CN115518155B - 一种胃酸响应性的活性氧纳米发生器的制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种胃酸响应性的活性氧纳米发生器的制备及其应用。该纳米发生器能够在胃酸环境快速解离并产生大量活性氧，能在20分钟内快速杀灭幽门螺杆菌并根除生物膜。其体内治疗效果与标准的基于抗生素的三联疗法相当，但具有更好的生物安全性，该纳米颗粒及其降解产物对共生菌没有毒性，不会伤害哺乳动物细胞和正常肠道菌群，在体内的副作用小于三联疗法。此外该纳米发生器相对于非纳米粒药物具有更长的滞留时间，而且重复使用也不会导致全身毒性和血液中Fe积累，还可进一步结合体外超声来提高去除幽门螺杆菌的效率，联合声动力学(SDT)和化学动力学(CDT)法，为抗菌感染提供了更好的选择。

Description

一种胃酸响应性的活性氧纳米发生器的制备及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种胃酸响应性的活性氧纳米发生器的制备及其应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染被广泛认为是胃病的主要病因，与慢性胃炎、消化性溃疡、肠型胃癌等多种疾病密切相关。在对H.pylori感染的有效预防和治疗中，临床上通常采用抗生素进行治疗如三联或四联法，但以抗生素为基础的疗法由于抗生素的耐药性和胃酸对抗生素的降解，会致使其疗效不断下降；此外，基于抗生素的使用会坏肠道菌群的平衡，引发更多疾病的发生。因此，迫切需要能够在不伤害共生菌的情况下，开发出新的、疗效更佳、安全性更高的治疗幽门螺杆菌感染的方法。
目前，对于细菌感染的治疗方法中，声动力疗法(SDT)是一种很有前途的非侵入性治疗方法，它利用声敏剂在超声条件下产生1O2杀死肿瘤细胞或病原微生物。由于超声波具有高组织穿透深度特性和安全性，SDT已被研究并应用于治疗包括细菌感染在内的多种疾病。因为细菌细胞比哺乳动物细胞更容易受到ROS的影响，细菌对由外源性活性氧(ROS)如单线态氧(1O2)和羟基自由基(·OH)引起的氧化损伤高度敏感。由于细菌感染后，往往会在感染部位形成生物膜，细菌生物膜内部通常是缺氧的，而氧气对于SDT产生1O2至关重要，因此生物被膜的缺氧条件极大地限制了SDT的治疗效果，难以用于H.pylori感染的治疗。
除SDT外，化学动力学疗法(CDT)是另一种使用ROS消除细菌细胞的治疗方法。CDT通常基于过氧化氢(H2O2)与金属离子(如亚铁离子)之间发生的芬顿(Fenton)或类芬顿(Fenton-like)反应生成·OH。亚铁具有的类过氧化物酶性质可以将感染部位的内源性H2O2转化为高反应性的·OH，从而导致病原体死亡。但CDT多用于肿瘤的治疗研究，并未见其能够用于抗H.pylori感染；且目前也鲜少采用SDT或CDT用于治疗H.pylori感染。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种胃酸响应性的活性氧纳米发生器的制备及其应用。
本发明的目的是提供一种胃酸响应性的活性氧纳米发生器。
本发明另一目的是提供所述胃酸响应性的活性氧纳米发生器的制备方法。
本发明又一目的是提供所述胃酸响应性的活性氧纳米发生器的应用。
本发明再一目的是提供一种抗幽门螺杆菌感染的产品
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供的一种胃酸响应性的活性氧(ROS)纳米发生器，其具有pH响应性和类过氧化物酶活性，以实现对H.pylori感染的选择性抗菌能力。ROS纳米发生器为核壳结构的纳米颗粒，核为有机声敏剂和铁离子形成的介孔纳米粒子，纳米粒子介孔中负载具有过氧桥结构的物质，壳为多酚类物质。首先通过配位作用制备了由有机声敏剂和铁离子组成的金属有机纳米核结构，然后负载具有过氧桥结构的物质作为Fenton/Fenton-like反应的过氧化氢源，再采用多酚类物质与Fe(III)形成多酚-金属多酚网络(MPN)壳，得到ROS纳米发生器。
其中，利用有机声敏剂中卟啉类似物上的活性官能团如羧基官能团等与Fe(III)配位形成金属有机配合物。之后，借助多酚类物质中的邻苯二酚结构与Fe(III)的配位，赋予了纳米颗粒铁Fe(II)的性质，使纳米颗粒具有类过氧化物酶活性，有利于催化Fenton反应发生，进而产生氧气。而多酚类物质中具有的邻苯二酚基团与Fe(III)之间形成配位键，可以在酸性环境下解离；铁离子与有机声敏剂之间的配位键在酸性条件下也会由于Fe-O的断裂而解离，因此具有pH响应性；解离的多酚类物质将Fe(III)还原为Fe(II)，Fe(II)催化位于H.pylori感染部位或生物膜微环境中的H2O2生成·OH，使其具有化学动力学活性，可以显著增强细胞内ROS生成。酸性环境中，从纳米发生器释放的具有过氧桥结构的物质可以保证其能持续产生ROS，即便是在H2O2不足的感染微环境中，也可通过Fenton反应与Fe(II)反应生成·OH，实现强大的化学动力学活性，从而消除H.pylori。而类过氧化物酶催化H2O2产生的氧气将缓解缺氧，并进一步增强SDT效果。此外，ROS纳米发生器的类过氧化物酶样活性在肠道的中性条件下会受到抑制，在非酸性条件下对正常肠道菌群没有表现出明显毒性。因此，级联催化纳米发生器能够协同SDT-CDT，以对抗H.pylori感染。
特别地，只要是具有活性官能团能够与铁离子发生配位的卟啉类似物都能用于本发明ROS纳米发生器的制备。同理，只要是具有过氧桥结构的物质，能够在酸性条件下被亚铁Fe(II)催化生成自由基，也能用于本发明ROS纳米发生器的制备。同理，只要是具有邻苯二酚结构的多酚类物质，能够与铁离子发生配位，都能用于本发明ROS纳米发生器的制备。
优选地，所述有机声敏剂为卟啉类似物。
进一步优选地，所述卟啉类似物血卟啉单甲醚、原卟啉、原卟啉二甲酯、次卟啉、次卟啉二甲酯、中介四苯基卟吩、中介四(4-羧基苯基)卟吩、焦脱镁叶绿酸-a、紫红素-18、二氢卟吩中的一种。
更优选地，所述有机声敏剂采用血卟啉单甲醚(HMME)。
优选地，所述多酚类物质选自单宁酸、表没食子儿、原儿茶酸、没食子酸、二羟基苯甲醛中的一种。
更优选地，所述多酚类物质采用单宁酸(TA)。
优选地，所述具有过氧桥结构的物质为双氢青蒿素。
优选地，所示有机声敏剂和铁离子的质量比为0.5～1:1～2。
更优选地，有机声敏剂和铁离子的质量比为1:2。
优选地，所述胃酸响应性的活性氧(ROS)纳米发生器的粒径50～200nm。
本发明提供活性氧纳米发生器的制备方法，包括如下步骤：
