DE69830842T9 - Peptide als kalium kanalaktivatoren - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zur Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten, die auf eine Öffnung von Kaliumkanälen ansprechen, Peptide mit Kaliumkanal öffnenden Aktivitäten, und solche Peptide umfassende pharmazeutische Zubereitungen und Kits.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Kalium (K+)-Kanäle sind wichtige Regulatoren zahlreicher biologischer Prozesse, einschließlich sekretorischer Prozesse, der Muskelkontraktion und des post-ischämischen Schutzes des Herzens. Elektrophysiologische Untersuchungen zeigten das Vorliegen von Kaliumkanälen in fast allen Zelltypen. Gopalakrishnan et al., Drug Dev. Res. 28:95–127 (1993). Solche Kanäle liegen in verschiedenen Formen vor, die im Allgemeinen über ihre jeweiligen strukturellen, biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften unterscheidbar sind. Id. Es ist allgemein bekannt, dass die Öffnung von Kaliumkanälen in elektrisch erregbaren Zellen mit solchen Kanälen zu einem gesteigerten Fluss von Kaliumionen aus dem Inneren der Zelle zur Außenseite der Zelle führt. Dieser Fluss von Kaliumionen verursacht eine messbare Änderung des Ruhepotentials der Zelle und führt zu einer Membranhyperpolarisierung und zur Relaxation der Zelle. Eine Aktivierung von Kaliumkanälen stabilisiert das Zellmembranpotential und verringert im Allgemeinen die Erregbarkeit der Zelle.
  • Kaliumkanäle wurden mit vielen Krankheiten, einschließlich kardiovaskulären Krankheiten, Asthma, Hypertension, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Diabetes, Epilepsie, hohem Blutdruck und Ernährungs- und Appetitstörungen in Verbindung gebracht. Man nimmt allgemein an, dass die Fehlfunktion dieser Kaliumkanäle oder das Vorliegen von Regulationsdefekten in Prozessen, welche solche Kaliumkanäle aktivieren, eine wichtige Rolle bei der Pathogenese solcher Krankheiten und Krankheitszuständen spielt. Folglich können Verbindungen, die zur Öffnung von Kaliumkanälen und somit zur Modulation des elektrophysiologischen Arbeitens der Zellen beitragen, ein wichtiges therapeutisches und prophylaktisches Potential für die Behandlung oder Linderung solcher Zustände, haben.
  • Kaliumkanal öffnende Verbindungen weisen vielfältige biologische und pharmakologische Wirkungen auf. Gegenwärtig bekannte Kaliumkanal öffnende Verbindungen umfassen Cromakalim, Pinacidil (US-Patent Nr. 4,057,636) und Nicorandil (US-Patent Nr. 4,200,640). Man nimmt an, dass diese Verbindungen ihre Wirkungen vorwiegend über die ATP-sensitiven Kaliumkanäle ausüben. Sie weisen eine hohe Affinität für glatte Gefäßmuskelzellen auf und sind durch ihre Fähigkeit charakterisiert, glatte Gefäßmuskeln erschlaffen zu lassen. Escande et al., Trends in Pharm. Sci. 23: 269–727 (1992). Beispielsweise wurde festgestellt, dass Cromakalim die Hyperpolarisierung glatter Gefäßmuskelgewebe induziert, die Erschlaffung von Gefäßen bewirkt, und die Wirkungen von ischämischem Schaden auf das Myokard verringert. Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 257: 156–162 (1991). Cromakalim scheint auch ein wirksamer chemotherapeutischer Wirkstoff für Herzrhythmusstörungen und Reizdarm zu sein, die beide mit einer Kaliumkanalaktivierung in Zusammenhang stehen. Zusätzlich wurde festgestellt, dass Cromakalim vorzeitige Uterus-Kontraktionen inhibiert, wenn es in Kombination mit Östrogen und Relaxin verwendet wird. Downing et al., J. Endocrinol. 135: 29 (1992). Von Pinacidil wurde gezeigt, dass es präkapillare Gefäße erweitert und glatten Muskel erschlaffen lässt. Nielsen-Kudsk et al., Europ. J. Pharmac. 157: 221–226 (1988). Es wurde gezeigt, dass Cromakalim und Pinacidi das Ausmaß ischämischer Verletzung des Myokards verringern. Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 251: 98–104 (1989). Es wurde beobachtet, dass bestimmte Kaliumkanal öffnende Substanzen, einschließlich Cromakalim, auf tracheale glatte Muskelzellen wirken und anti-asthmatische Wirkungen hervorrufen. Dilly, „Cromakalim/Lemakalim, Experience in Hypertension and Nocturnal Asthma" in Conference Documentation, Potassium Channels '90, The Royal College of Physicians, 6.–7. Dec. 1990. Siehe auch Small et al., Braz. J. Med. Biol. Res. 25(10): 983–998. Diese Wirkung steht in Zusammenhang mit einer Membranhyperpolarisierung in Richtung des Kaliumgleichgewichtspotentials und mit der Steigerung des Ausströmens von Kaliumionen aus den Muskelzellen. Id. Weiterhin wurde gezeigt, dass einige Kaliumkanal öffnende Substanzen neuronale Zellen hyperpolarisieren und anti-epileptische und antikonvulsive Wirkungen besitzen. Siehe z.B. Gandolfo et al., Europ. J. Pharmac. 167: 181–83 (1989); Abele et al., Neuroscience Letters 115: 195–200 (1990).
  • Unglücklicherweise rufen die gegenwärtig bekannten Kaliumkanal öffnenden Substanzen typischerweise ernsthafte Nebenwirkungen (einschließlich schwerer Kopfschmerzen, Flüssigkeitsretention und Reflextachykardie) bei den Individuen hervor, denen sie verabreicht werden. Darüber hinaus sind viele der bekannten Kaliumkanal öffnenden Substanzen instabil, und deren pharmakologische Wirkungen unterliegen Schwankungen und sind schwierig zu reproduzieren. Kidney et al., Thorax 48: 130–133 (1993). Folglich ist die therapeutische und prophylaktische Brauchbarkeit gegenwärtig bekannter Kaliumkanal öffnender Substanzen begrenzt.
  • Es besteht ein Bedarf für Verbindungen mit Kaliumkanal öffnender Aktivität, die ihre jeweiligen therapeutischen und prophylaktischen Wirkungen mit geringen oder ohne toxische Nebenwirkungen ausüben. Die vorliegende Erfindung befriedigt dieses und weitere Bedürfnisse.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von Krankheiten bereit, die auf die Öffnung von Kaliumkanälen in Individuen ansprechen, welche einer solchen Behandlung bedürfen. Diese Verfahren umfassen die Verabreichung einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Peptids an ein Individuum, das einer solchen Behandlung bedarf. Die erfindungsgemäßen Peptide umfassen L-Glycyl-L-Glutaminsäure (L-Gly-L-Glu), L-Valin-L-Threonin (L-Val-L-Thr), Polymere von L-Gly-L-Glu und L-Val-L-Thr, welche nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassen und Kombinationen davon, und pharmazeutisch annehmbare Salze davon. Die bevorzugten erfindungsgemäßen Peptide umfassen L-Gly-L-Glu und L-Val-L-Thr. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind brauchbar für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten, die auf Kaliumkanal aktivierende Eigenschaften ansprechen und gegenüber solchen Eigenschaften sensitiv sind.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt Verfahren für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung kardiovaskulärer Krankheiten für Individuen bereit, die einer solchen Behandlung bedürfen. Solche Verfahren umfassen die Verabreichung einer wirksamen Menge eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Peptids an ein Individuum.
  • Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Induktion der Erschlaffung glatter Muskeln bei Patienten bereit, die einer solchen Erschlaffung bedürfen. Diese Verfahren umfassen die Verabreichung einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Peptids wie oben beschrieben an das Individuum.
  • Ein weiterer Aspekt stellt Verfahren zur Induktion der Erschlaffung von Skelettmuskelns bei Patienten bereit, die einer solchen Erschlaffung bedürfen. Diese Verfahren umfassen die Verabreichung einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Peptids wie oben beschrieben an das Individuum.
  • Die Erfindung stellt weiterhin pharmazeutische Zubereitungen in Einheitsdosisform bereit, welche pro Einheitsdosis einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und einen Bereich von etwa 0,01 mg bis etwa 1000 mg L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon umfassen. Ein bevorzugter Aspekt der Erfindung stellt pharmazeutische Zubereitungen in Einheitsdosisform bereit, welche pro Einheitsdosis einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und einen Bereich von etwa 1 mg bis etwa 100 mg L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon umfassen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt Peptidpolymere bereit, welche wenigstens zwei Dipeptide umfassen, worin jedes der Dipeptide des Polymers L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr ist.
  • Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung stellt Verfahren zur Konservierung lebender Gewebe oder Organe bereit. Diese Verfahren umfassen das Inkontaktbringen des Gewebes oder Organs mit einer Zubereitung, welche einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine wirksame Menge eines Peptids umfasst, worin das Peptid L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
  • Die Erfindung stellt weiterhin Kits zur Konservierung lebender Gewebe oder Organe bereit. Solche Kits umfassen eine wirksame Menge eines Peptids, worin das Peptid L-Gly-L- Glu oder L-Val-L-Thr oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist, und einen Behälter für das lebende Gewebe.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • I. DEFINITIONEN
  • Soweit nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, die vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet, zu welchem diese Erfindung gehört, üblicherweise unterstellt wird. Die folgenden Literaturnachweise liefern dem Fachmann eine allgemeine Definition vieler Begriffe, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2. Aufl. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Hrsg.: Walker, 1988); und Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991). Die folgenden Begriffe haben hier, soweit nicht anders bestimmt, die ihnen zugewiesene Bedeutung. Wenngleich beliebige Verfahren und Materialien, die den hier beschriebenen ähnlich oder gleichwertig sind, bei der Durchführung oder dem Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe nachfolgend definiert.
  • Die Begriffe „Kaliumkanal öffnende Substanz" und „Kaliumkanal öffnende Aktivität" beziehen sich im Allgemeinen auf einen erhöhten Strom von Kaliumionen aus dem Inneren einer elektrisch erregbaren Zelle zum Äußeren der Zelle über eine Membran der Zelle, welche wenigstens einen Kaliumkanal aufweist. Kaliumkanal öffnende Aktivität kann beobachtet werden, indem ein Anstieg des Stroms von Kaliumionen aus dem Inneren der Zelle zur Außenseite der Zelle über einen Kaliumkanal in der Zellmembran gemessen wird.
  • Der Begriff „kardiovaskuläre Krankheit" bedeutet im Allgemeinen Krankheiten und pathologische Zustände, die sich auf das Herz oder auf Blutgefäße beziehen oder das Herz oder Blutgefäße einbeziehen. Beispiele kardiovaskulärer Krankheiten umfassen alle Formen ischämischer Herzerkrankungen, Herzdysrhythmien und Herzrhythmusstörungen, kongestiver Herzinsuffizienz und hypertensiver Krankheit, die in International Classification of Diseases, Bd. 9, Clinical Modification, Easy Coder (1997) („ICD 9 CM") aufgeführt sind, ebenso wie alle kardiovaskulären Krankheiten, die auf eine Erweiterung der Blutgefäße ansprechen oder dafür sensitiv sind, und alle kardiovaskulären Erkrankungen, die in E. Braunwald, HEART DISEASE. A TEXTBOOK OF CARDIOVASCULAR MEDICINE (3. Aufl. 1988) beschrieben sind.
  • Der Begriff "pharmazeutisch annehmbares Salz" bezieht sich auf nicht-toxische Säureadditionssalze, einschließlich mit anorganischen Säuren gebildete Salze, wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und Perchlorsäure, und mit organischen Säuren gebildete Salze, wie beispielsweise Essigsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Citronensäure, Bernsteinsäure oder Malonsäure. Weitere pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen anorganisches Nitrat, Sulfat, Acetat, Malat, Formiat, Lactat, Tartrat, Succinat, Citrat, p-Toluolsulfonat, und dergleichen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Kationen auf der Grundlage der Alkali- und Erdalkalimetalle, wie beispielsweise Natrium, Lithium, Kalium, Kalzium, Magnesium und dergleichen, ebenso wie nicht-toxische Ammonium-, quaternäre Ammonium- und Aminkationen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Ammonium, Tetramethylammonium, Tetraethylammonium, Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Triethylamin, Ethylamin und dergleichen.
  • Der Begriff „pharmazeutische Zubereitung" bedeutet eine Zubereitung, die für eine pharmazeutische Anwendung bei einem Individuum, einschließlich eines Tieres oder eines Menschen, geeignet ist. Eine pharmazeutische Zubereitung umfasst im Allgemeinen eine wirksame Menge eines aktiven Wirkstoffes und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  • Der Begriff „pharmazeutisch annehmbarer Träger" umfasst jeden der üblichen pharmazeutischen Träger, Puffer und Exzipienten, einschließlich phosphatgepufferter Kochsalzlösung, Wasser, und Emulsionen (wie beispielsweise Öl/Wasser- oder Wasser/Öl-Emulsion), und verschiedene Arten von Benetzungsmitteln und/oder Adjuvantien. Geeignete pharmazeutische Träger und deren Formulierungen sind beschrieben in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Co., Easton, 19. Aufl. 1995). Bevorzugte pharmazeutische Träger hängen von der beabsichtigten Verabreichungsart des aktiven Wirkstoffs ab. Typische Verabreichungsarten sind unten beschrieben.
  • Der Begriff „wirksame Menge" bedeutet eine Dosierung, welche ausreichend ist, um ein gewünschtes Ergebnis hervorzurufen. Das gewünschte Ergebnis kann eine subjektive oder objektive Verbesserung bei dem Empfänger der Dosierung umfassen.
  • Eine „prophylaktische Behandlung" ist eine Behandlung, die einem Individuum verabreicht wird, das keine oder nur frühe Zeichen einer Krankheit zeigt, wobei die Behandlung zum Zwecke der Verringerung des Risikos für die Entwicklung eines pathologischen Zustands durchgeführt wird.
  • Eine „therapeutische Behandlung" ist eine Behandlung, die einem Individuum verabreicht wird, das pathologische Zeichen zeigt, wobei die Behandlung zum Zwecke der Verringerung oder Beseitigung dieser pathologischen Zeichen durchgeführt wird.
  • Der Begriff „Organ" bedeutet Körpersysteme, wie beispielsweise das Herz, die Leber, die Lunge, die Niere, das Gehirn, das adrenale System, das vaskulär-endotheliale System, das Immunsystem, und dergleichen.
  • Der Begriff „Individuum" soll ein Tier, beispielsweise ein Säugetier, einschließlich des Menschen, bedeuten. Nicht-menschliche, tierische Individuen für die Behandlung umfassen beispielsweise Fische, Vögel, und Säugetiere, wie beispielsweise Kühe, Schafe, Schweine, Pferde, Hunde und Katzen.
  • Der Begriff „Krankheit, die auf Öffnung von Kaliumkanälen anspricht" bedeutet einen pathologischen Zustand, eine Krankheit oder eine Störung, die prophylaktisch oder therapeutisch auf die Aktivierung oder Öffnung von Kaliumkanälen in Zellen des Zielgewebes anspricht, dafür sensitiv ist oder damit assoziiert ist.
  • Der Begriff „Hypoxie" bezieht sich auf einen pathologischen Zustand, der auf einem Mangel in der Körpergewebe erreichenden Sauerstoffmenge beruht.
  • Der Begriff „Anoxie" bezieht sich auf einen pathologischen Zustand, der auf dem Fehlen von Sauerstoff beruht.
  • II. ERFINDUNGSGEMÄSSE PEPTIDE
  • A. Allgemeine Eigenschaften und Verwendungen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Klasse regulatorischer Peptide, die sich durch ihre Fähigkeit zur Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten auszeichnen, welche auf die Öffnung von Kaliumkanälen ansprechen oder dafür sensitiv sind, oder mit der Kaliumkanalaktivierung assoziiert sind. Wie oben angemerkt, liegen Kaliumkanäle in fast allen Zelltypen vor, einschließlich myokardialer Zellen, glatter Muskelzellen, Skelettmuskelzellen, beta-Zellen des Pankreas, sekretorischer Zellen, neuraler Zellen und Gehirnzellen, und dergleichen, und sind am korrekten Arbeiten der meisten Zellen beteiligt. Man nimmt an, dass der Wirkungsmechanismus der erfindungsgemäßen Peptide die Aktivierung der in den Membranen solcher Zellen befindlichen Kaliumkanäle beinhaltet.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide zeigen im Allgemeinen die biologischen und pharmakologischen Aktivitäten bekannter Kaliumkanal öffnender Verbindungen und sind somit brauchbar bei der Behandlung von Krankheiten, die häufig mit bekannten Kaliumkanal öffnenden Substanzen behandelt werden. Beispielsweise weisen die erfindungsgemäßen Peptide die gemeinsame Eigenschaft der Induktion der Erschlaffung glatter Muskeln auf, eine charakteristische Eigenschaft bekannter Kaliumkanal öffnender Substanzen. Diese Peptide verringern und inhibieren die Kontraktionsaktivität einer Reihe glatter Muskelgewebe, einschließlich intestinaler, vaskulärer, trachealer, bronchialer glatter Muskeln und glatter Muskeln des Uterus. Aus diesem Grund sind die erfindungsgemäßen Peptide brauchbar für die Behandlung und Vorbeugung von Störungen, deren Linderung oder Vorbeugung durch die Erschlaffung glatter Muskeln möglich ist. Da die erfindungsgemäßen Peptide intestinale glatte Muskeln erschlaffen lassen, sind sie beispielsweise für die Behandlung und Vorbeugung hyperreaktiver Störungen des Darms, beispielsweise Reizdarm, brauchbar.
  • Da sie eine Erschlaffung intestinaler glatter Muskeln bewirken, induzieren die erfindungsgemäßen Peptide wie auch bekannte Kaliumkanal öffnende Verbindungen weiterhin eine Erweiterung von Blutgefäßen. Siehe z.B. Guermonprez et al., Eur. Heart J.: 14 (Suppl. B): 30–34 (1993). Die Erweiterung von Blutgefäßen ruft typischerweise eine Erhöhung des Blutvolumens hervor, das durch ein Gefäß fließt und/oder eine Verringerung des Blutdrucks in dem Gefäß. Durch ihre Blutgefäß erweiternden Wirkungen sind die erfindungsgemäßen Peptide brauchbar bei der prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von Krankheiten, die auf eine Erweiterung von Blutgefäßen ansprechen oder dafür sensitiv sind, beispielweise solchen Krankheiten, die durch Verringerung des Blutdrucks in Gefäßen oder Steigerung des durch Gefäße fließenden Blutvolumens behandelt werden können. Die erfindungsgemäßen Peptide sind beispielsweise brauchbar für die Behandlung und Vorbeugung von Hypertension, die durch abnormal hohen, arteriellen Blutdruck gekennzeichnet ist, weil sie eine Erweiterung von Blutgefäßen fördern und den Blutdruck senken. Da sie den Blutstrom verbessern, sind die erfindungsgemäßen Peptide in ähnlicher Weise brauchbar für die Behandlung und Vorbeugung von Angina pectoris, einem schweren paroxysmalen Schmerz in der Brust, der mit einer unzureichenden Blutversorgung des Herzens assoziiert ist.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide weisen weiterhin anti-ischämische und Herz schützende Eigenschaften auf, welche typischerweise bei bekannten Kaliumkanal öffnenden Substanzen zu beobachten sind, und sind folglich brauchbar als anti-ischämische und Herz schützende Wirkstoffe. Es ist allgemein bekannt, dass Kaliumkanäle in Herzzellen vorliegen und dass die Aktivierung solcher Kanäle zu einer Membranhyperpolarisierung und einer Verkürzung der Dauer von Aktionspotentialen führt. Siehe z.B. Gopalakrishnan et al., supra; Grover et al., Europ. J. Pharmac. 191: 11–18 (1990); Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 251: 98–104 (1989); Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 257: 156–162 (1991). Für bekannte Kaliumkanal öffnende Substanzen wurde gezeigt, dass sie myokardiale Ischämie verringern und gegen Ischämie schützen (d.h. Herz schützende Wirkungen ausüben). Siehe z.B. Guermonprez, supra. Man nimmt an, dass die Aktivierung von Kaliumkanälen in Herzgewebe durch Kaliumkanal öffnende Substanzen, die durch Ischämie induzierte Depolarisierung und den Reperfusionsschaden verringert oder umkehrt, möglicherweise über Membranhyperpolarisierung (d.h. Erhöhung des Ruhepotentials von Zellen hin zu prä-ischämischen Graden) und eine Verringerung des zellulären Kalziumioneneinstroms. Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 251: 98–104 (1989); Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 257: 156–162 (1991).
  • In der vorliegenden Erfindung verringern die erfindungsgemäßen Peptide signifikant die Wirkungen von ischämischem Schaden in myokardialem Gewebe, stellen die Kontraktilität des Herzmuskels nach Ischämie wieder her und sichern und schützen das myokardiale Gewebe vor weiterem Schaden durch Ischämie. Die erfindungsgemäßen Peptide wirken auch als Wirkstoffe gegen Rhythmusstörungen. Angesichts dieser Aktivitäten, die bei bekannten Kaliumkanal öffnenden Substanzen beobachtet werden, sind die erfindungsgemäßen Peptide brauchbar bei der Behandlung und Vorbeugung einer Vielzahl kardiovaskulärer Krankheiten, die auf eine Aktivierung von Kaliumkanälen ansprechen, einschließlich ischämischer Herzerkrankung, Herzrhythmusstörungen, kongestiver Herzinsuffizienz, Schlaganfall und Angina pectoris. Siehe z.B. Guermonprez, supra.
