以下通过实例对式I化合物的制备方法作进一步详细说明:
制备实例1:称取3.68g 5-雄甾烯-17-酮-3β-磺酸钠盐溶于50ml乙二醇二甲醚中,加入1.5gl,2-二碘乙烷及1.6g四正丁基溴化铵和20m水,于60℃搅拌回流反应4小时,得到的混合物冷却后用乙醚萃取三次,合并萃取液,用水洗,再用无水硫酸钠干燥,蒸除溶剂,得到6.1g所需产物一乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯。
若分别用1,3-二碘丙烷或1,4-二碘丁烷、1,5-二碘戊烷代替上述实例1中的1,2-二碘乙烷,则最后得到的产物即分别为丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯或丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯或戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯。
制备实例2:称取500g 3β-羟基5-雄甾烯-17-酮溶于1000ml四氢呋喃溶液中,滴加入50ml丁二酰氯,110℃下搅拌反应,TLC检验反应基本完成后,将反应混合物倾入冰水中,用乙酸乙酯:石油醚(1∶1)洗涤三次,得式II化合物粗品,硅胶H柱层析得式II化合物纯品400g。
若分别用丙二酰氯、己二酰氯或戊二酰氯代替上述实例2中的丁二酰氯,则最后得到的产物即分别为丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯、己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯。
下列实验实例将进一步说明本发明的式I化合物的医药用途及其效果。
实验实例1急性毒性实验
一、材料
实验样品:式I化合物(8种,式IA类,n=2,3,4,5;式IB类,n’=-1,2,3,4),由广州时珍堂天然产物生理活性研究中心提供,批号分别为:19970101,19970102,19970103,19970104,19970105,19970106,19970107,19970108。
实验动物:NIH系小鼠,由广东省医学实验中心提供,批号1997A029
二、方法与结果
八种式I化合物分别按以下方法进行实验:
2.1灌胃给予受试物急性毒性实验:
选择健康NIH系小鼠,体重20±2g,20只,雌雄各半,将受试物以0.5%羧甲基纤维素钠配成20mg/ml悬浮液,对小鼠一次灌胃受试物悬浮液0.8ml/20g体重,连续观察七天,小鼠活动敏捷,毛皮光滑,未引起死亡或异常反应,限于给药浓度和体积不能再增大,不能测出其LD50。故进行最大耐受量试验。选择健康小鼠20只,雌雄各半,于24小时内分3次灌服式I化合物悬浮液(20mg/ml),每次0.5mg/20g体重,总剂量达1.5g/kg体重,观察7天,此期间让小鼠自由进食和饮水,小鼠活动敏捷,毛皮光滑,未引起死亡或异常反应。
2.2腹腔注射给予受试物急性毒性实验:
选取健康NIH系小鼠,体重20±2g,20只,雌雄各半,受试物以0.5%羧甲基纤维素钠配成20mg/ml悬浮液,经超声波乳化器及高速搅拌器处理使颗粒细化、均匀,对小鼠一次腹腔注射受试物1.0ml/20g体重,连续观察7d,小鼠活动正常、敏捷,毛皮光滑,未引起动物死亡或异常反应,限于给受试样品浓度和体积不能再增大,故进行最大耐受量试验。
另选择健康NIH小鼠40只,体重20±2g,雌雄各半,于24h每隔4h受试物(20mg/ml),每次0.5ml/20g体重,共6次。此后连续观察7d,此期间让小鼠自由进食和饮水。
三、结论
1.小鼠每天灌胃给予式I化合物最大耐受量应不小于0.5×3×20×50=1.5g/kg,按体表面积换算,相当于70kg成年人用量(50mg)的232.7倍(0.5×3×20×387.9÷50)。在最大耐受量试验给受试样品后观察期间,小鼠活动敏捷,毛皮光滑,未引起死亡或异常反应。
2.小鼠注射给予式I化合物最大耐受量为不小于3g/kg体重(=0.5×20×6×50mg)。在最大耐受量试验给受试样品后观察期间,小鼠活动敏捷,毛皮光滑,未引起死亡或异常反应。
注射给予式I化合物对小鼠最大耐受量,相当于70kg成年人每天用量(10mg)的2327倍(0.5×6×20×387.9÷100)。
3、由此可知,式I化合物属无毒性级化合物。
实验实例2抗心律失常作用
一、实验材料
丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物C),或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物D),或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物E),或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物F),乙二酮二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物G),丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物H),丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物I),戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物J);均由本实验室合成提供,使用时0.5%CMC-Na配成所需浓度液体;去氢异雄甾酮(Prasterone,Pras),胺腆酮(Amiodarin,Amio)Sanofi&Winthrop药厂出品;乌头碱(Aconitine,Aco)和哇巴因(Ouabain,Oua)是Merck药厂出品;羧甲基纤维素钠(CMC-Na),广州市化学试剂玻璃仪器批发部进口分装。
NIH小鼠,广东省医学实验动物中心提供,实验动物合格证号:97A018
SD大鼠,广东省医学实验动物中心提供,实验动物合格证号:97A017
新西兰大白兔,医动字26-97043号,广东省南海市黄岐泌冲威龙养殖场提供。
MS-302多媒体生物信号记录分析系统(广东药学院);WZ-50D型微量注射泵(浙江医科大学医学仪器厂)
二、方法与结果1、对乌头碱诱发大鼠心律失常的影响
SD大鼠,雄性,体重218.3±20.0g,腹腔注射乌拉坦1.2g/kg麻醉,以MS302生物信号记录分析系统连续监视并记录II导联心电图(ECG)。舌下静脉给药或0.5%CMC-Na后10min,颈外静脉插管,以2.5μg/min速度恒速静脉注射Aco,分别记录出现室性早搏(ventricular premature beat,VP),室性心动过速(ventricular tachycardia,VT),心室纤颤(ventricular fibrillation,VF)及心脏停搏(cardiacarrest,CA)时Aco的用量并进行t检验,表1显示式I的化合物C、化合物D、化合物E出现VP、VT、VF和CA所需Aco的用量均显著高于静脉注射0.5%CMC-Na组,在0.5mg/kg剂量下,化合物C、化合物D、化合物E效果明显较Pras及胺腆酮好。表1 对乌头碱诱发大鼠心律失常的作用(n=10,
x±s)
组别(mg/kg) |
Aco的用量(μg.kg-1) |
VP VT VF CA |
CMC-Na化合物C 0.5化合物D 0.5化合物E 0.5Pras 4.5胺腆酮 3 |
65.5±15.298.0±29.1**122.4±20.5**108.2±37.4**93.5±19.0**90.0±25.7* |
84.6±30.1118.9±35.3*137.8±24.4*122.4±37.8*110.0±16.1*108.8±25.4 |
121.4±28.0152.8±39.3*186.4±30.2*163.4±30.5**132.7±24.4141.2±28.2 |
148.2±33.0186.5±31.7*204.0±28.0*184.5±27.1*164.5±27.1176.0±38.0* |
与CMC-Na组相比较:
*P<0.05,
**P<0.012、对Oua诱发豚鼠心律失常的影响
雄性豚鼠40只,体重288.8±38.3g,分6组腹腔注射乌拉坦1.2g/kg麻醉。颈外静脉给药或静脉注射0.5%CMC-Na后10min,颈外静脉插管以3μg/min速度静脉注射Oua,记录ECG,分别测出VP,VT,VF及CA时的Oua用量并进行t检验。表2显示化合物F、化合物G、化合物H组出现VP,VT,VF及CA时所需Oua用量显著增加,表明化合物F、化合物G、化合物H组能显著提高豚鼠心脏Oua中毒的耐受剂量。表2.对Oua引起的心律失常的作用(n=8,
x±s)组别 Oua剂量(μg/kg)(mg/kg) VP VT VF CACMC-Na 60.9±14.6 92.9±29.0 137.2±31.9 166.6±33.7化合物F 1.5 87.4±21.3** 139.4±35.4** 176.2±48.1* 212.0±40.6*化合物G 1.5 110.9±20.3*** 144.3±33.8** 188.7±37.8** 228.0±39.8**化合物H 2.5 116.0±37.0** 140.2±35.6** 198.1±41.5** 223.2±30.7**Pras 4.5 89.3±15.5*** 131.6±24.6** 165.4±26.4* 195.5±33.0*胺腆酮 3 118.4±33.5*** 175.0±41.1*** 247.6±46.1*** 283.6±43.9***
与CMC-Na组相比较:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.3、对氯化钡(BaCl2)诱发心律失常的影响
SD大鼠50只,雄性,体重236.7±13.7,腹腔注射10%水合氯醛0.3g/kg麻醉,记录ECG,颈外静脉插管作给药用。静脉注射BaCl24mg/kg,一般立即出现室性早搏、心动过速,并发展成稳定和典型的双向性心律失常。待出现稳定和典型的双向性心律失常后立即静脉注射药或0.5%CMC-Na,以窦性心律恢复和恢复后维持时间(60min内)为标准,比较5组作用。由表3可见化合物I、化合物J对BaCl2所致心律失常均有非常显著的治疗作用,维持时间较长,相较胺腆酮起效快。