S1.将有机声敏剂溶液与含铁离子溶液混匀，黑暗条件下超声反应，离心，收集沉淀，洗涤后即得Fe-有机声敏剂纳米颗粒；
S2.将步骤S1得到的Fe-有机声敏剂纳米颗粒分散得悬浮液，再加入含具有过氧桥结构物质溶液，混匀反应，蒸发，离心后得负载具有过氧桥结构物质的Fe-有机声敏剂纳米颗粒；
S3.将多酚类物质水溶液加入步骤S2得到的负载具有过氧桥结构物质的Fe-有机声敏剂纳米颗粒悬浮液中，混合、洗涤、离心，去除多余的多酚类物质和Fe(III)，即得活性氧纳米发生器。
作为一种最优选地的可供选择的具体提取方案，ROS纳米发生器的制备方法如下：
S1.将有机声敏剂溶于甲醇/三乙胺溶液中，加入含铁离子的甲醇/DMF溶液，24～26℃磁力搅拌1～3h；在黑暗条件下，30～50kHz超声3～5h，搅拌8～16h，离心，收集沉淀，洗涤后即得Fe-有机声敏剂纳米颗粒；
S2.将步骤S1得到的Fe-有机声敏剂纳米颗粒分散于乙醇中得悬浮液，然后将具有过氧桥结构物质溶于乙醇/水后加入悬浮液中，24～26℃磁力搅拌12～36h，蒸发，离心后得负载具有过氧桥结构物质的Fe-有机声敏剂纳米颗粒。
S3.将多酚类物质水溶液加入步骤S2得到的负载具有过氧桥结构物质的Fe-有机声敏剂纳米颗粒悬浮液中，经过涡旋混合、洗涤、离心，再分散去除多余的多酚类物质和Fe(III)，最终得到活性氧纳米发生器。
优选地，采用甲醇/三乙胺溶液(v/v＝45-99:1-5)，甲醇/DMF溶液(v/v＝70-90:10-30)，乙醇/水(1mL，v/v＝2-5:1)。
更优选地，采用甲醇/三乙胺溶液(v/v＝49:1)，甲醇/DMF溶液(v/v＝85:15)，乙醇/水(1mL，v/v＝3:1)。
优选地，步骤S3中多酚类物质水溶液与负载具有过氧桥结构物质的Fe-有机声敏剂纳米颗粒的终浓度比例为0.5～2:0.5～2。
更优选地，多酚类物质水溶液与负载具有过氧桥结构物质的Fe-有机声敏剂纳米颗粒的终浓度比例为1:1。
本发明提供活性氧纳米发生器在制备抗幽门螺杆菌感染产品中的应用。
特别地，本发明提供的ROS纳米发生器对于其他细菌理论上也具有一定的抑菌效果，采用活性氧纳米发生器能抗强酸性条件下的幽门螺杆菌，其效果显著，生存条件为，而对于弱酸性条件下的其他细菌(其自身不耐强酸)也具有一定的抗菌效果。
本发明提供一种抗幽门螺杆菌感染的产品，含所述活性氧纳米发生器。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种胃酸响应性活性氧纳米发生器。所述胃酸响应性活性氧纳米发生器能够在胃酸环境快速解离并产生大量活性氧，能在20分钟内快速杀灭幽门螺杆菌并根除生物膜(biofilm)，是目前包括抗生素在内的常规药物和治疗方法所不能达到的。其体内治疗效果与标准的基于抗生素的三联疗法相当，但具有更好的生物安全性，该纳米发生器及其降解产物对共生菌没有毒性，不会伤害哺乳动物细胞和正常肠道菌群，在体内的副作用小于三联疗法。此外该纳米发生器相对于非纳米粒药物具有更长的滞留时间，而且重复使用也不会导致全身毒性和血液中Fe积累。
此外，本发明提供的纳米发生器对耐药菌和药物敏感菌株均具有良好的抗菌作用，有望克服幽门螺杆菌的耐药性。该纳米发生器可进一步结合体外超声来提高去除幽门螺杆菌并根除生物膜的效率，通过联合声动力学(SDT)和化学动力学(CDT)法，实现对幽门螺杆菌感染的高效安全的治疗，为抗菌感染提供了更好的选择。
附图说明
图1为催化ROS纳米发生器Fe-HMME@DHA@MPN的制备流程(a)和作用机制图(b)。
图2为Fe-HMME@DHA@MPN的表征结果图；(a)Fe-HMME纳米粒和Fe-HMME@DHA@MPN纳米粒的透射电镜图像，白色箭头代表介孔结构；(b)纳米粒子Fe-HMME、Fe-HMME@DHA和Fe-HMME@DHA@MPN的流体动力学尺寸和(c)ζ电位，n＝3，数据表示为平均值±标准差；(d)Fe-HMME的N2吸附-脱附等温线及相应的孔径分布；(e)纳米粒子Fe-HMME和Fe-HMME@DHA的紫外-可见吸收光谱；(f)Fe-HMME@DHA@MPN纳米粒的元素分布；(g)Fe-HMME和Fe-HMME@MPN的傅里叶红外光谱；(h)Fe-HMME@MPN中Fe 2p的XPS测量光谱；(i)Fe-HMME@MPN在pH 7.4或2.2的缓冲溶液中孵育不同时间(5分钟和30分钟)的透射电镜图像。
图3为Fe-HMME@DHA@MPN的ROS产生能力结果图；(a)紫外-可见漫反射光谱测量HMME、Fe-HMME和Fe-HMME@MPN的声动力活度和能带示意图；(b)SOSG溶液与不同样品孵育后的荧光光谱(US表示超声处理)；(c)氧传感器检测到的不同样品的氧气生成量；(d)不同样品孵育条件下，亚甲基蓝(MB，10μg/mL)的紫外可见吸收光谱；(e)过氧化物酶底物(TMB，120μg/mL)与不同样品在不同条件下孵育的紫外-可见吸收光谱；(f)细胞内荧光ROS探针DCFH-DA染色的共聚焦图像(标尺为5μm)和(g)荧光光谱。
图4为Fe-HMME@DHA@MPN对幽门螺杆菌的体外抗菌活性结果图；(a)Fe-HMME@DHA@MPN与幽门螺杆菌(ATCC：43504)在PBS中孵育的图片；(b)Fe-HMME@DHA@MPN(紫色荧光来自HMME)与幽门螺杆菌孵育的共聚焦显微镜图像，SYTO9染色(绿色)；(c)在pH为2.2的模拟胃液中，用Fe-HMME@DHA@MPN(40μg/mL)在不同条件下孵育20min，对剩余幽门螺杆菌细菌定量，点线表示检测限；(d)不同条件下，不加或加Fe-HMME@DHA@MPN(40μg/mL)孵育20min后，幽门螺杆菌活(绿色)/死(红色)染色试剂盒的荧光图像，比例尺：20μm；(e)不同条件下Fe-HMME@DHA@MPN(40μg/mL)处理20min幽门螺杆菌的SEM图像，比例尺：3μm，插入部分为选定区域的放大图像(插图：0.5μm)；(f)Fe-HMME@DHA@MPN对不同来源的幽门螺杆菌(ATCC:43504、ATCC:700392、CSO1、LQ2#)的最小杀菌浓度(MBC)，US：超声波处理，S：药物敏感，R：耐药，MTZ：甲硝唑，CLR：克拉霉素，AMO：阿莫西林，LEFT：左氧氟沙星。
图5为Fe-HMME@DHA@MPN对幽门螺杆菌的抗生物膜活性结果图；(a)超声处理示意图；(b)对成熟幽门螺杆菌(ATCC：43504)生物膜的清除作用，不同浓度的Fe-HMME@DHA@MPN分别在超声和不超声孵育20分钟，之后使用结晶紫染色表征生物膜量(n＝6)；(c)幽门螺杆菌生物膜被Fe-HMME@DHA@MPN(128μg/mL)处理20min后，用活/死染色试剂盒染色的激光共聚焦显微镜的Z-Stack图像。