  • Sowie es auch bekannte Kaliumkanal öffnende Wirkstoffe tun, führen die erfindungsgemäßen Peptide weiterhin zur Erschlaffung glatter Muskeln der Atemwege (z.B. trachealer glatter Muskeln) und weisen bronchodilatorische Wirkungen auf (d.h. erhöhen den Durchmesser des Bronchus oder der Bronchialröhre). Folglich sind sie nützlich für die Behandlung oder Linderung bestimmter trachealer und bronchialer Störungen, einschließlich Bronchialasthma, bronchospastischer Störungen und bronchospastischen Syndroms. Siehe z.B. Small et al., Braz. J. Med. Biol. Res. 25(10): 983–998.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide sind weiterhin nützlich bei der Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten des Gehirns, die mit einer Kaliumkanalaktivierung assoziiert sind. Es wurde gefunden, dass bekannte Kaliumkanal öffnende Substanzen Kaliumkanäle in Gehirnzellen aktivieren, wodurch sie die neuronale Erregbarkeit dieser Zellen verringern und zu antikonvulsiven Wirkungen auf solche Zellen führen. Dementsprechend wird angenommen, dass die erfindungsgemäßen Peptide für die Behandlung und Vorbeugung neurodegenerativer Erkrankungen brauchbar sind, welche mit einer Kaliumkanalaktivierung assoziiert sind oder darauf ansprechen und/oder zelluläre Erregbarkeit oder Depolarisierung und daraus entstehenden Schaden beinhalten. Solche neurodegenerativen Erkrankungen umfassen beispielsweise Epilepsie, Anoxie (die durch anfängliche, kurze Hyperpolarisation und anschließende anhaltende Depolarisierung von Zellen charakterisiert sein kann), Hypoxie, Krämpfe, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, und verschiedene Formen zerebraler Ischämie, einschließlich Schlaganfall und Trauma. Siehe z.B. Gopalakrishnan et al., supra; Ben-Ari et al., Neuroscience 37: 55–60 (1990); Gandolfo et al., supra; Ashford et al., Nature 370: 456–59 (August 11, 1994).
  • Weitere Krankheiten und Störungen, die einer Behandlung durch die erfindungsgemäßen Peptide und Verfahren zur Verwendung dieser Peptide zugänglich sind, sind unten beschrieben.
  • B. Repräsentative, erfindungsgemäße Peptide
  • Zunächst wurden bestimmte erfindungsgemäße Peptide aus einem als „Cardialin" bezeichneten myokardialen Extrakt isoliert. Das Cardialin-Extrakt ist in der USSR Nr. 1,417,242 (1988) beschrieben. Es wurde gezeigt, dass dieser Extrakt chemisch induzierter Kardiomyopathie vorbeugt (siehe USSR Nr. 2,007,157 (1992)), von Infarkten herrührenden Gewebeschaden verringert (Khavinson et al., Archive Pathologoy (USSR) 9: 27–31 (1989)) und die Erzeugung von Milchsäure in Herzmuskelschnitten durch Verringerung der Succinatdehydrogenase-Aktivität verringert (Khavinson et al., USSR Nr. 1,807,399 (1993)). Weiterhin wurde gezeigt, dass Cardialin (alternativ auch als „Cordialin" bezeichnet) den Energiemetabolismus myokardialer Zellen während einer Hypoxie oder Ischämie positiv beeinflusst. Pavlenko et al., Bull. Eksp. Biol. Med. (USSR) 112(7): 24–27 (1991); Pavlenko et al., Patol. Fiziol. Eksp. Ter. (Russia) 2: 20–24 (1992). Cardialin-Extrakt kann auch die ATP-sensitiven Kaliumkanäle in Kardiomyocyten beeinflussen. Babenko et al., Bull. Eksp. Biol. Med. (Russia) 114(7): 54–56 (1992). In früheren Untersuchungen war es jedoch nicht möglich zu bestimmen, ob diese Wirkungen von Cardialin das Ergebnis eines spezifischen Wirkstoffs oder eines nicht-spezifischen Insults waren.
  • In der vorliegenden Erfindung wurde Cardialin-Extrakt über Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) fraktioniert, wobei die Aktivierung der Adenylatcyclase-Aktivität von Kardiomyocyten als Screeningassay für die Suche nach biologisch aktiven Fraktionen (wie unten in Beispiel 1 beschrieben) verwendet wurde. Isolierte, biologisch aktive Fraktionen wurden auf ihren Peptidgehalt analysiert, wobei der Edman-Abbau für die Bestimmung der jeweiligen Aminosäuresequenzen von Peptidfragmenten in den Fraktionen verwendet wurde. Anhand der durch diese Verfahren erhaltenen Ergebnisse wurden synthetische Kandidatenpeptide hergestellt und auf ihre jeweilige Fähigkeit getestet, unter Verwendung von Radioimmunoassays die Kardiomyocyten-Adenylatcyclase-Aktivität bei isolierten Kardiomyocyten zu stimulieren. Die synthetischen Peptide wurden dann zusätzlich auf pharmakologische Aktivität (wie in den Beispielen 2 bis 9 unten ausgeführt) getestet.
  • Vier Peptide wurden über diese Verfahren identifiziert. Diese Peptide umfassen die Dipeptide L-Gly-L-Glu und L-Val-L-Thr, und die Tetrapeptide L-Gly-L-Glu-L-Gly-L-Glu und L-Val-L-Thr-L-Val-L-Thr. Man nimmt an, dass diese Peptide Kaliumkanäle in Zellmembranen, die Kaliumkanäle aufweisen, aktivieren und öffnen.
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung sind die Peptide charakterisiert durch ihre Fähigkeit zur Aktivierung oder Öffnung von Kaliumkanälen in Zellen, die Kaliumkanäle in ihren Zellmembranen aufweisen. Erfindungsgemäße Peptide bestehen im Allgemeinen aus einer seriellen Anordnung von 16 oder weniger natürlich auftretenden (nicht-derivatisierten) L-Aminosäureresten, die über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Ein erfindungsgemäßes Peptid besteht bevorzugt aus weniger als etwa 9 bis etwa 6 Aminosäureresten. Noch bevorzugter besteht das Peptid aus nicht mehr als 5 Aminosäureresten. Die Peptide weisen typischerweise ein Molekulargewicht von weniger als etwa 4000 Dalton auf. Noch bevorzugter weisen diese Peptide ein Molekulargewicht von weniger als etwa 2000 Dalton und besonders bevorzugt von weniger als etwa 1000 Dalton auf.
  • In einem weiteren Aspekt umfassen die erfindungsgemäßen Peptide L-Gly-LGlu, L-Val-L-Thr, L-Gly-LGlu-L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr-L-Val-L-Thr, nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassende Polymere von L-Gly-L-Glu, nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassende Polymere von L-Val-L-Thr, und pharmazeutisch annehmbare Salze davon. Gemäß den IUPAC-IUB-Empfehlungen, die in Arch. Biochem. Biphys. 115: 1–12 (1966) veröffentlicht wurden, werden L-Gly-L-Glu und L-Val-L-Thr durch GE bzw. VT dargestellt. Diese Dipeptide können von der Sigma Chemical Company (P.O. Box 14508, St. Louis, Missouri 63178-9916) bezogen werden.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt Peptidpolymere bereit, welche eine serielle Anordnung von 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 Dipeptiden von L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr, oder jede Kombination davon enthalten, oder pharmazeutisch annehmbare Salze solcher Polymere, wobei die Dipeptide über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Die Polymere können wenigstens zwei Dipeptide umfassen, worin jedes Dipeptid des Polymers L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr ist. Beispielsweise umfassen die erfindungsgemäßen Polymere die Tetrapeptide L-Gly-L-Glu-L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr-L-Val-L-Thr, L-Gly-L-Glu-L-Val-L-Thr und L-Val-L-Thr-L-Gly-L-Glu.
  • Im Blut oder in lebenden Geweben oder lebenden Organen werden Polymere erfindungsgemäßer Peptide, einschließlich nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassender Polymere von L-Gly-L-Glu, nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassender Polymere von L-Val-L-Thr, und von Polymeren, die L-Val-L-Thr und L-Gly-L-Glu umfassen und nicht mehr als 16 Aminosäurereste aufweisen, und Kombinationen davon, typischerweise enzymatisch in ihre jeweiligen Dipeptide und Tetrapeptide verdaut. Man nimmt an, dass die Dipeptide und Tetrapeptide, die aus solchen Polymeren durch enzymatischen Verdau freigesetzt werden, die gleichen prophylaktischen und therapeutischen Wirkungen ausüben wie die erfindungsgemäßen Dipeptide und Tetrapeptide, einschließlich der Dipeptide L-Gly-L-Glu und L-Val-L-Thr und aus Kombinationen von L-Gly-L-Glu und L-Val-L-Thr gebildeter Tetrapeptide.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt sind die erfindungsgemäßen Peptide charakterisiert durch Extrahierbarkeit aus dem Myokard bei einem sauren pH, der einen Bereich von etwa 2 bis etwa 3,5 einschließt, und Isolierbarkeit daraus in einem darin enthaltenen Volumen eines G-25 Superfein-Chromatographieharzes, durch fehlende Wirkung auf eine durch eine hohe Kaliumchloridkonzentration induzierte tonische Kontraktion einer Probe glatten Muskels, und durch eine Molekülgröße von weniger als etwa 15000 Dalton und ganz besonders bevorzugt weniger als etwa 5000 Dalton. Ein solches Peptid kann als ein „myokardiales Peptid" bezeichnet werden, da es aus dem Myokard isoliert wird. Alternativ können die erfindungsgemäßen Peptide aus natürlich vorkommenden Aminosäuren synthetisiert werden und eine serielle Anordnung aus nicht mehr als 16 L-Aminosäureresten umfassen.
  • Obwohl die erfindungsgemäßen Peptide hauptsächlich unter Verwendung der Begriffe „Peptid" oder „Peptide" beschrieben werden, ist es für den Fachmann nach Lesen der vorliegenden Beschreibung ersichtlich, dass diese Begriffe auch Strukturanaloga und Derivate der oben beschriebenen Peptide umfassen. Beispielsweise werden zusätzlich zu den oben beschriebenen Peptiden, welche natürlich vorkommende Aminosäuren umfassen können, auch Peptidomimetika der erfindungsgemäßen Peptide bereitgestellt. Peptidanaloga werden üblicherweise in der pharmazeutischen Industrie als Nicht-Peptidwirkstoffe benutzt, die Eigenschaften aufweisen, welche analog sind zu denen der Template-Peptide. Diese Arten von Nicht-Peptidverbindungen werden als „Peptidmimetika" oder als „Peptidomimetika" bezeichnet und normalerweise mit Hilfe von computergestütztem Molecular Modeling entwickelt. Fauchere, J., Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger, TINS 392 (1985); und Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Peptidmimetika, die strukturell therapeutisch oder prophylaktisch brauchbaren Peptiden ähneln, können verwendet werden, um eine gleichwertige therapeutische oder prophylaktische Wirkung hervorzurufen. Im Allgemeinen ähneln Peptidomimetika strukturell einem Muster-Peptid (d.h. einem Peptid, das eine biologische oder pharmakologische Aktivität aufweist), beispielsweise einem natürlich vorkommenden Peptid mit Kaliumkanal öffnender Aktivität, weisen aber eine oder mehrere Peptidverknüpfungen auf, die gegebenenfalls ersetzt sind durch eine Verknüpfung, die ausgewählt ist unter: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis und trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, und -CH2SO-. Solche Peptidomimetika können über dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden und sind weiterhin beschrieben in den folgenden Literaturstellen: Spatola, A.F. in CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES, AND PROTEINS 267 (B. Weinstein, Hrsg., 1983), Spatola, A.F., Vega Data Bd. 1, Ausgabe 3, „Peptide Backbond Modifikations) (allgemeiner Übersichtsartikel); Morley, J.S., Trends Pharm. Sci., Seiten 463–468 (1980) (allgemeiner Übersichtsartikel); Hudson, D. et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 14: 177–185 (1979) (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola, A.F. et al., Life Sci. 38: 1243–1249 (1986) (-CH2-S); Hann, M., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 307-314 (1982) (-CH-CH-, cis und trans); Almquist, R.G et al., J. Med. Chem. (1980) 23: 1392–1398 (-COCH2); Jennings-White, C. et al., Tetrahedron Lett. 23:2533 (1982) (-COCH2-); Szelke, M. et al., Europäische Patentanmeldung EP 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982) (-CH(OH)CH2-); Holladay, M.W. et al., Tetrahedron Lett. 24: 4401–4404 (1983) (-C(OH)CH2-); und Hruby, V.J. Life Sci. 31: 189–199 (1982 (-CH2-S-).
  • Peptidmimetika können gegenüber Peptid-Ausführungsformen wesentliche Vorteile aufweisen, einschließlich beispielsweise: wirtschaftlichere Herstellung; höhere chemische Stabilität; bessere pharmakologische Eigenschaften (Halbwertszeit, Absorption, Stärke, Wirksamkeit, usw.); veränderte Spezifität (z.B. ein breites Spektrum biologischer Aktivitäten); verringerte Antigenizität; und andere Vorteile.
  • Bei einigen Anwendungen kann es auch wünschenswert sein, die erfindungsgemäßen Peptide als markierte Einheiten bereitzustellen, d.h. kovalent angehängt an oder verknüpft mit einer nachweisbaren Gruppe, um die Identifizierung, den Nachweis und die Quantifizierung des Peptids unter den jeweiligen Umständen zu erleichtern. Diese nachweisbaren Gruppen können eine nachweisbare Proteingruppe umfassen, z.B. ein Enzym, das in einem Assay nachgewiesen werden kann, oder ein Antikörperepitop, wie obenstehend in der Diskussion über Fusionsproteine beschrieben. Alternativ kann die nachweisbare Gruppe aus einer Vielzahl weiterer nachweisbarer Gruppen oder Markierungen ausgewählt werden, beispielsweise Radiomarkierungen (z.B. 125I, 32P oder 35S) oder einer chemilumineszenten oder fluoreszenten Gruppe. In ähnlicher Weise kann die nachweisbare Gruppe ein Substrat, ein Cofaktor, ein Inhibitor oder ein Affinitätsligand sein. Die Derivatisierung (z.B. das Markieren) von Peptidomimetika sollte die gewünschte biologische oder pharmakologische Aktivität des Peptidomimetikums nicht wesentlich beeinflussen. Im Allgemeinen wird angenommen, dass Peptidomimetika von erfindungsgemäßen Peptiden eine nachweisbare biologische Aktivität aufweisen (z.B. die Fähigkeit, Kaliumkanäle zu aktivieren und zu öffnen).
  • Ein pharmazeutisch annehmbares Salz eines erfindungsgemäßen Peptids kann über übliche Verfahren aus einem Peptid (oder dessen Analogon) einfach hergestellt werden. Beispielsweise kann ein solches Salz hergestellt werden, indem man das Peptid mit einer wässrigen Lösung des gewünschten, pharmazeutisch annehmbaren Metallhydroxids oder einer anderen metallischen Base behandelt und die erhaltene Lösung dann bis zur Trockne verdampft, vorzugsweise unter verringertem Druck in einer Stickstoffatmosphäre. Alternativ kann eine Lösung eines Peptids mit einem Alkoxid des gewünschten Metalls gemischt und die Lösung anschließend bis zur Trockne verdampft werden. Die pharmazeutisch annehmbaren Hydroxide, Basen und Alkoxide umfassen für diesem Zweck solche mit Kationen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Kalium, Natrium, Ammonium, Kalzium und Magnesium. Weitere beispielhafte, pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Bisulfat, Acetat, Oxalat, Valerat, Oleat, Laurat, Borat, Benzoat, Lactat, Phosphat, Tosylat, Citrat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat und dergleichen.
  • Es kann wünschenswert sein, die erfindungsgemäßen Peptide und deren Analoga oder Derivate zu stabilisieren, um deren Lagerfähigkeit und pharmakokinetische Halbwertszeit zu erhöhen. Die Lagerfähigkeitsstabilität wird verbessert durch Zugabe von Exzipienten wie beispielsweise: a) hydrophoben Mitteln (z.B. Glycerin); b) Zuckern (z.B. Saccharose, Mannose, Sorbitol, Rhamnose oder Xylose); c) komplexen Kohlenhydraten (z.B. Lactose); und/oder d) bakteriostatischen Mitteln. Die pharmakokinetische Halbwertszeit der erfindungsgemäßen Peptide kann durch Kopplung an Trägerpeptide, -polypeptide und -kohlenhydrate unter Verwendung chemischer Derivatisierung (z.B. durch Kopplung von Seitenketten oder N- oder C-terminalen Resten) modifiziert werden, oder durch chemische Veränderung einer Aminosäure des erfindungsgemäßen Peptids. Die pharmakokinetische Halbwertszeit und die Pharmakodynamik dieser Peptide kann weiterhin modifiziert werden durch: a) Verkapselung (z.B. in Liposomen); b) Kontrolle des Hydratationsgrads (z.B. durch Kontrolle des Ausmaßes und der Art der Glycosylierung des Peptids); und c) Kontrolle der elektrostatischen Ladung und der Hydrophobizität des Peptids.
  • Es gibt eine große Vielzahl von Verfahren für die Synthese von Peptiden, wobei die Festphasensynthese üblicherweise das bevorzugte Verfahren darstellt. Bei diesem Verfahren wird eine Aminosäure an ein Harzpartikel gebunden, und das Peptid schrittweise durch aufeinander folgendes Hinzufügen geschützter Aminosäuren erzeugt, wodurch eine Kette von Aminosäuren hergestellt wird. Modifizierungen der von Merrifield beschriebenen Technik werden allgemein verwendet. Siehe z.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 96: 2989–93 (1964). Bei einem automatisierten Festphasenverfahren werden Peptide synthetisiert, indem mit der Carboxy-terminalen Aminosäure ein organischer Linker (z.B. PAM, 4-Oxymethylphenylacetamidomethyl) beladen wird, der kovalent an ein unlösliches Polystyrolharz angehängt ist, das mit Divinylbenzol vernetzt ist. Das endständige Amin kann durch Blockierung mit t-Butyloxycarbonyl geschützt werden. Hydroxyl- und Carboxylgruppen werden üblicherweise durch Blockierung mit O-Benzylgruppen geschützt. Die Synthese wird in einem automatisierten Peptidsynthesizer durchgeführt, beispielsweise einem von Applied Biosystems erhältlichen Peptidsynthesizer. Siehe z.B. Model 430-A, Applied Biosystems, Forster City, California.
  • Nach der Synthese kann das Produkt von dem Harz entfernt werden. Die blockierenden Gruppen werden unter Verwendung von Flusssäure oder Trifluormethylsulfonsäure nach gängigen Verfahren entfernt. Siehe z.B. Bergot und Mc Curdy, Applied Biosystems Bulletin (1987). Eine Routinesynthese kann 0,5 mmol Peptidharz erzeugen. Nach Abspaltung und Aufreinigung ergibt sich typischerweise eine Ausbeute von 60 bis 70 %. Die Aufreinigung des Peptidprodukts erfolgt beispielsweise über Kristallisation des Peptids aus einem organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Methylbutylether, anschließendes Lösen in destilliertem Wasser und Dialyse (wenn das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Peptids höher ist als 500 Dalton) oder reverse Hochdruckflüssigkeitschromatographie (z.B. unter Verwendung einer C18-Säule mit 0,1 % Trifluoressigsäure und Acetonitril als Lösungsmitteln), falls das Molekulargewicht des Peptids weniger als 500 Dalton beträgt. Das aufgereinigte Peptid kann lyophilisiert und bis zur Verwendung in trockenem Zustand aufbewahrt werden.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide sind bei den niedrigen Konzentrationen, in denen sie üblicherweise verwendet werden, wasserlöslich. Solche Peptide werden bevorzugt in Form ihrer Säure- oder Alkalisalze verwendet, die mit pharmazeutisch annehmbaren Agentien, wie beispielsweise Essigsäure, Citronensäure, Maleinsäure oder Bernsteinsäure, gebildet werden. Leicht lösliche Salze der erfindungsgemäßen Peptide können auch durch Modifikation mit einem geringfügig wasserlöslichen, pharmazeutisch annehmbaren Salz (wie beispielsweise Tanninsäure oder „palmoic acid"), durch Einschluss in einer Peptid-Retardformulierung (beispielsweise durch kovalente Kopplung an ein größeres Trägerprotein oder -peptid), oder durch Einschluss in eine Kapsel für Retardformulierung und dergleichen auch in Salze mit geringer Löslichkeit in Körperflüssigkeiten überführt werden. Im Allgemeinen sind die Säuresalze der erfindungsgemäßen Peptide biologisch und pharmakologisch den Peptiden selbst gleichwertig.
  • C. Pharmakologische Aktivitäten der erfindungsgemäßen Peptide
  • Wie oben ausgeführt, zeigen die erfindungsgemäßen Peptide ein weites Spektrum pharmakologischer und biologischer Aktivitäten, die mit der Aktivierung oder Öffnung von Kaliumkanälen assoziiert sind. Gemäß einem Aspekt weisen die erfindungsgemäßen Peptide die Fähigkeit auf, die funktionelle Aktivität glatter Muskeln von Organen zu regulieren, so wie es bekannte Kaliumkanal öffnende Substanzen tun. Die Kaliumkanal öffnenden Aktivitäten dieser Peptide können über Standardassays zur Messung des gesteigerten Ausstroms von Kaliumionen aus dem Inneren einer elektrisch erregbaren Testzelle mit einem Kaliumkanal in deren Zellmembran gemessen werden, die dem Fachmann allgemein bekannt sind. Solche Assays umfassen gewöhnliche Patch-Clamp-Assays, die dem Fachmann allgemein bekannt sind.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide vermögen insbesondere die Erschlaffung einer Vielzahl von Arten glatter Muskeln zu induzieren und hervorzurufen. Wie bei gewöhnlichen Kaliumkanal öffnenden Substanzen inhibieren die erfindungsgemäßen Peptide spontane Anspannungs- und Kontraktionsantworten glatter Muskeln und senken die spontane Kontraktionsaktivität glatter Muskeln, während sie keine oder minimale Wirkungen auf die durch Kalium induzierte tonische Kontraktion glatter Muskeln ausüben. Die erfindungsgemäßen Peptide zeigen auch Gefäß entspannende Wirkungen, die beispielsweise durch deren Fähigkeit zur Verringerung der Amplitude spontaner Gefäßmuskelkontraktionen gezeigt wird.
  • Erfindungsgemäße Peptide induzieren die Erschlaffung glatter Muskeln durch Unterdrückung der Amplitude spontaner Kontraktionen glatter Muskeln in ähnlicher Weise wie gewöhnliche Kaliumkanal blockierende Substanzen (wie beispielsweise VerapamilTM). Man nimmt an, dass die Unterdrückung der spontanen Kontraktion glatter Muskeln durch diese Peptide mit einem oder mehreren Aktionsmechanismen assoziiert ist. Erstens kann eine Verschiebung des Membranruhepotenzials der glatten Muskelzelle hin zu einem negativeren Wert (d.h. Hyperpolarisierung) durch Öffnung von Kaliumkanälen in der Zellmembran hervorgerufen werden, wodurch ein gesteigerter Ausstrom von Kaliumionen aus dem Inneren der Zelle aus der Zelle heraus über die Kaliumkanäle während der Phasen 3 und 4 eines Aktionspotentials bewirkt wird, wenn diese Peptide einer glatten Muskelzelle verabreicht werden (oder diese Peptide mit einer glatten Muskelzelle in Kontakt gebracht werden. Zweitens können diese Peptide die Repolarisierung einer Zelle beschleunigen, wobei sie indirekt das Einströmen von Kalziumionen über spannungssensitive Kalziumkanäle und letztlich die Freisetzung von Kalziumionen aus dem sarkoplasmatischen Retikulum, welche für die Kopplung von Erregung und Kontraktion wesentlich ist, beeinflussen. Da die Erregbarkeit einer glatten Muskelzelle in hohem Maße vom Membranruhepotenzial abhängt und die Kontraktionsaktivität glatter Muskelzellen von der intrazellulären Kalziumkonzentration abhängt, können Peptide, die über einen oder mehrere dieser zwei Mechanismen wirken, Kontraktionen glatter Muskelzellen in Testassays inhibieren.
