinigt. Die Eluatfraktionen wurden optisch bei Wellenlängen von
199 bis 214 nm und von 249 bis 299 nm überwacht. Fraktionen, welche
die drei (als B1, B2 und B3 bezeichneten) Hauptextinktionspeaks
enthielten, wurden über
Hochdruckflüssigkeitschromatographie
unter Verwendung einer 4,6 × 250
mm ODS 18/5 Mikroliter (μl)-Säule, die
mit einer Fließgeschwindigkeit
von 1 ml/min betrieben wurde, weiter analysiert. Die Elutionszeiten
und optischen Dichten der Elutionsfraktionen wurden erfasst und
für die
Unterscheidung von wenigstens sechs Hauptbestandteilen von Pool
II verwendet, die in Tabelle B unten zusammengefasst sind. Tabelle
B. Sechs Hauptbestandteile von Pool II nach HPLC-Aufreinigung
- Abkürzungen:
B1, B2 und B3 = drei Hauptextinktionspeaks von Fraktionen, die von
einer Fast-Proteinflüssigkeitschromatographie
(FPLC)-Säule
gesammelt wurden; SF = Superfein; HPLC = Hochdruckflüssigkeitschromatographie.
-
Man
untersuchte die einzelnen Peaks der ODS 18/5 μl HPLC auf Aktivierung der Adenylatcyclase-Aktivität unter
Verwendung des RIA-Screeningassays und anschließende zusätzliche HPLC-Trennung in verschiedenen
Lösungsmittelsystemen
(z.B. Acetonitril), einschließlich
sowohl isokratischer und Gradientenelutionsmethoden. Drei dicht
benachbarte Extinktionspeaks (Bestandteile 1–3 von Tabelle B, oben) wiesen
den Hauptteil der biologischen Aktivität auf, waren jedoch durch alle
verwendeten Techniken vergleichsweise untrennbar. Die Ergebnisse
legen nahe, dass ein oder mehrere Peptidkomplexe für die beobachtete
biologische Aktivität
der Bestandteile 1, 2 und 3 verantwortlich waren.
-
Anschließend führte man
mit jedem Peak einen Edman-Abbau durch. Die Mol-Verhältnisse
und die N-terminalen Reste der Aminosäuren, welche durch diese Analyse
nachgewiesen wurden, wiesen auf das Vorliegen von zwei Dipeptiden
und zwei Tetrapeptiden in den Fraktionen hin. Die Mol-Verhältnisse
der Dipeptide wiesen darauf hin, dass Glycin und Glutaminsäure in etwa
gleichen Mengen und Valin und Threonin ebenfalls in etwa gleichen
Mengen vorlagen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse stellte man
die synthetischen Peptide L-Gly-L-Glu (GE) und L-Val-L-Thr (VT)
her und führte
mit ihnen zusätzliche
Tests auf pharmakologische Aktivität durch, wie in den Beispielen
2 bis 9 unten gezeigt ist.
-
Materialien
und Methoden für
den Screeningassay
-
Unter
Verwendung der Langendorff-Perfusionsmethode, eines proteolytische
Enzyme enthaltenden Perfusats und mechanischen Schabens isolierte
man Kalziumtolerante Kardiomyozyten aus Ratten. Man isolierte die
Kardiomyozyten und beurteilte ihre Lebensfähigkeit anhand mikroskopischer,
morphologischer Kriterien und Trypanblau-Ausschluss.
-
Die
zur Untersuchung der Cardialin-Fraktionen verwendete Patch-Clamp-Methode
basiert auf den elektrophysiologischen Messungen von Ionenströmen, die
durch einzelne Ionenkanäle
im Sarkolemma wandern. Man verwendete Mikromanipulation und ein
Inversmikroskop zur Implantation von Glaselektroden in und auf die
Membran einzelner Kardiomyozyten. Durch Veränderung der Mediumzusammensetzung
in der Elektrode maß man
die Ionenströme
elektrisch sensitiver Kaliumkanäle,
einschließlich
ATP-sensitiver Typ I- und Typ
II-Rektifikationskanäle.
Durch Messung der austretenden Ströme bei jeder einzelnen Zelle
vor Zugabe der zu testenden Substanz (d.h. Testsubstanz) ermittelte
man einen Hintergrundwert. Über
diese Methode können Konformationsübergänge von
Ionenkanälen
vom Zustand „offen" zum Zustand „geschlossen", die sich in Schwankungen
der Ströme
widerspiegeln, gemessen werden. Man zeichnete Ionenströme auf einem
Magnetographen auf und digitalisierte sie dann für die Verarbeitung auf einem
IBM PC/AT-Computer
unter Verwendung einer PSL-718-Schnittstelle. Unter Verwendung von
Originalsoftware führte
man eine mathematische Analyse der Daten durch. Als Positivkontrollsubstanz
verwendete man den Gesamt-Cardialin-Peptidkomplex. Bei diesem Assay
führte
der Cardialin-Peptidkomplex innerhalb von einer Millisekunde (ms)
bei Konzentrationen von 10–4 bis 10–2 mg/ml
Cardialin zu einer Veränderung
der Membranströme,
und der Übergang
hielt in Gegenwart von Cardialin bis zu drei Stunden an.
-
Folgende
Ergebnisse wurden mit Cardialin aufgezeichnet. Zuerst verzeichnete
man nach 10- bis 15-minütiger
Inkubation mit 10–4 mg/ml Cardialin einen
steilen Anstieg des Ionenstroms, der darauf hinwies, dass die Kaliumkanäle „offen" waren (d.h. in einem
leitenden Zustand), wobei ein Peak erreicht wurde, der zehnfach
höher war
als die Basiswerte. Zweitens nahm bei höheren Cardialin-Konzentrationen
(z.B. 10–2 mg/ml)
innerhalb von 60 Minuten Inkubation der Kardiomyozyten mit dem Peptidkomplex
die Leitfähigkeit
für Kaliumionen
zu. Man maß die
Aktivierung der Kaliumkanäle
in Gegenwart von 10–4 mg/ml Cardialin an
der äußeren Oberfläche der
Zelle unter Verwendung der folgenden, an die Zelle angehängten Konfiguration:
gehaltene Millivolt (mV) = +20; zeitliche Auflösung = 0,424 ms; [K+]0 = 140 millimolar
(mM) (d.h. die extrazelluläre Kaliumionenkonzentration
betrug 140 mM), und ein Filterübertragungsband,
das anfänglich
(d.h. in den ersten 15–20
Sekunden) auf niedrigere Frequenzen bei etwa 1000 Hertz (Hz) und
anschließend
bei etwa 1,5 min auf etwa 300 Hz gelegt wurde. Bei jedem Zeitintervall
zeichnete man Strom-Spikes über
insgesamt etwa 220 ms auf. 15 bis 20 Sekunden nach der Zugabe von
Cardialin betrugen die maximalen, aufgezeichneten Ströme etwa
3 bis etwa 3,5 Picocampere (pA); der ausgelöste durchschnittliche Strom
betrug etwa 0,24 pA bei Strom-Spikes,
die jeweils eine Dauer von etwa 1 bis etwa 3 ms hatten; und die
Gesamtdauer der Ereignisse betrug etwa 17,3 ms (in der Gesamtaufzeichnungszeit
von 220 ms). Etwa 1,5 min nach der Zugabe von Cardialin betrugen
die aufgezeichneten maximalen Strom-Spikes etwa 8 pA, wobei jeder
Spike eine Dauer von etwa 2 bis etwa 4 ms hatte; der ausgelöste durchschnittliche
Strom betrug etwa 0,31 pA, und die Dauer der aufgezeichneten Ereignisse
betrug etwa 8 ms.
-
Der
Radioimmunoassay für
die Adenylatcyclase-Aktivität
in Kardiomyozyten wurde gemäß fachüblichen
Verfahren durchgeführt.
-
BEISPIEL 2
-
Wirkungen von GE und VT
auf die Kontraktionsaktivität
glatter Muskelproben der Pfortader der Ratte
-
Bei
diesem Experiment verglich man die Wirkungen von GE und VT auf die
spontane und Kaliumchlorid-induzierte Kontraktionsaktivität einer
glatten Muskelprobe (SMS) der Pfortader einer Ratte mit den durch Verapamil,
einem Vasodilator mit Kalziumionenkanal blockierender Aktivität, hervorgerufenen
Wirkungen. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass sowohl
GE als auch VT die spontane Kontraktionsaktivität der Pfortader der Ratte verringern
und erschlaffende Wirkungen auf venöse glatte Muskelproben ausüben. Weiterhin
beeinflusst keines dieser Dipeptide die Eigenschaften der tonischen
Kontraktion, die durch KCl in venösen glatten Muskeln induziert
wird.
-
Schritt 1. Verifizierung
der Eignung glatter Muskelproben aus der Pfortader der Ratte
-
SMS-Proben
der Pfortader der Ratte entnahm man chirurgisch aus zufallsgezüchteten
Ratten mit einem Gewicht von 200–250 g. Man bestimmte die Eignung
jeder isolierten SMS der Pfortader der Ratte durch Messung der spontanen
Kontraktionsantwort und der Kontraktionsantwort der Probe auf Kaliumchlorid
(KCl) folgendermaßen.