图6为Fe-HMME@DHA@MPN对幽门螺杆菌(ATCC：43504)感染的体内治疗作用结果图及体外安全性评价结果图；(a)BALB/c小鼠体内幽门螺杆菌感染和治疗的示意图(PBS：磷酸盐缓冲盐水，CDT：Fe-HMME@DHA@MPN，SDT：Fe-HMME+US，CDT+SDT：Fe-HMME@DHA@MPN+US，OAC：奥美拉唑、阿莫西林和克拉霉素联合)；(b)胃部幽门螺杆菌细菌涂板图像和(c)感染小鼠胃内菌落定量结果，点线表示检测限(n＝6)。P值通过two-tailed Student’s t-test计算得到:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。；(d)尿素酶实验用来评估不同治疗组中幽门螺杆菌感染的严重程度；(e)不同治疗组小鼠胃黏膜组织切片的革兰氏染色图像，红色箭头指向细菌；(f)用不同浓度的Fe-HMME@DHA@MPN或其降解产物处理24h后GES-1(人胃黏膜上皮细胞)细胞的活力；(g)用不同浓度的Fe-HMME@DHA@MPN纳米粒子处理24h后HUVEC(人脐静脉血管内皮细胞)细胞的活力；(h)E.coli和E.aerogenes(1×108CFU mL-1)经过或不经过Fe-HMME@DHA@MPN纳米颗粒或其降解产物(100μg mL-1)处理6小时后图板培养24h后的代表性菌落照片；(i)使用或不使用Fe-HMME@DHA@MPN纳米粒子或其降解产物(100μg mL-1)处理6小时后，对大肠杆菌和产气肠杆菌(1×108CFU mL-1)进行菌落定量。
图7为Fe-HMME@DHA@MPN对胃部的损伤及体内安全性评价结果图；(a)未感染小鼠胃黏膜经PBS、CDT+SDT、OAC处理后切片并进行H&E染色，黑色箭头表示粘膜底部和粘膜下层有炎症细胞浸润；(b)根据图7a的H&E染色图像分析得到的炎症评分；(c)用PBS、CDT+SDT或OAC治疗后的小鼠体重(对照：100μL磷酸盐缓冲盐水，CDT+SDT：30mg kg–1的Fe-HMME@DHA@MPN+US，OAC：组合400μmol kg-1的奥美拉唑、28.5mg kg-1的阿莫西林和14.3mg kg-1的克拉霉素)；(d)特定处理后小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的H&E染色图像(对照：100μL磷酸盐缓冲盐水，CDT+SDT：30mg kg–1的Fe-HMME@DHA@MPN+US，OAC：400μmol kg-1的奥美拉唑、28.5mg kg-1的阿莫西林和14.3mg kg-1的克拉霉素)；(e)灌胃Fe-HMME@DHA@TA纳米颗粒或三联抗生素治疗OAC的小鼠血清生化分析。数据为平均值±标准偏差(n＝6)，P值通过two-tailed Student’s t-test计算得到:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；
图8为Fe-HMME@DHA@MPN和标准三联疗法对对肠道菌群的影响结果图；(a)基于胃酸响应性的Fe-HMME@DHA@MPN对幽门螺杆菌具有杀菌作用，而不会影响小鼠肠道菌群平衡的机理示意图；(b)小鼠在Fe-HMME@DHA@MPN或者标准三联疗法处理后肠道和粪便中16srRNA的基因水平；小鼠肠道和粪便中微生物α-多样性的区系丰富度：(c)Chao 1多样性、(d)Shannon指数和(e)Simpson指数；(f)采用16s rRNA测序法测定小鼠粪便和肠道菌落的绝对丰富度；(g)16s rRNA测序测定小鼠粪便中菌落结构的相对丰富度，数据是平均值±标准偏差(n＝3)，P值通过two-tailed Student’s t-test计算得到:*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例所采用药物：血卟啉单甲醚(HMME)购于源叶生物有限公司；三氯化铁、三乙胺、N,N二甲基甲酰胺(DMF)、双氢青蒿素(DHA)、单宁酸(TA)等试剂均购于阿拉丁生化有限公司；脑心浸出液肉汤(BHI)和哥伦比亚血平板购于广州环凯生物。
采用菌株：本实验使用的幽门螺杆菌(H.pylori)菌株编号为ATCC No.43504和ATCC No.700392，来源于American Type Culture Collection(ATCC，美国)。LQ2#和CSO1来源于临床分离菌，由姚美村教授(中山大学，深圳)授予。大肠杆菌(E.coli，ATCC No.25922)和产气肠杆菌(E.aero，ATCC No.13048)来源于American Type Culture Collection(ATCC，美国)。
采用实验动物：本研究采用BALB/c小鼠(6-8周，雄性，体重20-25克，SPF级)作为动物实验对象，购买自Gempharmatech Co.,Ltd.，动物生产许可证号：SCXK(浙)2019-0001，动物合格证编号：20220112Abzz0619000578。实验期间小鼠可自由饮水，饲养于洁净区。
实施例1ROS纳米发生器的制备
采用5mg HMME溶于甲醇/三乙胺溶液(10mL，v/v＝45:1)中，然后加入含10mgFeCl3的甲醇/DMF溶液(10mL，v/v＝70:10)，24℃磁力搅拌1h。在黑暗中，用30kHz的超声清洗仪将混合物超声3h，然后搅拌8h。随后，通过离心(15000g，20分钟)收集Fe-HMME纳米颗粒，用乙醇/DMF(5mL，v/v＝70:10)洗涤3次。
将合成的Fe-HMME纳米颗粒(3mg)分散在1.5mL的乙醇中。然后将DHA(3mg)溶于乙醇/水(1mL，v/v＝2:1)中，加入Fe-HMME纳米颗粒悬浮液中，24℃下磁力搅拌12h。蒸发除去全部乙醇后，通过离心得到Fe-HMME@DHA纳米颗粒。
将40mg/mL单宁酸(TA)水溶液加入Fe-HMME@DHA水悬浮液中，使得二者最终浓度分别为Fe-HMME@DHA(0.4mg/mL)和TA(0.4mg/mL)。用涡旋混合器将悬浮液大力混合15分钟。纳米颗粒用Milli-Q水洗三次，离心/再分散去除多余的TA和Fe(III)，得到的Fe-HMME@DHA@MPN再分散在1mL Milli-Q水中。
实施例2ROS纳米发生器的制备