  • Es ist wichtig zu erwähnen, dass die erfindungsgemäßen Peptide keine derartigen unterdrückenden Wirkungen in Testassays haben, bei denen eine hohe Kaliumionenkonzentration in der extrazellulären Flüssigkeit vorliegt. Dies wird allgemein als ein wichtiges Merkmal von Kaliumkanal öffnenden Substanzen angesehen. Eine hohe extrazelluläre Kaliumionenkonzentration verschiebt das Gleichgewichtsmembranpotenzial normalerweise zu einem positiveren Wert hin, wodurch eine Kontraktion induziert wird. Unter solchen Bedingungen kann ein Peptid mit Kaliumkanal öffnender Aktivität unter Umständen zu keiner Inhibierung der Kontraktionsaktivität einer Zelle führen. Unter solchen Umständen können Kaliumionen in der Zelle nicht nach außen gegen den Konzentrationsgradienten fließen, obwohl die Kaliumkanäle der Zellmembran aktiviert sind.
  • Die Erschlaffung und Kontraktion glatter Muskeln kann über eine Vielzahl allgemein bekannter Verfahren beobachtet werden. Beispielsweise kann die Erschlaffung gastrointestinaler glatter Muskeln klinisch durch Untersuchung des Unterleibs oder über verschiedene radiographische Verfahren beobachtet werden, beispielsweise Kontrastmitteluntersuchungen, Bariumeinläufe und dergleichen, oder durch Messung der Verringerung der peristaltischen Aktivität (beispielsweise unter Verwendung eines Stethoskops zur Überwachung der peristaltischen Aktivität).
  • Gemäß einem weiteren Aspekt zeigen die erfindungsgemäßen Peptide pharmakologische Aktivitäten anti-ischämischer Wirkstoffe, wie sie bestimmten bekannten Kaliumkanal öffnenden Substanzen zu beobachten sind. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die erfindungsgemäßen Peptide die inotrope Funktion des ischämischen Myokards wiederherstellen, ohne Rhythmusstörungen zu induzieren. Die erfindungsgemäßen Peptide optimieren die Kontraktionsarbeit des ischämischen Muskels und stellen die Kontraktionsfunktion auf prä-ischämischem Niveau wieder her, wie belegt wird durch ihre Fähigkeit: (i) differentielle Herzdrücke wiederherzustellen; (ii) vorzeitige Ventrikelkontraktionen (PVCs) zu inhibieren; (iii) diastolische Drücke mit normalen Werten wiederherzustellen; und (iv) den sich aufbauenden Druck und die Kontraktionskraft des linken Ventrikels wiederherzustellen. Die erfindungsgemäßen Peptide zeigen bei intraperitonealer oder intravenöser Injektion, oder bei Einbringung in den Herzkreislauf (d.h. durch die Aorta) bei bestimmten Konzentrationen (z.B. etwa 10–5 bis 10–7 M) im ischämischen Myokard eine positive inotrope Aktivität (d.h. sie steigern die Arbeitseffizienz des Herzen, gemessen über gesteigerten Herzausstoß ohne gesteigerten Sauerstoffverbrauch, gesteigerte metabolische Rate, oder Induktion von Rhythmusstörungen), und schwach negative chronotrope Aktivität. Eine Steigerung der Effizienz der Herzarbeit bedeutet hier die Fähigkeit, mehr Herzarbeit unter geringerem Energieaufwand zu verrichten, was beispielsweise durch Bestimmung des durch einen Herzschlag bei einer bestimmten Herzfrequenz über eine definierte Zeitdauer ausgestoßenen Blutvolumens gemessen werden kann. Weiterhin zeigen die erfindungsgemäßen Peptide eine schwach negative oder keine chronotrope Aktivität (d.h. die erfindungsgemäßen Peptide steigern nicht die Herzfrequenz, sondern senken im Gegenteil die Herzfrequenz oder haben keine Wirkung auf die Herzfrequenz). Der Begriff „chronotrop" bedeutet die Beeinflussung der Frequenz rhythmischer Bewegungen, wie beispielsweise die Frequenz des Herzschlags oder von Herzkontraktionen. Der Begriff „positiv chronotrop" bedeutet eine Steigerung der Frequenz rhythmischer Bewegungen (z.B. eine Steigerung der Frequenz des Herzschlags oder von Herzkontraktionen). Der Begriff „negativ chronotrop" bedeutet eine Verringerung der Frequenz rhythmischer Bewegungen (z.B. eine Verringerung der Frequenz von Herzkontraktionen oder des Herzschlags).
  • Wie nachfolgend ausführlicher besprochen wird, verringern erfindungsgemäße Peptide das Ausmaß ischämischer Myokardläsionen, ohne inotrope Funktionen des Herzens nachteilig zu beeinflussen, wie durch geringe Grade enzymatischer Aktivitäten bestimmter intrazellulärer, myokardialer Enzyme im Blut nach Einsetzen von Ischämie belegt wird.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide wirken als Wirkstoffe gegen Rhythmusstörungen, wobei sie das Auftreten vorzeitiger Ventrikelkontraktionen oder von Episoden ventrikulärer Tachykardie oder ventrikulärer Fibrillation verringern. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die erfindungsgemäßen Peptide die normale Herzfunktion nicht beeinflussen. Erfindungsgemäße Peptide üben auch Herz schützende Wirkungen aus, die vergleichbar sind mit denen, die bei bekannten Kaliumkanal öffnenden Substanzen im Allgemeinen zu beobachten sind. Solche Herz schützenden Wirkungen umfassen: (1) Wiederherstellung der inotropen Funktion des ischämischen Myokards (die durch die Messung der ventrikulären systolischen und diastolischen Drücke, des sich aufbauenden ventrikulären Drucks, und der maximalen ventrikulären Druckerhöhungs- und -verringerungsraten beurteilt werden kann), wobei aber keine Rhythmusstörungen induziert werden; (2) Förderung anti-ischämischer Wirkungen durch Verringerung des Ausmaßes von Ischämie in einem Gewebe oder einem Organ oder Verringerung des Ausmaßes myokardialer Läsionen im Herzen nach Unterbrechung des Blutstroms zum Herzmuskel (wie beispielsweise nach Koronarverschluss) ohne nachteilige Beeinflussung der inotropen Funktionen des Herzens; (3) Verhinderung der Entwicklung von Rhythmusstörungen (oder Disrhythmien) bei Induktion von Rhythmusstörungen (oder Disrhythmien) durch Chloroform oder Koronarverschluss, wiedergegeben durch eine Verringerung der Anzahl vorzeitiger Ventrikelkontraktionen oder durch eine Verringerung der Gesamtdauer von Episoden ventrikulärer Tachykardie oder ventrikulärer Fibrillation; (4) Hervorrufung Blutgefäß erweiternder Wirkungen, einschließlich koronardilatorischer Aktivität und hypotensiver Wirkungen; (5) minimale oder fehlende Wirkung auf die inotrope Funktion des Myokards oder auf die Herzfrequenz eines normalen Herzens; und (6) minimaler oder fehlender Einfluss auf elektrophysiologische Parameter des normalen Herzens, beispielsweise wiedergegeben durch normale Elektrokardiogrammmessungen des Myokards.
  • Testassays zur Beurteilung von Herzfunktionen sind dem Fachmann ebenfalls allgemein bekannt. Beispielsweise wird Überwachung über Elektrokardiogramm (ECG) routinemäßig verwendet zur Identifizierung und Messung vorzeitiger Ventrikelkontraktionen, ventrikulärer Tachykardie und ventrikulärer Fibrillationen. Das Ausmaß von Ischämie in einem Gewebe oder Organ eines Individuums kann bestimmt werden durch makroskopische pathologische Untersuchung, histologische Untersuchung oder die Messung einer Organaktivität in vivo oder in vitro. Herzorganaktivität kann über verschiedene, allgemein bekannte Verfahren bestimmt werden (beispielsweise die Messung der Herzfrequenz, oder des diastolischen, systolischen, differenziellen oder sich aufbauenden Drucks in den Herzkammern, oder durch Messung der Konzentrationen von Herzmuskelenzymen, beispielsweise von Creatininphosphokinase im Blut).
  • Wie oben vermerkt, verringern die erfindungsgemäßen Peptide die spontane Kontraktionsaktivität glatter Gefäßmuskeln. Ein erwähnenswerter Unterschied zu Kalziumblockern besteht jedoch darin, dass die erfindungsgemäßen Peptide keine Wirkung auf die durch hohe Kaliumchloridkonzentrationen induzierte tonische Kontraktion ausüben. Die erfindungsgemäßen Peptide zeigen Blutgefäß erweiternde Aktivitäten und vermögen den durchschnittlichen arteriellen Blutdruck in Individuen zu verringern, die einer solchen Behandlung bedürfen. Diese Blutgefäß erweiternden Aktivitäten umfassen koronarerweiternde Aktivitäten (d.h. die Vergrößerung der Querschnittsfläche eines koronaren Blutgefäßes wie beispielsweise in einer Koronararterie) und hypotensive Aktivitäten (d.h. Blutdruck senkende Wirkungen).
  • Assays zur Messung der Blutgefäß erweiternden und gegen Rhythmusstörungen gerichteten Wirkungen von Substanzen sind dem Fachmann allgemein bekannt und umfassen die unten beispielhaft dargestellten Assays. Wie oben angemerkt, kann eine Erweiterung der Blutgefäße das Blutvolumen, das durch ein Gefäß fließt, erhöhen und/oder den Blutdruck in dem Gefäß senken. Eine Erweiterung von Blutgefäßen kann über eine Vielzahl üblicher klinischer Verfahren und Messungen nachgewiesen und gemessen werden. Beispielsweise wird eine Erweiterung von Blutgefäßen angezeigt, wenn ein Individuum eine Zunahme von Erythemen (z.B. eine Rötung der Haut aufgrund gesteigerten Blutflusses zur Haut oder ein „Erröten"), einen Blutdruckabfall, eine Wärmezunahme in einem Zielgebiet der Haut oder eine Gefäßschwellung zeigt. Eine Gefäßschwellung, die eine Erweiterung von Blutgefäßen anzeigt, kann in oberflächlichen Venen einfach beobachtet werden. Der Blutstrom kann über übliche Verfahren gemessen werden, einschließlich herkömmlicher Druckmanschetten-Blutdruckmessungen und Messungen mit Druck übertragenden Vorrichtungen. Veranschaulichende Assays zum Nachweis und zur Messung der Erweiterung von Blutgefäßen werden auch in den Beispielen unten vorgestellt.
  • Weiterhin induzieren und bewirken die erfindungsgemäßen Peptide eine Erschlaffung von Skelettmuskeln, wie durch deren Fähigkeit zur Verringerung der Amplitude kalziuminduzierter Kontraktionen intestinaler glatter Muskeln belegt wird. Man nimmt an, dass wie bei glattem Muskelgewebe diese Peptide die Erschlaffung von Skelettmuskeln induzieren, indem sie Kaliumkanäle des Skelettmuskels aktivieren oder öffnen. Assays zur Messung der Kontraktion und Erschlaffung von Skelettmuskeln sind dem Fachmann allgemein bekannt und umfassen die oben beschriebenen Assays.
  • Angesichts ihrer Aktivitäten hinsichtlich der Erschlaffung glatter Muskeln ist weiterhin zu erwarten, dass die erfindungsgemäßen Peptide glatte Muskeln der Atemwege erschlaffen lassen (beispielsweise tracheale glatte Muskeln) und bronchodilatorische Wirkungen auf bronchiale glatte Muskeln ausüben. Man nimmt an, dass diese bronchodilatorischen Wirkungen über einen gemeinsamen Mechanismus vermittelt werden, welcher die Wiederherstellung des normalen Musters der elektrophysiologischen Funktion in den elektrisch erregbaren Zellen des pathologisch veränderten Gewebes (z.B. pathologisch veränderter bronchialer glatter Muskeln) beinhaltet. Testassays zur Messung der Erschlaffung glatter Muskeln der Atemwege und bronchodilatorischer Wirkungen, wie beispielsweise in ex vivo- oder in vivo-Lungenfunktionsassays, sind dem Fachmann allgemein bekannt.
  • Aufgrund ihrer die Erschlaffung glatter Muskeln hervorrufenden Wirkungen ist weiterhin erwarten, dass die erfindungsgemäßen Peptide entspannende Wirkungen auf das Myometrium während der Schwangerschaft ausüben und prämenstruelle Krämpfe und vorzeitige Gebärmutterkontraktionen mildern. Solche Wirkungen können über dem Fachmann allgemein bekannte Verfahren einfach gemessen werden.
  • Aufgrund ihrer Kaliumkanal aktivierenden Aktivitäten nimmt man an, dass die erfindungsgemäßen Peptide die neuronale Erregbarkeit verringern und antikonvulsive Wirkungen auf Gehirnzellen ausüben. Die elektrische Aktivität des Gehirns kann durch elektroenzephalographische Techniken, PET-Scan und dergleichen gemessen werden.
  • Als anti-ischämische Wirkstoffe konservieren die erfindungsgemäßen Peptide Gewebe und Organe. Man nimmt an, dass die konservierenden Wirkungen dieser Peptide mit deren Kaliumkanal öffnenden Eigenschaften und deren Fähigkeit zur Regulierung von Kaliumkanälen assoziiert sind. Testassays zur Beurteilung solcher konservierenden Wirkungen sind dem Fachmann allgemein bekannt und umfassen die oben beschriebenen Testassays.
  • Veranschaulichende Assays für den Nachweis und die Messung der pharmakologischen und biologischen Aktivitäten der erfindungsgemäßen Peptide werden in den unten genannten Beispielen bereitgestellt.
  • III. PHARMAZEUTISCHE ZUBEREITUNGEN
  • Die Erfindung stellt die erfindungsgemäßen Peptide umfassende pharmazeutische Zubereitungen in Einheitsdosisform bereit. Wie oben beschrieben, sind diese Peptide sind brauchbar für die Behandlung oder Vorbeugung von auf die Öffnung von Kaliumkanälen ansprechenden Krankheiten in einem Individuum, das einer solchen Behandlung bedarf. Die erfindungsgemäßen Peptide umfassenden pharmazeutische Zubereitungen sind insbesondere brauchbar für die Behandlung oder Vorbeugung kardiovaskulärer Krankheiten, zur Induktion oder zum Bewirken der Erschlaffung glatter Muskeln, und zur Induktion oder zum Bewirken der Erschlaffung von Skelettmuskeln. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitungen in Einheitsdosisform umfassen im Allgemeinen pro Einheitsdosis einen Bereich von etwa 0,01 mg bis etwa 1000 mg L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung umfasst die Zubereitung pro Einheitsdosis einen Bereich von etwa 1 mg bis etwa 100 mg L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  • Die bevorzugte Form dieser pharmazeutischen Zubereitungen hängt von der beabsichtigten Verabreichungsart und therapeutischen Anwendung ab. Die Zubereitungen können (in Abhängigkeit von der gewünschten Formulierung) pharmazeutisch annehmbare, nicht-toxische Träger oder Verdünnungsmittel umfassen, die definiert sind als Vehikel, die üblicherweise zur Formulierung pharmazeutischer Zubereitungen für die Verabreichung an Tiere oder Menschen verwendet werden.
  • IV. ANWENDUNGEN
  • A. Therapeutische und prophylaktische Verfahren
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung von Krankheiten und Störungen bereit, die auf die Öffnung von Kaliumkanälen in Individuen, die einer solchen Behandlung bedürfen, ansprechen, dafür sensitiv sind oder damit assoziiert sind. Diese Individuen können Menschen und Tiere umfassen, insbesondere säugetierartige Wirbeltiere. Die vornehmlichen therapeutischen und prophylaktischen Anwendungsgebiete für diese Peptide umfassen Behandlungen, welche die folgenden Wirkungen erzielen sollen: (1) Blutgefäß erweiternde Wirkungen, einschließlich Koronardilation und hypotensive Wirkungen (z.B. Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide zur Behandlung von Individuen, die an Herzinsuffizienz leiden, oder zur Vorbeugung von Herzinsuffizienz bei Individuen, die einer solchen Vorbeugung bedürfen); (2) anti-ischämische, Herz schützende Wirkungen, welche eine Verringerung des Ausmaßes ischämischer, myokardialer Läsionen ohne nachteilige Beeinflussung inotroper Funktionen des Herzens umfassen (z.B. Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide zur Behandlung von Individuen nach Schlaganfall oder Herzattacke); (3) bronchodilatorische Wirkungen (z.B. Verwendung der Peptide zur Behandlung oder Vorbeugung von Asthma, bronchospastischen Störungen, oder bronchospastischem Syndrom und/oder zur Induktion der Erschlaffung bronchialer glatter Muskeln); (4) erschlaffende Wirkungen auf glatte Muskeln (z.B. Verwendung der Peptide zur Behandlung abnormaler Schwangerschaften, einschließlich Zuständen, welche vorzeitige Gebärmutterkontraktionen und prämenstruelle Krämpfe beinhalten, und zur Entspannung des Myometriums von Individuen während der Schwangerschaft); (5) Skelettmuskel-erschlaffende Wirkungen; (6) antiepileptische und antikonvulsive Wirkungen; (7) Verringerung der neuronalen Erregbarkeit; und (8) Regulation der Insulinsekretion. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die erfindungsgemäßen Peptide diese Wirkungen in niedrigen Dosierungskonzentrationen und ohne toxische Nebenwirkungen hervorrufen.
  • Ein erfindungsgemäßer Aspekt stellt Verfahren für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von Krankheiten und Störungen bereit, die durch die Öffnung von Kaliumkanälen in Zellmembranen von Individuen, die einer solchen Behandlung bedürfen, behandelbar sind, darauf ansprechen oder dafür sensitiv sind. Beispielhafte Krankheiten und Störungen werden unten besprochen. Wie oben beschrieben, umfassen diese Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Peptids an ein Individuum, das einer solchen Verabreichung bedarf, einschließlich eines Menschen. Im Allgemeinen umfasst das Peptid L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassendes Polymer von L-Gly-L-Glu, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassendes Polymer von L-Val-L-Thr, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassendes Polymer von L-Val-L-Thr und L-Gly-L-Glu, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon. Weiterhin kann das Peptid ein Polymer von L-Val-L-Thr und L-Gly-L-Glu umfassen, das nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfasst.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt stellt Verfahren bereit, die spezifisch auf die Behandlung und Vorbeugung kardiovaskulärer Krankheiten gerichtet sind, welche mit Kaliumkanälen assoziiert sind oder auf die Öffnung oder Aktivierung von Kaliumkanälen ansprechen. Solche kardiovaskulären Krankheiten werden unten im Detail besprochen. Diese Verfahren umfassen die Verabreichung einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Peptids, wie oben beschrieben, an ein Individuum, einschließlich eines Menschen, das dieser bedarf. Das Peptid umfasst normalerweise L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassendes Polymer von L-Gly-L-Glu, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassendes Polymer von L-Val-L-Thr, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon. Das Peptid kann ein Polymer aus L-Val-L-Thr und L-Gly-L-Glu umfassen, das nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Verfahren zur Induktion und zum Bewirken der Erschlaffung von Muskelzellen in Individuen, die einer solchen Erschlaffung bedürfen. Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt Verfahren zur Induktion und zur Bewirkung der Erschlaffung von Skelettmuskeln bei Individuen bereit, die einer solchen Erschlaffung bedürfen. Wie oben beschrieben umfassen diese beiden Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Peptids an ein Individuum, das ein Mensch sein kann. Gewöhnlich umfasst das Peptid L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassendes Polymer aus L-Gly-L-Glu, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassendes Polymer aus L-Val-L-Thr, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon. Das Peptid kann ein Polymer aus L-Val-L-Thr und L-Gly-L-Glu umfassen, das nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfasst. Solche Verfahren können verwendet werden, um die Erschlaffung verschiedener Arten glatter Muskeln zu bewirken, einschließlich intestinaler, bronchialer, trachealer glatter Muskeln, glatter Muskeln des Uterus, der Blase, des Darms, des Vas deferens und glatter Gefäßmuskeln.
  • B. Behandelbare Krankheiten und Störungen
  • Aufgrund ihrer Fähigkeit zur Aktivierung und Öffnung von Kaliumkanälen sind die erfindungsgemäßen Peptide brauchbar zur Behandlung oder Vorbeugung eines weiten Spektrums von Krankheiten und Störungen, die ansprechen auf oder sensitiv sind für die Öffnung von Kaliumkanälen oder mit Kaliumkanal öffnenden Aktivitäten assoziiert sind (einschließlich solcher Krankheiten und Störungen, bei denen die Zellmembranen von Geweben oder Organen des Individuums teilweise depolarisiert sind, z.B. bei ischämischen Geweben oder Organen). Erfindungsgemäße Peptide sind wirksam bei der Behandlung und Linderung kardiovaskulärer Krankheiten, die mit Kaliumkanälen assoziiert sind oder auf eine Aktivierung von Kaliumkanälen ansprechen. Die erfindungsgemäßen Peptide sind insbesondere brauchbar für die Behandlung und Vorbeugung aller hier beschriebenen Formen ischämischer Herzerkrankungen (einschließlich Myokardinfarkt, Angina pectoris, akute und chronische Koronarinsuffizienz, und postmyokardiale Infarktkardiosklerose). Wie oben besprochen wurde, wirken die erfindungsgemäßen Peptide auch erfolgreich als anti-ischämische und Herz schützende Wirkstoffe, wobei sie das Ausmaß ischämischer Läsionen im Herzen verringern, ohne die jeweiligen inotropen Funktionen des Herzens nachteilig zu beeinflussen. Nach dem Einsetzen von Ischämie und der Inhibition der Bildung von Herzkontraktion stellen die erfindungsgemäßen Peptide insbesondere die mechanische Herzfunktion wieder her und verbessern diese. Die Herz schützenden Wirkungen dieser Peptide sind zum Teil assoziiert mit deren Fähigkeit zur Regulierung und Aktivierung von Kaliumkanälen in ischämischem Myokardgewebe (d.h. die Fähigkeit, Kaliumkanal aufweisende Zellen in ischämischem Gewebe zu hyperpolarisieren oder eine weitere Depolarisierung zu inhibieren). Diese Peptide helfen dabei, einen Schaden am Herz zu verhindern, der normalerweise bei verschiedenen Zuständen von Herzfehlfunktionen (z.B. akutem Myokardinfarkt) auftritt.