Man legte jede entnommene SMS in ein Organbad mit einer Standard-Krebs-Henseleit (KH)-Lösung bei
35 °C. Dann
gab man 0,5 ml physiologische Kochsalzlösung in das Organbad. Bei diesem Verfahren
war ein Ende des glatten Muskelstreifens fixiert, während das
andere Ende des Muskelstreifens mit einer Sonde verbunden war, welche
durch Kontraktion induzierte Signale an einen Analog/Digital-Wandler übertrug.
Man zeichnete die spontane Kontraktionskurve für jede SMS durch wiederholte
Messungen über
einen Zeitraum von einer Minute auf. Anschließend gab man 0,5 ml einer 600
mM KCl-Lösung
in physiologischer Kochsalzlösung
zu dem SMS-Proben/Organ-Bad,
wodurch eine Endkonzentration von 60 mM KCl eingestellt wurde. KCl
induziert die Kontraktion von Pfortadergewebe der Ratte bei einer
Gewebeendkonzentration von etwa 60 mM.
-
Dann
zeichnete man die durch KCl induzierte Kontraktionskurve für jede Probe über den
nachfolgenden Zeitraum von fünf
Minuten auf. Nach Bestimmung der Werte für spontane und KCl-induzierte
Kontraktionskurven einer SMS-Probe und Bestätigung von deren Eignung zur
Verwendung in den Experimenten wusch man die SMS-Probe anschließend mit
Standard-Krebs-Henseleit-Lösung
und stabilisierte sie durch 30-minütige Inkubation bei 35 °C. Während dieses
Stabilisierungszeitraums verifizierte man die spontane Kontraktionskurve
für jede
SMS durch Überwachung
der vom Analog/Digital-Wandler erhaltenen Daten.
-
Schritt 2. Bestimmung
der durch KCl induzierten Kontraktionsbasislinie
-
Man
bestimmte einen Wert der Basislinie für die Kontraktionsantwort einer
SMS auf KCl über
die im obigen Schritt 1 dargestellte Vorgehensweise. Genauer gesagt
legte man jede SMS bei 35 °C
in 0,5 ml physiologische Kochsalzlösung in einem Organbad. Man
zeichnete die spontane Kontraktionskurve für jede SMS-Probe auf, indem
man wiederholte Messungen über
einen Zeitraum von einer Minute durchführte. Dann gab man fünf Milliliter
einer 600 mM KCl-Lösung
in physiologischer Kochsalzlösung
zu jeder SMS, bis eine Endkonzentration von 60 mM KCl in dem Bad
eingestellt war. Anschließend
zeichnete man die durch KCl induzierte Kontraktionskurve für jede Probe über einen
Zeitraum von fünf
Minuten auf. Man wusch die SMS 30 Minuten bei 35 °C mit Standard-Krebs-Henseleit-Lösung. Die durch KCl induzierte
Kontraktionskurve sollte als Kontrollkurve für den Vergleich mit der durch
Kalium induzierten Kontraktionsantwort der SMS in Gegenwart einer
Testsubstanz oder einer Referenzsubstanz dienen. GE und VT dienten
als Testsubstanzen, und Verapamil dient als Referenzsubstanz in
diesem Experiment. Das „General
Pharmacology Service Program" („Current Test
Protocols", PAN
Lab, GSP-26) empfiehlt Verapamil als Referenzsubstanz bei diesem
bestimmten Modell.
-
Schritt 3. Bestimmung
der Basislinie für
spontane Kontraktion
-
Man
gab jeder SMS in dem gemäß den obigen
Schritten 2 und 3 hergestellten Organbad 0,5 ml physiologische Kochsalzlösung zu
und zeichnete die spontane Kontraktionskurve eine Minute auf. Jede
spontane Kontraktionskurve diente als Basislinienkurve (Kontrollkurve)
zum Vergleich mit den jeweiligen spontanen Kontraktionen jeder SMS
in Gegenwart einer Testsubstanz oder einer Referenzsubstanz.
-
Schritt 4. Vergleich der
Wirkungen von GE, VT und Verapamil auf die spontane und durch Kalium
induzierte SMS-Kontraktionsaktivität
-
Man
untersuchte die Wirkungen von GE, VT und Verapamil auf die Kontraktionsaktivität der SMS
folgendermaßen.
Man behandelte jede SMS mit GE, VT bzw. Verapamil durch Zugabe von
0,5 ml einer Lösung der
jeweiligen Substanz in physiologischer Kochsalzlösung zu der SMS-Probe/dem Organbad
aus Schritt 3, bis eine Endkonzentration von 10–6 g/ml
für GE
(4,9 × 10–6 M
Lösung
von GE), 10–6 g/ml
für VT
(4,58 × 10–6 M Lösung von
VT) bzw. 5 × 10–7 g/ml
für Verapamil
(1 × 10–6 M
Lösung
von Verapamil) eingestellt war. Man maß die Werte der spontanen Kontraktionskurve
für jede
SMS durch wiederholte Messungen der spontanen Kontraktionsaktivität jeder
Probe 2, 5, 10 und 15 Minuten nach Zugabe der Test- oder Referenzsubstanz
zu jeder SMS/jedem Organbad. Anschließend gab man 0,5 ml einer 600
mM KCl-Lösung
in physiologischer Kochsalzlösung
zu jeder SMS in dem Organbad, bis eine Endkonzentration von 60 mM
KCl eingestellt war. Dann maß man
fünf Minuten
die Kontraktionsaktivität
jeder SMS.
-
Schritt 5. Berechnungen
-
Dann
beurteilte man die spontane Kontraktionsaktivität jeder SMS-Probe durch Messung
der Kontraktionsamplitude und der Fläche unter der Kontraktionsamplitude
(AUC) für
die Dauer von einer Minute. Die Werte der Parameter nach Zugabe
von GE, VT und Verapamil drückte
man als Prozentsatz der entsprechenden Basislinienwerte (Kontrollwerte)
aus, die in Schritt 3 erstellt worden waren. Die Ergebnisse sind
in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.
-
Man
bestimmte die tonische (Kalium-induzierte) Kontraktionsaktivität durch
Berechnung der Fläche unter
der Kontraktionskurve für
die Dauer von einer Minute. Die Parameterwerte nach Zugabe von GE,
VT und Verapamil drückte
man als Prozentsatz der entsprechenden Basislinienwerte (Kontrollwerte)
aus, die für
die durch Kalium induzierte Kontraktion in Schritt 2 erstellt worden
waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Für jede Test-
oder Referenzsubstanz wurden Bestimmungen bei 5 isolierten SMS-Proben
vorgenommen. Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte mit Standardabweichung
dargestellt. Tabelle
1. Die Wirkungen von GE und VT auf die spontane Aktivität glatter
Muskelzellen der Pfortader der Ratte
- *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter
Student's t-Test)
vom Kontrollwert (100 %).
- Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung.
Tabelle
2. Die Wirkungen von GE und VT auf die spontane Aktivität glatter
Muskelzellen der Pfortader der Ratte - *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter
Student's t-Test)
vom Kontrollwert (100 %).
- Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung
Tabelle
3. Die Wirkungen von GE und VT auf die durch KCl induzierte tonische
Kontraktion der Pfortader der Ratte - *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter
Student's t-Test)
vom Kontrollwert (100 %).
-
Wie
in den Tabellen 1 und 2 gezeigt, verringerten sowohl GE als auch
VT merklich die Amplitude der Kontraktionskurve und die Fläche unter
der Kontraktionskurve für
spontane Kontraktionen, die entnommene venöse glatte Muskelproben in Organkultur
zeigten. Es ist erwähnenswert,
dass die VT-induzierte Wirkung schneller einsetzte als bei Verapamil.
Die in den Tabellen 1 und 2 vorgestellten Daten zeigen, dass GE
und VT Erschlaffung hervorrufende Wirkungen auf die glatten Muskeln
von Gefäßen in Organkultur
hatten.
-
Wie
in Tabelle 3 gezeigt ist, beeinflussten weiterhin weder GE noch
VT die Eigenschaften der tonischen Kontraktion, die in venösen glatten
Muskelproben durch KCl induziert wurden, obwohl GE und VT die spontane
Kontraktion verringerten. Die Ergebnisse stehen im Gegensatz zu
denen, die bei Verapamil beobachtet wurden, welches eine ausgeprägte Wirkung
auf die durch KCl induzierte tonische Kontraktion ausübte.
-
Es
ist bekannt, dass in Proben glatter Gefäßmuskeln Substanzen mit Kaliumkanalaktivität die spontane
Kontraktionsaktivität
verringern, nicht dagegen die durch Kalium induzierte Kontraktionsaktivität. Nidel
et al., Br. J. Pharm. 95: 741–52
(1988). Die Ergebnisse dieses Experiments deuten darauf hin, dass
GE und VT Kaliumkanalaktivität
aufweisen, da sie beide die spontane Kontraktionsaktivität, nicht
aber die durch Kalium induzierte tonische Kontraktionsaktivität verringern.