采用5mg HMME溶于甲醇/三乙胺溶液(10mL，v/v＝99:5)中，然后加入含10mgFeCl3的甲醇/DMF溶液(10mL，v/v＝90:30)，25℃磁力搅拌3h。在黑暗中，用40kHz的超声清洗仪将混合物超声5h，然后搅拌16h。随后，通过离心(15000g，20分钟)收集Fe-HMME纳米颗粒，用乙醇/DMF(5mL，v/v＝90:30)洗涤3次。
将合成的Fe-HMME纳米颗粒(3mg)分散在1.5mL的乙醇中。然后将DHA(3mg)溶于乙醇/水(1mL，v/v＝5:1)中，加入Fe-HMME纳米颗粒悬浮液中，25℃下磁力搅拌24h。蒸发除去全部乙醇后，通过离心得到Fe-HMME@DHA纳米颗粒。
将40mg/mL单宁酸(TA)水溶液加入Fe-HMME@DHA水悬浮液中，使得二者最终浓度分别为Fe-HMME@DHA(0.4mg/mL)和TA(0.4mg/mL)。用涡旋混合器将悬浮液大力混合15分钟。纳米颗粒用Milli-Q水洗三次，离心/再分散去除多余的TA和Fe(III)，得到的Fe-HMME@DHA@MPN再分散在1mL Milli-Q水中。
实施例3ROS纳米发生器的制备
采用5mg HMME溶于甲醇/三乙胺溶液(10mL，v/v＝49:1)中，然后加入含10mgFeCl3的甲醇/DMF溶液(10mL，v/v＝85:15)，26℃磁力搅拌2h。在黑暗中，用40kHz的超声清洗仪将混合物超声4h，然后搅拌10h。随后，通过离心(15000g，20分钟)收集Fe-HMME纳米颗粒，用乙醇/DMF(5mL，v/v＝85:15)洗涤3次。
将合成的Fe-HMME纳米颗粒(3mg)分散在1.5mL的乙醇中。然后将DHA(3mg)溶于乙醇/水(1mL，v/v＝3:1)中，加入Fe-HMME纳米颗粒悬浮液中，26℃下磁力搅拌24h。蒸发除去全部乙醇后，通过离心得到Fe-HMME@DHA纳米颗粒。
将40mg/mL单宁酸(TA)水溶液加入Fe-HMME@DHA水悬浮液中，使得二者最终浓度分别为Fe-HMME@DHA(0.4mg/mL)和TA(0.4mg/mL)。用涡旋混合器将悬浮液大力混合15分钟。纳米颗粒用Milli-Q水洗三次，离心/再分散去除多余的TA和Fe(III)，得到的Fe-HMME@DHA@MPN再分散在1mL Milli-Q水中。
实施例4ROS纳米发生器的性能表征
1、试验方法
根据实施例3中ROS纳米发生器的制备，分别通过透射电镜图像、流体动力学尺寸和ζ电位、对N2吸附-脱附等温线及相应的孔径分布、紫外-可见吸收光谱、纳米粒的元素分布、高角环形暗场扫描透射电子显微镜、傅里叶红外光谱以及Fe 2p的XPS测量光谱，从ROS纳米发生器纳米形态、表面性质、介孔结构、化学组成、稳定性和pH响应释放性能等方面对制备得到的Fe-HMME纳米颗粒、Fe-HMME@DHA纳米颗粒以及ROS纳米发生器Fe-HMME@DHA@MPN进行表征。
分别将制备的Fe-HMME和Fe-HMME@DHA@MPN分散于水溶液中，浓度为10μg mL-1。分别取10μL液体滴加到铜网上，待液体挥干。将铜网置于透射电镜样品槽内观察纳米粒子形态。
分别将制备的Fe-HMME和Fe-HMME@DHA@MPN分散于水溶液中，浓度为10μg mL-1。将纳米粒水溶液加入比色皿中，将比色皿置于纳米粒度仪中，对其水合粒径进行测定，ζ电位通过将配置好的含纳米粒的水溶液置于带电极的比色皿中进行电位测定。
取100mg Fe-HMME@DHA@MPN粉末进行脱气除杂后装入样品管，进行吸附量/脱附量的测量，得到的曲线即为吸附/脱附等温线。吸附平衡等温线以相对压力(P/P0)为横坐标，恒温条件下单位重量固体吸附剂所吸附的吸附质的量或体积为纵坐标的曲线。其中P为气体的真实压力，P0为气体在测量温度的饱和蒸气压。
分别将制备的Fe-HMME和Fe-HMME@DHA分散于水溶液中，浓度为20μg mL-1。其中将二者与0.2％NaOH在50℃孵育30min后，将溶液置于石英比色皿中，设定扫描波长范围为200-700nm，得到其紫外光谱。
分别将制备的Fe-HMME和Fe-HMME@DHA@MPN分散于水溶液中，浓度为10μg mL-1。分别取10μL液体滴加到铜网上，待液体挥干。将铜网置于扫描透射电子显微镜下分析纳米粒的元素组成。
将纳米粒粉末制备成规格尺寸为1×1×0.5cm大小，取样时避免手和取样工具接触到需要测试的位置，使用X射线光电子能谱分析纳米粒表面元素化学态。
2、结果
本发明制备得到的ROS纳米发生器简易制备过程(图1a)以及作用机制(图1b)如图1所示，ROS纳米发生器的表征结果如图2所示，通过透射电镜图像显示，本发明制备的Fe-HMME呈相对均匀的球形形态，平均直径约为50nm，带少量正电荷(2a-2c)。Fe-HMME具有良好的介孔结构，比表面积为64.3m2/g，孔体积为0.32cm3/g，平均孔径为3.05nm(图2d)，有利于载药。
通过共孵育将DHA加载到Fe-HMME中，紫外-可见光谱290nm处的特征峰证实了DHA的成功加载(图2e)。计算得出DHA在Fe-HMME中的负载能力为0.302mg/mg。DHA的高负载能力可能是由于DHA与Fe-HMME之间的静电作用(图2c)，以及Fe-HMME的介孔结构(图2d)。
然后用TA与Fe-HMME@DHA中的Fe(III)配位包覆Fe-HMME，形成多酚-金属网络(MPN)壳，得到Fe-HMME@DHA@MPN。TA涂层使颗粒尺寸增大(～80nm)，表面负电位增强(-11.03mM)(图2a-2c)。从高角环形暗场扫描透射电子显微镜(HAADF-STEM)图像(图2f)可以看出，最终产物Fe-HMME@DHA@MPN具有均匀分布的C、N、O和Fe元素结构。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)证实了单宁酸包覆的Fe-HMME中MPN的形成(图2g)。由于TA的多酚基团与Fe-HMME的Fe(III)之间形成了配位键，原本与Fe(III)结合的部分羧基暴露出来，导致1710cm-1处出现羧基拉伸带，1427cm-1处出现剩余的羧基拉伸带。1612和597cm-1附近的吸收带则分别由TA的C＝O拉伸和Fe-O晶格振动引起，这也证实了TA与Fe(III)之间的相互作用。
Fe-HMME@MPN构建成功后，通过x射线光电子能谱分析高分辨率Fe 2p谱(图2h)分析了对CDT至关重要的Fe元素的氧化还原状态。在高分辨率的Fe 2p谱中，观察到Fe(II)2p3/2、Fe(III)2p3/2、Fe(II)2p1/2和Fe(III)2p1/2的峰和一个卫星特征峰。Fe-HMME@MPN中Fe的氧化还原状态分析显示，Fe-HMME中有19.5％的峰面积为亚铁Fe(II)，说明TA中邻苯二酚结构与铁Fe(III)的配位反应表现出了亚铁Fe(II)性质。MPN结构中的Fe(II)赋予了纳米颗粒还原性，有利于纳米颗粒的类过氧化物酶活性，有利于催化Fenton反应发生。除此之外，MPN涂层还提高了Fe-HMME的稳定性。