  • Weiterhin schützen die erfindungsgemäßen Peptide das Herz, indem sie es befähigen, einem vorübergehenden Sauerstoffentzug besser zu widerstehen. Ein Kennzeichen des Myokardzellschadens bei Ischämie und Hypoxie ist die Störung der respiratorischen Funktion der Mitochondrien oder eine Unterbrechung oder Blockierung der Sauerstoffversorgung der Myokardzellen. Die Blutgefäß erweiternden Wirkungen dieser Peptide können zu einem erhöhten Blut- und Sauerstoffstrom zum Herzen führen.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide sind weiterhin brauchbar für die Behandlung oder Vorbeugung weiterer kardiovaskulärer Krankheiten, die mit Kaliumkanälen assoziiert sind oder auf die Aktivierung von Kaliumkanälen ansprechen. Solche Krankheiten umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Herzdysrhythmien (einschließlich Rhythmus-Paroxysmaltachykardie und weitere Formen der Tachykardie, beispielsweise ventrikuläre Tachykardie, ventrikuläre Fibrillation, supraventrikuläre und ventrikuläre Ektopie, und nicht-spezifische vorzeitige Schläge), Herzrhythmusstörungen, Kardiomyopathie und Myokarddystrophie; alle Arten hypertensiver Krankheit; kongestive Herzinsuffizienz; Hypoxie; von Kontakt mit chemischen Toxinen herrührende kardiovaskuläre Krankheiten; Herzinsuffizienz; und mit Leitungsstörungen assoziierte kardiovaskuläre Krankheiten (d.h. AV-Blocks verschiedener Schweregrade). Siehe z.B. Guermonprez et al., supra. Da die erfindungsgemäßen Peptide wirksame Wirkstoffe gegen Rhythmusstörungen, Blutgefäß erweiternde, koronardilatorische oder hypotensive Wirkstoffe sind, können sie weiterhin für die Behandlung und Vorbeugung kardiovaskulärer Krankheiten (und verwandter Störungen) brauchbar sein, die von diesen Wirkungen profitieren können.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide sind weiterhin brauchbar für die Induktion und Bewirkung der Erschlaffung glatter Muskeln und für die Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten, Störungen, und mit Kontraktionen glatter Muskel assoziierter Störungen und auf die Mäßigung der Kontraktionsantwort der glatten Muskeln ansprechender Krankheiten. Die erfindungsgemäßen Peptide sind brauchbar für die Entspannung glatter Gefäßmuskeln und von Blutgefäßwänden, und für die Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten, Störungen und mit der Pathologie glatter Gefäßmuskeln assoziierter Störungen.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide sind weiterhin brauchbar für die Entspannung nicht-vaskulärer glatter Muskeln (wie beispielsweise solchen der Trachea, des Bronchus, der Harnblase, des Darms, des Uterus, des Vas deferens) und für die Behandlung und Vorbeugung von Störungen, Zuständen und Krankheiten nicht-vaskulärer glatter Muskeln, einschließlich hyperreaktiver Störungen nicht-vaskulärer glatter Muskeln (wie beispielsweise Asthma, Reizdarm, Reizblase), hyperreaktiver Zustände in der Lunge und im Gastrointestinaltrakt, und verschiedener allergischer Zustände, die mit abnormal erhöhter Reaktivität glatter Muskeln assoziiert sind (z.B. Asthma und bronchospastische Störungen). Angesichts ihrer die Erschlaffung glatter Muskeln bewirkenden Eigenschaften sind die erfindungsgemäßen Peptide brauchbar für die Behandlung, Vorbeugung und Linderung prämenstrueller Krämpfe, vorzeitiger Uteruskontraktionen, und/oder Komplikationen, die auf einem erhöhten Tonus des Myometriums beruhen.
  • Wie oben vermerkt, nimmt man an, dass die erfindungsgemäßen Peptide eine Erschlaffung der glatten Muskeln der Atemwege bewirken (z.B. bronchialen glatten Muskelgewebes) und bronchodilatorische Wirkungen ausüben, wie es bekannte Kaliumkanal öffnende Substanzen tun. Die erfindungsgemäßen Peptide sind erwartungsgemäß nützlich für die Behandlung, Kontrolle und Vorbeugung von Störungen, die mit Bronchialasthma assoziiert sind, einschließlich Bronchokonstriktion, bronchospastischen Zuständen, und bronchospastischem Syndrom und dergleichen. Bronchodilatation wird durch verbesserte Respiration bei einem asthmatischen Patienten angezeigt und kann über eine Vielzahl üblicher Lungenfunktionstests gemessen werden, beispielsweise den zum forcierten Exspirationsvolumen (FEV1).
  • Da diese Peptide eine Erschlaffung glatter Muskeln bewirken und die Kontraktion glatter Muskeln inhibieren, sind sie brauchbar für die Behandlung und Vorbeugung von pathologischen Zuständen, von Zuständen oder Krankheiten, die im Allgemeinen auf einer pathologischen Kontraktion glatter Gefäßmuskeln oder einer Überreaktivität glatter Muskeln (z.B. Hypertension) beruhen oder eine solche beinhalten. In ähnlicher Weise sind die erfindungsgemäßen Peptide brauchbar für die Behandlung und Vorbeugung von peripheren Gefäßkrankheiten und Zuständen, bei denen eine Verringerung der peristaltischen Aktivität erwünscht ist.
  • Da die erfindungsgemäßen Peptide eine Erschlaffung glatter Gefäßmuskeln bewirken und eine Erweiterung von Blutgefäßen induzieren, sind sie weiterhin brauchbar bei der prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von Krankheiten oder Störungen, die durch Vasodilatation behandelbar sind, darauf ansprechen oder dafür sensitiv sind. Beispielsweise sind sie nützlich für die Behandlung und Vorbeugung von Hypertension, hohem Blutdruck, peripherer Gefäßkrankheit und dergleichen. Es ist wichtig zu erwähnen, dass ein Erweiterung von Blutgefäßen den Blut-, Sauerstoff- und Nährstoffstrom in geschädigte Gewebe (beispielsweise ischämische Gewebe) und Gewebe, denen Blut, Sauerstoff und Nährstoffe vorenthalten wurden (beispielsweise Gewebe, die Bereiche mit Hypoxie aufweisen), steigert und wiederherstellt, und der Zelltod kann somit verhindert, verlangsamt oder verzögert werden. Als Ergebnis davon sind die erfindungsgemäßen Peptide mit ihren Blutgefäß erweiternden Eigenschaften wirksam bei der Vorbeugung und Verlangsamung von Zelltod in Geweben, denen Blut, Sauerstoff und Nährstoffe vorenthalten wurden, und bei der Behandlung und Vorbeugung von Störungen, die von solchen Umständen herrühren (z.B. Hypoxie, Anoxie, Ischämie).
  • Die erfindungsgemäßen Peptide sind weiterhin brauchbar für die Induktion der Erschlaffung von Skelettmuskeln und für die Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten und Störungen, die mit der Kontraktion von Skelettmuskeln assoziiert sind, und von Krankheiten, die auf eine Mäßigung der Kontraktionsantwort des Skelettmuskels ansprechen, einschließlich bestimmter Skelettmuskelmyopathien und ischämischer Skelettmuskelzustände. Carmeliet, Eur. Heart J. 12 (Suppl. F): 30–37 (1991); McPherson, Gen. Pharmac. 24(2): 275–81 (1993).
  • Angesichts ihrer die Erschlaffung glatter Muskeln bewirkender Eigenschaften und Blutgefäß erweiternden Wirkungen sind die erfindungsgemäßen Peptide erwartungsgemäß brauchbar sind für die Behandlung und Vorbeugung von Leberzirrhose. Leberzirrhose ist eine chronische Erkrankung der Leber, die gekennzeichnet ist durch eine fortschreitende Zerstörung und Regeneration von Leberzellen und zunehmende Bildung von Bindegewebe, das letztlich zu einer Blockierung der Pfortader-Zirkulation, zu Pfortader-Hypertension, Leberversagen und Tod führt. Durch Induktion der Erschlaffung glatter Muskeln und Vasodilatation bewirken die erfindungsgemäßen Peptide eine Abzweigung der Blutversorgung weg von der Pfortadervene und inhibieren oder verlangsamen somit das Fortschreiten der Zirrhose. Die Leberaktivität kann im Allgemeinen durch Messung der Konzentrationen von Enzymen (wie beispielsweise alkalische Phosphatase) in peripherem Blut gemessen werden.
  • Kaliumkanäle sind in Gehirnzellen weit verbreitet und wurden mit verschiedenen Gehirnstörungen in Verbindung gebracht, einschließlich Epilepsie, Anoxie, verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, und verschiedenen Formen zerebraler Ischämie, einschließlich Schlaganfall und Trauma. Siehe z.B. Gopalakrishnan et al., supra; Ben-Ari et al., Neuroscience 37: 55–60 (1990); Gandolfo et al., supra; Ashford et al., Nature 370: 456–59 (11. August 1994). Man fand, dass bekannte Kaliumkanal öffnende Substanzen die neuronale Erregbarkeit verringern und antikonvulsive Wirkungen auf Gehirnzellen ausüben. Die Wirkungen bekannter Kaliumkanäle auf Gehirnzellen können auf verschiedenen Wirkungsmechanismen beruhen. Wie in anderen Geweben, die Zellen mit Kaliumkanälen aufweisen, scheint die direkte Aktivierung von Kaliumkanälen in Gehirnzellen die Erregbarkeit dieser Zellen zu verringern und diese Zellen zu schützen.
  • Kaliumkanal öffnende Substanzen können Gehirngeweben auch über deren Blutgefäß erweiternde Eigenschaften nützen. Einige neurodegenerative Krankheiten sind, wenigstens zum Teil, durch einen Mangel an Sauerstoff und Nährstoffen in neuronalem Gewebe gekennzeichnet. Es ist bekannt, dass ein fortschreitender Mangel an Sauerstoff und Nährstoffen in Gehirn- und neuronalen Geweben das Fortschreiten neurodegenerativer Krankheiten fördert. Durch Verbesserung des Transports von Sauerstoff und Nährstoffen zum neuronalen Gewebe können neurodegenerative Krankheiten verlangsamt und stabilisiert werden. Eine Erweiterung von Blutgefäßen steigert im Allgemeinen die Zirkulation und den Blutstrom und verbessert den Transport von Sauerstoff und Nährstoffen in Körpergewebe. Durch ihre Blutgefäße erweiternden Wirkungen können Kaliumkanal öffnende Substanzen bei der Verzögerung und Stabilisierung neurodegenerativer Krankheiten helfen, indem sie den Strom von Sauerstoff und Nährstoffen zu Gehirngeweben steigern, die Sauerstoffe und Nährstoffe benötigen.
  • Angesichts ihrer Blutgefäß erweiternden Eigenschaften sind die erfindungsgemäßen Peptide erwartungsgemäß für die Behandlung und Vorbeugung einer Vielzahl von Gehirnstörungen brauchbar, die beispielsweise von übermäßiger oder inkorrekter neuronaler Erregbarkeit herrühren. Es ist zu erwarten, dass die erfindungsgemäßen Peptide die neuronale Erregbarkeit verringern und anti-ischämische und antikonvulsive Wirkungen auf Gehirnzellen mit Kaliumkanälen ausüben. Die erfindungsgemäßen Peptide sollten somit brauchbar sein für die Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten, die mit neuronalem Schaden und übermäßiger oder inkorrekter Erregbarkeit assoziiert sind, einschließlich Epilepsie, Anoxie, Hypoxie, Schlaganfall, Trauma, zerebraler Ischämie, Krämpfen und Alzheimer-Krankheit.
  • Als Blutgefäß erweiternde Substanzen steigern die erfindungsgemäßen Peptide weiterhin den Blutstrom und den Transport von Sauerstoff und Nährstoffen zu neuronalen Geweben, und verbessern somit die Qualität und Stabilität neuronaler Gewebe, und verlangsamen erwartungsgemäß das Fortschreiten neurodegenerativer Krankheiten. Die erfindungsgemäßen Peptide sind somit nützlich für die Behandlung und Vorbeugung von Störungen, die auf einem Mangel oder einem Entzug von Sauerstoff und Nährstoffen in Geweben beruhen. Aus diesen Gründen sind die erfindungsgemäßen Peptide brauchbar für die Behandlung und Vorbeugung von Anoxie (z.B. kardialer Hypoxie und neuronaler Hypoxie), Hypoxie (z.B. kardialer Hypoxie und neuronaler Hypoxie), Parkinson-Krankheit und Alzheimer-Krankheit. Da Epilepsie durch Sauerstoffmangel ausgelöst werden kann und/oder von hypoxischen Zuständen herrühren kann, sind die erfindungsgemäßen Peptide erwartungsgemäß weiterhin brauchbar für die Behandlung und Vorbeugung von Epilepsie und von damit in Zusammenhang stehenden Störungen. In ähnlicher Weise sind die erfindungsgemäßen Peptide weiterhin brauchbar für die Behandlung und Vorbeugung von Herzischämie, da während der Herzischämie Myocyten einem Sauerstoffentzug ausgesetzt sind und unter der Unterbrechung der Perfusion leiden.
  • Da Kaliumkanäle für die Appetitregulierung einen Rückkopplungskreis mit Betazellen der Bauchspeicheldrüse bilden können, sind die erfindungsgemäßen Peptide erwartungsgemäß nützlich bei der Behandlung und Vorbeugung von Appetit- und Ernährungsstörungen und -krankheiten. Gopalakrishnan et al., supra. Da Kaliumkanäle weiterhin mit Diabetes und damit in Zusammenhang stehenden Störungen assoziiert sein können, nimmt man an, dass die erfindungsgemäßen Peptide bei der Behandlung und Vorbeugung von Diabetes brauchbar sind. Siehe z.B. Ashford et al., supra.
  • Erwartungsgemäß sind die Peptide weiterhin nützlich bei der Behandlung und Vorbeugung von Nierenerkrankungen. Die Nierenaktivität kann durch Überwachung der Konzentration von Harnstoff-Stickstoff im Blut gemessen werden. Erfindungsgemäße Peptide sind auch nützlich für die Konservierung und den Erhalt lebender Gewebe und Organe ex vivo. Beispielsweise können diese Peptide für die ex vivo-Konservierung eines lebenden Gewebes und Organs, beispielsweise eines Herzens oder Blutgefäßes, vor der Transplantation (oder Re-Implantation) in ein Individuum verwendet werden.
  • C. Dosierungen und Verabreichungsmethoden
  • Bei therapeutischen Anwendungen kann ein erfindungsgemäßes Peptid einem bereits an einer unerwünschten Krankheit oder einem unerwünschten Zustand (z.B. ischämischer Herzerkrankung) leidenden Individuum in einer Menge verabreicht werden, die ausreicht, um das Fortschreiten der Krankheit und deren Komplikationen zu behandeln, zu heilen, teilweise anzuhalten oder nachweisbar zu verlangsamen. Eine für die Verwendung in therapeutischen Anwendungen wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Peptids hängt von der Schwere des Zustandes, dem allgemeinen Zustand des Individuums und der Verabreichungsroute ab. Die wirksame Menge des Peptids bei therapeutischen Anwendungen liegt pro Dosis im Allgemeinen in einem Bereich von etwa 0,15 Mikrogramm pro Kilogramm (mg/kg) bis etwa 10 mg/kg des Peptids (oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon). Die wirksame Menge des erfindungsgemäßen Peptids kann von etwa 0,01 mg/kg bis etwa 10 mg/kg pro Dosis reichen. Eine wirksame Menge L-Gly-L- Glu oder L-Val-L-Thr, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, für therapeutische Anwendungen kann von etwa 0,15 mg/kg bis etwa 10 mg/kg des jeweiligen Peptids (oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon) pro Dosis reichen.
  • Bei prophylaktischen Anwendungen werden die erfindungsgemäßen Peptide oder pharmazeutische Zubereitungen davon Individuen verabreicht, die noch nicht an einer unerwünschten Krankheit oder einem unerwünschten Zustand leiden, aber mit einem Risiko dafür behaftet sind. Die zu verabreichende wirksame Menge des Peptids hängt vom Gesundheitszustand und dem allgemeinen Grad der Immunität des Individuums ab. Die wirksame Menge des Peptids bei prophylaktischen Anwendungen liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,15 Mikrogramm pro Kilogramm (mcg/kg) bis etwa 10 mg/kg des Peptids pro Dosis. Die wirksame Menge kann von etwa 0,01 mg/kg bis etwa 10 mg/kg aktiver Wirkstoff pro Dosis reichen. Bei prophylaktischen Anwendungen kann eine wirksame Menge von L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, von etwa 0,15 mg/kg bis etwa 10 mg/kg des jeweiligen Peptids (oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon) pro Dosis reichen.
  • Bei Verfahren zur Induktion der Erschlaffung glatter Muskeln bei Individuen, welche dieser bedürfen, und bei Verfahren zur Induktion der Erschlaffung von Skelettmuskeln bei Individuen, welche dieser bedürfen, liegt die wirksame Menge des Peptids für jedes dieser Verfahren pro Dosis im Allgemeinen innerhalb eines Bereichs von etwa 0,15 Mikrogramm pro Kilogramm (mcg/kg) bis etwa 10 mg/kg des Peptids. Die wirksame Menge des erfindungsgemäßen Peptids kann von etwa 0,01 mg/kg bis etwa 10 mg/kg pro Dosis reichen. Bei Verfahren zur Induktion der Erschlaffung von glatten Muskeln oder von Skelettmuskeln kann eine wirksame Menge L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, von etwa 0,15 mg/kg bis etwa 10 mg/kg des jeweiligen Peptids pro Dosis reichen.
  • Alternativ können pharmazeutische Zubereitungen in Einheitsdosisform bei den oben genannten Anwendungen, einschließlich Protokollen zur prophylaktischen Behandlung, verabreicht werden. In einer Ausführungsform umfassen diese pharmazeutischen Zubereitungen pro Einheitsdosis eine wirksame Menge von etwa 0,01 mg bis etwa 1000 mg L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr (oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon) und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. In einer weiteren Ausführungsform können solche Zubereitungen pro Einheitsdosis eine wirksame Menge von etwa 1 mg bis etwa 100 mg L-Gly-L-Glu bzw. L-Val-L-Thr (bzw. eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon), und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen.
  • Die bevorzugte Form der erfindungsgemäßen Peptide für Inocula und die Dosierung hängt von der klinischen Indikation ab. Das Inoculum wird normalerweise aus einem getrockneten Peptid (oder dessen Konjugat) hergestellt, indem das Peptid in einem physiologisch annehmbaren Verdünnungsmittel, wie beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung suspendiert wird. Eine gewisse Variation bei der Dosierung tritt notwendigerweise in Abhängigkeit vom Zustand des behandelten Individuums auf, und der Arzt bestimmt die geeignete Dosis für das jeweilige Individuum. Die wirksame Peptidmenge pro Einheitsdosis hängt unter anderem vom Körpergewicht und der Physiologie des Individuums ab, und vom gewählten Inoculationsprotokoll. Eine Einheitsdosis des Peptids bezieht sich auf das Gewicht des Peptids ohne das Gewicht eines Trägers (falls ein Träger verwendet wird). Bei einer pharmazeutischen Zubereitung in Einheitsdosisform wird eine wirksame therapeutische oder prophylaktische Behandlung normalerweise durch Verabreichung von Peptid (oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon) innerhalb eines Bereichs von etwa 0,01 mg bis etwa 1000 mg pro Dosis erzielt, wobei einzelne Dosiseinheiten des Peptids von etwa 1 mg bis etwa 100 mg betragen. Die pharmakologisch wirksame Menge von L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr (oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon) liegt im Allgemeinen in einem Bereich von etwa 0,01 mg bis etwa 1000 mg des jeweiligen Peptids pro Einheitsdosis. Üblicherweise liegt die pharmakologisch wirksame Menge von L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr (oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon) innerhalb eines Bereichs von etwa 1 mg bis etwa 100 mg pro Einheitsdosis.
  • Der Verabreichungsweg der erfindungsgemäßen Peptide und pharmazeutischen Zubereitungen hängt von der Krankheit oder der klinischen Indikation und von der Stelle ab, an der eine Behandlung erforderlich ist. Für topische Anwendung kann es wünschenswert sein, das Peptid oder dessen Zubereitung an der lokalen Stelle zu verabreichen (z.B. unter Verwendung eines Katheders, der während einer Operation in die Koronararterie gelegt wird, oder durch Anlegen eines mit dem Peptid imprägnierten chirurgischen Verbandes auf das während der Herzoperation zu behandelnde Myokardgewebe). Alternativ kann es bei fortgeschrittenen Krankheiten erwünscht sein, das Peptid oder die Zubereitung systemisch zu verabreichen.
  • Für weitere Indikationen können die erfindungsgemäßen Peptide und pharmazeutischen Zubereitungen über intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, intranasale und intradermale Injektion, ebenso wie über intrabronchiale Instillation (z.B. unter Verwendung eines Verneblers), und transmukosale, systemische, transdermale (z.B. über einen fettlöslichen Träger in einem Hautpflaster), orale und gastrointestinale Verabreichung (z.B. mit einer Kapsel oder Tablette) verabreicht werden. Während oder nach einer kardiovaskulären Operation (z.B. Herz-Bypass-Operation, Angioplastie und dergleichen) können Peptide und pharmazeutische Zubereitungen über eine intravenöse Bolusinjektion (oder durch Perfusion) verabreicht werden.
  • Ein oder mehrere erfindungsgemäße Peptide können in einer Kombinationstherapie verabreicht werden. Beispielsweise können ein oder mehrere erfindungsgemäße Peptide in Kombination mit einem Antikoagulans (wie beispielsweise Streptokinase/Streptodornase, Gewebe-Plasminogen-Aktivator oder Urokinase) einem Individuum verabreicht werden, das einer solchen Behandlung bedarf, beispielsweise einem Individuum, das zuvor eine Episode koronarer Thrombose durchlebt hat.