表3对氯化钡(BaCl
2)诱发心律失常的作用(n=10,
x±s)
组别(mg/kg) |
恢复窦性心律时间(min) |
窦性心律维持时间(min) |
CMC-Na |
38.648±8.142 |
21.482±8.041 |
化合物I 0.5 |
6.752±4.123*** |
45.478±5.271*** |
化合物J 1.5 |
3.584±2.471*** |
51.762±6.275*** |
化合物J 2.5 |
0.845±1.529*** |
59.248±1.527*** |
胺腆酮 3 |
15.859±5.126*** |
40.156±5.124*** |
与CMC-Na组相比,***P<0.001实验实例3对心肌缺血的保护作用
一、实验材料
丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物C),或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物D),或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物E),或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物F),乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物G),丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物H),丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物I),戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物J);均由中山大学药学系药物化学实验室合成提供,使用时0.5%CMC-Na配成所需浓度液体;硝苯地平(Nifedipine,Nif),大同市利群制药厂生产,羧甲基纤维素钠(CMC-Na),广州市化学试剂玻璃仪器批发部进口分装。
SD大鼠,广东省医学实验动物中心提供,实验动物合格证号:98A033
新西兰大白兔,医动字26-98043号,广东省南海市黄岐泌冲威龙养殖场提供。
MS-302多媒体生物信号记录分析系统(广东药学院);WZ-50D型微量注射泵(浙江医科大学医学仪器厂)
二、实验方法
SD大鼠,试验前测定ECG和胸导联,弃去T波、ST段位移有异常和心律失常者。选取合格大鼠,体重208.1±18.8g,雌雄兼用,按表4分组,每组8只大鼠,按表4剂量十二指肠给予受试化合物或同体积0.5%CMC-Na溶液,30min后乙醚麻醉,记录ECG后颈背部皮下注射异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO)2mg/kg,30min后再记录ECG1次,于第一次灌胃供试品后24h和48h,各组按上述方法重复给供试药及ISO并记录ECG。72h后眼眶取血并离心分离血清,处死大鼠,剪取心尖以4℃生理盐水制成10%的心肌组织匀浆备用。对∑ST段位移幅度的影响
测量第一次给ISO前、第一、二、三次皮下注射ISO后30min各鼠ST值,计算∑ST的mv数均值作为心肌损伤程度的指标并做t检验。对血清中CK、LDH和MDA的影响
用试剂盒测血清中的丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的变化。对心肌组织匀浆中CK、LDH和MDA的影响
用试剂盒测血清和心肌匀浆中的丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的变化。三、结果
1对∑ST段的影响
ST段的变化幅度可基本反映心肌缺血的严重程度,而∑ST段可作为缺血程度的定量指标。皮下注射ISO诱发大鼠心肌缺血后,ST段明显抬高,显示大鼠心肌有严重的心肌缺血损伤。实验结果(见表4)表明受试化合物各组和硝苯地平均能降低皮下注射ISO引起的ST段的异常抬高程度(∑ST平均位移幅度),式I化合物对ISO致心肌缺血大鼠的心肌具有保护作用。表4 对异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤模型中∑ST的影响Group Dose ∑ST/mv