由于Fe(III)与HMME或TA之间的配位键在酸性条件下会由于Fe-O的断裂而解离，得到的Fe-HMME@DHA@MPN在酸性条件下(如胃中)会降解。在酸性溶液(pH 2.2)下，Fe-HMME@DHA@MPN在30分钟内观察到明显的降解，并在60分钟内完全降解(图2i)。同时，Fe-HMME@DHA@MPN在中性条件下保持60min基本不变。在酸性条件下Fe-HMME@DHA@MPN的降解会导致包裹在纳米颗粒中的DHA的pH响应释放。MPN涂层在生理条件下可防止DHA非控制释放，而在酸性条件下可触发DHA的释放，有利于在胃内的控释。
实施例5ROS产生能力分析
1、试验方法
在确定了本发明制备得到的Fe-HMME@DHA@MPN的介孔结构、化学组成、稳定性和pH响应释放性能后，分析其生成ROS的能力。由于本发明采用的有机声敏剂HMME，能在超声作用下利用O2产生1O2，因此测定了HMME、Fe-HMME和Fe-HMME@MPN在超声作用下的带隙，反映了其产生ROS的能力。
分别将样品槽中加入适量的HMME、Fe-HMME和Fe-HMME@MPN粉末，然后用盖玻片将粉末压实，使得粉末填充整个样品槽，并压成一个平面。用积分球进行测试紫外可见漫反射(UV-VisDRS)，然后将样品放入到样品卡槽中进行测试，得到紫外可见漫反射光谱。测试完一个样品后，重新制样，继续进行测试。根据(αhv)1/n＝A(hv-Eg)，其中α为吸光指数，h为普朗克常数，v为频率，Eg为半导体禁带宽度，A为常数。利用UV-Vis DRS数据分别求(αhv)1/n和hv＝hc/λ,c为光速，λ为光的波长。得到各个样品带隙数值。
为评估Fe-HMME@MPN的SDT性能，使用单线态氧探针(Singlet Oxygen SensorGreen,SOSG)试剂检测水溶液中的1O2(常氧组pH为7.0，乏氧组pH为4.0)。在Fe-HMME@MPN纳米颗粒(1mL，30μg/mL)的水溶液悬浮液中加入SOSG(10μmol)和H2O2(常氧组0μM，乏氧组100μM)。其中，乏氧组的液体提前煮沸，并注入氩气去除溶液中的溶解氧。超声(US，1.0MHz，70％占空比，1.5W/cm2)分别超声0、2、4、6、8min。荧光测量在荧光光谱仪上进行，激发/发射波长为488/525nm。
H.pylori(1×108CFU/mL)分别在以下条件下处理10min。pH 2.2、pH 7.4、Fe-HMME@MPN+pH 2.2、Fe-HMME@DHA@MPN+pH 2.2、Fe-HMME@MPN+H2O2+pH 2.2、Fe-HMME@DHA@MPN+H2O2+pH 2.2，样品的浓度分别为：Fe-HMME@DHA@MPN(120μg/mL)；Fe-HMME@MPN(90μg/mL)；H2O2(100μM)。之后离心除去上清，将胞内ROS荧光探针DCFH-DA(10μM)与细菌共孵育20分钟，之后将每组样品分别加入到石英皿中测量其500-580nm处荧光光谱。同时将其分别滴加至载玻片上，使用共聚焦显微镜观察各组细菌的绿色荧光强度。
2、结果
结果显示，与HMME和Fe-HMME各自的带隙1.86eV和1.88eV相比，Fe-HMME@MPN表现出了更窄的带隙约为1.70eV(图3a)，Fe-HMME@MPN带隙的减小有利于超声作用下，电子和空穴分离，激发的电子与O2反应产生毒性1O2。因此，根据带隙理论，Fe-HMME@MPM应具有比HMME更高的声动力性能。分子探针单重态氧传感器绿色(SOSG)表征的1O2产率显示Fe-HMME@MPN产1O2量最大(图3b)，这与能带图是一致的，显示出利用催化Fe-HMME@MPM作为SDT声敏剂的巨大潜力。
在治疗深部组织感染，尤其是与生物膜相关的感染时，通过超声催化法产生1O2的一个限制因是缺氧微环境，因为氧气的生成是1O2必不可少的。使用Fe-HMME@MPN作为声敏剂的优点之一是它具有类似过氧化物酶的特性，可以在酸性环境下产生氧气。类似的，将纳米发生器中的HMME替换为其他的声敏剂如原卟啉(CAS：553-12-8)、二氢卟吩e6(CAS：19660-77-6)可起到同样作用。如图3c所示，Fe-HMME@MPN在补充H2O2的胃酸条件下可以产生大量的氧气，是由于Fe(II)与H2O2发生Fenton反应，从而产生氧气。氧的产生可以缓解感染部位的缺氧，提高声动力疗效。与HMME和Fe-HMME相比，在模拟缺氧条件下产生1O2确实表明Fe-HMME@DHA@MPN的声动力活性增强，产生更多的1O2。
Fe-HMME@DHA@MPN在酸性条件下降解，释放出Fe(III)和TA，TA将Fe(III)还原为Fe(II)。随后，Fe(II)在感染部位催化H2O2，通过Fenton反应产生剧毒的羟基自由基(·OH)。此外，催化活性较低的另一个Fenton反应产物Fe(III)在TA的催化下再次还原为活性Fe(II)，并继续催化H2O2生成·OH。除供氧以增强声动力活性外，Fe-HMME@DHA@MPN还具有化学动力学活性，可进一步促进在酸性条件下通过Fenton反应产生ROS。
为了验证这种用于CDT的连续和有效的Fenton反应，我们测量了Fe-HMME@DHA@MPN在模拟胃酸条件下产生·OH的能力。在酸性条件下与Fe-HMME@MPN和H2O2孵育后，产生·OH的指示剂亚甲基蓝(MB)的吸光度明显下降，表明通过Fenton反应生成·OH。进一步的MB实验表明，胃部低pH和H2O2对纳米颗粒·OH的生成都是至关重要的，因为在中性pH或不添加H2O2的条件下Fe-HMME@MPN没有观察到明显的·OH生成(图3d)。Fe-HMME@MPN的·OH生成表明其具有类过氧化物酶样活性，过氧化物酶底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)进一步证实了这一活性(图3e)。而Fe-HMME@MPN在中性条件(pH 7.4)下的固有过氧化物酶样活性明显弱于酸性条件(pH 2.2)，适合治疗胃部幽门螺杆菌感染，但对共生肠道微生物无害。通过共聚焦显微镜和ROS探针DCFH-DA荧光表征的H.pylori细胞内ROS生成，也证实了Fe-HMME@MPN在酸性条件下H2O2的化学动力学活性(图3f和3g)，在Fe-HMME@DHA@MPN中负载的DHA可以显著增强细胞内ROS生成，即使在环境中没有H2O2时也能够产生大量ROS，这表明DHA可以作为Fenton/Fenton-like反应的过氧化氢源源生成ROS。DHA的加入对Fe-HMME@DHA@MPN实现强大的化学动力学活性是重要的，特别是在H2O2不足的感染微环境中。