-
BEISPIEL 3
-
Wirkungen von GE und VT
auf die Kalzium-induzierte Kontraktionsaktivität von Proben intestinaler glatter
Muskeln
-
Bei
diesem Experiment wurden die Wirkungen von GE und VT auf die Kalzium-induzierte Kontraktionsaktivität von Proben
intestinaler glatter Muskeln untersucht. Die Ergebnisse dieses Experiments
zeigen, dass GE und VT die Amplitude der Kalzium-induzierten tonischen Kontraktion glatter
Muskeln verringern und die Erschlaffung glatter Muskeln induzieren.
-
GE
und VT dienten in diesem Experiment als Testsubstanzen. GE wurde
bei Konzentrationen von 10–6 g/ml und 10–5 g/ml
(4,9 × 10–6 M
bzw. 4,9 × 10–5 M)
getestet, und VT wurde bei Konzentrationen von 10–6 g/ml und
10–5 g/ml
(4,58 × 10–6 bzw.
4,58 × 10–5 M)
getestet. Die Kalziumionenkanalblocker Verapamil, cholinolytisches
Atropin und Diltiazem dienten als Referenzsubstanzen und wurden
bei den folgenden Konzentrationen getestet: 10–8 g/ml
und 10–7 g/ml
Verapamil (2,04 × 10–8 M
bzw. 2,04 × 10–7 M);
10–6 g/ml
und 10–7 g/ml
cholinolytisches Atropin (1,48 × 10–7 M
bzw. 1,48 × 10–6 M);
und 10–9 g/ml
und 10–8 g/ml
Diltiazem (2,2 × 10–9 M
bzw. 2,2 × 10–8 M).
-
Schritt 1. Probenherstellung
-
SMS-Proben
aus dem Dünndarm
von 10 Meerschweinchen wurden chirurgisch entnommen und wie folgt
zubereitet. Zuerst inkubierte man die SMS-Proben 40 Minuten in einem
Organbad, das eine physiologische Standard-Krebs-Henseleit-Salzlösung enthielt,
die Kalziumchlorid (CaCl2) mit einer Konzentration
von 2,5 mM enthielt. Dann wusch man jede SMS mit Kalzium-freier
Krebs-Henseleit-Lösung
und inkubierte 40 Minuten in einer Kalzium-freien Krebs-Henseleit-Lösung. Bei
jeder SMS wurde die Kontraktionsaktivität vorinduziert, indem man das
die Probe enthaltende Organbad zuerst 15 Minuten mit einer 30 mM
KCl enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung perfundierte und dann
das Bad weitere 15 Minuten mit einer 20 mM CaCl2 enthaltenden
Krebs-Henseleit-Lösung
perfundierte. Schließlich
wusch man jede SMS-Probe 40 Minuten mit Kalzium-freier Krebs-Henseleit-Lösung. Bei
diesen Experimenten dienten Messungen der Kontraktionsantwort der SMS
nach Zugabe einer 20 mM Kalzium enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung als
Kontrolle (Basislinie). Änderungen
der Kontraktionsamplituden wurden über das in Schritt 1 von Beispiel
2 oben dargelegte Verfahren aufgezeichnet.
-
Schritt 2. Anwendung I
-
Nach
Waschen der SMS wie in Schritt 1 dargelegt, perfundierte man das
Organbad mit der SMS-Probe 15 Minuten mit der Lösung einer Test- oder Referenzsubstanz.
In diesem Fall dienten GE und VT als die Testsubstanzen, wobei jedes
Dipeptid bei einer Konzentration von 10–6 g/ml
getestet wurde. Die folgenden Referenzsubstanzen wurden verwendet:
10–8 g/ml
Verapamil, 10–7 g/ml
cholinolytisches Atropin und 10–9 g/ml
Diltiazem.
-
Nach
Perfusion mit der Test- oder Referenzsubstanz perfundierte man die/das
SMS-Probe/Organbad 10
Minuten mit einer 30 mM KCl enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung und
dann weitere 10 Minuten mit einer 20 mM CaCl2 enthaltenden
Krebs-Henseleit-Lösung.
Anschließend
wusch man jede SMS-Probe 40 Minuten mit Kalzium-freier Krebs-Henseleit-Lösung. Man beurteilte die Wirkung
der Test- oder Referenzsubstanz auf die SMS-Probe durch Messen der
Kontraktionsantwort (d.h. die Änderung
der Kontraktionsamplitude) der Probe nach Zugabe der 20 mM CaCl2 enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung.
-
Schritt 3. Anwendung II
-
Man
brachte jede SMS aus Schritt 2 ein zweites Mal mit der gleichen
Test- oder Referenzsubstanz in Kontakt, indem man die folgenden
Konzentrationen jeder jeweiligen Referenz- oder Testsubstanz dem
Perfusat des Organbads zugab: 10–7 g/ml
Verapamil; 10–6 g/ml
cholinolytisches Atropin; 10–8 g/ml Diltiazem und
entweder 10–5 g/ml
GE oder 10–5 g/ml
VT.
-
Anschließend perfundierte
man das Organbad 10 Minuten mit einer 30 mM KCl enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung und
dann weitere 10 Minuten mit einer 20 mM CaCl2 enthaltenden
Krebs-Henseleit-Lösung.
Man beurteilte die Wirkung der jeweiligen Test- oder Referenzsubstanz
ein zweites Mal durch Messen der Änderung der Kontraktionsamplitude
der SMS nach Zugabe der 20 mM CaCl2 enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung. Die
Effizienz der Herzarbeit beurteilte man durch Bestimmung der Fläche unter
der Kontraktionskurve einer isolierten glatten Muskelprobe.
-
Wie
die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, verringerten sowohl GE als auch
VT die Amplitude der Kalzium-induzierten tonischen Kontraktion intestinaler
glatter Muskeln signifikant. Bemerkenswerterweise war die Wirkung
von VT größer als
die der gewöhnlichen
Kalziumionenkanal-Blocker Verapamil und Diltiazem.
- *Signifikant
verschieden (P < 0,05,
Student's t-Test)
vom Kontrollwert (100 %).
- 2% der Kontrolle, wobei Kontrollwerte
wie in Schritt 1 von Beispiel 3 beschrieben nach Zugabe einer 20
mM Kalzium enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung erfasst wurden.
- Abkürzungen:
KH = Krebs-Henseleit
-
BEISPIEL 4.1
-
Wirkungen von GE und VT
auf die inotrope Funktion eines normalen Rattenherzens
-
Dieses
Experiment wurde konzipiert, um die jeweiligen Wirkungen von GE
und VT auf die inotrope Funktion eines isolierten Rattenherzens
zu beurteilen. Man maß die
inotrope Funktion des Herzens durch Messung verschiedener Parameter,
einschließlich
des systolischen Drucks im linken Ventrikel (Psyst. mm
Hg); des diastolischen Drucks im linken Ventrikel (Pdiast. mm
Hg); (iii) des sich aufbauenden Drucks (Pev. =
Psyst.– Pdiast. mm Hg); (iv) der maximalen Steigerungsrate
des linken Ventrikeldrucks (+dp/dtmax mm
Hg/sec); und (v) der maximalen Abnahmerate des linken Ventrikeldrucks
(–dp/dtmax mm Hg/sec). Zusätzlich bestimmte man die Herzfrequenz
(HR) jedes Herzens aus den Aufzeichnungen der Druckschwankungen
des linken Ventrikeldrucks. Dieses Experiment zeigt, dass weder
GE noch VT eine signifikante Wirkung auf die inotrope Funktion oder
auf die Herzfrequenz eines normalen Herzens ausübt.
-
Man
gewann Rattenherzproben chirurgisch von weißen, zufallsgezüchteten,
männlichen
Ratten mit einem Gewicht von etwa 250 g. Man hielt die Herzen unter
Verwendung retrograder Herzperfusion nach der Langendorff-Methode
in Kultur, wobei eine übliche
oxigenierte (95 % O2 und 5 % CO2)
Krebs-Henseleit-Lösung durch
eine gläserne
Aortenkanüle
geleitet wurde. Der Retroperfusionsdruck bewirkt ein Schließen der
Aortenklappen. Auf diese Weise trat die oxigenierte Lösung nur
durch das koronare Gefäßsystem
des Herzens, so dass beide Ventrikel praktisch leer blieben.
-
Perfusionsbedingungen:
eine durchschnittliche, konstante Perfusionsgeschwindigkeit von
15 bis 25 ml/min wurde bei einem konstanten Perfusatdruck von 80
cm H2O (0,0774 Atm) aufrechterhalten.
-
Druckmessungen:
Ein mit einer Druck übertragenden
Vorrichtung (EMT-746 Siemens-Elema, Schweden) verbundener Latexballon-Katheder
wurde in den linken Ventrikel des Herzens eingeführt, um Parameter der inotropen
Funktion des Herzens zu messen. Die Kurve der intraventrikulären Druckschwankung
des linken Ventrikels wurde mit einem Polygraph aufgezeichnet.