/mg·kg-1 30min 24h 48h 72hCMC-Na 1.26±0.24 1.18±0.21 0.87±0.17 0.90±0.15化合物C 0.76 0.64±0.21*** 0.52±0.11*** 0.50±0.14*** 0.52±0.12***化合物D 0.76 0.42±0.20*** 0.47±0.13*** 0.42±0.08*** 0.40±0.10***化合物E 0.76 0.53±0.11*** 0.50±0.10*** 0.57±0.04*** 0.51±0.07***化合物F 0.76 0.47±0.10*** 0.57±0.15*** 0.61±0.05*** 0.53±0.08***化合物G 0.76 0.51±0.13*** 0.50±0.14*** 0.67±0.19*** 0.42±0.07***化合物H 0.76 0.53±0.11*** 0.50±0.10*** 0.52±0.04*** 0.51±0.12***化合物I 0.76 0.49±0.12*** 0.54±0.12*** 0.50±0.06*** 0.54±0.08***化合物J 0.76 0.54±0.12*** 0.52±0.07*** 0.56±0.07*** 0.54±0.08***Nif组 0.76 0.50±0.09*** 0.53±0.08*** 0.52±0.05*** 0.51±0.07***x±s,n=8,与CMC-Na组相比,***P<0.001
2.对血清中CK、LDH和MDA的影响
大鼠皮下注射ISO后,血清中的CK、LDH和MDA均明显上升,显示由于心肌组织的损伤而使心肌细胞中的CK和LDH漏出到血液中,血清中的脂质过氧化物(Lipid per-oxidation,LPO)大量增加。表5显示受试化合物可明显抑制CK和LDH从心肌细胞内向血清中漏出,显著抑制Iso致大鼠血清中MDA的异常升高,对心肌细胞具有保护作用。表5 对Iso致心肌损伤大鼠血清的影响Group Dose Activity of CK Activity of LDH MDA
/mg·kg-1 (U/L) (U/L) (nmol/ml)CMC-Na 359.23±34.25 389.23±34.41 50.42±3.21化合物C 0.76 262.50±35.41*** 270.13±27.46*** 28.29±6.56***化合物D 0.76 229.27±31.32*** 218.55±37.35*** 18.15±4.52***化合物E 0.76 275.44±21.81*** 267.35±38.42*** 25.54±3.80***化合物F 0.76 252.17±18.41*** 250.40±31.30*** 24.16±4.18***化合物G 0.76 248.20±20.50*** 254.75±30.81*** 20.54±2.11***化合物H 0.76 261.24±24.27*** 253.24±31.55*** 21.17±3.36***化合物I 0.76 242.14±22.72*** 233.35±18.46*** 24.64±2.53***化合物J 0.76 239.40±16.15*** 257.05±31.30*** 26.47±3.25***Nif 0.76 255.90±31.22*** 224.01±51.20*** 27.17±3.44***
与CMC-Na组相比,x±s,n=8,***P<0.001
3对心肌组织匀浆中CK、LDH和MDA的影响
大鼠皮下注射ISO后,心肌组织中的CK、LDH含量显著降低,MDA含量明显升高。实验结果(表6)显示,与CMC组相比,硝苯地平组,说明式I化合物可明显抑制CK和LDH从胞内漏出。说明式I化合物对Iso所致的心肌组织损伤有明显的保护作用。表6 对Iso致心肌损伤大鼠心肌组织匀浆的影响(x±s,n=8)Group Dose Activity of CK Activity of LDH MDA
/mg.kg-1 (U/L) (U/L) (nmol/g)CMC-Na 108.84±21.11 98.57±12.81 253.23±35.11化合物C 0.76 186.55±26.25* 201.33±25.24*** 121.670±15.24***化合物D 0.76 270.41±34.31* 292.27±29.44* 78.43±7.51***化合物E 0.76 206.18±43.80*** 160.27±20.36*** 89.62±12.37***化合物F 0.76 221.58±45.58*** 157.39±20.69*** 105.02±10.84***化合物G 0.76 225.60±31.81*** 152.22±25.42*** 99.52±13.15***化合物H 0.76 230.15±53.46*** 167.23±27.44*** 105.52±14.64***化合物I 0.76 214.27±40.62*** 159.82±31.69*** 115.02±10.34***化合物J 0.76 268.28±42.59*** 197.45±26.88*** 95.67±15.67***Nif 0.76 195.67±32.63* 166.68±29.64*** 183.15±29.67***与CMC-Na组相比,*P<0.05,***P<0.001实验实例4对脑缺血模型的保护作用一、实验材料