实施例6体外抗菌活性研究
1、方法
评价Fe-HMME@DHA@MPN对幽门螺杆菌的抗菌能力，采用H.pylori(ATCC：43504)(1×107CFU/mL)和Fe-HMME@DHA@MPN(100μg/mL在PBS中37℃共孵育30min，然后用CLSM观察聚集的沉淀。Fe-HMME@DHA@MPN通过HMME的本征荧光标记，λEx/Em＝620/670nm。使用SYTO9染色标记活的H.pylori，证明Fe-HMME@DHA@MPN可在H.pylori表面聚集。
分别将游离H.pylori(ATCC：43504，ATCC：700392，CSO1或LQ2#，属于敏感菌和耐药菌)悬浮于生理盐水中，调整OD600为0.1。将调好浓度的菌悬液(100μL)、10mM新鲜尿素和不同浓度的Fe-HMME@DHA@MPN加入到pH 2.2的人工胃液中，在37℃下150rpm振荡孵育30min。每孵育10min使用超声仪对混合液进行超声处理2min，超声参数为：频率1.0MHz，70％占空比，功率1.5W/cm2。用平板涂布法将溶液涂布于哥伦比亚血琼脂平板上培养3-4天，计数菌落数。通过以上测量，确定杀灭≥99.9％细菌的纳米颗粒的最低浓度为最低杀菌浓度(MBC)。
将不同浓度的Fe-HMME@DHA@MPN纳米颗粒分散在pH 2.2含有新鲜尿素(10mM)的SGF中，与1×107CFU/mL浓度的H.pylori(ATCC：43504)共孵育。CDT处理组外加H2O2(200μM)，SDT处理组外加超声，每孵育10min超声2min，超声参数为：频率1.0MHz，70％占空比，功率1.5W/cm2。每隔一段时间将悬浮液稀释后涂布于哥伦比亚血琼脂平板上，在培养箱中孵育72h后计数菌落。
2、结果
结果显示，当Fe-HMME@DHA@MPN与幽门螺杆菌孵育时，原本分散良好的纳米颗粒和细菌形成了明显的团聚体(图4a)，共聚焦显微镜结果显示，纳米颗粒(HMME的紫色荧光)与SYTO 9染色的细菌重叠(图4b)，说明聚集是由于纳米颗粒与细菌的粘附而形成的，而不是纳米颗粒或细菌细胞本身的聚集。Fe-HMME@DHA@MPN与幽门螺杆菌的粘附是由于多酚基团与细菌膜形成共价键或非共价键，如氢键、范德华力或π-π叠加力。纳米颗粒在幽门螺杆菌上的聚集会减少纳米颗粒产生的ROS的传播距离，从而避免了ROS寿命短而导致抗菌活性下降。
Fe-HMME@DHA@MPN在生理盐水(0.9％m/m NaCl)中对幽门螺杆菌(ATCC：43504)的最低杀菌浓度(MBC)为>128.0μg/mL。在含H2O2的模拟胃液(SGF，pH 2.2)中检测，40μg/mL的纳米颗粒Fe-HMME@DHA@MPN可以在超声作用下完全清除所有细菌(图4c)，同时，未添加超声或H2O2的纳米颗粒抑菌活性较低。因此，CDT和SDT的结合可以增强Fe-HMME@DHA@MPN的抗菌活性，因为在混合条件下产生了更多的ROS。而Fe-HMME@DHA@MP将声动力和化学动力结合可以在20分钟内快速根除H.pylori，这种快速杀菌是目前包括抗生素在内的常规药物和治疗方法所不能达到的。
通过活/死细胞染色测定，进一步分析Fe-HMME@DHA@MPN的抗菌效果。在胃pH(pH2.2)条件下，Fe-HMME@DHA@MPN处理后幽门螺杆菌细胞的死/活比率显著升高(图4d)，表明DHA-Fe(II)反应产生的ROS具有杀菌作用。加入H2O2或超声处理后，由于化学动力学或声动力学活性增强ROS生成，死亡细胞增多。在相同的酸性条件下，超声处理Fe-HMME@DHA@MPN加H2O2处理的H.pylori几乎没有发现活菌，说明CDT和SDT具有协同抑菌活性。活/死实验也表明ROS诱导的膜破坏是主要抗菌机制，因为红色染料PI只进入细菌细胞，而没有完整的膜。Fe-HMME@DHA@MPN处理后细菌的扫描电镜(SEM)图像中观察到细菌细胞膜的褶皱和破裂(图4e)，进一步证实了细胞膜破裂的机制。
与大多数具有特异性药物靶点的抗生素相比，具有物理抗菌机制的Fe-HMME@DHA@MPN诱导细菌产生耐药性的可能性较小，而且对已经产生耐药性的细菌理应也具有较好的抗菌作用。因此，除了采用对抗生素甲硝唑耐药的幽门螺杆菌(ATCC 43504)之外，还利用标准的药物敏感菌株(ATCC 700392)和两种临床分离的抗生素耐药菌株(CSO1对克拉霉素耐药，LQ2#对克拉霉素、阿莫西林和左氧氟沙星)评价Fe-HMME@DHA@MPN的杀菌效果。结果如图4f所示在酸性条件下，在H2O2存在下观察到HMME@DHA@MPN具有很强的杀菌活性，MBC为5-10μg/mL，对所有测试菌株具有优异的杀菌能力，表明纳米发生器Fe-HMME@DHA@MPN能用于治疗幽门螺杆菌感染。
实施例7体外抗生物膜活性研究
生物膜可以保护细菌免受抗生素的攻击，显著降低细菌对抗生素的敏感性。根除幽门螺杆菌生物膜是治疗幽门螺杆菌感染的一大挑战。考虑到Fe-HMME@DHA@MPN具有良好的抗菌活性，我们也评估了纳米颗粒的抗生物膜活性。
1、试验方法
幽门螺杆菌生物膜的制备：H.pylori ATCC 43504在含25％甘油和10％胎牛血清(FBS)的BHI液体培养基中-80℃低温保存。为获得接种物，将幽门螺杆菌冻存液涂布在含5％无菌脱纤维羊血的哥伦比亚琼脂平板上，在37℃的微需氧条件(5％O2，10％CO2，85％N2，适当湿度)下培养3天。可在平板上看到细菌菌落。在含5％胎牛血清(FBS)的BHI液体培养基中，37℃微需氧(5％O2，10％CO2，85％N2)条件下培养4-5天，可形成成熟的幽门螺杆菌生物膜。
采用结晶紫染色法评价Fe-HMME@DHA@MPN纳米颗粒的抗生物膜活性。H.pylori悬浮液在96孔微量滴定板中孵育，按照上述步骤获得成熟的生物膜。将废弃的培养基从生物膜中去除，然后加入新鲜的培养基来清洗和去除浮游幽门螺杆菌。随后，在微氧(5％O2，10％CO2，85％N2，37℃)条件，不同浓度Fe-HMME@DHA@MPN培养皿孵育20min，并在孵育过程中进行超声处理，每孵育10min超声2min，超声参数为：频率1.0MHz，70％占空比，功率1.5W/cm2。孵育结束时，用无菌PBS(pH 7.4)冲洗平板，去除悬浮细胞，用0.1％(w/v)的结晶紫染色30min，然后加入乙醇溶解结晶紫，用酶标仪测定570nm处乙醇溶液的吸光度(OD570)来测定生物量。
2、结果