-
Experimentelles
Protokoll: GE und VT dienten als Testsubstanzen. Nach einer 30-minütigen Anpassung
des Herzens an die Bedingungen der Organkulturperfusion nahm man
eine Reihe von Basalmessungen (Kontrollmessungen) vor, wie in (i)
bis (v) unten beschrieben wird. Nach diesen Messungen führte man
GE oder VT mit einer Dosis von 10, 100 oder 1000 μg pro 0,1
ml Krebs-Henseleit-Lösung
in den Perfusatfluss ein. Das sympathomimetische Amin Isoproterenol
(Novodrin, Germed, Deutschland) diente als Referenzsubstanz und
wurde mit einer Dosierung von 0,01 mg verabreicht. Isoproterenol
erniedrigt bekanntermaßen
den peripheren Gefäßwiderstand
und erhöht
den Herzausstoß aufgrund
seiner positiv inotropen (d.h. die Effizienz der von einem ischämischen
Herzen verrichteten Kontraktionsarbeit steigernden) und chronotropen
Wirkungen bei intravenöser
Infusion in ein Individuum. Siehe GOODMAN UND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL
BASIS OF THERAPEUTICS 160 (Goodman et al., Hrsg., 7. Aufl., 1985).
Jede Dosis jeder jeweiligen Test- oder Referenzsubstanz testete
man bei vier verschiedenen Rattenherzen. Man beurteilte die inotropen
Funktionen jedes der vier Rattenherzen durch Messen: (i) des systolischen
Drucks im linken Ventrikel (Psyst. mm Hg);
(ii) des diastolischen Drucks im linken Ventrikel (Pdiast. mm
Hg); (iii) des sich aufbauenden Drucks (Pev. =
Psyst. – Pdiast. mm Hg); (iv) der maximalen Steigerungsrate
des linken Ventrikeldrucks (+dp/dtmax mm
Hg/sec); und (v) der maximalen Abnahmerate des linken Ventrikeldrucks
(–dp/dtmax mm Hg/sec). Zusätzlich bestimmte man aus den
Aufzeichnungen der Druckschwankungen des linken Ventrikeldrucks
die Herzfrequenz (HR) jedes Herzens.
-
Wie
die in den Tabellen 5A und 5B dargestellten Ergebnisse zeigen, hatte
weder GE noch VT eine signifikante Wirkung auf die inotrope Funktion
oder die Herzfrequenz des Herzens. Jedes Dipeptid hatte vielmehr
eine geringe oder minimale Wirkung auf diese Parameter. Tabelle
5A. Die Wirkung von GE auf die Arbeit des entnommenen, unter Verwendung
der Langendorff-Perfusionsmethode perfundierten Rattenherzens (Mittelwert
der Messungen)
- *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) vom Basalwert
(Kontrollwert).
- Abkürzungen:
mg = Mikrogramm; Subst. = Substanz; abs = absoluter Wert; HR = Herzfrequenz;
hb/min = Herzschläge/Minute;
Psyst. = systolischer Druck im linken Ventrikel;
Pdiast. = diastolischer Druck im linken
Ventrikel; Pev = sich aufbauender Druck;
+dp/dtmax = maximale Steigerungsrate des
linken Ventrikeldrucks; –dp/dtmax = maximale Abnahmerate des linken Ventrikeldrucks.
Tabelle
5B. Die Wirkung von VT auf die Arbeit des entnommenen, unter Verwendung
der Langendorff-Perfusionsmethode perfundierten, Rattenherzens (Mittelwert
der Messungen) - *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) vom Basalwert
(Kontrollwert).
- Abkürzungen:
mg = Mikrogramm; Subst. = Substanz; abs = absoluter Wert; HR = Herzfrequenz;
hb/min = Herzschläge/Minute;
Psyst. = systolischer Druck im linken Ventrikel;
Pdiast. = diastolischer Druck im linken
Ventrikel; Pev = sich aufbauender Druck;
+dp/dtmax = maximale Steigerungsrate des
linken Ventrikeldrucks; –dp/dtmax = maximale Abnahmerate des linken Ventrikeldrucks.
-
BEISPIEL 4.2
-
Wirkungen von GE und VT
auf die inotrope Funktion des ischämischen Myokards
-
Bei
diesem Experiment beurteilte man die Wirkungen von GE und VT auf
die inotrope Funktion des ischämischen
Myokardgewebes durch Messen verschiedener Parameter der inotropen
Herzfunktion. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass jedes
dieser Dipeptide die inotrope Funktion von Myokardgewebe, bei dem
Ischämie
induziert worden war, wiederherstellt und die Wirkungen von ischämischem
Schaden in Myokardgewebe verringert.
-
Man
entnahm Rattenherzen chirurgisch aus weißen, zufallsgezüchteten
Ratten mit einem Gewicht von etwa 250 g. Man perfundierte die entnommenen
Herzen auf retrograde Weise (d.h. nach Langendorff und unter Verwendung
eines konstanten Perfusatdrucks von 80 cm [0,0774 Atm] Wasser) mit
einer üblichen
oxigenierten (95 % O2 und 5 % CO2) Krebs-Henseleit-Lösung. Die
Herzen hielten eine gleichmäßige, spontane
Kontraktionsfrequenz ein. Man führte
einen mit einer Druck übertragenden
Vorrichtung (EMT-746 Siemens-Elema, Schweden) verbundenen Latexballon-Katheder
in den linken Ventrikel jedes Herzens ein, um die inotrope Funktion
des Herzens zu messen (wie in Beispiel 3 oben beschrieben). Man
zeichnete die Kurve der Druckschwankung des linken Ventrikels mit
einem Polygraph auf.
-
Experimentelles Protokoll:
-
Die
Stufe I („Adaptationsprotokoll") bestand aus einer
30-minütigen
Anpassung der jeweiligen Rattenherzen an das Perfusionprotokoll.
Man zeichnete die Basislinienparameter der inotropen Funktion jedes
Herzens auf, um die prä-ischämischen
Werte für
die folgenden gemessenen Parameter zu ermitteln: (i) den systolischen
Druck im linken Ventrikel (Psyst. mm Hg);
(ii) den diastolischen Druck im linken Ventrikel (Pdiast. mm
Hg); (iii) den sich aufbauenden Druck (Pev. =
Psyst. – Pdiast. mm Hg); (iv) die maximale Steigerungsrate
des linken Ventrikeldrucks (+dp/dtmax mm
Hg/sec); und (v) die maximale Abnahmerate des linken Ventrikeldrucks
(–dp/dtmax mm Hg/sec). Zusätzlich bestimmte man aus den
für die
Variationen des linken Ventrikeldrucks über die Zeit gemachten Aufzeichnungen
die Herzfrequenz (HR) jedes Herzens. In Stufe II („ischämische Simulation") induzierte man
Ischämie
durch Unterbrechung der Versorgung des Herzens mit der Perfusionslösung. Etwa
30 Minuten später
initiierte man Stadium III („Reperfusionsprotokoll"), indem man die
Reperfusion wieder aufnahm und in die Perfusatlösung eine Test- oder Kontrollsubstanz
bei einer der folgenden, jeweiligen Konzentrationen einbezog: eine
Perfusatlösung
einer Testsubstanz umfasste 0,06, 0,6 oder 6,0 mg/l GE bzw. 0,06,
0,6 oder 6,0 mg/l VT; eine Perfusatlösung der Positivkontrollsubstanz
umfasste 14 mg/l Inosin. Inosin ist eine Nukleosidzubereitung, die
eine günstige
inotrope Wirkung sowohl auf normales als auch auf ischämisches
Myokard ausübt, wogegen
sie keine Rhythmusstörungen
oder Beschleunigung der Entwicklung ischämischer Kontraktur induziert.
Woollard et al., Cardiovasc. Res. 15: 659–67 (1981). Inosin wurde von
der Sigma Chemical Company, USA, bezogen (Cat.-Code I-4125; Chargennummer
81H0227). Die Negativkontrollsubstanz umfasste eine Reperfusion
unter Verwendung einer üblichen
oxigenierten Krebs-Henseleit-Lösung.
-
Man
beurteilte die inotrope Funktion des Myokards für jedes Herz durch Messen der
oben besprochenen Parameter (i) bis (v) und der Herzfrequenz. Diese
sechs Parameter zeichnete man während
der Untersuchung kontinuierlich auf (d.h. beginnend mit Stufe I
und fortgesetzt bis zur Stufe III). Die Aufzeichnungen wurden zu
den folgenden Zeitpunkten analysiert: (a) unmittelbar vor Beginn
der Stufe II (d.h. nach der 30-minütigen Anpassungsperiode gemäß Stufe
I, aber vor Unterbrechung der Perfusion); und (b) nach 1-, 5-, 10-,
20- und 30-minütiger
Reperfusion in der Stufe III.
-
Die
Frequenz und Dauer der Rhythmusstörungen in der 30-minütigen Reperfusionsperiode
in Stufe III bestimmte man durch Messen der folgenden Parameter:
(i) der Anzahl der ventrikulären
Extrasystolen; (ii) der Gesamtdauer der ventrikulären Tachykardien
(in Sekunden); und (iii) der Gesamtdauer der ventrikulären Fibrillation
(in Sekunden). Man testete jede Dosis der Testsubstanz an neun isolierten
Herzen.