  • Die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von Peptiden der pharmazeutischen Zusammensetzungen variieren in verschiedenen Individuen. Bei einem akuten Fall kann es erwünscht sein, eine therapeutische oder prophylaktische Konzentration des Peptids in einem Organ, einer zu behandelnden Gewebestelle oder im Blut des behandelten Individuums durch Verabreichung des Peptids oder dessen Zubereitung an ein Individuum in einer Weise zu erreichen, so dass die Konzentration des Peptids in dem Gewebe, Organ oder im Blut schnell ansteigt. Beispielsweise kann die Konzentration eines Peptids an einer bestimmten Stelle durch intravenöse Bolusinjektion oder Infusion des Peptids oder einer pharmazeutischen Zubereitung davon schnell gesteigert werden. Alternativ kann eine therapeutische oder prophylaktische Konzentration des Peptids in einem Organ, an einer zu behandelnden Gewebestelle oder im Blut des Individuums erreicht werden, indem man eine ansteigende Menge oder Dosierung des Peptids (oder einer pharmazeutischen Zubereitung davon) über einen Zeitraum verabreicht, bis eine wirksame Menge des Peptids in dem Organ, der Gewebestelle oder im Blut erreicht wird. Die anfängliche Dosis für diese Art von Protokoll hängt von dem Verabreichungsweg ab. Um ein Beispiel zu nennen kann für eine intravenöse Verabreichung einer pharmazeutischen Zubereitung, welche ein Peptid mit einem Molekulargewicht von etwa 200 bis etwa 400 Dalton umfasst, eine anfängliche Dosierung von etwa 0,001 mg/kg bis etwa 10 mg/kg verabreicht werden. Bei jeder nachfolgenden Verabreichung kann die Dosierung durch Erhöhung der Peptidkonzentration um einen Faktor 10 erhöht werden.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide können allein oder in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie in den oben beschriebenen pharmazeutischen Zubereitungen, verabreicht werden. Die Peptide können als einzelne oder mehrfache Dosen verabreicht werden. Geeignete pharmazeutische Träger umfassen inerte, feste Verdünnungsmittel oder Füllmittel, sterile wässrige Lösungen und verschiedene nicht-toxische organische Lösungsmittel. Die durch Kombination eines erfindungsgemäßen Peptids mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger gebildeten pharmazeutischen Zubereitungen können in einer Vielzahl von Dosierungsformen, wie beispielsweise Tabletten, Pastillen, Sirups, injizierbaren Lösungen und dergleichen einfach verabreicht werden. Falls gewünscht, können die pharmazeutischen Träger zusätzliche Inhaltsstoffe enthalten, beispielsweise Geschmack gebende Mittel, Bindemittel, Exzipienten und dergleichen.
  • Für orale Verabreichung können Tabletten, die verschiedene Exzipienten wie beispielsweise Natriumcitrat, Kalziumcarbonat und Kalziumphosphat enthaltend, zusammen mit verschiedenen Zerfallhilfsmitteln, wie beispielsweise Stärke, und bevorzugt Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, und bestimmten komplexen Silikaten, zusammen mit Bindemitteln, wie beispielsweise Polyvinylpyrrolidon, Saccharose, Gelatin und Acacia verwendet werden. Für die Tablettenherstellung werden auch Schmiermittel wie beispielsweise Magnesiumstereat, Natriumlarylsulfat und Talkum zugegeben. Feste Zubereitungen ähnlicher Art können auch als Füllmittel in salz- oder feststoffgefüllten Gelatinkapseln verwendet werden. Für diesen Zweck bevorzugte Materialien umfassen Laktose oder Milchzucker und Polyethylenglykole mit hohem Molekulargewicht. Wenn wässrige Suspensionen von Elixieren für orale Verabreichung erwünscht sind, kann der wesentliche, aktive Peptidinhaltsstoff darin mit verschiedenen Süßungsmitteln oder Geschmack gebenden Mitteln, farbigen Substanzen oder Farbstoffen, und falls gewünscht, emulgierenden oder suspendierenden Mitteln, zusammen mit Verdünnungsmitteln, wie beispielsweise Wasser, Ethanol, Propylenglykol, Glycerin oder Kombinationen davon, kombiniert werden.
  • Für parenterale Verabreichung können Lösungen des Peptids (oder von dessen Analogon) in Sesam- oder Erdnussöl oder in wässrigem Polypropylenglykol verwendet werden, ebenso wie sterile wässrige Kochsalzlösungen der entsprechenden wasserlöslichen, pharmazeutisch annehmbaren Metallsalze, die zuvor beschrieben wurden. Eine solche wässrige Lösung sollte erforderlichenfalls in geeigneter Weise gepuffert sein, und das flüssige Verdünnungsmittel mit ausreichend Kochsalz oder Glucose zunächst isotonisch gemacht werden. Diese besonderen wässrigen Lösungen sind insbesondere für intravenöse, intramuskuläre, subkutane und intraperitoneale Injektion geeignet. Alle verwendeten sterilen wässrigen Medien sind über dem Fachmann allgemein bekannte Standardverfahren einfach zu erhalten. Darüber hinaus können die zuvor erwähnten Verbindungen unter Verwendung einer für diesen besonderen Zweck geeigneten Lösung topisch verabreicht werden (beispielsweise durch einen gelegten Katheder). Parenterale Lösungen können mit etwa 0,001–10 mg/ml Peptid in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger in einer Lösung aus steriler, physiologischer Kochsalzlösung formuliert werden und zur Erzielung einer Dosis von etwa 0,1–10 mg/kg einem Individuum verabreicht werden, das einer solchen Lösung bedarf.
  • V. VERFAHREN ZUR KONSERVIERUNG LEBENDER GEWEBE UND ORGANE
  • Die bereitgestellten erfindungsgemäßen Peptide sind brauchbar, um lebende Gewebe oder Organe bei verschiedenen Anwendungen ex vivo zu konservieren und zu lagern. Beispielsweise sind diese Peptide brauchbar, um ein lebendes Gewebe oder Organ, beispielsweise ein Herz oder ein Blutgefäß, vor der Transplantation (oder Reimplantation) in ein Individuum ex vivo zu konservieren und zu erhalten. Diese Peptide sind weiterhin brauchbar, um lebende Gewebe und Organe unter ischämischen Bedingungen zu konservieren und zu erhalten. Verfahren zur Konservierung lebender Gewebe und Organe umfassen normalerweise das Inkontaktbringen des Gewebes oder Organs mit einer Zubereitung, welche einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Peptids umfasst. Solche Peptide umfassen L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassendes Polymer von L-Gly-L-Glu, ein nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfassendes Polymer von L-Val-L-Thr, oder eine Kombination davon, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon. L-Gly-L-Glu und L-Val-L-Thr und Polymere davon gehören zu den für die Verwendung bei solchen Verfahren bevorzugten Peptiden. Für diese Verfahren ist die wirksame Menge von L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr diejenige Menge, die ausreicht, um eine Konzentration des Peptids von etwa 10–9 M bis etwa 10–5 M in dem zu behandelnden Gewebe oder zu behandelnden Organ zu erzeugen.
  • VI. KITS ZUR KONSERVIERUNG LEBENDER GEWEBE UND ORGANE
  • Die Erfindung stellt auch für die Konservierung lebender Gewebe oder Organe brauchbare Kits bereit. Diese Kits umfassen eine wirksame Menge L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon und einen Behälter für das lebende Gewebe. Die wirksame Menge von L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr liegt im Allgemeinen innerhalb eines Bereichs von etwa 10–9 M bis etwa 10–5 M. Alternativ können solche Kits ein Polymer von L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr, oder einer Kombination davon umfassen, worin das Polymer nicht mehr als 16 Aminosäurereste umfasst. Solche Kits umfassen einen Behälter für die Aufbewahrung des Peptids und des Gewebes oder Organs.
  • Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht. Diese Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung von Aspekten der vorliegenden Erfindung und sollen die Erfindung nicht beschränken.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • Isolierung, Aufreinigung und Charakterisierung von Peptiden des Myokards, die Kaliumkanal öffnende Aktivität aufweisen
  • Die erfindungsgemäßen Dipeptide, GE und VT, und zwei Tetrapeptid-Polymere dieser Dipeptide wurden folgendermaßen identifiziert, isoliert und aufgereinigt.
  • Für die Herstellung eines als „Cardialin" bezeichneten Gewebeextrakts stellte man etwa 0,5 Gramm (g) eines Extrakts mit niedrigem Molekulargewicht aus Rinderherzgewebe bei einem pH von 2 bis 3 in Zinkchlorid (ZnCl) her, wobei ein Verfahren angewendet wurde, das dem im UdSSR-Patent Nr. 1,417,242 (1988) veröffentlichten Verfahren ähnelt, worauf hier für alle Zwecke vollumfänglich Bezug genommen wird. Man führte mit etwa 100 Milligramm (mg) des erhaltenen Extrakts aus Rinderherzgewebe eine Molekularsieb-Chromatographie in präperativem Maßstab auf einer 2,6 × 88 Zentimeter (cm) Säule mit G-25 Superfein-Harz (Pharmacia/LKB, Schweden) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 Milliliter/Minute (ml/min) durch. Von dem Säuleneluat wurden Fraktionen von 5 Milliliter gesammelt. Die Extinktion (optische Dichte) jeder Fraktion wurde bei 214 bzw. 280 Nanometer (nm) gemessen. Das erhaltene Chromatogramm war komplex.
  • Für die weitere Analyse bildete man folgendermaßen sieben Pools von Fraktionen: einen Leervolumen-Pool (Pool I); einen Pool mit Zentrum enthaltendem Volumen (Pool II); einen Pool mit Trailing enthaltendem Volumen (Pool III); und vier Trailing-Extinktions-Peaks enthaltende Pools von Fraktionen (Pools IV, V, VI und VII). Die Bestandteile der Pools I, II und III untersuchte man über Fast-Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) (Pharmacia/LKB, Schweden), wobei man das Gold-SystemTM (Kodak) und eine 5,0 × 30 Millimeter (mm)-Säule mit G-25 Superfein-Harz (Pharmacia/LKB, Schweden) verwendete. Die jeweiligen Bestandteile dieser Pools unterschied man voneinander durch Vergleich der Elutionszeiten, der Peakflächen und der Messungen der optischen Dichte bei ausgewählten Wellenlängen. Die Ergebnisse sind in Tabelle A zusammengefasst.
    Figure 00310001
    • *Bestimmt aus den Daten der Extinktion unter Annahme eines Extinktionskoeffizienten von ≈ 1,0 Molar–1 Zentimeter–1 (M–1cm–1).
    • **Zwischen 199–214 nm oder 249–299 nm beobachtete Extinktionspeaks.
  • Um biologisch aktive Bestandteile in den Pools I bis VII aus der präperativen Säule mit G-25 Superfein-Harz zu identifizieren, screente man jeden Pool jeweils unter Verwendung des in „Materialien und Methoden für den Screeningassay" beschriebenen Radioimmunoassays (RIA) auf Aktivierung der Adenylatcyclase-Aktivität in Kulturen isolierter Kardiomyozyten. Man fand, dass die Pools II und V die Adenylatcyclase-Aktivität in Kardiomyozyten signifikant erhöhten.
  • Dann maß man die optischen Dichten von Pool II und V zwischen 200 nm und 214 nm und bei 280 nm. Jeder Pool wies messbare optische Dichten bei diesen Wellenlängen auf. Da der Nachweis von optischen Dichten bei diesen Wellenlängen bei Fraktionen, die von einer Molekularsieb-Säule gesammelt wurden, normalerweise auf dem Vorliegen von Verbindungen mit aromatischen Resten und Peptidbindungen beruht, legt dieser Nachweis von optischen Dichten bei den Pools II und V nahe, dass diese Pools Verbindungen umfassen, welche aromatische Reste und/oder Peptidbindungen aufweisen.
  • Um sicherzustellen, dass die biologische Aktivität nicht auf einen anderen Bestandteil zurückzuführen war, der mit den bei zwischen 200 nm und 214 nm und bei 280 nm optische Dichten aufweisenden Fraktionen coeluierte, beispielsweise einem Lipid-Intermediat, führte man mit Pool II zusätzlich eine Molekularsieb-Chromatographie auf G-15 Superfein-Harz in Gegenwart von organischen Lösungsmitteln durch. Von dieser Säule gesammelte Fraktionen wurden auf Aktivierung der Adenylatcyclase-Aktivität gescreent. Zusätzlich maß man die optischen Dichten dieser Fraktionen bei den oben angegebenen Wellenlängen. Wie zuvor hatten die Fraktionen, welche eine Aktivierung der Adenylatcyclase-Aktivität zeigten, auch messbare optische Dichten bei den oben genannten Wellenlängen.
  • Pool II wurde, wie oben, über FPLC auf einer 5,0 × 30 cm Säule mit G25 Superfein-Harz weiter aufgereinigt. Die Eluatfraktionen wurden optisch bei Wellenlängen von 199 bis 214 nm und von 249 bis 299 nm überwacht. Fraktionen, welche die drei (als B1, B2 und B3 bezeichneten) Hauptextinktionspeaks enthielten, wurden über Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer 4,6 × 250 mm ODS 18/5 Mikroliter (μl)-Säule, die mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min betrieben wurde, weiter analysiert. Die Elutionszeiten und optischen Dichten der Elutionsfraktionen wurden erfasst und für die Unterscheidung von wenigstens sechs Hauptbestandteilen von Pool II verwendet, die in Tabelle B unten zusammengefasst sind. Tabelle B. Sechs Hauptbestandteile von Pool II nach HPLC-Aufreinigung
    Figure 00320001
    • Abkürzungen: B1, B2 und B3 = drei Hauptextinktionspeaks von Fraktionen, die von einer Fast-Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC)-Säule gesammelt wurden; SF = Superfein; HPLC = Hochdruckflüssigkeitschromatographie.
  • Man untersuchte die einzelnen Peaks der ODS 18/5 μl HPLC auf Aktivierung der Adenylatcyclase-Aktivität unter Verwendung des RIA-Screeningassays und anschließende zusätzliche HPLC-Trennung in verschiedenen Lösungsmittelsystemen (z.B. Acetonitril), einschließlich sowohl isokratischer und Gradientenelutionsmethoden. Drei dicht benachbarte Extinktionspeaks (Bestandteile 1–3 von Tabelle B, oben) wiesen den Hauptteil der biologischen Aktivität auf, waren jedoch durch alle verwendeten Techniken vergleichsweise untrennbar. Die Ergebnisse legen nahe, dass ein oder mehrere Peptidkomplexe für die beobachtete biologische Aktivität der Bestandteile 1, 2 und 3 verantwortlich waren.
  • Anschließend führte man mit jedem Peak einen Edman-Abbau durch. Die Mol-Verhältnisse und die N-terminalen Reste der Aminosäuren, welche durch diese Analyse nachgewiesen wurden, wiesen auf das Vorliegen von zwei Dipeptiden und zwei Tetrapeptiden in den Fraktionen hin. Die Mol-Verhältnisse der Dipeptide wiesen darauf hin, dass Glycin und Glutaminsäure in etwa gleichen Mengen und Valin und Threonin ebenfalls in etwa gleichen Mengen vorlagen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse stellte man die synthetischen Peptide L-Gly-L-Glu (GE) und L-Val-L-Thr (VT) her und führte mit ihnen zusätzliche Tests auf pharmakologische Aktivität durch, wie in den Beispielen 2 bis 9 unten gezeigt ist.
  • Materialien und Methoden für den Screeningassay
  • Unter Verwendung der Langendorff-Perfusionsmethode, eines proteolytische Enzyme enthaltenden Perfusats und mechanischen Schabens isolierte man Kalziumtolerante Kardiomyozyten aus Ratten. Man isolierte die Kardiomyozyten und beurteilte ihre Lebensfähigkeit anhand mikroskopischer, morphologischer Kriterien und Trypanblau-Ausschluss.
  • Die zur Untersuchung der Cardialin-Fraktionen verwendete Patch-Clamp-Methode basiert auf den elektrophysiologischen Messungen von Ionenströmen, die durch einzelne Ionenkanäle im Sarkolemma wandern. Man verwendete Mikromanipulation und ein Inversmikroskop zur Implantation von Glaselektroden in und auf die Membran einzelner Kardiomyozyten. Durch Veränderung der Mediumzusammensetzung in der Elektrode maß man die Ionenströme elektrisch sensitiver Kaliumkanäle, einschließlich ATP-sensitiver Typ I- und Typ II-Rektifikationskanäle. Durch Messung der austretenden Ströme bei jeder einzelnen Zelle vor Zugabe der zu testenden Substanz (d.h. Testsubstanz) ermittelte man einen Hintergrundwert. Über diese Methode können Konformationsübergänge von Ionenkanälen vom Zustand „offen" zum Zustand „geschlossen", die sich in Schwankungen der Ströme widerspiegeln, gemessen werden. Man zeichnete Ionenströme auf einem Magnetographen auf und digitalisierte sie dann für die Verarbeitung auf einem IBM PC/AT-Computer unter Verwendung einer PSL-718-Schnittstelle. Unter Verwendung von Originalsoftware führte man eine mathematische Analyse der Daten durch. Als Positivkontrollsubstanz verwendete man den Gesamt-Cardialin-Peptidkomplex. Bei diesem Assay führte der Cardialin-Peptidkomplex innerhalb von einer Millisekunde (ms) bei Konzentrationen von 10–4 bis 10–2 mg/ml Cardialin zu einer Veränderung der Membranströme, und der Übergang hielt in Gegenwart von Cardialin bis zu drei Stunden an.
  • Folgende Ergebnisse wurden mit Cardialin aufgezeichnet. Zuerst verzeichnete man nach 10- bis 15-minütiger Inkubation mit 10–4 mg/ml Cardialin einen steilen Anstieg des Ionenstroms, der darauf hinwies, dass die Kaliumkanäle „offen" waren (d.h. in einem leitenden Zustand), wobei ein Peak erreicht wurde, der zehnfach höher war als die Basiswerte. Zweitens nahm bei höheren Cardialin-Konzentrationen (z.B. 10–2 mg/ml) innerhalb von 60 Minuten Inkubation der Kardiomyozyten mit dem Peptidkomplex die Leitfähigkeit für Kaliumionen zu. Man maß die Aktivierung der Kaliumkanäle in Gegenwart von 10–4 mg/ml Cardialin an der äußeren Oberfläche der Zelle unter Verwendung der folgenden, an die Zelle angehängten Konfiguration: gehaltene Millivolt (mV) = +20; zeitliche Auflösung = 0,424 ms; [K+]0 = 140 millimolar (mM) (d.h. die extrazelluläre Kaliumionenkonzentration betrug 140 mM), und ein Filterübertragungsband, das anfänglich (d.h. in den ersten 15–20 Sekunden) auf niedrigere Frequenzen bei etwa 1000 Hertz (Hz) und anschließend bei etwa 1,5 min auf etwa 300 Hz gelegt wurde. Bei jedem Zeitintervall zeichnete man Strom-Spikes über insgesamt etwa 220 ms auf. 15 bis 20 Sekunden nach der Zugabe von Cardialin betrugen die maximalen, aufgezeichneten Ströme etwa 3 bis etwa 3,5 Picocampere (pA); der ausgelöste durchschnittliche Strom betrug etwa 0,24 pA bei Strom-Spikes, die jeweils eine Dauer von etwa 1 bis etwa 3 ms hatten; und die Gesamtdauer der Ereignisse betrug etwa 17,3 ms (in der Gesamtaufzeichnungszeit von 220 ms). Etwa 1,5 min nach der Zugabe von Cardialin betrugen die aufgezeichneten maximalen Strom-Spikes etwa 8 pA, wobei jeder Spike eine Dauer von etwa 2 bis etwa 4 ms hatte; der ausgelöste durchschnittliche Strom betrug etwa 0,31 pA, und die Dauer der aufgezeichneten Ereignisse betrug etwa 8 ms.
  • Der Radioimmunoassay für die Adenylatcyclase-Aktivität in Kardiomyozyten wurde gemäß fachüblichen Verfahren durchgeführt.
  • BEISPIEL 2
  • Wirkungen von GE und VT auf die Kontraktionsaktivität glatter Muskelproben der Pfortader der Ratte
  • Bei diesem Experiment verglich man die Wirkungen von GE und VT auf die spontane und Kaliumchlorid-induzierte Kontraktionsaktivität einer glatten Muskelprobe (SMS) der Pfortader einer Ratte mit den durch Verapamil, einem Vasodilator mit Kalziumionenkanal blockierender Aktivität, hervorgerufenen Wirkungen. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass sowohl GE als auch VT die spontane Kontraktionsaktivität der Pfortader der Ratte verringern und erschlaffende Wirkungen auf venöse glatte Muskelproben ausüben. Weiterhin beeinflusst keines dieser Dipeptide die Eigenschaften der tonischen Kontraktion, die durch KCl in venösen glatten Muskeln induziert wird.
  • Schritt 1. Verifizierung der Eignung glatter Muskelproben aus der Pfortader der Ratte
  • SMS-Proben der Pfortader der Ratte entnahm man chirurgisch aus zufallsgezüchteten Ratten mit einem Gewicht von 200–250 g. Man bestimmte die Eignung jeder isolierten SMS der Pfortader der Ratte durch Messung der spontanen Kontraktionsantwort und der Kontraktionsantwort der Probe auf Kaliumchlorid (KCl) folgendermaßen. Man legte jede entnommene SMS in ein Organbad mit einer Standard-Krebs-Henseleit (KH)-Lösung bei 35 °C. Dann gab man 0,5 ml physiologische Kochsalzlösung in das Organbad. Bei diesem Verfahren war ein Ende des glatten Muskelstreifens fixiert, während das andere Ende des Muskelstreifens mit einer Sonde verbunden war, welche durch Kontraktion induzierte Signale an einen Analog/Digital-Wandler übertrug. Man zeichnete die spontane Kontraktionskurve für jede SMS durch wiederholte Messungen über einen Zeitraum von einer Minute auf. Anschließend gab man 0,5 ml einer 600 mM KCl-Lösung in physiologischer Kochsalzlösung zu dem SMS-Proben/Organ-Bad, wodurch eine Endkonzentration von 60 mM KCl eingestellt wurde. KCl induziert die Kontraktion von Pfortadergewebe der Ratte bei einer Gewebeendkonzentration von etwa 60 mM.
  • Dann zeichnete man die durch KCl induzierte Kontraktionskurve für jede Probe über den nachfolgenden Zeitraum von fünf Minuten auf. Nach Bestimmung der Werte für spontane und KCl-induzierte Kontraktionskurven einer SMS-Probe und Bestätigung von deren Eignung zur Verwendung in den Experimenten wusch man die SMS-Probe anschließend mit Standard-Krebs-Henseleit-Lösung und stabilisierte sie durch 30-minütige Inkubation bei 35 °C. Während dieses Stabilisierungszeitraums verifizierte man die spontane Kontraktionskurve für jede SMS durch Überwachung der vom Analog/Digital-Wandler erhaltenen Daten.