NIH系小鼠,由广东省医学实验动物中心提供合格证号98A032,99A030;达纳康(Tanakan),由Ipsen公司生产,丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物C),或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物D),或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物E),或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物F),乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物G),丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物H),丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物I),戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物J);均由中山大学药学系药物化学实验室合成提供,使用时0.5%CMC-Na配成所需浓度液体。二、实验方法与结果
NIH小鼠称体重后,以戊巴比妥钠60mg·kg-1,麻醉,进行手术。将小鼠仰卧位固定,颈部正中切开皮肤约7mm,分离两侧颈总动脉,并套以“O”号丝线,缺血时用动脉夹夹闭双侧颈总动脉2min,造成大脑缺血状态,缺血结束,松开动脉夹,恢复血液再灌注,短时间歇5min,如此反复二次。阻断颈总动脉血流后,缝合切口。加上尾端放血,放血量为总血量的10%以下。术毕从腹腔内注入适量的生理盐水以补充血容量。假手术组麻醉后分离双侧颈总动脉但不阻断血流,亦不放血。
双侧颈总动脉完全阻断后,首先出现惊厥,体温降低,呼吸减慢,最后翻正反射消失。实验动物以体温降低和翻正反射消失为缺血阳性指标,无典型缺血指征者弃之不用。在缺血过程中、或手术后均会有动物死亡。恢复血液灌注后,动物翻正反射逐渐恢复,呼吸加快,3~5h基本恢复正常活动。手术后的动物随机分为11组:假手术组,化合物C,D,E,F,G,H,I,J组,达纳康组,空白组。每天给药一次,按表7剂量灌胃,连续给药10天。10天后进行记忆试验。表7对脑缺血再灌注损伤小鼠脑记忆避暗实验的作用(
x±s,n=10)组别 剂量 到达暗箱的潜伏期(秒) 错误次数
(mg·kg-1) 学习 记忆 (n)假手术组 - 32.7±12.1** 65.4±15.2*** 2.2±1.0***空白对照组 - 12.3±5.2 33.1±13.4 6.9±1.4化合物C组 4.5 24.4±17.3* 58.1±16.2*** 2.5±1.5***化合物D组 4.5 37.3±15.1*** 67.4±19.7** 1.2±1.0***化合物E组 4.5 24.1±16.0* 45.8±12.9* 3.1±2.7***化合物F组 4.5 28.7±11.8*** 46.5±13.8* 2.9±1.1***化合物G组 4.5 29.5±17.5* 47.5±15.7* 3.4±1.6***化合物H组 4.5 26.2±15.2* 56.0±17.2* 3.0±1.5***化合物I组 4.5 25.7±14.8* 46.5±13.8* 3.1±1.7***化合物J组 4.5 30.8±15.0*** 52.0±17.2* 3.2±1.6***达纳康组 31.2 23.1±8.7** 53.2±18.6* 3.3±1.3***与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;
从表7的结果显示,假手术组与空白组相比,进入暗箱的潜伏期明显延长,受电击次数明显减少(P<0.001),说明脑缺血再灌注对小鼠的学习记忆功能造成了明显损害。与空白对照组相比,受试化合物能够明显延长进入暗箱的潜伏期,同时能显著降低错误次数,对脑缺血造成记忆功能损伤具有保护作用。实验实例5对机体免疫功能的影响一、实验材料
NIH系小白鼠,实验动物合格证号:97A018,由广东省医学实验动物中心提供;
S.D.系大白鼠,实验动物合格证号:97A017,由广东省医学实验动物中心提供;家鸡,由中山大学菜市场购得;丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物C),或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物D),或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物E),或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物F),乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物G),丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物H),丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物I),戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物J);均由中山大学药学系药物化学实验室合成提供,使用时0.5%CMC-Na配成所需浓度液体。二、实验方法