-
Die
Ergebnisse dieser Untersuchung sind in den Tabellen 6 bis 12 nachfolgend
gezeigt. Wie in Tabelle 6 gezeigt, führt die Induktion von Ischämie bei
diesem Herzmodell zu einer etwa 50%igen Verringerung des systolischen
Drucks eine Minute nach Initiierung der Reperfusion in Stufe III
(Negativkontrolle). Obwohl eine gewisse Erholung des systolischen
Drucks bei der Negativkontrolle zu den Zeitpunkten 5 und 10 Minuten
beobachtet wurde (d.h. Erholung auf etwa 78% des prä-ischämischen
systolischen Drucks), verschlechterte sich der Druck danach. Eine
Reperfusion mit GE oder VT in den Konzentrationen 0,06 bzw. 0,6
mg/l verhinderte den bei der Negativkontrolle beobachteten dramatischen
Abfall des systolischen Drucks. In diesem Modell waren die Wirkungen
von GE und VT deutlicher und stellten sich schneller ein als die
Wirkungen von Inosin, welches eine allmähliche Verbesserung des systolischen
Drucks während
der 30-minütigen
Beobachtungsdauer bewirkte. Tabelle
6. Die Wirkungen von GE und VT auf den systolischen Druck in einem
ischämischen
linken Ventrikel während
der Reperfusion (% der prä-ischämischen
Parameterwerte)
- *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den
entsprechenden Werten der Negativkontrollgruppe.
-
Die
Messungen der maximalen Steigerungsraten des Drucks der ischämischen
linken Ventrikel (+dp/dtmax) von Rattenherzen
sind in Tabelle 7 zusammengefasst. Die Induktion von Ischämie bei
diesem Herzmodell führte
zu einer etwa 46%igen Verringerung im +dp/dtmax-Wert
der Negativkontrolle eine Minute nach Initiierung der Reperfusion.
-
Während man
eine Erholung des +dp/dt
max bei der Negativkontrolle
auf etwa 82 % von dessen prä-ischämischen
Wert nach fünf
Minuten beobachtete, verschlechterte sich der +dp/dt
max anschließend. Man
fand, dass GE und VT den +dp/dt
max-Wert
während
der ersten Minute der Reperfusion erhöhten. Bemerkenswerterweise
fand man, dass Konzentrationen von 0,6 mg/l GE bzw. VT den +dp/dt
max eines isolierten Herzens nach 30-minütiger Reperfusion
beinahe auf dessen prä-ischämischen
Niveau wiederherstellten. Tabelle
7. Die Wirkungen von GE und VT auf die maximale Steigerungsrate
des linken Ventrikeldrucks während
der Reperfusion (% des prä-ischämischen
Parameterdurchschnittswerts)
- *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den
entsprechenden Werten der Negativkontrollgruppe.
-
Die
Wirkungen verschiedener Konzentrationen von GE und VT auf den diastolischen
Druck in diesem Rattenherzmodell sind in Tabelle 8 dargestellt.
Nach Induktion von Ischämie
in diesem Modell steigerte sich in der Negativkontrolle der diastolische
Druck im linken Ventrikel um mehr als das Zweifache. Sowohl GE als auch
VT verhinderten den Anstieg des diastolischen Drucks und erwiesen
sich in diesem Modell als wenigstens ebenso wirksam wie Inosin. Tabelle
8. Die Wirkungen von GE und VT auf den diastolischen Druck in einem
ischämischen
linken Ventrikel während
der Reperfusion (% des prä-ischämischen
Parameterdurchschnittswerts)
-
Die
Messungen der maximalen Abnahmerate des linken Ventrikeldrucks (–dp/dt
max) in ischämischen linken Ventrikeln von
Rattenherzen sind in Tabelle 9 zusammengefasst. Diese Ergebnisse
zeigen für
die Negativkontrolle eine etwa 50%ige Verringerung des –dp/dt
max-Wertes
eines ischämischen
linken Ventrikels eine Minute nach Initiation der Stufe III-Reperfusion (die
Negativkontrolle). Obwohl sich der Parameter –dp/dt
max für die Negativkontrolle
nach etwa 10 Minuten auf etwa 88 % von dessen prä-ischämischem Wert erholte, nahm –dp/dt
max danach ab. Bei diesem Modell beobachtete
man, dass GE und VT jeweils den –dp/dt
max-Wert
im ischämischen
linken Ventrikel innerhalb der ersten Minute der Reperfusion signifikant
erhöhten;
beispielsweise erhöhte
sich der Parameterdurchschnittswert mit 0,06 mg/l GE, 0,06 mg/l
VT bzw. 0,6 mg/l VT auf etwa 80 bis 100 % von dessen prä-ischämischen
Wert. Zu späteren
Zeitpunkten war –dp/dt
max für
ein mit 0,6 mg/l GE, 6,0 mg/l GE bzw. 0,6 mg/l VT behandeltes Herz
normalerweise höher
als bei der Negativkontrolle, und betrug in der 30. Minute der Reperfusion
mehr als 90 % von dessen prä-ischämischen
Wert. Die Reperfusion mit Inosin (der Positivkontrollsubstanz) führte in
einer solchen Weise zu einem langsamen, gleichmäßigen Anstieg des –dp/dt
max in einem Herzen, dass nach etwa 10 bis
20 Minuten etwa 80 % des prä-ischämischen
Werts für
den Parameter erreicht wurden. Tabelle
9. Die Wirkungen von GE und VT auf die maximale Rate der Druckabnahme
des linken Ventrikels während
der Reperfusion (% des prä-ischämischen
Parameterdurchschnittswerts)
- *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den
entsprechenden Werten der Negativkontrollgruppe.
-
Der
sich aufbauende Druck des Herzens ist ein wichtiger Parameter, der
die inotrope Pumpfunktion des Herzens wiederspiegelt. Die in Tabelle
10 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass nach Induktion von Ischämie im linken
Ventrikel eines Rattenherzens der sich aufbauende Druck innerhalb
von einer Minute auf etwa 29% von dessen prä-ischämischen Wert abnahm und während der
anschließenden
30-minütigen
Beobachtungsdauer niemals etwa 55 % von dessen prä-ischämischem
Wert überschritt.
Reperfusion mit GE und VT steigerte die gemessenen Werte des sich
aufbauenden Drucks auf etwa 70 bis 100 % der jeweiligen prä-ischämischen
Werte. Man fand, dass Reperfusion mit entweder 0,6 mg/l GE oder
0,6 mg/l VT den Wert des sich aufbauenden Drucks eines ischämischen
linken Ventrikels nach etwa 20 bzw. etwa 30 Minuten der Reperfusion
auf etwa 85 % oder mehr von dessen jeweiligem prä-ischämischen Wert wiederherstellte. Tabelle
10. Die Wirkungen von GE und VT auf die Abnahme des sich aufbauenden
Drucks in einem ischämischen
linken Ventrikel während
der Reperfusion (% des prä-ischämischen
Parameterdurchschnittswerts)
- *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den
entsprechenden Werten der Negativkontrollgruppe.
-
Die
Wirkungen von GE und VT auf die Herzfrequenz in diesem Rattenmodell
sind in Tabelle 11 dargestellt. Bei Konzentrationen von 0,06 und
6,0 mg/l führten
GE und VT jeweils zu einer erwünschten,
mäßig negativ
chronotropen Wirkung auf die Herzfrequenz (d.h. einer Verringerung
der Herzfrequenz). Tabelle
11. Die Wirkungen von GE und VT auf die Herzfrequenz bei Reperfusion
(% des prä-ischämischen
Parameterdurchschnittswerts)
- *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den
entsprechenden Werten der Negativkontrollgruppe.
-
Tabelle
12 zeigt die Wirkungen von GE und VT auf die Frequenz und Dauer
ventrikulärer
Rhythmusstörungen
während
der Reperfusion. Weder GE noch VT hatten bei dem in dieser Untersuchung
verwendeten Rattenherzmodell eine Rhythmus störende Wirkung. Tabelle
12. Die Wirkungen von GE und VT auf die Frequenz und Dauer ventrikulärer Rhythmusstörungen während der
Reperfusion
- *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den
entsprechenden Werten der Negativkontrollgruppe.
-
Zusammenfassend
erwies sich, dass GE und VT die inotrope Funktion des Herzens während der
Ischämie
optimieren, wie durch Verbesserungen der gemessenen Werte des systolischen
Drucks, des sich aufbauenden Drucks und der maximalen Steigerungsrate
des linken Ventrikeldrucks (+dp/dtmax) in
den getesteten Rattenherzen gezeigt wurde. GE und VT verhinderten
weiterhin die Entwicklung ischämischer
Kontrakturen und riefen beim ischämischen Myokard keine Rhythmus
störende
Wirkung hervor. Diese beobachteten Wirkungen stimmen mit denen überein,
die durch pharmazeutische Verbindungen mit Kaliumkanal öffnender
Aktivität
induziert werden.
-
BEISPIEL 5
-
Wirkungen von GE und VT
auf ischämische
Läsionen
des Myokards bei Tieren
-
Eine
Ligation der Koronararterie führt
zu akuter myokardialer Ischämie
mit irreversiblen Läsionen
der Kardiomyozytenmembranen und zur Freisetzung intrazellulärer, myokardialer
Enzyme, einschließlich
Creatinphosphokinase (CPK), in das Blut. Der Grad der enzymatischen
Aktivität
von CPK im Plasma während
der ersten Stunden der Ischämie
wurde in Korrelation gebracht mit dem Ausmaß der myokardialen ischämischen
Läsion.