超声处理示意图如图5a所示，经处理后结果显示Fe-HMME@DHA@MPN的抗生物膜活性呈剂量依赖性，在128μg/mL时生物膜降低了41.3％(图5b)。超声处理提高了抗生物膜活性，生物膜去除率达94.51％。产生的毒性ROS与超声的物理损伤共同作用，使其具有显著的根除效果。在没有Fe-HMME@DHA@MPN的情况下，75.4％的生物膜被去除，说明超声对细菌生物膜具有明显的破坏作用。显示单独超声确实可以去除生物膜，不能杀灭生物膜中的细菌，而超声结合Fe-HMME@DHA@MPN处理，导致生物膜中的细菌溶解，生物膜解体；横断面观察到强烈的红色荧光，说明通过化学动力学和声动力学过程产生的ROS可以穿透被超声破碎的生物膜，杀死生物膜深处的细菌(图5c)。因此，HMME@DHA@MPN在超声作用下的抗生物膜活性最高，这是由于超声对生物膜进行物理破坏，然后通过声动力学和化学动力学过程产生的ROS杀死生物膜内部的细菌。
实施例8体内抗菌活性研究
1、试验方法
体内实验均经中国科学院广州生物医学与健康研究院机构动物护理与使用委员会批准。BALB/c雌性小鼠(6-8周龄)按照GIBH实验动物福利和伦理委员会批准的指导方针使用。每只BALB/c小鼠灌胃200μL 1×108CFU/mL H.pylori PBS悬液，每天1次，连续4天(分别于第4、5、6和7天)，并允许感染发展2周。随后对感染小鼠实施安乐死，沿胃大弯切开小鼠胃部，进行革兰氏染色，尿素酶试验，胃部组织细菌匀浆涂板。将H.pylori的菌落形成单位(colony forming unit，CFU)归一化为组织重量(n＝6)。以上实验证明幽门螺杆菌在BALB/c小鼠胃内定殖成功，后续的体内抗菌实验也采用相同的感染模型。
将感染H.pylori的小鼠随机分为5个治疗组(n＝6)，分别给予PBS、Fe-HMME@DHA@MPN(CDT组)、Fe-HMME超声(SDT组)、Fe-HMME@DHA@MPN超声(CDT+SDT组)30mg/kg和三联疗法治疗OAC(奥美拉唑400μmol/kg、阿莫西林28.5mg/kg、克拉霉素14.3mg/kg)灌胃，每天1次，连续4天。以PBS处理的小鼠为阴性对照。Fe-HMME@MPN和Fe-HMME组剂量以Fe-HMME@DHA@MPN30mg/kg定量。
三联疗法(OAC)组，给予小鼠质子泵抑制剂(奥美拉唑)30min后灌胃抗生素，以中和胃酸，防止潜在的抗生素降解。需要超声照射的治疗组，每次灌胃后用超声治疗仪(1.0MHz，70％占空比，1.5W/cm2)对小鼠胃进行3次超声，共6min，并在探头与小鼠皮肤之间填充耦合剂。治疗结束后第二天处死小鼠，取胃组织，采用革兰氏染色、脲酶试验、胃部组织匀浆涂板法评价各组治疗效果。在涂板法中，将胃组织置于1mL PBS中匀浆，连续稀释后置于哥伦比亚血琼脂平板上，用含有5％无菌脱纤维羊血和多种抗生素(10μg/mL万古霉素、5μg/mL头孢磺啶钠、5μg/mL乳酸甲氧苄氨嘧啶、5μg/mL两性霉素B)对匀浆液进行涂板，然后在37℃的微氧条件下(5％O2、10％CO2、85％N2)孵育4天。并通过菌落计数的方法评价体内抑菌活性。
使用细胞计数试剂盒8(CCK-8)评估细胞活力。人胃上皮细胞(GES-1，每孔5×103个细胞)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC，每孔5×103个细胞)在补充有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM(Gibco)中培养在96孔板上37℃培养24h。随后，将不同浓度(0-200μg/mL)的Fe-HMME@DHA@MPN纳米颗粒及其降解产物加入细胞中并孵育24h。Fe-HMME@DHA@MPN纳米粒子的降解产物是将纳米粒子在不同浓度(0-200μg/mL)的模拟胃液中孵育4h，然后将pH调节至中性并冻干。细胞用DMEM洗涤3次，加入10％CCK-8溶液。5％CO2 37℃孵育2h后，用酶标仪测定450nm处的吸光度值
将大肠杆菌(E.coli)和产气肠杆菌(E.aero)悬浮液与生理盐水调至OD600＝0.07。将制备好的细菌悬液(～1×108CFU/mL)和一定量的Fe-HMME@DHA@MPN(100μg/mL)在37℃的PBS(pH 7.4)中孵育6h，然后在3500g下离心10min，除去上清。将悬液涂布于Mueller-Hinton琼脂平板上，培养24h后计数菌落。
2、结果
催化ROS纳米发生器Fe-HMME@DHA@MPN对H.pylori感染的体内治疗作用如图6a所示。感染小鼠胃内细菌检测结果显示CDT+SDT处理与OAC处理具有相似的抑菌活性，与PBS处理小鼠相比，其抑菌率超过99％(图6b和6c)。尽管CDT或SDT对细菌的抑制作用显著(>90％)，但单独CDT或SDT的抑菌活性弱于CDT+SDT和OAC处理，表明CDT和SDT对Fe-HMME@DHA@MPN的体内协同抑菌作用。
此外，H.pylori的重要临床试验尿素酶试验(图6d)也呈阴性，这也表明CDT+SDT处理小鼠的胃中H.pylori被清除，这与OAC处理小鼠的情况相似。幽门螺杆菌感染小鼠胃组织的革兰氏染色进一步证实CDT+SDT具有较好的抗菌活性(图6e)。表明Fe-HMME@DHA@MPN介导的CDT和SDT联合治疗胃内幽门螺杆菌可以消除胃内幽门螺杆菌，与标准三联疗法OAC治疗幽门螺杆菌感染的疗效相当。
除了对幽门螺杆菌感染的卓越治疗效果，生物相容性是进一步临床转化的关键。Fe-HMME@DHA@MPN对人胃上皮细胞系GES-1(图6f)和人脐静脉内皮细胞HUVEC(图6g)的体外细胞相容性在200μg/mL浓度时没有明显的细胞毒性，Fe-HMME@DHA@MPN降解产物的细胞毒性也可以忽略不记。此外，Fe-HMME@DHA@MPN对人或动物肠道中重要的生理菌，典型的共生菌大肠杆菌(E.coli)和产气肠杆菌(E.aero)也没有毒性(图6h和6i)。纳米颗粒良好的生物相容性主要是由于其生物相容性组分(内源性血红蛋白衍生物HMME、必需元素Fe和绿茶成分单宁酸)，这些组分在中性条件下无毒。Fe-HMME@DHA@MPN对pH的响应导致中性环境中没有产生显著的ROS，因此对正常细胞和肠道菌群没有明显的损伤。体外生物相容性表明Fe-HMME@DHA@MPN对幽门螺杆菌具有选择性杀伤作用，可避免对正常细胞和共生菌的不必要毒性。
实施例9体内安全性
1、试验方法