对小鼠胸腺和脾脏的作用
选择健康NIH系小鼠90只,18~22g,雌雄各半,每只实验时腹腔注射环磷酰胺60mg/Kg体重,随机分成9组,每组10只,雌雄各半,即空白对照组,化合物C,D,E,F,,G,H,I,J组。灌胃给受试样品,给受试样品剂量见表8,连续给受试样品30d,第30d各组小鼠禁食一天,但提供饮水。第31d,处死各组小鼠,称量各组小鼠的体重,胸腺及脾脏重量,计算胸腺指数及脾脏指数,比较各组间的差异。三、实验结果表8 对小鼠胸腺和脾脏的作用(
x±SD,n=10)项目 剂量 胸腺指数 脾脏指数组别 (mg/kg) (mg/10g体重) (mg/10g体重)空白对照组 I%CMC 11.06±3.21 42.42±8.31化合物C 10 18.98±2.32*** 57.55±11.23**化合物D 10 25.59±3.70*** 103.47±13.40***化合物E 10 20.22±2.75*** 68.20±9.82***化合物F 10 16.24±3.31*** 75.24±15.48***化合物G 10 18.39±3.24*** 80.22±17.33***化合物H 10 19.75±3.06*** 72.30±11.17***化合物I 10 16.44±3.25*** 69.60±16.10***化合物J 10 17.24±3.34*** 61.29±15.34**与空白对照组相比, **P<0.01,**P<0.01。
从表8所示小鼠免疫器官重量实验结果可知,与空白对照组相比,化合物C,D,E,F,G,H,I,J组小鼠胸脾指数及小鼠脾脏脂数能够显著升高。实验实例6对骨质疏松的药理作用一、实验材料1.1动物
SD系大鼠,雌雄各半,体重(196±47.3)g,由广东省医学实验动物中心提供。1.2药品与试剂
丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物C),或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物D),或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物E),或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物F),乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物G),丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物H),丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物I),戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物J);均由中山大学药学系药物化学实验室合成提供;维甲酸,重庆华邦制药有限公司,批准文号(95)卫药准字X-140号,批号991201。罗钙全,上海罗氏制药有限公司,批准文号(96)卫药准字J-88-3(1)号,批号B1063。以上药品试剂临用前用0.5%CMC-Na配制成混悬液。1.3仪器
XSP-BM生物显微镜,由上海光学仪器六厂制造。Panasonic彩色闭路监控摄象机,由MatushitaElectric Industrial Co.Ltd制造。创格图象分析软件,由中青旅创格科技集团公司设计。IRIS Advantage(HR)等离子体发射光谱仪(中山大学测试中心提供)由Thermo Jarrell Ash Corporation,U.S.A.制造。二、实验方法2.1维甲酸诱导大鼠骨质疏松模型
选取大鼠88只,体重(196±47.3)g,雌雄各半,随机分成11组。分为正常空白组(空白组)、维甲酸模型组(模型组)、阳性药物对照组(罗钙全组)、受试化合物C,D,E,F,G,H,I,J给药组。除正常空白组灌服0.5%CMC-Na溶液10ml.Kg-1体重外,各组大鼠每天上午灌服维甲酸70mg.Kg-1体重,下午各组大鼠相应灌服受试物。连续给药30天后,处死大鼠,取大鼠右股骨。2.2股骨骨组织计量学观察与测量
取右股骨相同部位组织块,常规脱钙,石蜡包埋,HE染色。在普通光学显微镜下观察,将所有图象经摄象机模数转换后输入主机,经图象分析软件处理可得到如下参数指标:相对胃体积,指骨小梁占骨髓腔的百分比,1.25×10×4倍;平均骨小梁宽度,1.25×10×10倍;单位面积骨小梁内骨细胞数,用图象分析软件采集同样面积骨小梁的图象(640×480),计算相应区域内的骨细胞数,1.25×10×40倍;平均骨细胞陷窝长度,1.25×10×40倍;平均骨细胞陷窝宽度,1.25×10×40倍。以上5个静态指标参数,均观察10个视野,求其均值。
表9对维甲酸诱导大鼠骨质疏松模型的股骨病变的影响,n=8,x±s
组别 |
相对骨体积/% |
单位面积骨小梁内细胞数 |
平均骨小梁宽度/μm |
空白组模型组罗钙全组化合物C组化合物D组化合物E组化合物F组化合物G组化合物H组化合物I组化合物J组 |