Siehe z.B. G. Forster et al., Method of Enzymatic Analysis (U. Bergmeyer
und W. Weynhame, Hrsg., Verlag Chemie GMBH). Bei diesem Experiment
maß man
die CPK-Aktivität, um das
Ausmaß des
durch Occlusion der Koronararterie über Ligation entstehenden myokardialen
ischämischen
Schadens zu überwachen.
Genauer gesagt, maß man
die CPK-Aktivität
eine Stunde nach Occlusion der Koronararterie bei Ratten, die unbehandelt
blieben oder, alternativ, mit einer intervenösen Injektion einer Test- oder Kontrollsubstanz
behandelt wurden. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass
sowohl GE als auch VT das Ausmaß der
myokardialen ischämischen
Läsionen
verringern und Herz schützende
Wirkung zeigen.
-
Man
betäubte
weiße,
zufallsgezüchtete
männliche
Ratten mit einem Gewicht von ungefähr 200 g durch Verabreichung
von Äther
leicht und immobilisierte sie dann und beatmete sie künstlich.
Man ligierte den absteigenden Ast der linken Koronararterie über die
von Selye et al., Angiology 11: 398–407 (1960) veröffentlichte
Technik. Unmittelbar nach der Ligation verabreichte man der Ratte über eine
katheterisierte Femoralvene eine Testsubstanz, eine Positivkontrollsubstanz
oder eine Negativkontrollsubstanz (nachfolgend beschrieben). Jede
Dosis jeder Testsubstanz oder jeder Positiv- oder Negativkontrollsubstanz
wurde einer experimentellen Gruppe oder einer Kontrollgruppe von
9 Testratten verabreicht. Bei dieser Untersuchung dienten GE und VT
als Testsubstanzen, Propanolol diente als Positivkontrollsubstanz
und physiologische Kochsalzlösung
als Negativkontrollsubstanz. Jeder Testratte in einer experimentellen
Gruppe verabreichte man eine Dosis von etwa 0,1, 1,0 oder 10,0 Milligramm
GE pro Kilogramm Körpergewicht
des jeweiligen Tieres (mg/kg) oder 0,1, 1,0 oder 10,0 Milligramm
VT pro Kilogramm Körpergewicht
des Tieres. Jedes Tier der Positivkontrollgruppe erhielt eine intravenöse Dosis
von 0,5 mg pro Kilogramm Körpergewicht β-adrenergen,
blockierenden Agens, Propanolol (Obzidan, Germed, Deutschland).
Propanolol wird üblicherweise
verwendet, um Herzrhythmusstörungen
zu kontrollieren, und es liegen gewisse Hinweise darauf vor, dass
das Mittel das Ausmaß des
ischämischen
Schadens am Herzen verringern kann. Siehe GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS
OF THERAPEUTICS, supra, auf Seite 192. Jedes Tier der Negativkontrollgruppe
erhielt physiologische Kochsalzlösung.
-
Eine
Stunde nach Initiierung der Occlusion der Koronararterie tötete man
jedes Testtier, sammelte dessen Blut und maß die CPK-Aktivität in dessen
Blutserum. Man bestimmte die CPK-Aktivität über ein übliches biochemisches Verfahren,
beispielsweise das von der Lachema Company (Tschechei) in dessen
Testkit kommerziell erhältliche,
und durch Befolgung der Anweisungen des Herstellers zur Vorgehensweise,
welche in der Beilage enthalten waren.
-
Als
zusätzliche
Kontrolle für
das mögliche
Trauma, das durch den chirurgischen Eingriff verursacht wurde, bezog
man eine Gruppe von 9 scheinoperierten Ratten in die Untersuchung
ein. Bei diesen Testtieren nahm man eine Brustdissektion vor, aber
keine Occlusion der Koronararterie. Diese „scheinoperierten" Tiere wurden nicht
mit irgendeiner der Test- oder Kontrollsubstanzen behandelt und
wurden eine Stunde nach der Operation eingeschläfert. Dann sammelte man ihr
Blut zur Bestimmung der CPK-Aktivität.
-
Die
Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 13 dargestellt.
Wie durch signifikante Verringerung der CPK-Aktivität im Blutserum
im Vergleich zur Negativkontrolle gemessen (d.h. die Freisetzung
des intrazellulären
myokardialen Enzyms in das Serum wurde gemessen, um das Ausmaß des nach
der Ligation der Koronararterie eintretenden Schadens zu überwachen),
erwies es sich, dass GE-Dosen von 0,1, 1,0 und 10,0 Milligramm jeweils
das Ausmaß der
induzierten myokardialen ischämischen
Läsionen
in den Testratten verringerten. VT lieferte ähnliche Ergebnisse bei Dosen
von 0,1 bzw. 1,0 mg/kg. Tiere mit induzierten myokardialen ischämischen
Läsionen,
die mit GE oder VT behandelt wurden, wiesen CPK-Aktivitäten im Serum
auf, die sich nicht signifikant von denen in der Gruppe der scheinoperierten
Tiere unterschieden.
-
Die
biologischen Aktivitäten
von GE und VT, die in diesem Modell beobachtet wurden, sind vergleichbar
mit jenen Aktivitäten,
die zuvor für
Aktivatoren des nach außen
gerichteten Kaliumflusses offenbart wurden, welche in parallelen
Tiermodellen getestet wurden. Es wurde gezeigt, dass pharmazeutische
Verbindungen mit Kaliumkanal öffnenden
Aktivitäten
Herz schützende
Wirkungen auf das ischämische
Myokard ausüben,
das „Lecken" von Enzym verringern
und den Verbrauch makroerger Phosphate optimieren. Wie in diesem
Experiment gezeigt, rufen GE und VT offenbar Wirkungen hervor, die
mit denen bekannter Verbindungen mit Kaliumkanal öffnenden
Aktivitäten
identisch sind oder ihnen wenigstens ähneln. Tabelle
13: Die Wirkungen von GE und VT auf die CPK-Aktivität im Blutserum
eine Stunde nach Koronarocclusion
- Signitikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den
für die
folgenden Gruppen verzeichneten Werten: &scheinoperierte
Tiere, *Negativkontrolle, #Positivkontrolle.
- Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung.
-
BEISPIEL 6
-
Gegen Rhythmusstörung gerichtete
Wirkungen von GE und VT in einem Modell Chloroform-induzierter Rhythmusstörung
-
Die
Inhalation von Chloroform induziert ventrikuläre Rhythmusstörung und
wird allgemein als Screening-Test für die Induktion von Rhythmusstörung in
Tiermodellen und für
die Identifizierung von Substanzen und Verbindungen mit Rhythmusstörung entgegenwirkender
Aktivität
verwendet. Beim Mäusen
führt eine
tiefe Betäubung
mit Chloroform zu ventrikulärer
Tachykardie und/oder ventrikulärer
Fibrillation. Obwohl der Mechanismus dieser Rhythmus störenden Wirkungen
noch nicht genau aufgeklärt
wurde, liegen einige Beweise dafür vor,
dass die myokardialen Zellen von Mäusen, welche mit Chloroform
betäubt
wurden, eine kürzere
Refraktionsdauer aufweisen und eine Desynchronisierung der Wiederherstellung
ihrer Erregbarkeit zeigen. Vermutlich tragen diese Bedingungen zum
Auftreten des wiederkehrenden Typs von Rhythmusstörungen bei.
Darüber
hinaus erhöht
Chloroform die Sensitivität
des Myokards gegenüber
endogenen Catecholaminen, wodurch deren Rhythmus störende Wirkungen
verstärkt
werden. Winslow, Pharmac. Ther. 24: 401–433 (1984).
-
Die
Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, dass GE und VT Rhythmusstörungen entgegenwirkende Aktivitäten und
Herz schützende
Wirkungen in Tiermodellen zeigen, bei denen ventrikuläre Rhythmusstörungen induziert
wurden. Diese Untersuchung wurde auf der Grundlage der Empfehlungen
des „General
Pharmacology Service Program" („Current
Test Protocols PAN Laboratory")
durchgeführt.
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Man
behandelte in dieser Untersuchung jede Maus 15 Minuten vor Verabreichung
einer tiefen Chloroformnarkose mit einer intraperitonealen Injektion
einer Dosis einer Test- oder
Kontrollsubstanz. Dann verabreichte man jeder Maus eine Test- oder
Kontrollsubstanz. GE und VT dienten als Testsubstanzen, und jedes Peptid
wurde bei Dosen von 0,001, 0,01, 0,1, 1,0 und 10,0 mg/kg untersucht.
Novocainamid, ein bekanntes Mittel gegen Rhythmusstörungen,
diente als Positivkontrollsubstanz und wurde den Mäusen in
der Positivkontrollgruppe in einer Dosis von 240 mg/kg verabreicht.
Physiologische Kochsalzlösung
diente als Negativkontrollsubstanz und wurde den Mäusen in
der Negativkontrollgruppe verabreicht.
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Man
verabreichte jeder Maus eine Chloroformbetäubung, indem man die Maus in
einen luftdichten Glasbehälter
mit in 20 ml absolutem Chloroform getränkter Watte setzte. Zum Zeitpunkt
des Atemstillstands entfernte man die Maus aus dem Behälter, begann
eine Elektrokardiogramm-Überwachung
(ECG) (Standardableitung II) und setzte diese 30 Sekunden lang fort.