  • Schritt 2. Bestimmung der durch KCl induzierten Kontraktionsbasislinie
  • Man bestimmte einen Wert der Basislinie für die Kontraktionsantwort einer SMS auf KCl über die im obigen Schritt 1 dargestellte Vorgehensweise. Genauer gesagt legte man jede SMS bei 35 °C in 0,5 ml physiologische Kochsalzlösung in einem Organbad. Man zeichnete die spontane Kontraktionskurve für jede SMS-Probe auf, indem man wiederholte Messungen über einen Zeitraum von einer Minute durchführte. Dann gab man fünf Milliliter einer 600 mM KCl-Lösung in physiologischer Kochsalzlösung zu jeder SMS, bis eine Endkonzentration von 60 mM KCl in dem Bad eingestellt war. Anschließend zeichnete man die durch KCl induzierte Kontraktionskurve für jede Probe über einen Zeitraum von fünf Minuten auf. Man wusch die SMS 30 Minuten bei 35 °C mit Standard-Krebs-Henseleit-Lösung. Die durch KCl induzierte Kontraktionskurve sollte als Kontrollkurve für den Vergleich mit der durch Kalium induzierten Kontraktionsantwort der SMS in Gegenwart einer Testsubstanz oder einer Referenzsubstanz dienen. GE und VT dienten als Testsubstanzen, und Verapamil dient als Referenzsubstanz in diesem Experiment. Das „General Pharmacology Service Program" („Current Test Protocols", PAN Lab, GSP-26) empfiehlt Verapamil als Referenzsubstanz bei diesem bestimmten Modell.
  • Schritt 3. Bestimmung der Basislinie für spontane Kontraktion
  • Man gab jeder SMS in dem gemäß den obigen Schritten 2 und 3 hergestellten Organbad 0,5 ml physiologische Kochsalzlösung zu und zeichnete die spontane Kontraktionskurve eine Minute auf. Jede spontane Kontraktionskurve diente als Basislinienkurve (Kontrollkurve) zum Vergleich mit den jeweiligen spontanen Kontraktionen jeder SMS in Gegenwart einer Testsubstanz oder einer Referenzsubstanz.
  • Schritt 4. Vergleich der Wirkungen von GE, VT und Verapamil auf die spontane und durch Kalium induzierte SMS-Kontraktionsaktivität
  • Man untersuchte die Wirkungen von GE, VT und Verapamil auf die Kontraktionsaktivität der SMS folgendermaßen. Man behandelte jede SMS mit GE, VT bzw. Verapamil durch Zugabe von 0,5 ml einer Lösung der jeweiligen Substanz in physiologischer Kochsalzlösung zu der SMS-Probe/dem Organbad aus Schritt 3, bis eine Endkonzentration von 10–6 g/ml für GE (4,9 × 10–6 M Lösung von GE), 10–6 g/ml für VT (4,58 × 10–6 M Lösung von VT) bzw. 5 × 10–7 g/ml für Verapamil (1 × 10–6 M Lösung von Verapamil) eingestellt war. Man maß die Werte der spontanen Kontraktionskurve für jede SMS durch wiederholte Messungen der spontanen Kontraktionsaktivität jeder Probe 2, 5, 10 und 15 Minuten nach Zugabe der Test- oder Referenzsubstanz zu jeder SMS/jedem Organbad. Anschließend gab man 0,5 ml einer 600 mM KCl-Lösung in physiologischer Kochsalzlösung zu jeder SMS in dem Organbad, bis eine Endkonzentration von 60 mM KCl eingestellt war. Dann maß man fünf Minuten die Kontraktionsaktivität jeder SMS.
  • Schritt 5. Berechnungen
  • Dann beurteilte man die spontane Kontraktionsaktivität jeder SMS-Probe durch Messung der Kontraktionsamplitude und der Fläche unter der Kontraktionsamplitude (AUC) für die Dauer von einer Minute. Die Werte der Parameter nach Zugabe von GE, VT und Verapamil drückte man als Prozentsatz der entsprechenden Basislinienwerte (Kontrollwerte) aus, die in Schritt 3 erstellt worden waren. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.
  • Man bestimmte die tonische (Kalium-induzierte) Kontraktionsaktivität durch Berechnung der Fläche unter der Kontraktionskurve für die Dauer von einer Minute. Die Parameterwerte nach Zugabe von GE, VT und Verapamil drückte man als Prozentsatz der entsprechenden Basislinienwerte (Kontrollwerte) aus, die für die durch Kalium induzierte Kontraktion in Schritt 2 erstellt worden waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Für jede Test- oder Referenzsubstanz wurden Bestimmungen bei 5 isolierten SMS-Proben vorgenommen. Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte mit Standardabweichung dargestellt. Tabelle 1. Die Wirkungen von GE und VT auf die spontane Aktivität glatter Muskelzellen der Pfortader der Ratte
    Figure 00360001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter Student's t-Test) vom Kontrollwert (100 %).
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung.
    Tabelle 2. Die Wirkungen von GE und VT auf die spontane Aktivität glatter Muskelzellen der Pfortader der Ratte
    Figure 00370001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter Student's t-Test) vom Kontrollwert (100 %).
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung
    Tabelle 3. Die Wirkungen von GE und VT auf die durch KCl induzierte tonische Kontraktion der Pfortader der Ratte
    Figure 00370002
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter Student's t-Test) vom Kontrollwert (100 %).
  • Wie in den Tabellen 1 und 2 gezeigt, verringerten sowohl GE als auch VT merklich die Amplitude der Kontraktionskurve und die Fläche unter der Kontraktionskurve für spontane Kontraktionen, die entnommene venöse glatte Muskelproben in Organkultur zeigten. Es ist erwähnenswert, dass die VT-induzierte Wirkung schneller einsetzte als bei Verapamil. Die in den Tabellen 1 und 2 vorgestellten Daten zeigen, dass GE und VT Erschlaffung hervorrufende Wirkungen auf die glatten Muskeln von Gefäßen in Organkultur hatten.
  • Wie in Tabelle 3 gezeigt ist, beeinflussten weiterhin weder GE noch VT die Eigenschaften der tonischen Kontraktion, die in venösen glatten Muskelproben durch KCl induziert wurden, obwohl GE und VT die spontane Kontraktion verringerten. Die Ergebnisse stehen im Gegensatz zu denen, die bei Verapamil beobachtet wurden, welches eine ausgeprägte Wirkung auf die durch KCl induzierte tonische Kontraktion ausübte.
  • Es ist bekannt, dass in Proben glatter Gefäßmuskeln Substanzen mit Kaliumkanalaktivität die spontane Kontraktionsaktivität verringern, nicht dagegen die durch Kalium induzierte Kontraktionsaktivität. Nidel et al., Br. J. Pharm. 95: 741–52 (1988). Die Ergebnisse dieses Experiments deuten darauf hin, dass GE und VT Kaliumkanalaktivität aufweisen, da sie beide die spontane Kontraktionsaktivität, nicht aber die durch Kalium induzierte tonische Kontraktionsaktivität verringern.
  • BEISPIEL 3
  • Wirkungen von GE und VT auf die Kalzium-induzierte Kontraktionsaktivität von Proben intestinaler glatter Muskeln
  • Bei diesem Experiment wurden die Wirkungen von GE und VT auf die Kalzium-induzierte Kontraktionsaktivität von Proben intestinaler glatter Muskeln untersucht. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass GE und VT die Amplitude der Kalzium-induzierten tonischen Kontraktion glatter Muskeln verringern und die Erschlaffung glatter Muskeln induzieren.
  • GE und VT dienten in diesem Experiment als Testsubstanzen. GE wurde bei Konzentrationen von 10–6 g/ml und 10–5 g/ml (4,9 × 10–6 M bzw. 4,9 × 10–5 M) getestet, und VT wurde bei Konzentrationen von 10–6 g/ml und 10–5 g/ml (4,58 × 10–6 bzw. 4,58 × 10–5 M) getestet. Die Kalziumionenkanalblocker Verapamil, cholinolytisches Atropin und Diltiazem dienten als Referenzsubstanzen und wurden bei den folgenden Konzentrationen getestet: 10–8 g/ml und 10–7 g/ml Verapamil (2,04 × 10–8 M bzw. 2,04 × 10–7 M); 10–6 g/ml und 10–7 g/ml cholinolytisches Atropin (1,48 × 10–7 M bzw. 1,48 × 10–6 M); und 10–9 g/ml und 10–8 g/ml Diltiazem (2,2 × 10–9 M bzw. 2,2 × 10–8 M).
  • Schritt 1. Probenherstellung
  • SMS-Proben aus dem Dünndarm von 10 Meerschweinchen wurden chirurgisch entnommen und wie folgt zubereitet. Zuerst inkubierte man die SMS-Proben 40 Minuten in einem Organbad, das eine physiologische Standard-Krebs-Henseleit-Salzlösung enthielt, die Kalziumchlorid (CaCl2) mit einer Konzentration von 2,5 mM enthielt. Dann wusch man jede SMS mit Kalzium-freier Krebs-Henseleit-Lösung und inkubierte 40 Minuten in einer Kalzium-freien Krebs-Henseleit-Lösung. Bei jeder SMS wurde die Kontraktionsaktivität vorinduziert, indem man das die Probe enthaltende Organbad zuerst 15 Minuten mit einer 30 mM KCl enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung perfundierte und dann das Bad weitere 15 Minuten mit einer 20 mM CaCl2 enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung perfundierte. Schließlich wusch man jede SMS-Probe 40 Minuten mit Kalzium-freier Krebs-Henseleit-Lösung. Bei diesen Experimenten dienten Messungen der Kontraktionsantwort der SMS nach Zugabe einer 20 mM Kalzium enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung als Kontrolle (Basislinie). Änderungen der Kontraktionsamplituden wurden über das in Schritt 1 von Beispiel 2 oben dargelegte Verfahren aufgezeichnet.
  • Schritt 2. Anwendung I
  • Nach Waschen der SMS wie in Schritt 1 dargelegt, perfundierte man das Organbad mit der SMS-Probe 15 Minuten mit der Lösung einer Test- oder Referenzsubstanz. In diesem Fall dienten GE und VT als die Testsubstanzen, wobei jedes Dipeptid bei einer Konzentration von 10–6 g/ml getestet wurde. Die folgenden Referenzsubstanzen wurden verwendet: 10–8 g/ml Verapamil, 10–7 g/ml cholinolytisches Atropin und 10–9 g/ml Diltiazem.
  • Nach Perfusion mit der Test- oder Referenzsubstanz perfundierte man die/das SMS-Probe/Organbad 10 Minuten mit einer 30 mM KCl enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung und dann weitere 10 Minuten mit einer 20 mM CaCl2 enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung. Anschließend wusch man jede SMS-Probe 40 Minuten mit Kalzium-freier Krebs-Henseleit-Lösung. Man beurteilte die Wirkung der Test- oder Referenzsubstanz auf die SMS-Probe durch Messen der Kontraktionsantwort (d.h. die Änderung der Kontraktionsamplitude) der Probe nach Zugabe der 20 mM CaCl2 enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung.
  • Schritt 3. Anwendung II
  • Man brachte jede SMS aus Schritt 2 ein zweites Mal mit der gleichen Test- oder Referenzsubstanz in Kontakt, indem man die folgenden Konzentrationen jeder jeweiligen Referenz- oder Testsubstanz dem Perfusat des Organbads zugab: 10–7 g/ml Verapamil; 10–6 g/ml cholinolytisches Atropin; 10–8 g/ml Diltiazem und entweder 10–5 g/ml GE oder 10–5 g/ml VT.
  • Anschließend perfundierte man das Organbad 10 Minuten mit einer 30 mM KCl enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung und dann weitere 10 Minuten mit einer 20 mM CaCl2 enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung. Man beurteilte die Wirkung der jeweiligen Test- oder Referenzsubstanz ein zweites Mal durch Messen der Änderung der Kontraktionsamplitude der SMS nach Zugabe der 20 mM CaCl2 enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung. Die Effizienz der Herzarbeit beurteilte man durch Bestimmung der Fläche unter der Kontraktionskurve einer isolierten glatten Muskelprobe.
  • Wie die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, verringerten sowohl GE als auch VT die Amplitude der Kalzium-induzierten tonischen Kontraktion intestinaler glatter Muskeln signifikant. Bemerkenswerterweise war die Wirkung von VT größer als die der gewöhnlichen Kalziumionenkanal-Blocker Verapamil und Diltiazem.
    Figure 00400001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) vom Kontrollwert (100 %).
    • 2% der Kontrolle, wobei Kontrollwerte wie in Schritt 1 von Beispiel 3 beschrieben nach Zugabe einer 20 mM Kalzium enthaltenden Krebs-Henseleit-Lösung erfasst wurden.
    • Abkürzungen: KH = Krebs-Henseleit
  • BEISPIEL 4.1
  • Wirkungen von GE und VT auf die inotrope Funktion eines normalen Rattenherzens
  • Dieses Experiment wurde konzipiert, um die jeweiligen Wirkungen von GE und VT auf die inotrope Funktion eines isolierten Rattenherzens zu beurteilen. Man maß die inotrope Funktion des Herzens durch Messung verschiedener Parameter, einschließlich des systolischen Drucks im linken Ventrikel (Psyst. mm Hg); des diastolischen Drucks im linken Ventrikel (Pdiast. mm Hg); (iii) des sich aufbauenden Drucks (Pev. = Psyst.– Pdiast. mm Hg); (iv) der maximalen Steigerungsrate des linken Ventrikeldrucks (+dp/dtmax mm Hg/sec); und (v) der maximalen Abnahmerate des linken Ventrikeldrucks (–dp/dtmax mm Hg/sec). Zusätzlich bestimmte man die Herzfrequenz (HR) jedes Herzens aus den Aufzeichnungen der Druckschwankungen des linken Ventrikeldrucks. Dieses Experiment zeigt, dass weder GE noch VT eine signifikante Wirkung auf die inotrope Funktion oder auf die Herzfrequenz eines normalen Herzens ausübt.
  • Man gewann Rattenherzproben chirurgisch von weißen, zufallsgezüchteten, männlichen Ratten mit einem Gewicht von etwa 250 g. Man hielt die Herzen unter Verwendung retrograder Herzperfusion nach der Langendorff-Methode in Kultur, wobei eine übliche oxigenierte (95 % O2 und 5 % CO2) Krebs-Henseleit-Lösung durch eine gläserne Aortenkanüle geleitet wurde. Der Retroperfusionsdruck bewirkt ein Schließen der Aortenklappen. Auf diese Weise trat die oxigenierte Lösung nur durch das koronare Gefäßsystem des Herzens, so dass beide Ventrikel praktisch leer blieben.
  • Perfusionsbedingungen: eine durchschnittliche, konstante Perfusionsgeschwindigkeit von 15 bis 25 ml/min wurde bei einem konstanten Perfusatdruck von 80 cm H2O (0,0774 Atm) aufrechterhalten.
  • Druckmessungen: Ein mit einer Druck übertragenden Vorrichtung (EMT-746 Siemens-Elema, Schweden) verbundener Latexballon-Katheder wurde in den linken Ventrikel des Herzens eingeführt, um Parameter der inotropen Funktion des Herzens zu messen. Die Kurve der intraventrikulären Druckschwankung des linken Ventrikels wurde mit einem Polygraph aufgezeichnet.
  • Experimentelles Protokoll: GE und VT dienten als Testsubstanzen. Nach einer 30-minütigen Anpassung des Herzens an die Bedingungen der Organkulturperfusion nahm man eine Reihe von Basalmessungen (Kontrollmessungen) vor, wie in (i) bis (v) unten beschrieben wird. Nach diesen Messungen führte man GE oder VT mit einer Dosis von 10, 100 oder 1000 μg pro 0,1 ml Krebs-Henseleit-Lösung in den Perfusatfluss ein. Das sympathomimetische Amin Isoproterenol (Novodrin, Germed, Deutschland) diente als Referenzsubstanz und wurde mit einer Dosierung von 0,01 mg verabreicht. Isoproterenol erniedrigt bekanntermaßen den peripheren Gefäßwiderstand und erhöht den Herzausstoß aufgrund seiner positiv inotropen (d.h. die Effizienz der von einem ischämischen Herzen verrichteten Kontraktionsarbeit steigernden) und chronotropen Wirkungen bei intravenöser Infusion in ein Individuum. Siehe GOODMAN UND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 160 (Goodman et al., Hrsg., 7. Aufl., 1985). Jede Dosis jeder jeweiligen Test- oder Referenzsubstanz testete man bei vier verschiedenen Rattenherzen. Man beurteilte die inotropen Funktionen jedes der vier Rattenherzen durch Messen: (i) des systolischen Drucks im linken Ventrikel (Psyst. mm Hg); (ii) des diastolischen Drucks im linken Ventrikel (Pdiast. mm Hg); (iii) des sich aufbauenden Drucks (Pev. = Psyst. – Pdiast. mm Hg); (iv) der maximalen Steigerungsrate des linken Ventrikeldrucks (+dp/dtmax mm Hg/sec); und (v) der maximalen Abnahmerate des linken Ventrikeldrucks (–dp/dtmax mm Hg/sec). Zusätzlich bestimmte man aus den Aufzeichnungen der Druckschwankungen des linken Ventrikeldrucks die Herzfrequenz (HR) jedes Herzens.
  • Wie die in den Tabellen 5A und 5B dargestellten Ergebnisse zeigen, hatte weder GE noch VT eine signifikante Wirkung auf die inotrope Funktion oder die Herzfrequenz des Herzens. Jedes Dipeptid hatte vielmehr eine geringe oder minimale Wirkung auf diese Parameter. Tabelle 5A. Die Wirkung von GE auf die Arbeit des entnommenen, unter Verwendung der Langendorff-Perfusionsmethode perfundierten Rattenherzens (Mittelwert der Messungen)
    Figure 00420001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) vom Basalwert (Kontrollwert).
    • Abkürzungen: mg = Mikrogramm; Subst. = Substanz; abs = absoluter Wert; HR = Herzfrequenz; hb/min = Herzschläge/Minute; Psyst. = systolischer Druck im linken Ventrikel; Pdiast. = diastolischer Druck im linken Ventrikel; Pev = sich aufbauender Druck; +dp/dtmax = maximale Steigerungsrate des linken Ventrikeldrucks; –dp/dtmax = maximale Abnahmerate des linken Ventrikeldrucks.
    Tabelle 5B. Die Wirkung von VT auf die Arbeit des entnommenen, unter Verwendung der Langendorff-Perfusionsmethode perfundierten, Rattenherzens (Mittelwert der Messungen)
    Figure 00430001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) vom Basalwert (Kontrollwert).
    • Abkürzungen: mg = Mikrogramm; Subst. = Substanz; abs = absoluter Wert; HR = Herzfrequenz; hb/min = Herzschläge/Minute; Psyst. = systolischer Druck im linken Ventrikel; Pdiast. = diastolischer Druck im linken Ventrikel; Pev = sich aufbauender Druck; +dp/dtmax = maximale Steigerungsrate des linken Ventrikeldrucks; –dp/dtmax = maximale Abnahmerate des linken Ventrikeldrucks.
  • BEISPIEL 4.2
  • Wirkungen von GE und VT auf die inotrope Funktion des ischämischen Myokards
  • Bei diesem Experiment beurteilte man die Wirkungen von GE und VT auf die inotrope Funktion des ischämischen Myokardgewebes durch Messen verschiedener Parameter der inotropen Herzfunktion. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass jedes dieser Dipeptide die inotrope Funktion von Myokardgewebe, bei dem Ischämie induziert worden war, wiederherstellt und die Wirkungen von ischämischem Schaden in Myokardgewebe verringert.
  • Man entnahm Rattenherzen chirurgisch aus weißen, zufallsgezüchteten Ratten mit einem Gewicht von etwa 250 g. Man perfundierte die entnommenen Herzen auf retrograde Weise (d.h. nach Langendorff und unter Verwendung eines konstanten Perfusatdrucks von 80 cm [0,0774 Atm] Wasser) mit einer üblichen oxigenierten (95 % O2 und 5 % CO2) Krebs-Henseleit-Lösung. Die Herzen hielten eine gleichmäßige, spontane Kontraktionsfrequenz ein. Man führte einen mit einer Druck übertragenden Vorrichtung (EMT-746 Siemens-Elema, Schweden) verbundenen Latexballon-Katheder in den linken Ventrikel jedes Herzens ein, um die inotrope Funktion des Herzens zu messen (wie in Beispiel 3 oben beschrieben). Man zeichnete die Kurve der Druckschwankung des linken Ventrikels mit einem Polygraph auf.
  • Experimentelles Protokoll:
  • Die Stufe I („Adaptationsprotokoll") bestand aus einer 30-minütigen Anpassung der jeweiligen Rattenherzen an das Perfusionprotokoll. Man zeichnete die Basislinienparameter der inotropen Funktion jedes Herzens auf, um die prä-ischämischen Werte für die folgenden gemessenen Parameter zu ermitteln: (i) den systolischen Druck im linken Ventrikel (Psyst. mm Hg); (ii) den diastolischen Druck im linken Ventrikel (Pdiast. mm Hg); (iii) den sich aufbauenden Druck (Pev. = Psyst. – Pdiast. mm Hg); (iv) die maximale Steigerungsrate des linken Ventrikeldrucks (+dp/dtmax mm Hg/sec); und (v) die maximale Abnahmerate des linken Ventrikeldrucks (–dp/dtmax mm Hg/sec). Zusätzlich bestimmte man aus den für die Variationen des linken Ventrikeldrucks über die Zeit gemachten Aufzeichnungen die Herzfrequenz (HR) jedes Herzens. In Stufe II („ischämische Simulation") induzierte man Ischämie durch Unterbrechung der Versorgung des Herzens mit der Perfusionslösung. Etwa 30 Minuten später initiierte man Stadium III („Reperfusionsprotokoll"), indem man die Reperfusion wieder aufnahm und in die Perfusatlösung eine Test- oder Kontrollsubstanz bei einer der folgenden, jeweiligen Konzentrationen einbezog: eine Perfusatlösung einer Testsubstanz umfasste 0,06, 0,6 oder 6,0 mg/l GE bzw. 0,06, 0,6 oder 6,0 mg/l VT; eine Perfusatlösung der Positivkontrollsubstanz umfasste 14 mg/l Inosin. Inosin ist eine Nukleosidzubereitung, die eine günstige inotrope Wirkung sowohl auf normales als auch auf ischämisches Myokard ausübt, wogegen sie keine Rhythmusstörungen oder Beschleunigung der Entwicklung ischämischer Kontraktur induziert. Woollard et al., Cardiovasc. Res. 15: 659–67 (1981). Inosin wurde von der Sigma Chemical Company, USA, bezogen (Cat.-Code I-4125; Chargennummer 81H0227). Die Negativkontrollsubstanz umfasste eine Reperfusion unter Verwendung einer üblichen oxigenierten Krebs-Henseleit-Lösung.