38.57±3.25***22.63±3.1536.72±7.82***38.94±3.73***41.55±4.38***35.87±3.12***37.14±3.46***34.37±3.27***38.31±3.55***29.84±3.56***37.55±3.26*** |
15.75±4.21*12.71±4.3619.27±3.89**19.50±5.54*20.70±5.27***19.35±3.13**26.31±3.16***25.84±3.31***35.69±3.70***31.84±3.94***29.84±3.16*** |
68.61±10.21**44.91±18.7267.16±13.11**72.69±10.38***70.76±8.56***68.66±9.80***74.67±3.56***69.67±3.15**60.84±4.81*61.37±4.71*67.84±4.68* |
与模型组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
从表9所示维甲酸诱导大鼠骨质疏松实验结果可知,与模型组相比,化合物C,D,E,F,G,H,I,J能够有效提高相对骨体积、单位面积骨小梁内细胞数、平均骨小梁宽度,提示受试化合物具有治疗骨质疏松作用。实验实例7对肾功能衰竭的作用一、实验材料
1.1动物:NIH小鼠,18-22g,雌雄各半,由广东省医学实验动物中心提供。
1.2试剂:内毒素,Sigma ChemicaI Com.;丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物C),或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物D),或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物E),或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物F),乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物G),丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物H),丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物I),戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羟基)二酯(代号化合物J);均由中山大学药学系药物化学实验室合成提供,使用前用0.5%CMC-Na配制成所需液体。二、实验方法
内毒素致动物急性肾衰模型
选取小鼠100只,随机分为10组,分别正常对照组、病理模型组、受试化合物C、D、E、F、G、H、I、J组,各组分别腹腔注射给予受试物或同体积溶媒(0.5%CMC-Na)后,立即尾静脉注射内毒素0.06g/kg(正常对照组注射等量的生理盐水)。5h后,小鼠摘眼球取血,测定血清尿素氮(BUN)和肌肝(Cr)浓度。取各小鼠一只肾分别制成100ml·L-1匀浆,测定谷胱甘肽过氧化物酶(GS H-Px)活性。三、实验结果
从表10所示急性肾功能衰竭实验结果可知,与病理模型组相比,化合物C,D,E,F,G,H,I,J能够有效抑制因内毒素致小鼠血清BUN、Cr值升高,提高GSH-Px酶活性,对内毒素致动物急性肾衰具有保护作用。表10 受试化合物对急性肾功能衰竭的作用(
x±SD,n=10)项目 剂量 Cr/10mg.L-1 BUN/10mg.L-1 GSH-Px/nU.L-1组别 (mg/kg)正常对照组 0.5%CMC 12.28±2.53*** 182.5±26.9*** 45.5±18.7***病理模型组 0.5%CMC 59.23±13.15 485.8±34.7 19.3±8.4化合物C组 10 37.99±8.74*** 387.0±40.2*** 29.8±11.6*化合物D组 10 29.31±7.94*** 295.5±36.0*** 38.4±15.0**化合物E组 10 32.86±8.07*** 315.9±40.8*** 32.0±14.4*化合物F组 10 38.31±9.69*** 377.1±38.1*** 35.2±12.8*化合物G组 10 40.42±10.94*** 412.2±40.5*** 31.8±12.3*化合物H组 10 35.78±7.26*** 366.0±30.2*** 35.6±10.7*化合物I组 10 34.41±9.65*** 344.4±40.6*** 37.6±15.1***化合物J组 10 37.60±8.44*** 337.6±32.8*** 32.2±13.1**与病理模型组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.
本发明上述实验例说明式I化合物在治疗心律失常、心肌缺血、脑缺血、免疫功能低下、骨质疏松、肾衰等方面同样具有显著的治疗效果,可用于制备治疗心律失常、心肮缺血、脑缺血、骨质疏松、肾衰以及增强机体免疫力的药物。