Nach den Kriterien des „General
Pharmacology Service Program" hat
eine Substanz eine schützende,
Rhythmusstörungen
entgegenwirkende Wirkung, wenn nach Verabreichung der Substanz an
ein Testtier, das Testtier kein Zeichen ventrikulärer, paroxysmaler
Rhythmusstörung
(z.B. ventrikulärer
Tachykardie oder ventrikulärer
Fibrillation) während
des 30-Sekundenintervalls des durch Chloroform induzierten Atemstillstands
zeigt, und wenn die Herzfrequenz des Testtiers während des Zeitraums von 30
Sekunden unter 100 Schlägen
in 30 Sekunden bleibt. Eine Rhythmusstörungen entgegenwirkende Aktivität für eine bestimmte
Dosis einer Testsubstanz ist pharmazeutisch annehmbar, wenn 30 %
der Tiere in einer Testgruppe die letztgenannten Ergebnisse zeigen
(d.h. nämlich
kein Zeichen ventrikulärer,
paroxysmaler Rhythmusstörungen
und eine Herzfrequenz unter 100 Schlägen pro 30 Sekunden innerhalb
von 30 Sekunden nach dem Atemstillstand).
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Die
Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 14 dargestellt. Man
fand, dass die Vorbehandlung von Mäusen mit GE oder VT mit einer
Dosis von 0,01, 0,1, 1,0 oder 10,0 mg/kg die Entwicklung ventrikulärer Rhythmusstörung verhinderte,
welche durch Inhalation toxischer Dosen von Chloroform oder durch
Koronarocclusion induziert wurden. Die schützenden, gegen Rhythmusstörung gerichteten
Wirkungen, die sowohl GE als auch VT aufwiesen, unterschieden sich
nicht signifikant von den schützenden,
gegen Rhythmusstörung
gerichteten Wirkungen, die durch Novocainamid bei einer Dosis von
240,0 mg/kg hervorgerufen wurden. Tabelle
14. Die gegen Rhythmusstörung
gerichteten Wirkungen von GE und VT in einem Tiermodell Chloroform-induzierter
Rhythmusstörungen
- *Signifikant verschieden (P < 0,05, Chi-Quadrat-Test)
von den Werten der Negativkontrollgruppe.
- #Signifikant verschieden (P < 0,05, Chi-Quadrat-Test)
von den Werten der Positivkontrollgrouppe.
- Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung.
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BEISPIEL 7
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Wirkungen von GE und VT
auf das Auftreten, die Häufigkeit
und die Dauer früher
ischämischer
Rhythmusstörungen
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Ischämische Rhythmusstörungen,
die innerhalb der ersten 20 bis 30 Minuten nach Koronarocclusion auftreten,
gehören
zu den gefürchtetsten
Komplikationen akuter myokardialer Ischämie, da sie ihrer Natur nach
oft irreversibel sind und zu plötzlichem
Tod führen.
Die Mechanismen, durch welche diese Rhythmusstörungen erzeugt werden, beruhen
offenbar auf wiedereinsetzender myokardialer Erregung. In diesem
Experiment wurde gezeigt, dass sowohl GE als auch VT die Dauer der
ventrikulären
Tachykardien im ischämischen Myokard
verringern.
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Man
verabreichte weißen,
zufallsgezüchteten
männlichen
Ratten mit einem Gewicht von 200 g eine leichte Etherbetäubung, immobilisierte
sie dann und beatmete sie künstlich.
Man ligierte den absteigenden Ast der linken Koronararterie jeder
Ratte. Unmittelbar nach der Ligation verabreichte man jeder Ratte
durch die katheterisierte Femoralvene eine Test- oder Kontrollsubstanz, begann mit einer
ECG-Aufzeichnung (Standardableitung II) und führte diese die folgenden 30
Minuten durch.
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GE
und VT dienten als Testsubstanzen und wurden den Tieren in den jeweiligen
Testgruppen in Dosen von 0,1, 1,0 und 10,0 mg/kg verabreicht. Das β-adrenerg
blockierende Mittel Propanolol (Obzidan, Germed, Deutschland) diente
als Positivkontrollsubstanz und wurde jedem Tier in der Positivkontrollgruppe
in einer Dosis von 0,5 mg/kg verabreicht. Physiologische Kochsalzlösung diente
als Negativkontrollsubstanz und wurde den Tieren in der Negativkontrollgruppe
verabreicht. Jede Dosis jeder Test- oder Kontrollsubstanz wurde
getrennt bei einer Gruppe von 9 Tieren getestet.
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Auf
der Grundlage der ECG-Aufzeichnungen wurden die folgenden Parameter
beurteilt: (i) die Anzahl der ventrikulären Extrasystolen, die innerhalb
einer 30-minütigen
Beobachtungsdauer nach Koronarocclusion auftraten; (ii) die gesamte
kumulative Dauer ventrikulärer
Tachykardien (d.h. die aufsummierte Dauer einzelner, paroxysmaler
ventrikulärer
Rhythmusstörungen
in Sekunden), die innerhalb der 30-minütigen Beobachtungsdauer auftraten;
und (iii) die Gesamtdauer (in Sekunden) der ventrikulären Fibrillationen,
die während
der 30-minütigen
Beobachtungsdauer auftraten. Die Daten wurden elektronisch verarbeitet
und statistische Vergleiche zwischen den von den Tieren in den experimentellen
Testgruppen und den in den jeweiligen unterschiedlichen Kontrollgruppen
erhaltenen Werten angestellt.
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Die
Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 15 dargestellt. Bei
dieser Untersuchung wurden keine ventrikulären Fibrillationen aufgezeichnet.
Wie in Tabelle 15 gezeigt ist, verringerten alle der getesteten Dosen
von GE und VT in diesem Modell die Gesamtdauer der ventrikulären Tachykardien
in ischämischem Myokard.
Dosen von 0,1 mg/kg und 10,0 mg/kg GE und eine Dosis von 10,0 mg/kg
VT erwiesen sich als besonders wirksam bei der Verringerung der
Gesamtdauer dieser ventrikulären
Tachykardien. Dosen von 0,1 mg/kg und 10,0 mg/kg GE und Dosen von
1,0 und 10,0 mg/kg VT verringerten die Gesamtdauer ventrikulärer Tachykardie.
Bemerkenswerterweise induzierte eine Dosis von 10 mg/kg VT eine
dreifache Abnahme der Zahl ventrikulärer Extrasystolen im Vergleich
mit der Negativkontrollgruppe. Tabelle
15. Die gegen Rhythmusstörung
gerichteten Wirkungen von GE und VT auf frühe, ischämische myokardiale Rhythmusstörungen
- *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den
Werten der Negativkontrollgruppe.
- Abkürzung:
S = Physiologische Kochsalzlösung.
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BEISPIEL 8
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Wirkungen von GE und VT
auf den arteriellen Blutdruck
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Bei
diesem Experiment wurden die Wirkungen von GE und VT auf den arteriellen
Blutdruck untersucht. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen,
dass sowohl GE als auch VT den arteriellen Blutdruck senken und hypotensive
(d.h. Blutdruck senkende) und Blutgefäß erweiternde Wirkungen bei
Individuen zeigten, denen diese Dipeptide verabreicht worden waren.
Diese Wirkungen sind charakteristische Kennzeichen bekannter Kaliumkanal öffnender
Substanzen.
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Für diese
Untersuchung verwendete man weiße,
zufallsgezüchtete
männliche
Ratten mit einem Gewicht von etwa 200 g. Man verabreichte jede Dosis
jeder Test- bzw. Kontrollsubstanz einer Gruppe aus fünf Ratten.
GE und VT verwendete man als Testsubstanzen und verabreichte sie
intravenös
in Dosen von 0,01, 0,1, 1,0 und 10,0 mg/kg. Physiologische Kochsalzlösung (0,2
ml) diente als Negativkontrollsubstanz. Das Ganglien blockierende
Mittel Pentamin diente als Positivkontrollsubstanz und wurde in
einer Dosis von 5 mg/kg getestet. Nach Verabreichung der Testsubstanz,
Positivkontrollsubstanz oder Negativkontrollsubstanz überwachte
man den arteriellen Blutdruck jedes Tieres.
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Vor
der Verabreichung der Test- oder Kontrollsubstanz betäubte man
jedes Tier mit α-Chloralose
und kathederisierte dann sowohl dessen Carotisarterie als auch dessen
Jugularvene. Den Carotis-Katheder verband man mit einem elektronischen
Manometer, das über
einen Digital/Analog-Wandler mit einem Computerrecorder verbunden
war. Die durchschnittlichen Basalwerte des arteriellen Blutdrucks
bestimmte man folgendermaßen: Über einen
Zeitraum von 30 Sekunden zeichnete man das dem arteriellen Blutdruck
entsprechende digitale Signal in Intervallen von einer Sekunde auf.
Dann bestimmte man den Durchschnittswert dieser 30 einzelnen Messungen
und zeichnete ihn auf.