  • Man beurteilte die inotrope Funktion des Myokards für jedes Herz durch Messen der oben besprochenen Parameter (i) bis (v) und der Herzfrequenz. Diese sechs Parameter zeichnete man während der Untersuchung kontinuierlich auf (d.h. beginnend mit Stufe I und fortgesetzt bis zur Stufe III). Die Aufzeichnungen wurden zu den folgenden Zeitpunkten analysiert: (a) unmittelbar vor Beginn der Stufe II (d.h. nach der 30-minütigen Anpassungsperiode gemäß Stufe I, aber vor Unterbrechung der Perfusion); und (b) nach 1-, 5-, 10-, 20- und 30-minütiger Reperfusion in der Stufe III.
  • Die Frequenz und Dauer der Rhythmusstörungen in der 30-minütigen Reperfusionsperiode in Stufe III bestimmte man durch Messen der folgenden Parameter: (i) der Anzahl der ventrikulären Extrasystolen; (ii) der Gesamtdauer der ventrikulären Tachykardien (in Sekunden); und (iii) der Gesamtdauer der ventrikulären Fibrillation (in Sekunden). Man testete jede Dosis der Testsubstanz an neun isolierten Herzen.
  • Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in den Tabellen 6 bis 12 nachfolgend gezeigt. Wie in Tabelle 6 gezeigt, führt die Induktion von Ischämie bei diesem Herzmodell zu einer etwa 50%igen Verringerung des systolischen Drucks eine Minute nach Initiierung der Reperfusion in Stufe III (Negativkontrolle). Obwohl eine gewisse Erholung des systolischen Drucks bei der Negativkontrolle zu den Zeitpunkten 5 und 10 Minuten beobachtet wurde (d.h. Erholung auf etwa 78% des prä-ischämischen systolischen Drucks), verschlechterte sich der Druck danach. Eine Reperfusion mit GE oder VT in den Konzentrationen 0,06 bzw. 0,6 mg/l verhinderte den bei der Negativkontrolle beobachteten dramatischen Abfall des systolischen Drucks. In diesem Modell waren die Wirkungen von GE und VT deutlicher und stellten sich schneller ein als die Wirkungen von Inosin, welches eine allmähliche Verbesserung des systolischen Drucks während der 30-minütigen Beobachtungsdauer bewirkte. Tabelle 6. Die Wirkungen von GE und VT auf den systolischen Druck in einem ischämischen linken Ventrikel während der Reperfusion (% der prä-ischämischen Parameterwerte)
    Figure 00450001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den entsprechenden Werten der Negativkontrollgruppe.
  • Die Messungen der maximalen Steigerungsraten des Drucks der ischämischen linken Ventrikel (+dp/dtmax) von Rattenherzen sind in Tabelle 7 zusammengefasst. Die Induktion von Ischämie bei diesem Herzmodell führte zu einer etwa 46%igen Verringerung im +dp/dtmax-Wert der Negativkontrolle eine Minute nach Initiierung der Reperfusion.
  • Während man eine Erholung des +dp/dtmax bei der Negativkontrolle auf etwa 82 % von dessen prä-ischämischen Wert nach fünf Minuten beobachtete, verschlechterte sich der +dp/dtmax anschließend. Man fand, dass GE und VT den +dp/dtmax-Wert während der ersten Minute der Reperfusion erhöhten. Bemerkenswerterweise fand man, dass Konzentrationen von 0,6 mg/l GE bzw. VT den +dp/dtmax eines isolierten Herzens nach 30-minütiger Reperfusion beinahe auf dessen prä-ischämischen Niveau wiederherstellten. Tabelle 7. Die Wirkungen von GE und VT auf die maximale Steigerungsrate des linken Ventrikeldrucks während der Reperfusion (% des prä-ischämischen Parameterdurchschnittswerts)
    Figure 00460001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den entsprechenden Werten der Negativkontrollgruppe.
  • Die Wirkungen verschiedener Konzentrationen von GE und VT auf den diastolischen Druck in diesem Rattenherzmodell sind in Tabelle 8 dargestellt. Nach Induktion von Ischämie in diesem Modell steigerte sich in der Negativkontrolle der diastolische Druck im linken Ventrikel um mehr als das Zweifache. Sowohl GE als auch VT verhinderten den Anstieg des diastolischen Drucks und erwiesen sich in diesem Modell als wenigstens ebenso wirksam wie Inosin. Tabelle 8. Die Wirkungen von GE und VT auf den diastolischen Druck in einem ischämischen linken Ventrikel während der Reperfusion (% des prä-ischämischen Parameterdurchschnittswerts)
    Figure 00470001
  • Die Messungen der maximalen Abnahmerate des linken Ventrikeldrucks (–dp/dtmax) in ischämischen linken Ventrikeln von Rattenherzen sind in Tabelle 9 zusammengefasst. Diese Ergebnisse zeigen für die Negativkontrolle eine etwa 50%ige Verringerung des –dp/dtmax-Wertes eines ischämischen linken Ventrikels eine Minute nach Initiation der Stufe III-Reperfusion (die Negativkontrolle). Obwohl sich der Parameter –dp/dtmax für die Negativkontrolle nach etwa 10 Minuten auf etwa 88 % von dessen prä-ischämischem Wert erholte, nahm –dp/dtmax danach ab. Bei diesem Modell beobachtete man, dass GE und VT jeweils den –dp/dtmax-Wert im ischämischen linken Ventrikel innerhalb der ersten Minute der Reperfusion signifikant erhöhten; beispielsweise erhöhte sich der Parameterdurchschnittswert mit 0,06 mg/l GE, 0,06 mg/l VT bzw. 0,6 mg/l VT auf etwa 80 bis 100 % von dessen prä-ischämischen Wert. Zu späteren Zeitpunkten war –dp/dtmax für ein mit 0,6 mg/l GE, 6,0 mg/l GE bzw. 0,6 mg/l VT behandeltes Herz normalerweise höher als bei der Negativkontrolle, und betrug in der 30. Minute der Reperfusion mehr als 90 % von dessen prä-ischämischen Wert. Die Reperfusion mit Inosin (der Positivkontrollsubstanz) führte in einer solchen Weise zu einem langsamen, gleichmäßigen Anstieg des –dp/dtmax in einem Herzen, dass nach etwa 10 bis 20 Minuten etwa 80 % des prä-ischämischen Werts für den Parameter erreicht wurden. Tabelle 9. Die Wirkungen von GE und VT auf die maximale Rate der Druckabnahme des linken Ventrikels während der Reperfusion (% des prä-ischämischen Parameterdurchschnittswerts)
    Figure 00480001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den entsprechenden Werten der Negativkontrollgruppe.
  • Der sich aufbauende Druck des Herzens ist ein wichtiger Parameter, der die inotrope Pumpfunktion des Herzens wiederspiegelt. Die in Tabelle 10 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass nach Induktion von Ischämie im linken Ventrikel eines Rattenherzens der sich aufbauende Druck innerhalb von einer Minute auf etwa 29% von dessen prä-ischämischen Wert abnahm und während der anschließenden 30-minütigen Beobachtungsdauer niemals etwa 55 % von dessen prä-ischämischem Wert überschritt. Reperfusion mit GE und VT steigerte die gemessenen Werte des sich aufbauenden Drucks auf etwa 70 bis 100 % der jeweiligen prä-ischämischen Werte. Man fand, dass Reperfusion mit entweder 0,6 mg/l GE oder 0,6 mg/l VT den Wert des sich aufbauenden Drucks eines ischämischen linken Ventrikels nach etwa 20 bzw. etwa 30 Minuten der Reperfusion auf etwa 85 % oder mehr von dessen jeweiligem prä-ischämischen Wert wiederherstellte. Tabelle 10. Die Wirkungen von GE und VT auf die Abnahme des sich aufbauenden Drucks in einem ischämischen linken Ventrikel während der Reperfusion (% des prä-ischämischen Parameterdurchschnittswerts)
    Figure 00490001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den entsprechenden Werten der Negativkontrollgruppe.
  • Die Wirkungen von GE und VT auf die Herzfrequenz in diesem Rattenmodell sind in Tabelle 11 dargestellt. Bei Konzentrationen von 0,06 und 6,0 mg/l führten GE und VT jeweils zu einer erwünschten, mäßig negativ chronotropen Wirkung auf die Herzfrequenz (d.h. einer Verringerung der Herzfrequenz). Tabelle 11. Die Wirkungen von GE und VT auf die Herzfrequenz bei Reperfusion (% des prä-ischämischen Parameterdurchschnittswerts)
    Figure 00490002
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den entsprechenden Werten der Negativkontrollgruppe.
  • Tabelle 12 zeigt die Wirkungen von GE und VT auf die Frequenz und Dauer ventrikulärer Rhythmusstörungen während der Reperfusion. Weder GE noch VT hatten bei dem in dieser Untersuchung verwendeten Rattenherzmodell eine Rhythmus störende Wirkung. Tabelle 12. Die Wirkungen von GE und VT auf die Frequenz und Dauer ventrikulärer Rhythmusstörungen während der Reperfusion
    Figure 00500001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den entsprechenden Werten der Negativkontrollgruppe.
  • Zusammenfassend erwies sich, dass GE und VT die inotrope Funktion des Herzens während der Ischämie optimieren, wie durch Verbesserungen der gemessenen Werte des systolischen Drucks, des sich aufbauenden Drucks und der maximalen Steigerungsrate des linken Ventrikeldrucks (+dp/dtmax) in den getesteten Rattenherzen gezeigt wurde. GE und VT verhinderten weiterhin die Entwicklung ischämischer Kontrakturen und riefen beim ischämischen Myokard keine Rhythmus störende Wirkung hervor. Diese beobachteten Wirkungen stimmen mit denen überein, die durch pharmazeutische Verbindungen mit Kaliumkanal öffnender Aktivität induziert werden.
  • BEISPIEL 5
  • Wirkungen von GE und VT auf ischämische Läsionen des Myokards bei Tieren
  • Eine Ligation der Koronararterie führt zu akuter myokardialer Ischämie mit irreversiblen Läsionen der Kardiomyozytenmembranen und zur Freisetzung intrazellulärer, myokardialer Enzyme, einschließlich Creatinphosphokinase (CPK), in das Blut. Der Grad der enzymatischen Aktivität von CPK im Plasma während der ersten Stunden der Ischämie wurde in Korrelation gebracht mit dem Ausmaß der myokardialen ischämischen Läsion. Siehe z.B. G. Forster et al., Method of Enzymatic Analysis (U. Bergmeyer und W. Weynhame, Hrsg., Verlag Chemie GMBH). Bei diesem Experiment maß man die CPK-Aktivität, um das Ausmaß des durch Occlusion der Koronararterie über Ligation entstehenden myokardialen ischämischen Schadens zu überwachen. Genauer gesagt, maß man die CPK-Aktivität eine Stunde nach Occlusion der Koronararterie bei Ratten, die unbehandelt blieben oder, alternativ, mit einer intervenösen Injektion einer Test- oder Kontrollsubstanz behandelt wurden. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass sowohl GE als auch VT das Ausmaß der myokardialen ischämischen Läsionen verringern und Herz schützende Wirkung zeigen.
  • Man betäubte weiße, zufallsgezüchtete männliche Ratten mit einem Gewicht von ungefähr 200 g durch Verabreichung von Äther leicht und immobilisierte sie dann und beatmete sie künstlich. Man ligierte den absteigenden Ast der linken Koronararterie über die von Selye et al., Angiology 11: 398–407 (1960) veröffentlichte Technik. Unmittelbar nach der Ligation verabreichte man der Ratte über eine katheterisierte Femoralvene eine Testsubstanz, eine Positivkontrollsubstanz oder eine Negativkontrollsubstanz (nachfolgend beschrieben). Jede Dosis jeder Testsubstanz oder jeder Positiv- oder Negativkontrollsubstanz wurde einer experimentellen Gruppe oder einer Kontrollgruppe von 9 Testratten verabreicht. Bei dieser Untersuchung dienten GE und VT als Testsubstanzen, Propanolol diente als Positivkontrollsubstanz und physiologische Kochsalzlösung als Negativkontrollsubstanz. Jeder Testratte in einer experimentellen Gruppe verabreichte man eine Dosis von etwa 0,1, 1,0 oder 10,0 Milligramm GE pro Kilogramm Körpergewicht des jeweiligen Tieres (mg/kg) oder 0,1, 1,0 oder 10,0 Milligramm VT pro Kilogramm Körpergewicht des Tieres. Jedes Tier der Positivkontrollgruppe erhielt eine intravenöse Dosis von 0,5 mg pro Kilogramm Körpergewicht β-adrenergen, blockierenden Agens, Propanolol (Obzidan, Germed, Deutschland). Propanolol wird üblicherweise verwendet, um Herzrhythmusstörungen zu kontrollieren, und es liegen gewisse Hinweise darauf vor, dass das Mittel das Ausmaß des ischämischen Schadens am Herzen verringern kann. Siehe GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, supra, auf Seite 192. Jedes Tier der Negativkontrollgruppe erhielt physiologische Kochsalzlösung.
  • Eine Stunde nach Initiierung der Occlusion der Koronararterie tötete man jedes Testtier, sammelte dessen Blut und maß die CPK-Aktivität in dessen Blutserum. Man bestimmte die CPK-Aktivität über ein übliches biochemisches Verfahren, beispielsweise das von der Lachema Company (Tschechei) in dessen Testkit kommerziell erhältliche, und durch Befolgung der Anweisungen des Herstellers zur Vorgehensweise, welche in der Beilage enthalten waren.
  • Als zusätzliche Kontrolle für das mögliche Trauma, das durch den chirurgischen Eingriff verursacht wurde, bezog man eine Gruppe von 9 scheinoperierten Ratten in die Untersuchung ein. Bei diesen Testtieren nahm man eine Brustdissektion vor, aber keine Occlusion der Koronararterie. Diese „scheinoperierten" Tiere wurden nicht mit irgendeiner der Test- oder Kontrollsubstanzen behandelt und wurden eine Stunde nach der Operation eingeschläfert. Dann sammelte man ihr Blut zur Bestimmung der CPK-Aktivität.
  • Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 13 dargestellt. Wie durch signifikante Verringerung der CPK-Aktivität im Blutserum im Vergleich zur Negativkontrolle gemessen (d.h. die Freisetzung des intrazellulären myokardialen Enzyms in das Serum wurde gemessen, um das Ausmaß des nach der Ligation der Koronararterie eintretenden Schadens zu überwachen), erwies es sich, dass GE-Dosen von 0,1, 1,0 und 10,0 Milligramm jeweils das Ausmaß der induzierten myokardialen ischämischen Läsionen in den Testratten verringerten. VT lieferte ähnliche Ergebnisse bei Dosen von 0,1 bzw. 1,0 mg/kg. Tiere mit induzierten myokardialen ischämischen Läsionen, die mit GE oder VT behandelt wurden, wiesen CPK-Aktivitäten im Serum auf, die sich nicht signifikant von denen in der Gruppe der scheinoperierten Tiere unterschieden.
  • Die biologischen Aktivitäten von GE und VT, die in diesem Modell beobachtet wurden, sind vergleichbar mit jenen Aktivitäten, die zuvor für Aktivatoren des nach außen gerichteten Kaliumflusses offenbart wurden, welche in parallelen Tiermodellen getestet wurden. Es wurde gezeigt, dass pharmazeutische Verbindungen mit Kaliumkanal öffnenden Aktivitäten Herz schützende Wirkungen auf das ischämische Myokard ausüben, das „Lecken" von Enzym verringern und den Verbrauch makroerger Phosphate optimieren. Wie in diesem Experiment gezeigt, rufen GE und VT offenbar Wirkungen hervor, die mit denen bekannter Verbindungen mit Kaliumkanal öffnenden Aktivitäten identisch sind oder ihnen wenigstens ähneln. Tabelle 13: Die Wirkungen von GE und VT auf die CPK-Aktivität im Blutserum eine Stunde nach Koronarocclusion
    Figure 00520001
    • Signitikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den für die folgenden Gruppen verzeichneten Werten: &scheinoperierte Tiere, *Negativkontrolle, #Positivkontrolle.
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung.
  • BEISPIEL 6
  • Gegen Rhythmusstörung gerichtete Wirkungen von GE und VT in einem Modell Chloroform-induzierter Rhythmusstörung
  • Die Inhalation von Chloroform induziert ventrikuläre Rhythmusstörung und wird allgemein als Screening-Test für die Induktion von Rhythmusstörung in Tiermodellen und für die Identifizierung von Substanzen und Verbindungen mit Rhythmusstörung entgegenwirkender Aktivität verwendet. Beim Mäusen führt eine tiefe Betäubung mit Chloroform zu ventrikulärer Tachykardie und/oder ventrikulärer Fibrillation. Obwohl der Mechanismus dieser Rhythmus störenden Wirkungen noch nicht genau aufgeklärt wurde, liegen einige Beweise dafür vor, dass die myokardialen Zellen von Mäusen, welche mit Chloroform betäubt wurden, eine kürzere Refraktionsdauer aufweisen und eine Desynchronisierung der Wiederherstellung ihrer Erregbarkeit zeigen. Vermutlich tragen diese Bedingungen zum Auftreten des wiederkehrenden Typs von Rhythmusstörungen bei. Darüber hinaus erhöht Chloroform die Sensitivität des Myokards gegenüber endogenen Catecholaminen, wodurch deren Rhythmus störende Wirkungen verstärkt werden. Winslow, Pharmac. Ther. 24: 401–433 (1984).
  • Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, dass GE und VT Rhythmusstörungen entgegenwirkende Aktivitäten und Herz schützende Wirkungen in Tiermodellen zeigen, bei denen ventrikuläre Rhythmusstörungen induziert wurden. Diese Untersuchung wurde auf der Grundlage der Empfehlungen des „General Pharmacology Service Program" („Current Test Protocols PAN Laboratory") durchgeführt.
  • Man behandelte in dieser Untersuchung jede Maus 15 Minuten vor Verabreichung einer tiefen Chloroformnarkose mit einer intraperitonealen Injektion einer Dosis einer Test- oder Kontrollsubstanz. Dann verabreichte man jeder Maus eine Test- oder Kontrollsubstanz. GE und VT dienten als Testsubstanzen, und jedes Peptid wurde bei Dosen von 0,001, 0,01, 0,1, 1,0 und 10,0 mg/kg untersucht. Novocainamid, ein bekanntes Mittel gegen Rhythmusstörungen, diente als Positivkontrollsubstanz und wurde den Mäusen in der Positivkontrollgruppe in einer Dosis von 240 mg/kg verabreicht. Physiologische Kochsalzlösung diente als Negativkontrollsubstanz und wurde den Mäusen in der Negativkontrollgruppe verabreicht.
  • Man verabreichte jeder Maus eine Chloroformbetäubung, indem man die Maus in einen luftdichten Glasbehälter mit in 20 ml absolutem Chloroform getränkter Watte setzte. Zum Zeitpunkt des Atemstillstands entfernte man die Maus aus dem Behälter, begann eine Elektrokardiogramm-Überwachung (ECG) (Standardableitung II) und setzte diese 30 Sekunden lang fort. Nach den Kriterien des „General Pharmacology Service Program" hat eine Substanz eine schützende, Rhythmusstörungen entgegenwirkende Wirkung, wenn nach Verabreichung der Substanz an ein Testtier, das Testtier kein Zeichen ventrikulärer, paroxysmaler Rhythmusstörung (z.B. ventrikulärer Tachykardie oder ventrikulärer Fibrillation) während des 30-Sekundenintervalls des durch Chloroform induzierten Atemstillstands zeigt, und wenn die Herzfrequenz des Testtiers während des Zeitraums von 30 Sekunden unter 100 Schlägen in 30 Sekunden bleibt. Eine Rhythmusstörungen entgegenwirkende Aktivität für eine bestimmte Dosis einer Testsubstanz ist pharmazeutisch annehmbar, wenn 30 % der Tiere in einer Testgruppe die letztgenannten Ergebnisse zeigen (d.h. nämlich kein Zeichen ventrikulärer, paroxysmaler Rhythmusstörungen und eine Herzfrequenz unter 100 Schlägen pro 30 Sekunden innerhalb von 30 Sekunden nach dem Atemstillstand).
  • Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 14 dargestellt. Man fand, dass die Vorbehandlung von Mäusen mit GE oder VT mit einer Dosis von 0,01, 0,1, 1,0 oder 10,0 mg/kg die Entwicklung ventrikulärer Rhythmusstörung verhinderte, welche durch Inhalation toxischer Dosen von Chloroform oder durch Koronarocclusion induziert wurden. Die schützenden, gegen Rhythmusstörung gerichteten Wirkungen, die sowohl GE als auch VT aufwiesen, unterschieden sich nicht signifikant von den schützenden, gegen Rhythmusstörung gerichteten Wirkungen, die durch Novocainamid bei einer Dosis von 240,0 mg/kg hervorgerufen wurden. Tabelle 14. Die gegen Rhythmusstörung gerichteten Wirkungen von GE und VT in einem Tiermodell Chloroform-induzierter Rhythmusstörungen
    Figure 00540001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, Chi-Quadrat-Test) von den Werten der Negativkontrollgruppe.
    • #Signifikant verschieden (P < 0,05, Chi-Quadrat-Test) von den Werten der Positivkontrollgrouppe.
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung.
  • BEISPIEL 7
  • Wirkungen von GE und VT auf das Auftreten, die Häufigkeit und die Dauer früher ischämischer Rhythmusstörungen
  • Ischämische Rhythmusstörungen, die innerhalb der ersten 20 bis 30 Minuten nach Koronarocclusion auftreten, gehören zu den gefürchtetsten Komplikationen akuter myokardialer Ischämie, da sie ihrer Natur nach oft irreversibel sind und zu plötzlichem Tod führen. Die Mechanismen, durch welche diese Rhythmusstörungen erzeugt werden, beruhen offenbar auf wiedereinsetzender myokardialer Erregung. In diesem Experiment wurde gezeigt, dass sowohl GE als auch VT die Dauer der ventrikulären Tachykardien im ischämischen Myokard verringern.