对小鼠每天灌胃PBS、Fe-HMME@DHA@MPN(30mg/kg)和OAC，连续4天。Fe-HMME@DHA@MPN治疗组小鼠在每次灌胃后，使用1.0MHz，70％占空比，1.5W/cm2的超声治疗仪进行3次超声，每次2min，共6min。第6天处死小鼠，收集各组小鼠的胃、心、肝、脾、肺、肾、粪便及结肠段。胃、心、肝、脾、肺、肾组织保存在福尔马林中进行H&E染色。以H&E染色法对胃炎症及损伤情况进行盲评分。对粪便和肠道菌群进行分析对比。取小鼠血液静置后离心得到小鼠血清，并对其进行生化分析。分析血液中天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALT)，尿素氮(urea nitrogen，BUN)，肌酐(creatinine，CRE)钠，钾和铁离子水平分别评估小鼠肝和肾的功能以及对其潜在的其他毒性。
2、结果
用Fe-HMME@DHA@MPN灌胃的未感染小鼠胃组织H&E染色显示无明显炎症和损伤，上皮细胞层清晰，黏膜完整，与PBS处理小鼠胃样相似(图7a)。H&E染色图像分析得到的炎症评分(图7b)和损伤评分与健康小鼠无显著差异，也证实了其生物相容性良好。
此外，经CDT+SDT处理后小鼠体重(图7c)和小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的H&E染色(图7d)均表明，口服Fe-HMME@DHA@MPN不会导致系统毒性。血液生化分析还表明，重复使用与治疗幽门螺杆菌感染相同剂量的HMME@DHA@MPN不会导致全身毒性和血液中Fe积累。而OAC处理导致丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平显著升高，提示可能存在肝毒性(图7e)。
基于胃酸响应性的Fe-HMME@DHA@MPN对幽门螺杆菌具有杀菌作用，而不会影响小鼠肠道菌群平衡的机理示意图如图8a显示，在胃部酸性条件下，Fe-HMME@DHA@MPN能催化ROS生成，抗菌效果显著增强。进入中性肠道后，Fe-HMME@DHA@MPN类过氧化物酶样活性被抑制，对共生菌的毒性最小。说明纳米颗粒Fe-HMME@DHA@MPN对胃肠道中的共生菌没有杀菌活性，而标准OAC处理显著杀灭了共生菌，回肠内容物和粪便中的细菌分别减少了73.3％和55.3％(图8b)。肠道和粪便微生物的丰富度(Chao1指数)和多样性(Shannon和Simpson指数)也证实了催化ROS发生器的无害性，但OAC处理在很大程度上改变了微生物生态(图8c-8e)。肠道和粪便中各分类等级的微生物绝对丰度和微生物的组成进一步表明，未处理组与OAC处理组差异较大，而CDT+SDT处理组的微生物组型与未处理组相似(图8f-8g)。微生物组学分析表明，催化ROS纳米发生器处理后，肠道菌群基本没有变化，未受干扰的肠道菌群可能避免因基于抗生素的三联疗法引起肠道菌群的改变而引起各种疾病。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种胃酸响应性的活性氧纳米发生器，其特征在于，所述活性氧纳米发生器为核壳结构的纳米颗粒，核为有机声敏剂和铁离子形成的介孔纳米粒子，纳米粒子介孔中负载具有过氧桥结构的物质，壳为多酚类物质；所述机声敏剂为血卟啉单甲醚，过氧桥结构的物质为双氢青蒿素，多酚类物质为单宁酸。
2.根据权利要求1所述活性氧纳米发生器，其特征在于，所述有机声敏剂和铁离子的质量比为0.5～1:1～2。
3.权利要求1所述活性氧纳米发生器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将有机声敏剂溶液与含铁离子溶液混匀，黑暗条件下超声反应，离心，收集沉淀，洗涤后即得Fe-有机声敏剂纳米颗粒；
S2.将步骤S1得到的Fe-有机声敏剂纳米颗粒分散得悬浮液，再加入含具有过氧桥结构物质的溶液，混匀反应，蒸发，离心后得负载具有过氧桥结构物质的Fe-有机声敏剂纳米颗粒；
S3.将多酚类物质水溶液加入步骤S2得到的负载具有过氧桥结构物质的Fe-有机声敏剂纳米颗粒悬浮液中，混合、洗涤、离心，去除多余的多酚类物质和铁离子，即得活性氧纳米发生器。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤S3中多酚类物质水溶液与负载具有过氧桥结构物质的Fe-有机声敏剂纳米颗粒的终浓度比例为0.5～2:0.5～2。
5.权利要求1或2所述活性氧纳米发生器在制备抗幽门螺杆菌感染产品中的应用。
6.一种抗幽门螺杆菌感染的产品，其特征在于，含权利要求1或2所述活性氧纳米发生器。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012093931A1 (en) * 2011-01-07 2012-07-12 Valiant Biopharma Sdn Bhd Antimicrobial fusion compounds and uses thereof
CN112168810A (zh) * 2020-09-27 2021-01-05 上海大学 一种光激发结合细胞铁死亡诱导的仿生药物载体及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012093931A1 (en) * 2011-01-07 2012-07-12 Valiant Biopharma Sdn Bhd Antimicrobial fusion compounds and uses thereof
CN112168810A (zh) * 2020-09-27 2021-01-05 上海大学 一种光激发结合细胞铁死亡诱导的仿生药物载体及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biocompatible Fe-Hematoporphyrin coordination nanoplatforms with efficient sonodynamic-chemo effects on deep-seated tumors;Hao Xu等;《Biomaterials》;第257卷;第1-11页 *
α-Fe2O3 based nanotherapeutics for near-infrared/dihydroartemisinin dual-augmented chemodynamic antibacterial therapy;Yueying Xu等;《Acta Biomaterialia》;第150卷;第367-379页 *

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