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Nach
Bestimmung des durchschnittlichen Basalwerts des arteriellen Blutdrucks
verabreichte man einem Tier in einem Volumen von 0,2 ml physiologischer
Kochsalzlösung
durch den Jugularvenen-Katheder eine bestimmte Dosis der Test- oder
Kontrollsubstanz. Dann nahm man in den folgenden 1,5 Stunden auf
folgende Weise Messungen des arteriellen Blutdrucks vor: (i) während der
ersten fünf
Minuten überwachte
man den arteriellen Blutdruck kontinuierlich, berechnete elektronisch
die Mittelwerte und zeichnete sie in jedem der 10 verschiedenen
Intervalle von 30 Sekunden auf (d.h. 30. Sekunde, 60. Sekunde, usw.);
(ii) danach berechnete man die Durchschnittswerte des arteriellen
Blutdrucks in den ersten Sekunden der 10. Minute, der 15. Minute,
der 30. Minute, der 45. Minute, der 60. Minute, der 75. Minute und
der 90. Minute nach Verabreichung der jeweiligen Test- oder Kontrollsubstanz.
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Die
Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Tabellen 16A und 16B
gezeigt. Bei diesem Modell blieb während der 90-minütigen Beobachtungsdauer
der arterielle Blutdruck von Tieren, die mit physiologischer Kochsalzlösung (Negativkontrollsubstanz)
behandelt worden waren, bei etwa 92 bis etwa 100 % der Basalwerte
vor der Behandlung. Es wurde gezeigt, dass Pentamin innerhalb der
ersten fünf
Minuten nach seiner Verabreichung den arteriellen Blutdruck auf
etwa 68 bis etwa 75 % der Basalwerte vor der Behandlung senkte, wodurch
bestätigt
wurde, dass dieses Tiermodell auf Blutgefäß erweiternde Mittel anspricht.
Eine Behandlung mit entweder GE oder VT führte zu einer mäßigen, aber
verzögerten
Verringerung des durchschnittlichen arteriellen Blutdrucks nach
etwa 60 bis 90 Minuten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass
GE und VT jeweils mäßige Blutgefäß erweiternde
Eigenschaften besitzen. Tabelle
16A. Die Wirkung von GE auf den arteriellen Blutdruck
- *Signifikant verschieden (gepaarter Student's t-Test) vom Basalwert.
Signifikant verschieden (ungepaarter Student's t-Test) von den Parameterwerten in
den Gruppen: Negativkontrollgruppe
(Injektion von Kochsalzlösung),
und #Positivkontrollgruppe (Pentamin-Injektion)
zur jeweiligen Minute.
- Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung.
Tabelle
16B. Die Wirkung von VT auf den arteriellen Blutdruck - *Signifikant verschieden (gepaarter Student's t-Test) vom Basalwert.
Signifikant verschieden (ungepaarter Student's t-Test) von den Parameterwerten in
den Gruppen: Negativkontrollgruppe
(Injektion von Kochsalzlösung),
und #Positivkontrollgruppe (Pentamin-Injektion)
zur jeweiligen Minute.
- Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung.
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BEISPIEL 9
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Wirkungen
von GE und VT auf die Herzfunktion
-
Dieses
Experiment wurde konzipiert, um die Wirkungen von GE und VT auf
die Herzfunktion zu untersuchen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung
zeigen, dass weder GE noch VT eine signifikante Wirkung auf die
Funktion eines normalen Herzens ausüben. Bemerkenswerterweise ändert keines
dieser Dipeptide die grundlegenden Eigenschaften eines normalen
Elektrokardiogramms (ECT).
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Man
betäubte
weiße,
zufallsgezüchtete
männliche
Ratten mit einem Gewicht von etwa 200 g mit Nembutal. Nach der Betäubung nahm
man so schnell wie möglich
ein Basal-ECG auf, um die basalen Messungen für die wesentlichen Parameter
der Herzfunktionen zu erstellen. Ratten, die irgendwelche Abweichungen
von normalen ECG-Parametern zeigten, wurden von der Untersuchung
ausgeschlossen.
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GE
und VT dienten als Testsubstanzen. Jedem Tier in der Versuchsgruppe
verabreichte man intravenös
entweder GE oder VT in einer Dosis von 0,001, 0,01, 0,1, 1,0, 10,0
und 100,0 mg/kg. Jede Dosis jeder Testsubstanz beurteilte man auf
der Grundlage einer getrennten experimentellen Gruppe aus 10 Ratten.
Man nahm 1, 3, 5 und 10 Minuten nach der Injektion der Testsubstanz
ECT-Spuren auf (nicht weniger als jeweils 4 Komplexe). Physiologische
Kochsalzlösung
diente als Negativkontrollsubstanz. Jedem Tier in der Negativkontrollgruppe
injizierte man intravenös
2 ml physiologische Kochsalzlösung.
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Die
Herzfunktion wurde durch Überwachung
der folgenden ECG-Parameter beurteilt:
- (i)
die Dauer des PQ-Intervalls (welches die Zeit definiert, in welcher
der Impuls über
die Atrien und den Atrioventrikularknoten läuft). Der normale Wert für diesen
Parameter für
Nembutal-betäubte
Ratten beträgt 25
bis 60 Millisekunden (ms) bei Verwendung eines Ableitung II-ECG.
- (ii) die Breite des QRS-Komplexes (der die Wanderung des Impulses über das
ventrikulare Myokard definiert). Der normale Wert für diesen
Parameter bei Nembutal-betäubten Ratten
beträgt
15 bis 30 msec bei Verwendung eines Ableitung II-ECG.
- (iii) die Spannung der R-Welle (welche die Ausbreitung der Erregung über den
linken Ventrikel definiert). Der normale Wert für diesen Parameter bei Nembutal-betäubten Ratten
beträgt
0,163 bis 0,9 Millivolt (mV) bei Verwendung eines Ableitung II-ECG.
- (iv) die Dauer des QT-Intervalls (welches die Zeit vom Beginn
des QRS-Komplexes bis zum Ende der T-Welle definiert und die Dauer
der ventrikulären
Depolarisation und Repolarisation wiederspiegelt). Der normale Wert
für diesen
Parameter bei Nembutal-betäubten Ratten
beträgt
50 bis 106 ms bei Verwendung eines Ableitung II-ECG.
- (v) die Spannung der T-Welle (welche den Repolarisierungsvorgang
im linken Ventrikel definiert). Der normale Wert für diesen
Parameter bei Nembutal-betäubten
Ratten beträgt
0,05 bis 0,38 mV unter Verwendung eines Ableitung II-ECG.
-
Wie
in den Tabellen 17A bis 21B gezeigt, wiesen GE und VT bei den getesteten
Dosisbereichen keine signifikante Wirkung auf irgendeinen dieser
Standard-Parameter der Herzfunktion auf. Selbst in den wenigen Fällen, in
denen für
einen gegebenen Parameter ein statistisch signifikanter Unterschied
zwischen dem anfänglichen
Wert und dem später
gemessenen Wert (den später
gemessenen Werten) beobachtet wurde, lagen die später gemessenen
Werte im normalen Bereich. Tabelle
17A. Die Wirkung von GE auf die Dauer des PQ-Intervalls (% des anfänglichen
Durchschnittswerts)
- *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter
Student's t-Test)
von: *dem entsprechenden anfänglichen
Wert; #den Werten der Parameter in der Kontrollgruppe
bei einer entsprechenden Minute.
- Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung
Tabelle
17B. Die Wirkung von VT auf die Dauer des PQ-Intervalls (% des anfänglichen
Durchschnittswerts) - Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung
Tabelle
18A. Die Wirkung von GE auf Breite des QRS-Komplexes (% des anfänglichen
Durchschnittswerts) - Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung
Tabelle
18B. Die Wirkung von VT auf Breite des QRS-Komplexes (% des anfänglichen
Durchschnittswerts) - Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung
Tabelle
19A. Die Wirkung von GE auf die Spannung der R-Welle (% des anfänglichen
Durchschnittswerts) - *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter
Student's t-Test)
vom entsprechenden anfänglichen
Wert
- Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung
Tabelle
19B. Die Wirkung von VT auf die Spannung der R-Welle (% des anfänglichen
Durchschnittswerts) - *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter
Student's t-Test)
vom entsprechenden anfänglichen
Wert.
- Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung
Tabelle
20A. Die Wirkung von GE auf die Dauer des QT-Intervalls (% des anfänglichen
Durchschnittswerts) - *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter
Student's t-Test)
von den Parameterwerten in der Kontrollgruppe zur entsprechenden
Minute.
- Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung
Tabelle
20B. Die Wirkung von VT auf die Spannung der R-Welle (% des anfänglichen
Durchschnittswerts) - *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter
Student's t-Test)
von: *– dem
entsprechenden anfänglichen
Wert; #– den
Parameterwerten in der Kontrollgruppe zur entsprechenden Minute
- Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung
Tabelle
21A. Die Wirkung von GE auf die Spannung der T-Welle (% des anfänglichen
Durchschnittswerts) - *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter
Student's t-Test)
vom entsprechenden anfänglichen
Wert.
- Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung
Tabelle
21B. Die Wirkung von VT auf die Spannung der T-Welle (% des anfänglichen
Durchschnittswerts) - *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter
Student's t-Test)
von: *– dem
entsprechenden anfänglichen
Wert; #– den
Parameterwerten in der Kontrollgruppe zur entsprechenden Minute
- Abkürzung:
S = physiologische Kochsalzlösung