  • Man verabreichte weißen, zufallsgezüchteten männlichen Ratten mit einem Gewicht von 200 g eine leichte Etherbetäubung, immobilisierte sie dann und beatmete sie künstlich. Man ligierte den absteigenden Ast der linken Koronararterie jeder Ratte. Unmittelbar nach der Ligation verabreichte man jeder Ratte durch die katheterisierte Femoralvene eine Test- oder Kontrollsubstanz, begann mit einer ECG-Aufzeichnung (Standardableitung II) und führte diese die folgenden 30 Minuten durch.
  • GE und VT dienten als Testsubstanzen und wurden den Tieren in den jeweiligen Testgruppen in Dosen von 0,1, 1,0 und 10,0 mg/kg verabreicht. Das β-adrenerg blockierende Mittel Propanolol (Obzidan, Germed, Deutschland) diente als Positivkontrollsubstanz und wurde jedem Tier in der Positivkontrollgruppe in einer Dosis von 0,5 mg/kg verabreicht. Physiologische Kochsalzlösung diente als Negativkontrollsubstanz und wurde den Tieren in der Negativkontrollgruppe verabreicht. Jede Dosis jeder Test- oder Kontrollsubstanz wurde getrennt bei einer Gruppe von 9 Tieren getestet.
  • Auf der Grundlage der ECG-Aufzeichnungen wurden die folgenden Parameter beurteilt: (i) die Anzahl der ventrikulären Extrasystolen, die innerhalb einer 30-minütigen Beobachtungsdauer nach Koronarocclusion auftraten; (ii) die gesamte kumulative Dauer ventrikulärer Tachykardien (d.h. die aufsummierte Dauer einzelner, paroxysmaler ventrikulärer Rhythmusstörungen in Sekunden), die innerhalb der 30-minütigen Beobachtungsdauer auftraten; und (iii) die Gesamtdauer (in Sekunden) der ventrikulären Fibrillationen, die während der 30-minütigen Beobachtungsdauer auftraten. Die Daten wurden elektronisch verarbeitet und statistische Vergleiche zwischen den von den Tieren in den experimentellen Testgruppen und den in den jeweiligen unterschiedlichen Kontrollgruppen erhaltenen Werten angestellt.
  • Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 15 dargestellt. Bei dieser Untersuchung wurden keine ventrikulären Fibrillationen aufgezeichnet. Wie in Tabelle 15 gezeigt ist, verringerten alle der getesteten Dosen von GE und VT in diesem Modell die Gesamtdauer der ventrikulären Tachykardien in ischämischem Myokard. Dosen von 0,1 mg/kg und 10,0 mg/kg GE und eine Dosis von 10,0 mg/kg VT erwiesen sich als besonders wirksam bei der Verringerung der Gesamtdauer dieser ventrikulären Tachykardien. Dosen von 0,1 mg/kg und 10,0 mg/kg GE und Dosen von 1,0 und 10,0 mg/kg VT verringerten die Gesamtdauer ventrikulärer Tachykardie. Bemerkenswerterweise induzierte eine Dosis von 10 mg/kg VT eine dreifache Abnahme der Zahl ventrikulärer Extrasystolen im Vergleich mit der Negativkontrollgruppe. Tabelle 15. Die gegen Rhythmusstörung gerichteten Wirkungen von GE und VT auf frühe, ischämische myokardiale Rhythmusstörungen
    Figure 00560001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, Student's t-Test) von den Werten der Negativkontrollgruppe.
    • Abkürzung: S = Physiologische Kochsalzlösung.
  • BEISPIEL 8
  • Wirkungen von GE und VT auf den arteriellen Blutdruck
  • Bei diesem Experiment wurden die Wirkungen von GE und VT auf den arteriellen Blutdruck untersucht. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass sowohl GE als auch VT den arteriellen Blutdruck senken und hypotensive (d.h. Blutdruck senkende) und Blutgefäß erweiternde Wirkungen bei Individuen zeigten, denen diese Dipeptide verabreicht worden waren. Diese Wirkungen sind charakteristische Kennzeichen bekannter Kaliumkanal öffnender Substanzen.
  • Für diese Untersuchung verwendete man weiße, zufallsgezüchtete männliche Ratten mit einem Gewicht von etwa 200 g. Man verabreichte jede Dosis jeder Test- bzw. Kontrollsubstanz einer Gruppe aus fünf Ratten. GE und VT verwendete man als Testsubstanzen und verabreichte sie intravenös in Dosen von 0,01, 0,1, 1,0 und 10,0 mg/kg. Physiologische Kochsalzlösung (0,2 ml) diente als Negativkontrollsubstanz. Das Ganglien blockierende Mittel Pentamin diente als Positivkontrollsubstanz und wurde in einer Dosis von 5 mg/kg getestet. Nach Verabreichung der Testsubstanz, Positivkontrollsubstanz oder Negativkontrollsubstanz überwachte man den arteriellen Blutdruck jedes Tieres.
  • Vor der Verabreichung der Test- oder Kontrollsubstanz betäubte man jedes Tier mit α-Chloralose und kathederisierte dann sowohl dessen Carotisarterie als auch dessen Jugularvene. Den Carotis-Katheder verband man mit einem elektronischen Manometer, das über einen Digital/Analog-Wandler mit einem Computerrecorder verbunden war. Die durchschnittlichen Basalwerte des arteriellen Blutdrucks bestimmte man folgendermaßen: Über einen Zeitraum von 30 Sekunden zeichnete man das dem arteriellen Blutdruck entsprechende digitale Signal in Intervallen von einer Sekunde auf. Dann bestimmte man den Durchschnittswert dieser 30 einzelnen Messungen und zeichnete ihn auf.
  • Nach Bestimmung des durchschnittlichen Basalwerts des arteriellen Blutdrucks verabreichte man einem Tier in einem Volumen von 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung durch den Jugularvenen-Katheder eine bestimmte Dosis der Test- oder Kontrollsubstanz. Dann nahm man in den folgenden 1,5 Stunden auf folgende Weise Messungen des arteriellen Blutdrucks vor: (i) während der ersten fünf Minuten überwachte man den arteriellen Blutdruck kontinuierlich, berechnete elektronisch die Mittelwerte und zeichnete sie in jedem der 10 verschiedenen Intervalle von 30 Sekunden auf (d.h. 30. Sekunde, 60. Sekunde, usw.); (ii) danach berechnete man die Durchschnittswerte des arteriellen Blutdrucks in den ersten Sekunden der 10. Minute, der 15. Minute, der 30. Minute, der 45. Minute, der 60. Minute, der 75. Minute und der 90. Minute nach Verabreichung der jeweiligen Test- oder Kontrollsubstanz.
  • Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Tabellen 16A und 16B gezeigt. Bei diesem Modell blieb während der 90-minütigen Beobachtungsdauer der arterielle Blutdruck von Tieren, die mit physiologischer Kochsalzlösung (Negativkontrollsubstanz) behandelt worden waren, bei etwa 92 bis etwa 100 % der Basalwerte vor der Behandlung. Es wurde gezeigt, dass Pentamin innerhalb der ersten fünf Minuten nach seiner Verabreichung den arteriellen Blutdruck auf etwa 68 bis etwa 75 % der Basalwerte vor der Behandlung senkte, wodurch bestätigt wurde, dass dieses Tiermodell auf Blutgefäß erweiternde Mittel anspricht. Eine Behandlung mit entweder GE oder VT führte zu einer mäßigen, aber verzögerten Verringerung des durchschnittlichen arteriellen Blutdrucks nach etwa 60 bis 90 Minuten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass GE und VT jeweils mäßige Blutgefäß erweiternde Eigenschaften besitzen. Tabelle 16A. Die Wirkung von GE auf den arteriellen Blutdruck
    Figure 00580001
    • *Signifikant verschieden (gepaarter Student's t-Test) vom Basalwert. Signifikant verschieden (ungepaarter Student's t-Test) von den Parameterwerten in den Gruppen:
      Figure 00580002
      Negativkontrollgruppe (Injektion von Kochsalzlösung), und #Positivkontrollgruppe (Pentamin-Injektion) zur jeweiligen Minute.
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung.
    Tabelle 16B. Die Wirkung von VT auf den arteriellen Blutdruck
    Figure 00590001
    • *Signifikant verschieden (gepaarter Student's t-Test) vom Basalwert. Signifikant verschieden (ungepaarter Student's t-Test) von den Parameterwerten in den Gruppen:
      Figure 00590002
      Negativkontrollgruppe (Injektion von Kochsalzlösung), und #Positivkontrollgruppe (Pentamin-Injektion) zur jeweiligen Minute.
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung.
  • BEISPIEL 9
  • Wirkungen von GE und VT auf die Herzfunktion
  • Dieses Experiment wurde konzipiert, um die Wirkungen von GE und VT auf die Herzfunktion zu untersuchen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, dass weder GE noch VT eine signifikante Wirkung auf die Funktion eines normalen Herzens ausüben. Bemerkenswerterweise ändert keines dieser Dipeptide die grundlegenden Eigenschaften eines normalen Elektrokardiogramms (ECT).
  • Man betäubte weiße, zufallsgezüchtete männliche Ratten mit einem Gewicht von etwa 200 g mit Nembutal. Nach der Betäubung nahm man so schnell wie möglich ein Basal-ECG auf, um die basalen Messungen für die wesentlichen Parameter der Herzfunktionen zu erstellen. Ratten, die irgendwelche Abweichungen von normalen ECG-Parametern zeigten, wurden von der Untersuchung ausgeschlossen.
  • GE und VT dienten als Testsubstanzen. Jedem Tier in der Versuchsgruppe verabreichte man intravenös entweder GE oder VT in einer Dosis von 0,001, 0,01, 0,1, 1,0, 10,0 und 100,0 mg/kg. Jede Dosis jeder Testsubstanz beurteilte man auf der Grundlage einer getrennten experimentellen Gruppe aus 10 Ratten. Man nahm 1, 3, 5 und 10 Minuten nach der Injektion der Testsubstanz ECT-Spuren auf (nicht weniger als jeweils 4 Komplexe). Physiologische Kochsalzlösung diente als Negativkontrollsubstanz. Jedem Tier in der Negativkontrollgruppe injizierte man intravenös 2 ml physiologische Kochsalzlösung.
  • Die Herzfunktion wurde durch Überwachung der folgenden ECG-Parameter beurteilt:
    • (i) die Dauer des PQ-Intervalls (welches die Zeit definiert, in welcher der Impuls über die Atrien und den Atrioventrikularknoten läuft). Der normale Wert für diesen Parameter für Nembutal-betäubte Ratten beträgt 25 bis 60 Millisekunden (ms) bei Verwendung eines Ableitung II-ECG.
    • (ii) die Breite des QRS-Komplexes (der die Wanderung des Impulses über das ventrikulare Myokard definiert). Der normale Wert für diesen Parameter bei Nembutal-betäubten Ratten beträgt 15 bis 30 msec bei Verwendung eines Ableitung II-ECG.
    • (iii) die Spannung der R-Welle (welche die Ausbreitung der Erregung über den linken Ventrikel definiert). Der normale Wert für diesen Parameter bei Nembutal-betäubten Ratten beträgt 0,163 bis 0,9 Millivolt (mV) bei Verwendung eines Ableitung II-ECG.
    • (iv) die Dauer des QT-Intervalls (welches die Zeit vom Beginn des QRS-Komplexes bis zum Ende der T-Welle definiert und die Dauer der ventrikulären Depolarisation und Repolarisation wiederspiegelt). Der normale Wert für diesen Parameter bei Nembutal-betäubten Ratten beträgt 50 bis 106 ms bei Verwendung eines Ableitung II-ECG.
    • (v) die Spannung der T-Welle (welche den Repolarisierungsvorgang im linken Ventrikel definiert). Der normale Wert für diesen Parameter bei Nembutal-betäubten Ratten beträgt 0,05 bis 0,38 mV unter Verwendung eines Ableitung II-ECG.
  • Wie in den Tabellen 17A bis 21B gezeigt, wiesen GE und VT bei den getesteten Dosisbereichen keine signifikante Wirkung auf irgendeinen dieser Standard-Parameter der Herzfunktion auf. Selbst in den wenigen Fällen, in denen für einen gegebenen Parameter ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen dem anfänglichen Wert und dem später gemessenen Wert (den später gemessenen Werten) beobachtet wurde, lagen die später gemessenen Werte im normalen Bereich. Tabelle 17A. Die Wirkung von GE auf die Dauer des PQ-Intervalls (% des anfänglichen Durchschnittswerts)
    Figure 00610001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter Student's t-Test) von: *dem entsprechenden anfänglichen Wert; #den Werten der Parameter in der Kontrollgruppe bei einer entsprechenden Minute.
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung
    Tabelle 17B. Die Wirkung von VT auf die Dauer des PQ-Intervalls (% des anfänglichen Durchschnittswerts)
    Figure 00620001
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung
    Tabelle 18A. Die Wirkung von GE auf Breite des QRS-Komplexes (% des anfänglichen Durchschnittswerts)
    Figure 00620002
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung
    Tabelle 18B. Die Wirkung von VT auf Breite des QRS-Komplexes (% des anfänglichen Durchschnittswerts)
    Figure 00630001
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung
    Tabelle 19A. Die Wirkung von GE auf die Spannung der R-Welle (% des anfänglichen Durchschnittswerts)
    Figure 00630002
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter Student's t-Test) vom entsprechenden anfänglichen Wert
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung
    Tabelle 19B. Die Wirkung von VT auf die Spannung der R-Welle (% des anfänglichen Durchschnittswerts)
    Figure 00640001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter Student's t-Test) vom entsprechenden anfänglichen Wert.
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung
    Tabelle 20A. Die Wirkung von GE auf die Dauer des QT-Intervalls (% des anfänglichen Durchschnittswerts)
    Figure 00640002
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter Student's t-Test) von den Parameterwerten in der Kontrollgruppe zur entsprechenden Minute.
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung
    Tabelle 20B. Die Wirkung von VT auf die Spannung der R-Welle (% des anfänglichen Durchschnittswerts)
    Figure 00650001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter Student's t-Test) von: *– dem entsprechenden anfänglichen Wert; #– den Parameterwerten in der Kontrollgruppe zur entsprechenden Minute
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung
    Tabelle 21A. Die Wirkung von GE auf die Spannung der T-Welle (% des anfänglichen Durchschnittswerts)
    Figure 00650002
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter Student's t-Test) vom entsprechenden anfänglichen Wert.
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung
    Tabelle 21B. Die Wirkung von VT auf die Spannung der T-Welle (% des anfänglichen Durchschnittswerts)
    Figure 00660001
    • *Signifikant verschieden (P < 0,05, gepaarter Student's t-Test) von: *– dem entsprechenden anfänglichen Wert; #– den Parameterwerten in der Kontrollgruppe zur entsprechenden Minute
    • Abkürzung: S = physiologische Kochsalzlösung

Claims (22)

  1. Verwendung einer wirksamen Menge eines Peptids, gewählt aus L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, einem Polymer aus zwei bis acht Dipetiden, worin jedes dieser Dipetide L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr ist, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, zur Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung einer Krankheit, die auf Öffnung von Kaliumkanälen anspricht, wobei diese Krankheit (a) bronchospastische Zustände oder Bronchodilatation einbezieht, (b) Asthma ist, (c) mit Hypoxie assoziiert ist, (d) mit Anoxie assoziiert ist, (e) Epilepsie ist, (f) zerebrale Ischämie ist, (g) eine neurodegenerative Erkrankung ist, (h) Diabetes ist, (i) Parkinson-Krankheit ist, (j) Alzheimer-Krankheit ist oder (k) Leberzirrhose ist.
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin die Behandlung die Verabreichung einer ansteigenden Menge des Peptids über die Zeit, bis die wirksame Menge des Peptids an einer zu behandelnden Gewebestelle oder im Blut erreicht ist, umfasst.
  3. Verwendung einer wirksamen Menge eines Peptids, gewählt aus L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, einem Polymer aus zwei bis acht Dipetiden, worin jedes dieser Dipetide L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr ist, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, zur Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung einer kardiovaskulären Krankheit.
  4. Verwendung gemäß Anspruch 3, worin die Krankheit ist: (a) ischämische Herzerkrankung, (b) Herzrhythmusstörungen, (c) hypertensive Krankheit, (d) kongestive Herzinsuffizienz oder (e) ansprechend auf Erweiterung der Blutgefäße.
  5. Verwendung einer wirksamen Menge eines Peptids, gewählt aus L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, einem Polymer aus zwei bis acht Dipetiden, worin jedes dieser Dipetide L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr ist, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Induktion der Erschlaffung eines glatten Muskels.
  6. Verwendung gemäß Anspruch 5, worin der glatte Muskel ist: (a) intestinaler glatter Muskel, (b) bronchialer glatter Muskel, (c) trachealer glatter Muskel, (d) glatter Gebärmuttermuskel, (e) glatter Harnblasemuskel, (f) glatter Darmmuskel oder (g) glatter Gefäßmuskel, gegebenenfalls, worin die Erschlaffung des glatten Gefäßmuskels zu einer Erweiterung der Blutgefäße führt.
  7. Verwendung einer wirksamen Menge eines Peptids, gewählt aus L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, einem Polymer aus zwei bis acht Dipetiden, worin jedes dieser Dipetide L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr ist, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Induktion der Erschlaffung eines Skelettmuskels.
  8. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei das Peptid topisch, systemisch, intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intranasal, transdermal, oral, oder mittels intradermaler Injektion, intrabronchialer Instillation, gastrointestinaler Abgabe oder transmukosaler Abgabe verabreicht wird.
  9. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Peptid L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
  10. Verwendung gemäß Anspruch 9, worin das Peptid L-Gly-L-Glu oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
  11. Verwendung gemäß Anspruch 9, worin das Peptid L-Val-L-Thr oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
  12. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medikament für eine Verabreichung an einen Menschen bestimmt ist, vorzugsweise worin die wirksame Menge des Peptids innerhalb des Bereichs von etwa 0,15 mg/kg bis etwa 10 mg/kg liegt.
  13. Pharmazeutische Zubereitung in Einheitsdosisform, umfassend pro Einheitsdosis einen Bereich von etwa 0,01 mg bis etwa 1000 mg, vorzugsweise etwa 1 mg bis etwa 100 mg L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  14. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 13, worin die Zubereitung pro Einheitsdosis einen Bereich von etwa 0,01 mg bis etwa 1000 mg L-Gly-L-Glu oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
  15. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 13, worin die Zubereitung pro Einheitsdosis einen Bereich von etwa 0,01 mg bis etwa 1000 mg L-Val-L-Thr oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
  16. Kit, das zur Konservierung eines lebenden Gewebes oder eines lebenden Organs geeignet ist, wobei das Kit einen Behälter zum Aufbewahren des Gewebes oder Organs und eine wirksame Menge des Peptids zur Konservierung des Gewebes oder Organs umfasst, worin das Peptid L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, ein Polymer aus 2 bis 8 Dipeptiden von L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist, vorzugsweise worin die wirksame Menge des Peptids innerhalb eines Bereichs von etwa 10–9 M bis etwa 10–5 M liegt.
  17. Kit gemäß Anspruch 16, worin das Peptid L-Gly-L-Glu oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
  18. Kit gemäß Anspruch 16, worin das Peptid L-Val-L-Thr oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
  19. In-vitro-Verfahren zur Konservierung eines lebenden Gewebes oder eines lebenden Organs, umfassend das in Kontaktbringen des Gewebes oder Organs mit einer Zubereitung, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine wirksame Menge eines Peptids, wobei das Peptid L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr, ein Polymer aus zwei bis acht Dipeptiden von L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist, vorzugsweise, worin die wirksame Menge des Peptids innerhalb eines Bereichs von etwa 10–9 M bis etwa 10–5 M liegt.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 19, worin das Peptid L-Gly-L-Glu oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 19, worin das Peptid L-Val-L-Thr oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
  22. Peptidpolymer, umfassend mindestens zwei Dipeptide, worin jedes dieser Dipeptide des Polymers L-Gly-L-Glu oder L-Val-L-Thr ist.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002000665A1 (en) * 2000-06-26 2002-01-03 Novo Nordisk A/S Use of potassium channel openers for the treatment of insulitis
CN1135983C (zh) * 2001-06-28 2004-01-28 中山大学 二酸（5－雄甾烯－17－酮－3β－羟基）二酯用于制备药物
GB0206711D0 (en) * 2002-03-21 2002-05-01 Isis Innovation HIF Inhibitor
US7585523B2 (en) * 2002-08-27 2009-09-08 Targeted Medical Pharma Composition and method to augment and sustain neurotransmitter production
JPWO2005018316A1 (ja) * 2003-08-22 2006-10-12 内田　康美 肥大型心筋症モデル動物
CN1845726A (zh) * 2003-09-04 2006-10-11 波塞东医药公司 用于治疗心脏心律失常的erg通道开放剂
US20060263805A1 (en) * 2005-03-16 2006-11-23 Andre Terzic Diagnosing and treating potassium channel defects
WO2013036403A1 (en) * 2011-09-06 2013-03-14 Curna, Inc. TREATMENT OF DISEASES RELATED TO ALPHA SUBUNITS OF SODIUM CHANNELS, VOLTAGE-GATED (SCNxA) WITH SMALL MOLECULES
KR101533308B1 (ko) * 2012-08-24 2015-07-03 경희대학교 산학협력단 안지오텐신-i 전환 효소 저해능을 나타내는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US9925233B2 (en) 2015-01-30 2018-03-27 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US9937223B2 (en) 2015-01-30 2018-04-10 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US9744209B2 (en) 2015-01-30 2017-08-29 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US9687526B2 (en) 2015-01-30 2017-06-27 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US9750785B2 (en) 2015-01-30 2017-09-05 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US9744239B2 (en) 2015-01-30 2017-08-29 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US20210106648A1 (en) * 2019-10-11 2021-04-15 TOBEBIO Novel Drug Laboratory Co., Ltd. Synergistic combination of chemotherapy and peptide for treating cancer

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1489879A (en) * 1974-12-20 1977-10-26 Leo Pharm Prod Ltd N'-cyano-n'-3-pyridylguanidines
US4200640A (en) * 1976-04-02 1980-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nitric ester of N-(2-hydroxyethyl)nicotinamide and pharmaceutical use
NO812612L (no) * 1980-08-06 1982-02-08 Ferring Pharma Ltd Enzym-inhibitorer.
SU1417242A1 (ru) * 1985-10-28 1995-10-27 Г.М. Яковлев Способ получения вещества, восстанавливающего функцию миокарда
GB9510477D0 (en) * 1995-05-24 1995-07-19 Sandoz Ltd Organic compounds
US5565483A (en) * 1995-06-07 1996-10-15 Bristol-Myers Squibb Company 3-substituted oxindole derivatives as potassium channel modulators

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Publication number Publication date
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